EP1203076A1 - Procede de culture in vitro de virus des familles togaviridae et flaviviridae et applications - Google Patents

Procede de culture in vitro de virus des familles togaviridae et flaviviridae et applications

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Publication number
EP1203076A1
EP1203076A1 EP00956580A EP00956580A EP1203076A1 EP 1203076 A1 EP1203076 A1 EP 1203076A1 EP 00956580 A EP00956580 A EP 00956580A EP 00956580 A EP00956580 A EP 00956580A EP 1203076 A1 EP1203076 A1 EP 1203076A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
virus
cells
medium
culture
togaviridae
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP00956580A
Other languages
German (de)
English (en)
Inventor
Patrice Andre
Vincent Lotteau
Glaucia Paranhos-Baccala
Florence Komurian-Pradel
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Biomerieux SA
Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
Original Assignee
Biomerieux SA
Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Biomerieux SA, Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM filed Critical Biomerieux SA
Publication of EP1203076A1 publication Critical patent/EP1203076A1/fr
Withdrawn legal-status Critical Current

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Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G01N33/56983—Viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/24011—Flaviviridae
    • C12N2770/24211—Hepacivirus, e.g. hepatitis C virus, hepatitis G virus
    • C12N2770/24251—Methods of production or purification of viral material
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/005—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from viruses
    • G01N2333/08—RNA viruses
    • G01N2333/18—Togaviridae; Flaviviridae

Definitions

  • the subject of the present invention is in particular a process for the culture and in vitro propagation of an RNA virus involved in the development of human viral pathologies.
  • the cultivation and propagation method of the invention applies mainly to viruses belonging to the families of Togaviridae and Flavi viridae. These viruses have the common characteristics of being enveloped viruses with non-segmented positive-sense single-stranded RNA.
  • the Togaviri dae family includes viruses of the genera Alphavirus and Rubi virus. Virions have a diameter of 70 nm, are spherical and have an envelope and peplomers composed of a heterodimer of two glycoproteins. The genome consists of a single molecule of single-stranded RNA from 9.7 to 11.8 b. Structural proteins include a capsid protein and two envelope glycoproteins. Virions contain lipids derived from the cell membranes of the host. Replication involves the synthesis of a complementary RNA strand, which serves as a template for the synthesis of genomic RNA.
  • the genomic RNA serves as a template for an intermediate replication RNA, which in turn serves as a template for the synthesis of RNA and the production of a polyprotein precursor which is cleaved to obtain structural and non-structural proteins. Replication takes place in the cytoplasm and assembly involves budding through the membrane.
  • the Sindbis virus, the equine encephalitis viruses (eastern, western, Venezuelan), the chikungunya virus, the o 'nyong-nyong virus, the Igbo Ora virus, the Ross River virus, the Mayaro virus and the Barmah Forest viruses belong to the genus of Alpha viruses and are pathogens for humans.
  • the hepatitis E virus is currently classified in the Alphavirus group, although it is non-enveloped and smaller.
  • the rubella virus which is classified in the genus of Rubiviruses is also a pathogen for humans.
  • Flaviviridae In the family of Flaviviridae are classified viruses of the genera Flavivirus (flavivirus), Pestivirus (mucosal disease virus) and Hepacivirus (hepatitis C and G virus).
  • the virions are spherical with a diameter of 45 to 60 n in diameter and consist of a lipid bilayer enveloping an icosahedral capsid enclosing the genome.
  • the genome consists of a single, single-strand, positive-sense linear RNA molecule of 10.7 kb for flaviviruses, 12.5 kb for pestiviruses and 9.5 kb for hepatitis C virus.
  • Virions contain two or three proteins associated with the membrane and a core protein.
  • Virions contain lipids derived from the cell membranes of the host. They contain carbohydrates in the form of glycolipids and glycoproteins. Replication involves the synthesis of complementary RNA which serves as a template for the synthesis of genomic RNA.
  • a single reading frame (ORF) codes for a polyprotein which is cleaved by viral and cellular proteolysis.
  • Structural proteins are encoded by the 5 'end and non-structural proteins are encoded by the 3' end of RNA.
  • Replication takes place in the cytoplasm and assembly involves passage and envelopment by the membranes of the host's endoplasmic reticulum. Replication is accompanied by a characteristic aspect of proliferation of intracellular membranes.
  • the yellow fever virus, the dengue virus, the Japanese encephalitis virus, the West Nile virus, the St. Louis encephalitis virus, the Murray Valley virus, the transmitted encephalitis by ticks and the meningoencephalitis virus from the turkey of Israel belong to the genus of Flaviviruses and are pathogens for humans.
  • the bovine diarrhea virus, the pig cholera virus and the sheep border disease virus belong to the genus Pestivirus.
  • Hepaci virus As for the genus Hepaci virus, it currently includes the hepatitis C and hepatitis G viruses (GBV-C and the viruses GBV-A and GBV-B) which are well known to be agents infecting humans.
  • GBV-C hepatitis C and hepatitis G viruses
  • GBV-A and GBV-B hepatitis G viruses
  • hepatitis C is the main cause of hepatitis acquired by transfusion. Hepatitis C can also be transmitted by other percutaneous routes, for example by injecting drugs intravenously. The risk of contamination of health professionals is also not negligible.
  • Hepatitis C is distinguished from other forms of liver disease associated with viruses, such as hepatitis A, B or D. Infections with the hepatitis C virus (HCV or HCV) are often chronic, resulting in liver diseases, such as hepatitis, cirrhosis and carcinoma in a large number of cases.
  • viruses such as hepatitis A, B or D.
  • HCV hepatitis C virus
  • HCV hepatotropic virus isolated using molecular biology techniques. The viral genome sequences were cloned before the viral particle was visualized.
  • HCV is a 9.5 kb positive single-strand RNA virus which replicates with a copy of complementary RNA and whose translation product is a precursor of a single polyprotein of approximately 3,000 amino acids.
  • the 5 'end of the HCV genome corresponds to an untranslated region adjacent to the genes that code for structural proteins, the core protein of the nucleocapsid and the two envelope glycoproteins, E1 and E2 / NS1.
  • the 5 'untranslated region and the core gene are relatively well conserved in the various genotypes, but the E2 envelope proteins are encoded by a hypervariable region different from one isolate to another isolate.
  • the 3 'end of the HCV genome contains the genes that code for non-structural proteins (NS) and for a well-conserved 3' non-coding region. Because of its genomic organization and its presumed mode of replication, HCV has been classified into a new genus in the family of Flaviviridae, the Hepaciviruses.
  • NS non-structural proteins
  • diagnostic immunoassays have been performed to detect antibodies to HCV proteins in patient sera.
  • the synthesis of cDNA by reverse transcription of viral RNA and amplification by PCR have also been used to detect the HCV genome, as the indirect measurement of a potentially infectious virus in the seru s of humans infected in a way chronic or those of experimentally infected chimpanzees.
  • hybridization techniques with a DNA probe have also been developed.
  • existing diagnostic techniques lack sensitivity and / or specificity and / or suffer from implementation difficulties. For example, with the probe hybridization method it is impossible to distinguish between a virus with low infectious power and a virus with high infectious power. It is therefore necessary, but difficult to implement, to inoculate the virus to be tested with a chimpanzee and to test the resulting infection on the animal.
  • HGV is a virus that was independently discovered by two different teams, one called it HGV and the other GBV-C. It has a genomic structure close to that of flaviviruses. Its 2,900 amino acid polyprotein is coded by an RNA of 9,400 nucleotides, the 5 'end of which codes for structural proteins (truncated nucleocapsid and envelope) and the 3' end of which codes for proteins that play a role in replication. . It is transmitted by blood transfusion and can be detected in patients with acute, chronic and fulminant hepatitis. Its contribution in acute and chronic liver diseases is still poorly understood. GBV-A and GBV-B have also been described and are very close to HGV.
  • particles containing viral RNA In the plasma of patients infected with HCV are found particles containing viral RNA very heterogeneous in density. This heterogeneity in density of the particles containing viral RNA is attributed to their association in variable proportion with lipoproteins.
  • LVPs lipo-viro-particles
  • LDLs Low Density Lipoprotems
  • VLDLs Very Low Density Lipoprotems
  • the size described (50 nm) brings them closer to the VLDLs.
  • the particles can be precipitated, sometimes even in their entirety, by anti- ⁇ -lipoproteme sera (Thomsen et al., 1992, Med. Microbiol. Immunol. 181: 293; Prince et al., 1996, J. Viral. Hepat. 3:11).
  • G can be precipitated, almost entirely, by anti- ⁇ -lipoprotein sera obtained from patients chronically infected with HGV (Sato et al. Biochem.
  • HCV infection of human hepatocytes is accompanied by an intracytoplasmic accumulation of lipid vesicles.
  • the transfection of the HCV gene coding for the capsid in a continuous line of human hepatocytes (Hep / G2) induces the same phenomenon (Barba et al., 1997, PNAS 94: 1200).
  • These vesicles are rich in triglycerides.
  • the HCV capsid protein is attached to the surface of the vesicles, as is the apolipoprotein apo A-II.
  • Apolipoproteins allow the transport of lipids by providing structural stability and solubility to the lipoprotein particles with which they are associated. They also determine the fate of these particles in metabolism, in particular by targeting them on receptors.
  • Apo B 100 is the main apolipoprotein in VLDLs, LDLs and IDLs (Intermediate Density Lipoproteins). It is synthesized in the liver and is essential for the assembly and secretion of VLDLs from the liver. It also constitutes a ligand for the binding of LDLs to their receptors.
  • One of the LDL receptors, the LDL receptor is a cell surface protein that binds and internalizes cholesterol-rich lipoproteins that contain apo B 100 and apo E.
  • Apo E is mainly synthesized in hepatocytes. It constitutes a ligand for the binding of different lipoproteins to the LDL receptor and to LRP (LDL-receptor-related protein).
  • Apo B 48 is essential for the assembly and secretion of chylomicrons. It is encoded by the same gene and the same mRNA as apo B 100, but in the intestine a mutation introduces a stop codon so that apo B 48 contains only 48% of the total length of apo B 100. Its role in The metabolism of chylomicrons in plasma is poorly understood, but individuals who have mutations that interfere with its normal synthesis have no, or very low levels, of chylomicrons, VLDLs, IDLs and LDLs.
  • LVPs are ligands for an endocytosis pathway associated with receptors, preferably for LSR (Lipolysis-Stimulated Receptor) (Frances T. Yen et al., Biochemistry, 1994, 33, 1172-1180 and Bernard E. Biha and Frances T. Yen, Biochemistry, 1992, 31, 4628-4636).
  • LSR Lipolysis-Stimulated Receptor
  • LVPs can be associated with human immunoglobum.
  • they have developed new processes which allow the culture, propagation and m replication of viruses belonging to the families of Togaviridae and Flavi viridae. These methods, which make it possible to obtain a propagation of these viruses, are useful in particular for studying their replication mechanisms, for testing neutralizing antibodies and antivirals, for developing biological materials for diagnosis and therapy.
  • the methods of the invention make it possible to obtain an infected cell line useful for screening and / or selecting at least an anti-viral molecule, by bringing the infected cell line into contact with the anti-viral molecule.
  • the fraction of LVPs is brought into contact, for a predetermined time in an appropriate culture medium, with permissive cells which have an endocytosis pathway relayed by at least one lipoprotein receptor and modulated by an activating agent.
  • permissive cells chosen from unsaturated fatty acids, derivatives of unsaturated fatty acids comprising from 16 to 20 carbon atoms and their mixtures.
  • the lipoprotein receptor is LSR and / or the LDL surface receptor and advantageously said permissive cells have both receptors.
  • the unsaturated fatty acid is chosen from oleic acid, palmitoleic acid, linoleic acid, linolenic acid, arachidonic acid, trans-hexadecenoic acid and elaidic acid or their derivatives.
  • the fatty acid retained is oleic acid which is added to the culture medium at a concentration of between 0.1 and 1 mM, preferably 0.5 mM.
  • the cells are preferably cells chosen from human or animal hepatocyte cells, the group of human or animal hepatocarcino cell lines, dendritic cells, macrophagic cells, Kuppfer cells and their combinations associated or not with lymphocytes.
  • these cells are human epatocarcinoma cells of the PLC / PRF / 5 cell line.
  • the culture medium comprises, in addition to the ingredients necessary for the culture and the agent activator, at least one agent modulating apoptosis.
  • This apoptosis modulating agent is chosen from interferons, anti-terferons, in particular anti-alpha and beta interferons, anti-caspase 3, in particular peptide analogs, such as z-VADf k, c ' ie N-benzyloxycarbonyl-Val-Ala-Asp-fluoromethyl ketone, and the antibodies directed against anti-caspase 3.
  • the present inventors have observed that in patients infected with both HIV and the Hepacivirus HCV, taking certain HIV protease inhibitors, such as Ritonavir (trade name) leads to an increase in viremia.
  • HCV associated with hepatic cytolysis.
  • the observation of a hepatic cytolysis immediately after taking a drug which, in addition to its anti-protease activity, also modifies the regulation of apoptosis is evocat ⁇ ce of an induction of the apoptosis signal. This is why, it is advantageous to add to the process of the invention at least one agent for modulating apoptosis.
  • the suitable medium selected is in particular chosen from DMEM medium or a medium derived from DMEM medium and RPMI medium or a medium derived from RPMI medium.
  • it is a medium derived from the DMEM medium which comprises the complete DMEM medium marketed by the company Gibco BRL, supplemented with 0 to 10 mM of sodium pyruvate, 0 to 10% of non-essential amino acids, 1 to 10 mM glutam, 100 to 200 U / ml of penicillin, 100 to 200 mg / ml of streptomycin and 1 to 20 of calf serum.
  • This medium advantageously further comprises 0.1 to 0.5% of BSA (bovine serum albumin) or HSA (human serum albumin) coupled to a fatty acid, according to the method of Dixon et al., 1991, Journal of Biological Chemistry, vol. 266, p 5080.
  • BSA bovine serum albumin
  • HSA human serum albumin
  • the culture, propagation and replication method described above is particularly well suited to the culture, propagation and replication of viruses belonging to the family of Flavi viridae and to the genus Hepacivirus, in particular the hepatitis C viruses and hepatitis G, including the GBV-A, GBV-B and GBV-C viruses, for which there has been no effective culture method to date.
  • a subject of the invention is also a culture medium for the culture of viruses belonging to the families of Togaviridae and Flavi viridae, which medium comprises the complete DMEM medium sold by the company Gibco BRL, supplemented with 0 to 10 mM sodium pyruvate, 0 to 10% of non-essential amino acids, 1 to 10 M of glutin, 100 to 200 U / ml of penicillin, 100 to 200 mg / ml of streptomycin and 1 to 20 ° of calf serum.
  • This medium advantageously comprises more than 0.1 to 0.5% of BSA (bovine se ⁇ que albumin) or HSA (human serum albumin), coupled to a fatty acid, according to the method cited with reference above.
  • the invention also relates to a cell line infected with at least one virus belonging to the families of Togaviridae and Flavi viridae, in which the cells in the cell line are permissive cells which have a relayed endocytosis pathway. by at least one lipoprotein receptor, capable of being modulated inter alia by an activating agent, said cells being capable of propagating and replicating the virus.
  • the receptor is the LSR and / or the LDL receptor and advantageously the permissive cells have the two receptors.
  • the cell line is a line in which the cells are derived by infection of a cell chosen from primary cells of human or animal hepatocytes, cells of the group of cell lines of human and animal hepatocarcinoma, in particular a cell from the human hepatocarcinoma cell line PLC / PRF / 5 which has a lipoprotein surface receptor which can be activated by fatty acids, denditric cells, macrophagic cells and Kuppfer cells.
  • the invention is not limited to a cell of a cell line which has at least the lipoprotein LSR surface receptor and includes transfected or transformed cells which are capable of expressing on their surface the LSR receptor and / or the LDL receptor.
  • the infected cell line obtained according to the method of the invention can be used to screen and / or select at least one anti-viral molecule according to which the anti-viral molecule and the infected cell line are brought into contact.
  • the invention also relates to a method for preparing a composition for detection in a sample of antibodies directed against at least one virus belonging to the families of Toga viri da e and Flavi viridae which comprises at least a partial or total purification of the viral particles of said virus or polypeptides obtained from one of the methods as defined above.
  • said viral particles or said polypeptides are fixed on a solid support.
  • the invention relates to a method for obtaining antibodies or antibody fragments directed against at least one virus belonging to the families of Togaviridae and Flaviviridae according to which an animal is immunized with viral particles or polypeptides obtained with from one of the methods as defined above.
  • polyclonal and monoclonal antibodies or antibody fragments are part of the general knowledge of those skilled in the art. Examples include Kôhler G. and Milstein C. (1975) Continuous culture of fused cells secreting antibody of predefined specificity, Nature, 256: 495-497 and Galfre G. et al. (1977) Nature, 266: 522-550 for the production of polyclonal antibodies and Roda A., Bolelli GF Production of high titer antibody to bile acids, Journal os Steroid Biochemistry, Vol. 13, pp 449-454 (1980) for the production of polyclonal antibodies.
  • Antibodies can be produced by immunizing mice or rabbits with the viral particles or the polypeptides obtained according to the method of the invention.
  • the immunogen can be coupled to Lymphet Keyhole hemocyanin (peptide KLH) as a carrier for immunization or to serum albumin (peptide SA).
  • the animals are injected with immunogen using complete Freund's adjuvant.
  • the sera and hybrid culture supernatants from immunized animals are analyzed for their specificity and their selectivity using standard techniques, such as for example ELISA or Western Blot tests.
  • the hybridomas producing the most specific and sensitive antibodies are selected.
  • Monoclonal antibodies can also be produced in vitro by cell culture of the hybridomas produced or by recovery of ascites fluid, after intraperitoneal injection of the hybridomas in mice. Whatever the mode of production, in H
  • the antibodies are then purified.
  • the purification methods used are essentially filtration on an ion exchange gel and exclusion chromatography or immunoprecipitation. A sufficient number of antibodies are screened in functional tests to identify the best performing antibodies.
  • the in vitro production of antibodies, antibody fragments or antibody derivatives, such as chimeric antibodies produced by genetic engineering is well known to those skilled in the art.
  • antibody fragment is meant the fragments F (ab) 2, Fab, Fab ', sFv (Blazar et al., 1997, Journal of Immunology 159: 5821-5833 and Bird et al., 1988, Science 242 : 423-426) of a native antibody and by derivative means, inter alia, a chimeric derivative of a native antibody (see for example Arakawa et al., 1996, J. Biochem 120: 657-662 and Chaudray et al ., 1989, Nature 339: 394-397).
  • the invention also relates to a diagnostic composition comprising at least the viral particles or the polypeptides obtained according to the method of the invention or the antibodies obtained according to the method defined above and a diagnostic kit comprising inter alia said composition, as well as a composition vaccine comprising at least the viral particles or the polypeptides optionally associated with a vehicle and / or with an excipient and / or with a pharmaceutically acceptable adjuvant.
  • the invention also opens up other therapeutic perspectives in that it makes it possible to develop a therapeutic composition capable of influencing in a qualitative and / or quantitative manner the propagation and the replication of the aforementioned viruses in vivo because it comprises between another a ligand capable of modulating, repressing or inhibiting the endocytosis pathway relayed by at least one of the lipoprotein receptors, the ligand being chosen from a antagonistic antibody directed against said receptor, the production of which is within the reach of those skilled in the art as described above and an unnatural protein, that is to say a soluble protein obtained by genetic recombination or a soluble synthetic polypeptide binding to said receptor or in that it comprises inter alia at least one molecule which modulates, represses or inhibits the expression of the gene coding for said receptor or the activity of the promoter of the gene which codes for said receptor.
  • the subject of the invention is a method for screening and / or selecting at least one anti-viral molecule according to which said anti-viral molecule is brought into contact with an infected cell line obtained according to one of the methods of the invention .
  • virus belonging to the families of Togaviridae and Flavi viridae as used in the invention refers to any viral species including strains pathogenic for humans, variant strains, attenuated strains and defective strains derived from said strains. Indeed, it is known that RNA viruses have a high rate of spontaneous mutations. There may therefore be multiple strains which may be more or less virulent. It is within the ability of those skilled in the art to identify such strains, for example by homology of nucleic and / or peptide sequences with respect to a reference strain and / or by identifying a strain or an isolate with respect to to morphological and / or immunological criteria.
  • cell line refers to a culture of permissive cells in which the virus spreads after a first culture and therefore includes, but is not limited to, individual cells, harvested cells and cultures containing the cells since they are derived from cells of the reference cell line. It is known that changes spontaneous or induced may occur in the karyotype during storage or transfer. Therefore, cells derived from the reference cell line may not be strictly identical to the original cells or cultures, and the cell line also refers to variants.
  • the term "cell line" also includes immortalized cells.
  • permissive cells refers to all cells which are capable of spreading the virus, ie cells which have an endocytosis pathway relayed by at least one lipoprotein receptor.
  • a vaccine composition is a composition which comprises at least the viral particles or the polypeptides obtained according to the process of the invention, but is not limited to these and also covers the recombinant proteins and their fragments which can be obtained by the techniques. Genetic recombination in an appropriate host cell.
  • Such a vaccine composition may comprise, if necessary, a vehicle and / or an excipient and / or an adjuvant, provided that they are pharmaceutically acceptable.
  • pharmaceutically acceptable vehicle is meant the supports and vehicles which can be administered to humans or to an animal, as described for example in Remington's Pharmaceutical Sciences 16 th ed., Mack Publishing Co.
  • the pharmaceutically acceptable vehicle is preferably isotonic, hypotonic or has low hypertonicity and has a relatively low ionic strength.
  • the definitions of pharmaceutically acceptable excipients and adjuvants are also given in Remington's Pharmaceutical Sciences supra.
  • Example 1 Preparation of biological material. The separation of the lipoproteins is carried out from the plasma or the serum of a patient who has been uninfected for 12 hours and detected positive for the hepatitis C virus. To the blood drawn from the patient is added 1% of an EDTA solution (0.15 M NaCl - 0.1 M EDTA). The mixture is centrifuged for 10 minutes at 3500 rpm, at a temperature of 4 ° C. The plasma is then harvested and stored at 4 ° C until use.
  • an EDTA solution 0.15 M NaCl - 0.1 M EDTA
  • the patient's blood is collected on a dry tube and, after coagulation, centrifuged for 10 minutes at 3000 rpm, at a temperature of 4 ° C.
  • the serum is taken and stored at 4 ° C until use.
  • (i) Obtaining a fraction comprising LVPs of a density of less than 1.0063 g / ml, of a fraction comprising LVPs of a density of between 1.0063 g / ml and 1.063 g / ml, and of a fraction comprising LVPs greater than 1.063 g / ml.
  • the plasma and the serum are respectively ultracentrifuged for 4 hours at 100,000 rpm, at 4 ° C.
  • the upper fraction which contains the LVPs with a density of less than 1.0063 g / ml is recovered and stored at 4 ° C.
  • the lower fraction is adjusted to a density of 1.063 g / ml by addition of 7.21 g of NaBr per 100 ml of the fraction.
  • the lower fraction is then ultracentrifuged for 4 hours at 100,000 rpm, at 4 ° C. in a TL100 device comprising a TL100 rotor. 4.
  • the resulting upper fraction containing the fraction with a density between 1.0063 g / ml and 1.063 g / ml is recovered and stored at 4 ° C.
  • the plasma and the serum are respectively adjusted to a final density of 1.025 g / ml by addition of 2.518 g of NaBr per 100 ml. Centrifugation is performed for 4 hours at 100,000 rpm, at 4 ° C on the TL100 device comprising a TL100 rotor. 4.
  • the upper fraction which contains the fraction with a density of less than 1.025 g / ml is recovered and stored at 4 ° C.
  • the lower fraction is adjusted to a density of 1.063 g / ml by adding 4.84 g of NaBr per 100 ml.
  • the lower fraction is then ultracentrifuged for 4 hours at 100,000 rpm, at 4 ° C. in the TL100 device comprising a TL100 rotor. 4.
  • the resulting upper fraction containing the LDLs is recovered and stored at 4 ° C.
  • the various harvested fractions are then dialyzed for 18 hours at 4 ° C. against the 0.15 M NaCl / 0.24 mM EDTA buffer.
  • the fractions are then collected and filtered on a 0.45 ⁇ membrane.
  • a protein assay is carried out by the Lowry method (Sigma).
  • Example 2 Cell culture.
  • the culture medium used is the DMEM medium (marketed by Gibco BRL) supplemented with: 1 mM sodium pyruvate (Gibco), 1% non-essential amino acids (Boeh ⁇ nger Mannheim), 2 mM Glutamine (Gibco BRL), 200 U / ml of Penicillin (bioMérieux), 200 mg / ml of Streptomycin (bioMérieux) and 10% calf serum (Boehringer).
  • the cells come from the PLC / PRF / 5 cell lines (Alexander cells) (ATCC reference: CRL 8024) which is an established line of a human hepatocarcinoma. This line, which has integrated a defective hepatitis B genome, secretes the HBs antigen of the hepatitis B virus but not of the infectious virus.
  • the cells are cultured in complete DMEM medium (Gibco-BRL) supplemented with 10% of the above-mentioned fetal calf serum. The cells are washed with PBS (Gibco-BRL) preheated to 37 ° C.
  • the study is carried out using different fractions of LVPs obtained from the plasma of two patients infected with HCV. Demonstration of the presence of the HCV genome in these different fractions was carried out by semi-nested RT-PCR. density d in g / ml These results show the presence of a positive signal for the presence of the HCV genome in the fractions of density less than 1.0063 g / ml, in the two patients either in the first round of PCR, or in the second round of PCR.
  • the analysis of the density fraction between 1.063 and 1.0063 g / ml, is negative for the presence of the HCV genome in patients # 1, but positive in the second round of PCR in patient # 2.
  • the density fraction greater than 1.063 g / ml is positive for the presence of the HCV genome in both patients, but the response is weaker for patient 1 than for patient 2.
  • Results were obtained from culture supernatants after infection of 100 ⁇ l of serum taken from patients no. 1 and no. 2 in the presence or absence of 0.5 mM oleic acid. Negative controls were carried out under the same conditions. The analysis carried out by semi-nested RT-PCR shows that for the two patients, the presence of the HCV genome in the culture supernatants is detected at a higher frequency in the tests for which the infection was carried out in the presence of oleate.
  • Example 4 Study of the binding kinetics of LVPs on the LSR receptor of hepatocytes in the presence or absence of oleate.
  • a fraction containing LVPs with a density between 1.025 g / ml and 1.055 g / ml was obtained from an HCV positive serum as described in Example 1.
  • the amount of protein present in the LVPs fraction was determined by the Lo ry method using the “Prote Assay” kit (Sigma Diagnostics) and the viral titer was evaluated by quantification of the HCV RNA by RT-PCR and detection of fluorescence in real time (LightCycler TM, Roche) (Wittwer et al., Biotechiques, 22: 176-181 (1997)).
  • the PLC / PRF / 5 cell line described in Example 2 and cultured in DMEM-10% FCS medium, was used to study the binding of LVPs to the LSR receptor in the presence or not of oleate.
  • the PLC / PRF / 5 cells were seeded at 1 million cells / well, so that after 24 hours of incubation at 37 ° C., 5% CO 2 , a confluence of approximately 80%.
  • the LVPs fraction (ie 10 mg of proteins and 1.7 ⁇ 10 6 copies of HCV RNA) is added to the cells in the presence or absence of 0.5 mM oleate. All the tests were carried out in triplicate. Incubation was carried out at + 4 ° C for a period ranging from 1 to 9 hours. Then, the cells were washed 3 times using cold PBS IX, then lysed with 0.5 ml of lysis buffer from the Rneasy kit (Qiagen). The RNAs were then purified using this same kit and analyzed by quantitative RT-PCR (L ⁇ ghtCycler TM ).
  • results obtained are indicated in the appended figure in which the incubation time is shown on the abscissa and orders the number of copies of HCV RNA.
  • the dark bars refer to a culture without oleate and the light bars refer to a culture with oleate.
  • the results show that in the presence of oleate, the binding of LVPs to the LSR receptor is significantly increased, compared to the tests without oleate.
  • Example 5 Demonstration of the association of LVPs with human immunoglobulms.
  • the amount of the HCV genome in these LVP fractions was measured by quantification of the HCV RNA by
  • RT-PCR reverse transc ⁇ ptase
  • PCR polymerase chain reaction
  • d * signifies the density of LVPs in g / ml
  • Patient # 3 means the density of LVPs in g / ml

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Abstract

Selon le procédé de culture, de propagation et de réplication in vitro de virus appartenant aux familles des Togaviridae et Flaviviridae, on dispose d'au moins une fraction de LVPs obtenue à partir de sérum ou de plasma d'un patient infecté par au moins un virus appartenant aux familles des Togaviridae et Flaviviridae, on met en contact ladite fraction, pendant un temps prédéterminé dans un milieu de culture approprié, avec des cellules permissives qui possèdent une voie d'endocytose relayée par au moins un récepteur des lipoprotéines et modulée entre autres par un agent activateur choisi parmi un acide gras insaturé ou un dérivé d'un acide gras insaturé comprenant de 16 à 20 atomes de carbone ou leur mélange. L'invention concerne aussi les applications des particules virales et polypeptides obtenus selon le procédé précité.

Description

Procédé de culture in vitro de virus des familles Togaviridae et Flaviviridae et applications
La présente invention a notamment pour objet un procédé de culture et de propagation in vi tro d'un virus à ARN impliqué dans le développement de pathologies humaines virales.
Le procédé de culture et de propagation de l'invention s'applique principalement aux virus appartenant aux familles des Togaviridae et Flavi viridae. Ces virus présentent les caractéristiques communes d'être des virus enveloppés à ARN simple brin positif-sens, non segmenté .
La famille des Togaviri dae comprend les virus des genres Alphavirus et Rubi virus . Les virions ont un diamètre de 70 nm, sont sphériques et comportent une enveloppe et des péplomères composés d'un hétérodimère de deux glycoprotéines . Le génome consiste en une molécule unique d'ARN simple brin de 9,7 à 11,8 b. Les protéines structurales incluent une protéine de la capside et deux glycoprotéines d'enveloppe. Les virions contiennent des lipides dérivés des membranes cellulaires de l'hôte. La replication implique la synthèse d'un brin d'ARN complémentaire, qui sert de matrice pour la synthèse de l'ARN genomique. L'ARN genomique sert de matrice à un ARN intermédiaire de replication, qui à son tour sert de matrice pour la synthèse d'ARN et la production d'un précurseur polyprotéique qui est clivé pour l'obtention des protéines structurales et non structurales. La replication a lieu dans le cytoplasme et l'assemblage implique un bourgeonnement au travers la membrane.
Le virus Sindbis, les virus des encéphalites équines (de l'est, de l'ouest, vénézuélienne), le virus chikungunya, le virus o' nyong-nyong, le virus Igbo Ora, le virus Ross River, le virus Mayaro et le virus Barmah Forest appartiennent au genre des Alpha virus et sont des agents pathogènes pour l'homme. Le virus de l'hépatite E est actuellement classé dans le groupe des Alphavirus, bien qu'il soit non enveloppé et de plus petite taille. Le virus de la rubéole qui est classé dans le genre des Rubivirus est également un agent pathogène pour l'être humain.
Dans la famille des Flaviviridae sont classés les virus des genres Flavivirus ( flavivirus) , Pestivirus (virus des maladies des muqueuses) et Hepacivirus (virus des hépatites C et G) . Les virions sont spheriques avec un diamètre de 45 à 60 n de diamètre et sont constitués d'une bi-couche lipidique enveloppant une capside icosaèdrique enfermant le génome. Le génome consiste en une molécule unique d'ARN linéaire simple brin, positif- sens de 10,7 kb pour les flavivirus, 12,5 kb pour les pestivirus et 9,5 kb pour le virus de l'hépatite C. Les virions contiennent deux ou trois protéines associées à la membrane et une protéine core. Les virions contiennent des lipides dérivés des membranes cellulaires de l'hôte. Ils contiennent des carbohydrates sous la forme de glycolipides et de glycoprotéines. La replication implique la synthèse d'un ARN complémentaire qui sert de matrice pour la synthèse de l'ARN genomique. Une trame de lecture unique (ORF) code pour une polyprotéine qui est clivée par protéolyse virale et cellulaire. Les protéines structurales sont codées par l'extrémité 5' et les protéines non structurales sont codées par l'extrémité 3' de l'ARN. La replication a lieu dans le cytoplasme et l'assemblage implique le passage et l'enveloppement par les membranes du réticulum endoplasmique de l'hôte. La replication est accompagnée par un aspect caractéristique de prolifération des membranes intracellulaires.
Le virus de la fièvre jaune, le virus de la dengue, le virus de l'encéphalite japonaise, le virus de West Nile, le virus de l'encéphalite de St Louis, le virus de la Vallée de Murray, les virus de l'encéphalite transmise par les tiques et le virus de la meningoencephalite de la dinde d' Israël appartiennent au genre des Flavivirus et sont des agents pachogenes pour l'homme.
Le virus de la diarrhée bovine, le virus du choléra du porc et le virus « border disease » du mouton appartiennent au genre des Pestivirus .
Quant au genre Hepaci virus, il regroupe actuellement les virus de l'hépatite C et de l'hépatite G (GBV-C et les virus GBV-A et GBV-B) qui sont bien connus pour être des agents infectant l'homme.
En effet, l'hépatite C est la cause principale des hépatites acquises par transfusion. L'hépatite C peut également être transmise par d'autres voies percutanées, par exemple par injection de drogues par voie intraveineuse. Le risque de contamination des professionnels de la santé n'est par ailleurs pas négligeable.
L'hépatite C se distingue des autres formes de maladies du foie associées à des virus, telles que les hépatites A, B ou D. Les infections par le virus de l'hépatite C (HCV ou VHC) sont souvent chroniques avec pour résultante des maladies du foie, telles que hépatite, cirrhose et carcinome dans un grand nombre de cas.
Bien que le risque de transmission du virus par transfusion ait diminué du fait de la sélection des donneurs de sang, la fréquence des hépatites C reste élevée. Actuellement, environ 170 millions de personnes à travers le monde sont infectées de manière chronique par HCV. Les populations à risque élevé se trouvent principalement chez les transfusés et les utilisateurs de drogues intraveineuses, mais il existe des donneurs de sang asymptomatiques qui n' appartiennent pas à ces groupes à risque élevé et chez lesquels des anticorps anti-HCV circulants ont été retrouvés. Pour ces derniers, la voie de l'infection n'a encore pas été identifiée. HCV a été le premier virus hépatotrope isolé au moyen des techniques de biologie moléculaire. Les séquences du génome viral ont été clonées avant que la particule virale ait été visualisée. HCV est un virus à ARN simple brin positif, de 9,5 kb, qui se réplique par une copie d'ARN complémentaire et dont le produit de la traduction est un précurseur d'une polyprotéine unique d'environ 3 000 acides aminés. L'extrémité 5' du génome de HCV correspond à une région non traduite adjacente aux gènes qui codent pour les protéines structurales, la protéine core de la nucléocapside et les deux glycoprotéines d'enveloppe, El et E2/NS1. La région non traduite 5' et le gène core sont relativement bien conservés dans les différents génotypes, mais les protéines d' enveloppe E2 sont codées par une région hypervariable différente d'un isolât à un autre isolât. L'extrémité 3' du génome de HCV contient les gènes qui codent pour les protéines non structurales (NS) et pour une région 3' non codante bien conservée. Du fait de son organisation genomique et de son mode présumé de replication, HCV a été classifié dans un nouveau genre de la famille des Flaviviridae, les Hepacivirus .
De nombreuses techniques ont été développées pour diagnostiquer une infection par HCV. Par exemple, des essais immunologiques de diagnostic ont été réalisés pour détecter des anticorps dirigés contre des protéines de HCV dans les sérums de patients. La synthèse d'ADNc par transcription inverse de l'ARN viral et l'amplification par PCR ont également été utilisées pour détecter le génome de HCV, comme la mesure indirecte d'un virus potentiellement infectieux dans les seru s d'humains infectés de manière chronique ou ceux de chimpanzés infectés expérimentalement. Par ailleurs, sur la base du clonage de gènes, des techniques d'hybridation avec une sonde ADN ont également été développées. Cependant, il est reconnu que les techniques de diagnostic existantes manquent de sensibilité et/ou de spécificité et/ou souffrent de difficultés de mise en oeuvre. A titre d'exemple, avec la méthode d'hybridation de sondes il est impossible de faire la distinction entre un virus à faible pouvoir infectieux et un virus à pouvoir infectieux élevé. Il est donc nécessaire, mais difficile à mettre en oeuvre, d' inoculer le virus devant être testé à un chimpanzé et de tester l'infection résultante sur l'animal.
Il est donc de toute première importance, d'un point de vue de santé publique, de pouvoir développer des méthodes spécifiques, sensibles et pratiques pour identifier et cribler les porteurs de HCV. Une des solutions pourrait être de réaliser un système de culture in vi tro très efficace de HCV qui permettrait d'obtenir une propagation du virus, en particulier pour étudier ses mécanismes de replication, pour tester des anticorps neutralisants ou des antiviraux, de même que pour développer des matériaux biologiques, des essais de diagnostic et des préparations vaccinales. En effet, bien que la séquence complète de HCV soit disponible depuis 1989 (Q. L Choo et al., Science 244, 359 (1989)), la compréhension du cycle de vie et du mode de replication d'HCV a été entravée par manque d'un système de culture in vitro approprié. Ito et al. (J. Gen. Virol. 77 : 1043-1054 (1996) ) ont bien confirmé le maintien de la replication de HCV dans des cultures primaires d' hépatocytes humains, obtenus à partir de patients porteurs de HCV et pour lesquels la maladie était établie de manière chronique, et suggéré un passage d' infection, mais des problèmes relatifs à la propagation du virus subsistent (impossibilité de culture au long cours) et le système développé est limité par la nécessité d'approvisionnement en foie humain et la lourdeur de la technique. Par ailleurs, à ce jour, il n'y a pas de consensus général sur le tropisme de HCV et tous les récepteurs cellulaires pour le virus n'ont pas encore ete identifies, notamment les récepteurs permettant l'endocytose du virus (Pileri et al., 1998, Science, 282, pages 938-941). HGV est un virus qui a été découvert de manière indépendante par deux équipes différentes, l'une l'a appelé HGV et l'autre GBV-C. Il possède une structure genomique proche de celle des flavivirus. Sa polyprotéine de 2 900 acides aminés est codée par un ARN de 9 400 nucléotides dont l'extrémité 5' code pour des protéines structurales (nucléocapside tronquée et enveloppe) et l'extrémité 3' code pour des protéines qui ont un rôle dans la replication. Il est transmis par transfusion sanguine et peut être détecté chez des patients qui présentent des hépatites aiguës, chroniques et fulminantes. Sa contribution dans des maladies du foie aiguë et chronique est encore mal connue. GBV-A et GBV-B ont également été décrits et sont très proches de HGV.
Dans le plasma de patients infectés par HCV sont retrouvées des particules contenant de l'ARN viral très hétérogènes en densité. Cette hétérogénéité de densité des particules contenant de l'ARN viral est attribuée à leur association en proportion variable avec des lipoprotéines
(Thomsen et al., 1993, Med. Microbiol. Immunol. 182 : 639) . Dans la description de la présente demande de brevet, les inventeurs ont dénommé ces particules hybrides LVPs (lipo-viro-particules) . La répartition de chacune de ces formes le long d'un gradient de densité varie d'un patient à l'autre. Les analyses existantes des particules de faible densité montrent des densités recouvrant celles des LDLs (Low Density Lipoprotems) et des VLDLs (Very Low Density Lipoprotems) . La taille décrite (50 nm) les rapprochent des VLDLs. Par ailleurs, les particules peuvent être précipitées, parfois même dans leur totalité, par des sérums anti-β-lipoprotemes (Thomsen et al., 1992, Med. Microbiol. Immunol. 181 : 293 ; Prince et al., 1996, J. Viral. Hepat. 3 : 11) .
Il a également été observé que le virus de l'hépatite
G peut être précipité, en quasi-totalité, par des sérums anti-β-lipoprotéines obtenus à partir de patients chroniquement infectés par HGV (Sato et al. Biochem.
Biophys . Res. Commun. 229 :719).
Il a par ailleurs été observé que l'infection par HCV d' hépatocytes humains s'accompagne d'une accumulation intracytoplasmique de vésicules lipidiques. La transfection du gène de HCV codant pour la capside dans une lignée continue d' hépatocytes humains (Hep/G2) induit le même phénomène (Barba et al., 1997, PNAS 94 :1200). Ces vésicules sont riches en triglycérides. La protéine de capside de HCV est accolée à la surface des vésicules, de même que l' apolipoprotéine apo A-II.
Les apolipoprotéines permettent le transport des lipides en apportant une stabilité structurelle et une solubilité aux particules lipoprotéiques auxquelles elles sont associées. Elles déterminent aussi le sort de ces particules dans le métabolisme, notamment en les ciblant sur des récepteurs.
Apo B 100 est l' apolipoprotéine principale des VLDLs, LDLs et IDLs (Intermediate Density Lipoproteins) . Elle est synthétisée dans le foie et est essentielle pour l'assemblage et la sécrétion des VLDLs à partir du foie. Elle constitue également un ligand pour la liaison des LDLs à leurs récepteurs. Un des récepteurs des LDLs, le LDL-récepteur, est une protéine de surface des cellules qui lie et internalise les lipoprotéines riches en cholestérol qui contiennent apo B 100 et apo E. Apo E est principalement synthétisée dans les hépatocytes. Elle constitue un ligand pour la liaison de différentes lipoprotéines au récepteur des LDLs et au LRP (LDL- receptor-related protein) . Apo B 48 est essentielle pour l'assemblage et la sécrétion des chylomicrons . Elle est codée par le même gène et le même ARNm que apo B 100, mais dans l'intestin une mutation introduit un codon stop de sorte que apo B 48 contient seulement 48% de la longueur totale de apo B 100. Son rôle dans le métabolisme des chylomicrons dans le plasma est mal connu, mais les individus qui présentent des mutations qui interfèrent avec sa synthèse normale n'ont pas, ou des niveaux très faibles, de chylomicrons, VLDLs, IDLs et LDLs.
La nature des LVPs précitées contenant de l'ARN viral n'est à ce jour pas connue, mais les présents inventeurs ont émis l'hypothèse et vérifie qu'au moins un des récepteurs de surface cellulaire des lipoprotéines participe à l'infection et la propagation des virus appartenant aux familles des Togaviridae et Flaviviridae dans une culture cellulaire. Ils ont en effet montré que les LVPs sont des ligands pour une voie d' endocytose associée à des récepteurs, preferentiellement pour le LSR (Lipolysis-Stimulated Receptor) (Frances T. Yen et al., Biochemistry, 1994, 33, 1172-1180 et Bernard E. Biha and Frances T. Yen, Biochemistry, 1992, 31, 4628-4636) . Ils ont par ailleurs montre que les LVPs peuvent être associées à des immunoglobummes humaines. Sur cette base, ils ont développes de nouveaux procédés qui permettent la culture, la propagation et la replication m vi tro de virus appartenant aux familles des Togaviridae et Flavi viridae . Ces procèdes, qui permettent d'obtenir une propagation de ces virus, sont utiles notamment pour étudier leurs mécanismes de replication, pour tester des anticorps neutralisants et des antiviraux, pour développer des matériaux biologiques pour le diagnostic et la thérapie. Par ailleurs, les procèdes de l'invention permettent d'obtenir une lignée cellulaire infectée utile pour cribler et/ou sélectionner au moins une molécule anti-virale, par mise en contact de la lignée cellulaire infectée et de la molécule anti-virale.
Selon ce procédé, on dispose d'au moins une fraction de LVPs ou d'au moins une fraction de LVPs associée à des immunoglobulmes humaines, obtenue à partir de sérum ou de plasma d'un patient infecté par un virus appartenant à la famille des Togaviridae ou Flavi viridae, on met en contact, pendant un temps prédéterminé dans un milieu de culture approprié, ladite fraction de LVPs avec des cellules permissives qui possèdent une voie d' endocytose relayée par au moins un récepteur des lipoprotéines et modulée par un agent activateur, choisi parmi les acides gras insaturés, les dérivés d'acides gras insaturés comprenant de 16 à 20 atomes de carbone et leurs mélanges. Le récepteur des lipoprotéines est le LSR et/ou le récepteur de surface des LDLs et avantageusement lesdites cellules permissives possèdent les deux récepteurs.
L'acide gras insaturé est choisi parmi l'acide oléique, l'acide palmitoléique, l'acide linoléique, l'acide linolénique, l'acide arachidonique, l'acide trans- hexadécénoïque et l'acide elaïdique ou leurs dérivés. Dans un mode de réalisation préféré de l'invention, l'acide gras retenu est l'acide oléique qui est ajouté au milieu de culture à une concentration comprise entre 0,1 et 1 mM, de préférence 0,5 mM.
Les cellules sont de préférence des cellules choisies parmi les cellules d' hépatocytes humains ou animaux, le groupe des lignées cellulaires d' hépatocarcino e humain ou animal, les cellules dendritiques, les cellules macrophagiques, les cellules de Kuppfer et leurs combinaisons associées ou non à des lymphocytes. Avantageusement, ces cellules sont des cellules d' épatocarcinome humain de la lignée cellulaire PLC/PRF/5. Préférentiellement, le milieu de culture comprend outre les ingrédients nécessaires à la culture et l'agent activateur, au moins un agent modulateur de l'apoptose. Cet agent modulateur de l'apoptose est choisi parmi les interferons, les anti- terferons, en particulier les anti-interférons alpha et beta, les anti-caspase 3, en particulier des analogues peptidiques, tels que le z- VADf k, c' est à dire le N-benzyloxycarbonyl-Val-Ala-Asp- fluorométhylcétone, et les anticorps dirigés contre les anti-caspase 3.
En effet, les présents inventeurs ont observé que chez des patients infectés à la fois par HIV et par l' Hepacivirus HCV, la prise de certains inhibiteurs de la protéase du HIV, tels que le Ritonavir (nom commercial) entraine une augmentation de la viremie HCV associée à la cytolyse hépatique. L'observation d'une cytolyse hépatique aussitôt après la prise d'un médicament qui, en plus de son activité anti-protéasique, modifie également la régulation de l'apoptose est évocatπce d'une induction du signal d'apoptose. C'est pourquoi, il est intéressant d'ajouter dans le procède de l'invention au moins un agent modulateur de l'apoptose.
Le milieu approprie retenu est en particulier choisi parmi le milieu DMEM ou un milieu dérivé du milieu DMEM et milieu RPMI ou un milieu dérivé du milieu RPMI . De préférence, c'est un milieu dérive du milieu DMEM qui comprend le milieu DMEM complet commercialisé par la société Gibco BRL, complémente par 0 à 10 mM de pyruvate de sodium, 0 à 10 % d'acides aminés non essentiels, 1 à 10 mM de glutamme, 100 a 200 U/ml de penicillmne, 100 à 200 mg/ml de streptomycine et 1 a 20 de sérum de veau. Ce milieu avantageusement comprend de plus 0,1 à 0,5% de BSA (Albumine Serique de Bovin) ou de HSA (Albumine Sérique Humaine) couplée a un acide gras, selon la méthode de Dixon et al., 1991, Journal of Biological Chemistry, vol. 266, p 5080. Dans un mode de réalisation préfère du procédé de l'invention, préalablement a la mise en contact des cellules permissives avec la fraction de LVPs, les cellules permissives sont lavées dans un tampon PBS préchauffé a une température d'environ 37°C.
On réalise plusieurs passages des cellules permissives ainsi infectées dans les conditions décrites ci-dessus et on met en évidence la présence dudit virus dans les cellules permissives infectées et dans le surnageant de culture par RT-PCR et/ou par une technique immunologique, telle que immunofluorescence indirecte à l'aide d'un anticorps spécifique dudit virus et/ou par cytométrie de flux.
Le procédé de culture, de propagation et de replication décrit précédemment est particulièrement bien adapte à la culture, la propagation et la replication des virus appartenant à la famille des Flavi viridae et au genre Hepacivirus, en particulier les virus de l'hépatite C et de l'hépatite G, incluant les virus GBV-A, GBV-B et GBV-C, pour lesquels il n'existait pas a ce jour de procédé de culture efficace. L'invention a également pour objet un milieu de culture pour la culture de virus appartenant aux familles des Togaviridae et Flavi viridae, lequel milieu comprend le milieu DMEM complet commercialise par la société Gibco BRL, complémente par 0 a 10 mM de pyruvate de sodium, 0 à 10 % d'acides aminés non essentiels, 1 a 10 M de gluta ine, 100 a 200 U/ml de penicillmne, 100 à 200 mg/ml de streptomycine et 1 a 20 ° de sérum de veau. Ce milieu avantageusement comprend de plus 0,1 a 0,5% de BSA (Albumine Séπque de Bovin) ou de HSA (Albumine Sérique Humaine), couplée a un acide gras, selon la méthode citée en référence ci dessus.
L' invention a aussi pour objet une lignée cellulaire infectée par au moins un virus appartenant aux familles des Togaviridae et Flavi viridae, dans laquelle les cellules dans la lignée cellulaire sont des cellules permissives qui possèdent une voie d' endocytose relayée par au moins un récepteur des lipoprotéines, susceptible d' être modulée entre autre par un agent activateur, lesdites cellules étant capables de propager et répliquer le virus. Préférentiellement, le récepteur est le LSR et/ou le récepteur des LDLs et avantageusement les cellules permissives possèdent les deux récepteurs.
En particulier, la lignée cellulaire est une lignée dans laquelle les cellules sont dérivées par infection d'une cellule choisie parmi les cellules primaires d' hépatocytes humains ou animaux, les cellules du groupe des lignées cellulaires d' hépatocarcinome humain et animal, en particulier une cellule provenant de la lignée cellulaire d' hépatocarcinome humain PLC/PRF/5 qui possède un récepteur de surface des lipoprotéines activable par des acides gras, les cellules denditriques, les cellules macrophagiques et les cellules de Kuppfer. Mais, l'invention n'est pas limitée à une cellule d'une lignée cellulaire qui possède au moins le récepteur de surface LSR des lipoprotéines et englobe les cellules transfectées ou transformées qui sont capables d'exprimer à leur surface le récepteur LSR et/ou le récepteur des LDLs. La lignée cellulaire infectée obtenue selon le procédé de l'invention est utilisable pour cribler et/ou sélectionner au moins une molécule anti-virale selon lequel on met en contact la molécule anti-virale et la lignée cellulaire infectée.
L' invention concerne encore un procédé pour préparer une composition pour la détection dans un échantillon d'anticorps dirigés contre au moins un virus appartenant aux familles des Toga viri da e et Flavi viridae qui comprend au moins une purification partielle ou totale des particules virales dudit virus ou des polypeptides obtenus à partir d'un des procédés tel que défini précédemment. En particulier, lesdites particules virales ou lesdits polypeptides sont fixes sur un support solide. Par ailleurs, l'invention concerne un procédé pour l'obtention d'anticorps ou de fragments d'anticorps dirigés contre au moins un virus appartenant aux familles des Togaviridae et Flaviviridae selon lequel on immunise un animal avec des particules virales ou des polypeptides obtenus à partir d'un des procédés tel que défini précédemment. La production d'anticorps polyclonaux et monoclonaux ou de fragments d' anticorps fait partie des connaissances générales de l'homme du métier. On peut citer à titre d'exemple Kôhler G. et Milstein C. (1975) Continuous culture of fused cells secreting antibody of predefined specificity, Nature, 256 : 495-497 et Galfre G. et al. (1977) Nature, 266 : 522-550 pour la production d'anticorps polyclonaux et Roda A., Bolelli G. F. Production of high titer antibody to bile acids, Journal os Steroid Biochemistry, Vol. 13, pp 449-454 (1980) pour la production d'anticorps polyclonaux. Des anticorps peuvent être produits par immunisation de souris ou de lapins avec les particules virales ou les polypeptides obtenus selon le procédé de l'invention. Pour la production d'anticorps monoclonaux, l' immunogène peut être couplé à de l' hémocyanine de Lymphet Keyhole (peptide KLH) comme support pour l'immunisation ou à de l'albumine sérique (peptide SA) . Les animaux sont soumis à une injection d' immunogène en utilisant de l'adjuvant complet de Freund. Les sérums et les surnageants de culture d'hybrido e issus des animaux immunisés sont analysé pour leur spécificité et leur sélectivité en utilisant des techniques classiques, telles que par exemple des tests ELISA ou de Western Blot. Les hvbridomes produisant les anticorps les plus spécifiques et les plus sensibles sont sélectionnés. Des anticorps monoclonaux peuvent également être produits in vi tro par culture cellulaire des hybridomes produits ou par récupération de liquide d'ascite, après injection intrapéritonéale des hybridomes chez la souris. Quelque soit le mode de production, en H
surnageant ou en ascite, les anticorps sont ensuite purifiés. Les méthodes de purification utilisées sont essentiellement la filtration sur gel échangeur d' ions et la chromatographie d'exclusion ou l' immunoprécipitation. Un nombre suffisant d' anticorps sont criblés dans des tests fonctionnels pour identifier les anticorps les plus performants. La production in vi tro d'anticorps, de fragments d'anticorps ou de dérivés d'anticorps, tels que des anticorps chimères produits par génie génétique est bien connue de l'homme du métier.
Plus particulièrement, par fragment d'anticorps on entend les fragments F(ab)2, Fab, Fab' , sFv (Blazar et al., 1997, Journal of Immunology 159 : 5821-5833 et Bird et al., 1988, Science 242 : 423-426) d'un anticorps natif et par dérivé on entend, entre autres, un dérivé chimérique d'un anticorps natif (voir par exemple Arakawa et al., 1996, J. Biochem 120 : 657-662 et Chaudray et al., 1989, Nature 339 : 394-397) .
L'invention concerne aussi une composition diagnostique comprenant au moins les particules virales ou les polypeptides obtenus selon le procédé de l'invention ou les anticorps obtenus selon le procédé défini précédemment et un kit de diagnostic comprenant entre autre ladite composition, ainsi qu'une composition vaccinale comprenant au moins les particules virales ou les polypeptides éventuellement associés à un véhicule et/ou à un excipient et/ou à un adjuvant pharmaceutiquement acceptable. Mais, l'invention ouvre également d'autres perspectives thérapeutiques en ce qu'elle permet de développer une composition thérapeutique susceptible d' influencer de manière qualitative et/ou quantitative la propagation et la replication des virus précités in vivo parce qu'elle comprend entre autre un ligand susceptible de moduler, de réprimer ou d'inhiber la voie d' endocytose relayée par au moins un des récepteurs des lipoprotéines, le ligand étant choisi parmi un anticorps antagoniste dirige contre ledit récepteur dont la production est a la portée de l'homme du métier comme décrit ci-dessus et une protéine non naturelle, c'est à dire une protéine soluble obtenue par recombinaison génétique ou un polypeptide de synthèse soluble se liant audit récepteur ou en ce qu' elle comprend entre autre au moins une molécule qui module, réprime ou inhibe l'expression du gène codant pour ledit récepteur ou l'activité du promoteur du gène qui code pour ledit récepteur.
Enfin, l'invention a pour objet un procédé pour cribler et/ou sélectionner au moins une molécule anti- virale selon lequel on met en contact ladite molécule anti-virale et une lignée cellulaire infectée obtenue selon l'un des procèdes de l'invention.
Le terme virus appartenant aux familles des Togaviridae et Flavi viridae tel qu'utilisé dans l'invention fait référence a toute espèce virale parmi lesquelles les souches pathogènes pour l'homme, les souches variantes, les souches atténuées et les souches défectives dérivées desdites souches. En effet, il est connu que les virus a ARN présentent un taux de mutations spontanées élevé. Il peut donc exister des souches multiples qui peuvent être plus ou moins virulentes. Il est à la portée de l'homme de l'art d'identifier de telles souches, par exemple par homologie de séquences nucléiques et/ou peptidiques par rapport a une souche de référence et/ou en identifiant une souche ou un isolât par rapport à des critères morphologiques et/ou îmmunologiques . Le terme lignée cellulaire fait référence a une culture de cellules permissives dans laquelle le virus se propage après une première culture et comprend donc, mais n'est pas limite, aux cellules individuelles, aux cellules récoltées et aux cultures contenant les cellules dans la mesure où elles sont dérivées de cellules de la lignée cellulaire de référence. Il est connu que des changements spontanés ou induits peuvent survenir au niveau du caryotype durant le stockage ou le transfert. Donc, les cellules dérivées de la lignée cellulaire de référence peuvent ne pas être strictement identiques aux cellules ou cultures d'origine et la lignée cellulaire fait également référence aux variants. Le terme « lignée cellulaire » inclut également des cellules immortalisées.
Le terme cellules permissives fait référence à toutes cellules qui sont capable de propager le virus, c'est à dire des cellules qui possèdent une voie d' endocytose relayée par au moins un récepteur des lipoprotéines.
Une composition vaccinale est une composition qui comprend au moins les particules virales ou les polypeptides obtenus selon le procédé de l' invention, mais n'est pas limitée à ceux ci et couvre également les protéines recombinantes et leurs fragments qui peuvent être obtenus par les techniques de recombinaison génétique dans une cellule hôte appropriée. Une telle composition vaccinale peut comprendre, si nécessaire, un véhicule et/ou un excipient et/ou un adjuvant, à la condition qu'ils soient pharmaceutiquement acceptables.
Par « véhicule pharmaceutiquement acceptable » on entend les supports et véhicules administrables à l'être humain ou à un animal, tels que décrits par exemple dans Remington' s Pharmaceutical Sciences 16th éd., Mack Publishing Co . Le véhicule pharmaceutiquement acceptable est de préférence isotonique, hypotonique ou présente une faible hypertonicité et a une force ionique relativement basse. Les définitions des excipients et adjuvants pharmaceutiquement acceptables sont également données dans Remington' s Pharmaceutical Sciences précité.
Exemple 1 : Préparation du matériel biologique. La séparation des lipoprotéines est effectuée à partir du plasma ou du sérum d'un patient à eun depuis 12 heures et détecté positif pour le virus de l'hépatite C. Au sang prélevé du patient est ajouté 1% d'une solution d'EDTA (0,15 M NaCl - 0,1 M EDTA) . Le mélange est centrifugé pendant 10 minutes à 3500 tpm, à la température de 4°C. Le plasma est ensuite récolté et stocké à 4°C jusqu'à utilisation.
Le sang du patient est récolté sur tube sec et, après coagulation, centrifugé pendant 10 minutes à 3000 tpm, à la température de 4°C. Le sérum est prélevé et stocké à 4°C jusqu'à utilisation. (i) Obtention d'une fraction comprenant des LVPs d'une densité inférieure à 1,0063 g/ml, d'une fraction comprenant des LVPs d'une densité comprise entre 1,0063 g/ml et 1,063 g/ml, et d'une fraction comprenant des LVPs supérieure à 1,063 g/ml. Le plasma et le sérum sont respectivement ultracentrifugés pendant 4 heures à 100 000 tpm, à 4°C dans un appareil TL100 commercialisé par la société Beckman et comprenant un rotor TL100.4. La fraction supérieure qui contient les LVPs de densité inférieure à 1,0063 g/ml est récupérée et conservée à 4°C. La fraction inférieure est ajustée à une densité de 1,063 g/ml par addition de 7,21 g de NaBr pour 100 ml de la fraction. La fraction inférieure est ensuite ultracentrifugée pendant 4 heures à 100 000 tpm, à 4°C. dans un appareil TL100 comprenant un rotor TL100.4. La fraction supérieure résultante contenant la fraction d'une densité comprise entre 1,0063 g/ml et 1,063 g/ml est récupérée et conservée à 4°C.
(ii) Obtention d'une fraction comprenant des LVP d'une densité inférieure à 1,025 g/ml, d'une fraction comprenant des LVPs d'une densité comprise entre 1,025 g/ml et 1,063 g/ml, et d'une fraction comprenant des LVP d'une densité supérieure à 1,063 g/ml.
Le plasma et le sérum sont respectivement ajustés à une densité finale de 1,025 g/ml par addition de 2,518 g de NaBr pour 100 ml. Une centrifugation est effectuée pendant 4 heures à 100 000 tpm, à 4°C sur l'appareil TL100 comprenant un rotor TL100.4.
La fraction supérieure qui contient la fraction d'une densité inférieure à 1,025 g/ml est récupérée et conservée à 4°C. La fraction inférieure est ajustée à une densité de 1,063 g/ml par addition de 4,84 g de NaBr pour 100 ml. La fraction inférieure est ensuite ultracentrifugée pendant 4 heures à 100 000 tpm, à 4°C. dans l'appareil TL100 comprenant un rotor TL100.4. La fraction supérieure résultante contenant les LDLs est récupérée et conservée à 4°C.
Les différentes fractions récoltées sont ensuite dialysées pendant 18 heures à 4°C contre le tampon 0,15 M NaCl/0,24 mM EDTA. Les fractions sont ensuite récupérées et filtrées sur une membrane de 0,45 μ. Un dosage de protéines est effectué par la méthode de Lowry (Sigma) .
Exemple 2 : Culture cellulaire.
Le milieu de culture utilisé est le milieu DMEM (commercialisé par Gibco BRL) complementé avec : 1 mM de pyruvate de sodium (Gibco) , 1% d'acides aminés non essentiels (Boehπnger Mannheim) , 2 mM de Glutamine (Gibco BRL), 200 U/ml de Pénicilline (bioMérieux) , 200 mg/ml de Streptomycine (bioMérieux) et 10% de sérum de veau (Boehringer) .
Les cellules proviennent de la lignées cellulaire PLC/PRF/5 (Alexander cells) (référence ATCC : CRL 8024) qui est une lignée établie d'un hépatocarcinome humain. Cette lignée, qui a intégré un génome défectif de l'hépatite B, secrète l'antigène HBs du virus de l'hépatite B mais pas de virus infectieux. Les cellules sont cultivées dans le milieu DMEM complet (Gibco-BRL) complementé avec 10% de sérum de veau foetal précité. Les cellules sont lavées avec du PBS (Gibco-BRL) préchauffé à 37°C. 1 ml de DMEM complementé avec 0,2% de BSA (Sigma) et 50 μg/ml de lipoprotéines provenant de chaque fraction ou 100 μl de sérum filtre sur une membrane de 0,45 μ sont ajoutés. Simultanément, une solution d'acide oléique dans de l' îεopropanol, préparée au préalable (100 mM) , est ajoutée dans une gamme de concentration de 0,1 à 0,8 mM. Les cellules sont ensuite soumises à incubation pendant 3 heures à 37°C sous atmosphère de C02 5%. Le milieu est ensuite remplacé par du milieu DMEM complet complementé avec 10% de sérum de veau foetal. Les cellules sont replacées dans l'incubateur dans les conditions décrites précédemment. Les surnageants de culture sont prélevés régulièrement pour une recherche par RT-PCR du génome du virus de l'hépatite C. En parallèle, une analyse par immunofluorescence est réalisée sur les cellules infectées et contrôlée a l'aide d'un anticorps monoclonal antiprotéines structurales HCV.
Exemple 3 : Résultats.
L'étude est réalisée à partir de différentes fractions de LVPs obtenues à partir de plasma de deux patients infectés par HCV. La mise en évidence de la présence du génome HCV dans ces différentes fractions a été réalisées par RT-PCR semi-nichée. densité d en g / ml Ces résultats montrent la présence d'un signal positif pour la présence du génome HCV dans les fractions de densité inférieure a 1,0063 g/ml, chez les deux patients soit au premier tour de PCR, soit au deuxième tour de PCR.
L'analyse de la fraction de densité comprise entre 1,063 et 1,0063 g/ml, est négative pour la présence du génome HCV chez les patients n°l, mais positive au deuxième tour de PCR chez le patient n°2. La fraction de densité supérieure à 1,063 g/ml est positive pour la présence du génome HCV chez les deux patients, mais la réponse est plus faible pour le patient 1 que pour le patient 2. Ces différences entre le patient n°l et le patient n°2 au niveau de la fraction de densité comprise entre 1,063 et 1,0063 g/ml, peuvent s'expliquer par une charge virale plus faible chez le patient n°l.
Des résultats ont ete obtenus a partir de surnageants de culture après infection de 100 μl de sérum prélevés chez les patients n°l et n°2 en présence ou non d'acide oléique 0,5 mM. Des contrôles négatifs ont été réalisés dans les mêmes conditions. L'analyse effectuée par RT-PCR semi-nichée, montre que pour les deux patients, la présence du génome HCV dans les surnageants de culture est détectée à une fréquence plus élevée dans les essais pour lesquels l'infection a ete réalisée en présence d'oléate.
Des essais similaires, réalises à partir des fractions de densités différentes (inférieure a 1,0063 g/ml, comprise entre 1,0063 g/ml et 1,063 g/ml et supérieure à 1,063 g/ml), confirment ces résultats et montrent que l'acide oleique facilite la voie d' endocytose des LVPs au moment de l' infection.
Exemple 4 : Etude de la cinétique de fixation des LVPs sur le récepteur LSR des hépatocytes en présence ou en absence d'oléate. Une fraction contenant des LVPs d'une densité comprise entre 1,025 g/ml et 1,055 g/ml a été obtenue à partir d'un sérum HCV positif comme décrit dans l'exemple 1. La quantité de protéines présente dans la fraction LVPs a été déterminée par la méthode de Lo ry à l'aide du kit « Prote Assay » (Sigma Diagnostics) et le titre viral a été évalué par quantification de l'ARN de HCV par RT-PCR et détection de la fluorescence en temps réel (LightCycler™, Roche) (Wittwer et al., Biotechiques, 22 : 176-181 (1997) ) .
La lignée cellulaire PLC/PRF/5, décrite dans l'exemple 2 et cultivée en milieu DMEM-10%SVF, a été utilisée pour l'étude de la fixation des LVPs sur le récepteur LSR en présence ou non d'oléate.
Les résultats ont été obtenus selon le protocole suivant :
Les cellules PLC/PRF/5, ont été ensemencées à 1 million de cellules / puits, de façon à obtenir après 24 heures d'incubation à 37°C, 5% C02, une confluence d'environ 80%.
Deux lavages en tampon PBS IX froid ont été réalisés, puis 1 ml de milieu DMEM complet froid contenant 0,2% de BSA est rajouté aux cellules PLC maintenues sur un lit de glace.
La fraction LVPs (soit 10 mg de protéines et 1,7 xlO6 copies d'ARN d' HCV) , est rajoutée aux cellules en présence ou non d'oléate 0,5 mM. Tous les essais ont été réalisés en triplicate. Une incubation a été réalisée à +4°C pendant une durée allant de 1 à 9 heures. Puis, les cellules ont été lavées 3 fois à l'aide de PBS IX froid, puis lysées avec 0,5 ml de tampon de lyse du kit Rneasy (Qiagen) . Les ARNs ont été ensuite purifiés à l'aide de ce même kit et analysés par RT-PCR quantitative (LιghtCyclerTM) . Les résultats obtenus sont indiques dans la figure annexée dans laquelle est représente en abscisse le temps d'incubation et en ordonne le nombre de copies d'ARN de HCV. Dans la représentation graphique de cette figure, les barres foncées font référence à une culture sans oléate et les barres claires font référence a une culture avec oléate. Les résultats montrent qu'en présence d'oléate, la fixation des LVPs au récepteur LSR est significativement augmentée, par rapport aux essais sans oléate.
Exemple 5 : Mise en évidence de l'association des LVPs à des immunoglobulmes humaines.
Différentes fractions contenant des LVPs récoltées à partir de plasma de trois patients infectés par HCV et préparées selon le protocole de l'exemple 1 ont été analysées par électrophorese sur gel de polyacrylamide
(PAGE) en présence de SDS (Dodecyl Sulfate de Sodium)
(SDS-PAGE) (Laemmli, Nature (1970), 227 : 680-685). La mise en évidence de la présence d' immunoglobulmes (Ig) dans ces fractions a été réalisée par la technique de Western blot (Towbm et al., PNAS, (1979) 76 : 4350-4354), à l'aide d'un sérum de chèvre anti-immunoglobul es humâmes couplé à la peroxydase (Jackson ImmunoResearch laboratoπes, France) . Les résultats montrent que les immunoglobulmes humâmes sont toujours détectées dans les fractions contenant des LVPs, en quantité différente selon les patients.
La quantité du génome HCV dans ces fractions de LVPs a été mesurée par quantification de l'ARN de HCV par
RT-PCR (RT = transcπptase inverse; PCR = polymerase chain reaction) et détection de fluorescence en temps réel
(LIGHTCYCLER™, ROCHE) (Wittwer et al., Biotechniques
(1997), 22 : 176-181). Les résultats montrent que l'ARN de HCV est toujours associe aux fractions contenant des LVPs, en quantité différente selon les patients. Les LVPs associées aux Ig (LVP/Ig+) ont de plus été purifiées à l'aide de la protéine A couplé à des illes MiltQnvi Biotec, France) après un passage dans des colonnes MS+ Separation Columns (Miltenyi Biotec, France) ou bien à l'aide de la Protéine A-Sepharose CL-4B (Pharmacia Biotech, France) . Dans ce cas, tout ou majorité de l'ARN- HCV co-purifie avec les Ig, comme illustré dans les tableaux qui suivent. En conséquence, à partir d'une fraction riche en LVPs, les échantillons utilisés pour les infections peuvent être purifiés par l'intermédiaire de leurs Ig de manière à utiliser préférentiellement les LVP/Ig+/ARN+.
Patient n°l
d* signifie la densité des LVPs en g/ml,
Patient n°2
signifie la densité des LVPs en g/ml.
Patient n°3 signifie la densité des LVPs en g/ml,
Ces résultats montrent que lorsque des immunoglobulmes sont présentes dans les fractions contenant des LVPs les ARNs viraux sont retrouvés majoritairement dans les fractions de LVPs associées à des immunoglobulmes humaines.

Claims

REVENDICATIONS
1. Procédé de culture, de propagation et de replication in vi tro de virus appartenant aux familles des Togaviridae et Flavi viridae, selon lequel on dispose d'au moins une fraction de LVPs obtenue à partir de sérum ou de plasma d'un patient infecté par au moins un virus appartenant aux familles des Togaviridae et Flaviviridae, on met en contact ladite fraction, pendant un temps prédéterminé dans un milieu de culture approprié, avec des cellules permissives qui possèdent une voie d' endocytose relayée par au moins un récepteur des lipoprotéines et modulée par un agent activateur, choisi parmi un acide gras msaturé ou un dérive d'un acide gras msaturé comprenant de 16 à 20 atomes de carbone ou leur mélange.
2. Procédé de culture, de propagation et de replication in vi tro de virus appartenant aux familles des Togaviridae et Flavi viridae, selon lequel on dispose d'au moins une fraction de LVPs, associée à des immunoglobulmes humâmes, obtenue à partir de sérum ou de plasma d'un patient infecte par au moins un virus appartenant aux familles des Togaviri dae et Flaviviridae, on met en contact ladite fraction, pendant un temps prédéterminé dans un milieu de culture approprié, avec des cellules permissives qui possèdent une voie d' endocytose relayée par au moins un récepteur des lipoprotéines et modulée par un agent activateur, choisi parmi un acide gras insaturé ou un dérive d'un acide gras msaturé comprenant de 16 à 20 atomes de carbone ou leur mélange.
3. Procédé selon la revendication 1 ou 2, dans lequel le récepteur des lipoprotéines est le LSR et/ou le récepteur de surface des LDLs.
4. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes dans lequel l'acide gras msaturé est choisi parmi l'acide oléique, l'acide palmitoléique, l'acide linoléique, l'acide lmolénique, l'acide arachidonique, l'acide trans-héxadécenoique et l'acide elaidique ou leurs dérivés .
5. Procédé selon la revendication 4, dans lequel l'acide gras est l'acide oléique qui est ajouté audit milieu de culture à une concentration comprise entre 0,1 et 1 mM, de préférence 0,5 mM.
6. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel les cellules permissives sont des cellules primaires d' hépatocytes humains ou animaux, des cellules choisies dans le groupe des lignées cellulaires d' hépatocarcinome humain ou animal, des cellules denditriques, des cellules macrophagiques, des cellules de Kuppfer et leurs combinaisons associées ou non à des lymphocytes .
7. Procédé selon la revendication 6, dans lequel les cellules permissives sont des cellules d' hépatocarcinome humain de la lignée cellulaire PLC/PRF/5.
8. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes dans lequel, le milieu de culture comprend outre les ingrédients nécessaires à la culture et l'acide gras ou le dérivé d'acide gras, un agent modulateur de 1' apoptose.
9. Procédé selon la revendication 8, dans lequel l'agent modulateur de l'apoptose est choisi parmi les interférons, les anti-mterférons, en particulier les anti-interférons alpha ou beta, les anti-caspase 3, en particulier des analogues peptidiques, tels que la zVAD- fmk et les anticorps diriges contre lesdits anti-caspase 3.
10. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel le milieu est le milieu DMEM ou un milieu dérive du milieu DMEM, le milieu RPMI ou un dérivé du milieu RPMI.
11. Procède selon la revendication 10, dans lequel le milieu est le milieu DMEM complementé avec 0 à 10 mM de pyruvate de sodium, 0 a 10 * d'acides aminés non essentiels, 1 à 10 mM de glutamme, 100 à 200 U/ml de pénicillinne, 100 à 200 mg/ml de streptomycine et 1 à 20 % de sérum de veau.
12. Procédé selon la revendication 11, dans lequel le milieu est avantageusement complementé avec 0,1 à 0,5 % de
BSA ou avec 0,1 à 0,5 t de HSA couplée a un acide gras.
13. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes dans lequel on effectue après mise en contact des cellules permissives et de ladite fraction de LVPs plusieurs passages desdites cellules permissives ainsi infectées dans des conditions telles que définies selon l'une quelconque des revendications précédentes et on met en évidence la présence dudit virus dans lesdites cellules permissives par RT-PCR et/ou par technique immunologique, telle que par immunofluorescence indirecte notamment à l'aide d'un anticorps spécifique dudit virus et/ou par cytométrie de flux.
14. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel le virus appartient a la famille des Flaviviridae et au genre des Hepacivirus .
15. Procédé selon la revendication 14, dans lequel le virus est le virus de l'hépatite C ou le virus de l'hépatite G.
16. Milieu pour la culture, la propagation et la replication d' au moins un virus appartenant aux familles des Togaviridae et Flaviviridae, ledit milieu étant le milieu DMEM complementé avec 0 à 10 mM de pyruvate de sodium, 0 à 10 % d'acides aminés non essentiels, 1 à 10 mM de glutamme, 100 à 200 U/ml de pénicillinne, 100 à 200 mg/ml de streptomycine et 1 à 20 % de sérum de veau et avantageusement comprenant de plus 0,1 à 0,5 % de BSA ou HSA couplée à un acide gras .
17. Procédé pour préparer une composition pour la détection dans un échantillon d'anticorps dirigés contre au moins un virus appartenant aux familles des Togaviridae et Flaviviridae qui comprend au moins une purification partielle ou totale des particules virales dudit virus ou des polypeptides obtenus à partir d'un procédé de culture selon les revendications 1 ou 2.
18. Procédé selon la revendication 17, dans lequel lesdites particules virales ou lesdits polypeptides sont fixés sur un support solide.
19. Procédé pour l'obtention d'anticorps ou de fragments d'anticorps dirigés contre au moins un virus appartenant aux familles des Togaviridae et Flavi viridae selon lequel on immunise un animal avec des particules virales ou des polypeptides obtenus à partir d'un procédé de culture selon les revendications 1 ou 2.
20. Composition diagnostique comprenant au moins les particules virales ou les polypeptides obtenus selon le procédé défini dans l'une quelconque des revendications 17 et 18 ou les anticorps obtenus selon le procédé défini dans la revendication 19.
21. Kit de diagnostic comprenant en outre une composition telle que définie dans la revendication 20.
22. Composition vaccinale comprenant au moins les particules virales ou les polypeptides obtenus selon le procédé défini dans la revendication 17 associé à un véhicule et/ou un excipient et/ou un adjuvant pharmaceutiquement acceptable.
23. Composition thérapeutique susceptible d'influencer de manière qualitative et/ou quantitative la propagation et la replication in vi vo de virus appartenant aux familles des Togaviridae et des Flavi viridae qui comprend entre autre un ligand susceptible de moduler, de réprimer ou d' inhiber la voie d' endocytose relayée par au moins des récepteurs des lipoprotéines, le ligand étant choisi parmi un anticorps antagoniste dirigé contre ledit récepteur et une protéine choisie parmi les protéines recombinantes solubles et les polypeptide de synthèse solubles se liant audit récepteur ou en ce qu' elle comprend entre autre au moins une molécule qui module, réprime ou inhibe l'expression du gène codant pour ledit récepteur ou l'activité du promoteur du gène qui code pour ledit récepteur.
24. Procédé pour cribler et/ou sélectionner au moins une molécule anti-virale selon lequel on met en contact ladite molécule anti-virale avec une lignée cellulaire infectée.
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