CN103980259B - 黄酮类或异黄酮类化合物及其用途 - Google Patents

黄酮类或异黄酮类化合物及其用途 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种式(Ⅰ)所示的黄酮类或式(Ⅱ)所示的异黄酮类化合物，该化合物可治疗HCV感染的疾病。式(Ⅰ)式(Ⅱ)其中，R1为式(Ⅲ)、式(Ⅳ)或式(Ⅴ)所示，式(Ⅲ)式(Ⅳ)式(Ⅴ)，R2、R3、R4、R5为H、OH、卤素、CN、氨基、(C1‑C8烷基)1‑2氨基、C1‑C8烷氧基甲酰基，(C1‑C8烷基)1‑2氨基甲酰基，C1‑C8烷基巯基，C1‑C8烷基磺酰基，C1‑C8烷基亚磺酰基，C1‑C8烷基、C1‑C8烷氧基、C3‑C8环烷基、C2‑C8杂环烷基、C6‑C10芳基、C6‑C10芳基氧基、或糖基氧基；或者，R1、R2与其连接的碳原子形成咪唑环。

Description

黄酮类或异黄酮类化合物及其用途
技术领域
本发明属于化合物合成的技术领域，具体地涉及到一种黄酮类或异黄酮类化合物及其用途。
背景技术
丙型肝炎病毒（HCV）是输血后以及散发性肝炎的主要病原，病毒体呈球形，直径小于80nm（在肝细胞中为36~40nm，在血液中为36~62nm），为单股正链RNA病毒，在核衣壳外包绕含脂质的囊膜，囊膜上有剌突。HCV-RNA大约有9500~10000bp组成，在5′非编码区下游紧接一开放的阅读框（open reading frame，ORF），基因组排列顺序为5'-C-E1-E2-p7-NS2-NS3-NS4-NS5-3，编码3014个氨基酸的单一多聚蛋白前体，经宿主信号肽酶和病毒蛋白酶裂解为结构蛋白（C、E1、E2、P7）和非结构蛋白（NS2、NS3、NS4和NS5）。非结构基因NS5区位于基因组第6258-9374nt，由NS3丝氨酸蛋白酶裂解成NS5A和NS5B两部分，裂解位点位于cys-2420/ser2421间，不同HCV分离株的裂解位点及其侧翼序列相对保守。NS5A区位于6258-7601nt，编码1973-2420aa，蛋白的相对分子量为56KD（即P56）和58KD（即P58），P58是P56的过磷酸化形式，在NS3、NS4A和NS4B存在情况下，P56才能转变成P58。
目前公认对丙型肝炎抗病毒治疗有效药物是干扰素（IFN），但HCV感染者对干扰素治疗的应答不一，平均应答率不足50%，且停药后复发率较高。FDA于2011年批准了两个NS3/4A丝氨酸蛋白酶抑制剂Telaprevir和Boceprevir上市，为丙型肝炎的治疗提供了新的有效方法。但是耐药性和毒副作用的出现，使得HCV病毒的治疗仍然需要新型药物，如作用于新型靶点NS5A的抑制剂。
发明内容
本发明的目的在于提供一种式(Ⅰ)所示的黄酮类或式(Ⅱ)所示的异黄酮类化合物，
式(Ⅰ)
式(Ⅱ)
或其氮氧化物、水合物、溶剂化物、代谢产物或药学上可接受的盐或前药，其中，
R1为式(Ⅲ)、式(Ⅳ)或式(Ⅴ)所示，
式(Ⅲ)
式(Ⅳ)
式(Ⅴ)，
其中，A为连接键、C1-C3亚烷基或C1-C2亚烷基氨基甲酰基；
R2、R3、R4、R5独立地为H、D、OH、卤素、CN、氨基，或者选自未被取代的或被1~5个R0取代的下列取代基组：(C1-C8烷基)1-2氨基、C1-C8烷氧基甲酰基，(C1-C8烷基)1-2氨基甲酰基，C1-C8烷基巯基，C1-C8烷基磺酰基，C1-C8烷基亚磺酰基，C1-C8烷基、C1-C8烷氧基、C3-C10环烷基、C2-C8杂环烷基、C6-C10芳基、C6-C10芳基氧基、糖基氧基、或被1~5个氧取代的C1-C8烷基；
或者，R1、R2与其连接的碳原子一起形成咪唑环，即R1、R2与黄酮或异黄酮上自身的苯基形成稠环结构——苯并咪唑环，该咪唑环上两个氮原子之间的一个碳原子连接有式(Ⅵ)所示的基团；
式(Ⅵ)
其中，
R1'独立地为H、D、OH、卤素、CN、氨基，或者选自未被取代的或被1~5个R0取代的下列取代基组：(C1-C8烷基)1-2氨基、C1-C8烷氧基甲酰基，(C1-C8烷基)1-2氨基甲酰基，C1-C8烷基巯基，C1-C8烷基磺酰基，C1-C8烷基亚磺酰基，C1-C8烷基、C1-C8烷氧基、C3-C10环烷基、C2-C8杂环烷基、C6-C10芳基、C6-C10芳基氧基、糖基氧基、或被1~5个氧取代的C1-C8烷基；
或者相邻两个碳原子上的R1'与其连接的2个碳原子一起形成C3-C7的碳环,或者同一碳原子上的两个R1'与其连接的1个碳原子形成可被0~2个选自N、O和S杂原子插入的3~7元环；
R2'为选自未被取代的或被1~5个R0取代的下列取代基组：C1-C8烷基、C3-C7环烷基或C2-C7杂环烷基；
R3'为H、D，或选自未被取代的或被1~5个R0取代的C1-C8烷基；
R4'为选自未被取代的或被1~5个R0取代的下列取代基组：C1-C8烷基、C1-C8烷基甲酰基或C1-C8烷氧基甲酰基；
或者R3'、R4'与其连接的氮原子形成含有1个N原子且含有0~2个选自N、O和S杂原子的3~7元单环、4~12元双环或5~12元螺环。
R0为H、D、OH、卤素、CN、氨基、(C1-C8烷基)1-2氨基、C1-C8烷氧基甲酰基，(C1-C8烷基)1-2氨基甲酰基，C1-C8烷基巯基，C1-C8烷基磺酰基，C1-C8烷基亚磺酰基，C1-C8烷基、C1-C8烷氧基、C3-C10环烷基、C2-C8杂环烷基、C6-C10芳基、C6-C10芳基氧基、糖基氧基、或被1~5个氧取代的C1-C8烷基。
在本发明中，优选地，R2、R3、R4、R5、R1'独立地选自未被取代的或被1~3个R0取代的下列取代基组：(C1-C6烷基)1-2氨基、C1-C6烷氧基甲酰基，(C1-C6烷基)1-2氨基甲酰基，C1-C6烷基巯基，C1-C6烷基磺酰基，C1-C6烷基亚磺酰基，C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、C3-C7环烷基、C2-C6杂环烷基、或被1~3个氧取代的C1-C6烷基；
R2'为未被取代的或被1~3个R0取代的C1-C6烷基、C3-C7环烷基或C2-C6杂环烷基；
R3'为未被取代的或被1~3个R0取代的C1-C6烷基；
R4'为未被取代的或被1~3个R0取代的C1-C6烷基、C1-C6烷基甲酰基或C1-C6烷氧基甲酰基。
在本发明中，所述的糖基氧基可以为任意单糖糖基或二糖糖基，如为葡萄糖基氧基、核糖基氧基、阿拉伯糖基氧基、木糖基氧基或果糖基氧基等等。
式(Ⅰ)所示或式(Ⅱ)所示的结构式中表示为单键或双键。
优选地是，R1为下列取代基之一：
R11'为C1-C8烷基，优选为C1-C6烷基。
本发明具体包括如下化合物：
本发明的另一目的在于提供式(Ⅰ)所示的黄酮类或式(Ⅱ)所示的异黄酮类化合物在制备治疗HCV感染的疾病的药物中的用途。
本发明式(Ⅰ)所示的黄酮类或式(Ⅱ)所示的异黄酮类化合物的合成流程如下所示：
式(Ⅰ)或式(Ⅱ)所示的目标化合物
步骤一：将黄酮类或异黄酮类原料与双联频哪醇硼酸酯在催化剂Pd(dppf)Cl2下于1,4-二氧六环溶剂中加热反应得到中间体化合物。
步骤二：再将中间体化合物与R1L(其中L为卤素或OTf)在1,4-二氧六环/H2O溶剂中用Pd(dppf)Cl2催化反应得到式(Ⅰ)或式(Ⅱ)所示的目标化合物。
具体实施方式
实施例1化合物A
中间体A-2的合成
三氟甲磺酸酐(Tf2O)(2.2eq)在室温下加入到大豆素A-1(1g)和吡啶(5eq)的二氯甲烷(50mL)溶液中，加完后室温搅拌3小时，TLC检测反应完全后，加水淬灭，二氯甲烷萃取。二氯甲烷层用1N HCl、饱和碳酸氢钠、盐水洗，干燥，旋干得到1.75g产物，淡黄色中间体A-2固体。
步骤一：中间体A-3的合成
中间体A-2(2g)、双联频哪醇硼酸酯(4eq)、KOAc(5eq)、Pd(dppf)Cl2（[1,1'-双(二苯基磷)二茂铁]二氯化钯）(0.1eq)在1,4-二氧六环(40mL)中加热到80℃过夜，加水淬灭，乙酸乙酯萃取，柱层析(PE/EA(石油醚/乙酸乙酯)100:1~10:1)纯化得到1.75g中间体A-2白色固体。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.31(d,J=7.6Hz,1H),8.08(s,1H),7.94(s,1H),7.90(d,J=8.0Hz,2H),7.84(dd,J=8.0Hz,J=0.8Hz,1H),7.62(d,J=8.0Hz,2H),1.40(s,12H),1.38(s,12H).
步骤二：化合物A（盐酸盐）的合成
中间体A-3(100mg)、化合物2（WO2011079327）(2eq)、Na2CO3(6eq)和Pd(dppf)Cl2(0.2eq)在1,4-二氧六环/H2O(2/1,3mL)中80℃下搅拌过夜，点板显示反应完全。该混合物用水和二氯甲烷萃取，二氯甲烷层盐水洗涤，干燥，浓缩，柱层析(DCM/MeOH(二氯甲烷/甲醇)200:1~100:1)得到80mg淡黄色产物。粗品制备板(EA/MeOH=50/1)分离后得到30mg淡黄色固体。然后溶在甲基叔丁基醚/1,4-二氧六环(1/1,1.5mL)中，滴加HCl/1,4-二氧六环(4.5N)，室温搅拌过夜，静置1小时，上层清液吸走，固体抽干，然后在乙酸乙酯中室温搅拌两小时，过滤，干燥得到12mg淡黄色固体（化合物A）。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ14.92(s,1H),14.58(s,1H),8.71(s,1H),8.24-8.22(m,3H),8.15(s,1H),7.98-7.96(m,1H),7.91(d,J=8.4Hz,2H),7.81(d,J=8.4Hz,2H),7.35-7.31(m,2H),5.16(q,J=7.6Hz,2H),4.15-4.11(m,2H),3.95-3.86(m,4H),3.55(s,6H),2.43-2.33(m,2H),2.22-2.12(m,4H),2.08-2.02(m,4H),0.87-0.77(m,12H).
实施例2化合物B
中间体B-1的合成
2-乙酰基-4-溴苯酚(2g,9.3mmol)溶解在吡啶(10mL)中，再加入对溴苯甲酰氯(2.042g,9.3mmol)，把反应液加热到80℃搅拌30分钟，TLC反应完全，冷却到室温，反应液倒入冰水中，有固体析出，过滤固体，滤饼用饱和NaHCO3洗两遍，然后再用石油醚洗三遍，干燥固体，得到白色固体B-1(2.6g,收率70%)。
中间体B-2的合成
中间体B-1(2.6g,6.5mmol)溶解在吡啶(15mL)中，再加入氢氧化钾(1g)，该混合物加热到70℃，搅拌3小时，冷却到室温，倒入冰水中，用稀盐酸调pH=3~5，固体过滤，滤饼用石油醚洗三遍，重结晶，得到黄色固体B-2(2g,收率77%)。
中间体B-3的合成
中间体B-2(2g,5mmol)加入到浓H2SO4(10mL)中，室温搅拌1小时，倒入冰水中，过滤，滤饼用水洗5遍，乙醇洗重结晶，得到白色固体B-3(1.8g,收率90%)。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)：δ8.12(d,J=2.4Hz,1H),8.09(d,J=8.0Hz,2H),8.02(dd,J＝8.4,2.0Hz,1H),7.80-7.83(m,3H),7.17(s,1H).
中间体B-4的合成
采用中间体B-3为原料，方法同实施例1的步骤一，得到中间体B-4（180mg,收率80%）。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.39(s,1H),8.14(d,J=8.4Hz,2H),8.06(d,J=8.2Hz1H),7.86(d,J=8.4Hz,2H),7.81(d,J=8.2Hz,1H),7.12(s,1H),1.30(s,12H),1.20(s,12H).
化合物B的合成
采用中间体B-4为原料，方法同实施例1的步骤二，得到化合物B(盐酸盐)（46mg，收率20%）。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ14.80(brs,4H),8.53(s,1H),8.32(m,5H),8.13(d,J=8.0Hz,2H),8.03(d,J=8.2Hz,1H),7.32(t,J=7.6Hz,2H),7.25(s,1H),5.15-5.21(m,2H),4.13(m,2H),3.80-3.97(m,,4H),3.65(s,3H),3.64(s,3H),2.23-2.45(m,2H),2.14-2.20(m,4H),2.09-2,14(m,4H),0.85(m,6H),0.78(m,6H);ESI-LCMS m/z807.2(M+H).
实施例3化合物C
中间体C-2的合成
化合物C-1(21g,93mmol)溶解在1,2-二氯乙烷(200mL)中，氮气保护，0℃下加入AlCl3(12.8g,96mmol)，搅拌20分钟，间溴苯酚(11g,64mmol)的1,2-二氯乙烷溶液在0℃下加入到上述反应液中，混合物加热回流过夜，冷却到室温，倒入到冰的HCl(1M)中，用乙酸乙酯萃取(300mL×3)，合并有机相，用饱和食盐水洗，无水硫酸钠干燥，过滤，减压浓缩，过柱纯化(PE:EA=100:1)，浓缩后用乙酸乙酯/石油醚(1/3)重结晶，得到白色固体C-2(9g,收率38%)。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ11.83(s,1H),7.96(d,J=8.4Hz,1H),7.52(dd,J=6.0Hz,1.6Hz,2H),7.23(d,J=8.4Hz,2H),7.08(d,J=2.0Hz,1H),7.03(dd,J=8.8Hz,2.0Hz,1H),4.43(s,2H).
中间体C-3的合成
中间体C-2(3g,8.1mmol)加入到NaOH(10%aq,225mL)中，然后在60℃加入多聚甲醛(0.486g,16.2mmol)，然后60℃搅拌5小时，中间体C-2完全消失，过滤固体，干燥固体，然后用乙醇重结晶得到白色固体C-3(1.1g,收率36%)。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ7.82(d,J=8.8Hz,1H),7.56(d,J=8.8Hz,2H),7.28(t,J=6.2Hz,2H),7.24(s,1H),7.17(dd,J=8.8Hz,2.0Hz,1H),4.80(dd,J=11.2,11.2Hz,1H),4.70(dd,J=11.2,5.2Hz1H),4.30(dd,J=11.4,5.2Hz,1H).
中间体C-4的合成
如实施例1的步骤一，中间体C-3(200mg,0.52mmol)、双联频哪醇硼酸酯(532mg,2.15mmol)、Pd(dppf)Cl2(76mg,0.1mmol)、KOAc(308mg,3.14mmol)、1,4-二氧六环(5mL)加入到拇指瓶中，氮气置换3次，在氮气氛围下加热到80℃搅拌2小时，浓缩反应液，柱层析纯化(PE:EA=5:1)得到白色产物C-4(200mg)。
ESI-LCMS m/z478(M+H).
化合物C
以中间体C-4为原料，方法同实施例1的步骤二，得到化合物C（60mg）。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ10.30-11.0(multi brs,2H),7.94(d,J=8.0Hz,1H),7.74(d,J=8.0Hz,2H),7.25-7.45(m,4H),7.18(m,1H),6.96(s,1H),5.40-5.50(m,2H),5.20-5.30(m,2H),4.68(m,1H),4.33(m,2H),3.55-3.98(m,10H),2.9-3.10(m,2H),2.35(m,2H),2.15(m,4H),1.95(m,4H),0.87(m,12H);ES-LCMS m/z809.3(M+H).
实施例4化合物D
中间体D-1的合成
中间体C-2(1g,2.7mmol)、NaOAc(2.217g,27mmol)、醋酐(8mL)加入到一个单口瓶中，氮气保护下加热回流过夜，反应液倒入冰水中，有固体析出，过滤，滤饼溶解在乙酸乙酯中，用无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压浓缩，过柱纯化(PE:EA=20:1)，得到中间体D-1(850mg,收率80%)。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δ8.05(d,J=8.4Hz,1H),7.88(d,J=1.6Hz,1H),7.65(d,J=8.4Hz,2H),7.54(dd,J=8.8Hz,1.6Hz,1H),7.28(d,J=8.4Hz,2H),2.29(s,3H).
中间体D-2的合成
以中间体D-1为原料(300mg,0.761mmol)，方法同实施例1的步骤一，得到中间体D-2(280mg,收率78%)。
ES-LCMS m/z489.2(M+H).
化合物D的合成
以中间体D-2(450mg,0.95mmol)为原料，方法同实施例1的步骤二，得到化合物D(120mg,收率15%)。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ10.85(brs,1H),10.61(brs,1H),10.41(brs,1H),8.19-8.17(d,J=8.8Hz,1H),7.89(s,1H),7.72(m,1H),7.49(m,1H),7.32(m,3H),7.24(s,1H),5.12(t,J=12Hz,2H),5.29(m,2H),4.35(t,J=7.6Hz,2H),3.86(m,2H),3.75(m,9H),3.10(m,2H),2.39(m,2H),2.33(s,3H),2.25(m,2H),2.15(m,2H),2.05(m,3H),1.08(m,2H),0.90(m,12H);ES-LCMS m/z821.3(M+H).
实例5化合物E
中间体E-1的合成
中间体C-2(2g,5.4mmol)、苯甲酸酐(3.668g,16.2mmol)、三乙胺(20mL)、加入到单口瓶中，氮气下加热回流过夜，冷却到室温，反应液倒入冰水中，用HCl(2N)调pH=3，搅拌2小时，过滤，滤饼溶解在甲醇(50mL)中，NaOH(2N,10ml)溶液加入上述甲醇溶液中，回流2小时，反应液冷却到室温，倒入冰水中，用乙酸乙酯萃取，用无水硫酸钠干燥。过柱纯化(PE:EA=20:1)，得到中间体E-1(550mg)。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.11(d,J=8.8Hz,1H),7.97(d,J=1.6Hz,1H),7.60(dd,J=8.4Hz,1.6Hz,1H),7.51(d,J=8.4Hz,2H),7.36-7.43(m,5H),7.14(d,J=8.0Hz,2H)。
中间体E-2的合成
以中间体E-1(100mg,0.219mmol)为原料，方法同实施例1的步骤一，得到中间体E-2(110mg)。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δ8.28(d,J=8.0Hz,1H),8.03(s,1H),7.83(d,J=7.6Hz,1H),7.78(d,J=8.4Hz,2H),7.41(d,J=7.6Hz,2H),7.35(t,J=7.6Hz,1H),7.25-7.29(m,4H),1.41(s,12H),1.36(s,12H)。
化合物E的合成
以中间体E-2(110mg,0.20mmol)为原料，方法同实施例1的步骤二，得到化合物E(35mg)。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ:10.88(brs,1H),10.75(brs,1H),8.23(d,J=8.4Hz,1H),7.98(s,1H),7.65-7.77(m,2H),7.15-7.49(m,8H),5.60(d,J=9.2Hz,2H),5.25-5.35(m,2H),4.30-4.38(m,2H),3.82-3.89(m,2H),3.62-3.78(m,9H),3.15(m,2H),1.95-2.45(m,9H),0.89(m,12H);ESI-LCMS m/z883.3(M+H).
实施例6化合物F
中间体F-1的合成
5'-溴-2'-羟基苯乙酮(1.075g,5mmol,1.0eq)和原料对溴苯甲醛(0.925g,5mmol,1.0eq)搅拌下溶于EtOH(乙醇)(30mL)中。将NaOH(0.6g,15mmol,3.0eq)加入上述反应液中，室温搅拌。反应半小时后停止反应。反应液用HCl水溶液(10%)调节pH=6~7，析出大量黄色固状物。抽滤后所得固体溶于乙酸乙酯(250mL)中，无水Na2SO4干燥。过滤后，减压旋蒸得黄色固体F-1(1.53g，收率80%)。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ12.68(s,1H),7.99(d,J=2.4Hz,1H),7.88(d,J=15.2Hz,1H),7.61-7.54(m,6H),6.97(d,J=8.8Hz,1H)
中间体F-2的合成
中间体F-1(940mg,2.46mmol,1.0eq)加入醋酸(55mL)中，油浴125℃，加热搅拌反应。反应30小时，冷至室温。将反应液倒入水(500mL)中，用乙酸乙酯(150mL)萃取三次。用饱和NaCl洗涤，无水MgSO4干燥，过滤，浓缩，柱层析纯化（PE:EA200:1~100:1）得中间体F-2(578mg)。
1H NMR(400MHz,CDCl3):δ8.04(d,J=2.4Hz,1H),7.55-7.65(m,3H),7.35(d,J=8.4Hz,2H),6.96(d,J=8.4Hz,1H),5.44(dd,J=13.2Hz,J=3.2Hz,1H),3.04(dd,J=17.2Hz,J=13.2Hz,1H),2.90(dd,J=17.2Hz,J=3.2Hz,1H)
中间体F-3的合成
以中间体F-2(500mg,1.31mmol,1.0eq)为原料，方法同实施例1的步骤一，得白色固体中间体F-3(0.361g)。
ESI-LCMS m/z:477.2(M+H).
化合物F的合成
以中间体F-3为原料，方法同实施例1的步骤二，得到产物化合物F，制成盐酸盐后得黄色粉末固体（8mg）。
1H NMR(400MHz,CD3Cl3)δ10.10-12.0(multi-brs,2H),7.60-8.00(m,2H),7.45-7.41(m,2H),7.35-7.25(m,1H),7.21-7.16(m,1H),7.07-7.05(m,1H),6.95-9.91(m,2H),5.55-5.35(m,3H),5.35-5.22(m,2H),4.36-4.30(m,2H),3.86-3.80(m,2H),3.70(s,6H),3.73-3.61(m,2H),3.11-2.91(m,4H),2.36-1.94(m,8H),0.88-0.84(m,12H)。ESI-LCMS m/z:809.4(M+H).
不同的R1L可以按照如下文献制备：
式R1(2)根据PCT Int.Appl.,2012041014,05Apr2012制备
式R1(3)根据PCT Int.Appl.,2011059887,19May2011制备
式R1(4)根据PCT Int.Appl.,2011119853,29Sep2011制备
式R1(5)根据PCT Int.Appl.,2011079327,30Jun2011制备
式R1(6)按From PCT Int.Appl.,2011149856,01Dec2011制备
式R1(7)根据PCT Int.Appl.,2011119853,29Sep2011制备
式R1(8)根据PCT Int.Appl.,2011091446,28Jul2011制备
式R1(9)根据PCT Int.Appl.,2010132601,18Nov2010制备
式R1(10)根据PCT Int.Appl.,2011009084,20Jan2011制备
根据上述实施例1~6合成出的含有主核结构的中间体以及文献给出的R1L，再按照步骤一和步骤二所述的方法合成下列目标化合物，如表1所示。
表1化合物7~18
效果实施例1
HCV复制子实验
按照文献（Science.1999Jul2;285(5424):110-3以及J.Virol.2003,Mar;77(5):3007-19）中所述方法准备、进行和验证。用HCV基因型GT1a、GT1b和GT2a复制子细胞来测试化合物A~F，以及HCV1b野生型细胞和Y93H、L31F、P32L、I302V抗性细胞测试化合物A~F。GT1a和GT1b是分别转染有HCV1a、1b、2a基因型的丙肝的复制子系统(HCV Replicon System)，该系统含有G418抗性基因NEO和荧光素酶报告基因，通过实时定量聚合酶链反应(qPCR)检测NEO的含量和化学发光法检测荧光素酶基因的表达高低，可以用来确定丙肝的复制水平的高低，评估化合物A~F对HCV病毒复制的作用效果。
实验方法：
HCV复制子转染细胞：HCV复制子（野生型1b）转染的Huh7.5.1细胞。将转染细胞接种于96孔板中，8000细胞每孔，在37℃、5％CO2培养24小时。
样品处理：在HCV复制子转染的Huh7.5.1细胞中加入不同浓度的化合物A~F样品，每个浓度设二复孔，并设无样品对照孔。受试样品从受试最高浓度开始，用POD810全自动微孔板预处理系统加不同浓度化合物至细胞中；3倍稀释10个浓度；继续培养72小时。
化合物的活性及细胞毒性测定：
加入Cell Titer-fluor（Promega）测定荧光信号，获得的数据（RFU）用GraphPadPrism软件计算化合物的EC50。
效果实施例2
HCV体外感染人肝肿瘤细胞Huh7.5.1后HCV繁殖抑制活性的检测
本实验采用的J399EM是转染了EGFP的HCV全长突变株，可以产生与JFH-1野生型具有相同感染能力的病毒，同时通过在NS5A区域插入EGFP编码序列，可以直接在感染细胞内观察NS5A-EGFP融合蛋白荧光。
本试验用J399EM感染Huh7.5.1细胞8小时后，用不同浓度化合物A~F样品处理感染细胞72小时，通过荧光酶标仪上测定相对荧光强度（RFU）进行样品对HCV的抑制作用的检测。
试验方法：
Huh7.5.1细胞准备：Huh7.5.1细胞接种于96孔板中，37℃、5%CO2培养24h。
病毒感染：J399EM病毒上清（moi≈0.1）感染Huh7.5.1细胞，同时设无感染的细胞对照孔，感染8小时后，以PBS清洗。
药物处理：在J399EM病毒感染的Huh7.5.1细胞中加入不同浓度的化合物A~F样品，每个浓度设双复孔，并设无样品对照孔。受试样品从最高浓度开始,四倍稀释，五个浓度分别加入，继续培养72小时。
HCV蛋白荧光检测：样品处理72小时后，荧光酶标仪上，激发波长为488nm，发射波长为516nm，读取相对荧光强度（RFU），计算HCV病毒抑制率。
经测定，化合物A~F不仅可以有效地抑制HCV复制子1b基因型，还可以有效地抑制HCV体外感染人肝肿瘤细胞2a基因型。化合物A~F还具有抑制多种HCV基因型的活性。表2列出了化合物A~F针对HCV1b和2a基因型的EC50值。
针对HCV1b和HCV2a的EC50范围分别如下:a表示：0.0001nM≤EC50≤0.100nM；b表示：0.100nM＜EC50≤10.00nM；c表示：10.00nM＜EC50≤100.0nM；d表示：EC50＞100nM。
表2化合物A~F针对HCV1b和2a基因型的EC50值

Claims (6)

1.一种式(I)所示的黄酮类或式(II)所示的异黄酮类化合物
或其药学上可接受的盐，其中，
R1为式(III)或式(IV)所示，
R2、R3、R4、R5独立地为H、D、OH、卤素、CN、氨基，或者选自未被取代的或被1～5个R0取代的下列取代基组：(C1-C8烷基)1-2氨基、C1-C8烷氧基甲酰基，(C1-C8烷基)1-2氨基甲酰基，C1-C8烷基巯基，C1-C8烷基磺酰基，C1-C8烷基亚磺酰基，C1-C8烷基、C1-C8烷氧基、C3-C10环烷基、C6-C10芳基、C6-C10芳基氧基、或被1～5个氧取代的C1-C8烷基；
或者，R1、R2与其连接的碳原子一起形成咪唑环，该咪唑环上两个氮原子之间的一个碳原子连接有式(VI)所示的基团；
其中，
R1′独立地为H、D、OH、卤素、CN、氨基，或者选自未被取代的或被1～5个R0取代的下列取代基组：(C1-C8烷基)1-2氨基、C1-C8烷氧基甲酰基，(C1-C8烷基)1-2氨基甲酰基，C1-C8烷基巯基，C1-C8烷基磺酰基，C1-C8烷基亚磺酰基，C1-C8烷基、C1-C8烷氧基、C3-C10环烷基、C6-C10芳基、C6-C10芳基氧基、或被1～5个氧取代的C1-C8烷基；
R2′为选自未被取代的或被1～5个R0取代的下列取代基组：C1-C8烷基或C3-C7环烷基；
R3′为H、D，或选自未被取代的或被1～5个R0取代的C1-C8烷基；
R4′为选自未被取代的或被1～5个R0取代的下列取代基组：C1-C8烷基、C1-C8烷基甲酰基或C1-C8烷氧基甲酰基；
或者R3′、R4′与其连接的氮原子形成含有1个N原子且含有0～2个选自N、O和S杂原子的3～7元单环、4～12元双环或5～12元螺环，
其中，R0为H、D、OH、卤素、CN、氨基、(C1-C8烷基)1-2氨基、C1-C8烷氧基甲酰基，(C1-C8烷基)1-2氨基甲酰基，C1-C8烷基巯基，C1-C8烷基磺酰基，C1-C8烷基亚磺酰基，C1-C8烷基、C1-C8烷氧基、C3-C10环烷基、C6-C10芳基、C6-C10芳基氧基、或被1～5个氧取代的C1-C8烷基。
2.如权利要求1所述的化合物，其特征在于，R2、R3、R4、R5、R1′独立地选自未被取代的或被1～3个R0取代的下列取代基组：(C1-C6烷基)1-2氨基、C1-C6烷氧基甲酰基，(C1-C6烷基)1-2氨基甲酰基，C1-C6烷基巯基，C1-C6烷基磺酰基，C1-C6烷基亚磺酰基，C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、C3-C7环烷基、或被1～3个氧取代的C1-C6烷基；
R2′为未被取代的或被1～3个R0取代的C1-C6烷基或C3-C7环烷基；
R3′为未被取代的或被1～3个R0取代的C1-C6烷基；
R4′为未被取代的或被1～3个R0取代的C1-C6烷基、C1-C6烷基甲酰基或C1-C6烷氧基甲酰基。
3.如权利要求1所述的化合物，其特征在于，R1为下列取代基之一：
其中，R11′为C1-C8烷基。
4.如权利要求3所述的化合物，其特征在于，R11′为C1-C6烷基。
5.如权利要求1所述的化合物，其特征在于，该化合物为：
6.权利要求1所述的化合物在制备治疗HCV感染的疾病的药物中的用途。
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