FR2890446A1 - Methode de detection d'interaction intracellulaire entre bio-molecules - Google Patents

Abstract

La présente invention concerne une méthode non microscopique, quantitative, de détection d'interactions intracellulaires entre bio-molécules, sur cellules vivantes, en réponse à une stimulation biologique ou pharmacologique, par effet de transfert d'énergie de proximité en temps résolu entre deux membres d'un couple donneur/accepteur de fluorescence.Applications : criblage à haut débit de molécules et détection des voies de signalisation intracellulaire

Description

Méthode de détection d'interaction intracellulaire entre bio-molécules

La présente invention décrit une méthode non microscopique, quantitative, de détection d'interactions intracellulaires entre bio-molécules, sur cellules vivantes, en réponse à une stimulation biologique ou pharmacologique, par effet de transfert d'énergie de proximité en temps résolu entre deux membres d'un couple donneur/accepteur de fluorescence et ses applications telles que notamment le criblage à haut débit de molécules et la détection des voies de signalisation intracellulaire.

Domaine technique et art antérieur Les molécules à activité pharmacologique (médicaments par exemple) agissent sur des cibles moléculaires localisées soit à la membrane plasmique soit à l'intérieur même des cellules vivantes. La sélection et l'optimisation de molécules candidates dans les processus de recherche au sein des industries pharmaceutiques nécessite de déterminer leurs actions moléculaires et, dans la mesure du possible, dans un environnement natif afin d'intégrer les modulations éventuellement apportées par des interactions entre différents partenaires. D'un point de vue plus fondamental, dans les conditions physiologiques ou pathologiques, il est important de disposer de modèles cellulaires où les interactions directes entre bio-molécules impliquées dans des voies de signalisation intracellulaire, peuvent être facilement étudiées, caractérisées et quantifiées [voir par exemple Takesono et al. Journal of Cell Sciences, 115, 3039-3048, (2002)]. Cette volonté de compréhension de mécanismes d'action en condition native explique pourquoi de plus en plus d'essais sur cellules sont utilisés dans les criblages primaires de molécules. Mais à l'heure actuelle, les techniques de criblage à haut débit permettent de détecter principalement les produits finaux des évènements biologiques, tels que la production de seconds messagers. Dans ce cas, les cellules doivent être Iysées pour permettre l'accès à la molécule cible intracellulaire qu'il faut doser. Très peu d'observations cinétiques sont actuellement possibles et les évènements rares sont facilement non détectés. De nouvelles approches utilisant les techniques de microscopie ou d'imagerie sur cellules vivantes permettent d'avoir accès aux paramètres dynamiques et cinétiques d'une ou plusieurs bio-molécules d'intérêt dans leur environnement natif, en réponse à une stimulation. Ces techniques sont basées sur les études de mouvements de ces bio-molécules en réponse à un stimulus. L'analyse de ces déplacements fait appel à un traitement des images qui donnent accès, a posteriori et par des méthodes indirectes, à des valeurs arbitraires qui permettent de quantifier les évènements biologiques considérés.

Ces techniques de microscopie consistent à déterminer la localisation d'une cible moléculaire et le suivi d'éventuels changements de localisation. Pour ces approches la cible moléculaire est généralement fusionnée à une protéine fluorescente pouvant être de la famille des GFP. De telles techniques de visualisation directe à l'intérieur d'une cellule sont réalisées à l'aide d'un microscope à fluorescence classique, de microscopes cofocaux ou de nouvelles plates-formes intégrant la microscopie et l'acquisition d'image. De telles plates-formes sont, par exemple, utilisées dans la technologie lo TRANSFLUOR (Molecular Devices) ou sur des instruments tels que OPERA (Evotech Technologies) ou In Cell analyser (GE Healthcare) (voir revue de John Comley, DDW, summer 2005, pp 31-53).

De nombreux désavantages limitent toutefois l'utilisation de telles technologies: - Les études microscopiques sont délicates, difficilement automatisables et elles nécessitent des outils complexes d'analyse d'image, des logiciels spécifiques et des utilisateurs très expérimentés et elles nécessitent beaucoup de temps.

- L'analyse des images est compliquée, souvent source d'erreur et ces technologies sont difficilement reproductibles et peu fiables (faible valeur de paramètre Z').

- Elles permettent le suivi d'événements biologiques dans des cellules vivantes avec un débit moyen de criblage de molécules limitant leur utilisation dans les étapes de criblage primaire.

- Les effets visualisés sont généralement en aval de la cascade de signalisation. C'est pour ces principales raisons que ces techniques ne sont pas compatibles avec un criblage de molécules à haut débit.

Outre ces aspects, ces technologies servent à qualifier un ou plusieurs évènements cellulaires, qui découlent le plus souvent d'une cascade d'évènements antérieurs, ce qui donne un accès indirect à l'évènement que l'on souhaite mesurer. De plus, ces techniques ne permettent pas de donner directement des informations sur les interactions entre bio- molécules ou sur les changements de conformation au sein d'une même molécule qui sont tous deux des indicateurs directs de l'événement biologique que l'on souhaite détecter et quantifier.

Actuellement les technologies intracellulaires permettant de caractériser les interactions entre bio-molécules ou les changements de conformation au sein d'une même bio-molécule, tous deux témoins d'événements biologiques, sont basées sur la technologie de transfert d'énergie (FRET) entre différentes protéines fluorescentes telles que la protéine fluorescente verte (GFP) et ses différents mutants. A titre d'exemple, deux variants protéiques de la GFP (CFP et YFP) forment une paire compatible pour établir un FRET. Elles peuvent être fusionnées avec les protéines cibles d'intérêt et être exprimées dans les cellules vivantes. De nombreux évènements d'interaction ou de changements de conformation entre protéines ainsi marquées ont été détectés en utilisant un procédé de FRET (voir Janetopoulos et al. SCIENCE (2001) 291: 2408-2411, Vilardaga et al. NATURE BIOTECH. (2003) 21: 807-812 et WO 2004 057333 Al).

Les deux variants de la GFP (CFP et YFP) peuvent être également exprimés dans les cellules vivantes en fusion avec une seule et même protéine cible. Cette bio- molécule, doublement fusionnée avec les deux variants de la GFP, est définie comme bio-senseur. Un bio-senseur est capable d'adopter différentes conformations en fonction des changements d'environnement biologique, ces changements de conformation pouvant être suivi par un procédé de FRET. De telles bio-molécules peuvent être utilisées dans le suivi de nombreux évènements cellulaires comme la production de CAMP, d'IP3 ou cGMP (voir pour revue Nikolaev et al., JBC, vol. 279, N 36, pp. 37215-37218, 2004, Tanimura et al. JBC, vol. 279, N 37, pp. 38095-38098, 2004 et le brevet US 6.924.119 B2).

Toutefois, l'utilisation de ces protéines fluorescentes présente certains désavantages majeurs: - Les spectres de recouvrement des deux molécules fluorescentes (CFP et YFP) sont larges et ils entraînent une forte excitation parasite de l'accepteur (YFP) dans les longueurs d'ondes utilisées pour exciter le donneur (CFP). Cette contamination parasite induit un fort bruit de fond qui réduit le rapport signal sur bruit à une valeur inférieure à 1.5. De si faibles différences de modulation empêchent une utilisation confortable de ces techniques en criblage de molécule à haut débit.

- Aux longueurs d'ondes utilisées pour la détection du FRET avec ces protéines fluorescentes, une auto-fluorescence intrinsèque aux cellules perturbe la lecture de FRET.

- Des analyses microscopiques peuvent être nécessaire pour révéler des changements subtils en signaux de FRET. De telles analyses présentent alors les mêmes inconvénients que ceux décrits ci-dessus pour la première approche de détection.

- La limitation du nombre de variants de la GFP restreint l'utilisation de telles protéines à des applications où les changements de proximité sont en accord avec le rayon de Fdrster (Ro) de la paire CFP/YFP.

- Ces protéines sont fusionnées avec les protéines cibles. La fluorescence de ces protéines est détectée dès que la cellule l'exprime et ne peux être déclenchée ou contrôlée par l'expérimentateur sans mettre en place des systèmes d'expression beaucoup plus complexes.

Une alternative au FRET utilisant la GFP ou ses variants, qui peut être contrôlée par l'expérimentateur, est l'utilisation d'une molécule qui génère de la bioluminescence, on parle alors de BRET. Un processus de BRET peut avoir lieu, dans des cellules vivantes, entre des protéines marquées respectivement à la Iuciférase et à la GFP. Plusieurs interactions protéiques intracellulaires ont pu être mesurées en fusionnant la Iuciférase à l'un des partenaires et la GFP à l'autre (voir Milligan G Eur J Pharm Sci. 2004 Mar;21(4):397-405, Boute N et al. Trends Pharmacol Sci. 2002 Aug; 23(8):351-4 et Trugnan G. et al. Med Sci (Paris). 2004 Nov;20(11):1027-34.). Le processus de transfert d'énergie est initié lorsque le substrat de l'enzyme Iuciférase est apportée dans la préparation cellulaire à tester. La Iuciférase produit une lumière qui, dans le cas d'une interaction protéique permettant une proche proximité entre les deux partenaires, excite la GFP. Le signal de fluorescence émis par la GFP est alors mesuré.

Tout comme pour le couple CFP-YFP, de nombreux désavantages limitent l'utilisation du couple Luciférase-GFP en HTS: - Le rapport signal/bruit des essais BRET est assez faible.

- Le signal de fluorescence peut être facilement masqué par une autofluorescence des produits testés. La technologie BRET n'est pas assez robuste pour un criblage de molécules du fait de la faible stabilité du signal dans le temps qui laisse une fenêtre de lecture très courte, peu compatible avec le criblage à haut débit de molécules.

Une autre série de technologies permettant d'étudier les interactions entre biomolécules consiste à utiliser un processus de complémentation fonctionnelle. Les bio- molécules d'intérêt sont fusionnées avec 2 fragments inactifs d'une 3ème protéine. Lorsque l'interaction directe entre les bio-molécules d'intérêt intervient, les 2 fragments inactifs de la 3eme protéine reconstituent alors, par interaction directe ou par un processus plus complexe d'épissage protéique, une 3ème protéine fonctionnelle dont l'activité peut être mesurée. Cette protéine, dont l'activité a été restaurée par l'interaction entre les bio-molécules d'intérêt, peut être une Iuciférase; on mesure dans ce cas un signal de luminescence, une protéine fluorescente telle que la GFP (voir Ozawa T, Current Opinion in Chemical Biology, 2001, N 5, pp578-583 pour revue) ou une enzyme telle que la 33-galactosidase dont on mesure l'activité enzymatique par méthode colorimétrique (voir Eglen R, ASSAY and Drug Develop. Technologies, 2002, vol. 1, pp 97-104) et la méthode Path Hunter de DISCOVER.

L'inconvénient principal de ces approches utilisant la complémentation fonctionnelle réside dans le fait que la mesure d'interaction entre biomolécules est dépendante d'une parfaite reconstitution de la 3ème protéine sous sa forme active, telle que la 0-galactosidase et nécessite parfois un déplacement du complexe d'interaction dans un compartiment cellulaire autre que celui où interagissent normalement les biomolécules. Enfin, il s'agit d'une méthode indirecte de caractérisation d'une interaction entre bio-molécules d'intérêt où la mesure d'une activité enzymatique rend compte de l'interaction. L'utilisation de la complémentation fonctionnelle est plus complexe à mettre en oeuvre dans le cas d'une bio-molécule unique du type bio-senseur.

En fonction des propriétés intrinsèques des protéines mises oeuvre dans ces processus de transfert d'énergie, les technologies utilisant des protéines fluorescentes telles que la GFP (ou ses autres variants) ou des protéines bio-luminescentes telle que la luciférase, ne permettent pas d'avoir une grande flexibilité dans le choix du couple donneur/accepteur impliqué dans le processus de transfert d'énergie.

L'utilisation de molécules fluorescentes particulières, appelées "QuantumDots", offre un nombre de couples donneur/accepteur possible beaucoup plus large, permet de travailler sur une gamme de longueur d'ondes d'excitation plus important et permet, en combinant différents couples, de mesurer de façon concomitante différentes interactions entre bio-molécules (approche multiplex). Cependant, il est difficile de marquer spécifiquement les bio-molécules par ces composés dans la cellule.

L'utilisation de molécules organiques fluorescentes pour des applications en FRET intracellulaire a par exemple été décrite pour visualiser des ARN messagers dans les cellules vivantes. L'interaction mise en oeuvre dans ce cas repose sur un appariement entre l'ARN messager cible et des séquences d'oligonucléotides anti-sens marqués avec des molécules organiques fluorescentes (voir Dirks et al. 2003, METHODS, Jan 29, N 1, pp 51-57 et Tsuji et al. Biophys J. 2001 Jul; 81(1):501-15). L'information obtenue dans ce cas n'est pas quantitative puisqu'elle fait appel à une détection en microscopie. Par ailleurs, elle ne qualifie en rien une interaction entre deux bio-molécules d'intérêt et sert uniquement à révéler la présence d'un ARN messager d'intérêt.

Il existe dans la communauté scientifique un réel besoin de nouveaux outils et procédés permettant d'étudier les phénomènes biologiques dans des cellules vivantes, to tout en s'affranchissant des inconvénients liés à l'utilisation des techniques connues.

DESCRIPTION DE L'INVENTION

La présente méthode d'analyse quantitative et directe d'interactions intracellulaires sur cellules vivantes sans l'aide de la microscopie, exploite les propriétés des composés fluorescents à durée de vie longue pour effectuer une détection par FRET en temps résolu (TR-FRET).

Cette technique met en oeuvre un premier composé fluorescent donneur à durée de vie longue et un ou plusieurs composés fluorescents accepteurs possédant des caractéristiques spectrales compatibles avec le premier composé fluorescent.

Cette mesure de FRET en temps résolu permet de s'affranchir des problèmes de bruit de fond, d'auto-fluorescence des cellules et éventuellement des molécules à tester par deux voies: - la longue durée de vie du composé fluorescent supérieure à 100 nanosecondes permet de définir une fenêtre de temps pour réaliser la mesure où les émissions des 25 composés fluorescents à durée de vie courte ne sont pas présentes; - la mesure de deux traceurs, dont un comme référence, permet de compenser les effets d'auto-fluorescence résiduelle en utilisant comme lecture le rapport d'émission de fluorescence entre les deux traceurs.

De part sa sensibilité, sa spécificité, sa robustesse et sa résolution moléculaire, le TR-FRET permet dans la méthode de l'invention d'éliminer tous les désavantages des applications FRET entre CFP/YFP ou BRET avec la luciférase et la GFP observés dans les cellules vivantes, notamment: - le large choix des composés fluorescents et la lecture en temps résolu permet d'éliminer la forte excitation parasite de l'accepteur dans les longueurs d'ondes utilisées pour exciter le donneur; - la lecture en temps résolu permet de supprimer les effets de l'auto- fluorescence des cellules et des produits à tester.

- l'amplitude des signaux en TR-FRET est plus élevée que celle mesurée avec des techniques de FRET utilisant des colorants/protéines fluorescentes.

La technique de TR-FRET n'a jusqu'à présent jamais été utilisée dans des cellules vivantes. Cela est dû à de nombreux obstacles techniques que la Demanderesse a pu surmonter.

Un des problèmes techniques majeur pour mettre en uvre cette technique dans une cellule vivante réside dans le fait que la plupart des composés fluorescents sont souvent très hydrophiles et ne traversent pas la membrane plasmique. Un autre problème est lié au fait que ces composés sont sensibles à leur environnement et en 1s particulier leur rendement de fluorescence peut être très affecté dans un milieu biologique. Enfin, la Demanderesse a dû surmonter un autre obstacle afin de marquer des biomolécules présentes dans la cellule par des composés fluorescents introduits à l'extérieur de la cellule, et ce sans affecter l'intégrité biologique des cellules.

Le procédé de l'invention permet de contourner ces obstacles et fournit donc des moyens efficaces pour étudier des phénomènes biologiques à l'intérieur de cellules vivantes.

Le procédé de l'invention permet la détection et la quantification d'interactions ou de modifications de conformation entre bio-molécules sur cellules vivantes en réponse à une stimulation spécifique.

L'invention concerne un procédé de détection d'interactions entre biomolecules, de translocation ou de changement de conformation de biomolécules dans des cellules vivantes, comprenant les étapes suivantes qui consistent à : 1) marquer une première bio-molécule, dans la cellule vivante, avec un premier composé fluorescent possédant une durée de vie de fluorescence longue; 2) marquer, dans la cellule vivante, au moins une deuxième biomolécule avec un deuxième composé fluorescent; 3) soumettre les cellules vivantes à une stimulation spécifique adaptée à la réponse biologique à étudier, en présence ou non d'une librairie de molécules à activité pharmacologique (candidats potentiels pour de futurs médicaments) à tester; 4) soumettre les cellules vivantes à une source lumineuse ayant une longueur d'onde permettant l'excitation dudit premier composé fluorescent à durée de vie longue; 5) mesurer l'intensité de la fluorescence émise par lesdits premier et second composés fluorescents, et calculer le rapport entre les intensités de fluorescence dudit premier composé fluorescent et dudit second composé fluorescent, ou mesurer la to durée de vie du premier ou du second composé fluorescent.

6) comparer les signaux mesurés à ceux obtenus avant stimulation des cellules.

L'excitation lumineuse des cellules vivantes peut être réalisée par des procédés bien connus de l'homme du métier, tels que par une source laser, des lampes flash ou au Xénon.

Les mesures d'émission, d'intensité et de durée de vie des différents composés fluorescents utilisés dans la méthode de l'invention sont réalisées aux moyens des signaux FRET par des méthodes conventionnelles bien connues de l'homme du métier. Les lecteurs appropriés pour détecter le signal de FRET en temps résolu selon la méthode de l'invention sont du type RUBYstar ou PHERAstar de chez BMG Labtech ou d'autres lecteurs compatibles avec le temps résolu tels que l'ULTRA, l'ULTRA Evolution ou le GENios Pro de chez TECAN ou l'Analyst de chez Molecular Devices. Le calcul du rapport entre la fluorescence du premier composé fluorescent et la fluorescence du second composé fluorescent ou des autres (dans le cadre d'une analyse en multiplexing) s'effectue par une méthode connue par l'homme du métier et décrite notamment dans EP 569 496 B1.

Les fluorophores utilisés pour marquer les bio-molécules sont des composés fluorescents partenaires de TR-FRET. Selon l'invention, on entend par composés fluorescents partenaires de TR-FRET , des paires de composés fluorescents dont les spectres de fluorescence se recouvrent partiellement, et dont le donneur est un composé fluorescent à durée de vie longue et l'accepteur est un composé fluorescent à durée de vie plus courte que le donneur. L'homme du métier est à même de sélectionner des couples de composés fluorescents partenaires de TR-FRET pour mettre en oeuvre le procédé selon l'invention.

Dans une mise en oeuvre alternative du procédé selon l'invention, et dans le cas où l'on souhaite étudier des changements de conformation d'une biomolécule dans la cellule, les deux composés fluorescents sont utilisés pour marquer une seule et même bio-molécule.

Selon une variante de mise en oeuvre, le procédé selon l'invention comporte des étapes additionnelles de marquage de biomolécules avec d'autres composés fluorescents, ce qui permet d'étudier des phénomènes biologiques plus complexes. Dans ce cas, le système comportera toujours un premier composé fluorescent donneur à durée de vie longue, ainsi que plusieurs autres composés fluorescents accepteurs lo partenaires de TRFRET, ce qui permettra de mesurer plusieurs interactions, translocations ou changement de conformation dans une même cellule.

Les biomolécules: Par biomolécule, on entend une molécule présente dans un organisme vivant, et en particulier les molécules constituant la structure d'un organisme, celles impliquées dans la production et la transformation d'énergie ou dans la transmission des signaux biologiques. Cette définition englobe les acides nucléiques, les protéines, les sucres, les lipides, les peptides, les oligonucléotides, les intermédiaires métaboliques, les enzymes, les hormones et les neurotransmetteurs.

Les bio-molécules qui peuvent être étudiées à l'aide du procédé selon l'invention sont tous les types de molécules exprimées artificiellement, grâce à des techniques d'expression hétérologues connues par l'homme du métier, dans des cellules vivantes en culture. Ces bio-molécules peuvent être par exemple, toutes protéines, lipides, sucres ou oligo-nucléotides artificiellement produits par les cellules vivantes, comme par exemple les récepteurs membranaires, tels que les récepteurs à tyrosine kinase, les récepteurs à 7 domaines transmembranaires couplés aux protéines G et sous-unités des protéines G hétéro-trimériques, les récepteurs nonmembranaires, tels que les récepteurs aux hormones, les canaux ioniques, les transporteurs présents à la membrane (les aquarines, les transporteurs sodium, les transporteurs bicarbonate (HCO3), les pompes ioniques (pompe sodium/potassium), les protéines de la transduction du signal, telles que les protéines G monomériques, les enzymes, telles que les kinases, les phosphatases, les transglutaminases, les hydrolases, les halogénases, les lipases, les transférases, les enzymes du métabolisme, les protéines d'échafaudage, telles que SOS, GRB, IRS, HSP, les protéines de liaison aux lipides, les protéines contenant des domaines PH, ou FYVE, s'associant à la membrane par ancrage lipidique du type N-myristoylation, S-palmitoylation, S-prénylation géranylgéranylation, les protéines associées aux récepteurs couplés aux protéines G (monomériques ou trimériques) telles les GEFs, GAPs et RGS, les sous-unités des protéines G hétéro-trimériques et les récepteurs à 7 domaines transmembranaires couplés aux protéines G, les protéines adaptatrices telles que les protéines contenant les domaines SH2, SH3, les facteurs de transcription tels c-fos, c-jun, CREB, les protéines mitochondriales (telles que les protéines de la chaîne respiratoire, les cytochromes C, les caspases, le PBR...), les phospholipides, les protéines nucléaires telles que les polymérases à DNA, les hélicases, les topoisomérases, les protéines de la famille des récepteurs dits "de mort", telles que FAS, les protéines de l'apoptose, telles que de la famille de bd-2, les protéines du cycle cellulaire, telles que les cdk et les cyclines.

Les cellules vivantes utilisées dans la présente invention sont tous les types de cellules vivantes mises en culture selon des techniques connues par l'homme du métier, comme par exemple, les cellules procaryotes (bactéries), les levures, les lignées de cellules eucaryotes immortalisées, les cellules d'insectes, les cultures primaires, telles que des cultures provenant du sang, de tissus ou d'organes de mammifères. Il est important de souligner que le procédé de l'invention permet de travailler sur des cellules vivantes et de conserver l'intégrité des mécanismes biochimiques intracellulaires: les membranes cellulaires ne sont pas perméabilisées comme c'est le cas dans d'autres procédés de l'état de la technique et les cellules n'ont pas besoin d'être fixées.

Les interactions entre molécules pouvant être mis en évidence par le procédé selon l'invention sont nombreuses et variées et elles sont dépendantes de la nature des bio-molécules utilisées dans ledit procédé. Ces interactions peuvent être, par exemple, les interactions entre le récepteur androgène et l'androgène qui induisent une translocation du récepteur du cytoplasme vers le noyau cellulaire, de la PKC-y qui subit une translocation après stimulation du cytoplasme vers les lipides composant la membrane plasmique cellulaire, du complexe calcineurine qui nécessite une liaison avec la calmoduline pour être active, de p65/p50, etc. Les changements de conformation de bio-molécules au sein même de la cellule vivante peuvent avoir lieu dans certaines circonstances de stimulation, ces modifications peuvent être, par exemple, la bétaarrestine, EPAC (protéines liant le cAMP), les facteurs d'échange des petites protéines G monomériques, (GEFs), les canaux ioniques, tels que les canaux K+ dépendants du potentiel à inactivation rapide, etc. Les composés fluorescents:, Plusieurs composés fluorescents sont utilisés dans le procédé de l'invention, le premier de ces composés possède une durée de vie de fluorescence longue et les autres des durées de vie de fluorescence généralement courtes. Dans tous les cas, les composés fluorescents sont des partenaires de TR-FRET.

Les composés fluorescents à durée de vie longue particulièrement appropriés aux fins de l'invention ont de préférence une durée de vie égale ou supérieure à 100 nanosecondes.

Plus précisément ces composés fluorescents appropriés sont des complexes de terre rare, tels que les cryptates et les chélates, en particulier les cryptates comportant un ou plusieurs motifs pyridine. De tels cryptates de terre rare sont décrits par exemple dans les brevets EP 180 492, EP 321 353, EP 601 113 et WO 01/96 877. Les cryptates de Terbium (Tb3+) et l'Europium (Eu3+) sont particulièrement appropriés aux fins de la présente invention. Les chélates de terres rares sont décrits notamment dans les brevets US 4 761 481, US 5 032 677, US 5 055 578, US 5 106 957, US 5 116 989, US 4 761 481, US 4 801 722, US 4 794 191, US 4 637 988, US 4 670 572, US 4 837 169, US 4 859 777. D'autres chélates sont composés d'un ligand nonadenté tel que la terpyridine (EP 403 593, US 5 324 825, US 5 202 423, US 5 316 909).

Les composés fluorescents ayant une durée de vie courte peuvent être sélectionnés parmi les protéines fluorescentes, telles que la protéine fluorescente verte (GFP) et ses dérivés (notamment CFP, YFP), ou des composés fluorescents ayant des durée de vie inférieure à 100 nanosecondes, telles que les cyanines, les rhodamines, les fluorescéines, les squarènes et les molécules fluorescentes connues sous le nom de BODIPY's (difluoroboradiazaindacenes), les composés connus sous la dénomination AlexaFluor, les protéines fluorescentes extraites de coraux, les phycobiliprotéines, telles que la B-phycoérythrine, la Rphycoérythrine, la C-phycocyanine, les allophycocyanines, en particulier celles connues sous la dénomination XL665, les "Quantum Dots". D'autres composés fluorescents appropriés sont décrits dans la demande de brevet FR 2 840 611 et comprennent un fluorophore couplé à un oligonucléotide.

Marquage des molécules biologiques par les composés fluorescents:, Les différentes méthodes de marquage des bio-molécules par des composés fluorescents sont détaillées ci-dessous: 1) Génération d'une protéine de fusion entre la / les bio-molécules d'intérêt et une protéine possédant des propriétés intrinsèques de fluorescence, telles que les protéines de la famille des GFP. L'expression de telles protéines de fusion fait appel à des techniques de biologie moléculaire bien connues de l'homme dumétier, et consistant par exemple à transfecter dans la cellule vivante, de manière stable ou transitoire, des vecteurs d'expression, tels que des plasmides, dont l'ADN code pour la protéine de fusion.

2) Génération d'une protéine de fusion entre la / les bio-molécules d'intérêt et une protéine possédant une activité enzymatique suicide, telles que par exemple les protéines SnapTag (Covalys) ou HaloTag (Promega) qui transfèrent de façon covalente et irréversible le composé fluorescent sur la / les bio-molécules d'intérêt. Le composé fluorescent est dans ce cas lié de manière covalente au substrat de l'enzyme suicide et est introduit dans le milieu extracellulaire. Les techniques décrites ci-après permettent de faire franchir la membrane cellulaire aux conjugués composé fluorescent substrat qui ne seraient pas naturellement lipophiles.

Les enzymes suicides sont des protéines qui ont une activité enzymatique modifiée par des mutations spécifiques qui leur confèrent la capacité de lier rapidement et de façon covalente un substrat. Ces enzymes sont dites suicides car chacune ne peut lier qu'une seule molécule fluorescente, l'activité de l'enzyme étant bloquée par la fixation du substrat. Actuellement deux familles d'enzymes suicides connues permettent ce type de marquage: - le mutant d'une alkylguanine-DNA alkyltransférase (ou SnapTag commercialisé par la société Covalys) (voir Klepper A. et al. (2003) in Nature Biotechnology, vol. 21, 30 p. 86 et WO 02/083937 A2).

- le mutant d'une déhalogénase (HaloTag commercialisé par Promega) qui génère également une réaction enzymatique du type suicide (voir WO 04/072232 A2).

Dans ces 2 cas, le substrat qui sera incorporé par ces enzymes suicides devra au préalable être marqué avec un composé organique fluorescent.

3) Génération d'une protéine de fusion entre la/les bio-molécules d'intérêt et une séquence retrouvant une activité d'épissage protéique après liaison avec une séquence complémentaire préalablement marquée avec le/les molécules fluorescentes d'intérêt transférant ainsi de façon covalente et irréversible par une liaison peptidique le composé fluorescent sur la/les bio-molécules cibles, telles que la séquence codant pour le domaine intéine de la Ssp DnaE.

Cette approche exploite un procédé biologique de maturation posttraductionnelle, appelé épissage protéique. Ce procédé catalyse une série de réactions chimiques qui a pour but final d'enlever un domaine nommé intéine présent dans une protéine précurseur et de lier par une liaison peptidique les deux domaines se trouvant de part et d'autre du domaine intéine. Le trans-épissage protéique nécessite deux moitiés de domaine intéine complémentaire. La première moitié est fusionnée à la protéine cible et la seconde moitié à la molécule fluorescente. Cette méthode est décrite par Muir T.W. et al. (2003) J. Am. Chem. Soc. 2003, 125, 71807181. Les techniques décrites ci-après permettent de faire franchir la membrane cellulaire aux conjugués "composé fluorescent intéine" qui ne seraient pas naturellement lipophiles.

4) Génération d'une protéine de fusion entre la/les bio-molécules à étudier et une séquence peptidique ou un membre d'un couple de partenaires de liaison possédant des caractéristiques de reconnaissance spécifique et de liaison à haute affinité avec un substrat préalablement marqué avec le /les molécules fluorescentes d'intérêt telles que par exemple: - Les séquences cystéine-cystéine-X-X-cystéine-cystéine (CCX(CC) qui ont la propriété de se lier à des composés bi-arsenic. Ces composés bi-arsenic peuvent être facilement marqués avec une molécule organique du type fluorescéine ou rhodamine (voir B.A.Griffin et al. (1998) Science. 1998, 281, 269-271 et S.A. Adams et al. (2002) J. Am. Chem. Soc. 2002, 124, 6063-6076 pour des détails sur la technologie).

- Les répétitions Poly histidine se lient à des ions métalliques qui peuvent être couplés à des molécules "quencheurs" de composés fluorescents (voir E.G. Guignet et al. (2004), Nature biotech., 2004, 22, 440-444).

- Le Tag BTX (bungarotoxine), composé d'un peptide de 13 acides aminés qui est reconnu par la bungarotoxine (BTX), peut être préalablement couplé à une molécule fluorescente. (voir C. M. McCann et al. (2005), Biotechnique (2005), 38, 945-952).

- La séquence de liaison de la Streptavidine (SBP-Tag) est une séquence formée par 38 acides aminés qui présente une haute affinité pour la biotine pouvant être préalablement marquée avec un fluorophore ( voir C. M. McCann et al. (2005), Biotechnique (2005), 38, 945-952).

5) Génération d'une protéine de fusion entre la / les bio-molécules à étudier et Io une séquence peptidique de reconnaissance de certaines enzymes comme, par exemple, les transglutaminases ou les ligases qui transfèrent sur un acide aminé spécifique de la séquence Tag le composé fluorescent préalablement fixé sur le substrat de l'enzyme.

La séquence peptidique PKPQQFM (Proline-Lysine-Proline-GlutamineGlutamine- Phenylalanine-Methionine) est par exemple reconnue par une enzyme nommée transglutaminase. La transglutaminase transfère le composé organique fluorescent couplé à son substrat, la cadaverine, directement sur le premier résidu glutamine de la séquence PKPQQFM (voir Taki et al (2004) Protein Engeneering, Design Selection, 2004,17, 119-12). Les techniques décrites ci-après permettent de faire franchir la membrane cellulaire aux conjugués composé fluorescent substrat qui ne seraient pas naturellement lipophiles.

6) Des séquences nucléiques peuvent être elles aussi spécifiquement reconnues par des enzymes ayant des activités transférases leurs permettant de lier de façon covalente une molécule organique fluorescente présente sur un cofacteur ou un substrat directement sur la séquence spécifique. Un tel procédé peut être illustré par la séquence nucléique spécifique 5'-TCGA-3' sur laquelle la méthyltranférase Taql transfère le composé fluorescent préalablement greffé sur le cofacteur aziridine (voir Pljevaljcic G. et al. (2004) ChemBioChem, 5; 265-269 pour plus de détail sur la technologie).

Dans le procédé selon l'invention, le marquage composé fluorescent / biomolécule est donc effectué en couplant le composé fluorescent et la biomolecule, respectivement avec les membres des couples choisis parmi: un substrat de SNAPTag/l'enzyme SNAP-Tag, un substrat d'HALO-Tag/l'enzyme HALO-Tag, une partie d'intéine telle que I'intéine de Ssp DnaE / la partie d'intéine complémentaire permettant de reconstituer une intéine fonctionnelle, un motif bi-arsenic / la séquence Cys-Cys-XX-Cys-Cys, X représentant un acide aminé quelconque, un ion métallique / une séquence poly-histidine, la biotine / la streptavidine, la streptavidine / la biotine, la bungarotoxine / le tag BTX, la cadaverine / la séquence protéique PKPQQFM, l'aziridine / la séquence nucléique TCGA.

Les techniques de marquage citées ci-dessus impliquent parfois de faire franchir la membrane cellulaire à des composés qui ne sont pas naturellement lipophiles et qui ne rentrent pas naturellement dans la cellule. Ces composés ou leurs conjugués avec to des substrats, des étiquettes ("tags"), ou des membres d'un couple de partenaires de liaison tels que décrits plus haut, peuvent être introduits dans la cellule en utilisant par exemple l'une des techniques suivantes: 1). Utilisation d'esters qui masquent les groupes chargés pendant le passage de la bicouche lipidique; ces esters rentrent dans la catégorie des composés nommés pro-drogues et font référence à des composés qui sont rapidement transformés in vivo pour donner le composé parent suite à une hydrolyse dans des conditions physiologiques. [T. Higuchi et V. Stella in "Pro-drugs as Novel Delivery Systems", Vol. 14 of the A.C.S. Symposium Series, American Chemical Society (1975)]. Des exemples incluent principalement les groupes pivaloyl-oxyméthyle, acétoxyméthyle ainsi que esters glycoliques [Nielsen et Bundgaard, Int. J. of Pharmacy. 39(1984) 75-85]. Lorsque cette technique est utilisée, un de ces groupements est greffé de manière covalente sur le fluorophore.

2). Utilisation de peptides viraux greffés de manière covalente au fluorophore: certains de ces peptides permettent en effet de véhiculer le fluorophore à travers la membrane cellulaire. A titre d'exemple de tels peptides viraux, on peut citer les analogues de penetratine et transportan [Langel et al. Bioconj. Chem. (2000), 11, 619-626], les poly-Arginines [Wender et al. Arginine-based molecular transporters. Org. Lett. (2003), 5(19), 3459-3462], ou encore les pepto des, analogues de peptides portant des groupes guanidines [The design, synthesis, and evaluation of molecules that enable or enhance cellular uptake: peptoid molecular transporters. Wender et al. Proc Nati Acad Sci U S A. (2000), 13003-8].

3). Modification de la lipophilie et de la polarité des composés fluorescents par l'addition de chaînes latérales contenant des molécules de cholesterol de vitamin E ou des chaînes aliphatiques qui interagissent avec les membranes cellulaires en utilisant l'approche exemplifiée sur les oligonucléotides utilisant des chaînes undecyl- ou 1,2-di-0-hexadecylglycerol. [3'-end conjugates of minimally phosphorothioate-protected oligonucleotides with 1-0-hexadecylglycerol: synthesis and anti-ras activity in radiation-resistant cells. Rait et al. Bioconj. Chem. (2000), 11, 153-160].

Ces modifications sont plus efficaces que les surfactants cationiques (cationic "lipids") qui forment des complexes supramoleculaires avec les acides nucléiques et augmentent l'endocytose mais qui sont toxiques et endommagent les membranes cellulaires.

Par conséquent, dans le procédé selon l'invention, au moins un composé fluorescent comporte un motif lui permettant de franchir la membrane plasmique, ce motif étant selectionné parmi les groupes suivants: ester tels que les pivaloyl- oxyméthyle ester acétoxyméthyle ester, ou les esters glycoliques; des peptides viraux pris en charge par des transporteurs membranaires tels que la penetratine et ses analogues, le transportan et ses analogues, les groupes polyarginines, les peptdides portant des groupes guanidines; des groupes cholesterol, vitamines E ou des chaînes aliphatiques, telles que les chaînes undécyle ou 1,2-di-Ohexadécyl-glycérol.

Dans une mise en oeuvre alternative, au moins deux composés fluorescents partenaires de TR-FRET comporte de tels motifs leur permettant de franchir la membrane plasmique.

L'invention fournit également un nécessaire de composants (communément appelé "kit of parts" en langue anglaise) comprenant les réactifs permettant la mise en oeuvre du procédé de détection d'interactions entre biomolécules, de translocation ou de changement de conformation de biomolécules dans des cellules vivantes selon l'invention.

Ce nécessaire (ou kit) comprend: - un premier composé fluorescent et au moins un second composé fluorescent, 30 ces composés étant partenaires de TR-FRET et l'un au moins de ces composés comportant un motif lui permettant de franchir la membrane plasmique; - des cellules vivantes comprenant lesdites biomolécules; - des moyens de marquage des biomolécules par les composés fluorescents; - des instructions permettant d'étudier des phénomènes d'interactions entre biomolécules, de translocation ou de changement de conformation de biomolécules dans des cellules vivantes.

Les réactifs présents dans ce nécessaire permettent le marquage des biomolécules à étudier présentes dans la cellule par les composés fluorescents partenaires de TR-FRET: en pratique, cela signifie que le composé fluorescent et la biomolecule sont couplés, respectivement avec les membres des couples choisis parmi: un substrat de SNAP-Tag / l'enzyme SNAP-Tag, un substrat d'HALO-Tag / l'enzyme HALO-Tag, une partie d'intéine telle que l'intéine de Ssp DnaE / la partie d'intéine complémentaire permettant de reconstituer une intéine fonctionnelle, un motif bi-arsenic / la séquence Cys-Cys-X-X-Cys-Cys, X représentant un acide aminé quelconque, un ion métallique / une séquence poly-histidine, la biotine / la streptavidine, la streptavidine / la biotine, la bungarotoxine / le tag BTX, la cadaverine / la séquence protéique PKPQQFM, l'aziridine / la séquence nucléique TCGA.

Au moins un des composés fluorescents comporte par ailleurs un motif lui permettant de franchir la membrane plasmique, et ce motif est choisi parmi les composés suivants: les esters tels que les pivaloyl-oxyméthyle ester, acétoxyméthyle ester, ou les esters glycoliques; des peptides viraux pris en charge par des transporteurs membranaires tels que la penetratine et ses analogues, le transportan et ses analogues, les groupes polyarginines, les pepto des portant des groupes guanidines; des groupes cholestérol, vitamines E ou des chaînes aliphatiques telles que les chaînes undècyl ou 1,2-di-O-hexadécyl-glycérol.

Les cellules vivantes comprises dans ce nécessaire peuvent être génétiquement modifiée de manière à exprimer des biomolécules dont on veut étudier l'interaction.

ces modifications font appel aux techniques classiques de biologie moléculaire bien connues de l'homme du métier, telle que la transfection stable ou transitoire des cellules par des plasmides exprimant les biomolécules, ou des protéines de fusion comprenant les biomolécules d'intérêt.

Les fluorophores partenaires de TR-FRET présent dans le nécessaire selon l'invention sont un composé fluorescent à durée de vie longue et au moins un composé fluorescent choisi parmi les suivants: les protéines fluorescentes telles que la protéine fluorescente verte (GFP) et ses dérivés (notamment CFP, YFP), ou des composés fluorescents ayant des durée de vie inférieure à 100 nanosecondes, telles que les cyanines, les rhodamines, les fluorescéines, les squarènes et les molécules fluorescentes connues sous le nom de BODIPY's (difluorobora-diaza indacenes), les composés connus sous la dénomination AlexaFluor, les protéines fluorescentes extraites de coraux, les phycobiliprotéines, telles que la B-phycoérythrine, la R-phycoérythrine, la C-phycocyanine, les allophycocyanines, en particulier celles connues sous la dénomination XL665.

De manière préférée, le composé fluorescent à durée de vie longue a une durée de vie supérieure à 100 ns et de manière encore plus préférée est un chélate ou un cryptate de terres rares. Dans une formulation particulière du nécessaire selon l'invention, la terre rare est le terbium ou l'europium.

La présente invention peut être maintenant décrite plus en détail par les exemples illustratifs suivants, qui ne doivent en aucun cas limiter les applications de la présente invention.

Exemple N 1: Mesure de la translocation de la protéine kinase C -gamma: PKC-y (Voir schéma de principe, Fig. 1) Les protéines kinases C sont des protéines appartenant à un groupe de kinases sérine/thréonine dépendantes des phospholipides. Ces protéines jouent un grand rôle dans de nombreuses voies de signalisation cellulaire. Physiologiquement la PKC-y est activée d'une manière dépendant au calcium par les phosphoditylsérines (PS) et elle lie le diacylglycérol (DAG), mais la PKC-y peut être activée indépendamment de la présence de DAG par les esters de phorbol inducteur de tumeurs (PMA).

Après stimulation, la PKC-y subit une translation du cytoplasme vers la membrane plasmique, cette translocation peut être mesurée à l'aide d'une protéine de fusion avec la GFP après une stimulation au PMA (Sakai N. J. Cell Bio. (1997) 139, 1465-1476).

On a créé une protéine de fusion entre la PKC-y et une enzyme suicide, nommée HaloTag, pour marquer la PKC-y avec un composé organique fluorescent accepteur et on a élaboré un outil pour faire un marquage spécifique de la membrane plasmique avec un composé organique fluorescent donneur pouvant entrer en FRET avec la PKC-y marquée.

La membrane plasmique est spécifiquement marquée avec une enzyme suicide, nommée SnapTag fusionnée avec une séquence Cys-Ala-Ala-X (X est un acide aminé quelconque) qui est une séquence de reconnaissance pour les enzymes de modification post-traductionnelle. Cette séquence va provoquer le greffage d'un groupe farnésyl en C-terminal de l'enzyme Snaptag, qui a pour conséquence l'adressage et l'ancrage de cette enzyme sur le feuillet interne de la membrane plasmique. Des cellules COS-7 ont été transfectées de façon transitoire avec les deux constructions plasmidiques avec de la lipofectamine 2000 ou par électroporation.

24 h ou 48h après la transfection transitoire, les cellules sont incubées pendant 1 heure avec du milieu cellulaire contenant 5 pM de chaque substrat spécifique des enzymes HaloTag et SnapTag, chacun des substrats étant porteur des molécules organiques fluorescentes formant le FRET.

Après 3 lavages avec du milieu, la translocation est mesurée par TR-FRET après induction par différentes stimulations comme par exemple après addition de 12-myristate 13-acétate phorbol ester (PMA). Une augmentation du signal TR-FRET est corrélée avec une augmentation du processus de translocation.

Des molécules potentiellement inhibitrices de la voie de translocation de la PKC-y peuvent être ajoutées au milieu de culture afin de tester leurs effets sur la stimulation de la translocation.

Exemple 2: Mise en évidence d'intéractions récepteur androgène coactivateur ou récepteur androgène corépresseur. (voir schéma de principe figure 2) Les androgènes et leur récepteur fonctionnel (AR) sont responsables de la différenciation normale du phénotype mâle externe. Les récepteurs des androgènes cytosoliques, à l'état inactif, sont associés avec les protéines chaperonnes (connues sous la dénomination anglaise "heat shock proteins"). Après liaison avec le ligand, les récepteurs se dimérisent et font l'objet d'une translocation vers le noyau. Les corégulateurs (coactivateurs ou corépresseurs) du AR vont alors interagir ou pas avec le récepteur et le résultat de ces interactions va éventuellement provoquer la liaison du complexe à l'ADN au niveau d'une séquence spécifique (dite ARE pour androgen receptor responsive element ) et ainsi réguler la transcription.

La méthode selon l'invention est utilisée pour mettre en évidence les interactions entre un corépresseur, un coactivateur, et un AR. Pour cela, des vecteurs d'expression sont introduits dans la cellule, afin d'exprimer dans le milieu intracellulaire: - une protéine de fusion AR- enzyme SnapTag. L'enzyme suicide Snaptag permet le couplage avec uncomposé fluorescent marqué avec un substrat de snaptag.

- une protéine de fusion HDAC1-Halotag. HDAC1 (histone acétyltransfèrase 1) est un corépresseur susceptible de se fixer sur AR. L'enzyme suicide halotag permet le couplage avec un composé fluorescent marqué avec un substrat d'halotag.

- une protéine de fusion p160-fragment inteine. P160 est un coactivateur de to susceptible de se fixer sur AR. Le fragment d'intéine permet le couplage avec un composé fluorescent comportant le fragment d'intéine complémentaire par transépissage protéique.

Lorsque l'AR se localise dans le noyau après stimulation, (liaison de son ligand), on peut doser son effet final en mesurant le signal de TR-FRET: l'AR est marqué avec le composé fluorescent donneur et le coactivateur et le corépresseur avec deux composés fluorescents accepteurs bien distincts dans leur propriétés spectrales, et dont la longueur d'onde d'émission suite à un transfert d'énergie est respectivement 665 et 780 nm.

La mesure d'un signal de TR-FRET à 665 nm sera donc représentative de la liaison de l'AR avec son coactivateur, alors que la mesure d'un TR-FRET à 780nm sera significative d'une interaction AR-corépresseur. Ce format d'essai permet donc la détection de deux types d'interaction dans un seul et unique essai cellulaire. Cet essai de multidétection peut être encore amélioré par l'addition d'autres composés fluorescents accepteurs pour révéler simultanément d'autres interactions.

Exemple 3: Bio-senseur CAMP: Detection de modifications de la conformation d'une protéine de fusion comprenant un domaine de liaison à IAMPc (Voir schéma de principe, Fig. 3) Dans cet exemple, on mesure les variations du signal TR-FRET d'une paire de composés fluorescents donneur / accepteur en couplant ces fluorophores à un domaine de liaison à I'AMPc (comme par exemple celui de la sous unité régulatrice 13II de la PKA, celui des protéines d'échange activées par la CAMP) connues sous le terme de CAMPS. Ces constructions moléculaires peuvent être utilisées pour quantifier dans des cellules vivantes les niveau d'AMPc après stimulation pharmacologique d'un récepteur couplé aux protéines G (GPCR) (voir (Nikolaev et al., JBC, vol. 279, N 36, pp. 37215-37218, 2004).

Le plasmide codant pour une proteine de fusion de type SNAP-tag / CAMPS / Halo-tag est transfecté dans des cellules HEK. 24 heures ou 48 heures après la transfection, les cellules sont incubées (1 heure à 37 C) avec les substrats de SNAP-Tag et HALO-Tag, chacun étant couplé à un membre d'un couple donneur / accepteur de TR-FRET.

A l'issue de l'étape d'incubation, les fluorophores sont couplés de manière covalente via les réactions suicides des enzymes SNAP-Tag et HALOTag, et la protéine CAMPS est marquée par la paire de fluorophores impliqués dans le TR-FRET.

A l'état basal, un signal de TR-FRET est mesuré en raison de la proximité des fluorophores. Après stimulation pharmacologique (par exemple stimulation par un agoniste d'un récepteur couplé aux protéines Gs exprimé dans des cellules HEK), la concentration intracellulaire d'AMPc va augmenter et la liaison de cAMP à CAMPS va provoquer un changement de conformation de cette dernière protéine. On observe alors une diminution du signal de TR-FRET mesuré.

Cet exemple montre que l'amplitude du signal de TR-FRET est directement corrélée à la liaison de l'AMPc à la protéine CAMPS.

La même expérience peut être menée avec un antagoniste du GPCR, qui provoque un diminution de la concentration d'AMPc dans la cellule et une variation de la conformation de la protéine CAMPS qui peut être détectée en mesurant une augmentation du signal de TR-FRET.

Exemple 4: Mesure de l'interaction calcineurine / calmoduline (voir schéma de principe figure 4) La calcineurine possède une activité de phosphatase et joue un rôle fondamental dans la voie de signalisation cellulaire impliquant les niveaux de calcium intracellulaire. La calcineurine est impliquée dans le développement et l'adaptation au stress chez les mammifères, et ce par l'intermédiaire de deux classes de facteurs de transcription: NFAT et MEF2.

La calcineurine est un hétérodimère comprenant deux sous-unités, la calcineurine A (CnA) et la calcineurine B (CnB). L'enzyme est inactive sous sa forme hétérodimérique et l'activité phosphatase est stimulée par la formation d'un complexe calcineurine-calmoduline lors de l'augmentation de la concentration en calcium intracellulaire.

Un plasmide codant pour une protéine de fusion comprenant la sous-unité CnA et l'enzyme HALO-Tag et un plasmide codant pour une protéine de fusion comprenant la calmoduline et l'enzyme SNAP-Tag sont co-transfectés dans des cellules en utilisant la lipofectamine 2000 ou par électroporation. Après 24 ou 48 heures, les cellules sont incubées 1 heure à 37 C dans un milieu comprenant les substrats des enzymes SNAP-Tag et HALO-Tag, chacun couplé à un membre d'une paire de fluorophores compatible pour le TR-FRET.

Après lavage, les cellules sont stimulées pharmacologiquement ou par un stress (par exemple par la cyclosporine A, ou acidification du milieu). L'amplitude du signal de TR-FRET mesuré augmente et est corrélée à l'association de l'hétérodimère CnA-CnB avec la calmoduline.

On peut ajouter au milieu de mesure avant stimulation des molécules dont on veut tester l'effet sur l'activation de la voie de signalisation calcineurine-dépendante. Cet exemple montre que le procédé selon l'invention permet d'étudier la voie de signalisation calcineurine dépendante dans des cellules vivantes, éventuellement en présence de composés à tester. Ce type de test permet le criblage à haut débit de composés candidates susceptibles de permettre le traitement de pathologies impliquant cette voie de signalisation.

Exemple 5: Criblage de composés ayant une activité anti-inflammatoire Le TNF alpha est un facteur de l'inflammation qui provoque plusieurs réponses cellulaires lors de sa liaison à son récepteur membranaire. Une des réponses provoquée par le TNF alpha dans les lymphocytes B est l'activation du facteur de transcription NFkB, qui contrôle la production des chaînes légères des anticorps une étape critique de la réponse immunitaire. Les inhibiteurs du TNF alpha sont donc utile pour réguler la réponse immunitaire, et peuvent par exemple être utilisé dans la prévention du choc septique, ou comme médicaments anti-inflammatoires. De tels inhibiteurs de l'activité TNFalpha peuvent être découvert en mesurant le niveau d'activation de NFkB, ce que permet la présente invention.

La figure 5 illustre la rétention cytosolique de NFkB par la protéine cytosolique IkB: le complexe NFkB (p65, p50)-IkB est retenu dans le cytosol. Une stimulation appropriée (mitogenes de cellules T et B, le lipopolysaccharide, et le TNFalpha) provoque la phosphorylation de IkB, entraîne sa dégradation et libère NFkB qui peut alors pénétrer le noyau cellulaire et activer la production des chaines légères d'anticorps.

Le procédé selon l'invention est appliqué en introduisant dans des lymphocytes B par les techniques classiques de biologie moléculaire les constructions suivantes: - un vecteur exprimant une protéine de fusion IkB-Snaptag, qui pourra être marquée par un composé fluorescent donneur conjugué au substrat de Snaptag; - un vecteur exprimant une protéine de fusion p50-Halotag, qui pourra être to marqué par un composé fluorescent accepteur conjugué à un substrat d'Halotag.

Dans les conditions de repos, le complexe NFkB (p65/p50) forme un complexe avec IkB et l'on peut mesures un signal de TR-FRET. Après stimulation des cellules par le TNFalpha, la phosphorylation de IkB et sa dissociation du complexe va provoquer une diminution du signal de TR-FRET. L'amplitude de cette diminution est représentative du degré d'activation de la NFkB.

Ces cellules sont cultivés dans une plaque micropuits, et l'on applique à différents puits l'un des traitements suivants: - ajout des composés fluorescents donneur et accepteur couplés aux substrats Snaptag et Halotag, mesure du signal de TR-FRET (puit de contrôle TR-FRET élevé) ; ajout des composés fluorescents couplés aux substrats Snaptag et Halotag, stimulation des cellules par ajout de TNFalpha, mesure du signal de TRFRET (puit de contrôle TR-FRET bas) ; - ajout des composés fluorescents couplés aux substrats Snaptag et Halotag, ajout d'un composé à tester, stimulation des cellules par ajout de TNFalpha, mesure 25 du signal de TRFRET (puits tests).

Lorsque le signal des puits tests est similaire à celui mesuré dans les puits de contrôle TR-FRET élevé, on peut conclure que les composés à tester ont un effet inhibiteur sur l'activité TNF alpha. Lorsque cette valeur est proche de la valeur mesurée dans les puits de contrôle TR-FRET bas, on peut conclure que les composés à tester n'ont pas d'effet sur l'action de TNF alpha.

Cet exemple illustre l'application du procédé selon l'invention au criblage de médicaments et est particulièrement adapté au criblage dit à haut débit.

Claims (20)

REVENDICATIONS

1. Procédé de détection d'interactions entre biomolécules, de translocation ou de changement de conformation de biomolécules dans des cellules vivantes, comprenant 5 les étapes suivantes: 1) marquer, dans une cellule vivante, une première biomolécule avec un premier composé fluorescent possédant une durée de vie de fluorescence longue; 2) marquer, dans ladite cellule vivante, au moins une deuxième to biomolécule avec un deuxième composé fluorescent; 3) soumettre les cellules vivantes à une stimulation spécifique adaptée à la réponse biologique à étudier, en présence ou non d'un composé appartenant à une librairie de molécules à tester; 4) soumettre les cellules vivantes à une source lumineuse ayant une longueur d'onde permettant l'excitation dudit premier composé fluorescent à durée de vie longue; 5) mesurer l'intensité de la fluorescence émise par lesdits premier et second composés fluorescents, calculer le rapport entre les intensités de fluorescence dudit premier composé fluorescent et dudit second composé fluorescent, ou mesurer la durée de vie du premier ou du second composé fluorescent; et 6) comparer les signaux mesurés à ceux obtenus avant stimulation des cellules; lesdit premier et au moins second composés fluorescents étant partenaires de 25 TR-FRET.

2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'on étudie un changement de conformation d'une biomolécule et en ce que les composés fluorescents sont couplés à la même biomolécule

3. Procédé selon les revendications 1 ou 2, caractérisé en ce que le marquage des biomolécules par les composés fluorescents est effectué à l'aide d'une technique choisi parmi les suivantes: marquage covalent par action d'un enzyme suicide, marquage covalent par épissage protéique, marquage par expression d'une protéine de fusion comprenant la bio-molécule et une protéine fluorescente en tant que composé fluorescent, marquage non- covalent de haute affinité par l'intermédiaire de partenaires de liaison.

4. Procédé selon les revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que le marquage composé fluorescent / biomolécule est effectué en couplant le composé fluorescent et la biomolecule, respectivement avec les membres des couples choisi parmi: un substrat de SNAP-Tag / l'enzyme SNAP-Tag, un substrat d'HALO-Tag / l'enzyme HALO-Tag, une partie d'intéine telle que l'intéine de Ssp DnaE / la partie d'intéine complémentaire permettant de reconstituer une intéine fonctionnelle, un motif bi-arsenic / la séquence Cys-Cys-X-X-Cys-Cys, X représentant un acide aminé quelconque, un ion métallique / une séquence poly-histidine, la biotine / la streptavidine, la streptavidine / la biotine, la bungarotoxine / le tag BTX, la cadaverine / la séquence protéique PKPQQFM, l'aziridine / la séquence nucléique TCGA

5. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes caractérisé en ce qu'au moins un des composés fluorescents comporte un motif lui permettant de franchir la membrane plasmique.

6. Procédé selon la revendication 5 caractérisé en ce que le motif permettant au composé fluorescent de franchir la membrane plasmique est choisi parmi les motifs suivants: ester tels que les pivaloyl-oxyméthyle ester, acétoxyméthyle ester, ou les esters glycoliques; des peptides viraux pris en charge par des transporteurs membranaires tels que la penetratin et ses analogues, le transportan et ses analogues, les groupes polyarginines, les peptoïdes portant des groupes guanidines; des groupes cholesterol, vitamines E ou des chaînes aliphatiques telles que les chaînes undecyl oi 1, 2-d i-O-hexadecyl-g lycerol.

7. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé 25 en ce que la durée de vie du premier composé fluorescent est supérieure à 100 nanosecondes.

8. Procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce que le premier composé fluorescent est choisi parmi les chélates ou cryptates de terres rares.

9. Procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce que le premier composé 30 fluorescent est un cryptate de terre rare comprenant un motif pyridine

10. Procédé selon les revendications 7 à 9, caractérisé en ce que la terre rare est le terbium ou l'europium.

11. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 10, caractérisé en ce que le deuxième composé fluorescent est choisi parmi les composés suivants: les protéines fluorescentes telles que la protéine fluorescente verte (GFP) et ses dérivés (notamment CFP, YFP), les protéines fluorescentes extraites de coraux, les phycobiliprotéines, telles que la B-phycoérythrine, la R-phycoérythrine, la C-phycocyanine, les allophycocyanines, en particulier celles connues sous la dénomination XL665 ou les composés fluorescents organiques ayant des durée de vie inférieure à 100 nanosecondes, telles que les cyanines, les rhodamines, les fluorescéines, les squarènes et les molécules fluorescentes connues sous le nom de BODIPY's (difluorobora-diaza indacenes), les composés connus sous la dénomination AlexaFluor.

12. Procédé selon la revendication 11, caractérisé en ce que le deuxième composé fluorescent est un composé fluorescent organique comportant un motif lui permettant de franchir la membrane plasmique.

13. Nécessaire de composants (kit of parts), comprenant: - un premier composé fluorescent et au moins un second composé fluorescent, ces composés étant partenaires de TR-FRET et l'un au moins de ces composés comportant un motif lui permettant de franchir la membrane plasmique; des cellules vivantes comprenant lesdites biomolécules; - des moyens de marquage des biomolécules par lesdits composés fluorescents; - des instructions permettant d'étudier des phénomènes d'interactions entre biomolécules, de translocation ou de changement de conformation de biomolécules dans les cellules vivantes.

14. Nécessaire de composants selon la revendication 13, caractérisé en ce que les moyens de marquage des biomolécules par les composés fluorescents consistent à coupler le composé fluorescent et la biomolecule, respectivement avec les membres des couples choisi parmi: un substrat de SNAP-Tag / l'enzyme SNAP-Tag, un substrat d'HALO-Tag / l'enzyme HALO-Tag, une partie d'intéine telle que I'intéine de Ssp DnaE / la partie d'intéine complémentaire permettant de reconstituer une intéine fonctionnelle, un motif bi-arsenic / la séquence Cys-Cys-X-X-Cys-Cys, X représentant un acide aminé quelconque, un ion métallique / une séquence poly-histidine, la biotine / la streptavidine, la streptavidine / la biotine, la bungarotoxine / le tag BTX, la cadaverine / la séquence protéique PKPQQFM, I'aziridine / la séquence nucléique TCGA.

15. Nécessaire de composants selon la revendication 13, caractérisé en ce que le motif permettant à au moins un des composés fluorescents de franchir la membrane plasmique est choisi parmi les suivants: ester tels que les pivaloyl-oxyméthyle ester, acétoxyméthyle ester, ou les esters glycoliques; des peptides viraux pris en charge par des transporteurs membranaires tels que la penetratine et ses analogues, le transportan et ses analogues, les groupes polyarginines, les peptdides portant des groupes guanidines; des groupes cholestérol, vitamines E ou des chaînes aliphatiques telles que les chaînes undecyl oi 1,2-di-O-hexadecylglycerol.

16. Nécessaire de composants selon la revendication 13, caractérisé en ce que to les cellules sont génétiquement modifiées de manière à exprimer les bio-molécules à étudier, ou des protéines de fusion comprenant les molécules à étudier.

17. Nécessaire de composants selon la revendication 13, caractérisé en ce qu'il comprend un composé fluorescent à durée de vie longue et au moins un autre composé fluorescent choisi parmi les suivants: les protéines fluorescentes, telles que la protéine fluorescente verte (GFP) et ses dérivés (notamment CFP, YFP), ou des composés fluorescents ayant des durée de vie inférieure à 100 nanosecondes, tels que les cyanines, les rhodamines, les fluorescéines, les squarènes et les molécules fluorescentes connues sous le nom de BODIPY's (difluorobora-diaza indacenes), les composés connus sous la dénomination AlexaFluor, les protéines fluorescentes extraites de coraux, les phycobiliprotéines, telles que la B-phycoérythrine, la R-phycoérythrine, la C-phycocyanine, les allophycocyanines, en particulier celles connues sous la dénomination XL665.

18. Nécessaire selon la revendication 17, caractérisé en ce que le composé fluorescent à durée de vie longue à une durée de vie supérieure à 100 ns.

19. Nécessaire selon la revendication 18, caractérisé en ce que le composé fluorescent à durée de vie longue est un chélate de terre rare ou un cryptate de terre rare.

20. Nécessaire selon la revendication 18, caractérisé en ce que le composé fluorescent à durée de vie longue est un chélate de terre rare ou un cryptate de terbium ou d'europium.