FR2867783A1 - Procede de criblage d'agent modulant l'ubiquitination de la proteine ikbalpha et moyens destines a la mise en oeuvre dudit procede - Google Patents
Procede de criblage d'agent modulant l'ubiquitination de la proteine ikbalpha et moyens destines a la mise en oeuvre dudit procede Download PDFInfo
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Abstract
Procédé pour le criblage d'agents modulant l'ubiquitination de la protéine IκBα par un complexe protéique fonctionnel ubiquitine ligase comprenant la protéine β-TrCP, ledit procédé comprenant les étapes suivantes :(a) mettre en contact un agent candidat à tester avec des cellules de levure recombinantes qui expriment dans leur noyau :(i) une protéine de fusion comprenant le polypeptide IκBα et au moins une première protéine détectable ; et(ii) une protéine comprenant le polypeptide β-TrCP ;(b) quantifier ladite première protéine détectable dans les cellules de levure, à la fin d'au moins une période de temps prédéterminée après la mise en contact de l'agent candidat avec lesdites cellules ;(c) comparer la valeur obtenue à l'étape (b) avec une valeur témoin obtenue lorsque l'étape (a) est réalisée en l'absence de l'agent candidat.
Description
DOMAINE DE L'INVENTION
La présente invention se rapporte au domaine du criblage d'agents biologiquement actifs capables de moduler l'ubiquitination de la protéine IcBa, en particulier d'agents d'intérêt thérapeutique, et encore plus spécifiquement d'agents thérapeutiques destinés à prévenir ou traiter des affections inflammatoires, des affections auto-immunes ou des cancers.
ETAT DE LA TECHNIQUE
L'un des grands problèmes médicaux non résolu demeure la mise au io point de traitements effectifs des syndromes inflammatoires et auto-immuns. Ces pathologies sont actuellement traitées à l'aide de molécules comme des anti-inflammatoires non stéroïdiens tels que l'aspirine et l'ibuprofène, et les corticostéroïdes, molécules à l'efficacité limitée et présentant des effets toxiques non négligeables. Les inhibiteurs plus spécifiques des cyclooxygénases, comme le réfécoxib et les agents bloquant le facteur de nécrose tumorale (TNF), apparus plus récemment sur le marché, se sont révélés présenter les mêmes inconvénients.
Les facteurs de transcription de la famille NF-xB font partie des premiers moyens de défense de l'organisme lors d'infections virales, bactériennes ou fongiques et également lors de situations physiologiques de stress. Ces facteurs transcriptionnels dirigent l'expression d'un nombre important de gènes, et notamment de nombreux gènes codant pour des médiateurs de l'inflammation. Parmi ces gènes, on peut citer les gènes codant le facteur TNF-a, les interleukines IL-1, IL-6, IL-8, les molécules d'adhésion ICAM-1, VCAM-1 et la E-Sélectine, la NO synthase ou encore la prostaglandine synthase Cox2.
Les facteurs de la famille NF-1<B sont activés par une grande variété de stimuli pathogènes, aussi bien endogènes qu'exogènes, ce qui inclut des protéines ou lipides bactériens, les cytokines, les facteurs de croissance et des molécules liées à des situations de stress oxydatif. L'activation des facteurs NF-KB, en réponse à ces stimuli pathogènes, est observée pour la presque totalité des cellules impliquées dans la réponse immune, telles que les cellules épithéliales, les cellules du mésenchyme, les lymphocytes, les cellules neutrophiles et les macrophages.
Bien que l'étiologie exacte de la plupart des syndromes inflammatoires chroniques reste indéterminée à ce jour, des résultats expérimentaux, y compris des résultats d'études cliniques, ont montré le rôle important de l'activation du facteur NF-1B, à la fois dans l'initiation de l'inflammation et dans l'installation d'un état d'inflammation chronique. Le blocage de l'activation des facteurs appartenant à la famille NF-xB constitue donc une voie efficace pour traiter des syndromes inflammatoires tels que l'asthme, l'arthrite rhumatoïde, les colopathies inflammatoires, telle que la maladie de Crohn, les scléroses multiples ou le psoriasis (Ballard, 2001; Baud et Karin, 2001).
II est maintenant établi que la réponse inflammatoire et l'activation du facteur NF-xB est étroitement liée à la destruction du facteur IKBa par la voie ubiquitine protéasome (Kroll et al, 1999; Winston et al, 1999). En effet dans des cellules non stimulées ou non-activées, le facteur NF- xB est séquestré is dans le cytoplasme des cellules. Dans des cellules non stimulées ou non activées, le facteur NF-kB est donc incapable d'activer l'expression des gènes cibles de ce facteur. L'activation des gènes cibles nécessite tout d'abord la translocation du facteur NFkB du cytoplasme vers le noyau. Cette translocation est déclenchée par la dégradation du facteur IxBa par la voie ubiquitine protéasome. Le facteur IKBa est en effet une protéine qui séquestre les facteurs NF-KB dans le cytoplasme des cellules non stimulées (Hay et al., 1999).
Des stimuli inflammatoires exogènes, telle qu'une infection virale ou bactérienne, activent une voie de signalisation qui provoque la phosphorylation du facteur IxBa. Cette phosphorylation a lieu spécifiquement sur les résidus Sérine en positions 32 et 36 de la séquence d'acides aminés du facteur IKB . Le facteur IxBa est phosphorylé par le complexe protéique kinase IxK. Lorsqu'il est ainsi phosphorylé, le facteur IKBa est reconnu par l'ubiquitine ligase SCFR-Trcp (Kroll et aI, 1999; Winston et al, 1999). La reconnaissance du facteur IKBa par l'ubiquitine ligase SCFR-Trop provoque la poly-ubiquitination de ce facteur. Après ubiquitination, le facteur IKBa est alors reconnu et dégradé par le protéasome. La destruction du facteur IxBa provoque la libération du facteur cytoplasmique NF-1(B. Le facteur NF-xB subit une translocation du cytoplasme vers le noyau. Une fois localisé dans le noyau des cellules stimulées, le facteur NF-xB reconnaît spécifiquement les promoteurs de gènes cibles et active fortement leur transcription: la réponse inflammatoire est installée (Ben Neriah, 2002).
De nombreuses données expérimentales semblent confirmer que la libération du facteur NF-xB, qui est induite par la dégradation du facteur IKBa phosphorylé, constitue une étape essentielle pour l'initiation de l'inflammation et également pour l'installation d'une situation d'inflammation chronique (Magnani et aI, 2000; Lewis et Manning, 1999).
Il existe un besoin dans l'état de la technique pour de nouveaux composés anti-inflammatoires, que ce soit pour le traitement d'un état io inflammatoire aigu ou d'un état inflammatoire chronique. En particulier, il existe un besoin pour des composés anti-inflammatoires qui soient à la fois plus efficaces et plus spécifiques que les composés antiinflammatoires connus. De tels composés anti-inflammatoires, du fait de leur spécificité vis-à-vis d'une cible biologique, seraient susceptibles de posséder des effets secondaires indésirables réduits, voire d'être exempts de tout effet secondaire indésirable.
Il existe aussi un besoin pour la mise au point de procédés pour identifier des composés d'intérêt thérapeutique, plus spécifiquement des composés anti-inflammatoires à effet amélioré, du type de ceux ci-dessus.
DESCRIPTION DE L'INVENTION
Description générale du procédé de criblage de l'invention Selon l'invention, on a mis au point un procédé de criblage d'agents d'intérêt thérapeutique, qui sont sélectionnés pour leur spécificité d'action sur l'ubiquitination de la protéine humaine IKBa par un complexe ubiquitine ligase comprenant la protéine humaine R-TrCP.
Le demandeur a montré que, de manière surprenante, il était possible de mimer, dans des cellules de levure, le processus de dégradation du facteur IxBa par le protéasome, processus qui a lieu naturellement dans les cellules humaines.
De manière surprenante, on a montré selon l'invention qu'il était possible de créer artificiellement, dans des cellules de levure, un complexe protéique possédant l'activité ubiquitine ligase et la spécificité de reconnaissance du complexe SCFa-TrCP qui est produit naturellement dans les cellules humaines. Ainsi, selon l'invention, on a reconstitué, dans des cellules de levure, un complexe ubiquitine ligase artificiel comprenant des protéines de levure auxquelles est associée la protéine humaine (3-TrCP. En particulier, on a montré que la protéine humaine 13-TrCP, lorsqu'elle est artificiellement exprimée dans les cellules de levure, s'associe à la protéine Skpl de levure, laquelle protéine Skpl de levure est contenue dans un complexe protéique ubiquitine ligase de levure. Ainsi, dans une cellule de levure dans laquelle on io inséré une cassette d'expression codant la protéine humaine R-TrCP, la protéine R-TrCP s'associe au complexe protéique SCF de levure qui comprend (i) un coeur catalytique constitué de l'association des protéines Skpl, Cdc53 et Hrt1, ledit coeur catalytique étant lui-même associé à l'enzyme E2 Cdc34. On a montré que ce complexe protéique hybride levure/homme est capable de mimer, dans des cellules de levure, l'activité ubiquitine Iigase exercée dans des cellules humaines par le complexe SCFR" Trcp humain naturel.
De manière tout aussi surprenante, on a montré selon l'invention que, dans les cellules de levure, ce complexe protéique artificiel possédant l'activité ubiquitine ligase du complexe SCFR-Trcp humain n'est biologiquement actif que lorsque ce complexe artificiel est localisé dans le noyau cellulaire. Au contraire, dans les cellules humaines, le complexe SCFRTrCp naturel exerce son activité biologique dans le cytoplasme des cellules humaines, compartiment cellulaire dans lequel il réalise l'ubiquitination d'une seconde protéine également localisée dans le cytoplasme, le facteur IKBa. On a aussi montré selon l'invention que le complexe artificiel ubiquitine Iigase qui a été mis au point n'est actif, dans le processus de dégradation du facteur IKBa, que lorsque le facteur IKBa est co-localisé dans le noyau avec ledit complexe artificiel ubiquitine ligase.
Ainsi, on a montré selon l'invention que, dans des cellules de levure, le complexe protéique artificiel ubiquitine ligase comprenant la protéine humaine Q-TrCP est capable de réaliser l'ubiquitination du facteur IKBa humain, lorsque la protéine R-TrCP et le facteur IKBa sont artificiellement exprimés dans le noyau cellulaire.
Enfin, on a également montré que, dans des cellules de levure, l'ubiquitination du facteur IKBa par le complexe ubiquitine ligase artificiel nouveau, bien que cette ubiquitination soit réalisée dans le noyau de la cellule, et non dans le cytoplasme cellulaire, provoque néanmoins la dégradation du facteur IiBa ubiquitiné par le protéasome.
L'ensemble des résultats surprenants ci-dessus a permis au demandeur de mettre au point un procédé de criblage d'agents capables de moduler la dégradation du facteur IaBu dans les cellules de levure, en présence d'un complexe ubiquitine ligase artificiel mimant l'activité biologique io du complexe ubiquitine ligase humain SCFR-Trop naturel.
L'invention a pour objet un procédé pour le criblage in vitro d'agents modulant l'ubiquitination de la protéine IxBa par un complexe protéique fonctionnel ubiquitine ligase comprenant la protéine R-TrCP, ledit procédé comprenant les étapes suivantes: (a) mettre en contact un agent candidat à tester avec des cellules de levure recombinantes qui expriment dans leur noyau: (i) une protéine de fusion comprenant le polypeptide IxBa et au moins une première protéine détectable; et (ii) une protéine comprenant le polypeptide -TrCP; (b) quantifier ladite première protéine détectable dans les cellules de levure, à la fin d'au moins une période de temps prédéterminée après la mise en contact de l'agent candidat avec lesdites cellules; (c) comparer la valeur obtenue à l'étape (b) avec une valeur témoin obtenue lorsque l'étape (a) est réalisée en l'absence de l'agent candidat.
Le procédé ci-dessus permet à l'homme du métier de déterminer si un agent à tester est capable de modifier la vitesse de dégradation, ou le degré de dégradation, du facteur IxBa par le protéasome, dans les cellules de levure exprimant à la fois la protéine R-TrCP et le facteur IkBa humains.
Le procédé de criblage in vitro ci-dessus, du fait qu'il met en oeuvre un système d'ubiquitination artificiel humanisé dans des cellules de levure, permet un criblage d'agents qui agissent de manière spécifique sur l'activité des seules protéines humaines exprimées dans ces cellules.
De plus, grâce au procédé ci-dessus, on a mis au point un test physiologique de criblage d'agents actifs sur la voie ubiquitine ligase, en construisant chez la levure une voie métabolique de dégradation protéique mimant la voie de dégradation par le protéasome du facteur IKBa humain. Ainsi, du point de vue de la voie métabolique de dégradation des protéines qui est visée, le procédé de l'invention est réalisé dans des conditions physiologiques très proches des conditions physiologiques de dégradation des protéines par le protéasome humain.
Grâce au procédé ci-dessus, on peut identifier les agents capables d'inhiber la vitesse ou le degré de dégradation du facteur IKBa par le protéasome des cellules de levure. De tels agents inhibiteurs, identifiés grâce lo au procédé de l'invention, du fait qu'ils vont inhiber également la dégradation du facteur IKBa dans les cellule humaines, constituent des agents d'intérêt thérapeutique susceptibles d'inhiber ou de bloquer la translocation du facteur NF-1<13 dans le noyau cellulaire et, en conséquence, inhiber ou bloquer l'activation, par NF-xB, de divers gènes impliqués dans l'inflammation, des is pathologies d'auto-immunité ou encore des cancers.
Ainsi, le procédé de criblage in vitro ci-dessus peut comprendre une étape additionnelle (d) qui consiste à sélectionner positivement les agents candidats inhibiteurs pour lesquels la quantité de protéine détectable mesurée à l'étape (b) est inférieure à la valeur témoin de comparaison.
Le procédé de l'invention permet aussi d'identifier des agents capables d'augmenter la vitesse ou le degré de dégradation du facteur IKBa par le protéasome des cellules de levure. De tels agents activateurs sont susceptibles d'induire ou d'augmenter la translocation du facteur NF-KB dans le noyau cellulaire et, en conséquence, d'induire ou d'augmenter l'activation, par NF-KB, de divers gènes impliqués dans l'inflammation, des pathologies d'auto-immunité ou des cancers. Ainsi, selon ce second aspect, le procédé de criblage in vitro de l'invention permet de cribler des agents pro-inflammatoires. Certains des agents pro-inflammatoires sélectionnés selon le procédé sont susceptibles de revêtir un intérêt thérapeutique lorsqu'ils sont utilisés à faible dose ou lorsqu'ils sont administrés pendant une courte durée, par exemple en tant qu'agents inducteurs d'une réponse immune précoce, telle que l'induction d'une réaction de résistance non spécifique à l'infection ou encore telle que l'activation des cellules présentatrices de l'antigène, pour l'initiation d'une réponse immunitaire spécifique d'un antigène, qu'elle soit à médiation humorale ou à médiation cellulaire. Certains autres agents proinflammatoires sélectionnés selon le procédé de criblage in vitro de l'invention peuvent consister en des principes actifs connus, notamment des principes actifs de médicament, dont un effet pro-inflammatoire indésirable est identifié, et pour lesquels des précautions d'emploi particulières vis-à-vis de la santé humaine devront être observées.
Ainsi, selon un autre aspect, le procédé de criblage selon l'invention peut comprendre une étape additionnelle (d) qui consiste à sélectionner positivement les agents candidats activateurs, pour lesquels la quantité de protéine détectable mesurée à l'étape (b) est supérieure à la valeur témoin de comparaison.
Ainsi, un agent qui module l'ubiquitination de la protéine R-TrCP consiste (i) en un agent qui augmente ou au contraire consiste (ii) en un agent qui inhibe ou bloque la dégradation de la protéine (3-TrCP qui est détectée à l'étape (b) du procédé de criblage de l'invention, par rapport à une situation témoin de dégradation de cette protéine, lorsque le procédé est réalisé en l'absence de l'agent testé.
Comme on l'aura compris, l'agent modulant l'ubiquitination de la protéine 13-TrCP peut être de toute nature. Ledit agent peut être tout composé organique ou minéral, et peut être soit un agent d'origine naturelle, soit un agent produit, au moins en partie, par synthèse chimique ou biologique. Ledit agent peut être notamment un peptide ou protéine. Ledit agent englobe aussi toute molécule déjà connue pour posséder un effet biologique, notamment un effet thérapeutique, ou à l'inverse un effet toxique démontré ou suspecté pour l'organisme.
Dans le procédé de l'invention, une fois que la protéine de fusion IWBaprotéine détectable est ubiquitinylée par le complexe SCF artificiel comprenant le polypeptide R-TrCP, ladite protéine de fusion subit une protéolyse qui est effectuée par le complexe multi-catalytique du protéasome. La quantification de la protéine détectable contenue dans la cellule de levure, à un instant donné, permet de déterminer le degré de dégradation de ladite protéine de fusion IWBa-protéine détectable, à cet instant donné.
Selon l'invention on a montré que la sensibilité du procédé de criblage décrit ci-dessus est accrue lorsque, préalablement à la mise en contact des cellules de levure avec l'agent à tester, on favorise l'accumulation de la protéine cible de fusion Bu-protéine détectable dans le noyau cellulaire.
Ainsi, selon un premier mode de réalisation préféré du procédé ci- dessus, l'étape (a) comprend elle-même les étapes suivantes: (a1) cultiver les cellules de levure qui expriment dans leur noyau une protéine de fusion comprenant le polypeptide IxBa et au moins une première protéine détectable; io (a2) stopper l'expression de ladite protéine de fusion comprenant le polypeptide IxBa et au moins une première protéine détectable par les cellules de levure; (a3) mettre en contact les cellules de levures obtenues à la fin de l'étape (a2) avec l'agent candidat à tester.
is L'arrêt de l'expression de la protéine de fusion IKBa-protéine détectable, à un moment choisi, peut être facilement réalisé par l'homme du métier, en utilisant, pour transformer les cellules de levure, une cassette d'expression dans laquelle le polynucléotide codant ladite protéine de fusion est placé sous le contrôle d'un promoteur fonctionnel dans les cellules de levure et dont l'activation, ou à l'inverse la répression, est induite par un agent inducteur. De nombreux promoteurs inductibles actifs dans des cellules de levure sont connus par l'homme du métier, dont certains d'entre eux sont décrits plus loin dans la description, y compris dans les exemples.
L'accumulation de la protéine de fusion IKBo-protéine détectable dans le noyau des cellules de levure, pendant l'étape (a1) du procédé, permet l'obtention d'un fort signal de détection de la protéine détectable, au début du procédé. Ces conditions de fort signal permettent de quantifier avec une grande sensibilité la protéine détectable pendant toute la durée du procédé, au fur et à mesure de la dégradation de la protéine de fusion IxBa-protéine détectable par le protéasome, après qu'elle ait été ubiquitinylée par le complexe SCF artificiel comprenant la protéine 13TrCP. De manière évidente, plus le signal détectable de départ est fort, meilleure est la sensibilité des mesures lors de la mise en oeuvre du procédé.
Selon un premier aspect du mode de réalisation ci-dessus, les cellules de levure expriment la protéine comprenant le polypeptide 13-TrCP durant la totalité des étapes (a1), (a2) et (a3).
Selon un second aspect du mode de réalisation ci-dessus, les cellules de levure expriment la protéine comprenant le polypeptide R-TrCP durant la totalité des étapes (a2) et (a3) et n'expriment pas la protéine comprenant le polypeptide 13-TrCP durant l'étape (a1).
Selon ce second aspect, le contrôle de l'expression de la protéine comprenant le polypeptide (3-TrCP est facilement réalisé, en utilisant, pour io transformer les cellules de levure, une cassette d'expression dans laquelle le polynucléotide codant la protéine comprenant le polypeptide f3-TrCP est placé sous le contrôle d'un promoteur fonctionnel dans les cellules de levure et dont l'activation, ou à l'inverse la répression, est induite par un agent inducteur. De nombreux promoteurs inductibles actifs dans des cellules de levure sont connus par l'homme du métier, dont certains d'entre eux sont décrits plus loin dans la description, y compris dans les exemples. De manière tout à fait préférée, le promoteur inductible inclus dans la cassette d'expression codant la protéine comprenant le polypeptide [3-TrCP est distinct du promoteur inductible inclus dans la cassette d'expression codant la protéine de fusion IxBa-protéine détectable. Selon ce mode de réalisation préférentiel, on réalise un contrôle séparé respectivement (i) de l'expression de la protéine de fusion IxBa-protéine détectable et (ii) de l'expression de la protéine comprenant le polypeptide 13-TrCP.
Selon ce second aspect, la protéine de fusion IKB -protéine détectable s'accumule dans le noyau des cellules de levure pendant l'étape (a1), en l'absence de polypeptide 13-TrCP. Puis, à l'étape (a2) la protéine de fusion IKBa-protéine détectable qui n'est plus produite est mise en présence, dans le noyau cellulaire, du complexe SCF artificiel qui comprend la protéine 13-TrCP dont l'expression a été induite. Dans ce mode de réalisation du procédé, on accumule d'abord la protéine de fusion cible comprenant IxBa, puis on exprime la protéine effectrice de l'ubiquitination, à savoir la protéine comprenant le polypeptide 13-TrCP, laquelle va initier le processus de dégradation de la protéine de fusion IxBa-protéine détectable. Et le processus de dégradation de la protéine de fusion IxBa-protéine détectable, io qui peut être modulé par l'agent à tester, est mesuré à l'étape (b) du procédé de criblage de l'invention.
Selon un troisième aspect du mode de réalisation préféré du procédé de criblage de l'invention, les cellules de levure expriment la protéine 5 comprenant le polypeptide 13-TrCP durant la totalité des étapes (a2) et (a3), et (i) n'expriment pas la protéine comprenant le polypeptide R-TrCP pendant une durée prédéterminée, au début de l'étape (a1) ; (ii) expriment la protéine comprenant le polypeptide R-TrCP pendant la io durée restante de l'étape (a1).
Selon ce troisième aspect également, la protéine de fusion IKBaprotéine détectable est exprimée durant la totalité de l'étape (a1) du procédé, et l'expression de ladite protéine de fusion est stoppée à l'étape (a2) du procédé.
is Selon ce troisième aspect, on active l'expression de la protéine comprenant le polypeptide R-TrCP à un moment choisi pendant la durée de l'étape (a1). Dans ces conditions, dans la partie (ii) de l'étape (a1), la protéine de fusion IxBa-protéine détectable et la protéine comprenant le polypeptide R-TrCP sont simultanément exprimées dans les cellules de levure.
Selon ce troisième aspect, la protéine de fusion IKBa-protéine détectable s'accumule en grande quantité dans le noyau des cellules de levure durant la totalité de l'étape (a1) et la protéine effectrice comprenant le polypeptide [3-TrCP est exprimée précocement au cours de l'étape (a1) et continue de s'accumuler durant les étapes (a2) et (a3) pendant lesquelles la protéine de fusion cible n'est plus synthétisée. Dans ces conditions, du fait de la grande quantité de le protéine effectrice comprenant le polypeptide 13-TrCP accumulée dans le noyau des cellules de levure, on favorise un haut niveau de réaction d'ubiquitination de la protéine de fusion cible et donc aussi une forte activité de dégradation de la protéine de fusion cible par le protéasome, ce qui accroît considérablement la sensibilité du procédé de criblage, lorsqu'on teste des agents candidats potentiellement inhibiteurs de l'ubiquitination du polypeptide IKBa.
2867783 Il Préférentiellement, selon ce troisième aspect du procédé de l'invention, pendant l'étape (a1), l'expression de la protéine de fusion IxBaprotéine détectable est activée pendant une durée Ti comprise entre 0, 25 heure et 10 heures, mieux entre 0,5 heure et 6 heures, et encore mieux entre 1 heure et 4 heures.
Puis, à un instant t2 déterminé, situé pendant la durée T1, on active l'expression de la protéine effectrice comprenant le polypeptide R-TrCP. Préférentiellement, l'instant t2 est situé entre [T1 8 heures] et [T1 0,1 heure], mieux entre [T1 5 heures] et [T1 0,25 heure], et encore mieux entre [T1 3 heures] et [T1 0,5 heure], l'instant t2 étant, par définition, choisi à l'intérieur des limites de la durée T1 préalablement sélectionnée.
Puis, à la fin de la période de temps Ti, c'est à dire au début de l'étape (a2), on stoppe l'expression de la protéine de fusion IxBa- protéine détectable. A partir de cet instant, seule l'expression de la protéine effectrice comprenant le polypeptide R-TrCP est maintenue activée dans les cellules de levure, et ce pour la totalité de la durée restante du procédé de criblage, c'est à dire jusqu'à la fin du procédé.
Description des modes de réalisation préférés du procédé de criblage Les modes de réalisation préférés du procédé de criblage de l'invention sont décrits ci-dessous, notamment en relation avec la description des aspects fonctionnels et structurels des divers moyens permettant la mise en oeuvre dudit procédé.
De manière générale, la protéine détectable qui est comprise dans la protéine de fusion IxBa-protéine détectable peut être de toute nature, dès lors que sa présence, peut être spécifiquement détectée dans les cellules de levure avant sa protéolyse, et que la présence de formes protéolysées de la protéine détectable, notamment de fragments peptidiques produits par protéolyse de ladite protéine détectable, ne sont pas détectées par le moyen de détection spécifique qui est choisi.
Comme cela se comprend aisément, l'activité ubiquitine ligase du complexe protéique artificiel comprenant la protéine [3-TrCP est suivie, selon le procédé de l'invention, en mesurant son effet sur la stabilité de la protéine de fusion IKBa-protéine détectable. L'ajout de chaînes de polyubiquitine sur le facteur IxBa, par le complexe SCF artificiel hommellevure, entraîne la reconnaissance du facteur IkBa ubiquitiné par le protéasome et sa dégradation rapide par ce dernier. Grâce à l'expression dans les cellules de levure du facteur IxBa sous forme de protéine fusion, la dégradation de la protéine fusion contenant IxBa peut être suivie en temps réel, par détection de la protéine détectable non protéolysée. Selon la nature de la protéine détectable fusionnée à IxBa, la dégradation de la protéine fusion peut être suivie par des techniques connues en soi, notamment des techniques de mesure de fluorescence à l'aide, soit d'un cytomètre de flux, soit d'un lecteur de microplaques, soit d'un fluorimètre, soit grâce à un microscope à fluorescence, ou encore par des techniques colorimétriques, enzymatiques ou immunologiques. A titre illustratif, la protéine détectable peut être choisie parmi un antigène, une protéine fluorescente ou une protéine ayant une activité enzymatique.
Lorsque la protéine détectable consiste en un antigène, elle peut être tout type d'antigène, dès lors que des anticorps spécifiques de cet antigène sont déjà accessibles ou, alternativement, peuvent être préparés, selon toute technique d'obtention d'anticorps, notamment d'anticorps polyclonaux ou monoclonaux, bien connues de l'homme du métier. Préférentiellement, dans ce cas, la protéine détectable consiste en un antigène de faible taille, qui n'est pas susceptible d'interférer avec la reconnaissance du facteur IxBa par le polypeptide [3-TrCP. Ainsi, préférentiellement, on utilise, comme antigène, un peptide ayant une chaîne de 7 à 100 acides aminés de longueur, mieux de 7 à 50 acides aminés de longueur, et encore mieux de 7 à 30 acides aminés de longueur, par exemple 10 acides aminés de longueur. A titre illustratif, on peut utiliser l'antigène HA de séquence [NH2-YPYDVPDYACOOH] SEQ ID N 17, ou encore un antigène FLAG de séquence [NH2-DYKDDDDK-COOH] SEQ ID N 18 (monomère FLAG) ou de séquence [NH2-MDYKDHDGDYKDHDIDYKDDDDK-000H] SEQ ID N 19 (trimère FLAG) Dans ce cas, on utilise, pour quantifier la protéine détectable à l'étape (b) du procédé, un anticorps qui reconnaît spécifiquement l'antigène compris dans la protéine de fusion, cetanticorps étant marqué directement ou indirectement. La quantification est alors réalisée par mesure du signal détectable produit par les complexes formés, dans les cellules de levure, entre l'anticorps marqué et la protéine de fusion IKBa-antigène. Ainsi, à l'étape (b), lorsque la première protéine détectable est un antigène, on quantifie ladite première protéine détectable par détection des complexes formés entre ladite protéine et des anticorps la reconnaissant.
Lorsque la protéine détectable consiste en une protéine à fluorescence intrinsèque, elle est notamment choisie parmi la protéine GFP ou l'un de ses dérivés, la protéine YFP ou l'un de ses dérivés, et la protéine dsRED. Parmi les protéines dérivées de la protéine GFP, on peut utiliser notamment l'une quelconque des protéines connues sous les noms GFPMut3, Venus, Sapphire etc. Une liste illustrative des protéines GFP susceptibles d'être utilisées dans le procédé de l'invention est présentée dans le Tableau 3, à la fin de la présente description. Dans ce cas, on quantifie la protéine détectable à l'étape (b) du procédé par mesure du signal de fluorescence qui est émis par la protéine de fusion bau-protéine fluorescente à l'aide de tout dispositif adapté. Ainsi, à l'étape (b), lorsque la première protéine détectable est une protéine fluorescente, on quantifie ladite protéine détectable par une mesure du signal de fluorescence émis par ladite protéine.
Lorsque la protéine détectable consiste en une protéine à activité enzymatique, ladite protéine détectable est choisie notamment parmi la luciférase et la f3-lactamase. Dans ce cas, on quantifie la protéine détectable à l'étape (b) du procédé par mesure de la quantité du ou des composés produits par la conversion du substrat par l'enzyme. Lorsque le produit de l'activité enzymatique est coloré, la mesure peut être réalisée par colorimétrie. Lorsque le produit de l'activité enzymatique est fluorescent, on mesure l'intensité du signal de fluorescence qui est émis par ledit produit, à l'aide de tout dispositif de mesure de la fluorescence adapté. Ainsi, à l'étape (b), lorsque la première protéine détectable est une protéine ayant une activité enzymatique, on quantifie ladite protéine détectable par une mesure de la quantité de substrat transformé par ladite protéine.
Dans un mode de réalisation particulier du procédé de criblage selon l'invention, la protéine comprenant le polypeptide R-TrCP consiste également en une protéine de fusion comprenant, outre le polypeptide f3TrCP, également une protéine détectable. Dans ce mode de réalisation particulier, on peut suivre dans le temps le niveau d'expression du polypeptide R-TrCP dans les cellules de levure, en détectant, et facultativement en quantifiant, la protéine détectable contenue dans la protéine comprenant le polypeptide f3- TrCP. Ce mode de réalisation particulier est principalement mis en oeuvre lorsque l'on contrôle positivement ou négativement l'expression de la protéine comprenant le polypeptide I3-TrCP, aux différentes sous-étapes de l'étape (a) du procédé. La protéine détectable contenue dans le polypeptide comprenant le polypeptide 13-TrCP est choisie parmi un antigène, une protéine fluorescente et une protéine ayant une activité enzymatique. Préférentiellement, la protéine détectable contenue dans la protéine comprenant le polypeptide [3-TrCP est distincte de la protéine détectable contenue dans la protéine de fusion IxBa-protéine détectable, ce qui permet de suivre séparément l'expression du facteur IKB et l'expression du polypeptide R-TrCP dans les cellules de levure.
Comme cela a déjà été précédemment dans la description, la dégradation du polypeptide cible IKBa humain par le protéasome des cellules de levure est réalisée uniquement lorsque la protéine de fusion IKBa-protéine détectable et la protéine comprenant le polypeptide [3-TrCP humain sont toutes les deux co-localisées dans le noyau des cellules de levure.
En particulier, le demandeur a montré, comme cela est illustré dans les exemples, que le facteur IcBa est phosphorylé sur le résidu sérine en position 32 exclusivement dans le noyau des cellules de levure, alors qu'il ne subit pas de phosphorylation dans le cytoplasme. A posteriori, l'événement de phosphorylation du résidu sérine en position 32 du facteur IKBa, dans les cellules de levure, permet d'expliquer, au moins partiellement, la raison pour laquelle, dans les cellules de levure, l'ubiquitination de ce facteur ne peut être réalisée que dans le noyau cellulaire.
En conséquence, pour réaliser le procédé de criblage de l'invention, on met en oeuvre tout moyen permettant la localisation nucléaire à la fois de la protéine de fusion IKBu-protéine détectable et de la protéine comprenant le polypeptide I3-TrCP.
Préférentiellement, la protéine de fusion IKBa-protéine détectable et la protéine comprenant le polypeptide [3-TrCP comprennent toutes les deux un peptide permettant de localiser ces deux protéines dans le noyau des cellules de levure.
Ainsi, de manière préférée, la protéine de fusion IxBa-protéine détectable et la protéine comprenant le polypeptide (3-TrCP comprennent toutes les deux, dans leur séquence en acides aminés, au moins un peptide de localisation nucléaire ( NLS ) qui est fonctionnel dans les cellules eucaryotes, et plus particulièrement dans les cellules de levure. Chacune des protéines comprend, indépendamment l'une de l'autre, 1, 2, 3 ou 4 peptides de localisation nucléaire. Selon un autre aspect, chacune de ces protéines comprend, indépendamment l'une de l'autre de 1 à 4 copies d'un peptide de localisation nucléaire.
Préférentiellement, le ou les peptide(s) de localisation nucléaire sont choisis parmi les peptides suivants: io - le peptide NLS dérivé du grand antigène du virus SV40 ayant la séquence en acides aminés SEQ ID N 24; le peptide NLS de la nucléoplasmine ayant la séquence en acides aminés SEQ ID N 20; - un peptide NLS du répresseur alpha 2 de levure choisi parmi les 15 séquences SEQ ID N 21 et SEQ ID N 22; - un peptide NLS de la protéine Gal4 de levure ayant la séquence en acides aminés SEQ ID N 23.
Dans les exemples, la protéine de fusion IKBa-protéine détectable et la protéine comprenant le polypeptide 13-TrCP comprennent toutes les deux 20 le peptide de localisation nucléaire de séquence SEQ ID N 24.
De préférence, le polypeptide de fusion IkBa-protéine détectable consiste en une chaîne d'acides aminés qui comprend, de l'extrémité NH2-terminale vers l'extrémité COOH-terminale, respectivement (i) la séquence de la protéine détectable, (ii) la séquence NLS de localisation nucléaire et (iii) la séquence de IkBa.
Tout d'abord, dans le polypeptide fusion, la séquence de la GFP et la séquence NLS peuvent être liées directement entre elles, par une liaison peptidique. Egalement, la séquence NLS et la séquence de IkBa peuvent être liées directement entre elles, par une liaison peptidique.
Selon un autre aspect, la séquence de GFP et la séquence NLS peuvent être séparées, dans la séquence du polypeptide de fusion, par un premier peptide espaceur.
Selon encore un autre aspect, la séquence NLS et la séquence de IkBa peuvent être séparées, dans la séquence du polypeptide de fusion, par un second peptide espaceur.
Avantageusement, le ou les peptide(s) espaceur(s), lorsqu'il est (sont) s présent(s), a (ont) une taille allant de 1 à 30 acides aminés, préférentiellement de 1 à 15 acides aminés, et de manière tout à fait préférée de 2 à 10 acides aminés de longueur.
Selon un mode de réalisation préféré, la protéine comprenant le polypeptide IxBa consiste en la protéine de séquence en acides aminés SEQ ID N 2, qui peut être codée par l'acide nucléique de séquence SEQ ID N 1. La protéine de séquence SEQ ID N 2 consiste, de l'extrémité NH2terminale vers l'extrémité COOH-terminale, respectivement en (i) la séquence de la protéine détectable GFP(yEGFP3) allant de l'acide aminé en position 1 jusqu'à l'acide aminé en position 240, (ii) un premier peptide espaceur allant de l'acide aminé en position 241 jusqu'à l'acide aminé en position 243, (iii) le peptide NLS du grand antigène T de SV40 allant de l'acide aminé en position 244 jusqu'à l'acide aminé en position 250, (iv) un second peptide espaceur allant de l'acide aminé en position 251 jusqu'à l'acide aminé en position 255 et (v) le polypeptide IKBa allant de l'acide aminé en position 256 jusqu'à l'acide aminé en position 572. L'acide nucléique de séquence SEQ ID N 1 consiste, de l'extrémité 5' vers l'extrémité 3', respectivement en (i) la séquence codant la protéine détectable GFP(yEGFP3) allant du nucléotide en position 1 jusqu'au nucléotide en position 714, (ii) la séquence codant un premier peptide espaceur allant du nucléotide en position 715 jusqu'au nucléotide en position 729, (iii) la séquence codant le peptide NLS du grand antigène T de SV40 allant du nucléotide en position 730 jusqu'au nucléotide en position 750, (iv) la séquence codant un second peptide espaceur allant du nucléotide en position 751 jusqu'au nucléotide en position 765 et (v) la séquence codant le polypeptide IxBa allant du nucléotide en position 766 jusqu'au nucléotide en position 1719.
Préférentiellement, la protéine comprenant le polypeptide I3TrCP consiste en une chaîne d'acides aminés qui comprend, de l'extrémité NH2-terminale vers l'extrémité COOH-terminale, respectivement (i) la séquence d'une seconde protéine détectable, (ii) la séquence NLS de localisation nucléaire, et (iii) la séquence de 13TrCP.
Selon un mode de réalisation préféré, la protéine comprenant le polypeptide R-TrCP consiste en la protéine de séquence en acides aminés SEQ ID N 4, qui est codée par l'acide nucléique de séquence SEQ ID N 3. La protéine de séquence SEQ ID N 4 consiste, de l'extrémité NH2terminale vers l'extrémité COOH-terminale, respectivement en (i) la séquence de la protéine détectable GFP(yEGFP3) allant de l'acide aminé en position 1 jusqu'à l'acide aminé en position 240, (ii) un premier peptide espaceur allant io de l'acide aminé en position 241 jusqu'à l'acide aminé en position 243, (iii) le peptide NLS du grand antigène T de SV40 allant de l'acide aminé en position 244 jusqu'à l'acide aminé en position 250, (iv) un second peptide espaceur allant de l'acide aminé en position 251 jusqu'à l'acide aminé en position 255 et (v) le polypeptide R-TrCP allant de l'acide aminé en position 256 jusqu'à l'acide aminé en position 860. L'acide nucléique de séquence SEQ ID N 3 consiste, de l'extrémité 5' vers l'extrémité 3', respectivement en (i) la séquence codant la protéine détectable GFP(yEGFP3) allant du nucléotide en position 1 jusqu'au nucléotide en position 714, (ii) la séquence codant un premier peptide espaceur allant du nucléotide en position 715 jusqu'au nucléotide en position 729, (iii) la séquence codant le peptide NLS du grand antigène T de SV40 allant du nucléotide en position 730 jusqu'au nucléotide en position 750, (iv) la séquence codant un second peptide espaceur allant du nucléotide en position 751 jusqu'au nucléotide en position 765 et (v) la séquence codant le polypeptide 33-TrCP allant du nucléotide en position 766 jusqu'au nucléotide en position 2538.
Selon encore un autre aspect, le procédé de criblage selon l'invention est caractérisé en ce que les cellules de levure recombinantes sont transformées avec: (1) un premier polynucléotide qui comprend (a) un cadre de lecture ouvert codant (i) la protéine de fusion comprenant le polypeptide IKBa, (ii) une séquence de localisation nucléaire et (iii) une première protéine détectable, et (b) une séquence régulatrice fonctionnelle dans des cellules de levure qui dirige l'expression dudit cadre de lecture ouvert; et (2) un second polynucléotide qui comprend (a) un cadre de lecture ouvert codant (i) une protéine comprenant le polypeptide R-TrCP, (ii)une séquence de localisation nucléaire, et (iii) une séquence régulatrice fonctionnelle dans des cellules de levure qui dirige l'expression dudit cadre de lecture ouvert; Le polynucléotide (1) ci-dessus peut consister en l'acide nucléique de séquence SEQ ID N 1.
Le polynucléotide (2) ci-dessus peut consister en l'acide nucléique de séquence SEQ ID N 3.
io Acides nucléiques, vecteurs d'expression et cellules de levure transformées préférés selon l'invention.
On synthétisé selon l'invention des acides nucléiques, lesquels, lorsqu'ils sont introduits dans des cellules de levure, provoquent l'expression respectivement de la protéine de fusion IxBa-protéine détectable et de la protéine comprenant le polypeptide f3-TrCP dans ces cellules, et plus particulièrement dans le noyau des cellules de levure.
Tout d'abord, chacun des acides nucléiques synthétisés comprend une séquence codante, qui est aussi désignée cadre de lecture ouvert ou ORF . qui code la protéine d'intérêt, respectivement soit la protéine de fusion IKBa-protéine détectable, soit la protéine comprenant le polypeptide J3-TrCP, ladite protéine d'intérêt comprenant aussi dans sa séquence au moins la séquence d'un peptide de localisation nucléaire. Des exemples illustratifs des acides nucléiques selon l'invention sont les acides nucléiques de séquence SEQ ID N 1 et SEQ ID N 3, dont la structure a été décrite
précédemment dans la description.
Chacun des acides nucléiques comprend aussi une séquence régulatrice comprenant un promoteur fonctionnel dans les cellules de levure.
Selon un premier mode de réalisation préféré, le promoteur fonctionnel dans les cellules de levure consiste en un promoteur constitutif qui peut être choisi parmi les promoteurs PGK1, ADH1, TDH3, LEU2 et TEF1.
Préférentiellement, dans le but de contrôler précisément les périodes durant lesquelles sont exprimées respectivement la protéine de fusion IxBa- protéine détectable et la protéine comprenant le polypeptide R-TrCP, chacun des acides nucléiques comprend, en tant que promoteur, un promoteur dit inductible , c'est à dire un promoteur fonctionnel dans les cellules de levure et qui est sensible à l'action d'un agent inducteur. On peut utiliser un promoteur lequel, lorsque l'agent inducteur est ajouté dans le milieu de culture des cellules de levure, active l'expression de la séquence codant la protéine d'intérêt placée sous son contrôle. On peut aussi utiliser un promoteur lequel, lorsque l'agent inducteur est ajouté dans le milieu de culture des cellules de levure, réprime ou bloque l'expression de la séquence codant la protéine d'intérêt placée sous son contrôle.
Ainsi, selon un second mode de réalisation préféré d'un promoteur, le w promoteur inductible qui est contenu dans les acides nucléiques de l'invention est choisi parmi CUP1, GALS, METS, MET25, MET28, SAM4 et PHO5.
Dans un mode de réalisation préféré, l'acide nucléique ou le polynucléotide qui code la protéine de fusion IKBa-protéine détectable 1s comprend la séquence régulatrice GAL 1, qui active l'expression du cadre de lecture ouvert codant la protéine de fusion comprenant le polypeptide le polypeptide IKBa en présence de galactose.
Ainsi, dans un mode de réalisation avantageux du procédé de criblage de l'invention, l'expression de la protéine fusion comprenant le facteur IKBa est réalisée de manière temporaire durant l'essai de criblage. Apres avoir été induite durant un temps fixé pouvant varier de 20 minutes à 24 heures, l'expression de la protéine contenant IKBa est spécifiquement stoppée (dans une expérience connue par l'homme du métier sous le nom de promoter shut off ) avant d'exposer les cellules aux molécules devant être criblées.
Cet arrêt de l'expression est obtenu par l'addition (ou la suppression) dans le milieu de culture d'une molécule pouvant réprimer l'activité du promoteur contrôlant l'expression de la protéine tripartite contenant IKBa.
Ainsi, lorsque la protéine de fusion IKBa-protéine détectable est exprimée sous le contrôle du promoteur du gène GAL1, alors l'expression de ce promoteur est réprimée en ajoutant du glucose à la concentration finale de 2 % dans le milieu de culture. L'arrêt de la néo-synthèse de la protéine de fusion comprenant IKBa permet de mesurer sa stabilité en temps réel, en déterminant par exemple la fluorescence des cellules de levure au cours du temps après l'arrêt de synthèse, dans le mode de réalisation dans lequel ladite protéine de fusion contient une protéine détectable à fluorescence intrinsèque, comme la GFP ou une protéine dérivée de la GFP.
Dans un autre mode particulièrement avantageux du procédé de criblage selon l'invention, l'expression temporaire de la protéine fusion comprenant le facteur IKBa est associée à une expression également temporaire de la protéine comprenant le polypeptide R-TrCP. Dans ce mode de réalisation, la protéine de fusion comprenant le polypeptide IKBa est exprimée pendant la période de temps T1 choisie, par exemple en utilisant des cellules de levure qui expriment la protéine de fusion comprenant le io polypeptide IxBa sous le contrôle du promoteur GAL1 et qui sont cultivées en présence de 0, 5 à 4 % de galactose pendant la durée Ti. A l'instant t2, l'expression de la protéine comprenant le polypeptide RTrCP est induite. Cette induction est par exemple obtenue, chez des cellules exprimant la protéine contenant R-TrCP sous le contrôle du promoteur du gène CUP1, en ajoutant dans le milieu de culture une concentration de sulfate de cuivre comprise entre 0.05 mM et 5 mM. A la fin de la période de temps T1, l'expression de la protéine de fusion comprenant IKBa est stoppée en ajoutant dans le milieu de culture du glucose à une concentration comprise entre 0.5 et 2 %. Cet ajout de glucose n'a pas d'effet sur l'expression de la protéine comprenant 33TrCP à partir du promoteur du gène CUP1. Ainsi dans ce mode de mise oeuvre du procédé, l'accumulation de l'ubiquitine ligase comprenant R- TrCP est poursuivie, alors que la néo-synthèse de la protéine de fusion comprenant IKBa est stoppée.
Ainsi, dans un mode de réalisation particulier du procédé de criblage selon l'invention, l'acide nucléique ou le polynucléotide qui code la protéine comprenant le polypeptide 13-TrCP comprend la séquence régulatrice CUPI, qui active l'expression du cadre de lecture ouvert codant une protéine comprenant le polypeptide [3-TrCP en présence de sulfate de cuivre.
Ainsi, l'invention a aussi pour objet une cassette d'expression fonctionnelle dans les cellules de levure comprenant un polynucléotide codant qui comprend un cadre de lecture ouvert codant la protéine de fusion comprenant le polypeptide le polypeptide IKBa et au moins une première protéine détectable, et une séquence régulatrice fonctionnelle dans des cellules de levure qui dirige l'expression dudit cadre de lecture ouvert.
Une telle cassette d'expression peut notamment consister en l'acide nucléique de séquence SEQ ID N 1 selon l'invention, qui code la protéine de fusion GFP-NLS-IkBa de séquence SEQ ID N 2.
L'invention concerne aussi une cassette d'expression fonctionnelle dans les cellules de levure comprenant un polynucléotide qui comprend un cadre de lecture ouvert codant une protéine comprenant le polypeptide 13-TrCP et une séquence régulatrice fonctionnelle dans des cellules de levure qui dirige l'expression dudit cadre de lecture ouvert.
Une telle cassette d'expression peut notamment comprendre l'acide 10 nucléique de séquence SEQ ID N 3 selon l'invention, qui code la protéine de fusion GFP-NLS-pTrCP de séquence SEQ ID N 4.
Selon un premier mode de réalisation préféré d'une telle cassette d'expression, la séquence régulatrice comprend un promoteur inductible fonctionnel dans les cellules de levure, tel qu'un promoteur choisi parmi les promoteurs PGK1, ADHI, TDH3, LEU2 et TEF1.
Selon un second mode préféré d'une telle cassette d'expression, dans l'une ou l'autre des cassettes d'expression ci-dessus, ou dans les deux, la séquence régulatrice contenue dans ledit polynucléotide, la séquence régulatrice contenue dans le second polynucléotide, ou les deux séquences régulatrices, comprenne(nt) un promoteur fonctionnel dans les cellules de levure et qui est sensible à l'action d'un agent inducteur, qui est aussi appelé promoteur inductible.
De manière tout à fait préférée, le promoteur inductible fonctionnel dans les cellules de levure est choisi parmi CUP1, GAL 1, MET3, MET25, 25 MET28, SAM4 et PHO5.
Selon un autre mode de réalisation avantageux du procédé de criblage selon l'invention, les cellules de levure sont transformées par (i) l'acide nucléique ou le polynucléotide comprenant la séquence codant la protéine de fusion IKBa-protéine détectable ainsi que par (ii) l'acide nucléique ou le polynucléotide codant la protéine comprenant le polypeptide (3-TrCP, qui se présentent sous une forme non intégrée, par exemple sous la forme de vecteurs fonctionnels dans les cellules de levure et qui portent au moins une origine de réplication fonctionnelle dans les cellules de levure.
Dans encore une autre mode de réalisation du procédé de criblage selon l'invention, les cellules de levure recombinantes possèdent l'acide nucléique ou le polynucléotide comprenant la séquence codant la protéine de fusion IWBa-protéine détectable ainsi que l'acide nucléique ou le polynucléotide codant la protéine comprenant le polypeptide p-TrCP sous une forme intégrée dans leur génome, comme cela est illustré dans les
exemples.
De manière générale, pour la mise en oeuvre du procédé de criblage de l'invention, il est avantageux d'utiliser des cellules de levures qui possèdent une bonne perméabilité membranaire, notamment une bonne perméabilité membranaire pour les agents à tester par le procédé.
Pour la mise en oeuvre du mode de réalisation préféré du procédé de criblage de l'invention dans lequel l'expression des deux protéines d'intérêt est réalisée sous le contrôle de promoteurs inductibles, il est également avantageux d'utiliser des cellules de levures qui possèdent une bonne perméabilité membranaire pour les composés inducteurs vis-à-vis desquels lesdits promoteurs inductibles sont sensibles Ainsi, dans un autre mode de réalisation préféré du procédé de criblage de l'invention, on utilise des souches de levure dont le génome comprend une à plusieurs mutations qui augmentent la perméabilité aux produits à tester, telles que des mutations inactivant les gènes PDR1 et PDR3, deux gènes codant des facteurs transcriptionnels qui chez la levure contrôlent l'expression de transporteurs insérés dans la membrane plasmique (Vidal et al, 1999, Nourani et aI, 1997).
Préférentiellement, on utilise des souches de levure possédant le fond génétique de la souche W303 de la levure Saccharomyces cerevisiae décrite par Bailis et al. (1990), ou tout autre souche caractérisée de la dite levure Saccharomyces cerevisiae.
La transformation des cellules de levure par de l'ADN exogène est préférentiellement en utilisant des techniques connues de l'homme du métier, notamment la technique décrite par Schiestl et al. (1989). Les constructions des différentes souches de levure ont été réalisées en employant des techniques de génétique (croisement, sporulation dissection des asques et analyse phénotypique des spores) connues et décrites notamment par Sherman et aI. (1979) et les techniques de génétique inverse décrites notamment par Rothstein (1991).
Conformément à l'invention, les levures sont transformées préférentiellement par des plasmides construits selon des techniques de biologie moléculaire classiques, notamment selon les protocoles décrits par Sambrook et al. (1989) et Ausubel et al. (1990-2004).
Ainsi, un autre objet de l'invention consiste en un vecteur d'expression caractérisé en ce qu'il comprend une cassette d'expression telle que définie dans la présente description.
Un premier vecteur conforme à l'invention est le vecteur pCSY226-NLS-IxBa qui est décrit dans les exemples, et qui a servi à la construction de io la souche de levure CYS135 déposée à la Collection Nationale de Cultures de microorganismes de l'Institut Pasteur de Paris sous le numéro d'accès 1-3187.
Un second vecteur conforme à l'invention est le vecteur pCSY226-NLS-f3TrCP qui est décrit dans les exemples, et qui a servi à la construction de la souche de levure CYS135 déposée à la Collection Nationale de Cultures de microorganismes de l'Institut Pasteur de Paris sous le numéro d'accès 1-3187.
La présente invention est également relative à une souche de levure recombinante comprenant, sous une forme intégrée dans son génome, (i) un premier polynucléotide qui comprend un cadre de lecture ouvert codant la protéine de fusion comprenant le polypeptide le polypeptide IxBa et au moins une première protéine détectable, et une séquence régulatrice fonctionnelle dans des cellules de levure qui dirige l'expression dudit cadre de lecture ouvert; et (ii) un second polynucléotide qui comprend un cadre de lecture ouvert codant une protéine comprenant le polypeptide R-TrCP et une séquence régulatrice fonctionnelle dans des cellules de levure qui dirige l'expression dudit cadre de lecture ouvert; En particulier, l'invention est relative à une souche de levure recombinante conforme à la définition ci-dessus, qui consiste en la souche de levure CYS135 déposée à la Collection Nationale de Cultures de microorganismes de l'Institut Pasteur de Paris (CNCM) sous le numéro d'accès 1-3187.
L'invention concerne aussi une trousse ou kit pour le criblage d'agents 35 modulant l'ubiquitination de la protéine IkBa par un complexe protéique fonctionnel ubiquitine ligase comprenant la protéine f3-TrCP, caractérisé en ce qu'il comprend: (i) un premier vecteur d'expression comprenant une cassette d'expression codant la protéine de fusion comprenant le polypeptide IkBa 5 telle que définie ci-dessus; et (ii) un second vecteur d'expression comprenant une cassette d'expression codant la protéine comprenant le polypeptide BTrCP telle que définie ci- dessus.
L'invention est aussi relative à une trousse ou kit pour le criblage d'agents modulant l'ubiquitination de la protéine IkBa par un complexe protéique fonctionnel ubiquitine ligase comprenant la protéine f -TrCP, caractérisé en ce qu'il comprend des cellules de levures recombinantes comprenant, sous une forme insérée dans leur génome, respectivement: (i) une cassette d'expression codant la protéine de fusion comprenant le polypeptide IkBa telle que définie ci-dessus; et (ii) une cassette d'expression codant la protéine comprenant le polypeptide BTrCP telle que définie ci-dessus.
Préférentiellement, la trousse ou kit ci-dessus comprend des cellules de levures recombinantes de la souche de levure CYS 135 déposée à la 20 CNCM sous le numéro d'accès II-3187.
Le procédé de criblage selon l'invention, permet de visualiser l'activité de l'ubiquitine ligase SCFR-TrcP vis à vis du facteur IxBa humain, substrat de la voie ubiquitine protéasome de dégradation des protéines. Ce procédé est particulièrement avantageux pour cribler des molécules ou agents aptes à agir sur les pathologies liées à l'activation des facteurs NF-xB et aux dysfonctionnements de la voie NF-1<B chez l'homme tels que les syndromes inflammatoires et immuns, certains cancers, certaines maladies comme la reperfusion injury et les infections fongiques, bactériennes et virales.
Les principaux avantages du procédé de criblage de l'invention sont notamment les suivants: - la simplicité de mise en oeuvre: l'induction del'activité de l'ubiquitine ligase SCFP-TrcP vis -à-vis du facteur IxBa est réalisée simplement grâce à l'expression contrôlée des facteurs humains IxBa et (i- TrCP dans les cellules de levure. De plus, lorsque le facteur IxBa est exprimé en tant que protéine hybride en fusion avec une protéine à fluorescence intrinsèque, telle que la GFP, l'activité de l'ubiquitine Iigase SCFR-TrcP artificielle vis-à-vis du facteur IKBa est directement mesurée par la quantification de la fluorescence émise par la protéine hybride. De même lorsque le facteur IKBa est exprimé en tant que protéine hybride en fusion avec une protéine telle que la luciférase, s l'activité de l'ubiquitine Iigase SCFR-TrcP artificielle vis-à-vis du facteur IxBa est directement mesurée par la quantification de la luminescence émise par la protéine hybride en présence d'un substrat comme la fluorescéine.
- l'adéquation avec un contexte thérapeutique: l'activité de l'ubiquitine ligase SCFR-TrcP artificielle vis-à-vis du facteur IxBa est suivie selon un test io fonctionnel réalisé dans des cellules entières. Le procédé de criblage in vitro selon l'invention permet donc de sélectionner des molécules capables d'activer ou d'inhiber la dégradation d'IKBa dans un contexte semblable à celui de leur usage thérapeutique final.
- la spécificité: bien que réalisé in vitro dans la cellule, le procédé de criblage selon l'invention est spécifique, car il repose sur la coexpression, dans un organisme hétérologue à l'organisme humain, des deux protéines humaines IxBa et R-TrCP. Les molécules sélectionnées grâce au procédé de criblage de l'invention seront spécifiques de ce couple ubiquitine ligase R-TrCP / protéine substrat IKBa, et ne seront donc pas des molécules sélectionnées en raison, par exemple, de leur capacité à interférer avec l'une des nombreuses voies de signalisation induisant la dégradation d'IKBa dans les cellules humaines. En effet, lors de la mise en oeuvre du procédé de criblage selon l'invention, la dégradation d'IiBa, par l'intermédiaire de l'ubiquitine ligase SCFR"TrcP artificielle, est induite par une voie métabolique tout à fait artificielle et totalement reproductible, comme par exemple, l'ajout de glucose pour bloquer l'activité du promoteur GAL1, lorsque IKBa est exprimé sous le contrôle de ce promoteur.
- la stabilité des souches de levure recombinantes: les techniques d'intégration dans un endroit choisi d'un chromosome de levure, et de remplacement ciblé de gènes permettent la construction de souches de levures recombinantes exprimant les protéines humaines' hybrides contenant soit IKBa soit R-TrCP à partir des chromosomes de la levure. Ces souches de levure recombinantes sont donc génétiquement stables et peuvent être multipliées et conservées indéfiniment.
- la rapidité de croissance et de criblage: la levure est un microorganisme à croissance rapide et rendement élevé. En particulier, le procédé de criblage de l'invention est préférentiellement réalisé en cultivant les cellules de levure dans un milieu de culture complet, dans lequel la croissance des cellules de levure est particulièrement rapide et le rendement particulièrement élevé, ce qui permet l'obtention d'une grande quantité de cellules de levure recombinantes pour la réalisation simultanée d'un nombre important de tests de criblage.
- le faible coût: la levure est un microorganisme dont la culture, le io stockage et la caractérisation sont peu onéreux, - l'automatisation du procédé de criblage de l'invention: la levure est un microorganisme dont la culture, réalisée dans un faible volume de milieu, à température basse, en atmosphère classique, dans l'air, est tout particulièrement adapté à l'automatisation (robotisation) des procédés de criblage.
Le procédés de criblage selon l'invention sont utiles notamment pour sélectionner et caractériser des agents actifs tels que des agents antiinflammatoires, anticancéreux, anti-viraux, des agents contre des infections fongiques, bactériennes ou virales.
La présente invention est en outre illustrée, sans pour autant être limitée, par les figures et les exemples suivants.
FIGURES
La fiqure 1 illustre la possibilité pour les protéines Skpl de levure et R-TrCP 25 humaine d'interagir dans les cellules de levure.
En abscisse: les plasmides présents dans les cellules de levure transformées; En ordonnée, l'activité I3-galactosidase, exprimée en nanomoles de substrat transformé par minute et par mg de protéines cellulaires.
La fiqure 2 illustre les localisations dans les cellules de levures des protéines humaines IKBa et [3-TrCP selon qu'elles sont fusionnées ou non à une séquence NLS de SV40.
Ligne supérieure: clichés de microscopie à fluorescence de coloration de 35 l'ADN des noyaux cellulaires avec le colorant Hoechst 333-42.
Ligne inférieure: clichés de microscopie à fluorescence permettant de localiser dans les cellules l'expression de la GFP.
A: Cellules transformées par le vecteur GFP-NLS-13-TrCP; B: cellules transformées par le vecteur GFP-R-TrCP; C: cellules transformée par le 5 vecteur GFP-NLS-IKBa; D: cellules transformées par le vecteur GFP- IxBa.
La figure 3 illustre comment l'adressage de la protéine humaine IxBa dans le noyau des cellules de levure induit sa phosphorylation sur les sérines 32 et 36.
La figure représente un gel d'électrophorèse des protéines cellulaires des souches de levure recombinantes CYS22 et CYS126, respectivement.
La figure 4 illustre par une analyse au microscope d'épifluorescence, la dégradation de la protéine fusion tripartite GFP-NLS-IxBa dans des cellules de levure lorsque celles-ci expriment également la protéine fusion tripartite Flag-NLS-13-TrCP.
Les figures 4A à 4D représentent des clichés de microscopie par fluorescence: ligne supérieure, coloration de l'ADN des noyaux cellulaires avec le colorant Hoechst 333-42; ligne inférieure, clichés de microscopie à fluorescence permettant de localiser dans les cellules l'expression de la GFP.
Figure 4A: résultats obtenus avec la souche de levure recombinante CYS22; Figure 4B: résultats obtenus avec la souche de levure recombinante CYS61.
Figure 4C: résultats obtenus avec la souche de levure recombinante CYS126.
Figure 4D: résultats obtenus avec la souche de levure recombinante CYS 135.
En ordonnées: les différents temps après l'ajout de glucose dans les 30 cultures cellulaires, exprimés en minutes.
La figure 5 illustre par une quantification de la fluorescence émise, la dégradation de la protéine fusion tripartite GFP-NLS-IxBa dans des cellules de levure lorsque celles-ci expriment ou non la protéine fusion tripartite Flag- NLS-13-TrCP.
Les résultats sont illustrés pour les souches de levure recombinantes CYS135, CYS126, CYS61 et CYS22, respectivement, qui sont indiquées par des encadrés sur la figure.
En abscisse: temps écoulé après l'addition de glucose dans les cultures 5 cellulaires, exprimé en minutes; en ordonnée: moyenne de l'intensité du signal de fluorescence, exprimée en unités arbitraires de fluorescence.
La fiqure 6 illustre par une analyse biochimique de type Western Blotting, la dégradation de la protéine fusion tripartite GFP-NLS-IxBa dans des cellules 10 de levure lorsque celles-ci expriment également la protéine fusion tripartite Flag-NLS-5-TrCP.
Clichés de gels d'immuno-empreinte ( Western blotting ) révélés avec des anticorps anti-GFP et des anticorps anti-peptide FLAG En abscisse: temps écoulé après l'addition de glucose dans les cultures 15 cellulaires, exprimé en minutes.
Les résultats sont illustrés pour les souches de levure recombinantes suivantes: CYS22 (Figure 6A), CYS61 (Figure 6B), CYS126 (Figure 6C) et CYS135 (Figure 6D).
La fiqure 7 illustre par une analyse biochimique de type Western blotting, la dégradation de la protéine fusion tripartite mutante GFP-NLSIcBa[S3236A] dans laquelle les sites de phosphorylation Ser32 et Ser36 ont été remplacés par des résidus Ala, mutations qui dans des cellules humaines rendent la protéine non-dégradable.
Clichés de gels d'immuno-empreinte ( Western blotting ) révélés avec des anticorps anti-GFP et des anticorps anti-peptide FLAG En abscisse: temps écoulé après l'addition de glucose dans les cultures cellulaires, exprimé en minutes.
Les résultats sont illustrés pour les souches de levure recombinantes 30 suivantes: CYS138 (Figure 7A) et CYS139 (Figure 7B).
La fiqure 8 illustre par une analyse au microscope d'épifluorescence, la dégradation de la protéine fusion tripartite GFP-NLS-IxBa[S3236A] dans des cellules de levure lorsque celles-ci expriment également la protéine fusion tripartite Flag-NLS-13-TrCP.
Les figures 8A et 8B représentent des clichés de microscopie à fluorescence: ligne supérieure, coloration de l'ADN des noyaux cellulaires avec le colorant Hoechst 333-42; ligne inférieure, clichés de microscopie à fluorescence permettant de localiser dans les cellules l'expression de la GFP.
Figure 8A: résultats obtenus avec la souche de levure recombinante CYS138; Figure 8B: résultats obtenus avec la souche de levure recombinante CYS139.
En ordonnées: les différents temps après l'ajout de glucose dans les io cultures cellulaires, exprimés en minutes.
La fiqure 9 illustre par une quantification de la fluorescence émise, la dégradation de la protéine fusion tripartite GFP-NLS-IKBa[S3236A] dans les souches de levure décrites ci-dessus.
Les résultats sont illustrés pour les souches de levure recombinantes CYS138 et CYS139, respectivement, qui sont indiquées par des encadrés sur la figure.
En abscisse: temps écoulé après l'addition de glucose dans les cultures cellulaires, exprimé en minutes; en ordonnée: moyenne de l'intensité du 20 signal de fluorescence, exprimée en unités arbitraires de fluorescence.
EXEMPLES
Exemples 1 à 3: Construction des vecteurs recombinants selon l'invention.
A. MATERIEL ET METHODES DES EXEMPLES 1 A 3.
A.1. Récapitulatif des séquences de polynucléotide utilisées La séquence de la protéine IKBa est celle décrite dans Strausberg et al. (PNAS (1999), 99(26) : 16899-16903).
La séquence de la sous unité réceptrice [3-TrCP du complexe 3o ubiquitine ligase SCFR-TrcP est celle décrite dans Yaron et al. (Nature (1998) 396(6711) : 590-594).
La séquence du gène GFP d' Aequora victoria et de son produit la Green Fluorescent Protein mut3 dont la séquence est optimisée pour l'expression en levures (yEGFP3) (désignée ci-après sous le terme GFP) est celle décrite dans Cormack et al. (Gene (1996) 173 (1) : 33-38).
La séquence de localisation nucléaire NLS du grand antigène T codée par le virus SV40 est la traduction de la séquence nucléique; 5' ACCTCCAAAAAAGAAGAGAAAGGTCGAATT 3' (SEQ ID N 25).
La séquence du plasmide pRS306 est celle décrite dans Sikorski et Hieter (Genetics (1989) 122(1) : 19-27).
La séquence du plasmide pRS304 est celle décrite dans Sikorski et Hieter (Genetics (1989) 122(1) : 19-27).
io La séquence du plasmide pRS314 est celle décrite dans Sikorski et Hieter (Genetics (1989) 122(1) : 19-27).
La séquence du plasmide pRS316 est celle décrite dans Sikorski et Hieter (Genetics (1989) 122(1) : 19-27).
La séquence du plasmide pSH18-34 qui contient quatre opérateurs 15 LexA placé en amont du gène LacZ est celle décrite par Hanes et Brent (Cell (1989), 57:1275-1293) La séquence du plasmide pLexSkpl-1, qui permet l'expression de la protéine Skpl de levure fusionnée à la protéine bactérienne LexA, est celle décrite dans Patton et al. (Genes & Dev (1998) , 12:692-705) La séquence du plasmide pGAD13TrCP, qui permet l'expression de la protéine humaine 5-TrCP fusionnée au domaine activateur du facteur transcriptionnel Gal4 de levure est celle décrite dans Margottin et al. (Molec. Cell (1998), 1:565-574).
La séquence du promoteur du gène GAL1 de la levure S. cerevisiae 25 utilisé dans les descriptions qui suivent est celle décrite par Johnston et Davis (Mol. Cell. Biol. (1984) 4 (8) : 1440-1448).
La séquence du promoteur du gène MET3 de la levure S. cerevisiae utilisé dans les descriptions qui suivent est celle décrite dans Cherest et al. (Mol. Gen. Genet. (1987) 210 (2) : 307-313).
La séquence du promoteur du gène MET28 de la levure S. cerevisiae utilisé dans les descriptions qui suivent est celle décrite dans Kuras et al. (EMBO J. (1996) 15(10) : 2519-2529).
La séquence du promoteur du gène TEF1 de la levure S. cerevisiae utilisé dans les descriptions qui suivent est celle décrite par SchaaffGerstenschlager et al. (Eur. J. Biochem. (1993) 217 (1) : 487-492).
La séquence du promoteur du gène SAM4 de la levure S. cerevisiae utilisé dans les descriptions qui suivent est celle décrite par Thomas et al. (J. Biol. Chem. (2000) 275(52) : 40718-40724).
La séquence du promoteur du gène MET25 de la levure S. cerevisiae utilisé dans les descriptions qui suivent est celle décrite dans Kerjan et al. (Nucleic Acids Res.(1986) 14(20) : 7861-7871).
La séquence du promoteur du gène PHO5 de la levure S. cerevisiae utilisé dans les descriptions qui suivent est celle décrite par Feldmann et al. 15 (EMBO J. (1994) 13(24) : 5795-5809).
La séquence du promoteur du gène CUP1 de la levure S. cerevisiae utilisé dans les descriptions qui suivent est celle décrite par Karin et al. (PNAS (1984) 81(2) : 337-341).
La séquence du promoteur du gène PGK1 de la levure S. cerevisiae 20 utilisé dans les descriptions qui suivent est celle décrite par Boite et al. (Yeast (1992) 8(3) : 205-213).
La séquence du promoteur du gène ADH1 de la levure S. cerevisiae utilisé dans les descriptions qui suivent est celle décrite par Bennetzen et Hall (J. Biol. Chem. (1982) 257(6) : 3018-3025).
La séquence du promoteur du gène TDH3 de la levure S. cerevisiae utilisé dans les descriptions qui suivent est celle décrite par Arroyo et al. Non publié (1996) soumission directe au MIPS).
La séquence du promoteur du gène LEU2 de la levure S. cerevisiae utilisé dans les descriptions qui suivent est celle décrite par Rad et al. (Yeast 30 (1991) 7(5) : 533-538).
A.2. Conventions utilisées Les descriptions sont faites en utilisant la nomenclature et les règles typographiques en usage dans la communauté des biologistes spécialistes de la levure Saccharomyces cerevisiae.
- le nom de la forme sauvage d'un gène est donné en majuscule italique; exemple: GAL 1.
- le nom d'une forme mutante d'un gène est donné en minuscule italique, le numéro d'allèle si il est connu est précisé à la suite d'un tiret; exemple cupl-1.
io - le nom d'un allèle inactivé d'un gène est donné en minuscule suivi de 2 fois deux points suivi du nom du gène inactivant ex pprl::TRPI (dans cet exemple le gène inactivé pprl a été interrompu par le gène actif TRP1) .
Alternativement, le nom d'un gène inactivé peut être donné par le 15 symbole delta ; exemple gal4d.
- le nom de la protéine est celui du gène qui la code est donné en minuscule, excepté la première lettre qui est en majuscule ex GaI4 (alternativement on peut utiliser le même symbole suivi d'un p; exemple Gal4p).
A.3. Remarques préliminaires concernant la construction des plasmides L'ensemble des plasmides a été construit par des techniques de biologie moléculaire classiques selon des protocoles décrits par Sambrook et al. (in Molecular Cloning, Laboratory Manual, 2nd edition, (1989), Cold Spring Harbor, N. Y.) et Ausubel et al., (in Current Protocols in Molecular Biology, (1990-2004), John Wiley and Sons Inc, N.Y.). Le clonage, la propagation et la production d'ADN plasmidiques ont été réalisés dans la souche d'Escherichia col/ DH1OB.
EXEMPLE 1: Construction des plasmides permettant l'expression chez la levure des protéines fusions GFP-IxBa et GFP-NLS-IxBa.
Les plasmides suivants permettent l'expression chez la levure Saccharomyces cerevisiae de dérivés de la protéine humaine IxBa fusionnés à un variant de la Green Fluorescente Protéine (GFP) d'Aequora victoria. Selon le plasmide construit, les protéines fusions construites comprennent ou non la séquence de localisation nucléaire du grand antigène T du virus SV40. L'introduction de cette séquence permet l'adressage dans le compartiment nucléaire des protéines fusion qui la comprennent.
Un fragment de 620 paires de bases (pb) correspondant au promoteur du gène GAL1 (pGAL1) de la levure Saccharomyces cerevisiae a été amplifié par Polymerase Chain Reaction (PCR) à partir d'ADN génomique io d'une souche sauvage de S.cerevisiae X2180-1A, en utilisant les oligonucléotides pGAL1(Asp)Forw de séquence 5'- GCTGGGTACCTTAATAATCATATTACATGGCATTA-3 [SEQ ID N 6] et pGALI (EcoRl)Rev de séquence 5'GGCGGAATTCTATAGTTTTTTCTCCTTGACGTTA-3' [SEQ ID N 7].
Le fragment obtenu a été digéré par les enzymes de restriction Asp7181 et EcoRl et inséré dans le plasmide navette S.cerevisiae-E.coli pRS306 préalablement digéré par les enzymes Asp7181 et EcoRl, produisant le vecteur pRS306-pGAL1.
Un fragment de 720 paires de bases (pb) correspondant à un variant du gène codant pour la Green Fluorescent Protein (GFP) d'Aequora victoria, dont la séquence est optimisée pour l'expression en levures (yEGFP3), a été amplifié par Polymerase Chain Reaction (PCR) à partir du vecteur pUC19-yEGFP3, en utilisant les oligonucléotides GFPEcoRI5' de séquence 5'-GGTCGGAATTCATGTCTAAAGGTGAAGAATTATTC-3' [SEQ ID N 8] et PBamHI(Smal/Srfl Pstl)3' de séquence 5'-GGCGGGATCCGCCCGGGCTCTG CAGTTTGTACAATTCATCCATACC-3' [SEQ ID N 9] . Le fragment obtenu a été digéré par les enzymes de restriction BamHl et EcoRl et inséré dans le plasmide pRS306-pGAL1 préalablement digéré par les enzymes BamHl et EcoRI, produisant le vecteur pRS306-pGAL1-yEGFP3.
Un fragment de 340 paires de bases (pb) correspondant au terminateur du gène ADH1 (tADH1) de la levure Saccharomyces cerevisiae a été amplifié par Polymérase Chain Reaction (PCR) à partir d'ADN génomique d'une souche sauvage de S.cerevisiae X2180-1A, en utilisant les oligonucléotides TermADH1(NotlBstXl)5' de séquence 5'GGCGGCGGCCGCCACCGCGGTGGGCGAATTTCTTATGATTTATG-3' [SEQ ID N 10] et TermADH1(Sacl)3' de séquence 5'-GGCGGAGCTCTGGAAGAACGATTACAACAG-3' [SEQ ID N 11].
Le fragment obtenu a été digéré par les enzymes de restriction Sacl et Notl et inséré dans le plasmide pRS306-pGAL1-yEGFP3 préalablement digéré par les enzymes Sacl et Notl, produisant le vecteur pCSY226.
io Le gène codant pour la protéine IKBa a été purifiée à partir du plasmide pGad1318-IkBa par digestion par l'enzyme de restriction Xbal suivi d'un traitement avec le fragment de Klenow de l'ADN polymerase I afin de transformer l'extrémité cohésive en 3' du fragment en extrémité franche, puis d'une seconde digestion par l'enzyme de restriction BamHl pour l'extrémité 5' du gène. Le fragment a été cloné dans le plasmide pCSY226 préparé par une digestion par l'enzyme de restriction Kpnl, suivie d'un traitement avec le fragment de Klenow, puis d'une digestion par l'enzyme de restriction BamHl. Le vecteur produit a été appelé pCSY226-IiBa.
Une version de ce vecteur contient en plus la séquence d'adressage 20 nucléaire NLS. Celle-ci a été obtenue en synthétisant une paire d'oligonucléotides complémentaire de séquence NLS-5' : 5'ACCTCCAAAAAAGAAGAGAAAGGTCGAATT-3' [SEQ ID N 12], et NLS-3' : 5'-AATTCGACCTTTCTCTTCTTTTTTGGAGGT-3' [SEQ ID 25 N 26].
réhybridés pour former un ADN double brin. Ce fragment d'ADN a ensuite été incorporé dans le vecteur pCSY226-IKBa digéré par l'enzyme de restriction ScrFl pour donner le vecteur pCSY226-NLS-IKBa.
EXEMPLE 2: Construction des plasmides permettant l'expression chez la levure des protéines fusions GFP-R-TrCP et GFP-NLS-(3-TrCP.
Les plasmides suivants permettent l'expression chez la levure Saccharomyces cerevisiae de dérivés de la protéine humaine [3-TrCP fusionnés à un variant de la Green Fluorescente Protéine (GFP) d'Aequora victoria. Selon le plasmide construit, les protéines fusions construites comprennent ou non la séquence de localisation nucléaire du grand antigène T du virus SV40. L'introduction de cette séquence permet l'adressage dans le compartiment nucléaire des protéines fusion qui la comprennent.
s Un fragment de 620 paires de bases (pb) correspondant au promoteur du gène GAL1 (pGAL1) de la levure Saccharomyces cerevisiae a été amplifié par Polymerase Chain Reaction (PCR) à partir d'ADN génomique d'une souche sauvage de S.cerevisiae X2180-1A, en utilisant les oligonucléotides pGAL1(Asp)Forw de séquence io 5'-GCTGGGTACCTTAATAATCATATTACATGGCATTA-3' [SEQ ID N 6] et pGAL1(EcoRl)Rev de séquence 5'GGCGGAATTCTATAGTTTTTTCTCCTTGACGTTA-3' [SEQ ID N 7].
Le fragment obtenu a été digéré par les enzymes de restriction Asp7181 et EcoRl et inséré dans le plasmide navette S.cerevisiae-E.coli pRS306 préalablement digéré par les enzymes Asp7181 et EcoRl, produisant le vecteur pRS306-pGAL1.
Un fragment de 720 paires de bases (pb) correspondant à un variant du gène codant pour la Green Fluorescent Protein (GFP) d'Aequora victoria, dont la séquence est optimisée pour l'expression en levures (yEGFP3), a été amplifié par Polymerase Chain Reaction (PCR) à partir du vecteur pUC19yEGFP3, en utilisant les oligonucléotides GFPEcoRI5' de séquence 5'GGTCGGAATTCATGTCTAAAGGTGAAGAATTATTC-3' [SEQ ID N 8] et GFPBamHI(Smal/Srfl Pstl)3' de séquence 5'GGCGGGATCCG000GGGCTCTGCAGTTTGTACAATTCATCCATACC- 3' [SEQ ID N 9]..
Le fragment obtenu a été digéré par les enzymes de restriction BamHl et EcoRl et inséré dans le plasmide pRS306-pGAL1 préalablement digéré par les enzymes BamHl et EcoRl, produisant le vecteur pRS306-pGALI-yEGFP3.
Un fragment de 340 paires de bases (pb) correspondant au terminateur du gène ADH1 (tADH1) de la levure Saccharomyces cerevisiae a été amplifié par Polymérase Chain Reaction (PCR) à partir d'ADN génomique d'une souche sauvage de S.cerevisiae X2180-1A, en utilisant les oligonucléotides TermADHI (NotlBstXl)5' de séquence 5'GGCGGCGGCCGCCACCGCGGTGGGCGAATTTCTTATGATTTATG-3' [SEQ ID N 10] et TermADH1(Sacl)3' de séquence 5'-GGCGGAGCTCTGGAAGAACGATTACAACAG-3' [SEQ ID N 11].
Le fragment obtenu a été digéré par les enzymes de restriction Sacl et Notl et inséré dans le plasmide pRS306-pGAL1-yEGFP3 préalablement digéré par les enzymes Sacl et Notl, produisant le vecteur pCSY226.
Le gène codant pour la protéine [3TrCP a été purifiée à partir du plasmide pGad1318-6TrCP par digestion par les enzymes de restriction BamHl et Notl. Le fragment a été cloné dans le plasmide pCSY226 préparé io par une digestion par les enzymes de restriction BamHl et Notl. Le vecteur produit a été appelé pCSY226-[3TrCP.
Une version de ce vecteur contient en plus la séquence d'adressage nucléaire NLS. Celle-ci a été obtenue en synthétisant une paire d'oligonucléotides complémentaire de séquence NLS-5' : 5'-ACCTCCAAAAAAGAAGAGAAAGGTCGAATT-3' [SEQ ID N 12], et NLS-3' : 5'-AATTCGACCTTTCTCTTCTTTTTTGGAGGT-3' [SEQ ID N 26] réhybridés pour former un ADN double brin. Ce fragment d'ADN a ensuite 20 été incorporé dans le vecteur pCSY226-[3TrCP digéré par l'enzyme de restriction ScrFl pour donner le vecteur pCSY226-NLS-[3TrCP.
EXEMPLE 3: Construction des plasmides permettant l'expression chez la levure des protéines fusions GFP-I3-TrCP et GFP-NLS-R-TrCP.
Les plasmides suivants permettent l'expression chez la levure Saccharomyces cerevisiae de dérivés de la protéine [3-TrCP comprenant une répétition de trois motifs antigénique Flag à leur extrémité aminoterminale. L'expression de ces protéines fusions est induite en cultivant les cellules de levures hébergeant ces plasmides en présence de 2 à 5 % de galactose dans le milieu de culture pendant 1 à 10 heures.
Un fragment de 700 paires de bases (pb) correspondant au promoteur du gène PGK1 (pPGK1) de la levure Saccharomyces cerevisiae a été amplifié par Polymerase Chain Reaction (PCR) à partir d'ADN génomique d'une souche sauvage de S.cerevisiae X2180-1A, en utilisant les oligonucléotides pPGK1-Asp718-5' de séquence 5'-GGCGGGTACCGTGAGTAAGGAAAGAGTGAGG-3' [SEQ ID N 13] et pPGK-EcoRI-3' de séquence 5'-GGCGGAATTCTGTTTTATATTTGTTGTAAAAAG-3' [SEQ ID N 14].
Le fragment obtenu a été digéré par les enzymes de restriction Asp7181 et EcoRI et inséré dans le plasmide navette S.cerevisiae-E.coli pRS304 préalablement digéré par les enzymes Asp7181 et EcoRI, produisant le vecteur pRS304-pPGK1.
Un fragment de 100 paires de bases (pb) correspondant à une succession de 3 séquences rapporteuses FLAG (3FLAG) a été amplifié par io Polymerase Chain Reaction (PCR) à partir du vecteur p3XFLAG-myc-CMV-24 5Sigma Aldrich), en utilisant les oligonucléotides 3FLAG-EcoRl-5' de séquence 5'-GGCGGAATTCATGGACTACAAAGACCATGACGG-3' [SEQ ID N 15] et 3FLAGBamHI(SmallSrfl Pstl)3' de séquence 5'-GGCGGGATCCGCCCGGGCTCTGCAGCTTGTCATCGTCATCCTTGTA-3' [SEQ ID N 16]..
Le fragment obtenu a été digéré par les enzymes de restriction BamHl et EcoRl et inséré dans le plasmide pRS304-pPGK1 préalablement digéré par les enzymes BamHI et EcoRl, produisant le vecteur pRS304-pPGK1- 3FLAG.
Un fragment de 340 paires de bases (pb) correspondant au terminateur du gène ADHI (tADH1) de la levure Saccharomyces cerevisiae a été amplifié par Polymérase Chain Reaction (PCR) à partir d'ADN génomique d'une souche sauvage de S.cerevisiae X2180-1A, en utilisant les oligonucléotides TermADH1(NotlBstXl)5' de séquence 5'GGCGGCGGCCGCCACCGCGGTGGGCGAATTTCTTATGATTTATG-3' [SEQ ID N 10] et TermADH1(Sacl)3' de séquence 5'-GGCGGAGCTCTGGAAGAACGATTACAACAG-3' [SEQ ID N 11].
Le fragment obtenu a été digéré par les enzymes de restriction Sacl et Notl et inséré dans le plasmide pRS304-pPGK1-3FLAG préalablement digéré par les enzymes Sacl et Notl, produisant le vecteur pCSY614.
Le gène codant pour la protéine f3TrCP a été purifiée à partir du plasmide pGad1318-(3TrCP par digestion par les enzymes de restriction BamHl et Notl. Le fragment a été cloné dans le plasmide pCSY614 préparé par une digestion par les enzymes de restriction BamHl et Notl. Le vecteur produit a été appelé pCSY614-[3TrCP.
Une version de ce vecteur contient en plus la séquence d'adressage nucléaire NLS. Celle-ci a été obtenue en synthétisant une paire d'oligonucléotides complémentaire de séquence 5'ACCTCCAAAAAAGAAGAGAAAGGTCGAATT-3' [SEQ ID N 12]. réhybridés pour former un ADN double brin. Ce fragment d'ADN a ensuite été incorporé dans le vecteur pCSY614-13TrCP digéré par l'enzyme de restriction ScrFI pour donner le vecteur pCSY614-NLS-[3TrCP. i0
Exemples 4 à 12: Mise au point du procédé de criblage selon l'invention.
EXEMPLE 4: Interaction entre les protéines Skpl de levure et R-TrCP 15 humaine dans les cellules de levure.
L'interaction entre les protéines Skpl et R-TrCP est visualisée par la technique du double hybride Bartel et al. (in Cellular Interactions in Development: a practical approach (1991), Oxford University Press, Oxford, pp153-179). Des cellules de levure ont été simultanément transformées par le plasmide pGAD-f3TrCP, qui permet l'expression de la protéine humaine [3-TrCP fusionnée au domaine activateur Gal4, par le plasmide pLexSkpl -1 qui permet l'expression de le protéine de levure Skpl fusionnée au domaine de fixation à l'ADN de la protéine bactérienne LexA, et par le plasmide pSHI8-34 qui comprend le gène rapporteur LacZ codant la [3-galactosidase, placé sous le contrôle d'opérateurs LexA. La mesure de l'activité 3-galactosidase dans des extraits cellulaires réalisées dans de tellescellules démontre que l'expression de ce gène rapporteur est induite par un facteur 15, en comparaison de son expression chez des cellules n'exprimant que l'une des deux protéines de fusion décrites ci- dessus. Cette induction de l'expression du gène rapporteur indique que la protéine Skpl de la levure Saccharomyces cerevisiae est capable d'interagir avec la protéine Q-TrCP humaine. L'activité f3-galactosidase est exprimée en nmoles de substrat transformé par minute et par mg de protéines (nmoles/ min /mg).
EXEMPLE 5: localisation, dans les cellules de levure, des protéines humaines IKBa et (3-TrCP selon qu'elles sont fusionnées ou non à une séquence NLS de SV40.
Des cellules de levures comportant des plasmides permettant l'expression des protéines hybrides soit GPF-IKBa, soit GFP-NLS-IKBa, soit GFP-R-TrCP, soit GFP-NLS-f -TrCP à partir du promoteur GAL1 ont été cultivées en présence de galactose 2 % pendant 2 heures et ont été ensuite observées en microscopie à fluorescence. La position du noyau a été révélée en employant un indicateur coloré spécifique du noyau, le Hoescht 333-42. i0
EXEMPLE 6: Phosphorylation de la protéine IKBa dans le noyau des cellules de levure.
L'exemple 6 illustre comment l'adressage de la protéine humaine IKBa dans le noyau des cellules de levure induit sa phosphorylation sur les sérines 15 32 et 36.
Des cellules exprimant soit la protéine fusion GFP-IKBa, soit la protéine fusion tripartite GFP-NLS-IKBa à partir du promoteur GALI sont cultivées en milieu minimum en présence de 2% galactose pendant 2 heures. Les protéines de ces cellules sont alors préparées selon le protocole décrit par Kuras et al. (Mol. Cell (2002), 10:69-80). Les protéines sont ensuite analysées par la technique de Western blotting à l'aide premièrement, d'anticorps reconnaissant spécifiquement la protéine GFP (indiquée GFPIKBa ) et deuxièmement, d'anticorps reconnaissant spécifiquement la forme phosphorylée sur la sérine 32 de la protéine humaine IKBa (indiquée P- IKBa ). Un contrôle de la quantité de protéines totales déposée dans chaque puit a été réalisé en analysant ces mêmes protéines à l'aide d'anticorps reconnaissant spécifiquement la Lysyl-ARNt-synthase de levure (indiquée par LysRS ). Les protéines issues de la souche de levure parentale n'exprimant aucune protéine fusion (indiquée contrôle ) servent de témoin de spécificité.
EXEMPLE 7: Déqradation de la protéine GFP-NLS-IKBa L'exemple 7 illustre par une analyse au microscope d'épifluorescence, la dégradation de la protéine fusion tripartite GFP-NLS-IKBa dans des cellules de levure lorsque celles-ci expriment également la protéine fusion tripartite FlagNLS-13-TrCP.
Toutes les souches employées ont été cultivées et analysées en microscopie à fluorescence de manière identique. Les cellules ont été cultivées en milieu riche en présence de galactose comme source de carbone pendant 120 minutes. Au temps t=0, du glucose 2 % est ajouté à la culture et les cellules sont observées au microscope à épifluorescence (microscope à fluorescence Nikon Eclipse équipé d'un filtre Omega XF116). Toutes les images ont été enregistrées en employant une caméra io Hamamastu en employant des réglages identiques et analysées avec le logiciel LUCIA G, juste avant (t = 0) et 10, 20, 30 et 60 minutes après l'addition de glucose. La fluorescence des protéines fusions GFP-IxBa ou GFP-NLS-IxBa est indiquée GFP . La position du noyau (indiquée DNA ) dans les cellules a été révélée en employant un indicateur coloré ls spécifique du noyau, le Hoescht 333-42.
A) souche de levure CYS22 (MATa, his3, leu2, trpl, ura3::pGALIGFPIKBa::URA3) exprimant la protéine fusion GFP-IxBa sans NLS et localisée dans le cytoplasme des cellules de levure; B) souche de levure CYS61 (MATa, his3, leu2, ura3::pGAL1-GFP- IKBa::URA3, trpl::pGALI-3Flag-f3TrCP::TRPI) exprimant les protéines fusions GFP-IxBa et Flag-R-TrCP, localisées dans le cytoplasme des cellules de levure; C) souche de levure CYS126 (MATa, his3, leu2, trpl, ura3::pGALI-GFPNLS-IKBa::URA3) exprimant la protéine fusion GFP-NLS-IxBa localisée dans 25 le noyau des cellules de levure; D) souche de levure CYS135 (MATa, his3, leu2, ura3::pGAL1-GFP-NLSIKBa::URA3, trpl::pGAL13Flag-NLS-R TrCP::TRPI) exprimant les protéines fusions GFP-NLS-IxBa et Flag-NLS-(3-TrCP localisées dans le noyau des cellules de levure.
EXEMPLE 8: Dégradation de GFP-NLS-IxBa avec ou non co-expression de FlaqNLS-13-TrCP (Résultats par fluorescence).
L'exemple 8 illustre par une quantification de la fluorescence émise, la dégradation de la protéine fusion tripartite GFP-NLS-IxBa dans des cellules de levure lorsque celles-ci expriment ou non la protéine fusion tripartite Flag-NLS-f3-TrCP.
* Les souches de levure identiques à celles décrites dans la figure 4, et cultivées dans les mêmes conditions que celles décrites figure 4, ont été analysées par microscopie à fluorescence. Pour chaque souche, la fluorescence de 200 cellules (au moins) a été mesurée juste avant (t=0) et 10, 20, 30 et 60 minutes après l'addition de glucose, à l'aide du logiciel LUCIA G. Les résultats sont donnés en quantité de fluorescence mesurée par cellule en unité arbitraire.
EXEMPLE 9: Déqradation de GFP-NLS-IxBa avec ou non co-expression de FlaqNLS-13-TrCP (Résultats d'immuno-empreinte) L'exemple 9 illustre par une analyse biochimique de type Western Blotting, la dégradation de la protéine fusion tripartite GFP-NLS-IxBa dans des cellules de levure lorsque celles-ci expriment également la protéine fusion tripartite FlagNLS-13-TrCP. Toutes les souches employées ont été cultivées et analysées de manière identique. Les cellules ont été cultivées en milieu riche en présence de galactose comme source de carbone pendant 120 minutes. Au temps t=0, du glucose 2 % est ajouté à la culture et les protéines totales sont préparées juste avant (t =0) et 10, 20, 30 et 60 minutes après l'addition de glucose. Ces protéines sont analysées par la technique de Western blotting en employant un anticorps reconnaissant la partie GFP des protéines fusions contenant IxBa (indiquée GFP-NLS-IxBa ) et un anticorps reconnaissant la partie Flag de la protéine fusion Flag-NLS-13-TrCP (indiquée Flag-NLS-13-TrCP ). Un contrôle de la quantité de protéines déposée dans chaque puit est réalisé en analysant les mêmes protéines à l'aide d'anticorps reconnaissant la Lysyl-ARNt-synthase de levure (indiquée LysRS ). Les protéines issues de la souche de levure parentale n'exprimant aucune protéine fusion (indiquée contrôle ) servent de témoin de spécificité.
A) souche de levure CYS22 (MATa, his3, leu2, trpl, ura3::pGAL1GFPIKBa::URA3) exprimant la protéine fusion GFP-IxBa sans NLS et localisée dans le cytoplasme des cellules de levure; B) souche de levure CYS61 (MATa, his3, leu2, ura3::pGALI-GFP-35 IKBa::URA3, trpl::pGAL1-3FIag/3TrCP::TRPI) exprimant les protéines fusions GFP-IxBa et Flag-R-TrCP, localisées dans le cytoplasme des cellules de levure; C) souche de levure CYS126 (MATa, his3, leu2, trpl, ura3::pGALI-GFPNLS-lxBa::URA3) exprimant la protéine fusion GFP-NLS-IxBa localisée dans 5 le noyau des cellules de levure; D) souche de levure CYS135 (MATa, his3, leu2, ura3::pGALI-GFPNLSIKBa::URA3, trpl::pGAL1-3Flag-NLS-l3TrCP::TRPI) exprimant les protéines fusions GFP-NLS-IxBa et Flag-NLS-3-TrCP localisées dans le noyau des cellules de levure. i0
EXEMPLE 10: Dégradation de GFP-NLS-IxBa mutée sur les résidus sérine 32 et 36 avec ou non co-expression de Flaq-NLS-R-TrCP (Résultats d'immunoempreinte) L'exemple 10 illustre par une analyse biochimique de type Western blotting, la dégradation de la protéine fusion tripartite mutante GFP- NLSIKBa[S3236A] dans laquelle les sites de phosphorylation Ser32 et Ser36 ont été remplacés par des résidus Ala, mutations qui dans des cellules humaines rendent la protéine non-dégradable. L'analyse a été faite dans des cellules de levure exprimant également ou non la protéine fusion tripartite Flag-NLS- 3-TrCP. Toutes les souches employées ont été cultivées et analysées de manière identique. Les cellules ont été cultivées en milieu riche en présence de galactose comme source de carbone pendant 120 minutes. Au temps t=0, du glucose 2 % est ajouté à la culture et les protéines totales sont préparées juste avant (t=0) et 10, 20, 30 et 60 minutes après l'addition de glucose. Ces protéines sont analysées par la technique de Western blotting en employant un anticorps reconnaissant la partie GFP des protéines fusions contenant IxBa[S3236A] (indiqué GFPNLS-IKBa[S3236A] ) et un anti-corps reconnaissant la partie Flag des protéines fusions Flag-NLS-5-TrCP (indiqué Flag-NLS-(3-TrCP ). Un contrôle de la quantité de protéines déposée dans chaque puit est réalisé en analysant les mêmes protéines à l'aide d'anticorps reconnaissant la Lysyl-ARNt-synthase de levure (indiquée LysRS ). Les protéines issues de la souche de levure parentale n'exprimant aucune protéine fusion (indiquée contrôle ) servent de témoin de spécificité.
A) souche de levure CYS138 (MATa, his3, leu2, trpl, ura3::pGALI-GFPNLSIKBa[S3236AJ::URA3) exprimant la protéine fusion mutante GFPNLSIKBa[S3236A] localisée dans le noyau des cellules de levure; B) souche de levure CYS139 (MATa, his3, leu2, ura3::pGALI-GFP-NLS1KBa[S3236AJ::URA3, trpI::pGALI-3Flag-NLS-I3 TrCP::TRPI) exprimant les protéines fusions GFP-NLS-IicBa[S3236A] et Flag-NLS-13-TrCP localisées dans le noyau des cellules de levure.
EXEMPLE 11: Déqradation de GFP-NLS-IKBa avec ou non coexpression de FlaqNLS-(3-TrCP (Résultats par fluorescence) L'exemple 11 illustre par une analyse au microscope d'épifluorescence, la dégradation de la protéine fusion tripartite GFP-NLSIKBa[S3236A] dans des cellules de levure lorsque celles-ci expriment également la protéine fusion tripartite Flag-NLS-[3TrCP. Les 2 souches employées (CYS138 et CYS139) ont été cultivées et analysées en microscopie à fluorescence de manière identique. Les cellules sont observées au microscope à épifluorescence (microscope à fluorescence Nikon Eclipse équipé d'un filtre Omega XF116. Toutes les images ont été enregistrées en employant une caméra Hamamastu en employant des réglages identiques et analysées avec le logiciel LUCIA G, juste avant (t=0) et 10, 20, 30 et 60 minutes après l'addition de glucose. La fluorescence des protéines fusions GFP-IxBa ou GFP-NLS-IxBa est indiquée GFP . La position du noyau (indiquée DNA ) dans les cellules a été révélée en employant un indicateur coloré spécifique du noyau, le Hoescht 333-42.
EXEMPLE 12: Dégradation de GFP-NLS-IxBa avec ou non coexpression de FlaqNLS-8-TrCP (Résultats par fluorescence) L'exemple 12 illustre par une quantification de la fluorescence émise, la dégradation de la protéine fusion tripartite GFP-NLS-IKBa[S3236A] dans les souches de levure décrites ci-dessus. Pour chaque souche, la fluorescence de 200 cellules (au moins) a été mesurée juste avant (t=0) et 10, 20, 30 et 60 minutes après l'addition de glucose à l'aide du logiciel LUCIA G. Les résultats sont donnés en quantité de fluorescence mesurée par cellule en unité arbitraire.
Tableau 1: Génotype des souches de levure Saccharomyces cerevisiae construites pour les besoins de la présente invention.
Souche Génotype CC788-2B MATa, his3, leu2, ura3, trpl.
CYS22 MATa, his3, leu2, trpl, ura3::pGAL1-GFP-IiBa::URA3 CYS61 MATa, his3, leu2, ura3::pGAL1-GFP-IiBa::URA3, trp 1:: pGAL 1-3FIag-/3TrCP:: TRPI CYS122 MATa, his3, leu2, trpl, ura3::pGALI-GFP-/3TrCP::URA3 CYS123 MATa, his3, leu2, trpl, ura3::pGALI-GFP-NLS-J3TrCP::URA3 CYS126 MATa, his3, leu2, trp l, ura3:: pGAL l -GFP-NLS-I KBa:: URA3 CYS135 MATa, his3, leu2, ura3::pGALI-GFP-NLS-IxBa.::URA3, trp 1:: pGAL 1-3Flag-NLS- f3TrCP:: TRPI CYS138 MATa, his3, leu2, trpl, ura3::pGAL1-GFP-NLS- 1 id3a[S3236AJ:: URA3 CYS139 MATa, his3, leu2, ura3::pGALI-GFP-NLS- /rd3a[S3236Aj::URA3, trpl::pGALI-3FIag-NLS-J3TrCP::TRPI TABLEAU 2 (SEQUENCES)
SEQ ID N Type Description
1 ADN GFP-NLS-IkBa 2 Protéine GFP-NLS-IkBa 3 ADN GFP-NLS-3TrCP 4 Protéine GFP-NLS-33TrCP ADN Séquence NLS du grand antigène T du virus SV40 6-16 ADN Amorces 17 Protéine Antigène HA 18 Protéine Monomère FLAG 19 Protéine Trimère FLAG Protéine NLS Nucléoplasmine 21 Protéine NLS répresseur alpha 2 (1) 22 Protéine NLS répresseur alpha 2 (2) 23 Protéine NLS GaI4 24 ADN NLS Ag T SV40 ADN Amorce Tableau 3: Liste des GFP utilisables selon l'invention Résidus 7v 7v émission Références excitation (nm) (nm) 26 46 64 65 66 67 68 69 70 72 80 145 146 153 163 164 167 168 175 203 212 wtGFP Lys Phe Phe Ser Tyr Gly Val Gln Cys Ser Gln Tyr Asn Met Val Asn lie Ile Ser Thr Asn 395-470 509-540 Heim et al., 1994 BFP Leu Isis Ala 387 450 Quantum CFP Leu Trp Ile Thr Ala His 436 480 (YRC) EBFP Lys Thr His Phe 380 440 Yang et al., 1996 (Clontech) Cormack et al., 1996 ECFP Leu Thr Ile Thr Ala 475 501 Heim et al., 1994-1996 (Clontech) ECFP Arg Lys Thr Trp Ile Thr Ala His Lys 434 474 Miyawaki et al., 1997 EGFP = Leu Thr 488 508 Yang et al., 1998 GFPmutl Cormack et al., 1996 (Clontech) EYFP Gly Leu Ala Tyr 514 527 Ormô etal., 1997 (Clontech) GFP405 405 510 Clontech "SuperBright" Tableau 3 (suite) : Liste des GFP utilisables selon l'invention GFPmut3 GIy Ala 501 511 Cormack et al., 1996 GFPuv 395 408 Crameri et al., 1996 mCFP Trp Ala GIy 440 485 Haseloff et al., 1999 mGFP5 Ala Thr GIy 400-475 508 Haseloff et al., 1997 Siemering etal., 1996 mYFP Gly Ala Ala Tyr Gly Tyr 514 527 Haseloff et al. , 1999 PA-GFP Ala His 413-488 520 Patterson et al., 2002 rs GFP Leu Cys Thr 473 509 Quantum RsGFP Gly Ala Trp 505 522 Reed et al., 2001 S65T Thr 488 507 Heim et al., 1995 T- Sapphire Met Val Ala Gly IIe 399 511 O. Zapata-Hommer and O. Griesbeck, 2003 yEGFP3 GIy Ala 501 511 Cormack et al., 1997 (Cormack) YFP Gly Ala Tyr 500 535 Ormô etal., 1996 (YRC) YFP- citrine Gly Leu Met Ala Tyr 490-510 515 Griesbeck etal., 2001 YFP- Venus Leu Leu Gly Leu Ala Thr Ala Gly Tyr 488 514-527 Nagai etal., 2002 (YRC)
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Claims (40)
1. Procédé pour le criblage d'agents modulant l'ubiquitination de la protéine IxBa par un complexe protéique fonctionnel ubiquitine ligase comprenant la s protéine 13-TrCP, ledit procédé comprenant les étapes suivantes: (a) mettre en contact un agent candidat à tester avec des cellules de levure recombinantes qui expriment dans leur noyau: (i) une protéine de fusion comprenant le polypeptide IKBa et au moins une première protéine détectable; et (ii) une protéine comprenant le polypeptide R-TrCP; (b) quantifier ladite première protéine détectable dans les cellules de levure, à la fin d'au moins une période de temps prédéterminée après la mise en contact de l'agent candidat avec lesdites cellules; (c) comparer la valeur obtenue à l'étape (b) avec une valeur témoin 15 obtenue lorsque l'étape (a) est réalisée en l'absence de l'agent candidat.
2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'étape (a) comprend les étapes suivantes: (a1) cultiver les cellules de levure qui expriment dans leur noyau une 20 protéine de fusion comprenant le polypeptide IxBa et au moins une première protéine détectable; (a2) stopper l'expression de ladite protéine de fusion comprenant le polypeptide IxBa et au moins une première protéine détectable par les cellules de levure; (a3) mettre en contact les cellules de levures obtenues à la fin de l'étape (a2) avec l'agent candidat à tester.
3. Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que les cellules de levure expriment la protéine comprenant le polypeptide f3-TrCP durant la 30 totalité des étapes (a1), (a2) et (a3).
4. Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que les cellules de levure expriment la protéine comprenant le polypeptide (i-TrCP durant la totalité des étapes (a2) et (a3) et n'expriment pas la protéine comprenant le 35 polypeptide 13-TrCP durant l'étape (a1).
5. Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que les cellules de levure expriment la protéine comprenant le polypeptide f3-TrCP durant la totalité des étapes (a2) et (a3), et (i) n'expriment pas la protéine comprenant le polypeptide R-TrCP pendant une durée prédéterminée, au début de l'étape (a1) ; (ii) expriment la protéine comprenant le polypeptide (3-TrCP pendant la durée restante de l'étape (a1).
6. Procédé selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que la protéine détectable comprise dans la protéine de fusion comprenant le polypeptide IKBa est choisie parmi un antigène, une protéine fluorescente et une protéine ayant une activité enzymatique.
7. Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce que la protéine détectable consiste en une protéine fluorescente choisie parmi la protéine GFP ou l'un de ses dérivés, la protéine YFP ou l'un de ses dérivés, et la protéine dsRED.
8. Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce que la protéine détectable consiste en une protéine ayant une activité enzymatique choisie parmi la luciferase et la E3-lactamase.
9. Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce que la protéine 25 détectable consiste en un antigène choisi parmi le peptide Ha et le peptide Flag.
10. Procédé selon l'une des revendications 1 à 9, caractérisé en ce que la protéine comprenant le polypeptide R-TrCP consiste en une protéine de 30 fusion comprenant aussi une seconde protéine détectable.
11. Procédé selon la revendication 10, caractérisé en ce que la seconde protéine détectable comprise dans la protéine de fusion comprenant le polypeptide R-TrCP est choisie parmi un antigène, une protéine fluorescente et une protéine ayant une activité enzymatique.
12. Procédé selon l'une des revendications 10 et 11, caractérisé en ce que (i) la première protéine détectable comprise dans la protéine de fusion comprenant le polypeptide IKBa et (ii) la seconde protéine détectable comprise dans la protéine de fusion comprenant le polypeptide f3-TrCP sont distinctes l'une de l'autre.
13. Procédé selon l'une des revendications 1 à 12, caractérisé en ce que la protéine comprenant le polypeptide IKBa comprend de plus un peptide de lo localisation nucléaire.
14. Procédé selon l'une des revendications 1 à 13, caractérisé en ce que la protéine comprenant le polypeptide t3-TrCP comprend de plus un peptide de localisation nucléaire.
15. Procédé selon l'une des revendications 1 à 14, caractérisé en ce que la protéine comprenant le polypeptide IxBa consiste en la protéine de séquence SEQ ID N 2.
16. Procédé selon l'une des revendications 1 à 15; caractérisé en ce que la protéine comprenant le polypeptide R-TrCP consiste en la protéine de séquence SEQ ID N 4.
17. Procédé selon l'une des revendications 1 à 16, caractérisé en ce qu'à l'étape (b), lorsque la première protéine détectable est un antigène, on quantifie ladite première protéine détectable par détection des complexes formés entre ladite protéine et des anticorps la reconnaissant.
18. Procédé selon l'une des revendications 1 à 16, caractérisé en ce qu'à l'étape (b), lorsque la première protéine détectable est une protéine fluorescente, on quantifie ladite protéine détectable par une mesure du signal de fluorescence émis par ladite protéine.
19. Procédé selon l'une des revendications 1 à 16, caractérisé en ce qu'à 35 l'étape (b), lorsque la première protéine détectable est une protéine ayant une activité enzymatique, on quantifie ladite protéine détectable par une mesure de la quantité de substrat transformé par ladite protéine.
20. Procédé selon l'une des revendications 1 à 19, caractérisé en ce que les s cellules de levures recombinantes sont transformées avec: respectivement: (1) un premier polynucléotide qui comprend (a) un cadre de lecture ouvert codant (i) la protéine de fusion comprenant le polypeptide IKBa et (iii) une première protéine détectable, et (b) une séquence régulatrice fonctionnelle dans des cellules de levure qui dirige l'expression dudit cadre de lecture ouvert; et (2) un second polynucléotide qui comprend (a) un cadre de lecture ouvert codant (i) une protéine comprenant le polypeptide f3-TrCP, (ii) une séquence de localisation nucléaire et (iii) une séquence régulatrice fonctionnelle dans des cellules de levure qui dirige l'expression dudit cadre de lecture ouvert;
21. Procédé selon la revendication 20, caractérisé en ce que la séquence régulatrice contenue dans le premier polynucléotide, la séquence régulatrice contenue dans le second polynucléotide, ou les deux séquences régulatrices, comprenne(nt) un promoteur fonctionnel dans les cellules de levure et qui est sensible à l'action d'un agent inducteur.
22. Procédé selon la revendication 21, caractérisé en ce le promoteur 25 inductible fonctionnel dans les cellules de levure est choisi parmi PGK1, ADH1, TDH3, LEU2 et TEFI.
23. Procédé selon la revendication 21, caractérisé en ce le promoteur inductible fonctionnel dans les cellules de levure est choisi parmi CUP1, 30 GAL 1, METS, MET25, MET28, SAM4 et PHO5.
24. Procédé selon l'une des revendications 20 à 23, caractérisé en ce que le premier polynucléotide comprend la séquence régulatrice GAL1, qui active l'expression du cadre de lecture ouvert codant la protéine de fusion comprenant le polypeptide le polypeptide lKBa en présence de galactose.
25. Procédé selon l'une des revendications 20 à 23, caractérisé en ce que le second polynucléotide comprend la séquence régulatrice CUP1, qui active l'expression du cadre de lecture ouvert codant une protéine comprenant le polypeptide R-TrCP en présence de sulfate de cuivre.
26. Procédé selon l'une des revendications 20 à 25, caractérisé en en ce que les cellules de levure recombinantes possèdent le premier et le second polynucléotide sous une forme insérée dans leur génome.
27. Procédé selon l'une des revendications 1 à 26, caractérisé en ce que les cellules de levure recombinantes possèdent dans leur génome une forme inactivée d'un ou plusieurs gènes contrôlant l'expression de protéines transporteurs insérées dans la membrane plasmique.
28. Procédé selon la revendication 27, caractérisé en ce que le ou les gènes inactivés sont choisis parmi les gènes PDRI et PDR3.
29. Cassette d'expression fonctionnelle dans les cellules de levure comprenant un polynucléotide codant qui comprend un cadre de lecture ouvert codant la protéine de fusion comprenant le polypeptide IxBa et au moins une première protéine détectable, et une séquence régulatrice fonctionnelle dans des cellules de levure qui dirige l'expression dudit cadre de lecture ouvert.
30. Cassette d'expression fonctionnelle dans les cellules de levure comprenant un polynucléotide qui comprend un cadre de lecture ouvert codant une protéine comprenant le polypeptide 8-TrCP et une séquence régulatrice fonctionnelle dans des cellules de levure qui dirige l'expression dudit cadre de lecture ouvert.
31. Cassette d'expression selon l'une des revendications 29 et 30, caractérisée en ce que la séquence régulatrice contenue dans ledit polynucléotide, comprend un promoteur fonctionnel dans les cellules de levure et qui est sensible à l'action d'un agent inducteur.
32. Cassette d'expression selon la revendication 31, caractérisée en ce le promoteur inductible fonctionnel dans les cellules de levure est choisi parmi PGK1, TEF1, PHO5, METS, MET28, CUP1, GAL1 et SAM4.
33. Vecteur d'expression caractérisé en ce qu'il comprend une cassette d'expression selon l'une des revendications 29 à 32.
34. Vecteur d'expression selon la revendication 33, caractérisé en ce qu'il io s'agit du vecteur pCSY226-NLS-IKBa.
35. Vecteur d'expression selon la revendication 33, caractérisé en ce qu'il s'agit du vecteur pCSY226-NLS-(3-TrCP.
36. Souche de levure recombinante comprenant, sous une forme intégrée dans son génome, (i) un premier polynucléotide qui comprend un cadre de lecture ouvert codant la protéine de fusion comprenant le polypeptide lcBa et au moins une première protéine détectable, et une séquence régulatrice fonctionnelle dans des cellules de levure qui dirige l'expression dudit cadre de lecture ouvert; et (ii) un second polynucléotide qui comprend un cadre de lecture ouvert codant une protéine comprenant le polypeptide (3-TrCP et une séquence régulatrice fonctionnelle dans des cellules de levure qui dirige l'expression dudit cadre de lecture ouvert;
37. Souche de levure recombinante selon la revendication 36, caractérisée en ce qu'elle consiste en la souche de levure CYS135 déposée à la Collection Nationale de Cultures de microorganismes de l'Institut Pasteur de Paris (CNCM) sous le numéro d'accès 1-3187.
38. Trousse ou kit pour le criblage d'agents modulant l'ubiquitination de la protéine IiBa par un complexe protéique fonctionnel ubiquitine iigase 35 comprenant la protéine R-TrCP, caractérisé en ce qu'il comprend: (i) un premier vecteur d'expression comprenant une cassette d'expression selon la revendication 29; et (il) un second vecteur d'expression comprenant une cassette d'expression selon la revendication 30.
39. Trousse ou kit pour le criblage d'agents modulant l'ubiquitination de la protéine IcBa par un complexe protéique fonctionnel ubiquitine ligase comprenant la protéine f3-TrCP, caractérisé en ce qu'il comprend des cellules de levures recombinantes comprenant, sous une forme insérée dans leur génome, respectivement: (i) une cassette d'expression selon la revendication 29; et (ii) une cassette d'expression selon la revendication 30.
40. Trousse ou kit selon la revendication 39, caractérisé en ce qu'il 15 comprend des cellules de levures recombinantes de la souche de levure CYS 135 déposée à la CNCM sous le numéro d'accès l-3187.
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