JP6953047B1 - アンジオテンシン転換酵素2(ace2)及び/又はtmprss2発現を阻害するための組成物 - Google Patents
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Abstract
Description
(発明1)
アンジオテンシン転換酵素2(ACE2)及び/又はTMPRSS2の発現を阻害するための組成物であって、
前記組成物は、FoxO1阻害剤を含む、組成物。
(発明2)
前記FoxO1阻害剤は、インスリン系化合物である、発明1の組成物。
(発明3)
前記インスリン系化合物が、野生型インスリンである、発明2の組成物。
(発明4)
前記インスリン系化合物が、改変型インスリンである、発明2の組成物。
(発明5)
前記改変型インスリンが、超速効型インスリン、速効型インスリン、中間型インスリン、持効型溶解性インスリン、混合型インスリン、及び配合溶解性インスリンから選択される1種以上である、発明4の組成物。
(発明6)
前記改変型インスリンが、ヒト野生型インスリンと90%以上同一のアミノ酸配列を有する、発明4の組成物。
(発明7)
前記改変型インスリンが、ヒト野生型インスリンと95%以上同一のアミノ酸配列を有する、発明6の組成物。
(発明8)
前記改変型インスリンのA鎖が、ヒト野生型インスリンのA鎖と100%同一のアミノ酸配列を有する、発明6又は7の組成物。
(発明9)
前記FoxO1阻害剤は、成長因子及び/又はこれをコードする核酸である、発明1の組成物。
(発明10)
前記成長因子が、以下から選択されるいずれかと、90%以上同一のアミノ酸配列を有する、発明9の組成物:
IGF1、IGF2、EGF、FGF2、FGF14、VEGF、HGF。
(発明11)
前記成長因子が、以下から選択されるいずれかと、95%以上同一のアミノ酸配列を有する、発明10の組成物:
IGF1、IGF2、EGF、FGF2、FGF14、VEGF、HGF。
(発明12)
前記成長因子が、以下から選択されるいずれかと、100%以上同一のアミノ酸配列を有する、発明11の組成物:
IGF1、IGF2、EGF、FGF2、FGF14、VEGF、HGF。
(発明13)
前記FoxO1阻害剤は、FoxO1作用型阻害剤である、発明1の組成物。
(発明14)
前記FoxO1阻害剤は、PI3K/PDK1/Akt作用型阻害剤である、発明1の組成物。
(発明15)
前記FoxO1阻害剤は、FoxO1の遺伝子発現抑制剤である、発明1の組成物。
(発明16)
コロナウィルス感染症を治療するための組成物である、発明1〜15いずれか1つに記載の組成物。
(発明17)
コロナウィルス感染症を予防するための組成物である、発明1〜15いずれか1つに記載の組成物。
(発明18)
コロナウィルス感染症を予防又は治療するための組成物であって、FoxO1阻害剤を含む、組成物。
本明細書で記載される用語「アンジオテンシン転換酵素2(ACE2)及び/又はTMPRSS2の発現を阻害するため」は、ACE2及び/又はTMPRSS2に関する特定の疾患を改善するという目的を包含する。更には、当該用語は、治療目的に限定されない。例えば、当該用語は、特定の疾患を有さないとしても、その疾患を発症することを予防する目的を包含する。
{ただし、
R1は、NH又はCH2であり、
R2は、N−R8又はCH−R8 (R8:C1〜C3までのアルキル基)であり、
R3は、F、Cl、Br、又はIであり、
R4は、それぞれ独立して、H又はCH3であり、
R5は、S又はOであり、
R6は、カルボキシル基であり、
R7は、NH2、又はCH3であり、
nは、1−11である。
}
一実施形態において、本開示は、アンジオテンシン転換酵素2(ACE2)及び/又はTMPRSS2の発現を阻害するための組成物であって、前記組成物は、FoxO1阻害剤を含む、組成物に関する。
・インスリン系化合物
・成長因子又はこれをコードする核酸
・FoxO1作用型阻害剤、及び/又は、PI3K/PDK1/Akt作用型阻害剤
・FoxO1の遺伝子発現抑制剤
以下では、各々の阻害剤について詳述する。
一実施形態においては、こうした組成物は、インスリン系化合物(例えば、ヒトインスリン)を含む。これにより、ACE2及び/又はTMPRSS2の遺伝子の転写が阻害され、mRNA量が減少する。
一実施形態においては、組成物は、成長因子を含む。これにより、ACE2及び/又はTMPRSS2の遺伝子の転写が阻害され、mRNA量が減少する。
・ペプチド又はタンパク質を少なくとも部分的に含むこと
・細胞内のFoxO1の転写因子の活性を抑制すること
一実施形態においては、組成物は、FoxO1作用型阻害剤、及び/又は、PI3K/PDK1/Akt作用型阻害剤を含む。これにより、ACE2及び/又はTMPRSS2の遺伝子の転写が阻害され、mRNA量が減少する。
・細胞膜を透過して、細胞内のPIP3を増加させるか、及び/又は、PI3K、PDK1、Aktのうち少なくともいずれか1つに直接作用すること
・作用した結果、PI3K、PDK1及びAktのうち少なくともいずれか1つの活性を変化させること
・活性を変化させた結果、細胞内のFoxO1の転写因子の活性を抑制すること
・FoxO1に対して活性を阻害する作用
・PIP3を増加させる作用、
・PI3K、PDK1、Aktのうち少なくともいずれか1つに対して活性を促進する作用
VO−Ohpic trihydrate
SF1670
bpV(HOpic)
これらの化合物は、PI3Kと逆の作用をするPTENを阻害することで、間接的にPI3K/PDK1/Aktに対して活性を促進する効果があることが知られている。
一実施形態においては、組成物は、FoxO1遺伝子発現抑制剤を含む。これにより、FoxO1自体の発現量が減少する。そして、ACE2及び/又はTMPRSS2の遺伝子の転写が減少し、mRNA量が減少する。典型的には、FoxO1遺伝子発現抑制剤の例として、siRNA(small interference RNA)、あるいはmiRNA(microRNA)などを用いたFoxO1遺伝子発現の阻害が挙げられる。
一実施形態において、本開示の組成物は、アンジオテンシン転換酵素2(ACE2)及び/又はTMPRSS2が関与する疾患の治療及び/又は予防に利用することができる。具体的には、これらが関与する感染症の治療及び/又は予防に利用することができる。感染症の例としては、コロナウィルス感染症、例えば、SARS−CoV又はSARS−CoV2などのウイルスによる感染症が挙げられる。好ましくは、SARS−CoV2による感染症(COVID19)である。これらのウイルスは、ヒト細胞のACE2受容体に、自身のスパイクタンパク質を結合させ、これを足掛かりとして細胞内に侵入する。また、SARS−CoV2は、ヒト細胞の表面のACE2と結合した後、ヒト細胞のTMPRSS2の酵素処理によって、細胞内への侵入効率が増強される。従って、ACE2及び/又はTMPRSS2の発現を抑制することで、こうしたウイルスによる細胞の侵入を抑制することができる。これによって感染を抑制することができる。
4−1.実施例1(HepG2細胞の培養)
HepG2細胞はATCC(登録商標)(American Type Culture Collection、HB−8065)から購入した。当該細胞はDMEM(SIGMA,D8900)+10%FBS(SIGMA,F7524)の血清培地を用いて継代・維持した。
HepG2細胞を12 well plate(Corning(登録商標),3336)の各ウェルに50,000cells/cm2で播種し、一晩培養した。翌日(播種後16〜24時間)、野生型および改変型インスリンを10μg/mlで添加し、又はコントロールとしてPBS(−)を加え、3日(約72時間)培養した。培養後、ReliaPrep RNA Miniprep system(Promega(登録商標), Z6012)を用いてHepG2細胞からTotal RNAを抽出した。抽出後、500ngのRNAを用いてcDNA合成(PrimeScript RT Master Mix; Takara(登録商標), RR036A)を行い、更に、定量的PCR(Thunderbird(登録商標) Sybr qPCR Mix; TOYOBO(登録商標), QPS−201X5)を行った。
5xPrimeScript RT Master Mix 2μl(最終濃度 1x)
Total RNA 500 ng
RNase free H2O 合計10 μlに調整
37℃ 15分
↓
85℃ 5秒
↓
4℃ ∞
より具体的には、当該希釈物を、以下の条件で混合した。
2×THUNDERBIRD(登録商標) Probe qPCR Mix 10μl
5mM Forward Primer 0.4μl
5mM Reverse Primer 0.4μl
H2O 8.2μl
cDNA(10倍希釈) 1 μl
1.95℃ 1分 (初期変性)
2.95℃ 15秒 (変性)
3.60℃ 30秒 (伸長)
(2−3のステップを40回繰り返し、ステップ3が終わるたびに蛍光シグナルを検出)
4.65 ℃ 〜 95 ℃まで0.5 ℃刻みで温度を上昇させ、5秒ずつ温度を保持してから蛍光シグナルを検出
各遺伝子を検出するためのプライマー配列は以下の通りであった。
GAPDH Forward primer: 5’ - agccacatcgctcagacac - 3’
GAPDH Reverse primer: 5’ - gcctaatacgaccaaatcc - 3’
ACE2 Forward primer: 5’ - ttctgtcacccgattttcaa - 3’
ACE2 Reverse primer: 5’ - tcccaacaatcgtgagtgc - 3’
TMPRSS2 Forward primer: 5’ - cgctggcctactctggaa - 3’
TMPRSS2 Reverse primer: 5’ - ctgaggagtcgcactctatcc - 3’
各遺伝子の発現量は、定量PCRで得られた各遺伝子の発現量を、さらにGAPDHの発現量で割って標準化したものを示している。さらに、インスリンで処理をしていないコントロール条件(PBS(−)処理)での発現量を「1」になるように標準化している。以上のプライマーを用いて増幅したPCR産物は全て単一のものであること(つまり、同一のプライマーで、複数種類の配列が増幅されていないこと)をMelting curveによって確認した。
商品名:リスプロ(インスリン リスプロ)(超速効型)
商品名:ノボラピッド(登録商標)(インスリン アスパルト)(超速効型)
商品名:アピドラ(登録商標)(インスリン グルリジン)(超速効型)
商品名:ヒューマリン(登録商標)R(レギュラーインスリン)(速効型)
商品名:ヒューマリン(登録商標)N(イソフェンインスリン)(中間型)
商品名:ノボリン(登録商標)N(イソフェンインスリン)(中間型)
商品名:ノボラピッド(登録商標)30ミックス(インスリンアスパルト(超速効型)とプロタミン結晶性インスリンアスパルト(中間型)を3:7で混合したもの)(混合型)
商品名:レベミル(登録商標)(インスリン デテミル)(持効型溶解性)
商品名:ライゾデグ(登録商標)(インスリンアスパルト(超速効型)とインスリンデグルデク(持効型)を3:7で混合したもの)(配合溶解性)
Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Asn
Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr(ヒト野生型、レギュラーインスリン)
Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Asp Lys Thr(アスパルト)
Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Lys Pro Thr(リスプロ)
Phe Val Lys Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Glu Thr(グルリジン)
Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys −Myristic Acid(デテミル)
Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys −γ−Glu−Nε−hexadecandioyl(デグルデク)
次に、インスリンによるACE2の発現抑制が、SARS−CoV2とホスト細胞の結合及び細胞内への取り込みを阻害できるか検討した。この目的で、SARS−CoV2のスパイクタンパク質のS1ドメイン、さらにS1の中でACE2に結合するために必要十分な領域RBD(Receptor Binding Domain、R319〜F541)にマウスIgGのFc領域が融合されたリコンビナントタンパク質S1−mFc(Sino Biological、40592−V05H1)、及びRBD−mFc(Sino Biological、40592−V05H2)を準備した。実験の模式図を図3に示す。
実施例1〜3と同様の実験を行った。ただし、各種インスリン化合物に代えて、以下の成長因子を10ng/mlの濃度で使用した。これらは、シグナル経路の下流として、FoxO1を抑制することが知られている。
IGF1(PeproTech社、製品番号AF−100−11)、
IGF2(PeproTech社、製品番号AF−100−12)、
EGF(PeproTech社、製品番号AF−100−15)、
FGF2(PeproTech社、製品番号AF−100−18B)、
FGF14(BioVision(登録商標)社、製品番号7347)、
VEGF165(PeproTech社、製品番号AF−100−20)、
https://www.peprotech.com/gb/recombinant-human-igf-i-2
Gly Pro Glu Thr Leu Cys Gly Ala Glu Leu Val Asp Ala Leu Gln Phe Val Cys Gly Asp Arg Gly Phe Tyr Phe Asn Lys Pro Thr Gly Tyr Gly Ser Ser Ser Arg Arg Ala Pro Gln Thr Gly Ile Val Asp Glu Cys Cys Phe Arg Ser Cys Asp Leu Arg Arg Leu Glu Met Tyr Cys Ala Pro Leu Lys Pro Ala Lys Ser Ala
https://www.peprotech.com/en/recombinant-human-igf-ii-2
Ala Tyr Arg Pro Ser Glu Thr Leu Cys Gly Gly Glu Leu Val Asp Thr Leu Gln Phe Val Cys Gly Asp Arg Gly Phe Tyr Phe Ser Arg Pro Ala Ser Arg Val Ser Arg Arg Ser Arg Gly Ile Val Glu Glu Cys Cys Phe Arg Ser Cys Asp Leu Ala Leu Leu Glu Thr Tyr Cys Ala Thr Pro Ala Lys Ser Glu
https://www.peprotech.com/en/recombinant-human-egf
Asn Ser Asp Ser Glu Cys Pro Leu Ser His Asp Gly Tyr Cys Leu His Asp Gly Val Cys Met Tyr Ile Glu Ala Leu Asp Lys Tyr Ala Cys Asn Cys Val Val Gly Tyr Ile Gly Glu Arg Cys Gln Tyr Arg Asp Leu Lys Trp Trp Glu Leu Arg
https://www.peprotech.com/en/recombinant-human-fgf-basic-154-aa-2
Ala Ala Gly Ser Ile Thr Thr Leu Pro Ala Leu Pro Glu Asp Gly Gly Ser Gly Ala Phe Pro Pro Gly His Phe Lys Asp Pro Lys Arg Leu Tyr Cys Lys Asn Gly Gly Phe Phe Leu Arg Ile His Pro Asp Gly Arg Val Asp Gly Val Arg Glu Lys Ser Asp Pro His Ile Lys Leu Gln Leu Gln Ala Glu Glu Arg Gly Val Val Ser Ile Lys Gly Val Cys Ala Asn Arg Tyr Leu Ala Met Lys Glu Asp Gly Arg Leu Leu Ala Ser Lys Cys Val Thr Asp Glu Cys Phe Phe Phe Glu Arg Leu Glu Ser Asn Asn Tyr Asn Thr Tyr Arg Ser Arg Lys Tyr Thr Ser Trp Tyr Val Ala Leu Lys Arg Thr Gly Gln Tyr Lys Leu Gly Ser Lys Thr Gly Pro Gly Gln Lys Ala Ile Leu Phe Leu Pro Met Ser Ala Lys Ser
https://www.biovision.com/fgf14-human-recombinant.html
Met Gly Ser Ser His His His His His His Ser Ser Gly Leu Val Pro Arg Gly Ser His Met Gly Ser His Met Ala Ala Ala Ile Ala Ser Gly Leu Ile Arg Gln Lys Arg Gln Ala Arg Glu Gln His Trp Asp Arg Pro Ser Ala Ser Arg Arg Arg Ser Ser Pro Ser Lys Asn Arg Gly Leu Cys Asn Gly Asn Leu Val Asp Ile Phe Ser Lys Val Arg Ile Phe Gly Leu Lys Lys Arg Arg Leu Arg Arg Gln Asp Pro Gln Leu Lys Gly Ile Val Thr Arg Leu Tyr Cys Arg Gln Gly Tyr Tyr Leu Gln Met His Pro Asp Gly Ala Leu Asp Gly Thr Lys Asp Asp Ser Thr Asn Ser Thr Leu Phe Asn Leu Ile Pro Val Gly Leu Arg Val Val Ala Ile Gln Gly Val Lys Thr Gly Leu Tyr Ile Ala Met Asn Gly Glu Gly Tyr Leu Tyr Pro Ser Glu Leu Phe Thr Pro Glu Cys Lys Phe Lys Glu Ser Val Phe Glu Asn Tyr Tyr Val Ile Tyr Ser Ser Met Leu Tyr Arg Gln Gln Glu Ser Gly Arg Ala Trp Phe Leu Gly Leu Asn Lys Glu Gly Gln Ala Met Lys Gly Asn Arg Val Lys Lys Thr Lys Pro Ala Ala His Phe Leu Pro Lys Pro Leu Glu Val Ala Met Tyr Arg Glu
https://www.peprotech.com/en/recombinant-human-vegfsub165sub-2
Ala Pro Met Ala Glu Gly Gly Gly Gln Asn His His Glu Val Val Lys Phe Met Asp Val Tyr Gln Arg Ser Tyr Cys His Pro Ile Glu Thr Leu Val Asp Ile Phe Gln Glu Tyr Pro Asp Glu Ile Glu Tyr Ile Phe Lys Pro Ser Cys Val Pro Leu Met Arg Cys Gly Gly Cys Cys Asn Asp Glu Gly Leu Glu Cys Val Pro Thr Glu Glu Ser Asn Ile Thr Met Gln Ile Met Arg Ile Lys Pro His Gln Gly Gln His Ile Gly Glu Met Ser Phe Leu Gln His Asn Lys Cys Glu Cys Arg Pro Lys Lys Asp Arg Ala Arg Gln Glu Asn Pro Cys Gly Pro Cys Ser Glu Arg Arg Lys His Leu Phe Val Gln Asp Pro Gln Thr Cys Lys Cys Ser Cys Lys Asn Thr Asp Ser Arg Cys Lys Ala Arg Gln Leu Glu Leu Asn Glu Arg Thr Cys Arg Cys Asp Lys Pro Arg Arg
AS1842856は、FoxO1に直接結合して、FoxO1の転写因子の活性を阻害することが知られている(ただし、上述の定義にある通り、本明細書で規定する「FoxO1阻害剤」には含まれない)。参考例としてAS1842856を用いて以下の実験を行った。
HepG2細胞はATCC(登録商標)(American Type Culture Collection、HB−8065)から購入した。当該細胞はDMEM(SIGMA,D8900)+10%FBS(SIGMA,F7524)の血清培地を用いて継代・維持した。
HepG2細胞を12 well plate(Corning(登録商標),3336)の各ウェルに50,000cells/cm2で播種し、一晩培養した。翌日(播種後16〜24時間)、FoxO1阻害剤AS1842856を複数の濃度で添加(1nM、10nM、50nM、100nM、1μM)し、又はその溶媒として用いたDMSOをコントロールとして加え、1日(約24時間)培養した。培養後、ReliaPrep RNA Miniprep system(Promega(登録商標), Z6012)を用いてHepG2細胞からTotal RNAを抽出した。抽出後、500ngのRNAを用いてcDNA合成(PrimeScript RT Master Mix; Takara(登録商標), RR036A)を行い、更に、定量的PCR(Thunderbird(登録商標) Sybr qPCR Mix; TOYOBO(登録商標), QPS−201X5)を行った。
5xPrimeScript RT Master Mix 2 μl(最終濃度 1 x)
Total RNA 500 ng
RNase free H2O 合計10 μlに調整
37℃ 15分
↓
85℃ 5秒
↓
4℃ ∞
より具体的には、当該希釈物を、以下の条件で混合した。
2×THUNDERBIRD(登録商標) Probe qPCR Mix 10μl
5mM Forward Primer 0.4μl
5mM Reverse Primer 0.4μl
H2O 8.2μl
cDNA(10倍希釈) 1 μl
1.95℃ 1分 (初期変性)
2.95℃ 15秒 (変性)
3.60℃ 30秒 (伸長)
(2−3のステップを40回繰り返し、ステップ3が終わるたびに蛍光シグナルを検出)
4.65 ℃ 〜 95 ℃まで0.5 ℃刻みで温度を上昇させ、5秒ずつ温度を保持してから蛍光シグナルを検出
各遺伝子を検出するためのプライマー配列は以下の通りであった。
GAPDH Forward primer: 5’ - agccacatcgctcagacac - 3’
GAPDH Reverse primer: 5’ - gcctaatacgaccaaatcc - 3’
ACE2 Forward primer: 5’ - ttctgtcacccgattttcaa - 3’
ACE2 Reverse primer: 5’ - tcccaacaatcgtgagtgc - 3’
TMPRSS2 Forward primer: 5’ - cgctggcctactctggaa - 3’
TMPRSS2 Reverse primer: 5’ - ctgaggagtcgcactctatcc - 3’
各遺伝子の発現量は、定量PCRで得られた各遺伝子の発現量を、さらにGAPDHの発現量で割って標準化したものを示している。さらに、FoxO1阻害剤で処理をしていないコントロール条件(DMSO処理)での発現量を「1」になるように標準化している。以上のプライマーを用いて増幅したPCR産物は全て単一のものであること(つまり、同一のプライマーで、複数種類の配列が増幅されていないこと)をMelting curveによって確認した。
次に、FoxO1阻害剤によるACE2の発現抑制が、SARS−CoV2とホスト細胞の結合及び細胞内への取り込みを阻害できるか検討した。この目的で、SARS−CoV2のスパイクタンパク質のS1の中でACE2に結合するために必要十分な領域RBD(Receptor Binding Domain、R319〜F541)にマウスIgGのFc領域が融合されたリコンビナントタンパク質RBD−mFc(Sino Biological、40592−V05H2)を準備した。実験の模式図を図8に示す。
4−7−1.間葉系幹細胞の初代培養
はじめに、脂肪組織由来間葉系幹細胞(AD−MSC)を準備した。具体的には、脂肪組織由来間葉系幹細胞を用いた再生医療を受ける予定の患者より、皮下脂肪組織を分取した。当該皮下脂肪組織は、投与用細胞の調製に必要な原料となる。当該皮下脂肪組織を分取した後の剰余を、初代培養に供した。なお、予め、患者から研究利用に関する同意を取得した。
3日に1回の頻度で培地全交換を実施した。上澄みは破棄して、フラスコ底面上で増殖する細胞を選択的に増殖させた。セミコンフルエントまで増殖したT−25フラスコ内の細胞に対して、2mLの酵素溶液(TrypLE Express; Thermo Fisher Scientific,12604021)を添加し、細胞をフラスコの底面から剥離した(37℃、5分間静置)。細胞をPBS(−)で希釈し、遠心分離(400×gで5分間)に供した。沈殿した細胞を培養液sf−DOTで懸濁し、一部を分取してトリパンブルー染色法による細胞数計測を行なった。新たなT75フラスコ(CellBIND(登録商標); Corning(登録商標), 3290)にsf−DOTで懸濁した細胞を播種し、インキュベータ内(37℃,5%CO2)に静置して継代培養を行った(P0→P1)。その後も同様の手順で継代培養を行い、必要な細胞数を得た。
HepG2細胞はATCC(登録商標)(American Type Culture Collection、HB−8065)から購入した。当該細胞はDMEM(SIGMA,D8900)+10%FBS(SIGMA,F7524)の血清培地を用いて継代・維持した。
HepG2細胞を6well plate(CellBIND(登録商標); Corning(登録商標), 3335)の各ウェルに100,000個の細胞を播種した。そこに、トランスウェル(6well plate用24mmインサート,0.4μm poreサイズ;Corning(登録商標), 3412)を載せた。トランスウェル内にもDMEM+10%FBSを適量注ぎ、さらにそこに何も細胞を播種しないコントロール(HepG2細胞のみ)、脂肪由来間葉系幹細胞を播種(HepG2とAD−MSCの共培養)、及び臍帯由来間葉系幹細胞を播種した(HepG2とUC−MSCの共培養)ものを用意した。播種したAD−MSC及びUC−MSCはともに100,000個である。尚、用いたトランスウェルはあらかじめPLL(Poly−L−Lysine;Cultrex,3438−100−01)でコーティングすることで、間葉系幹細胞がトランスウェルに張り付くことを可能にしている。コーティングは一晩かけて37℃で行った。そして余分なPLLは滅菌水で洗浄・除去した。トランスウェルを介してHepG2細胞と間葉系幹細胞を3日間共培養した(約72時間)。培養後、ReliaPrep RNA Miniprep system(Promega(登録商標), Z6012)を用いてHepG2細胞からTotal RNAを抽出した。抽出後、500ngのRNAを用いてcDNA合成(PrimeScript RT Master Mix; Takara(登録商標), RR036A)を行い、更に、定量的PCR(Thunderbird(登録商標) Sybr qPCR Mix; TOYOBO(登録商標), QPS−201X5)を行った。
5xPrimeScript RT Master Mix 2 μl(最終濃度 1 x)
Total RNA 500 ng
RNase free H2O 合計10 μlに調整
37℃ 15分
↓
85℃ 5秒
↓
4℃ ∞
より具体的には、当該希釈物を、以下の条件で混合した。
2×THUNDERBIRD(登録商標) Probe qPCR Mix 10μl
5mM Forward Primer 0.4μl
5mM Reverse Primer 0.4μl
H2O 8.2μl
cDNA(10倍希釈) 1 μl
1.95℃ 1分 (初期変性)
2.95℃ 15秒 (変性)
3.60℃ 30秒 (伸長)
(2−3のステップを40回繰り返し、ステップ3が終わるたびに蛍光シグナルを検出)
4.65 ℃ 〜 95 ℃まで0.5 ℃刻みで温度を上昇させ、5秒ずつ温度を保持してから蛍光シグナルを検出
各遺伝子を検出するためのプライマー配列は以下の通りであった。
GAPDH Forward primer: 5’ - agccacatcgctcagacac - 3’
GAPDH Reverse primer: 5’ - gcctaatacgaccaaatcc - 3’
ACE2 Forward primer: 5’ - ttctgtcacccgattttcaa - 3’
ACE2 Reverse primer: 5’ - tcccaacaatcgtgagtgc - 3’
TMPRSS2 Forward primer: 5’ - cgctggcctactctggaa - 3’
TMPRSS2 Reverse primer: 5’ - ctgaggagtcgcactctatcc - 3’
各遺伝子の発現量は、定量PCRで得られた各遺伝子の発現量を、さらにGAPDHの発現量で割って標準化したものを示している。さらに、共培養していないコントロール条件での発現量を「1」になるように標準化している。以上のプライマーを用いて増幅したPCR産物は全て単一のものであること(つまり、同一のプライマーで、複数種類の配列が増幅されていないこと)をMelting curveによって確認した。
実施例1〜3と同様の実験を行った。ただし、各種インスリン化合物に代えて、HGF(R&D systems社、製品番号294−HGN−005/CF)を使用した。HGFは、受容体に結合後、細胞内シグナル経路の下流として、FoxO1を抑制することは広く知られている。
https://www.uniprot.org/uniprot/P14210
Met Trp Val Thr Lys Leu Leu Pro Ala Leu Leu Leu Gln His Val Leu Leu His Leu Leu Leu Leu Pro Ile Ala Ile Pro Tyr Ala Glu Gly Gln Arg Lys Arg Arg Asn Thr Ile His Glu Phe Lys Lys Ser Ala Lys Thr Thr Leu Ile Lys Ile Asp Pro Ala Leu Lys Ile Lys Thr Lys Lys Val Asn Thr Ala Asp Gln Cys Ala Asn Arg Cys Thr Arg Asn Lys Gly Leu Pro Phe Thr Cys Lys Ala Phe Val Phe Asp Lys Ala Arg Lys Gln Cys Leu Trp Phe Pro Phe Asn Ser Met Ser Ser Gly Val Lys Lys Glu Phe Gly His Glu Phe Asp Leu Tyr Glu Asn Lys Asp Tyr Ile Arg Asn Cys Ile Ile Gly Lys Gly Arg Ser Tyr Lys Gly Thr Val Ser Ile Thr Lys Ser Gly Ile Lys Cys Gln Pro Trp Ser Ser Met Ile Pro His Glu His Ser Phe Leu Pro Ser Ser Tyr Arg Gly Lys Asp Leu Gln Glu Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Arg Gly Glu Glu Gly Gly Pro Trp Cys Phe Thr Ser Asn Pro Glu Val Arg Tyr Glu Val Cys Asp Ile Pro Gln Cys Ser Glu Val Glu Cys Met Thr Cys Asn Gly Glu Ser Tyr Arg Gly Leu Met Asp His Thr Glu Ser Gly Lys Ile Cys Gln Arg Trp Asp His Gln Thr Pro His Arg His Lys Phe Leu Pro Glu Arg Tyr Pro Asp Lys Gly Phe Asp Asp Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Gly Gln Pro Arg Pro Trp Cys Tyr Thr Leu Asp Pro His Thr Arg Trp Glu Tyr Cys Ala Ile Lys Thr Cys Ala Asp Asn Thr Met Asn Asp Thr Asp Val Pro Leu Glu Thr Thr Glu Cys Ile Gln Gly Gln Gly Glu Gly Tyr Arg Gly Thr Val Asn Thr Ile Trp Asn Gly Ile Pro Cys Gln Arg Trp Asp Ser Gln Tyr Pro His Glu His Asp Met Thr Pro Glu Asn Phe Lys Cys Lys Asp Leu Arg Glu Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Gly Ser Glu Ser Pro Trp Cys Phe Thr Thr Asp Pro Asn Ile Arg Val Gly Tyr Cys Ser Gln Ile Pro Asn Cys Asp Met Ser His Gly Gln Asp Cys Tyr Arg Gly Asn Gly Lys Asn Tyr Met Gly Asn Leu Ser Gln Thr Arg Ser Gly Leu Thr Cys Ser Met Trp Asp Lys Asn Met Glu Asp Leu His Arg His Ile Phe Trp Glu Pro Asp Ala Ser Lys Leu Asn Glu Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Asp Asp Ala His Gly Pro Trp Cys Tyr Thr Gly Asn Pro Leu Ile Pro Trp Asp Tyr Cys Pro Ile Ser Arg Cys Glu Gly Asp Thr Thr Pro Thr Ile Val Asn Leu Asp His Pro Val Ile Ser Cys Ala Lys Thr Lys Gln Leu Arg Val Val Asn Gly Ile Pro Thr Arg Thr Asn Ile Gly Trp Met Val Ser Leu Arg Tyr Arg Asn Lys His Ile Cys Gly Gly Ser Leu Ile Lys Glu Ser Trp Val Leu Thr Ala Arg Gln Cys Phe Pro Ser Arg Asp Leu Lys Asp Tyr Glu Ala Trp Leu Gly Ile His Asp Val His Gly Arg Gly Asp Glu Lys Cys Lys Gln Val Leu Asn Val Ser Gln Leu Val Tyr Gly Pro Glu Gly Ser Asp Leu Val Leu Met Lys Leu Ala Arg Pro Ala Val Leu Asp Asp Phe Val Ser Thr Ile Asp Leu Pro Asn Tyr Gly Cys Thr Ile Pro Glu Lys Thr Ser Cys Ser Val Tyr Gly Trp Gly Tyr Thr Gly Leu Ile Asn Tyr Asp Gly Leu Leu Arg Val Ala His Leu Tyr Ile Met Gly Asn Glu Lys Cys Ser Gln His His Arg Gly Lys Val Thr Leu Asn Glu Ser Glu Ile Cys Ala Gly Ala Glu Lys Ile Gly Ser Gly Pro Cys Glu Gly Asp Tyr Gly Gly Pro Leu Val Cys Glu Gln His Lys Met Arg Met Val Leu Gly Val Ile Val Pro Gly Arg Gly Cys Ala Ile Pro Asn Arg Pro Gly Ile Phe Val Arg Val Ala Tyr Tyr Ala Lys Trp Ile His Lys Ile Ile Leu Thr Tyr Lys Val Pro Gln Ser
実施例1〜3と同様の実験を行った。ただし、FoxO1の遺伝子発現抑制のために、siRNAを使用した。siRNAはコントロールとして何も抑制しないもの(Cell Signaling(登録商標)社,製品番号6568S)、及びヒトFoxO1遺伝子をターゲットとしたもの(#1;Cell Signaling(登録商標)社,製品番号6242S、及び#2;Cell Signaling(登録商標)社,製品番号6256S、配列情報はコントロールも含め非公開)を用いた。siRNAの細胞内への導入にはトランスフェクション試薬(Horizon Discovery社,DharmaFECT1,製品番号T2001−01)を使用した。各種siRNAを導入し、3日後(約72時間後)に細胞を回収し、上記のようにqPCRで定量した。
Claims (8)
- アンジオテンシン転換酵素2(ACE2)及びTMPRSS2の発現を阻害するための組成物であって、
前記組成物は、FoxO1阻害剤を含む、組成物であり、
前記FoxO1阻害剤は、インスリン系化合物、成長因子及び/又はこれをコードする核酸、FoxO1の遺伝子発現抑制剤から選択される1種以上である、組成物であって、
前記成長因子は、以下から選択されるいずれかと、90%以上同一のアミノ酸配列を有し:IGF1、IGF2、EGF、FGF2、FGF14、VEGF、HGF
前記FoxO1の遺伝子発現抑制剤は、FoxO1のアンチセンス核酸、shRNA、siRNA、miRNAから選択される1種以上であり、
前記インスリン系化合物は、野生型インスリン及び改変型インスリンから選択される1種以上である、
組成物(ただし、投与対象として糖尿病患者を除く)。 - 前記改変型インスリンが、超速効型インスリン、速効型インスリン、中間型インスリン、持効型溶解性インスリン、混合型インスリン、及び配合溶解性インスリンから選択される1種以上である、請求項1の組成物。
- 前記改変型インスリンが、ヒト野生型インスリンと90%以上同一のアミノ酸配列を有する、請求項1の組成物。
- 前記改変型インスリンが、ヒト野生型インスリンと95%以上同一のアミノ酸配列を有する、請求項3の組成物。
- 前記改変型インスリンのA鎖が、ヒト野生型インスリンのA鎖と100%同一のアミノ酸配列を有する、請求項3又は4の組成物。
- 前記成長因子が、以下から選択されるいずれかと、95%以上同一のアミノ酸配列を有する、請求項1の組成物:
IGF1、IGF2、EGF、FGF2、FGF14、VEGF、HGF。 - 前記成長因子が、以下から選択されるいずれかと、100%同一のアミノ酸配列を有する、請求項6の組成物:
IGF1、IGF2、EGF、FGF2、FGF14、VEGF、HGF。 - コロナウィルス感染症を治療又は予防するための組成物である、請求項1〜7いずれか1項に記載の組成物(ただし、投与対象として糖尿病患者を除く)であり、前記FoxO1阻害剤は、インスリン系化合物、FoxO1の遺伝子発現抑制剤から選択される1種以上である、組成物。
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