FR2930553A1 - Composes azabicycliques, leur preparation et leur utilisation comme medicaments, notamment inhibiteurs de beta-lactamases - Google Patents

Abstract

L'invention concerne les composés répondant à la formule (I) dans laquelle R1 et R2 représentent l'un un hydrogène et l'autre un fluor ou tous les deux un fluor, sous forme libre, de zwitterions et de sels avec les bases minérales ou organiques pharmaceutiquement acceptables, leur préparation et leur utilisation comme médicaments inhibiteurs de l'action des beta-lactamases par les bactéries pathogènes.

Description

COMPOSES AZABICYCLIQUES, LEUR PREPARATION ET LEUR UTILISATION COMME MEDICAMENTS, NOTAMMENT INHIBITEURS DE f3 -LACTAMASE S L'invention concerne de nouveaux composés hétérocycliques, leur préparation et leur utilisation comme médicaments, notamment comme inhibiteurs de l'action des (3-lactamases par les bactéries pathogènes.

La demande W002/10172 décrit des composés azabicycliques et leurs sels avec les bases ou avec les acides, répondant à la formule A: R1 (CH2)nX 2 (A) dans laquelle: R1, R2 , R3, A, X et n' sont définis dans la demande, et notamment des composés dans lesquels X représente un groupement divalent -C(0)-B- relié à l'atome d'azote par l'atome de carbone, et B représente un groupement divalent -NR8- relié au carbonyle par l'atome d'azote, R8 étant choisi dans le groupe constitué par hydrogène OH, R, OR, Y, OY, Y1 , OY1 r Y2, OY2 r Y3, OCH2CH2SOm,R, OSiRaRbRc et SiRaRbRc, R, Y, Y1, Y2 , Y3, m, Ra, Rb et Rc étant définis dans la demande. R8 peut ainsi notamment représenter un radical OSO3H 30 ou 0-CH2-COOH . Les composés décrits dans la demande W002/10172 présentent des propriétés anti-bactériennes. ., La demande W003/063864 décrit l'utilisation des composés (A) comme inhibiteurs de (3-lactamases et leur association avec les (3-lactamines.

Les demandes W002/100860 et W004/052891 décrivent des composés azatricycliques répondant à la formule B : R1 R2 ~~ R3 se distinguant des composés (A) par notamment R3 et R4 qui forment ensemble un phényle ou un hétérocycle à caractère aromatique, éventuellement substitué. La présente invention a pour objet les composés 15 répondant à la formule (I) X~~R4 (CH2)n (B) H2N (1) R1 OH R2 0 20 dans laquelle R et R2 représentent l'un un hydrogène et l'autre un fluor ou tous les deux un fluor, sous forme libre, de zwitterions et sous forme de sels avec les

:3 bases, minérales ou organiques, pharmaceutiquement acceptables. Parmi les sels de bases des produits de formule (I), on peut citer, entre autres, ceux formés avec les bases minérales telles que, par exemple, l'hydroxyde de sodium, de potassium, de lithium, de calcium, de magnésium ou d'ammonium ou avec les bases organiques telles que, par exemple, la méthylamine, la propylamine, la triméthylamine, la diéthylamine, la triéthylamine, la N,N- diméthyléthanolamine, le taris (hydroxyméthyl) amino méthane, l'éthanolamine, la pyridine, la picoline, la dicyclohexylamine, la morpholine, la benzylamine, la procaïne, la lysine, l'arcinine, l'histidine, la N- méthylglucamine, ou encore les sels de phosphonium, tels que les alkyl-phosphonium, les aryl-phosphoniums, les alkyl-aryl-phosphonium, les alkényl-aryl-phosphonium ou les sels d'ammoniums quaternaires tels que le sel de tétra-nbutyl-ammonium.

Les atomes de carbone asymétriques contenus dans les composés de formule (I) peuvent indépendamment les uns des autres présenter la configuration R, S ou RS et l'invention a donc également pour objet les composés de 25 formule (I) se présentant sous la forme d'énantiomères purs ou de diastéréoisomères purs ou sous la forme d'un mélange d'énantiomères notamment de racémates, ou de mélanges de diastéréoisomères. Il résulte de ce qui précède que le substituant CONH2 30 d'une part et l'atome d'azote du second cycle d'autre part peuvent être en position cis et/ou trans par rapport au cycle à 6 sommets sur lequel ils sont fixés et que l'invention a donc pour objet les composés de formule (I) se présentant sous la forme d'isomères cis ou d'isomères 35 trans ou de mélanges.

L'invention a notamment pour objet - le trans-(1R,2S,5R)-6-(l-fluoro-2-hydroxy-2- oxoéthoxy)-7-oxo-1,6-diazabicyclo [3.2.1] octane-2-carboxamide, - le trans-(1R,2S,5R)-6-(1,1-difluoro-2-hydroxy-2-oxoéthoxy)-7-oxo-1, 6-diazabicyclo [3.2.1] octane-2-carboxamide, sous forme libre, de zwitterions et de sels avec les bases minérales ou organiques pharmaceutiquement acceptables, en particulier leurs sels de sodium. L'invention a également pour objet un procédé de 15 préparation des composés de formule (I), caractérisé en ce que l'on traite un composé de formule (II) O H 2 N - ' par un réactif de formule (III) Hal CO2alc (III) R1 R2

25 dans laquelle Ra et R2 sont définis comme précédemment, Hal représente un atome d'halogène différent du fluor et alc représente un radical alcoyle renfermant de 1 à 6 atomes de carbone, en présence d'une base, pour obtenir le composé de formule (IV) 20 o H2N Oalc dont on hydrolyse la fonction ester pour obtenir l'acide 5 correspondant de formule (I) que, si désiré, l'on salifie. Dans des conditions préférées de mise en œuvre du procédé de l'invention, Hal est un atome de brome. La base utilisée peut être un carbonate ou un bicarbonate alcalin ou encore une base aminée, un carbonate alcalin étant préféré.

15 On peut opérer au sein d'un solvant tel que le diméthylformamide, le tétrahydrofuranne ou 1'acétonitrile.

L'hydrolyse de l'ester peut être effectuée par 20 saponification par action d'un hydroxyde alcalin, par exemple l'hydroxyde de lithium ou de sodium, au sein du tétrahydrofuranne ou d'un mélange tétrahydrofuranne-eau, ou bien par hydrolyse acide en utilisant par exemple l'acide trifluoroacétique, notamment dans le cas d'un 25 ester de tert-butyle. Les composés de l'invention possèdent de remarquables propriétés inhibitrices de P-lactamases et présentent 10 donc de l'intérêt à titre de médicaments, pour lutter contre les maladies infectieuses ou prévenir celles-ci, sous forme d'association avec divers composés antibiotiques de type (3-lactamines, afin de renforcer leur efficacité dans la lutte contre les bactéries pathogènes productrices de (3-lactamases. Il est bien connu que l'inactivation enzymatique des antibiotiques de type (3-lactamines, que ce soit des composés de type pénicillines ou céphalosporines, dans le traitement des infections bactériennes est un obstacle pour ce type de composés. Cette inactivation consiste en un processus de dégradation des P-lactamines et constitue l'un des mécanismes pour lesquels les bactéries peuvent devenir résistantes aux traitements. Il est donc souhaitable de parvenir à contrer ce processus enzymatique en associant à l'agent antibactérien de type 3-lactamines un agent susceptible d'inhiber l'enzyme. Lorsqu'un inhibiteur de (3-lactamases est utilisé en combinaison avec un antibiotique de type (3-lactamines, il 20 peut donc renforcer son efficacité contre certains microorganismes.

L'activité inhibitrice de (3-lactamases des composés de formule (I) est remarquable et inattendue en 25 particulier si on la compare à celle du composé non fluoré correspondant. Une préparation de ce composé de référence est décrite ci-après à l'exemple 1. Un tableau des activités comparées est fourni plus loin dans la demande. 30 La présente invention a donc également pour objet, à titre de médicaments et notamment de médicaments destinés au traitement des infections bactériennes chez l'homme ou l'animal via l'inhibition de la production des f3-lactamases par les bactéries pathogènes, les composés de formule (I) tels que définis ci-dessus, ainsi que leurs sels avec les acides et les bases pharmaceutiquement acceptables, et notamment les deux composés cités plus haut. L'antibiotique de type 0-lactamines auquel peut-être associé un composé de formule (I) peut être choisi dans le groupe constitué par les pénames, les pénèmes, les carbapénèmes, les céphèmes, les carbacéphèmes, les oxacéphèmes, les céphamycines et les monobactames. Par (3-lactamines, on entend par exemple les pénicillines telles que amoxicilline, ampicilline, 15 azlocilline, mezlocilline, apalcilline, hetacilline, bacampicilline, carbenicilline, sulbenicilline, ticarcilline, piperacilline, azlocilline, mecillinam, pivmecillinam, methicilline, ciclacilline, talampicilline, aspoxicilline, oxacilline, cloxacilline, 20 dicloxacilline, flucloxacilline, nafcilline ou pivampicilline, les céphalosporines telles que céphalothine, céphaloridine, céfaclor, céfadroxile, céfamandole, céfazoline, céphalexine, céphradine, ceftizoxime, céfoxitine, céphacétrile, céfotiam, 25 céfotaxime, cefsulodine, céfopérazone, ceftizoxime, cefménoxime, cefmétazole, céphaloglycine, céfonicide, céfodizime, cefpirome, ceftazidime, ceftriaxone, cefpiramide, cefbupérazone, cefozopran, céfépime, céfoselis, céfluprenam, céfuzonam, cefpimizole, 30 cefclidine, céfixime, ceftaroline, ceftibutène, cefdinir, cefpodoxime axétil, cefpodoxime proxétil, ceftéram pivoxil, céfétamet pivoxil, cefcapène pivoxil ou cefditoren pivoxil, céfuroxime, céfuroxime axétil, loracarbacef, latamoxef, les carbapénèmes tels que 35 imipénème, méropénème, biapénème ou panipénème et les monobactames tels que l'aztréonam et le carumonam, ainsi que leur sels. Parmi les céphalosporines, le ceftazidime est particulièrement préféré .

8 Les composés de formule (I) ou leurs sels pharmaceutiquement acceptables, peuvent être administrés en même temps que la prise d'antibiotiques de type (3-lactamines, ou séparément, de préférence après celle-ci.

Cela peut s'effectuer sous forme d'un mélange des deux principes actifs ou sous forme d'une association pharmaceutique des deux principes actifs séparés. La posologie des composés de formule (I) et de leurs sels pharmaceutiquement acceptables peut bien entendu varier dans de larges limites et doit naturellement être adaptée, dans chaque cas particulier, aux conditions individuelles et à l'agent pathogène à combattre. En général, pour une utilisation dans la traitement des infections bactériennes, la dose journalière peut être comprise entre 0,250 g et 10 g par jour, par voie orale chez l'homme, avec le produ:t décrit à l'exemple 3 ou encore comprise entre 0,25 g et 10 g par jour par voie intramusculaire ou intraveineuse. Pour une utilisation comme inhibiteur de (3-lactam.ases, une dose journalière chez l'homme pouvant aller ce 0,1 à environ 10 g peut convenir. Par ailleurs, le rapport de l'inhibiteur de F3-lactamase de formule (I) ou du sel pharmaceutiquement acceptable de celui-ci à l'antibiotique de type (3- lactamines peut également varier dans de larges limites et doit être adapté, dans chaque cas particulier, aux conditions individuelles. En général, un rapport allant d'environ 1:20 à environ 1:1 devrait être indiqué. Les médicaments inhibiteurs de (3-lactamases tels que définis plus haut sont mis en oeuvre sous forme de compositions pharmaceutiques en mélange avec un excipient pharmaceutique inerte, organique ou minéral, adapté au mode d'administration recherché, et l'invention a également pour objet les compositions pharmaceutiques renfermant comme principe actif, au moins un des composés de l'invention tels que définis plus haut ainsi que les associations des composés de l'invention avec les E3-lactamines.

9 Ces compositions peuvent être administrées par voie buccale, rectale, parentérale, notamment intramusculaire, ou par voie locale en application topique sur la peau et les muqueuses.

Ces compositions peuvent être solides ou liquides et se présentent sous les formes pharmaceutiques couramment utilisées en médecine humaine, comme par exemple les comprimés simples ou dragéifiés, les gélules, les granulés, les suppositoires, les préparations injectables, les pommades, les crèmes, les gels ; elles sont préparées selon les méthodes usuelles. Le ou les principes actifs peuvent y être incorporés à des excipients habituellement employés dans ces compositions pharmaceutiques, telles que le talc, la gomme arabique,le lactose, l'amidon, le stéarate de magnésium, le beurre de cacao, les véhicules aqueux ou non, les corps gras d'origine animale ou végétale, les dérivés paraffiniques, les glycols, les divers agents mouillants, dispersants ou émulsifiants et les conservateurs.

Ces compositions peuvent également se présenter sous forme de lyophilisat destiné à être dissout extemporanément dans un véhicule approprié par exemple de l'eau stérile apyrogène.

Les exemples suivants illustrent l'invention. PARTIE EXPERIMENTALE Exemple 1 - Préparation du trans-(1R,2S,5R)-6-(2-hydroxy-30 2-oxoéthoxy)-7-oxo-1,6-diazabcyclo [3.2.1] octane-2-carboxamide (composé de référence).

Stade A trans-(lR,2S,5R)-6-(2-éthoxy-2-oxoéthoxy)-7-oxo-1,6-35 diazabicyclo [3.2.1] octane-2--carboxamide

10 Le bromoacétate d'éthyle (200 pL, 17.8 mmol) est ajouté à une suspension de K2CO3 (270 mg, 19.4 mmol) et de trans-(1R,2S,5R)-6-hydroxy-7-oxo-1,6-diazabicyclo [3.2.1] octane -2- carboxamide (racémique décrit au stade B de l'exemple 33a du WO 03/063864) (300 mg, 16.2 mmol) dans du diméthylformamide (0.6 rr.L) sous azote. Le mélange réactionnel est agité pendant 24 h à température ambiante. La suspension est ensuite diluée avec de l'acétate d'éthyle et filtrée. Le filtrat (environ 60 mL) est lavé à l'eau. Les phases organiques réunies sont séchées puis concentrées sous pression réduite. L'huile obtenue est chromatographiée sur silice avec un éluant dichlorométhane / méthanol de 99/1 à 95/5 pour donner une huile incolore (223 mg, 46 %) 1H NMR (400 MHz, MeOH-d4 ) : $ (ppm) = 4.56-4.69 (m, 2H, OCH2CO2CH2CH3), 4.26 (q, 2H, OCH2CO2CH2CH3), 4.11 (m, 1H, CHCONH2), 3.94 (m, 1H, NCH2CHN), 3.13 (m, 1H, NCH2CHN), 3.03 (m, 1H, NCH2CHN), 2.29 (m, 1H, CH2CH2), 2.14 (m, 1H, CH2CH2), 1.93 (m, 1H, CH2CH2), 1.81 (m, 1H, CH2CH2), 1.33 (t, 3H, OCH2CO2CH2CH3).

Stade B trans-(1R,2S,5R)-6-(2-hydroxy--2-oxoéthoxy)-7-oxo-1,6-25 diazabicyclo [3.2.1] octane-2--carboxamide

Le produit obtenu au stade A (129 mg, 4.8 mmol) est dissout dans 8 mL de tétrahydrofurane La solution est diluée avec 2.7 mL d'eau, puis refroidie à 0°C. LiOH,H20 30 (21 mg, 5.0 mmol) est ajouté à la solution. L'agitation est poursuivie pendant 30 min à 0°C. La saponification est stoppée par addition de 300 pL d'une solution aqueuse HC1 2N. Le mélange réactionnel est dilué progressivement avec de l'acétate d'éthyle (50 mL) et agité pendant 30 35 min tout en laissant la température remonter vers 10°C. On décante et la phase aqueuse est réextraite avec de l'acétate d'éthyle. Les phases organiques réunies sont séchées, puis concentrées sous pression réduite. Le

1:L produit obtenu est séché sous vide pour donner un solide amorphe (76 mg, 66 %).

MS (ES(+)) : m/z [M+H]+ = 244 ; [2M+H]+ = 287. 1H NMR (400 MHz, MeOH-d4 ) : (ppm) = 4.57-4.66 (m, 2H, OCH2CO2H), 4.14 (m, 1H, CHCONH2), 3.94 (d, 1H, NCH2CHN), 3.16 (m, 1H, NCH2CHN), 3.04 (m, 1H, NCH2CHN), 2.29 (dd, 1H, CH2CH2), 2.16 (m, 1H, CH,CH2), 1.93 (m, 1H, CH2CH2), 1.79 (m, 1H, CH2CH2).

Exemple 2 trans-(1R,2S,5R)-6-(l-fluoro-2-hydroxy-2-oxoéthoxy)-7-oxo-1,6-diazabicyclo [3.2.1] octane-2-carboxamide Stade A trans-(1R,2S,5R)-6-(2-éthoxy-l-fluoro-2-oxoéthoxy)-7-oxo-1,6-diazabicyclo [3.2.1] octane-2-carboxamide

La substitution est réalisée dans les mêmes conditions que celles décrites à l'exemple 1 de référence en utilisant au départ le bromofluoroacétate d'éthyle (730 pL, 5.94 mmol), K2CO3 (896 mg, 6.48 mmol) et l'isomère (1R,2S,5R)du composé du stade B de l'exemple 33a du WO 03/063864 (1 g, 5.40 mmol) dans 2 mL de diméthylformamide. Après traitement, l'huile obtenue est chromatographiée sur silice avec un éluant dichlorométhane / méthanol de 98/2 à 95/5 pour donner 1.18 g de produit avec une pureté HPLC estimée à 71 Le produit est un mélange de 2 diastéréoisomères dans un rapport 1:1. Le produit est chromatographié une seconde fois pour donner une huile incolore (975 mg, 62 %).

1H NMR (400 MHz, MeOH-d4 ) : ii (ppm) = 6.02/6.09 (d, 1H, OCHFCO2CH2CH3), 4.29 à 4.37 (m, 2H, OCHFCO2CH2CH3), 3.98 à 4.03(m, 2H, CHCONH2 et NCH2CHN), 3.10 à 3.21 (m, 2H, NCH2CHN), 2.28 (m, 1H, CH2CH2), 2.10 (m, 1H, CH2CH2), 1.89 à 1.96 (m, 2H, CH2CH2), 1.32 à 1.39 (m, 3H, OCHFCO2CH2CH3). 12 Stade B trans-(1R,2S,5R)-6-(1-fluoro-2-hydroxy-2-oxoéthoxy)-7-oxo-1,6-diazabicyclo [3.2.1] octane-2-carboxamide 5 La saponification est réalisée dans les mêmes conditions que celles décrites à l'exemple 1 stade B en utilisant au départ l'ester obtenu précédemment (298 mg, 1.03 mmol), du tétrahydrofurane (12 mL), de l'eau (4 mL) et LiOH,H20 10 (45 mg, 1.08 mmol) L'agitation est poursuivie pendant 1 h à 0°C. Le traitement de la réaction conduit à un produit amorphe jaune (231 mg, 84 M.

MS (ES(-)) : m/z [M-H] = 260 ; [M+HCOOH-H] = 306 ; [2M-15 H]- = 521. 1H NMR (400 MHz, MeOH-d4 ) : S (ppm) = 5.96/6.03 (d, 1H, OCHFCO2H) , 3.99 à 4.05(m, 2H, CHCONH2 et NCH2CHN), 3.10 à 3.20 (m, 2H, NCH2CHN), 2.28 (rn, 1H, CH2CH2), 2.13 (m, 1H, CH2CH2), 1.84 à 2.01 (m, 2H, CH2CH2).

Exemple 3 : Sel de sodium du trans-(1.R,2S,5R)-6-(1,1-difluoro-2- hydroxy-2-oxoéthoxy)-7-oxo-1,6-diazabicyclo [3.2.1] octane-2-carboxamide

Stade A trans-(1R,2S,5R)-6-(1,1-difluoro-2-éthoxy-2-oxoéthoxy)-7-oxo-1, 6-diazabicyclo [3.2.1] cctane-2-carboxamide

30 La substitution est réalisée dans les mêmes conditions que celles décrites à l'exemple 1 stade A en utilisant au départ du bromodifluoroacétate d'éthyle (1.4 mL, 10.9 mmol), du K2CO3 (1.21 g, 8.8 mmol) et l'isomère (1R,2S,5R)du composé du stade B de l'exemple 33a du WO 35 03/063864 (690 mg, 3.73 mmol) dans du diméthylformamide (4 mL). L'huile, obtenue apres traitement, est chromatographiée sur silice avec un éluant dichlorométhane / méthanol de 99/1 à 95/5 pour donner une 20 25

13 huile incolore qui tend à cristalliser (505 mg, 44 %). Le solide résiduel est trituré dans l'éther isopropylique pour donner un solide blanc (361 mg).

MS (ES(+)) : m/z [M+H]+ = 308.1 ; [M+CH3CN+H]+ = 349 ; [2M+H]+ = 615. 1H NMR (400 MHz, MeOH-d9 ) S (ppm) = 4.44 (q, 2H, OCF2CO2CH2CH) , 3.99 à 4.06 (m, 2H, CHCONH2 et NCH2CHN) , 3.28 (m, 1H, NCH2CHN), 3.18 (d système AB, 1H, NCH2CHN), 2.29 (m, 1H, CH2CH2), 2.10 (m, 1H, CH2CH2), 1.89 à 2.00 (m, 2H, CH2CH2), 1.40 (t, 3H, OCF2CO2CH2CH3) .

Stade B trans-(1R,2S,5R)-6-(1,1-difluoro-2-hydroxy-2-oxoéthoxy)-15 7-oxo-1,6-diazabicyclo [3.2.1=1 octane-2-carboxamide

La saponification est réalisée dans les mêmes conditions que celles décrites à l'exemple 1 stade B en utilisant au départ l'ester obtenu précédemment (110 mg, 0.36 mmol), 20 du tétrahydrofurane, de l'eau (2 mL) et LiOH,H20 (16 mg, 0.38 mmol). L'agitation est poursuivie pendant 1 h à 0°C. Le traitement de la réaction conduit à un solide blanc (73 mg, 73 %).

25 MS (ES(-)) : m/z [M-H] = 278 ; [M+HCOOH-H] = 324 ; [2M-H]- = 557. 1H NMR (400 MHz, MeOH-d4 ) : $ (ppm) = 3.99 à 4.05 (m, 2H, CHCONH2 et NCH2CHN), 3.29 (m, 1H, NCH7CHN), 3.17 (m, 1H, NCH2CHN), 2.29 (m, 1H, CH2CH2) , 2.12 (m, 1H, CH2CH2), 30 1.95 à 2.04 (m, 2H, CH2CH2).

Stade C Sel de triéthylamine du trans-(1R,2S,5R)-6-(1,l-difluoro-2-hydroxy-2-oxoéthoxy)-7-oxo-1, 6-diazabicyclo [3.2.1] 35 octane-2-carboxamide

Le composé obtenu au stade B est repris dans 3 mL de tétrahydrofurane. De la triéthylamine (70 pL, 0.5 mmol)

14 est ajoutée goutte à goutte à la solution refroidie par un bain de glace. Un précipité se forme. L'agitation est poursuivie pendant 1 h. La suspension est diluée avec le THF et filtrée pour donner un solide blanc (100 mg, 55 %) 1H NMR (400 MHz, MeOH-d4 ) : (ppm) = 4.01 à 4.04 (m, 2H, CHCONH2 et NCH2CHN), 3.24 à 3.30 (m, 7H, 1 H de NCH2CHN et 6 H de (CH3CH2) 3N) , 3.14 (d, 1H, NCH2CHN), 2.30 (m, 1H, CH2CH2), 2.22 (m, 1H, CH2CH2), 2.03 (m, 1H, 10 CH2CH2), 1.86 (m, 1H, CH2CH2), 1.37 (t, 9H, (CH3CH2) 3N) .

Stade D Sel de sodium du trans-(1R,2S,5R)-6-(1,1-difluoro-2-hydroxy-2-oxoéthoxy)-7-oxo-1, 6-diazabicyclo [3.2.1] 15 octane-2-carboxamide

Une suspension de 10g de résine DOWEX 50WX8 dans une solution d'hydroxyde de sodium 2N (50mL) est agitée pendant 1h, puis versée sur une colonne à 20 chromatographie. La colonne est conditionnée à l'eau déminéralisée jusqu'à pH neutre, puis avec un mélange eau/THF 90/10. Le sel obtenu au stade C de l'exemple 3 (50 mg, 0.13 mmol) est dissout dans un minimum de solution eau/THF, déposé sur la colonne, puis élué avec 25 un mélange eau/THF 90/10. Les fractions contenant le substrat sont réunies et congelées. La solution congelée est lyophilisée pour conduire au sel de sodium attendu (39 mg, 97%) sous forme d'un solide blanc.

30 MS (ES(-)) : m/z [M-H] = 278 ; [M+HCOOH-H] = 324 ; [2M- H]- = 557. 1H NMR (400 MHz, MeOH-d4 ) S (ppm) = 4.01 (m, 2H, CHCONH2 et NCH2CHN), 3.29 (m, 1H, NCH2CHN), 3.11 (d, 1H, NCH2CHN), 2.27 (m, 1H, CH2CH2), 2.17 (m, 1H, CH2CH2), 2.00 35 (m, 1H, CH2CH2), 1.84 (m, 1H, (7H2CH2) .5

15 Etude de l'activité inhibitrice des f3-lactamases des composés de l'invention I/ Les composés de formule (I) et leurs sels pharmaceutiquement acceptables présentent des activités inhibitrices marquées contre les P-lactamases de diverses souches bactériennes et ces propriétés thérapeutiquement intéressantes peuvent être déterminées in vitro sur des (3-lactamases isolées :

A. Préparation des (3-lactamases Tem-1 et P99 Les (3-lactamases sont isolées à partir de souches bactériennes résistantes aux pénicillines et aux céphalosporines (Tend_ et P99 sont respectivement produites par E.coli 250HT21 et E.Cloacae 293HT6). Les bactéries sont cultivées dans du bouillon cœur-cervelle à 37g/1(DIFCO), à 37°C. Elles sont récoltées en fin de phase exponentielle, refroidies et centrifugées. 20 Les culots bactériens sont. repris dans du tampon Phosphate de sodium 50mM, pH 7.0 et à nouveau centrifugés. Les bactéries sont reprises dans deux volumes de ce même tampon et lysées au moyen d'une French-Press maintenue à 4°C. Après une centrifugation 1h 25 à 100 000g, à 4°C, les surnageants contenant la fraction soluble des extraits bactériens sont récupérés et congelés à -80°C. B. Détermination de l'activité (3-lactamases La méthode utilise comme substrat la Nitrocéfine (OXOID), 30 céphalosporine chromogène, dont le produit d'hydrolyse par les B-lactamases est rouge et absorbe à 485nm.

L'activité (3-lactamases est déterminée en cinétique par la mesure de la variation d'absorbance à 485nm résultant 35 de l'hydrolyse du substrat sur un spectrophotomètre de

16 plaques (Spectra Max Plus de Molecular Devices). Les expériences se font à 37°C. La quantité d'enzyme a été normalisée et les mesures se font en vitesse initiale.

C. Détermination de l'activité inhibitrice des (3-lactamases Les mesures sont effectuées avec préincubation de l'enzyme et de l'inhibiteur (5 min). Les produits sont testés à 11 concentrations. Le mélange réactionnel contient 100 pM de nitrocéfine et du tampon phosphate de sodium 50 mM pH 7.0 et 0.1 mg/mL de sérum albumine bovine. D. Calculs des IC50 Les Vitesses d'hydrolyse scnt mesurées avec et sans inhibiteur. On détermine la concentration d'inhibiteur qui inhibe de 50ô la réaction d'hydrolyse de la Nitrocéfine par l'enzyme (C150). Le traitement des données est réalisé à l'aide du logiciel GraFit (Erithacus Software). Les valeurs d'IC50 sont la moyenne des IC50 obtenues au minimum dans 2 expériences différentes. IC50 (pM) inhibition enzymatique 13-Iactamase Exemple 1 Exemple 2 Exemple 3 E. coli TEM1 0.72 0.002 0.0008 E. cloacae P99 54 4.6 2.2 II/ L'activité inhibitrice de (3-lactamases démontrée potentialise l'activité antibactérienne des antibiotiques de type (3-lactamises, donc entraîne un effet synergique,25 ainsi que le démontrent les résultats ci-après, qui expriment la concentration minimale inhibitrice in vitro (CMI en tg/ml), contre un certain nombre de microorganismes pathogènes, d'associations de ceftazidime ( CAZ ) avec les composés de formule (I) à la concentration de 4 mg/1. On opère comme suit, par la méthode dite micro dilution en milieu liquide. On prépare une série de concentrations de la (3-lactamine en présence d'une concentration constante (4 mg/1) du produit à étudier, chacune est ensemencée ensuite avec diverses souches bactériennes. Après incubation de 24 heures en étuve à 37°C, l'inhibition de la croissance est appréciée par l'absence de tout développement bactérien ce qui permet de déterminer les concentrations minimales inhibitrices (CMI)pour chaque souche, exprimées en milligrammes/l.

On a obtenu les résultats figurant dans le tableau suivant . Restauration des CMI en combinaison avec CAZ (pg/mL) 24 h (concentration inhibiteur 4 pg/mL) CAZ-Inhibiteur Essai Souche Phénotype CAZ seul Exemple 1 Exemple 2 Exemple 3 1 250BE6 E. coli TEM3 >32 2 0,25 0,25 2 293HT6 E. cloacae P99 AmpC >32 >32 8 1 3 293HT4 E. cloacae AmpC >32 >32 8 0,5 4 261GR6 C. freundii AmpC >32 >32 4 120

1 8 Exemples de compositions pharmaceutiques :

1) On a préparé une composition pharmaceutique pour injection dont les ingrédients sont les suivants : composé de l'exemple 2 500 mg excipient aqueux stérile q.s.p. 10 ml

2) On a préparé une composition pharmaceutique 10 (lyophilisat) pour injection renfermant : - d'une part : composé de l'exemple 3 500 mg - d'autre part : Ceftazidime 1 g - excipient aqueux stérile q.s.p 5 ml Les deux principes actifs peuvent, si désiré, être 15 introduits séparément dans deux ampoules ou flacons distincts. 20

Claims (10)

1. REVENDICATIONS1) Les composés répondant à la formule (I) H2N O) OH dans laquelle R1 et R2 représentent l'un un hydrogène et l'autre un fluor ou tous les deux un fluor, sous forme libre, de zwitterions et sous forme de sels avec les bases minérales ou organiques, pharmaceutiquement acceptables.
2. 2) Les composés selon la revendication 1) dont les noms suivent . le trans-(lR,2S,5R)-6-(1-fluoro-2-hydroxy-2- oxoéthoxy)-7-oxo-1, 6-diazabicyclo [3.2.1] octane-2- carboxamide, - le trans-(lR,2S,5R)-E-(1,1-difluoro-2-hydroxy-2-oxoéthoxy)-7-oxo-1, 6-diazabicyclo [3.2.1] octane-2-carboxamide, sous forme libre, de zwitterions, et de sels avec les bases minérales ou organiques pharmaceutiquement acceptables, en particulier leurs sels de sodium.
3. 3) Procédé de préparation des composés de formule (I) caractérisé en ce que l'on traite un composé de formule (II) par un réactif de formule III Hal A -COZaIc (III) R1 R2 10 dans laquelle R1 et R2 sont définis comme à la revendication 1, Hal représente un atome d'halogène différent du fluor et alc représente un radical alcoyle renfermant de 1 à 6 atomes de carbone, en présence d'une 15 base, pour obtenir le composé de formule (IV) O HZ N ~\ ùN O R1 Oalc R2~ O dont on hydrolyse la fonction ester pour obtenir l'acide 20 correspondant de formule (1) que, si désiré, l'on salifie. 'OH , O
4. 4) A titre de médicaments, les composés de formule (I) telle que définie à la revendication 1.
5. 5) A titre de médicaments, les composés de la 5 revendication 2.
6. 6) Compositions pharmaceutiques, caractérisées en ce qu'elles renferment à titre de principe actif, au moins un médicament selon l'une des revendications 4 ou 5. 10
7. 7) Compositions pharmaceutiques, caractérisées en ce qu'elles renferment à titre de principes actifs, au moins un médicament inhibiteur de 0-lactamases selon l'une des revendications 4 ou 5 et au moins un médicament de type 15 (3-lactamine.
8. 8) Associations d'un médicament inhibiteur de (3-lactamases selon l'une des revendications 4 ou 5 avec un médicament de type (3-lactamine.
9. 9) Associations d'un médicament inhibiteur de P-lactamases selon l'une des revendications 4 ou 5 avec une céphalosporine ou un carbapénème. 25
10. 10) Associations d'un médicament inhibiteur de (3-lactamases selon l'une des revendications 4 ou 5 avec le ceftazidime. 20 30