WO2012130893A1 - Utilisation de l'epigallocatechine gallate comme agent antiviral contre les infections par le virus de l'hépatite c - Google Patents

Utilisation de l'epigallocatechine gallate comme agent antiviral contre les infections par le virus de l'hépatite c Download PDF

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WO2012130893A1
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WO
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compound
formula
hcv
hydrogen atom
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Application number
PCT/EP2012/055533
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Karin Seron
Jean Dubuisson
Yves Rouille
Czeslaw Wychowski
Original Assignee
Centre National De La Recherche Scientifique (C.N.R.S)
Institut Pasteur De Lille
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Publication date
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    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/24011—Flaviviridae
    • C12N2770/24211—Hepacivirus, e.g. hepatitis C virus, hepatitis G virus

Definitions

  • the invention relates to a flavonoid compound or a pharmaceutically acceptable salt or ester thereof for use as an antiviral agent in the treatment and / or prevention of infection with the hepatitis C virus (HCV).
  • HCV hepatitis C virus
  • the invention also relates to an in vitro inactivation method of HCV comprising a step of contacting said HCV with a flavonoid compound or a pharmaceutically acceptable salt or ester thereof.
  • Viral hepatitis C is a major cause of chronic liver disease that affects approximately 3% of the world's population. Infected patients are at high risk of cirrhosis or hepatocellular carcinoma requiring liver transplantation.
  • HCV is a linear positive-strand single-stranded RNA virus belonging to the family Flaviviridae in the genus Hepacivirus. This virus is the only known member of the Hepacivirus genus.
  • genotype 1 of HCV is predominant in Europe and the United States, genotype 4 in the Middle East and Africa.
  • genotype 4 in the Middle East and Africa.
  • the high genetic heterogeneity of HCV linked to the high propensity of the virus to mutate has important clinical and diagnostic implications and may explain the difficulties in vaccine development and the lack of response to current treatments.
  • Flavonoid compounds are naturally present in plants and especially in most fruits and vegetables. They are responsible for the varied color of flowers and fruits and are an important source of antioxidants in the diet. They form a subclass of polyphenols. Many flavonoid compounds possess therapeutic virtues and are well known for their excellent potential for inhibiting the processes of angiogenesis and metastasis formation. Among the flavonoids and more particularly among the 3-hydroxyflavonoids, there are subclasses of flavonols, anthocyanins, leucoanthocyanins and catechins. Catechins are the most studied flavonoid compounds.
  • Catechins have multiple therapeutic properties. Their therapeutic effects are widely described in the form of an isolated catechin as in the form of extracts of green tea from which they are mainly derived.
  • catechin catechin, (-) - epicatechin (EC); (-) - epigallocatechin (EGC), (-) - epicatechin-3-gallate (ECG) or epigallocatechin-3-gallate (EGCG).
  • catechins are described as having a preventive effect on obesity or on cardiovascular diseases such as atherosclerosis. They are also described as having an antioxidant, anticarcinogenic, antibacterial or antiviral effect (Khan N. et al., Life Sci., 200781, 19-33.).
  • catechins are diverse. Thus, their anti-carcinogenicity in the case of breast or prostate cancer, would be related to a cytotoxic effect of EGCG on cancer cells (Stuart EC.et al., Life Sci., 2006, 79: 2329-36 ). The antiviral effect of catechins would pass through different metabolic pathways. In the case of influenza or hepatitis B virus, EGCG and / or ECG would inhibit viral replication and / or transcription (Song JM et al., Antiviral Research 2005 68 66-74; et al., 2007).
  • EGCG For influenza or human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1), EGCG would inhibit binding to their respective host cells (Song JM et al., Antiviral Research 2005 68 66-74 and Nance CL. al., J Allergy Clin Immunol 2009 123: 459-65). In the case of Herpes Simplex Virus (type 1 and 2), EGCG would induce viral death by pore creation as a result of binding to envelope glycoproteins (Isaacs CE et al., Antimicrob Agents Chemother 2008 52: 962-70).
  • catechins are described as hepatoprotective especially because of their antioxidant nature. In addition, they are often associated with liver disease treatments. Thus, catechins are described in the treatment of viral hepatitis type B or C as reducing cell necrosis (Patrick L. et al., Altern Med Rev. 1999 Aug; 4 (4): 220-38.) . This effect is independent of the viral infection itself, but reduces the necrotic inflammation of the liver associated with it.
  • Catechins have been proposed for the treatment of diseases involving the immunosuppression route mediated by indoleamine 2,3-dioxygenase (IDO), among which certain cancers, but also viral infections including hepatitis C (WO 20081 15804).
  • IDO indoleamine 2,3-dioxygenase
  • This treatment pathway is therefore nonspecific and indirect since it is an immunomodulation treatment.
  • the prior art also discloses treatment of hepatitis C by the use of an antiviral agent in admixture with a cell proteasome inhibitor.
  • a cell proteasome inhibitor Among all the cell proteasome inhibitors mentioned, EGCG is found.
  • the mechanism of action and advantage of a proteasome inhibitor in this treatment is, however, not described (WO201 1/009961).
  • Catechins are also mentioned in the treatment of hepatitis C in a polymeric form (US 2010/0055065).
  • This polyphenol polymer is described as having antiviral activity by inhibiting the replication of HCV, provided that it contains at least 3 monomers. Many polyphenols are considered as potential monomers and more particularly all catechins.
  • genotype 1b replicon as described by Lohmann et al. Science, 1999 is used by the authors.
  • the invention relates to a compound of fo
  • R1 and R2 are independently of one another a hydrogen atom, a hydroxyl group or a methoxyl group,
  • R3, R5 and R7 are, independently of one another, a hydrogen atom, a hydroxyl group (OH), an O-glycosyl group, a (C1 -C18) alkoxyl or a group of formula (II)
  • R4 and R6 are independently of each other, a hydrogen atom or an OH group
  • R 3 R 5 and R 7 is a group of formula (II) and / or R 1 and R 2 are both hydroxyl groups (OH), or a pharmaceutically acceptable salt or ester thereof, said compound of formula (I) being in the form of a pure stereoisomer or a mixture of enantiomers and / or diastereoisomers, including racemic mixtures, for use as an antiviral agent in the treatment and / or prevention of infection with the hepatitis C virus (HCV).
  • HCV hepatitis C virus
  • a and b are either a single bond or a double bond and a and b are not simultaneously a double bond.
  • &quot refers to compositions, carriers, diluents and reagents which are used interchangeably and can be administered to a mammal. without induction of undesirable physiological effects such as nausea, dizziness, gastric disturbances, etc.
  • salts or esters refers to the relatively non-toxic, inorganic and organic acid addition salts, or esters of the compounds of the present invention, which are generally prepared by reaction of the free acid with a base organic or inorganic. These salts or esters can be prepared in situ during the final isolation and purification of the compounds.
  • the acid addition salts can be prepared by separately reacting the purified compound in its purified form with an organic or inorganic acid and isolating the salt thus formed.
  • acid addition salts are salts of hydrobromide, hydrochloride, sulfate, bisulfate, phosphate, nitrate, acetate, oxalate, valerate, oleate, palmitate, stearate, laurate, borate, benzoate, lactate, phosphate, tosylate, citrate, maleate, fumarate, succinate, tartrate, naphthylate, mesylate, glucoheptanate, lactobionate, sulfamates, malonates, salicylates, propionates, methylenebis-b-hydroxynaphthoates, gentisic acid, isethionates, di-p-toluoyltartrates, methanesulfonates, ethanesulfonates, benzenesulfonates, p -toluenesulfonates, cyclohexyl sulfamates and qu
  • the compound according to the invention is a specific inhibitor of HCV in that within single-stranded RNA viruses, it inhibits a single member of the Flaviviridae family: HCV. Moreover, unlike many anti-HCV viral inhibitors, the compound according to the invention has an effective antiviral effect vis-à-vis all genotypes of HCV and even towards the genotypes most resistant to conventional antivirals. This is the case HCV genotype 1. This makes it an inhibitor of interest.
  • the inventors have shown that among the molecules of the flavonoid family, only the molecules having a 3,4,5-trihydroxy-phenyl group had an antiviral effect on HCV. Thus, the presence of the 3,4,5-trihydroxyphenyl group is essential for the antiviral activity of the compound of the invention.
  • This structure is found in the galloyl group of formula (II) as well as in C2 of the central heterocycle (chromane heterocycle) when R1 and R2 are hydroxyl groups.
  • any one of the groups R 3, R 5 or R 7 is a group of formula (II), and the groups R 1 and R 2 are both OH groups.
  • At least two of the groups R 3, R 5 and R 7 are groups of formula (II).
  • the inventors have demonstrated an additive effect of the 3,4,5-trihydroxyphenyl groups on the antiviral nature of the compounds of formula (I), so that the antiviral effect of a compound of formula (I) comprising two 3,4,5-trihydroxy-phenyl groups is much greater than that of a compound having only one.
  • the compound according to the invention is a compound of formula (I) in which, the groups R 3, R 5 and R 7 are independently of each other, an O-alkyl group selected from the group consisting of an O-methyl group. , O-ethyl or O-propyl.
  • O-glycosyl group one or more carbon chains comprising at least one saccharide, namely a monosaccharide or an oligosaccharide bonded to an OH group of the compound of formula (I), the monosaccharide or the oligosaccharide being capable of be substituted by C1-C6 alkyl groups or by phenolic groups.
  • the O-glycosyl moiety comprises at least one monosaccharide selected from the group consisting of glucose, galactose, rhamnose and arabinose.
  • the glycosyl moiety is selected from the group consisting of a monosaccharide, a disaccharide or a tri-saccharide.
  • the compound according to the invention is aglycan.
  • the invention also relates to a compound of formula (I) in which,
  • X is O when a is a single bond or 0+ when a is a double bond, a and b identical or different being either a single bond or a double bond,
  • the groups R1, R5 and R7 are hydroxyl groups
  • R2 is a hydroxyl group or a hydrogen atom
  • R 3 is a hydroxyl group, a hydrogen atom or a galloyl group of formula (II)
  • R4 ' is a hydrogen atom when a is a single bond or R4' is nothing when a is a double bond
  • R6 is a hydrogen atom
  • the compound according to the invention is a compound of formula
  • R1 and R2 are independently of one another a hydrogen atom, a hydroxyl group or a methoxyl group,
  • R3, R5 and R7 are, independently of one another, a hydrogen atom, an OH group, an O-glycosyl group, a (C1 -C18) alkoxyl or a group of formula (II)
  • the compound is an anthocyanidin or an anthocyanin.
  • the compound according to the invention is a compound of formula (III) in which R1, R2, R3, R5 and R7 are OH groups and R6 is a hydrogen atom.
  • One such compound of formula (III) is delphinidin (3,3 ', 4', 5,5 ', 7-Hexahydroxyflavyliumchloride CAS No. 528-53-0).
  • Delphinidin can be modified by glycosylation on R3, R5 and / or R7 groups. Delphinidin may be in the form of a salt, such as delphinidine chloride.
  • the compound according to the invention is the compound of formula (III) in which R1, R2, R5 and R7 are OH groups and R3 and R6 are hydrogen atoms.
  • a compound of formula (III) is tricetinidine (3 ', 4', 5,5 ', 7-pentahydroxyflavylium chloride, CAS No. 65618-21-5).
  • Tricetinidine can be modified by glycosylation on R3, R5 or R7 groups. Tricetinidine is found in tea and is the degradation product by oxidative degassing of EGCG.
  • the compound according to the invention is the compound of formula (III) in which R1, R2, R3 and R7 are OH groups; R6 is a hydrogen atom, R5 is an O-methyl group.
  • R1, R2, R3 and R7 are OH groups; R6 is a hydrogen atom, R5 is an O-methyl group.
  • One such compound of formula (III) is Pulchelidine (3,7,3 ', 4', 5'-Pentahydroxy-5-methoxyflavylium, CAS RN 19077-86-2.) Pulchelidine may be modified by glycosylation on R3 groups. and R7.
  • the compound according to the invention is a compound of formula
  • R1 and R2 are independently of one another a hydrogen atom, a hydroxyl group or a methoxyl group,
  • R 3 is an OH group, an O-glycosyl group, a (C 1 -C 18) alkoxyl or a group of formula (II)
  • R5 and R7 are, independently of one another, a hydrogen atom, an OH group, an O-glycosyl group, a (C1 -C18) alkoxyl or a group of formula (II),
  • R 6 is a hydrogen atom or an OH group
  • R3, R5 or R7 is a group of formula (II), or R1 and R2 are both OH groups,
  • the compound according to the invention is a flavonol (3-hydroxy-2-phenylchromen-4-one).
  • the compound according to the invention is the compound of formula (IV) in which R1, R2, R3, R5 and R7 are OH groups; R6 is a hydrogen atom.
  • R1, R2, R3, R5 and R7 are OH groups; R6 is a hydrogen atom.
  • One such compound of formula (IV) is Myricetin (or 3,3 ', 4', 5 ', 5,7-hexahydroxy-2-phenylchromen-4-one; CAS529-44-2). Myricetin can be modified by glycoylation especially on the R3 group.
  • the compound according to the invention is a compound of formula
  • R1 and R2 are independently of one another a hydrogen atom, a hydroxyl group or a methoxyl group,
  • R 3 is an OH group, an O-glycosyl group, a (C 1 -C 18) alkoxyl or a group of formula (II)
  • R 5 and R 7 are, independently of one another, a hydrogen atom, an OH group, an O-glycosyl group, a (C 1 -C 18) alkoxyl or a group of formula (II), and
  • R3, R5 or R7 is a group of formula (II), or R1 and R2 are both OH groups,
  • the compound according to the invention is a flavan-3-ol (flavanol or catechin).
  • Catechins are a subfamily of flavonoids whose structure is based on 2-phenyl-3-chromano.
  • the compound according to the invention is the compound of formula (V) in wherein R1, R2, R3, R5 and R7 are OH groups, the compound according to the invention is referred to as (-) - Epigallocatechin (EGC)
  • the compound according to the invention is the compound of formula (V) in which R 1, R 5 and R 7 are OH groups; R2 is a hydrogen atom; R 3 is a galloyl group of formula (II), the compound according to the invention being referred to as (-) - Epicatechin-3-gallate (ECG) ((2R, 3R) -2- (3,4-dihydroxyphenyl) -3, 4-Dihydro-1 (2H) -benzopyran-3,5,7-triol
  • the compound according to the invention is the compound of formula (V) in which R1, R2, R5 and R7 are OH groups; R3 is a galloyl group of formula (II), the compound according to the invention being named (-) - Epigallocatechin-3-Gallate (EGCG) ((2R, 3R) -5,7-dihydroxy-2- (3,4) , 5-trihydroxyphenyl) -3,4-dihydro-2H-chromen-3-yl 3,4,5-trihydroxybenzoate, CAS No.
  • EGCG Epigallocatechin-3-Gallate
  • the compound according to the invention is selected from the group consisting of delphinidin, Myricetin, tricetinidine, Pulchelidine, epigallocatechin (EGC), epigallocatechin gallate (EGCG), gallocatechin (GC), catechin gallate (CG), gallocatechin gallate (GCG), epicatechin gallate (ECG), their pharmaceutically acceptable salts and esters, and mixtures thereof.
  • ECG epigallocatechin
  • EGCG epigallocatechin gallate
  • GC gallocatechin
  • CG catechin gallate
  • GCG gallocatechin gallate
  • ECG epicatechin gallate
  • said compound according to the invention is selected from the group consisting of epigallocatechin (EGC), epigallocatechin gallate (EGCG), gallocatechin (GC), catechin gallate (CG), gallocatechin gallate (GCG ), epicatechin gallate (ECG), pharmaceutically acceptable salts and esters thereof, and mixtures thereof.
  • ECG epigallocatechin
  • EGCG epigallocatechin gallate
  • GC gallocatechin
  • CG catechin gallate
  • GCG gallocatechin gallate
  • GCG gallocatechin gallate
  • ECG epicatechin gallate
  • pharmaceutically acceptable salts and esters thereof and mixtures thereof.
  • said compound according to the invention is epigallocatechin gallate (EGCG) or a pharmaceutically acceptable salt or ester thereof.
  • EGCG epigallocatechin gallate
  • the flavonoid compounds according to the invention being naturally present in plants and in particular in most fruits and vegetables, they can be obtained by purification.
  • catechins may be obtained by extraction of green or black tea by various filtration methods, such as those described in US Pat. No. 6,383,392 or EP 1 077 211.
  • the anthocyanins can also be obtained by purification from plants as described in the state of the art and in particular in the patent applications US 2010041877 or US 2003147980. Such flavonoid compounds are found in commerce.
  • the flavonoid compounds can also be obtained by chemical synthesis by the implementation of methods known to those skilled in the art such as in particular solid phase synthesis processes. Such flavonoid compounds are commercially available.
  • hepatitis C virus or “HCV” must be understood as referring to all the genotypes of the hepatitis C virus, genotypes already described or not described, in particular genotypes numbered from 1 to 6, as well as their different subtypes, more particularly genotypes 1a, 1b, 2a, 2b, 3, 4, 5, and 6.
  • This expression must also be understood as a reference a recombinant or non-recombinant HCV virus capable of infecting a host, such as a target cell of a subject.
  • Target cell (s) or “target cell (s) of HCV
  • host cell (s) or “host cell (s) of HCV” means cells likely to be infected with HCV.
  • the host cell or target cell according to the present invention is the hepatocyte.
  • antiviral agent is used in reference to an agent that is capable of interacting directly with HCV or with one or more of its constituents and induces inhibition of HCV infection by either a decrease or abolition of HCV infection. viral entry, viral replication or pathogenesis or any other event occurring in the host cell or their combinations. This direct action of the antiviral agent is to oppose the indirect action of compounds used in the treatment of HCV infections and acting by stimulation of the immune system for example.
  • HCV infection or "viral infection” in reference to HCV refers to the condition of a subject or patient infected with HCV.
  • HCV infection refers to either asymptomatic or chronic HCV infection, regardless of stage of development. This expression also refers to the entry, replication, or other event or process involved in the pathogenesis of HCV in a host cell.
  • the infection comprises the introduction of an infectious agent, such as a recombinant or non-recombinant HCV virus, capable of infecting a host, such as a cell of a subject.
  • prevention refers to reducing the risk or inhibiting the development of a viral infection.
  • the compound of the invention inhibiting the early stages of infection is particularly advantageous in the prevention of HCV infection.
  • treatment generally refers to the improvement of a sign or symptom of a disease or condition related, for example, to a particular HCV infection. Because of the inhibition of the virus, the stop of its development, the decrease of the viral load of the patient or the eradication of the virus. Thus, reference is made to means for regression, reduction, inhibition of HCV progression, or prevention of HCV infection or one or more symptoms of this infection.
  • Said compound according to the invention is an antiviral agent in particular, by inhibition of the infection of a target cell (such as a hepatocyte cell) with the hepatitis C virus and / or the transmission of the virus of the hepatitis C virus.
  • a target cell such as a hepatocyte cell
  • hepatitis C between two target cells. For example, from an infected hepatocyte cell to an uninfected hepatocyte cell.
  • the compound according to the invention inhibits the two major modes of viral infection, namely, the infection of a healthy target cell (such as an uninfected hepatocyte cell) with the isolated virus and the second mode, viral dissemination. from cell to cell, that is, infection by an infected target cell of a non-infected target cell.
  • This latter mode of transmission is important since it is suspected to be a dominant pathway in vivo for some families of enveloped viruses.
  • said compound is an antiviral agent by inhibiting the entry of the hepatitis C virus.
  • an entry inhibitor may be particularly advantageous in the case of a liver transplantation in order to avoid the transplanted liver infection.
  • the inventors have demonstrated such an inhibition, by the use of a reference study model allowing the expression of glycoproteins of the viral envelope of interest that it is the infectious viral pseudoparticles.
  • the expression "inhibition of viral entry” or “inhibition of the entry of the virus” must be understood as inhibition of the passage of a viral genome from the outside to the inside. of the host cell, whether it is an infection mediated by an individualized virus particle or any other mechanism leading to infection of a non-infected host cell.
  • This expression can also be understood as the inhibition of any of the steps of viral infection prior to the release of the viral genome into the cytoplasm of the host cell.
  • These preliminary steps are: i) the adhesion or attachment of the virus or an infected host cell to the surface of a second host cell (typically an uninfected host cell), ii) the interaction with the (s) ) viral specific receptor (s) and iii) the fusion of the viral lipid envelope, the viral particle with a cell membrane (plasma or endosomal) allowing the introduction of the viral genome into the cytoplasm of the infected cell.
  • the inventors have carried out experiments aimed at splitting the mechanism of the entry of HCV into the host cell in its 3 constituent steps and have thus shown that only the attachment step is inhibited by the compounds of formula (I) such that EGCG, ECG, EGC or Delphinidine.
  • the attachment stage is the earliest stage of the viral entry mechanism.
  • said compound is an antiviral agent by inhibiting HCV surface glycoproteins in their function during the steps of entry of the viral genome into the uninfected host cell. This can be confirmed by pull down or microcalorimetry tests and surface plasmon resonance (Biacore).
  • the compound according to the invention is an antiviral agent by inhibiting the adhesion of the hepatitis C virus, or of a host cell infected with the hepatitis C virus, to the membrane of a host cell uninfected.
  • said compound is an antiviral agent by inhibiting the interaction of HCV surface glycoproteins with at least one target protein of a host cell and more particularly the inhibition of HCV glycoproteins such as E1 and / or E2 glycoproteins.
  • E1 protein Acc No: AAB67037 SEQ ID NO: 1
  • E2 protein Acc No: AAB67037 SEQ ID NO: 2
  • HCV genotype 1a of the E1 protein (Acc No AY734976 SEQ ID NO: 3) or E2 protein (Acc No: AY734976 SEQ ID NO: 4) of genotype 1b HCV
  • E1 protein Acc No: AB047639 SEQ ID NO: 5
  • E2 protein Acc No: AB047639 SEQ ID NO: 6
  • HCV genotype 2b protein
  • inhibiting the interaction of HCV surface glycoproteins or “inhibition of the binding of HCV surface glycoproteins” or “inhibition of the interaction of glycoproteins E1 and / or E2” is meant the inhibition of the specific binding of at least one of the surface glycoproteins of HCV and in particular one of the glycoproteins E1 or E2 with at least one target protein or glycoprotein of a host cell.
  • HCV surface glycoproteins can be found on the surface of a virus particle but can also be attached to the surface of an infected target cell.
  • Binding of the surface glycoproteins of HCV and in particular glycoproteins E1 and / or E2 to the target proteins is carried out during the step of attachment or adhesion of HCV with a target cell, or the step of attachment or adhesion of an infected target cell to another target cell.
  • the "target proteins” or “target proteins of a host cell” are the surface proteins or glycoproteins, namely transmembrane proteins or glycoproteins anchored to the surface of the plasma membrane of host cells. , which proteins are specifically recognized by the surface glycoproteins of HCV and in particular by glycoproteins E1 and / or E2.
  • the glycosaminoglycans of a target cell such as a hepatocyte.
  • the inventors have demonstrated that inhibition by compounds of formula (I) such as EGCG, ECG, EGC or Delphinidine specifically involves glycoproteins E1 and / or E2.
  • the compounds of the invention would inhibit the interaction between HCV E1 and / or E2 proteins and target proteins such as hepatocyte glycosaminoglycans.
  • the inhibitory effect of the viral entry mediated by the compounds of formula (I) such as EGCG, ECG, EGC or Delphinidine directly implicates the glycoproteins of the viral envelope at a conserved area of them.
  • the inventors have shown that the inhibitory effect of the compounds of formula (I) such as EGCG, ECG, EGC or delphinidin was observed on all the HCV viral genotypes namely the genotypes 1a, 1b, 2a, 2b, 3, 4, 5, and 6 indicating that the binding of the molecules according to the invention with glycoproteins E1 and / or E2 takes place in a very conserved zone of the latter .
  • the treatment and / or prevention of infection with the hepatitis C virus is intended for a patient resistant or intolerant to the treatment of an infection with HCV, an immunomodulatory agent and / or by an inhibitor of viral metabolism.
  • HCV genotype 1 is the most refractory to current treatments. He is said to be responsible for 70% of known cases of hepatitis C in the United States, Japan and Western Europe. However, less than 50% of patients obtain a sustained virological response with the current treatment.
  • the compound according to the invention allows the inhibition of the HCV infection of all the described genotypes and more particularly HCV genotype 1 for which it shows a very strong antiviral capacity.
  • inhibitors of viral metabolism includes: i) translation inhibitors including inhibitors of TIRES (Internai Ribosome Entry Site), ribozymes or SiRNA; ii) protein processing inhibitors such as protease inhibitors (NS3 / NS4a proteases), iii) inhibitors of viral genome replication including inhibitors of the binding between viral RNA and RNA polymerase or inhibitors NS5B polymerase that may be nucleoside or non-nucleoside inhibitors or helicase inhibitors; vi) inhibitors of viral assembly such as glycosylation inhibitors.
  • TIRES Internai Ribosome Entry Site
  • NS3 / NS4a proteases protease inhibitors
  • inhibitors of viral genome replication including inhibitors of the binding between viral RNA and RNA polymerase or inhibitors NS5B polymerase that may be nucleoside or non-nucleoside inhibitors or helicase inhibitors
  • inhibitors of viral assembly such as glycosylation inhibitors
  • the second group of inhibitors includes the "inhibitors of viral entry" in the hepatocyte.
  • immunomodulatory agents molecules of synthetic or natural origin which make it possible to initiate or potentiate the immune response of mammals during of a viral infection.
  • immunomodulatory agents include interferons type 1 (such as interferons alpha (IFN- ⁇ ), beta (IFN- ⁇ ) or omega (IFN- ⁇ )), interferons type 2 (such as interferon gamma IFN- ⁇ ) and pegylated interferons.
  • the compound according to the invention is co-administered with an additional agent for treating and / or preventing an infection with HCV.
  • Said additional agent is preferably a viral inhibitor as defined above.
  • the additional agent is an immunomodulatory agent or an inhibitor of the viral metabolism of HCV.
  • said compound is the only antiviral agent administered for the treatment and / or prevention of infection with the hepatitis C virus.
  • said compound is formulated in the form of a pharmaceutical composition.
  • said pharmaceutical composition contains a pharmaceutically acceptable vehicle and the compound according to the invention.
  • pharmaceutically acceptable carrier any solvent, dispersion medium, retarding agent, etc., which does not produce a side reaction, for example allergic, in humans or animals.
  • pharmaceutically acceptable carriers are well known to those skilled in the art, and include those described in
  • the pharmaceutically acceptable vehicle is in particular chosen according to the route of administration, which may for example be oral, sub-lingual, nasal, oral, transdermal, intravenous, subcutaneous, intramuscular and / or rectal.
  • the dose depends on factors such as the active principle considered, the mode of administration, the therapeutic indication, the age, the weight and the state of the patient.
  • the invention also relates to a method of treating or preventing an HCV infection, comprising administering to an individual in need of a therapeutically effective amount of a compound of formula (I) pharmaceutically acceptable salts and esters thereof or mixtures thereof, said compound of formula (I) being in the form of a pure stereoisomer or in the form of a mixture of enantiomers and / or diastereoisomers, including racemic mixtures, preferentially, said compound of Formula (I) is selected from the group consisting of delphinidin, Myricetin, tricetinidine, Pulchelidine, epigallocatechin (EGC), epigallocatechin gallate (EGCG), gallocatechin (GC), catechin gallate (CG) gallocatechin gallate (GCG), epicatechin gallate (ECG), their pharmaceutically acceptable salts and esters, and mixtures thereof.
  • the individual is preferably a mammal, more particularly a human.
  • the effective therapeutic dose can easily be determined by those skilled in the art.
  • terapéuticaally effective amount or "effective therapeutic dose” as used herein means the amount of antiviral agents such as flavonoid compounds of formula (I) or their derivatives causing a biological or medical response in a tissue, system animal or human biologic that includes the relief of symptoms of HCV infection including inhibition of the virus, stopping its development, decreasing the viral load of the patient or the eradication of the virus.
  • a therapeutically effective amount may also be considered a “prophylactic amount” of active agents.
  • patient or “patient in need” are intended for a human or non-human mammal that is affected or likely to be affected by HCV.
  • the patient is a human being.
  • the patient is a chimpanzee.
  • the subject of the invention also relates to a preferentially ex vivo method of reducing the infectivity or inactivation of a hepatitis C virus (HCV) comprising a step of contacting said hepatitis virus C with a compound of formula (I):
  • R1 and R2 are independently of one another a hydrogen atom, a hydroxyl group or a methoxyl group,
  • R3, R5 and R7 are independently of each other, a hydrogen atom, an OH group, an O-glycosyl group, a (C 1 -C 18) alkoxyl or a group of formula (II):
  • R4 and R6 are independently of each other, a hydrogen atom or an OH group
  • R3, R5 and R7 is a group of formula (II) and / or R1 and R2 are both OH groups
  • HCV is contacted with the compound of formula (I) for a time and under conditions sufficient to achieve inactivation or inhibition of partial or complete virus.
  • the HCV is brought into contact with the compound of formula (I) before or during the infection step.
  • the infection step is the step of bringing the virus into contact with its target cell (s).
  • infectiousness is meant the infectious nature of the virus, namely the capacity of the virus to cause a viral infection within the meaning of the present invention, in particular the reduction of the capacity of the virus to enter a target cell preferentially, the reduction of its ability to attach to a target cell.
  • the ex vivo method according to the invention can be implemented by bringing into contact a sample capable of comprising a HCV and a compound of formula (I) in a liquid or semi-liquid medium, the compound of formula (I) being preferentially applied at a concentration of 0.5 to 100 ⁇ l, advantageously at a concentration of 10 to 80 ⁇ or even 20 to 70 ⁇ .
  • the compound of formula (I) is applied at a concentration of 50 ⁇ .
  • the method can be carried out at a temperature of 4 to 37 ° C, preferably 4 to 10 ° C or 20 to 37 ° C.
  • the compound according to the invention can be brought into contact with said virus for 15 to 90 minutes, preferably 30 to 45 minutes.
  • said hepatitis C virus is present in a biological sample.
  • biological sample refers to a sample of biological origin or taken from a biological organism such as an organ, a tissue, a cell, a population of cells, a biological fluid, a protein or a purified peptide.
  • a biological organism such as an organ, a tissue, a cell, a population of cells, a biological fluid, a protein or a purified peptide.
  • liquid samples of biological origin such as blood, plasma, serum, cerebrospinal fluid, lymph or cell lysates
  • solid samples such as organs intended especially for transplantation or tissues or cell cultures that may be intended for transplantation.
  • the ex vivo method of reducing the infectivity or inactivation of HCV according to the invention comprises an additional step of washing the biological sample. This step allows the reduction or elimination of the compound of formula (I) of said biological sample.
  • the washing step may be preceded by a step of incubating the compound mixture of formula (I) in said biological sample.
  • the ex vivo method according to the invention may also comprise an additional step of controlling the infectivity of a biological sample.
  • a step may be considered before the step of contacting the compound of formula (I) with the biological sample or after contacting; to determine if another cycle of contacting the biological sample with the compound of formula (I) is to be considered.
  • Such a control step can be carried out by any means allowing in particular, a rapid detection of an infection with HCV.
  • a detection of a specific marker of HCV can be carried out, for example by the use of an antibody specific for a viral protein or by a PCR detection of the HCV RNA.
  • Figure 1 Illustration of the relative viral infection of Huh7 cells by the JFH1 -RLuc virus as a function of the presence of (+) - catechin (C), (-) - epicatechin (EC), (-) - epicatechin-3 -gallate (ECG), (-) - epigallocatechin (EGC) and (-) - epigallocatechin-3-gallate marketed by EXTRASYNTHESE® (EGCG EXTRASYNTHESE®) or by CALBIOCHEM® (CALBIOCHEM® EGCG) at 50 ⁇ or DMSO.
  • EXTRASYNTHESE® EGCG EXTRASYNTHESE®
  • CALBIOCHEM® CALBIOCHEM®
  • Figure 2 Illustration of the relative viral infection of Huh-7 cells by the JFHI -RLuc virus as a function of the concentration of the medium in EGCG (0, 0.5, 5, 50 ⁇ ) during infection or pretreatment of 50 ⁇ C of EGCG virus before the infection stage.
  • FIG. 3 Illustration of the relative viral infection of Huh-7 cells infected with infectious viral pseudoparticles (VHCpp) expressing on their surface the envelope proteins E1 and E2 of the HCV virus genotypes 1a, 1b, 2a, 2b , 3, 4, 5, or 6 or infected with VSV pseudoparticles expressing VSV envelope protein (VSVpp) depending on the presence of EGCG (50 ⁇ ) or DMSO in the infection medium.
  • VHCpp infectious viral pseudoparticles
  • Figure 4 Illustration of the relative viral infection of Huh-7 cells infected with yellow fever virus (YFV) or Sindbis virus (SINV) or MDBK cells infected with bovine diarrhea virus (BVDV) as a function of the presence of EGCG (50 ⁇ l) or DMSO in the medium of infection.
  • YFV yellow fever virus
  • SIDV Sindbis virus
  • BVDV bovine diarrhea virus
  • FIG. 5 Illustration of the number of cells per infectious focus of the viral infection of Huh-7 cells by the JFH1 virus, with or without EGCG (at 50 ⁇ M).
  • Figure 6 Illustration of the percentage of cells infected by the cell supernatants at the P0 to P4 passages depending on whether the infection medium was treated with DMSO or EGCG.
  • Figure 7 A Diagram illustrating the experimental conditions for the study of the inhibitory effect of EGCG on the entry of HCV (sample 5) and more particularly on the attachment steps (sample 2), d interaction with host cell receptors (sample 3) and the endocytosis and fusion stage of viral and cell membranes (sample 4), with DMSO being used as a control (sample 1).
  • Figure 7B Illustration of the relative viral infection of Huh7 cells by JFH1 -RLuc virus according to the presence of DMSO or EGCG (at 50 ⁇ ) in samples 1 to 5.
  • Figure 8 Illustration of the relative viral infection of Huh7 cells by the HCVVV virus as a function of the presence of EGCG or delphinidin (at increasing concentrations). This graph shows a representative experience of 3 independently performed experiments.
  • Figure 9 Illustration of the relative viral attachment of Huh7 cells by the HCVV virus according to the presence of DMSO, 50 ⁇ of EGCG, 50 ⁇ l of delphinidine chloride or 500 g of heparin. relative attachment is expressed as a percentage of the control (DMSO) for which a value of 100% has been arbitrarily assigned.
  • Dulbecco's Modified Medium's DMG Medium (GIBCO®), Dulbecco's Essential Minimum Medium (GIBCO®), phosphate buffered saline (PBS), reduced serum (OptiMEM® from GIBCO®), L-alanyl-L-glutamine (GLUTAMAX-I TM), goat serum, horse serum, and fetal calf serum (FCS) are products marketed by Invitrogen. 4 ', 6-Diamidino-2-phenylindole (DAPI) was obtained from MOLECULAR PROBES®.
  • DAPI 6-Diamidino-2-phenylindole
  • (-) - Epigallocatechine Gallate (EGCG CALBIOCHEM®) and polyvinyl alcohol (MOWIOL® 3-88) are marketed by CALBIOCHEM®.
  • the ExGen500® in vivo transfection reagent is marketed by EUROMEDEX®.
  • (-) - catechin, (-) - epicatechin, (-) - epicatechin - 3 - gallate (ECG), (-) - epigallocatechin (EGC), and (-) - epigallocatechin - 3 - gallate ( EGCG Extrasynthesis®) are sold by Extrasyn lectur® (Lyon, France). Delphinidin chloride is produced by Extrasynthesis (Lyon, France).
  • the other reagents were marketed by SIGMA®.
  • mouse monoclonal antibodies directed against the proteins of the envelope (E) of the yellow fever virus (YFV) referenced MAb 2D12 (ATCC CRL-1689) and the mouse monoclonal antibodies directed against the NS3 protein of the virus bovine viral diarrhea (anti-BVDV) referenced NS3 MAb Osc-23 (Boulanger, D., et al., J. Gen. Virol., 1991. 7: pp. 1195-1198) were produced in vitro using the MiniPerm® device (HERAEUS®) according to the manufacturer's recommendations.
  • the anti-CD81 mouse monoclonal antibodies referenced MAb 5A6 Oren, R., et al., Mol Cell Biol, 1990.
  • the Huh-7 hepatic cell line (Nakabayashi, H. et al., Cancer Res, 1982. 42 (9) p3858-63) as well as HEK 293T cells were cultured in DMEM medium (Invitrogen®) supplemented with L-alanyl-L-glutamine (GLUTAMAX-I TM) and 10% fetal calf serum.
  • Bovine kidney cells of Madin-Darby (Madin-Darby Bovine Kidney MDBK) were cultured in DMEM supplemented with L-alanyl-L-glutamine (GLUTAMAX-I TM) supplemented with 10% horse serum.
  • the BHK-21 cells were cultured in MEM medium (Invitrogen®) supplemented with L-alanyl-L-glutamine (GLUTAMAX-I TM) and 10% fetal calf serum.
  • the modified version of the plasmid encoding the genome of JFH1 isolate was kindly provided by MT Wakita (National Institute of Infectious Diseases, Tokyo, Japan) (Wakita, T., and al., Nat Med, 2005. 11 (7): 791-6.).
  • the modified JFH1 viral clone contains mutations leading to the following amino acid changes F172C, P173S and N534K that have been shown to induce an increase in viral load (Deigrange, D., et al., J Gen Virol, 2007. 88 (Pt 9): pp. 2495-503.).
  • E1 sequence encoding residues 196TSSSYMVTNDC was modified to reconstitute the A4 epitope (SSGLYHVTNDC) of the HCV glycoprotein E1 (Dubuisson, J., et al., J. Virol, 1994. 68 (10): pp. 6147-60.) as described in the state of the art (Goueslain, L., et al., J. Virol, 2010. 84 (2): 773-87).
  • the JFH-Luc plasmid contains the Renilla reniformis luciferase gene (RLuc) as a reporter gene and the JFH- ⁇ E2-Luc plasmid contains a deletion that does not cause a reading shift in the E1 E2 region (Wakita, T., et al., Nat Med, 2005. 11 (7): 791-6), as described in the prior art (Goueslain, L., et al., J. Virol, 2010. 84 (2)). : pp. 773-87 and Rocha-Perugini, V., et al., PLoS ONE, 2008. 3 (4): pp. e1866).
  • RLuc Renilla reniformis luciferase gene
  • the plasmids are linearized at the 3 'end of the HCV cDNA by cleavage at the XbaI restriction site. Following the Mungo bean nuclease treatment, the linear DNA is then used as a template for in vitro transcription with the MEGAscript® kit marketed by AMBION®. RNA transcribed in vitro is transfected by electroporation into Huh-7 cells as described in the prior art (Kato, T., et al., Gastroenterology, 2003. 125 (6): 1808-17). The viral extracts were obtained as described in the prior art (Deigrange, D., et al., J Gen Virol, 2007. 88 (Pt 9): pp. 2495-503).
  • Huh-7 cells are in culture in 24-well plates, in which the infection is carried out for 2 hours at 37 ° C.
  • the viruses are preincubated in the presence of EGCG for 45 min before infection and / or EGCG is added during infection with the culture medium until the end of the reaction, unless otherwise stated.
  • EGCG is added after the infection stage for various times (24, 48 or 72 hours post-infection).
  • the infection rate is evaluated by measuring the luciferase activity 48 hours after the infection stage in the cell lysates, by the use of the Renilla luciferase assay System kit marketed by PROMEGA® or by immunofluorescence with the anti-antibodies. -E1 (A4) at 48 hours or 72 hours after infection.
  • genotype 1a-H77 AAB67037 with a mutation at the level of 3 amino acids: R564C, V566A, G650E
  • R564C, V566A, G650E The plasmid of genotype 1a-H77 (AAB67037 with a mutation at the level of 3 amino acids: R564C, V566A, G650E) has been described in the prior art (Bartosch, B., J. Dubuisson, and FL Cosset, J. Exp. Med., 197 (5): 633-42.)
  • genotype 2a-JFH-1 was kindly provided by R. Bartenschlager (University of Heidelberg, Germany).
  • VSV G vesicular stomatitis virus G protein
  • VSVpp murine leukemia virus
  • BVDV bovine viral diarrhea virus
  • YFV yellow fever virus
  • the infected cells as well as the control cells are rinsed in PBS buffer and then fixed with 3% paraformaldehyde, in order to undergo immunofluorescent staining with anti-NS3 MAb (osc-23) antibodies.
  • Huh-7 cells were seeded on plates of a 24-well plate and then infected 24 hours later. The cells were infected in the presence of EGCG for 1 hour at 37 ° C with YFV virus and at an M1 of about 1, and then cultured for 23 h.
  • the infected cells as well as the control cells are rinsed in PBS buffer, fixed with 3% paraformaldehyde.
  • the immunofluorescence reaction is performed with an anti-E MAb 2D12 antibody.
  • RNA BHK-21 cells were obtained by electroporation of in vitro transcribed RNA BHK-21 cells. Briefly, 1 g of RNA is mixed with 4 x 10 6 BHK-21 cells followed by an electroporation step at 25 ⁇ and 140 V with a rectangular wave electroporator. The supernatant is recovered after 48 hours.
  • the procedure for detecting immunofluorescent viral proteins expressed in infected cells is carried out as described in the literature (Rust, Y., et al., J. Virol, 2006. 80 (6): pp. 2832-41.).
  • the nuclei are stained by a 5-min incubation in PBS buffer containing 1 ⁇ g / ml of 4 ', 6'-diamidino-2-phenylindole (DAPI).
  • the slides were mounted on glass slides using the Mowiol® mounting medium (10% Mowiol, 25% glycerol, 0.1M Tris-HCl pH 8.5) and then observed using the ZEISS® AXIOPHOT fluorescence microscope equipped with a magnification of 10x and 20 ⁇ , numerical aperture objectives of 0.5.
  • the fluorescence signal is collected with a Coolsnap ES (Photometrix) camera specifically using excitation and emission filters. fluorescence. Images are assembled and processed using Adobe Photoshop® software. Concerning the quantization step, images of areas of each strip taken at random are recorded.
  • Cells labeled with anti-E1 MAb A4, anti-BVDV NS3 or anti-YFV E antibodies are counted as infected cells. The total number of cells was counted by nuclear tagging at DAPI. Infections are defined as the ratios of infected cells to the total number of cells.
  • Huh-7 cells cultured in 24-well plates are infected with HCVcc for 2 hours.
  • the inocula is removed and replaced with DMEM supplemented with GLUTAMAX®, 10% FCS and 1% low-melting agarose gel (SeaPlaque® Agarose marketed by LONZA®) containing EGCG. (50 ⁇ l) or an equivalent volume of dimethyl sulfoxide (DMSO) as a control.
  • the cells are incubated at 37 ° C. for 3 days at the end of which the agarose is eliminated and the infectious foci are detected using indirect immunofluorescence for the HCV E1 proteins as previously described.
  • Huh-7 cells were infected with JFH-Luc viruses for 1 h at 4 ° C (attachment / binding step) in the presence of DMSO or 50 ⁇ l of EGCG.
  • the cells were washed with PBS and again incubated for 1 h at 4 ° C (post-attachment / receptor binding step of the host cell) in the presence of DMSO or 50 ⁇ l EGCG.
  • the cells are then washed in order to eliminate EGCG or DMSO and then incubated for 1 hour at 37 ° C. in the presence of DMSO or 50 ⁇ l of EGCG (endocytosis / melting step).
  • the cells are washed and then cultured with DMEM medium (Invitrogen®) supplemented with L-alanyl-L-glutamine (GLUTAMAX-I TM) and 10% fetal calf serum at 37 ° C. for 48 h.
  • DMEM medium Invitrogen®
  • L-alanyl-L-glutamine GLUTAMAX-I TM
  • 10% fetal calf serum 37 ° C. for 48 h.
  • the level of infection is calculated by measuring the luciferase activity in cell lysates using the Renilla luciferase assay System kit marketed by PROMEGA®.
  • HCVcc virus was mass produced and purified by concentration and iodixanol gradient separation. Infected cell supernatants were precipitated with 8% PEG 6000 at 4 ° C overnight and centrifuged for 25 min at room temperature. 10,000 rpm. The pellets were resuspended in 1 mL of PBS, loaded on a continuous gradient of iodixanol (10-40%), and centrifuged at 36,000 rpm for 16 h at 4 ° C. Fractions of 500 ⁇ were collected and the title of each fraction was determined. The most infectious fractions were collected to carry out the experiments.
  • EGCG 50 ⁇ l
  • delphinidine chloride 50 ⁇ l
  • porcine intestinal heparin 500 ⁇ g / ml.
  • the total (cellular and viral) RNAs were extracted using the NucleoSpin RNA II kit (Macherey-Nagel, Duren, Germany) and the quantified HCV RNA by quantitative RT-PCR (Castelain et al. ., J Clin Virol 2004). Heparin was used in parallel as a control.
  • Huh-7 cells were infected with JFH1-Rluc virus for 2 h in the presence of DMSO or 50 ⁇ l of different catechins, namely: (+) - catechin (C), (-) - epicatechin (EC), (-) - epicatechin-3-gallate (ECG), (-) - epigallocatechin (EGC) and (-) - epigallocatechin-3-gallate marketed by EXTRASYNTHESE® (EGCG EXTRASYNTHESE®) or CALBIOCHEM® (CALBIOCHEM EGCG) ®). These EGCG compositions differ in their degree of purity EXTRASYNTHESE®> 99%, CALBIOCHEM®> 95%. Since DMSO is used as a solvent for the various catechins, it serves as control tests.
  • DMSO is used as a solvent for the various catechins, it serves as control tests.
  • ECG epicatechin-3-gallate ECG
  • EGCG epigallocatechin-3-gallate
  • the EGCG that it is marketed by CALBIOCHEM® or by EXTRASYNTHESE® shows a major antiviral effect with an inhibition of viral infection greater than 95%.
  • Concerning the ECG and EGC molecules, an antiviral effect is also observed, nevertheless, with a lower viral infection inhibition rate, of the order of about 40% and 80%, respectively.
  • Huh-7 cells cultured in vitro were infected for 2 hours with JFH1 -RLuc virus in the presence of increasing doses of EGCG (0; 0.5; 5; 50 ⁇ ) or by the virus previously incubated for 45 minutes with EGCG (50 ⁇ ). After infection, the cells are washed with DMEM culture medium supplemented with 10% fetal calf serum and incubated in this same medium. Forty-eight hours after infection, the cells are lysed and the Renilla luciferase activity is quantified by luminometer after incubation of 20 ⁇ l of cell lysate with the substrate of luciferase.
  • Figure 2 shows that the inhibition of viral infection by EGCG is dose dependent.
  • IC 50 5 ⁇ M
  • viral replication is not affected by EGCG (results not shown).
  • EGCG inhibits the early stages of viral infection, namely, the steps allowing the entry of the virus into the cell.
  • Proteins in the viral envelope play a major role in viral entry. In fact, in addition to allowing interaction with the host cell receptor (s), these proteins make it possible to induce fusion between the viral and cellular envelopes.
  • a reference study model was used to express glycoproteins of the viral envelope of interest: these are the infectious viral pseudoparticles.
  • VHCpp Infectious viral pseudoparticles
  • VSVpp VSV virus expressing VSV envelope protein
  • Huh-7 cells were infected for 2 hours by the VHCpp pseudoparticles of the different genotypes tested or by the VSVpp pseudoparticles in the presence of 50 ⁇ M EGCG or DMSO. Since DMSO is the solvent for EGCG, it is used as a control. At forty-eight hours post-infection, the cells are lysed and the luciferase activity is quantified by luminometer after incubation of 20 ⁇ l of cell lysate with the substrate of luciferase.
  • the inhibitory effect of EGCG directly involves the glycoproteins of the viral envelope.
  • the inhibition of EGCG-mediated viral entry is either due to an inhibition of the attachment step ie the first interactions with the (s) cell receptor (s) host is an inhibition of the fusion step between the viral and cellular envelopes, or these two steps.
  • EGCG is an effective antiviral of HCV whatever the genotype tested.
  • a VSVpp infection induces the measurement of a relative infection of 85% in the presence of EGCG
  • infection with HCVpp whatever the genotype involved, induces the measurement of a relative infection between 13 and 0%. in the presence of EGCG.
  • Example 2 demonstrates the antiviral character of EGCG against HCV regardless of its genotype. Example 2 further demonstrates that this effect is specific for HCV since EGCG does not inhibit VSV infection. While HCV is a single-stranded positive-strand RNA virus, VSV is an unsegmented negative-sense RNA virus.
  • the yellow fever virus (YFV), the Sindbis virus (SINV) and the bovine diarrhea virus (BVDV) were tested. Infections are performed either in the presence of DMSO or EGCG at 50 ⁇ .
  • the cells infected by these different viruses were Huh-7 for YFV or SINV and MDBK cells for BVDV.
  • the quantification of the infection was carried out by immunofluorescence after labeling the infected cells with an anti-E antibody (2D12) for the YFV virus or an anti-NS3 antibody (osc23) for the BVDV virus. A revelation step with a secondary antibody labeled with Cy3 is then performed.
  • EGCG is not an antiviral for other members of the family Flaviviridae.
  • the antiviral effect of EGCG is therefore specific to HCV.
  • EGCG inhibits the entry of the virus into cells in culture.
  • a second mode of viral infection is the transmission of the cell-to-cell virus.
  • Huh-7 cells were infected with JFH1 virus for 2 hours, then incubated in medium containing 1% agarose in the presence or absence of EGCG (at 50 ⁇ ). The agarose avoids the infection of the cells with the virus secreted in the medium and thus makes it possible to visualize the transmission of the cell-cell virus by contacting the cells with each other.
  • the cells are fixed and the infection is detected by immunofluorescence after labeling with an anti-E1 antibody.
  • a revelation step is then performed with a secondary antibody coupled to Cy3.
  • the nuclei are stained with DAPI markings.
  • the number of cells per infectious focus is quantified ( Figure 5).
  • the infectious foci are much smaller. They contain on average 3-4 infected cells showing that the virus did not spread after infecting a cell. In contrast, control foci contain an average of 45 infected cells.
  • EGCG is an inhibitor of cell-to-cell HCV virus propagation.
  • EGCG appears to be a good antiviral candidate for preventing re-infection of a healthy liver after transplantation in an infected patient.
  • the entry of HCV into the host cell is composed of 3 steps: i) attachment of the virus or an infected host cell to the surface of the uninfected host cell, ii) interaction with the receptor (s) ( s) specific viral and iii) fusion of the viral lipid envelope and the infected host cell (plasma or endosomal membrane) allowing the introduction of the viral genome into the cytoplasm of the infected cell.
  • the viral entry was fractionated so as to separately study the inhibitory effect of EGCG on each of these steps (see Figure 7 A).
  • the step of attaching the viral particles to the cells is carried out by placing the virus in the presence of the virus followed by incubation for one hour at 4 °.
  • the second step is by incubating the cells for one hour at 4 ° C after removal of viral inocula, allowing the attached viruses to enhance their attachment to their receptors.
  • the process of endocytosis is blocked.
  • the third stage of endocytosis and fusion of the viral and cellular membranes is carried out at 37 ° C. for one hour.
  • sample 1 is the control sample that received DMSO in the first step.
  • sample 2 is the control sample that received DMSO in the first step.
  • sample 3 interaction with the receptors of the host cell
  • endocytosis and fusion of the viral lipid envelope and the infected host cell
  • sample 5 during all three stages of entry
  • the cells are then incubated for 45 hours at 37 ° C. and then lysed in order to quantify the luciferase activity. Infection is expressed as a percentage of luciferase activity measured without EGCG.
  • the experiments are performed in triplicate and the values given correspond to the average values of these three different experiments.
  • EGCG As shown in FIG. 7B, a sharp reduction in infection is observed when EGCG is added as early as the attachment step (samples 2 and 5). On the other hand, EGCG does not seem to have any effect on the interaction stage with the host cell receptors (sample 3) or during the endocytosis or fusion step (sample 4). All of these results demonstrate that EGCG inhibits the early steps of HCV binding to the plasma membrane of the host cell to the stage of attachment of HCV to the host cell.
  • Huh-7 cells were infected with HCVcc for 2h in the presence of increasing doses of EGCG or delphinidine chloride.
  • the infection rate was determined 34 h after inoculation by detecting the E1 envelope protein by immunofluorescence using an anti-E1 antibody (A4) and then a secondary anti-mouse IgG antibody conjugated to the fluorochrome Cy3.
  • A4 anti-E1 antibody
  • This experiment shows that delphinidin chloride, like EGCG, inhibits cell infection by HCVcc in a dose-dependent manner (Fig 8).
  • the concentration inhibiting 50% of the infection (IC50) was determined in these experiments.
  • the calculated IC50 of EGCG is about 1 1 ⁇ while that of delphinidin chloride is about 3.5 ⁇ .
  • Example 3 demonstrates that EGCG inhibits an early step of HCV entry into cells mediated by HCV surface glycoproteins.
  • Heparin a known inhibitor of HCV attachment at the cell surface, has been used as a positive control.
  • the cells were incubated with purified HCVc at a multiplicity of infection for 1 hour at 4 ° C in the presence of DMSO, 50 ⁇ l of EGCG, 50 ⁇ l of delphinidine chloride or 500 ⁇ l / ml of heparin.
  • the cells were washed 3 times with cold PBS and the total RNA extracted. The amount of fixed virus was determined by quantifying the viral genomic RNA by quantitative RT-PCR.

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Abstract

La présente invention est relative à un composé flavonoïde de formule I dans laquelle au moins un des R3, R5 ou R7 est un groupement de formule II, ou R1 et R2 sont l'un et l'autre des groupements OH, ou un de ses sels ou esters pharmaceutiquement acceptables, pour une utilisation comme agent antiviral dans le traitement et/ou la prévention d'une infection par le virus de l'hépatite C (VHC). L'invention porte également sur une méthode ex vivo de réduction de l'infectiosité ou d'inactivation du VHC comprenant une étape de mise en contact dudit virus de l'hépatite C avec un composé de formule (I).

Description

Utilisation de l'epigallocatechine gallate comme agent antiviral contre les infections par le virus de l'hépatite C
L'invention concerne un composé flavonoïde ou un de ses sels ou esters pharmaceutiquement acceptables pour une utilisation comme agent antiviral dans le traitement et/ou la prévention d'une infection par le virus de l'hépatite C (VHC). L'invention concerne également, une méthode d'inactivation in vitro du VHC comprenant une étape de mise en contact dudit VHC avec un composé flavonoïde ou un de ses sels ou esters pharmaceutiquement acceptables.
L'Hépatite C virale est une cause majeure de maladie chronique du foie qui touche environ 3 % de la population mondiale. Les patients infectés ont un risque élevé de développer une cirrhose ou un carcinome hépatocellulaire nécessitant un recours à la greffe de foie.
Le VHC est un virus à ARN monocaténaire linéaire de polarité positive appartenant à la famille des Flaviviridae dans le genre Hepacivirus. Ce virus est le seul membre connu du genre des Hepacivirus.
Il y a six principaux génotypes du VHC et plus de 50 sous-types qui sont différemment répartis géographiquement. A titre indicatif, le génotype 1 du VHC est prédominant en Europe et aux Etats-Unis, le génotype 4 au Moyen-Orient et en Afrique. La grande hétérogénéité génétique du VHC liée à la forte propension du virus à muter, a d'importantes implications cliniques et diagnostiques et peut expliquer les difficultés dans le développement de vaccins et l'absence de réponse aux traitements actuels.
En effet, les traitements de référence, à savoir, une combinaison d'interféron (IFN) alpha pégylée (peginterféron alfa) et d'un antiviral tel que la ribavirine, sont non spécifiques et d'efficacité modérée. Ainsi, une rémission est observée dans 40 à 80% des cas de patients infectés suivant le génotype viral concerné, le génotype 1 étant celui le plus résistant aux traitements. A côté d'une efficacité limitée, ce traitement combiné comporte des effets secondaires importants. Les effets indésirables les plus fréquemment observés d'une thérapie IFN sont des symptômes pseudo-grippaux tels que la fièvre, les douleurs musculaires ou articulaires ou la perte de poids. En outre, des effets secondaires neuropsychiatriques, y compris des sautes d'humeur voire des psychoses d'idées suicidaires sont décrits. L'interféron pégylé peut également induire des maladies auto-immunes voire peut aggraver des troubles auto-immuns préexistants. Un effet secondaire fréquemment observé avec la ribavirine est l'anémie, notamment l'anémie hémolytique, ce qui nécessite un contrôle continu des paramètres sanguins pendant la durée du traitement.
Ces différents effets indésirables sont une raison majeure de refus de ce traitement par les patients. Il y a donc un besoin de traitements plus efficaces, pratiques et mieux tolérés.
Une large majorité des antiviraux anti-VHC développés dans l'art antérieur sont dépendants du génotype viral, voire du sous-type viral. Tel est le cas des inhibiteurs du métabolisme viral spécifiques des protéases ou des polymérases virales. Il y a donc également un besoin d'inhibiteurs indépendant du génotype viral du VHC.
Afin de résoudre ces problèmes de l'art antérieur, les inventeurs ont montré que les flavonoïdes contenant un groupement 3,4,5-trihydroxy-phényl de formule
Figure imgf000003_0001
et plus particulièrement certaines catéchines, avaient un effet antiviral spécifique du VHC indépendamment de son génotype viral.
Les composés flavonoïdes sont naturellement présents dans les végétaux et notamment dans la plupart des fruits et légumes. Ils sont responsables de la couleur variée des fleurs et des fruits et représentent une source importante d'antioxydants dans l'alimentation. Ils forment une sous-classe des polyphénols. De nombreux composés flavonoïdes possèdent des vertus thérapeutiques et sont très connus pour leur excellent potentiel d'inhibition des processus d'angiogenèse et de formation de métastases. Parmi les flavonoïdes et plus particulièrement parmi les 3-hydroxyflavonoïdes, on distingue les sous-classes des flavonols, des anthocyanes, des leucoanthocyanes et des catéchines. Les catéchines sont les composés flavonoïdes les plus étudiés.
Les catéchines, leurs dérivés, voire leurs produits de dégradation, possèdent de multiples propriétés thérapeutiques. Leurs effets thérapeutiques sont largement décrits que ce soit sous la forme d'une catéchine isolée que sous la forme d'extraits de thé vert duquel elles sont majoritairement issues. On peut citer à titre indicatif, la catéchine, l'(-)-épicatéchine (EC) ; l'(-)-épigallocatéchine (EGC), l'(-)-épicatéchine-3-gallate (ECG) ou l'épigallocatéchine-3-gallate (EGCG). C'est ainsi que les catéchines sont décrites comme ayant un effet préventif sur l'obésité ou sur les maladies cardiovasculaires telles que l'athérosclérose. Elles sont décrites également comme ayant un effet antioxydant, anticarcinogène, antibactérien ou antiviral (Khan N.et al., Life Sci. 200781, 19-33.). Les modes d'action de ces catéchines sont divers. Ainsi, leur anti-carcinogénicité dans le cas du cancer du sein ou de la prostate, serait lié à un effet cytotoxique de l'EGCG sur les cellules cancéreuses (Stuart EC.et al., Life Sci. 2006, 79: 2329-36). L'effet antiviral des catéchines passerait par différentes voies métaboliques. Dans le cas du virus de l'influenza ou de l'hépatite B, l'EGCG et/ou l'ECG inhiberaient la réplication virale et/ou la transcription (Song J-M et al., Antiviral Research 2005 68 66-74 ; Xu et al., 2007). Concernant les virus de l'influenza ou de Nmmunodéficience Humaine sous type 1 (VIH-1 ), l'EGCG inhiberait la liaison à leurs cellules hôtes respectives (Song J-M et al., Antiviral Research 2005 68 66-74 et Nance CL. et al., J Allergy Clin Immunol. 2009 123:459-65). Dans le cas du Virus de l'Herpès Simplex (type 1 et 2), l'EGCG induirait la mort virale par création de pores à la suite d'une liaison aux glycoprotéines de l'enveloppe (Isaacs CE. et al., Antimicrob Agents Chemother. 2008 52 :962-70).
Au niveau hépatique, les catéchines sont décrites comme hépato-protectrices notamment du fait de leur caractère antioxydant. En outre, elles sont souvent associées aux traitements des maladies hépatiques. C'est ainsi que les catéchines sont décrites dans les traitements des hépatites virales de type B ou C comme réduisant la nécrose cellulaire (Patrick L.et al., Altern Med Rev. 1999 Aug;4(4):220-38.). Cet effet est indépendant de l'infection virale en elle-même, mais permet de réduire l'inflammation nécrotique du foie qui y est associée.
Les catéchines ont été proposées pour le traitement de maladies impliquant la voie d'immunosuppression médiée par l'indoléamine 2,3-dioxygénase (IDO), parmi lesquelles certains cancers mais également des infections virales dont l'hépatite C (WO 20081 15804). Cette voie de traitement est donc non spécifique et indirecte puisqu'il s'agit d'un traitement par immunomodulation.
L'art antérieur décrit également un traitement de l'hépatite C par l'utilisation d'un agent antiviral en mélange avec un inhibiteur du protéasome cellulaire. Parmi l'ensemble des inhibiteurs du protéasome cellulaire cités, on retrouve l'EGCG. Le mécanisme d'action et l'avantage d'un inhibiteur du protéasome dans ce traitement n'est néanmoins pas décrit (WO201 1 /009961 ).
Les catéchines sont également évoquées dans le traitement de l'hépatite C sous une forme polymérique (US 2010/0055065). Ce polymère de polyphénols est décrit comme ayant une activité antivirale par inhibition de la réplication du VHC, sous réserve de contenir au moins 3 monomères. De nombreux polyphénols sont envisagés comme potentiels monomères et plus particulièrement l'ensemble des catéchines. Cependant, au cours de cette étude, seul le réplicon de génotype 1 b tel que décrit par Lohmann et al. Science, 1999 est utilisé par les auteurs.
Néanmoins, aucun document de l'art antérieur ne décrit une molécule ayant un effet antiviral spécifique du VHC qui soit à la fois efficace, ayant peut ou pas d'effets secondaires sur le patient traité et qui soit spécifique au VHC quelque soit le génotype viral concerné.
Afin de répondre à l'ensemble des problèmes de l'art antérieur, l'invention porte sur un composé de fo
Figure imgf000005_0001
dans laquelle :
• X est O quand a est une liaison simple ou 0+ quand a est une liaison double,
• R1 et R2 sont indépendamment l'un de l'autre un atome d'hydrogène, un groupement hydroxyle ou un groupement méthoxyl,
• R3, R5 et R7 sont indépendamment les uns des autres, un atome d'hydrogène, un groupement hydroxyle (OH), un groupement O-glycosyle, un alcoxyle en (C1 -C18) ou un groupement de formule (II)
Figure imgf000005_0002
• R4 et R6 sont indépendamment l'un de l'autre, un atome d'hydrogène ou un groupement OH,
• R4' est un atome d'hydrogène ou R4' est avec R4 et l'atome de carbone auquel ils sont liés, un groupement C=0, lorsque a est une simple liaison ou R4' n'est rien lorsque a est une double liaison,
• a et b identiques ou différents étant soit une simple liaison, soit une double liaison,
sous réserve qu'au moins l'un des groupes R3, R5 et R7 est un groupement de formule (II) et/ou R1 et R2 sont l'un et l'autre des groupements hydroxyle (OH), ou un de ses sels ou esters pharmaceutiquement acceptables, ledit composé de formule (I) étant sous forme de stéréoisomère pur ou sous forme de mélange d'énantiomères et/ou de diastéréoisomères, y compris de mélanges racémiques, pour une utilisation comme agent antiviral dans le traitement et/ou la prévention d'une infection par le virus de l'hépatite C (VHC).
Selon le composé de formule (I), a et b sont soit une simple liaison, soit une double liaison et a et b ne sont pas simultanément une double liaison.
Tels qu'ils sont utilisés ici, les termes « pharmaceutiquement acceptable », et les variations grammaticales qui s'y référèrent, renvoient à des compositions, des transporteurs, diluants et réactifs, qui sont utilisés de façon interchangeable et peuvent être administrés à un mammifère sans induction d'effets physiologiques indésirables tels que nausées, étourdissements, troubles gastriques, etc.
L'expression « sels ou esters pharmaceutiquement acceptables » fait référence aux sels d'addition acide relativement non toxiques, inorganiques et organiques, ou aux esters des composés de la présente invention, qui sont généralement préparés par réaction de l'acide libre avec une base organique ou inorganique approprié. Ces sels ou esters peuvent être préparés in situ pendant l'isolement final et la purification des composés. En particulier, les sels d'addition acide peuvent être préparés en faisant réagir séparément le composé purifié sous sa forme épurée avec un acide organique ou inorganique et en isolant le sel ainsi formé. Parmi les exemples de sels d'addition acide, on trouve les sels bromhydrate, chlorhydrate, sulfate, bisulfate, phosphate, nitrate, acétate, oxalate, valerate, oléate, palmitate, stéarate, laurate, borate, benzoate, lactate, phosphate, tosylate, citrate, maléate, fumarate, succinate, tartrate, naphthylate, mésylate, glucoheptanate, lactobionate, sulfamates, malonates, salicylates, propionates, méthylènebis-b-hydroxynaphtoates, acide gentisique, iséthionates, di-p-toluoyltartrates, méthanesulfonates, éthanesulfonates, benzènesulfonates, p-toluènesulfonates, cyclohexyl sulfamates et quinateslaurylsulfonate, et analogues. (Voir par exemple S. M. Berge et al. « Pharmaceutical Salts » J. Pharm. Sci, 66 :p.1 -19 (1977) qui est incorporé ici par référence).
Le composé selon l'invention est un inhibiteur spécifique du VHC en ce qu'au sein des virus à ARN simple brin, il inhibe un seul membre de la famille des Flaviviridae : le VHC. Par ailleurs, contrairement à de nombreux inhibiteurs viraux anti-VHC, le composé selon l'invention à un effet antiviral efficace vis-à-vis de l'ensemble des génotypes du VHC et ce même envers les génotypes les plus résistants aux antiviraux classiques. Tel est le cas du VHC de génotype 1 . Ceci en fait un inhibiteur d'intérêt.
En outre, les inventeurs ont montré que parmi les molécules de la famille des flavonoïdes, seules les molécules ayant un groupement 3,4,5-trihydroxy-phényl avaient un effet antiviral sur le VHC. Ainsi, la présence du groupement 3,4,5-trihydroxy-phényl est essentielle pour l'activité antivirale du composé selon l'invention. Cette structure est retrouvée dans le groupement galloyle de formule (II) ainsi qu'en C2 de l'hétérocycle central (hétérocycle chromane) lorsque R1 et R2 sont des groupements hydroxyles.
Selon une première variante du composé selon l'invention, l'un quelconque des groupes R3, R5 ou R7 est un groupement de formule (II), et les groupes R1 et R2 sont l'un et l'autre des groupements OH.
Selon une seconde variante du composé selon l'invention, au moins deux des groupes R3, R5 et R7 sont des groupements de formule (II).
Les inventeurs ont mis en évidence un effet additif des groupements 3,4,5-trihydroxy-phényl sur le caractère antiviral des composés de formule (I), de sorte que l'effet antiviral d'un composé de formule (I) comprenant deux groupements 3,4,5-trihydroxy-phényl est bien supérieur à celui d'un composé n'en comportant qu'un.
Avantageusement, le composé selon l'invention est un composé de formule (I) dans laquelle, les groupes R3, R5 et R7 sont indépendamment les uns des autres, un groupement O-alkyl sélectionné dans le groupe constitué d'un groupement O-méthyl, O-éthyl ou O-propyl.
Par « groupement O-glycosyle » on entend une ou plusieurs chaînes carbonées comprenant au moins un saccharide à savoir, un monosaccharide ou un oligosaccharide lié à un groupement OH du composé de formule (I), le monosaccharide ou l'oligosaccharide étant susceptible d'être substitué par des groupements alkyls en C1 -C6 ou par des groupements phénoliques.
Typiquement le groupement O-glycosyle comprend au moins un monosaccharide sélectionné dans le groupe constitué du glucose, galactose, rhamnose et arabinose. De préférence, le groupement glycosyle est sélectionné dans le groupe constitué d'un monosaccharide, un disaccharide ou un tri-saccharide.
Avantageusement, le composé selon l'invention est aglycane. 'invention concerne également, un composé de formule (I) dans laquelle,
Figure imgf000008_0001
• X est O quand a est une liaison simple ou 0+ quand a est une liaison double, a et b identiques ou différents étant soit une simple liaison, soit une double liaison,
• les groupements R1 , R5 et R7 sont des groupements hydroxyles,
• R2 est un groupement hydroxyle ou un atome d'hydrogène,
• R3 est un groupement hydroxyle, un atome d'hydrogène ou un groupement galloyle de formule (II)
Figure imgf000008_0002
• R4' est un atome d'hydrogène lorsque a est une simple liaison ou R4' n'est rien lorsque a est une double liaison, et
• R6 est un atome d'hydrogène
ou un de ses sels ou esters pharmaceutiquement acceptables.
Selon une première variante, le composé selon l'invention est un composé de formule
Figure imgf000008_0003
dans laquelle :
• R1 et R2 sont indépendamment l'un de l'autre un atome d'hydrogène, un groupement hydroxyle ou un groupement méthoxyl,
• R3, R5 et R7 sont indépendamment les uns des autres, un atome d'hydrogène, un groupement OH, un groupement O-glycosyle, un alcoxyle en (C1 -C18) ou un groupement de formule (II)
Figure imgf000009_0001
l'un et l'autre des groupements OH,
ou un de ses sels ou esters pharmaceutiquement acceptables.
Préférentiellement, le composé est une anthocyanidine ou une anthocyane. Typiquement, le composé selon l'invention est un composé de formule (III) dans laquelle R1 , R2, R3, R5 et R7 sont des groupements OH et R6 est un atome d'hydrogène. Un tel composé de formule (III) est la delphinidine (3,3',4',5,5',7-Hexahydroxyflavyliumchloride N ° CAS 528-53-0). La delphinidine peut être modifiée par glycosylation sur les groupes R3, R5 et/ou R7. La delphinidine peut être sous la forme d'un sel, tel que le chlorure de delphinidine.
Typiquement, le composé selon l'invention est le composé de formule (III) dans laquelle R1 , R2, R5 et R7 sont des groupements OH et R3 et R6 sont des atomes d'hydrogène. Un tel composé de formule (III) est la tricétinidine (3',4',5,5',7-pentahydroxyflavylium chloride ; N ° CAS 65618-21 -5). La tricétinidine peut être modifiée par glycosylation sur les groupes R3, R5 ou R7. La tricétinidine est retrouvée dans le thé et serait le produit de dégradation par dégallation oxydative de l'EGCG.
Typiquement, le composé selon l'invention est le composé de formule (III) dans laquelle R1 , R2, R3 et R7, sont des groupements OH ; R6 est un atome d'hydrogène, R5 est un groupement O-méthyl. Un tel composé de formule (III) est la Pulchéllidine (3,7,3',4',5'-Pentahydroxy-5-méthoxyflavylium, N CAS 19077-86-2. La Pulchéllidine peut être modifiée par glycosylation sur les groupes R3 et R7.
Figure imgf000009_0002
Delphinidine Tricétinidine Pulchéllidine Selon une seconde variante, le composé selon l'invention est un composé de formule
(IV)
Figure imgf000010_0001
dans laquelle :
• R1 et R2 sont indépendamment l'un de l'autre un atome d'hydrogène, un groupement hydroxyle ou un groupement méthoxyl,
• R3 est groupement OH, un groupement O-glycosyle, un alcoxyle en (C1 -C18) ou un groupement de formule (II)
Figure imgf000010_0002
• R5 et R7 sont indépendamment l'un de l'autre, un atome d'hydrogène, un groupement OH, un groupement O-glycosyle, un alcoxyle en (C1 -C18) ou un groupement de formule (II),
• R6 est un atome d'hydrogène ou un groupement OH, et
au moins un des R3, R5 ou R7 est un groupement de formule (II), ou R1 et R2 sont l'un et l'autre des groupements OH,
ou un de ses sels ou esters pharmaceutiquement acceptables.
Préférentiellement, le composé selon l'invention est un flavonol (3-hydroxy-2-phénylchromèn-4-one).
Typiquement, le composé selon l'invention est le composé de formule (IV) dans laquelle R1 , R2, R3, R5 et R7 sont des groupements OH ; R6 est un atome d'hydrogène. Un tel composé de formule (IV) est la Myricétine (ou 3,3',4',5',5,7-hexahydroxy-2-phénylchromen-4-one ; N° CAS529-44-2). La Myricétine peut être modifiée par glycoylation notamment sur le groupe R3.
Figure imgf000011_0001
Myricétine
Selon une troisième variante, le composé selon l'invention est un composé de formule
Figure imgf000011_0002
dans laquelle :
• R1 et R2 sont indépendamment l'un de l'autre un atome d'hydrogène, un groupement hydroxyle ou un groupement méthoxyl,
• R3 est un groupement OH, un groupement O-glycosyle, un alcoxyle en (C1 -C18) ou un groupement de formule (II)
Figure imgf000011_0003
• R5 et R7 sont indépendamment l'un de l'autre un atome d'hydrogène, un groupement OH, un groupement O-glycosyle, un alcoxyle en (C1 -C18) ou un groupement de formule (II), et
au moins un des R3, R5 ou R7 est un groupement de formule (II), ou R1 et R2 sont l'un et l'autre des groupements OH,
ou un de ses sels ou esters pharmaceutiquement acceptables.
Préférentiellement, le composé selon l'invention est un flavan-3-ol (flavanol ou catéchine).
Les catéchines sont une sous-famille de flavonoïdes dont la structure est basée sur la 2-phényl-3-chromano.
Typiquement, le composé selon l'invention est le composé de formule (V) dans laquelle R1 , R2, R3, R5 et R7 sont des groupements OH, le composé selon l'invention est dénommé l'(-)-Epigallocatéchine (EGC)
((2R,3R)-2-(3,4,5-trihydroxyphényl)chromane-3,5,7-triol, numéro CAS 970-74-1 ) lorsque les groupements en C2 et C3 de l'hétérocycle central (hétérocycle chromane) sont en cis et dénommé la (-)-Gallocatéchine
(2H-1 -Benzopyran-3,5,7-triol,3,4-dihydro-2-(3,4,5-trihydroxyphényl)-(2S,3R) ; numéro CAS 3371 -27-5) ou la ((+)-Gallocatechin (GC)
(2H-1 -Benzopyran-3,5,7-triol,3,4-dihydro-2-(3,4,5-trihydroxyphényl)-, (2R.3S) ; N ° CAS 970-73-0) lorsque les groupements en C2 et C3 de l'hétérocycle central (hétérocycle chromane) sont en trans.
Figure imgf000012_0001
Typiquement, le composé selon l'invention est le composé de formule (V) dans laquelle R1 , R5 et R7 sont des groupements OH ; R2 est un atome d'hydrogène ; R3 est un groupement galloyle de formule (II), le composé selon l'invention étant dénommé (-)-Epicatechin-3-gallate (ECG) ((2R,3R)-2-(3,4-Dihydroxyphényl)-3,4-dihydro-1 (2H)-benzopyrane-3,5,7-triol
3-(3,4,5-trihydroxybenzoate); N ° CAS 1257-08-5) lorsque les groupements en C2 et C3 de l'hétérocycle central (hétérocycle chromane) sont en cis et dénommé la catéchine-3-gallate (CG) ((2S,3R)-2-(3,4-Dihydroxyphényl)-3,4-dihydro-1 (2H)-benzopyran-3,5,7-triol 3-(3,4,5-trihydroxybenzoate) N ° CAS 130405-40-2) lorsque les groupements en C2 et C3 de l'hétérocycle central (hétérocycle chromane) sont en trans.
Figure imgf000013_0001
Typiquement, le composé selon l'invention est le composé de formule (V) dans laquelle R1 , R2, R5 et R7 sont des groupements OH ; R3 est un groupement galloyle de formule (II), le composé selon l'invention étant nommé (-)-Epigallocatéchine-3-Gallate (EGCG) ((2R,3R)-5,7-dihydroxy-2-(3,4,5-trihydroxyphényl)-3,4-dihydro-2H-chromen-3-yl 3,4,5-trihydroxybenzoate ; N ° CAS 989-51 -5) lorsque les groupements en C2 et C3 de l'hétérocycle central (hétérocycle chromane) sont en cis et nommé la (-)-Gallocatéchine gallate (GCG) ((2S,3R)-2-(3,4,5-Trihydroxyphényl)-3,4-dihydro-1 (2H)-benzopyran-3,5,7-triol 3-(3,4,5-trihydroxybenzoate), N ° CAS 4233-96-9) lorsque les groupements en C2 et C3 de l'hétérocycle central (hétérocycle chromane) sont en trans.
Figure imgf000013_0002
(+)-gallocatéchine-3-gallate (GCG) (-)-épigallocatéchine-3-gallate (EGCG)
Préférentiellement, le composé selon l'invention est sélectionné dans le groupe constitué de la delphinidine, la Myricétine, la tricétinidine, la Pulchéllidine, l'épigallocatéchine (EGC), l'épigallocatéchine gallate (EGCG), la gallocatéchine (GC), la catéchine gallate (CG), la gallocatéchine gallate (GCG), l'épicatéchine gallate (ECG), leurs sels et esters pharmaceutiquement acceptables, et leurs mélanges.
De façon avantageuse, ledit composé selon l'invention est sélectionné dans le groupe constitué de l'épigallocatéchine (EGC), l'épigallocatéchine gallate (EGCG), la gallocatéchine (GC), la catéchine gallate (CG), la gallocatéchine gallate (GCG), l'épicatéchine gallate (ECG), leurs sels et esters pharmaceutiquement acceptables, et leurs mélanges.
Préférentiellement, ledit composé selon l'invention est l'épigallocatéchine gallate (EGCG) ou un de ses sels ou esters pharmaceutiquement acceptables.
Les composés flavonoïdes selon l'invention étant naturellement présents dans les végétaux et notamment dans la plupart des fruits et légumes, ils peuvent être obtenus par purification. A titre d'exemple, les catéchines peuvent être obtenues par extraction du thé vert ou noir par différents procédés de filtration, tels que ceux décrits dans les brevets US 6.383.392 ou EP 1 077 21 1 . Les anthocyanines peuvent également être obtenues par purification à partir de plantes tel que décrit dans l'état de la technique et notamment dans les demandes de brevet US 2010041877 ou US 2003147980. De tels composés flavonoïdes sont retrouvés dans le commerce.
Les composés flavonoïdes peuvent également être obtenus par synthèse chimique par la mise en œuvre de procédés connus de l'homme du métier tels que notamment des procédés de synthèse en phase solide. De tels composés flavonoïdes sont retrouvés dans le commerce.
Dans le cadre de la présente invention, l'expression « virus de l'Hépatite C » ou « VHC » doit être comprise comme faisant référence à l'ensemble des génotypes du virus de l'hépatite C, génotypes déjà décrits ou non décrits, en particulier les génotypes numérotés de 1 à 6, ainsi que leurs différents sous-types, plus particulièrement les génotypes 1 a, 1 b, 2a, 2b, 3, 4, 5, et 6. Cette expression doit également être comprise comme faisant référence à un virus VHC recombinant ou non recombinant capable d'infecter un hôte, tel qu'une cellule cible d'un sujet. Par « cellule(s) cible(s) » ou « cellule(s) cible(s) du VHC », « cellule(s) hôte(s) » ou « cellule(s) hôte(s) du VHC » on entend les cellules susceptibles d'être infectées par le VHC. La cellule hôte ou cellule cible selon la présente invention, est l'hépatocyte.
L'expression « agent antiviral » est utilisé en référence à un agent susceptible d'interagir directement avec le VHC ou avec un ou plusieurs de ses constituants et induit l'inhibition de l'infection par le VHC soit par une diminution ou une abolition de l'entrée virale, de la réplication virale ou de la pathogénie ou tout autre événement ayant lieu dans la cellule hôte ou leurs combinaisons. Cette action directe de l'agent antiviral est à opposer à l'action indirecte de composés utilisés dans le traitement des infections par le VHC et agissant par stimulation du système immunitaire par exemple.
L'expression « infection par le VHC » ou « infection virale » en référence au VHC, se réfère à la condition d'un sujet ou d'un patient infecté par le VHC. L'infection par le VHC désigne indifféremment une infection asymptomatique ou chronique par le VHC, quel que soit son stade de développement. Cette expression se rapporte également à l'entrée, la réplication ou tout autre événement ou processus impliqué dans la pathogenèse du VHC dans une cellule hôte. Ainsi, l'infection comprend l'introduction d'un agent infectieux, comme un virus VHC recombinant ou non recombinant, capable d'infecter un hôte, tel qu'une cellule d'un sujet.
Le terme « prévention », tel qu'il est utilisé présentement en référence à une infection par le VHC se rapporte à la réduction du risque ou à l'inhibition du développement d'une infection virale. Le composé selon l'invention inhibant les premières étapes de l'infection est particulièrement avantageux dans la prévention de l'infection par le VHC.
Le terme « traitement », tel qu'il est utilisé présentement, désigne généralement l'amélioration d'un signe ou d'un symptôme d'une maladie ou d'un état pathologique lié, par exemple, à une infection par le VHC notamment du fait de l'inhibition du virus, l'arrêt de son développement, la diminution de la charge virale du patient ou l'éradication du virus. Il est ainsi fait référence à des moyens de régression, de réduction, d'inhibition de la progression du VHC, ou la prévention de l'infection par le VHC ou un ou plusieurs symptômes de cette infection.
Ledit composé selon l'invention est un agent antiviral en particulier, par inhibition de l'infection d'une cellule cible (telle qu'une cellule hépatocytaire) par le virus de l'hépatite C et/ou de la transmission du virus de l'hépatite C entre deux cellules cibles. Par exemple, d'une cellule hépatocytaire infectée à une cellule hépatocytaire non-infectée.
Le composé selon l'invention inhibe les deux grands modes d'infection virale à savoir, l'infection d'une cellule cible saine (telle qu'une cellule hépatocytaire non-infectée) par le virus isolé et le second mode, la dissémination virale de cellules à cellules, autrement dit, l'infection par une cellule cible infectée d'une cellule cible non-infectée. Ce dernier mode de transmission est important puisqu'on le suspecte d'être une voie prépondérante in vivo pour certaines familles de virus enveloppés.
Préférentiellement, ledit composé est un agent antiviral par inhibition de l'entrée du virus de l'hépatite C. L'utilisation d'un inhibiteur d'entrée peut être particulièrement avantageux dans le cas d'une transplantation hépatique afin d'éviter l'infection du foie transplanté. Les inventeurs ont mis en évidence une telle inhibition, par l'usage d'un modèle d'étude de référence permettant l'expression de glycoprotéines de l'enveloppe virale d'intérêts que ce sont les pseudoparticules virales infectieuses. Ainsi, selon l'invention, l'expression « inhibition de l'entrée virale » ou « inhibition de l'entrée du virus » doit être comprise comme l'inhibition du passage d'un génome viral de l'extérieur vers l'intérieur de la cellule hôte, qu'il s'agisse d'une infection médiée par une particule virale individualisée ou tout autre mécanisme conduisant à l'infection d'une cellule hôte non-infectée. Cette expression peut également être comprise comme l'inhibition de l'une quelconque des étapes de l'infection virale préalable au relargage du génome viral dans le cytoplasme de la cellule hôte. Ces étapes préalables sont : i) l'adhésion ou l'attachement du virus ou d'une cellule hôte infectée à la surface d'une seconde cellule hôte (typiquement une cellule hôte non infectée), ii) l'interaction avec le(s) récepteur(s) spécifique(s) viraux et iii) la fusion de l'enveloppe lipidique virale, de la particule virale avec une membrane cellulaire (plasmique ou endosomale) permettant l'introduction du génome viral dans le cytoplasme de la cellule infectée. Les inventeurs ont réalisé des expériences visant à fractionner le mécanisme de l'entrée du VHC dans la cellule hôte en ses 3 étapes constitutives et ont ainsi montré que seule l'étape d'attachement est inhibée par les composés de formule (I) tels que l'EGCG, l'ECG, l'EGC ou la Delphinidine. L'étape d'attachement est l'étape la plus précoce du mécanisme d'entrée virale. De tels résultats peuvent être confortés par des expériences de « binding » et de quantification par RT-PCR quantitative de l'ARN du virus attaché à la cellule ou de quantification de la protéine de capside.
Préférentiellement, ledit composé est un agent antiviral par inhibition des glycoprotéines de surface du VHC dans leur fonction au cours des étapes de l'entrée du génome viral dans la cellule hôte non infectée. Ceci peut être confirmé par des essais de pull down ou de microcalorimétrie et de résonnance plasmonique de surface (Biacore).
Avantageusement, le composé selon l'invention est un agent antiviral par inhibition de l'adhésion du virus de l'hépatite C, ou d'une cellule hôte infectée par le virus de l'hépatite C, à la membrane d'une cellule hôte non-infectée.
Préférentiellement, ledit composé est un agent antiviral par inhibition de l'interaction des glycoprotéines de surface du VHC avec au moins une protéine cible d'une cellule hôte et plus particulièrement l'inhibition des glycoprotéines du VHC telles que des glycoprotéines E1 et/ou E2, et notamment, de la protéine E1 (Acc No : AAB67037 SEQ ID NO : 1 ) ou de la protéine E2 (Acc No : AAB67037 SEQ ID NO : 2) du VHC de génotype 1 a, de la protéine E1 (Acc No : AY734976 SEQ ID NO : 3) ou de la protéine E2 (Acc No : AY734976 SEQ ID NO : 4) du VHC de génotype 1 b, de la protéine E1 (Acc No : AB047639 SEQ ID NO : 5) ou de la protéine E2 (Acc No : AB047639 SEQ ID NO : 6) du VHC de génotype 2a, de la protéine E1 (Acc No : AY734982 SEQ ID NO : 7) ou de la protéine E2 (Acc No : AY734982 SEQ ID NO : 8) du VHC de génotype 2b, de la protéine E1 (Acc No : AY734984 SEQ ID NO : 9) ou de la protéine E2 (Acc No : AY734984 SEQ ID NO : 10) du VHC de génotype 3a, de la protéine E1 (Acc No : AY734986 SEQ ID NO : 1 1 ) ou de la protéine E2 (Acc No : AY734986 SEQ ID NO : 12) du VHC de génotype 4, de la protéine E1 (Acc No : AY785283 SEQ ID NO : 13) ou de la protéine E2 (Acc No : AY785283 SEQ ID NO : 14) du VHC de génotype 5, de la protéine E1 (Acc No : AY736194 SEQ ID NO : 15) ou de la protéine E2 (Acc No : AY736194 SEQ ID NO : 16) du VHC de génotype 6.
Par « inhibition de l'interaction des glycoprotéines de surface du VHC » » ou « inhibition de la liaison des glycoprotéines de surface du VHC » ou « inhibition de l'interaction des glycoprotéines E1 et/ou E2 » on entend, l'inhibition de la liaison spécifique d'au moins l'une des glycoprotéines de surface du VHC et notamment l'une des glycoprotéines E1 ou E2 avec au moins une protéine ou glycoprotéine cible d'une cellule hôte. Par exemple, l'inhibition de la liaison entre les glycoprotéines E1 et/ou E2 et les glycosaminoglycanes des hépatocytes. Les glycoprotéines de surface du VHC peuvent être retrouvées à la surface d'une particule virale mais également se fixer à la surface d'une cellule cible infectée. La liaison des glycoprotéines de surface du VHC et notamment des glycoprotéines E1 et/ou E2 aux protéines cibles s'effectue au cours de l'étape d'attachement ou d'adhésion du VHC avec une cellule cible, ou de l'étape d'attachement ou d'adhésion d'une cellule cible infectée à une autre cellule cible.
Dans le cadre de la présente invention, les « protéines cibles » ou « protéines cibles d'une cellule hôte » sont les protéines ou glycoprotéines de surface, à savoir des protéines ou glycoprotéines transmembranaires ou ancrées à la surface de la membrane plasmique de cellules hôtes, lesquelles protéines étant reconnues spécifiquement par les glycoprotéines de surface du VHC et notamment par les glycoprotéines E1 et/ou E2. A titre d'exemples, on peut citer les glycosaminoglycanes d'une cellule cible telle qu'un hépatocyte.
Ainsi, les inventeurs ont démontré que l'inhibition par les composés de formule (I) tels que l'EGCG, l'ECG, l'EGC ou la Delphinidine implique spécifiquement les glycoprotéines E1 et/ou E2. Les composés selon l'invention inhiberaient l'interaction entre les protéines E1 et/ou E2 du VHC et les protéines cibles telles que les glycosaminoglycanes des hépatocytes. De plus, les inventeurs ont mis en évidence que l'effet inhibiteur de l'entrée virale médié par les composés de formule (I) tels que l'EGCG, l'ECG, l'EGC ou la Delphinidine, implique directement les glycoprotéines de l'enveloppe virale au niveau d'une zone conservée de celles-ci. En effet, les inventeurs ont montrés que l'effet inhibiteur des composés de formule (I) tels que l'EGCG, l'ECG, l'EGC ou la delphinidine était observé sur l'ensemble des génotypes viraux du VHC à savoir les génotypes 1 a, 1 b, 2a, 2b, 3, 4, 5, et 6 indiquant que la liaison des molécules selon l'invention avec les glycoprotéines E1 et /ou E2 s'effectue au niveau d'une zone très conservée de ces dernières.
Selon l'invention, le traitement et/ou la prévention de l'infection par le virus de l'hépatite C est destiné à un patient résistant ou intolérant au traitement d'une infection par le VHC, par un agent immunomodulateur et/ou par un inhibiteur du métabolisme viral.
Le génotype 1 de VHC est le plus réfractaire aux traitements actuels. Il serait responsable de 70 % des cas connus d'hépatite C aux Etats-Unis, au Japon et en Europe occidentale. Or, moins de 50 % des patients obtiennent une réponse virologique soutenue avec le traitement actuel. Le composé selon l'invention permet l'inhibition de l'infection par le VHC de l'ensemble des génotypes décrits et plus particulièrement le VHC de génotype 1 pour lequel il montre une très forte capacité antivirale.
Les « inhibiteurs viraux » peuvent être définis en trois groupes.
Le premier comprend les inhibiteurs du métabolisme viral. Par « inhibiteurs du métabolisme viral » on entend, i) les inhibiteurs de la traduction notamment les inhibiteurs de TIRES (Internai Ribosome Entry Site), les ribozymes ou les SiRNA ; ii) les inhibiteurs de la maturation protéique tels que les inhibiteurs de protéases (protéases NS3/NS4a), iii) les inhibiteurs de la réplication du génome viral notamment les inhibiteurs de la liaison entre l'ARN viral et l'ARN polymérase ou les inhibiteurs de la polymérase NS5B qui peuvent être inhibiteurs nucléosidique ou non-nucléosidique ou les inhibiteurs des hélicases, vi) les inhibiteurs de l'assemblage viral tels que les inhibiteurs de la glycosylation.
Le second groupe d'inhibiteurs comprend les « inhibiteurs de l'entrée virale » dans l'hépatocyte. Sont considérés comme tels notamment toute molécule susceptible d'inhiber partiellement ou totalement l'étape de reconnaissance de la cellule hôte par une particule virale individualisée, ou par la membrane d'une cellule hôte infectée ou l'étape d'attachement du virus ou de la membrane d'une cellule hôte infectée, à la surface cellulaire de la cellule hôte non-infectée ou l'étape d'endocytose des particules virales par la cellule hôte ou l'étape de fusion de la membrane virale avec la membrane endosomale.
Le troisième comprend les « agents immunomodulateurs ». Par « agents immunomodulateurs » on entend, des molécules d'origine synthétique ou naturelle qui permettent d'initier ou de potentialiser la réponse immunitaire des mammifères au cours d'une infection virale. On peut citer à titre d'exemple d'agents immunomodulateurs, les interférons type 1 (tels que les interférons alpha (IFN-α), beta (IFN-β) ou oméga (IFN-ω)), les interférons type 2 (tels que l'interféron gamma l'IFN-γ) et les interférons pegylatés.
Selon une première variante préférentielle, le composé selon l'invention est co-administré avec un agent additionnel destiné au traitement et/ou à la prévention d'une infection par le VHC. Ledit agent additionnel est de préférence, un inhibiteur viral tel que défini ci-dessus.
L'utilisation d'une telle combinaison de plusieurs inhibiteurs permet une réduction des risques de résistance virale souvent observée dans le cadre de traitements de virus à haut taux de mutations.
Avantageusement, l'agent additionnel est un agent immunomodulateur ou un inhibiteur du métabolisme viral du VHC.
Selon une seconde variante préférentielle, ledit composé est le seul agent antiviral administré pour le traitement et/ou la prévention de l'infection par le virus de l'hépatite C.
Avantageusement, ledit composé est formulé sous forme d'une composition pharmaceutique. Typiquement, ladite composition pharmaceutique contient un véhicule pharmaceutiquement acceptable et le composé selon l'invention.
Par « véhicule pharmaceutiquement acceptable », on entend tout solvant, milieu de dispersion, agent retardant l'absorption, etc., qui ne produit pas de réaction secondaire, par exemple allergique, chez l'humain ou l'animal. Les véhicules pharmaceutiquement acceptables sont bien connus de l'homme de l'art, et incluent ceux décrits dans
« Remington's Pharmaceutical Sciences » (Mack Publishing Company, Easton, USA, 1985).
Le véhicule pharmaceutiquement acceptable est notamment choisi en fonction de la voie d'administration, qui peut par exemple être orale, sous-linguale, nasale, buccale, transdermique, intraveineuse, sous-cutanée, intramusculaire et/ou rectale. La dose dépend de facteurs tels que le principe actif considéré, le mode d'administration, l'indication thérapeutique, l'âge, le poids et l'état du patient.
L'invention concerne également une méthode de traitement ou de prévention d'une infection par le VHC, comprenant l'administration à un individu en ayant besoin d'une quantité thérapeutiquement efficace d'un composé de formule (I) leurs sels et esters pharmaceutiquement acceptables ou leurs mélanges, ledit composé de formule (I) étant sous forme de stéréoisomère pur ou sous forme de mélange d'énantiomères et/ou de diastéréoisomères, y compris de mélanges racémiques, préférentiellement, ledit composé de formule (I) est sélectionné dans le groupe constitué de la delphinidine, la Myricétine, la tricétinidine, la Pulchéllidine, l'épigallocatéchine (EGC), l'épigallocatéchine gallate (EGCG), la gallocatéchine (GC), la catéchine gallate (CG), la gallocatéchine gallate (GCG), l'épicatéchine gallate (ECG), leurs sels et esters pharmaceutiquement acceptables, et leurs mélanges. L'individu est de préférence un mammifère, plus particulièrement un humain. La dose thérapeutique efficace peut facilement être déterminée par l'homme du métier.
L'expression « quantité thérapeutiquement efficace » ou « dose thérapeutique efficace » utilisée dans la présente signifie la quantité d'agents antiviral tels que des composés flavonoïdes de formule (I) ou leurs dérivés provoquant une réponse biologique ou médicale dans un tissu, un système biologique animal ou humain qui comprend le soulagement des symptômes de l'infection par le VHC du fait notamment de l'inhibition du virus, l'arrêt de son développement, la diminution de la charge virale du patient ou l'éradication du virus. Aux fins de la prévention, une quantité thérapeutiquement efficace peut aussi être considérée comme un «quantité prophylactique» d'agents actifs.
Les termes et expressions «patient» ou «patient qui en a le besoin » sont destinés à un mammifère humain ou non-humain affecté ou susceptible d'être affecté par le VHC. Dans un mode de réalisation préférentiel, le patient est un être humain. Dans un autre mode de réalisation, le patient est un chimpanzé.
L'objet de l'invention porte également sur une méthode préférentiellement ex vivo de réduction de l'infectiosité ou d'inactivation d'un virus de l'hépatite C (VHC) comprenant une étape de mise en contact dudit virus de l'hépatite C avec un composé de formule (I) :
Figure imgf000020_0001
dans laquelle :
• X est O quand a est une liaison simple ou 0+ quand a est une liaison double,
• R1 et R2 sont indépendamment l'un de l'autre un atome d'hydrogène, un groupement hydroxyle ou un groupement méthoxyl,
• R3, R5 et R7 sont indépendamment les uns des autres, un atome d'hydrogène, un groupement OH, un groupement O-glycosyle, un alcoxyle en (C1 -C18) OU un groupement de formule (II) :
Figure imgf000021_0001
• R4 et R6 sont indépendamment l'un de l'autre, un atome d'hydrogène ou un groupement OH,
• R4' est un atome d'hydrogène ou R4' est avec R4 et l'atome de carbone auquel ils sont liés, un groupement C=0, lorsque a est une simple liaison ou R4' n'est rien lorsque a est une double liaison,
• a et b identiques ou différents étant soit une simple liaison, soit une double liaison,
sous réserve qu'au moins l'un des groupes R3, R5 et R7 est un groupement de formule (II) et/ou R1 et R2 sont l'un et l'autre des groupements OH,
ou un de ses sels ou esters pharmaceutiquement acceptables, ledit composé de formule (I) étant sous forme de stéréoisomère pur ou sous forme de mélange d'énantiomères et/ou de diastéréoisomères, y compris de mélanges racémique.
Le VHC est mis en contact avec le composé de formule (I) pendant une durée et dans des conditions suffisantes pour obtenir une inactivation ou une inhibition du virus partielle ou totale. Selon l'invention, le VHC est mis en contact avec le composé de formule (I) avant ou pendant l'étape d'infection. L'étape d'infection étant l'étape de mise en contact du virus avec sa ou ses cellule(s) cible(s).
Par « infectiosité » on entend le caractère infectieux du virus, à savoir la capacité du virus en entraîner une infection virale au sens de la présente invention, notamment la réduction de la capacité du virus à entrer dans une cellule cible préférentiellement, la réduction de sa capacité à s'attacher à une cellule cible.
Avantageusement, la méthode ex vivo selon l'invention, peut être mise en œuvre en mettant en contact un échantillon susceptible de comprendre un VHC et un composé de formule (I) dans milieu liquide ou semi liquide, le composé de formule (I) est préférentiellement appliqué à une concentration de 0,5 à 100 μΜ, avantageusement, à une concentration de 10 à 80 μΜ voire 20 à 70 μΜ. Typiquement, le composé de formule (I) est appliqué à une concentration de 50μΜ. La méthode peut être mise en œuvre à une température de 4 à 37 °C, préférentiellement, de 4 à 10°C ou de 20 à 37 °C. Le composé selon l'invention peut être mis en contact avec ledit virus durant 15 à 90 min, préférentiellement, de 30 à 45 min.
Préférentiellement, selon la méthode ex vivo de réduction de l'infectiosité ou d'inactivation du VHC, ledit virus de l'hépatite C est présent dans un échantillon biologique.
L'expression « échantillon biologique » désigne un échantillon d'origine biologique ou prélevé sur un organisme biologique tel qu'un organe, un tissu, une cellule, une population de cellules, un fluide biologique, une protéine ou un peptide purifié. Des exemples non limitatifs comprennent des échantillons liquides d'origine biologique tel que le sang, le plasma, le sérum, le liquide céphalo-rachidien, la lymphe ou des lysats cellulaires ; des échantillons solides tels que des organes notamment destinés à la transplantation ou des tissus ou des cultures cellulaire pouvant être destinés à une greffe.
Selon une variante avantageuse, la méthode ex vivo de réduction de l'infectiosité ou d'inactivation du VHC selon l'invention comprend une étape additionnelle de lavage de l'échantillon biologique. Cette étape permet la réduction ou l'élimination du composé de formule (I) dudit échantillon biologique. L'étape de lavage peut être précédée d'une étape d'incubation du mélange composé de formule (I) dans ledit échantillon biologique.
La méthode ex vivo selon l'invention, peut également comprendre une étape additionnelle de contrôle de l'infectiosité d'un échantillon biologique. Une telle étape peut être envisagée avant l'étape de mise en contact du composé de formule (I) avec l'échantillon biologique ou après la mise en contact ; afin de déterminer si un autre cycle de mise en contact de l'échantillon biologique avec le composé de formule (I) est à envisager. Une telle étape de contrôle peut être effectuée par tout moyen permettant en particulier, une détection rapide d'une infection par le VHC. Ainsi, une mise en évidence d'un marqueur spécifique du VHC peut être effectuée, par exemple par l'usage d'un anticorps spécifique d'une protéine virale ou par une détection par PCR de l'ARN du VHC.
DESCRIPTION DES FIGURES
Figure 1 : Illustration de l'infection virale relative des cellules Huh7 par le virus JFH1 -RLuc en fonction de la présence de (+)-catéchine (C), (-)-épicatéchine (EC), (-)-épicatéchine-3-gallate (ECG), (-)-épigallocatéchine (EGC) et (-)-épigallocatechine-3-gallate commercialisée par EXTRASYNTHESE® (EGCG EXTRASYNTHESE®) ou par CALBIOCHEM® (EGCG de CALBIOCHEM®) à 50μΜ ou de DMSO. Figure 2 : Illustration de l'infection virale relative des cellules Huh-7 par le virus JFHI -RLuc en fonction de la concentration du milieu en EGCG (0 ; 0,5 ; 5 ; 50 μΜ) pendant l'infection ou en prétraitement du virus à 50 μΜ d'EGCG avant l'étape infection.
Figure 3 : Illustration de l'infection virale relative des cellules Huh-7 infectées par des pseudoparticules virales infectieuses (VHCpp) exprimant à leur surface les protéines d'enveloppe E1 et E2 du virus VHC des génotypes 1 a, 1 b, 2a, 2b, 3, 4, 5, ou 6 ou infectées par les pseudoparticules du virus VSV exprimant la protéine d'enveloppe du VSV (VSVpp) en fonction de la présence d'EGCG (50 μΜ) ou de DMSO dans le milieu d'infection.
Figure 4 : Illustration de l'infection virale relative des cellules Huh-7 infectées par le virus de la fièvre jaune (YFV) ou le virus Sindbis (SINV) ou les cellules MDBK infectées le virus de la diarrhée bovine (BVDV) en fonction de la présence d'EGCG (50 μΜ) ou de DMSO dans le milieu d'infection.
Figure 5 : Illustration du nombre de cellules par foyer infectieux de l'infection virale de cellules Huh-7 par le virus JFH1 en présence ou non d'EGCG (à 50 μΜ).
Figure 6 : Illustration du pourcentage de cellules infectées par les surnageants de cellules aux passages P0 à P4 suivant que le milieu d'infection ait été traité au DMSO ou à l'EGCG.
Figure 7 : Figure 7 A. Schéma illustrant les conditions expérimentales pour l'étude de l'effet inhibiteur de l'EGCG sur l'entrée du VHC (échantillon 5) et plus particulièrement sur les étapes d'attachement (échantillon 2), d'interaction avec les récepteurs de la cellule hôte (échantillon 3) et l'étape d'endocytose et de fusion des membranes virales et cellulaires (échantillon 4), le DMSO étant utilisé au titre de témoin (échantillon 1 ).
Figure 7B. Illustration de l'infection virale relative des cellules Huh7 par le virus JFH1 -RLuc en fonction de la présence de DMSO ou de d'EGCG (à 50 μΜ) dans les échantillons 1 à 5.
Figure 8 : Illustration de l'infection virale relative des cellules Huh7 par le virus VHCcc en fonction de la présence de d'EGCG ou de delphinidine (à des concentrations croissantes). Ce graphique montre une expérience représentative de 3 expériences réalisées indépendamment.
Figure 9 : Illustration de l'attachement viral relatif des cellules Huh7 par le virus VHCcc en fonction de la présence de DMSO, de 50 μΜ d'EGCG, de 50 μΜ de chlorure de delphinidine ou de 500 g mL d'héparine._L'attachement relatif est exprimé en pourcentage du contrôle (DMSO) pour lequel une valeur de 100% a été arbitrairement attribuée. EXEMPLES
Matériels et méthodes
Réactifs.
Le Milieu modifié de Dulbecco (Dulbecco's modified Eagle's médium DMEM; GIBCO®), le Milieu essentiel minimum de Dulbecco (Minimum Essential Médium Eagle MEM; GIBCO®), le tampon phosphate salin (phosphate-buffered saline PBS), le milieu à apport en sérum réduit (OptiMEM® de GIBCO®), la L-alanyl-L-glutamine (GLUTAMAX-I™), le sérum de chèvre, le sérum de cheval, ainsi que le sérum de veau fœtal (SVF) sont des produits commercialisés par INVITROGEN®. Le 4',6-Diamidino-2-phénylindole (DAPI) a été obtenu auprès de MOLECULAR PROBES®. La (-)-Epigallocatechine Gallate (EGCG CALBIOCHEM®) et l'alcool polyvinylique (MOWIOL® 3-88) sont commercialisés par CALBIOCHEM®. Le réactif de transfection in vivo ExGen500® est commercialisé par EUROMEDEX®. La (+)-catéchine, la (-)-épicatéchine, la (-)-épicatéchine-3-gallate (ECG), la (-)-épigallocatéchine (EGC), et la (-)-épigallocatechine-3-gallate (EGCG Extrasynthèse®) sont commercialisées par la société Extrasynthèse® (Lyon, France). Le chlorure de delphinidine est produit par Extrasynthèse (Lyon, France). Les autres réactifs ont été commercialisés par la société SIGMA®.
Anticorps.
Les anticorps monoclonaux de souris (MAb) dirigés contre les protéines de l'enveloppe (E) du virus de la fièvre jaune (YFV) référencé MAb 2D12 (ATCC CRL-1689) et les anticorps monoclonaux de souris dirigés contre la protéine NS3 du virus de la diarrhée virale bovine (anti-BVDV) référencés NS3 MAb Osc-23 (Boulanger, D., et al., J. Gen. Virol., 1991. 7: p. 1195-1198) ont été produit in vitro en utilisant l'appareil MiniPerm® (HERAEUS®) selon les recommandations du fabriquant. Les anticorps monoclonaux de souris anti-CD81 référencés MAb 5A6 (Oren, R., et al., Mol Cell Biol, 1990. 10(8): p. 4007-15) ont été aimablement fournis par S. Levy (Stanford University) et les anticorps monoclonaux anti-CD81 (référencé MAb JS-81 ) sont commercialisés par BD Pharmingen®. Les anticorps de chèvre conjugué Cy3 anti-lgG de souris sont commercialisés par MOLECULAR PROBES®.
Lignées cellulaires et conditions de culture cellulaire
La lignée cellulaire hépatique Huh-7 (Nakabayashi, H. et al ; Cancer Res, 1982. 42(9) p3858-63) ainsi que les cellules HEK 293T ont été mises en culture dans du milieu DMEM (Invitrogen®) supplémenté en L-alanyl-L-glutamine (GLUTAMAX-I™) et à 10% de sérum de veau fœtal. Les cellules rénales bovines de Madin-Darby (Madin-Darby Bovine Kidney MDBK) ont été mises en culture dans du milieu DMEM supplémenté en L-alanyl-L-glutamine (GLUTAMAX-I™) à 10% de sérum de cheval. Les cellules BHK-21 ont été mises en culture dans du milieu MEM (Invitrogen®) supplémenté en L-alanyl-L-glutamine (GLUTAMAX-I™) et à 10% de sérum de veau fœtal.
VHCcc.
La version modifiée du plasmide codant pour le génome de l'isolât JFH1 (génotype 2a; GenBank numéro d'accès AB237837) a été aimablement fourni par M. T. Wakita (Institut National des Maladies Infectieuses, Tokyo, Japon) ( Wakita, T., et al., Nat Med, 2005. 11(7): p. 791-6.). Le clone viral JFH1 modifié contient des mutations conduisant aux changements d'acides aminés suivants F172C, P173S et N534K qui ont été montrés comme induisant une augmentation de la charge virale (Deigrange, D., et al., J Gen Virol, 2007. 88(Pt 9): p. 2495-503.). De plus, la séquence E1 codant pour les résidus 196TSSSYMVTNDC a été modifiée afin de reconstituer l'épitope A4 (SSGLYHVTNDC) de la glycoprotéine E1 de VHC (Dubuisson, J., et al., J Virol, 1994. 68(10): p. 6147-60.) comme décrit dans l'état de la technique (Goueslain, L, et al., J Virol, 2010. 84(2): p. 773-87). Le plasmide JFH-Luc contient le gène de la luciférase de Renilla reniformis (RLuc) au titre de gène rapporteur et le plasmide JFH-ΔΕΙ E2-Luc contient une délétion n'entraînant pas un décalage de lecture dans la région E1 E2 ( Wakita, T., et al., Nat Med, 2005. 11(7): p. 791-6), tel que décrit dans l'art antérieur (Goueslain, L, et al., J Virol, 2010. 84(2): p. 773-87 et Rocha-Perugini, V., et al., PLoS ONE, 2008. 3(4): p. e1866).
Afin de générer un ARN génomique de VHC, les plasmides sont linéarisés à l'extrémité 3' de l'ADNc du VHC par une coupure au site de restriction Xbal. Consécutivement au traitement par la nucléase de haricot Mungo, l'ADN linéaire est ensuite utilisé comme matrice pour la transcription in vitro avec le kit MEGAscript® commercialisé par AMBION®. L'ARN transcrit in vitro est transfecté par électroporation dans les cellules Huh-7 tel que décrit dans l'art antérieur (Kato, T., et al., Gastroenterology, 2003. 125(6): p. 1808-17). Les extraits viraux ont été obtenus tel que décrit dans l'art antérieur (Deigrange, D., et al., J Gen Virol, 2007. 88(Pt 9): p. 2495-503).
Concernant les essais d'infection par les virus VHCcc, les cellules Huh-7 sont mises en culture dans des plaques 24 puits, dans lesquelles l'infection est effectuée durant 2 heures à 37 °C. Concernant les essais avec le EGCG, les virus sont préincubés en présence d'EGCG pendant 45 min avant l'infection et/ou l'EGCG est ajouté au cours de l'infection avec le milieu de culture jusqu'au terme de la réaction, sauf indication contraire. Au cours de certains essais, l'EGCG est ajouté après l'étape d'infection pendant des temps variés (24, 48 ou 72 heures post-infection). Le taux d'infection est évalué par la mesure de l'activité luciférase 48 heures après l'étape d'infection dans les lysats cellulaires, par l'utilisation du kit Renilla luciférase assay System commercialisé par PROMEGA® ou par immunofluorescence avec les anticorps anti-E1 (A4) à 48 heures ou 72 heures après l'infection.
VHCDD.
Les particules rétrovirales pseudotypées ont été décrites par l'art antérieur (Bartosch, B., J. Dubuisson, and F.L. J Exp Med, 2003. 197(5): p. 633-42). Brièvement, les cellules 293T ont été co-transfectées avec un vecteur de transfection dérivés du virus de la leucémie murine (MLV) codant pour la luciférase (Op De Beeck, A., et al., J Virol, 2004. 78(6): p. 2994-3002.), un vecteur comportant une construction des gènes Gag-Pol du virus de la leucémie murine et un vecteur exprimant la glycoprotéine de l'enveloppe. La co-transfection a été mise en œuvre en utilisant le réactif de transfection Exgen® 500 dans les conditions recommandées par le fournisseur. Les plasmides suivants codant pour la glycoprotéine de l'enveloppe virale du VHC de génotype 1 b - UKN1 b-5.23 (AY734976) ; de génotype 2b- UKN2b-1 .1 (AY734982) ; de génotype 3a - UKN3a-1 .28 (AY734984) ; de génotype 4 - UKN4-1 1 .1 (AY734986) ; de génotype 5- UKN5-14.4 (AY785283) ; de génotype 6- UKN6-5.340 (AY736194), ont été aimablement fournis par J. Bail (Université de Nottingham, GB) (Lavillette, D., et al., Hepatology, 2005. 41(2): p. 265-74). Le plasmide de génotype 1 a- H77 (AAB67037 avec une mutation au niveau de 3 acides aminés: R564C, V566A, G650E) a été décrit dans l'art antérieur (Bartosch, B., J. Dubuisson, et F.L. Cosset, J Exp Med, 2003. 197(5): p. 633-42.), et le plasmide de génotype 2a- JFH-1 (AB047639) a été aimablement fourni par R. Bartenschlager (Université d'Heidelberg, Allemagne). Le vecteur d'expression phCMV-G, codant pour la protéine G du virus de la stomatite vésiculaire (VSV G), a été utilisé pour une production contrôlée des particules rétrovirales pseudotypées arborant les glycoprotéines de l'enveloppe VSV G sur des centres correspondant au virus de la leucémie murine (VSVpp). Les réactions de transfection par des VHCpp exprimant la luciférase ont été décrites dans la littérature (Op De Beeck, A., et al., J Virol, 2004. 78(6): p. 2994-3002.). Autres virus
La lignée NADL du virus de la diarrhée virale bovine (BVDV) et la lignée 17D du virus de la fièvre jaune (YFV) ont été utilisées comme contrôle. Les BVDV ont été produits comme précédemment décrit (Lecot, S., et al., J Virol, 2005. 79(16): p. 10826-9.). Les cellules MDBK ont été ensemencées sur les lamelles de plaques 24 puits et infectées 24 heures après. Les cellules sont infectées en présence d'EGCG pendant 1 heure à 37 °C avec le virus BVDV à une multiplicité d'infection (Ml) d'environ 1 , puis elles sont mises en culture durant 15 heures. Les cellules infectées ainsi que les cellules contrôles sont rincées dans le tampon PBS, puis fixées par 3% de paraformaldéhyde, afin de subir un marquage par immunofluorescence avec les anticorps anti-NS3 MAb (osc-23). Concernant les infections YFV, les cellules Huh-7 ont été ensemencées sur des lamelles d'une plaque à 24 puits puis infectées 24 heures plus tard. Les cellules ont été infectées en présence d'EGCG pendant 1 heure à 37°C avec le virus YFV et à une Ml d'environ 1 , puis elles sont mises en culture durant 23 h. Les cellules infectées ainsi que les cellules témoins sont rincées dans le tampon PBS, fixées avec 3% de paraformaldéhyde. La réaction d'immunofluorescence est effectuée avec un anticorps anti-E MAb 2D12. Les échantillons de Toto1 101 /Luc (Bick, M.J., et al., J Virol, 2003. 77(21): p. 11555-62.), ainsi que le virus Sindbis (SINV) exprimant la luciférase (système luciferase Firefly) (aimablement fourni par M. MacDonald, Université de Rockefeller, NY, USA), ont été obtenus par électroporation de cellules BHK-21 d'ARN transcrit in vitro. Brièvement, ^g d'ARN sont mélangés avec 4 x 106 cellules BHK-21 suivie d'une étape d'électroporation à 25μΡ et 140V avec un électroporateur à ondes rectangulaires. Le surnageant est récupéré après 48heures.
Microscopie d'immunofluorescence Indirecte.
La procédure de détection des protéines virales immunofluorescentes exprimées dans les cellules infectées est mise en œuvre comme décrit dans la littérature (Rouille, Y., et al., J Virol, 2006. 80(6): p. 2832-41.). Les noyaux sont colorés par une incubation de 5-min dans un tampon PBS contenant 1 μg/ml de 4',6'-diamidino-2-phénylindole (DAPI). Les lamelles sont montées sur des lames de verre en utilisant le milieu de montage Mowiol® (10% Mowiol, 25% glycérol, Tris-HCL 0,1 M pH 8,5) puis observées au moyen du microscope à fluorescence ZEISS® AXIOPHOT équipé avec un grossissement de 10x et 20χ, des objectifs d'ouverture numérique de 0,5. Le signal fluorescence est collecté avec un appareil photo Coolsnap ES (Photometrix) utilisant spécifiquement des filtres d'excitation et d'émission de fluorescence. Les images sont assemblées et travaillées en utilisant le logiciel Adobe Photoshop®. Concernant l'étape de quantification, des images d'aires de chaque lamelle prise au hasard sont enregistrées. Les cellules marquées avec les anticorps anti-E1 MAb A4, anti-BVDV NS3 ou anti-YFV E sont comptabilisées au titre de cellules infectées. Le nombre total de cellules a été comptabilisé par marquage nucléaire au DAPI. Les infections sont définies comme les ratios de cellules infectées sur le nombre total de cellules.
Essais de transmission de cellule à cellule des virus VHCcc.
Les cellules Huh-7 mises en culture dans des plaques 24 puits sont infectées avec les VHCcc pendant 2 heures. L'inocula est éliminé et remplacé par du milieu DMEM complémenté avec du GLUTAMAX®-!, 10 % de SVF et 1 % de gel d'agarose à bas point de fusion (SeaPlaque® Agarose commercialisé par LONZA®) contenant de l'EGCG (50 μΜ) ou un volume équivalent de Diméthyle sulfoxide (DMSO) au titre de témoin. Les cellules sont incubées à 37 °C durant 3 jours au terme desquelles l'agarose est éliminé et les foyers infectieux sont détectés en utilisant l'immunofluorescence indirecte pour les protéines VHC E1 comme précédemment décrit.
Expérimentation de liaison.
Les cellules Huh-7 ont été infectées par des virus JFH-Luc pendant 1 h à 4°C (attachement/étape de liaison) en présence de DMSO ou de 50 μΜ d'EGCG. Les cellules ont été lavées avec du PBS puis à nouveau incubées pendant une 1 h à 4°C (post-attachement/ étape de fixation aux récepteurs de la cellule hôte) en présence de DMSO ou de 50 μΜ d'EGCG. Les cellules sont ensuite lavées afin d'éliminer l'EGCG ou le DMSO puis mise à incuber pendant 1 h à 37°C en présence de DMSO ou de 50 μΜ d'EGCG (endocytose/ étape de fusion). Enfin, les cellules sont lavées puis mises en culture avec du milieu DMEM (Invitrogen®) supplémenté en L-alanyl-L-glutamine (GLUTAMAX-I™) et à 10% de sérum de veau fœtal à 37°C pendant 48h. Le niveau d'infection est calculé par la mesure de l'activité luciférase dans les lysats cellulaires en utilisant le kit Renilla luciferase assay System commercialisé par PROMEGA®.
Test de "bindinq" quantitatif.
VHCcc. Pour les expériences de "binding" quantitatif, du virus VHCcc a été produit en masse et purifié par concentration et séparation sur gradient d'iodixanol. Des surnageants de cellules infectées ont été précipités au PEG 6000 8% à 4°C sur la nuit et centrifugés 25 min à 10 000 rpm. Les culots ont été resuspendus dans 1 mL de PBS, chargés sur un gradient continu de iodixanol (10-40%), et centrifugés à 36 000 rpm pendant 16 h à 4°C. Des fractions de 500 μΐ ont été collectées et le titre de chaque fraction a été déterminé. Les fractions les plus infectieuses ont été rassemblées pour réaliser les expériences.
Test de "binding" quantitatif. Le virus VHCcc a été mis en contact avec les cellules
Huh-7 pendant 1 h à 4^ en présence d'EGCG (50 μΜ), de chlorure de delphinidine (50 μΜ) ou d'héparine intestinale porcine (500 Mg/mL). Après 3 lavages au PBS, les ARNs totaux (cellulaires et viraux) ont été extraits en utilisant le kit NucleoSpin RNA II kit (Macherey-Nagel, Duren, Allemagne) et l'ARN de VHC quantifié par RT-PCR quantitative (Castelain et al., J Clin Virol 2004). L'héparine a été utilisée en parallèle comme contrôle.
Exemple 1
Test de l'effet des différentes catéchines de thé vert sur l'infection du virus VHC
Des cellules Huh-7 ont été infectées par du virus JFH1 -Rluc pendant 2h en présence de DMSO ou de 50μΜ de différentes catéchines à savoir : la (+)-catéchine (C), la (-)-épicatéchine (EC), la (-)-épicatéchine-3-gallate (ECG), la (-)-épigallocatéchine (EGC) et la (-)-épigallocatechine-3-gallate commercialisée par EXTRASYNTHESE® (EGCG EXTRASYNTHESE®) ou par CALBIOCHEM® (EGCG de CALBIOCHEM®). Ces compositions d'EGCG diffèrent par leur degré de pureté EXTRASYNTHESE® >99%, CALBIOCHEM® > 95%. Le DMSO étant utilisé comme solvant pour les différentes catéchines, il sert d'essais contrôle.
Figure imgf000029_0001
(+)-catéchine (C) (-)-épicatéchine (EC) (-)-épigallocatéchine EGC
Figure imgf000029_0002
(-)-épicatéchine-3-gallate ECG (-)-épigallocatéchine-3-gallate (EGCG) Les cellules ont été lysées 48h après l'infection et l'expression de la luciférase est quantifiée.
La mesure de l'infection virale relative des cellules Huh7 par le virus JFH1 -RLuc en fonction de la catéchine présente dans le milieu au cours de l'infection (figure 1 ), permet clairement de constater que ni la (+)-catéchine, ni l'(-)-épicatéchine n'induit l'inhibition de l'infection virale par le VHC. En effet, la mesure de l'infection virale relative est identique à celle observée pour le DMSO.
En revanche, on remarque que l'EGCG qu'il soit commercialisé par CALBIOCHEM® ou par EXTRASYNTHESE® montre un effet antiviral majeur avec une inhibition de l'infection virale supérieure à 95%. Concernant les molécules ECG et EGC un effet antiviral est également constaté, néanmoins, avec un taux d'inhibition de l'infection virale inférieur, de l'ordre d'environ 40% et 80% respectivement.
La mesure de l'infection virale relative en présence de ECG ou d'EGC comparativement à l'EGCG, suggère un effet additif du groupement 3,4,5-trihydroxy-phényl en C2 de l'hétérocycle chromane et cette même structure retrouvée dans le groupement galloyle en C3 de l'hétérocycle chromane sur le rôle antiviral de l'EGCG.
Les molécules d'EGCG qu'elles soient fournies par CALBIOCHEM® ou par EXTRASYNTHESE®, ayant un effet identique quant à l'inhibition de l'infection par VHC, seul l'EGCG fourni par CALBIOCHEM® sera exemplifié par la suite. Exemple 2
Des cellules Huh-7 cultivées in vitro ont été infectées pendant 2 heures par le virus JFH1 -RLuc en présence de doses croissantes d'EGCG (0 ; 0,5 ; 5 ; 50 μΜ) ou par le virus préalablement incubé 45 minutes avec de l'EGCG (50 μΜ). Après infection, les cellules sont lavées avec du milieu de culture DMEM supplémenté avec 10% de sérum de veau fœtal et incubées dans ce même milieu. Quarante-huit heures après infection, les cellules sont lysées et l'activité Renilla luciférase est quantifiée au luminomètre après incubation de 20 μί de lysat cellulaire avec le substrat de la luciférase.
La figure 2 montre que l'inhibition de l'infection virale par l'EGCG est dose dépendante.
A 50 μΜ l'EGCG diminue l'infection virale de cellules Huh-7 en culture d'un facteur supérieur à 10 (IC50 = 5 μΜ). Or, la réplication virale n'est pas affectée par l'EGCG (résultats non montrés). En conséquence, l'EGCG inhibe les premières étapes de l'infection virale, à savoir, les étapes permettant l'entrée du virus dans la cellule.
Par contre, aucun effet de l'EGCG n'est observé sur l'entrée virale, si les cellules non-infectées sont traitées par la molécule avant ou après infection. Par conséquent, l'inhibition induite par l'EGCG agit directement sur le virus et non sur la cellule hôte. Cette hypothèse est confortée par l'observation d'une augmentation de l'effet inhibiteur de l'EGCG lorsque le virus est incubé avec la molécule avant infection (prétraitement 50 μΜ).
Exemple 3
Les protéines de l'enveloppe virale jouent un rôle prépondérant dans l'entrée virale. En effet, en plus de permettre l'interaction avec le(s) récepteur(s) cellulaire(s) hôte, ces protéines permettent d'induire la fusion entre les enveloppes virale et cellulaire. Afin d'étudier l'effet de l'EGCG sur les premières étapes d'infection par le VHC, un model d'étude de référence a été utilisé permettant l'expression de glycoprotéines de l'enveloppe virale d'intérêt : ce sont les pseudoparticules virales infectieuses.
Différents génotypes du virus VHC sont présents dans la population mondiale. Ainsi, afin de déterminer la spécificité de l'effet inhibiteur de l'EGCG quant au génotype viral du VHC, différents génotypes de glycoprotéines d'enveloppe E1 et E2 du virus VHC ont été étudiés. Ont été produites, les pseudoparticules virales infectieuses (VHCpp) exprimant à leur surface les protéines d'enveloppe E1 et E2 du virus VHC des génotypes 1 a, 1 b, 2a, 2b, 3, 4, 5, et 6 ; et, à titre de contrôle, les pseudoparticules du virus VSV exprimant la protéine d'enveloppe du VSV (VSVpp). Les différentes pseudoparticules produites expriment la luciférase afin de quantifier l'infection.
Pour ce faire, des cellules Huh-7 ont été infectées pendant 2 heures par les pseudoparticules VHCpp des différents génotypes testés ou par les pseudoparticules VSVpp en présence d'EGCG à 50 μΜ ou de DMSO. Le DMSO étant le solvant de l'EGCG, il est utilisé comme contrôle. A quarante-huit heures post-infection, les cellules sont lysées et l'activité luciférase est quantifiée au luminomètre après incubation de 20 μί de lysat cellulaire avec le substrat de la luciférase.
Bien que sans effet sur l'infection par le VSVpp, l'EGCG (à 50 μΜ) a un effet inhibiteur sur l'infection des VHCpp de tous les génotypes testés (Figure 3).
En conséquence, l'effet inhibiteur de l'EGCG implique directement les glycoprotéines de l'enveloppe virale. Ainsi, l'inhibition de l'entrée virale médiée par l'EGCG est soit due à une inhibition de l'étape d'attachement à savoir les premières interactions avec le(s) récepteur(s) cellulaire(s) hôte soit une inhibition de l'étape de fusion entre les enveloppes virale et cellulaire, soit ces deux étapes.
Par ailleurs, l'usage des VHCpp exprimant les glycoprotéines virales des différents génotypes viraux montre que l'EGCG est un antiviral efficace du VHC quelque soit le génotype testé. On observe une infection relative pratiquement nulle en présence d'EGCG, lors d'une infection par les VHCpp de génotype 1 b, 2a, 2b et 4. Les infections relatives observées sont très basses pour les génotypes 1 a, 3a, 5 et 6, soit entre 5 et 13%. Ainsi, alors qu'une infection par les VSVpp induit la mesure d'une infection relative de 85% en présence d'EGCG, une infection par les VHCpp quelque soit le génotype concerné induit la mesure d'une infection relative entre 13 à 0% en présence d'EGCG. Ces résultats montrent le fort potentiel de l'EGCG comme antiviral dans le traitement de l'hépatite C quelque soit le génotype viral. En outre, il est important de noter que le génotype 1 de VHC qui est le plus réfractaire aux traitements actuels et le génotype majoritaire dans la population européenne et américaine est également inhibé par l'EGCG. Exemple 4
L'exemple 2 démontre le caractère antiviral de l'EGCG à rencontre du VHC indépendamment de son génotype. L'exemple 2 démontre de plus, que cet effet est spécifique de l'VHC puisque l'EGCG n'inhibe pas l'infection par le VSV. Or, alors que l'VHC est un virus à ARN simple brin à polarité positive, le VSV est un virus à ARN à sens négatif non segmenté.
Ainsi, afin de déterminer le niveau de spécificité de l'EGCG au sein même des virus à ARN simple brin positif, des expériences d'infection en présence d'EGCG ont été réalisées avec d'autres virus de la famille des Flaviviridae.
Ont été testés le virus de la fièvre jaune (YFV), le virus Sindbis (SINV) et le virus de la diarrhée bovine (BVDV). Les infections sont réalisées soit en présence de DMSO soit d'EGCG à 50 μΜ. Les cellules infectées par ces différents virus ont été les Huh-7 pour le YFV ou le SINV et les cellules MDBK pour le BVDV. La quantification de l'infection a été réalisée par immunofluorescence après marquage des cellules infectées avec un anticorps anti-E (2D12) pour le virus YFV ou un anticorps anti-NS3 (osc23) pour le virus BVDV. Une étape de révélation avec un anticorps secondaire marqué au Cy3 est ensuite réalisée. Concernant le virus SINV, ce dernier exprimant la luciférase, la mesure de l'infection relative a été réalisée par la quantification de la luciférase. La quantification de l'infection en fonction de la présente d'EGCG ou de DMSO dans le milieu au cours de l'infection des cellules par les virus YFV, BVDV et SINV (figure 4) montre clairement que l'EGCG n'a pas d'effet inhibiteur de l'infection cellulaire par l'un quelconque de ces virus.
En conséquence, l'EGCG n'est pas un antiviral pour les autres membres de la famille des Flaviviridae. L'effet antiviral de l'EGCG est donc spécifique au VHC.
Exemple 5
Les résultats décrits précédemment montrent que l'EGCG inhibe l'entrée du virus dans les cellules en culture. Un deuxième mode d'infection virale est la transmission du virus de cellule à cellule. Pour déterminer si l'EGCG inhibe également la propagation du virus de cellule à cellule, des cellules Huh-7 ont été infectées par le virus JFH1 pendant 2 heures, puis incubées dans un milieu contenant 1 % d'agarose en présence ou non d'EGCG (à 50 μΜ). L'agarose évite l'infection des cellules par le virus sécrété dans le milieu et permet ainsi de visualiser la transmission du virus de cellules à cellules par contact des cellules entre elles.
A soixante-douze heures post-infection, les cellules sont fixées et l'infection est détectée par immunofluorescence après marquage par un anticorps anti-E1 . Une étape de révélation est ensuite réalisée avec un anticorps secondaire couplé au Cy3. Les noyaux sont colorés au marquage DAPI. Le nombre de cellules par foyer infectieux est quantifié (Figure 5). En présence d'EGCG les foyers infectieux sont beaucoup plus petits. Ils contiennent en moyenne 3-4 cellules infectées montrant que le virus ne s'est pas propagé après avoir infecté une cellule. Par contre, les foyers contrôles contiennent en moyenne 45 cellules infectées. Au vu de ce qui précède, l'EGCG est un inhibiteur de la propagation du virus VHC de cellule à cellule.
L'EGCG semble être un bon candidat comme antiviral pour empêcher la réinfection d'un foie sain après une greffe chez un patient infecté.
Exemple 6
Des expériences d'infection successives en présence ou non d'EGCG à partir de surnageants de cellules infectées ont été menées afin de tester l'efficacité de l'EGCG sur la virulence d'un surnageant de cellules infectées, ainsi que ses capacités d'éradication du virus de surnageants de culture infectés. Des cellules Huh-7 ont été infectées par le virus VHC JFH1 (PO). Du DMSO ou 50 μ M d'EGCG ont été ajoutés post-infection. Le surnageant de culture est collecté après 48 heures puis utilisé pour infecter des cellules saines en présence de DMSO ou de 50 μΜ d'EGCG (P1 ). Le surnageant de cette culture (P1 ) est collecté à son tour après 48 heures et utilisé pour réinfecter des cellules saines (P2). Cette procédure est reproduite encore deux fois (jusqu'à P4). Le nombre de cellules infectées a été quantifié à chaque passage par immunofluorescence après marquage des cellules avec un anticorps dirigé contre la protéine d'enveloppe virale E1 (A4). Le nombre total de cellules est quantifié par comptage des noyaux après coloration au marquage DAPI.
L'étude du pourcentage de cellules infectées à chaque passage d'un surnageant d'une culture à une autre en fonction l'adjonction d'EGCG ou de DMSO (figure 6), montre que l'EGCG permet une élimination du VHC du surnageant de culture dès le troisième passage et une complète élimination au quatrième passage. Ceci permet de conclure que l'EGCG est un bon candidat comme molécule curative chez les patients infectés par le VHC.
Exemple 7
L'entrée du VHC dans la cellule hôte est composée de 3 étapes i) l'attachement du virus ou d'une cellule hôte infectée à la surface de la cellule hôte non infectée, ii) l'interaction avec le(s) récepteur(s) spécifique(s) viraux et iii) la fusion de l'enveloppe lipidique virale et de la cellule hôte infectée (membrane plasmique ou endosomale) permettant l'introduction du génome viral dans le cytoplasme de la cellule infectée. Afin de déterminer laquelle de ces étapes est inhibée par l'EGCG, l'entrée virale a été fractionnée de sorte à étudier séparément l'effet inhibiteur de l'EGCG sur chacune de ces étapes (voir figure 7 A).
L'étape d'attachement des particules virales aux cellules s'effectue par une mise en présence du virus suivie d'une incubation d'une heure à 4^. La seconde étape s'effectue par incubation des cellules pendant une heure à 4°C après retrait des inocula viraux, permettant aux virus attachés de renforcer leur attachement avec leurs récepteurs. A 4°C, le processus d'endocytose est bloqué. Ainsi, la troisième étape d'endocytose et de fusion des membranes virales et cellulaires s'effectue à 37 °C durant une heure.
Du DMSO ou 50 μΜ d'EGCG sont ajoutés durant ces différentes étapes suivant les échantillons concernés comme représenté sur le diagramme (Figure 7A). Ainsi, l'échantillon 1 est l'échantillon témoin ayant reçu du DMSO au cours de la première étape. Les autres échantillons correspondant à l'adjonction de 50 μΜ d'EGCG durant l'étape d'attachement (échantillon 2), d'interaction avec les récepteurs de la cellule hôte (échantillon 3), d'endocytose et de fusion de l'enveloppe lipidique virale et de la cellule hôte infectée (échantillon 4) ou durant l'ensemble des trois étapes de l'entrée (échantillon 5).
Les cellules sont ensuite incubées pendant 45h à 37 °C puis lysées afin de quantifier l'activité luciférase. L'infection est exprimée en pourcentage de l'activité luciférase mesurée sans l'EGCG. Les expériences sont réalisées en triplicate et les valeurs données correspondent aux valeurs moyennes de ces trois différentes expériences.
Comme montré à la figure 7B, une forte réduction de l'infection est observée lorsque l'EGCG est ajouté dès l'étape d'attachement (échantillons 2 et 5). Par contre, l'EGCG ne semble pas avoir d'effet sur l'étape d'interaction avec les récepteurs de la cellule hôte (échantillon 3) ou lors de l'étape d'endocytose ou de fusion (échantillon 4). L'ensemble de ces résultats démontre que l'EGCG inhibe les étapes précoces de liaison du VHC à la membrane plasmique de la cellule hôte à s'avoir l'étape d'attachement du VHC à la cellule hôte.
Exemple 8
Les cellules Huh-7 ont été infectées par VHCcc pendant 2h en présence de doses croissantes d'EGCG ou de chlorure de delphinidine. Le taux d'infection a été déterminé 34 h après inoculation en détectant la protéine d'enveloppe E1 par immunofluorescence en utilisant un anticorps anti-E1 (A4) puis un anticorps secondaire anti-lgG de souris conjugué au fluorochrome Cy3. Cette expérience montre que le chlorure de delphinidine, comme l'EGCG, inhibe l'infection des cellules par le VHCcc de façon dose-dépendante (Fig 8). La concentration inhibant 50% de l'infection (IC50) a été déterminée dans ces expériences. L'IC50 calculée de l'EGCG est d'environ 1 1 μΜ alors que celle du chlorure de delphinidine est d'environ 3,5 μΜ.
Ces résultats montrent d'une part, que le chlorure de delphinidine est un nouvel inhibiteur de l'entrée du VHC dans les cellules et d'autre part, que cette molécule a une efficacité supérieure comparée à l'EGCG comme agent antiviral anti-VHC.
Exemple 9
L'exemple 3 démontre que l'EGCG inhibe une étape précoce de l'entrée du VHC dans les cellules médiée par les glycoprotéines de surface du VHC.
Pour déterminer si l'étape d'attachement à la surface cellulaire était inhibée par l'EGCG, des tests de "binding" (ou d'attachement) quantitatifs ont été réalisés. L'action du chlorure de delphinidine a été testée en parallèle. L'héparine, un inhibiteur connu de l'attachement du VHC, à la surface cellulaire, a été utilisée comme contrôle positif. Les cellules ont été incubées avec du VHCcc purifié à une multiplicité d'infection de 10 pendant 1 h à 4°C en présence DMSO, de 50 μΜ d'EGCG, de 50 μΜ de chlorure de delphinidine ou de 500 μς/ιηί d'héparine. Les cellules ont été lavées 3 fois avec du PBS froid et l'ARN total extrait. La quantité de virus fixé a été déterminée en quantifiant l'ARN génomique viral par RT-PCR quantitative. Comme attendu, l'attachement du virus à la surface des cellules en présence d'héparine est fortement diminué (Fig 9). De la même façon, en présence d'EGCG ou de chlorure de delphinidine, une forte diminution de l'attachement du virus à la surface cellulaire est également observée. L'ensemble de ces résultats montre qu'à la fois l'EGCG et le chlorure de delphinidine probablement en agissant directement sur la particule virale, inhibent l'entrée virale en empêchant l'attachement du VHCcc à la surface cellulaire.

Claims

REVENDICATIONS
1 .- Composé de formule (I)
Figure imgf000037_0001
dans laquelle :
• X est O quand a est une liaison simple ou 0+ quand a est une liaison double,
• R1 et R2 sont indépendamment l'un de l'autre un atome d'hydrogène, un groupement hydroxyle ou un groupement méthoxyl,
• R3, R5 et R7 sont indépendamment les uns des autres, un atome d'hydrogène, un groupement OH, un groupement O-glycosyle, un alcoxyle en (C1 -C18) ou un groupement de formule (II)
Figure imgf000037_0002
• R4 et R6 sont indépendamment l'un de l'autre, un atome d'hydrogène ou un groupement OH,
• R4' est un atome d'hydrogène ou R4' est avec R4 et l'atome de carbone auquel ils sont liés, un groupement C=0, lorsque a est une simple liaison ou R4' n'est rien lorsque a est une double liaison,
• a et b identiques ou différents étant soit une simple liaison, soit une double liaison,
sous réserve qu'au moins l'un des groupes R3, R5 et R7 est un groupement de formule (II) et/ou R1 et R2 sont l'un et l'autre des groupements OH,
ou un de ses sels ou esters pharmaceutiquement acceptables, ledit composé de formule (I) étant sous forme de stéréoisomère pur ou sous forme de mélange d'énantiomères et/ou de diastéréoisomères, y compris de mélanges racémiques,
pour une utilisation comme agent antiviral dans le traitement et/ou la prévention d'une infection par le virus de l'hépatite C (VHC).
2. - Composé pour son utilisation selon la revendication 1 , caractérisé en ce que ledit composé est un agent antiviral par inhibition de l'infection d'une cellule hôte par le VHC et/ou de la transmission du VHC d'une cellule hôte infectée à une autre cellule hôte.
3. - Composé pour son utilisation selon la revendication 2, caractérisé en ce que ledit composé est un agent antiviral par inhibition de l'entrée du VHC dans une cellule hôte.
4.- Composé pour son utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que ledit composé est un agent antiviral par inhibition de l'adhésion du virus de l'hépatite C, ou d'une cellule hôte infectée par le virus de l'hépatite C, à la membrane d'une cellule hôte non-infectée.
5.- Composé pour son utilisation selon l'une quelconque des revendications 2 à 4, caractérisé en ce que ladite cellule hôte est une cellule hépatocytaire.
6. - Composé pour son utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que ledit composé est un agent antiviral par inhibition de l'interaction des glycoprotéines de surface du VHC avec au moins une protéine cible d'une cellule hôte.
7. - Composé pour son utilisation selon la revendication 6, caractérisé en ce que ledit composé est un agent antiviral par inhibition de l'interaction des glycoprotéines E1 et/ou E2 du VHC avec au moins une protéine cible d'une cellule hôte.
8. - Composé pour son utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 7 caractérisé en ce que le traitement et/ou la prévention de l'infection par le VHC est destiné à un patient résistant ou intolérant au traitement d'une infection par le VHC par un agent immunomodulateur et/ou par un inhibiteur du métabolisme viral.
9. - Composé pour son utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, caractérisé en ce que le composé selon l'invention est un composé de formule (III) :
Figure imgf000039_0001
dans laquelle :
• R1 et R2 sont indépendamment l'un de l'autre un atome d'hydrogène, un groupement hydroxyle ou un groupement méthoxyl,
• R3, R5 et R7 sont indépendamment les uns des autres, un atome d'hydrogène, un groupement OH, un groupement O-glycosyle, un alcoxyle en (C1 -C18) ou un groupement de formule (II)
Figure imgf000039_0002
• R6 est un atome d'hydrogène ou un groupement OH, et
au moins un des R3, R5 ou R7 est un groupement de formule (II), ou R1 et R2 sont l'un et l'autre des groupements OH,
ou un de ses sels ou esters pharmaceutiquement acceptables.
10.- Composé pour son utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, caractérisé en ce que le composé selon l'invention est un composé de formule (IV)
Figure imgf000039_0003
dans laquelle :
• R1 et R2 sont indépendamment l'un de l'autre un atome d'hydrogène, un groupement hydroxyle ou un groupement méthoxyl,
• R3 est groupement OH, un groupement O-glycosyle, un alcoxyle en (C1 -C18) ou un groupement de formule (II)
Figure imgf000040_0001
• R5 et R7 sont indépendamment l'un de l'autre, un atome d'hydrogène, un groupement OH, un groupement O-glycosyle, un alcoxyle en (C1 -C18) ou un groupement de formule (II),
• R6 est un atome d'hydrogène ou un groupement OH, et
au moins un des R3, R5 ou R7 est un groupement de formule (II), ou R1 et R2 sont l'un et l'autre des groupements OH,
ou un de ses sels ou esters pharmaceutiquement acceptables.
1 1 .- Composé pour son utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, caractérisé en ce que le composé selon l'invention est un composé de formule (V)
Figure imgf000040_0002
dans laquelle :
• R1 et R2 sont indépendamment l'un de l'autre un atome d'hydrogène, un groupement hydroxyle ou un groupement méthoxyl,
• R3 est un groupement OH, un groupement O-glycosyle, un alcoxyle en (C1 -C18) ou un groupement de formule (II)
Figure imgf000040_0003
• R5 et R7 sont indépendamment l'un de l'autre un atome d'hydrogène, un groupement OH, un groupement O-glycosyle, un alcoxyle en (C1 -C18) ou un groupement de formule (II), et
au moins un des R3, R5 ou R7 est un groupement de formule (II), ou R1 et R2 sont l'un et l'autre des groupements OH,
ou un de ses sels ou esters pharmaceutiquement acceptables.
12.- Composé pour son utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, caractérisé en ce que le composé selon l'invention est un composé de formule (I)
Figure imgf000041_0001
dans laquelle,
• X est O quand a est une liaison simple ou 0+ quand a est une liaison double, a et b identiques ou différents étant soit une simple liaison, soit une double liaison,
• les groupements R1 , R5 et R7 sont des groupements hydroxyles,
• R2 est un groupement hydroxyle ou un atome d'hydrogène,
• R3 est un groupement hydroxyle, un atome d'hydrogène ou un groupement galloyle de formule (II)
Figure imgf000041_0002
• R4' est un atome d'hydrogène lorsque a est une simple liaison ou R4' n'est rien lorsque a est une double liaison, et
• R6 est un atome d'hydrogène,
ou un de ses sels ou esters pharmaceutiquement acceptables.
13.- Composé pour son utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 12, caractérisé en ce que ledit composé est sélectionné dans le groupe constitué des anthocyanidines, des anthocyanes, des flavonols et des flavan-3-ols.
14.- Composé pour son utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, 1 1 à 13 caractérisé en ce que ledit composé est une anthocyanidine sélectionnée dans le groupe constitué de la delphinidine, la Pulchéllidine ou la tricétinidine ou un flavan-3-ol sélectionné dans le groupe constitué de l'épigallocatéchine (EGC), l'épigallocatéchine gallate (EGCG), la gallocatéchine (GC), la catéchine gallate (CG), la gallocatéchine gallate (GCG), l'épicatéchine (EC), l'épicatéchine gallate (ECG), leurs sels et esters pharmaceutiquement acceptables, et leurs mélanges.
15.- Composé pour son utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 9 et 1 1 à 14, caractérisé en ce que ledit composé est l'épigallocatéchine (EGC), l'épicatéchine gallate (ECG), l'épigallocatéchine gallate (EGCG), la delphinidine ou un de ses sels ou esters pharmaceutiquement acceptables.
16.- Composé pour son utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à
15, caractérisé en ce que ledit composé est co-administré avec un agent additionnel destiné au traitement et/ou à la prévention d'une infection par le VHC.
17. - Composé pour son utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 16, caractérisé en ce que ledit composé est le seul agent antiviral administré pour le traitement et/ou la prévention de l'infection par le VHC.
18. - Méthode ex vivo de réduction de l'infectiosité ou d'inactivation d'un virus de l'hépatite C (VHC), ladite méthode comprenant une étape de mise en contact dudit VHC avec un composé de formule (I)
Figure imgf000042_0001
dans laquelle :
• X est O quand a est une liaison simple ou 0+ quand a est une liaison double,
• R1 et R2 sont indépendamment l'un de l'autre un atome d'hydrogène, un groupement hydroxyle ou un groupement méthoxyl,
• R3, R5 et R7 sont indépendamment les uns des autres, un atome d'hydrogène, un groupement OH, un groupement O-glycosyle, un alcoxyle en (C1 -C18) ou un groupement de formule (II)
Figure imgf000043_0001
• R4 et R6 sont indépendamment l'un de l'autre, un atome d'hydrogène ou un groupement OH,
• R4' est un atome d'hydrogène ou R4' est avec R4 et l'atome de carbone auquel ils sont liés, un groupement C=0, lorsque a est une simple liaison ou R4' n'est rien lorsque a est une double liaison,
• a et b identiques ou différents étant soit une simple liaison, soit une double liaison,
sous réserve qu'au moins l'un des groupes R3, R5 et R7 est un groupement de formule (II) et/ou R1 et R2 sont l'un et l'autre des groupements OH,
ou un de ses sels ou esters pharmaceutiquement acceptables, ledit composé de formule (I) étant sous forme de stéréoisomère pur ou sous forme de mélange d'énantiomères et/ou de diastéréoisomères, y compris de mélanges racémiques.
19.- Méthode ex vivo d'inactivation selon la revendication 18, dans laquelle ledit VHC est présent dans un échantillon biologique.
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