EP1730297A1 - Procede de criblage d'agents modulant l'ubiquitination de la proteine lkb alpha et moyens destines a la mise en oeuvre dudit procede - Google Patents

Procede de criblage d'agents modulant l'ubiquitination de la proteine lkb alpha et moyens destines a la mise en oeuvre dudit procede

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Publication number
EP1730297A1
EP1730297A1 EP05739597A EP05739597A EP1730297A1 EP 1730297 A1 EP1730297 A1 EP 1730297A1 EP 05739597 A EP05739597 A EP 05739597A EP 05739597 A EP05739597 A EP 05739597A EP 1730297 A1 EP1730297 A1 EP 1730297A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
protein
polypeptide
trcp
yeast cells
expression
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP05739597A
Other languages
German (de)
English (en)
Inventor
Cécile BOUGERET
Patrick Zarzov
Jean-François BRIAND
Dominique Thomas
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Cytomics Systems
Original Assignee
Cytomics Systems
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Filing date
Publication date
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Publication of EP1730297A1 publication Critical patent/EP1730297A1/fr
Withdrawn legal-status Critical Current

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/25—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving enzymes not classifiable in groups C12Q1/26 - C12Q1/66
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/566—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor using specific carrier or receptor proteins as ligand binding reagents where possible specific carrier or receptor proteins are classified with their target compounds
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2500/00—Screening for compounds of potential therapeutic value
    • G01N2500/10—Screening for compounds of potential therapeutic value involving cells

Definitions

  • the present invention relates to the field of screening for biologically active agents capable of modulating the ubiquitination of the IKBCC protein, in particular agents of therapeutic interest, and even more specifically therapeutic agents intended for preventing or treating conditions. inflammatory, autoimmune conditions or cancer.
  • the transcription factors of the NF- ⁇ B family are part of the body's first defenses during viral, bacterial or fungal infections and also during physiological situations of stress. These transcriptional factors direct the expression of a large number of genes, and in particular many genes coding for mediators of inflammation. Among these genes, mention may be made of the genes encoding factor TNF- ⁇ , the interleukins IL-1, IL-6, IL-8, the molecules of adhesion ICAM-1, VCAM-1 and E-Selectin, NO synthase or even prostaglandin synthase Cox2.
  • Factors in the NF- ⁇ B family are activated by a wide variety of pathogenic stimuli, both endogenous and exogenous, including bacterial proteins or lipids, cytokines, growth factors and molecules linked to stressful situations oxidative.
  • pathogenic stimuli both endogenous and exogenous, including bacterial proteins or lipids, cytokines, growth factors and molecules linked to stressful situations oxidative.
  • the activation of NF- ⁇ B factors, in response to these pathogenic stimuli, is observed for almost all cells involved in the immune response, such as epithelial cells, mesenchyme cells, lymphocytes, neutrophil cells and macrophages .
  • factor NF- ⁇ B is closely linked to the destruction of factor l ⁇ B ⁇ by the ubiquitin proteasome pathway (Kroll et al, 1999; Winston et al, 1999).
  • the factor NF- ⁇ B is sequestered in the cytoplasm of the cells.
  • the factor NF- k B is therefore incapable of activating the expression of the target genes for this factor.
  • the activation of target genes first requires the translocation of the NF k B factor of the cytoplasm towards the nucleus. This translocation is triggered by the degradation of factor l ⁇ B ⁇ by the ubiquitin proteasome pathway.
  • Factor l ⁇ B ⁇ is indeed a protein which sequesters NF- ⁇ B factors in the cytoplasm of unstimulated cells (Hay et al., 1999).
  • Exogenous inflammatory stimuli such as a viral or bacterial infection, activate a signaling pathway that causes phosphorylation of the IKBOC factor.
  • This phosphorylation takes place specifically on the Serine residues at positions 32 and 36 of the amino acid sequence of factor l ⁇ B ⁇ .
  • the factor l ⁇ B ⁇ is phosphorylated by the protein kinase complex l ⁇ .
  • the factor l ⁇ B ⁇ is recognized by the ubiquitin ligase SCF ⁇ TrCp (Kroll et al, 1999; Winston et al, 1999).
  • the recognition of the factor IKBCC by the ubiquitin ligase SCF ⁇ TrCp causes the poly-ubiquitination of this factor.
  • the factor l ⁇ B ⁇ is then recognized and degraded by the proteasome.
  • the destruction of factor l ⁇ B ⁇ causes the release of the cytoplasmic factor NF- ⁇ B.
  • the factor NF- ⁇ B undergoes a translocation from the cytoplasm to the nucleus. Once localized in the nucleus of stimulated cells, the NF- ⁇ B factor specifically recognizes the promoters of target genes and strongly activates their transcription: the inflammatory response is installed (Ben Neriah, 2002).
  • anti-inflammatory compounds which are both more effective and more specific than known anti-inflammatory compounds.
  • anti-inflammatory compounds because of their specificity vis-à-vis a biological target, would be likely to have reduced undesirable side effects, or even to be free of any undesirable side effect.
  • a method for screening agents of therapeutic interest, which are selected for their specificity of action on the ubiquitination of the human protein l ⁇ B by an ubiquitin ligase complex comprising the human protein ⁇ -TrCP.
  • the applicant has shown that, surprisingly, it is possible to mimic, in yeast cells, the process of degradation of factor h B by the proteasome, a process which takes place naturally in human cells.
  • an artificial ubiquitin ligase complex comprising yeast proteins with which the protein is associated has been reconstituted in yeast cells.
  • human ⁇ -TrCP it has been shown that the human protein ⁇ -TrCP, when it is artificially expressed in yeast cells, associates with the yeast protein Skp1, which yeast protein Skp1 is contained in a protein complex ubiquitin ligase yeast.
  • the ⁇ -TrCP protein associates with the yeast SCF protein complex which comprises (i) a catalytic core consisting of association of the proteins Skp1, Cdc53 and Hrt1, said catalytic heart being itself associated with the enzyme E2 Cdc34. It has been shown that this hybrid yeast / human protein complex is capable of mimicking, in yeast cells, the ubiquitin ligase activity exerted in human cells by the natural human SCF ⁇ ⁇ TrCp complex.
  • this artificial protein complex having the ubiquitin ligase activity of the human SCF ⁇ 'TrC complex is only biologically active when this artificial complex is located in the cell nucleus.
  • the natural SCF ⁇ TrCp complex exerts its biological activity in the cytoplasm of human cells, a cellular compartment in which it performs the ubiquitination of a second protein also localized in the cytoplasm, the factor IKBOC.
  • the artificial ubiquitin ligase complex which has been developed is only active, in the process of degradation of factor l ⁇ B, when the factor IKBOC is co-located in the nucleus with said artificial complex ubiquitin ligase.
  • the artificial protein complex ubiquitin ligase comprising the protein human ⁇ -TrCP is capable of achieving the ubiquitination of human factor l ⁇ B ⁇ , when the protein ⁇ -TrCP and factor IKBOC are artificially expressed in the cell nucleus.
  • the subject of the invention is a method for the in vitro screening of agents modulating the ubiquitination of the l ⁇ B ⁇ protein by a functional protein complex ubiquitin ligase comprising the ⁇ -TrCP protein, said method comprising the following steps: (a) contacting a candidate agent to be tested with recombinant yeast cells which express in their nucleus: (i) a fusion protein comprising the polypeptide It B ⁇ and at least one first detectable protein; and (ii) a protein comprising the ⁇ -TrCP polypeptide; (b) quantifying said first detectable protein in yeast cells, at the end of at least a predetermined period of time after contacting the candidate agent with said cells; (c) compare the value obtained in step (b) with a control value obtained when step (a) is carried out in the absence of the candidate agent.
  • the above method allows a person skilled in the art to determine whether an agent to be tested is capable of modifying the rate of degradation, or the degree of degradation, of the factor IKBOC by the proteasome, in yeast cells expressing both human ⁇ -TrCP protein and factor IkBoc.
  • the above in vitro screening method because it implements a humanized artificial ubiquitination system in yeast cells, allows screening of agents which act specifically on the activity of human proteins only expressed in these cells.
  • agents capable of inhibiting the rate or degree of degradation of factor IKBOC by the proteasome of yeast cells can be identified.
  • Such inhibitory agents, identified by the method of the invention because they will also inhibit the degradation of factor IKBOC in human cells, constitute agents of therapeutic interest capable of inhibiting or blocking the translocation of the factor NF- ⁇ B in the cell nucleus and, in Consequently, inhibit or block the activation, by NF- ⁇ B, of various genes involved in inflammation, pathologies of autoimmunity or even cancers.
  • the above in vitro screening method can comprise an additional step (d) which consists in positively selecting the inhibiting candidate agents for which the amount of detectable protein measured in step (b) is less than the control value of comparison.
  • the method of the invention also makes it possible to identify agents capable of increasing the speed or the degree of degradation of the factor IKBOC by the proteasome of yeast cells.
  • Such activating agents are capable of inducing or increasing the translocation of factor NF- ⁇ B in the cell nucleus and, consequently, of inducing or increasing the activation, by NF- ⁇ B, of various genes involved in inflammation, pathologies of autoimmunity or cancers.
  • the in vitro screening method of the invention makes it possible to screen for pro-inflammatory agents.
  • Some of the pro-inflammatory agents selected according to the method are likely to be of therapeutic interest when they are used in low doses or when they are administered for a short period, for example as agents inducing an early immune response.
  • pro-inflammatory agents selected according to the in vitro screening method of the invention may consist of known active ingredients, in particular active drug ingredients, including a pro-inflammatory effect. undesirable is identified, and for which special precautions for use with regard to human health must be observed.
  • the screening method according to the invention can comprise an additional step (d) which consists in positively selecting the activating candidate agents, for which the quantity of detectable protein measured in step (b) is greater to the comparison control value.
  • an agent which “modulates” the ubiquitination of the ⁇ -TrCP protein consists (i) of an agent which increases or on the contrary consists (ii) of an agent which inhibits or blocks the degradation of the ⁇ -TrCP protein which is detected in step (b) of the screening method of the invention, compared with a control situation of degradation of this protein, when the method is carried out in the absence of the agent tested.
  • the agent modulating the ubiquitination of the ⁇ -TrCP protein can be of any kind.
  • Said agent can be any organic or mineral compound, and can be either an agent of natural origin, or an agent produced, at least in part, by chemical or biological synthesis.
  • Said agent can in particular be a peptide or protein.
  • Said agent also includes any molecule already known to have a biological effect, in particular a therapeutic effect, or conversely a toxic effect demonstrated or suspected for the organism.
  • the fusion protein IKBOC-detectable protein is ubiquitinylated by the artificial SCF complex comprising the ⁇ -TrCP polypeptide
  • said fusion protein undergoes proteolysis which is carried out by the multi-catalytic complex of proteasome.
  • the quantification of the detectable protein contained in the yeast cell, at a given time makes it possible to determine the degree of degradation of said l ⁇ B ⁇ -detectable protein fusion, at this given time.
  • the sensitivity of the screening method described above is increased when, prior to bringing the yeast cells into contact with the agent to be tested, the accumulation of the target fusion protein is promoted.
  • l ⁇ B ⁇ -protein detectable in the cell nucleus is promoted.
  • step (a) itself comprises the following steps:
  • step (ai) culturing yeast cells which express in their nucleus a fusion protein comprising the IKBOC polypeptide and at least one first detectable protein; (a2) stopping the expression of said fusion protein comprising the polypeptide I KBOC and at least one first protein detectable by yeast cells; (a3) bringing the yeast cells obtained at the end of step (a2) into contact with the candidate agent to be tested.
  • Stopping the expression of the l ⁇ B ⁇ -detectable protein fusion, at a chosen time, can be easily carried out by a person skilled in the art, by using, to transform the yeast cells, an expression cassette in which the polynucleotide encoding said fusion protein is placed under the control of a functional promoter in yeast cells and whose activation, or conversely repression, is induced by an inducing agent.
  • a functional promoter in yeast cells whose activation, or conversely repression, is induced by an inducing agent.
  • Many inducible promoters active in yeast cells are known to those skilled in the art, some of which are described later in the description, including in the examples.
  • step (ai) of the process allows a strong detection signal of the detectable protein to be obtained, at the start of the process. .
  • These strong signal conditions make it possible to quantify with great sensitivity the detectable protein throughout the duration of the process, as the fusion protein ItcBoc-detectable protein by the proteasome degrades, after it has been ubiquitinylated. by the artificial SCF complex comprising the protein ⁇ -TrCP.
  • the stronger the detectable starting signal the better the sensitivity of the measurements during the implementation of the method.
  • the yeast cells express the protein comprising the ⁇ -TrCP polypeptide during all of the steps (ai), (a2) and (a3).
  • the yeast cells express the protein comprising the ⁇ -TrCP polypeptide during all of the steps (a2) and (a3) and do not express the protein comprising the ⁇ -TrCP polypeptide during step (ai).
  • the control of the expression of the protein comprising the ⁇ -TrCP polypeptide is easily achieved, using, to transform the yeast cells, an expression cassette in which the polynucleotide encoding the protein comprising the ⁇ polypeptide -TrCP is placed under the control of a functional promoter in yeast cells and whose activation, or conversely repression, is induced by an inducing agent.
  • a functional promoter in yeast cells whose activation, or conversely repression, is induced by an inducing agent.
  • Many inducible promoters active in yeast cells are known to those skilled in the art, some of which are described later in the description, including the examples.
  • the inducible promoter included in the expression cassette coding for the protein comprising the ⁇ -TrCP polypeptide is distinct from the inducible promoter included in the expression cassette coding for the fusion protein I KBOC-detectable protein.
  • a separate control is carried out respectively (i) of the expression of the l ⁇ Boc-detectable protein fusion protein and (ii) of the expression of the protein comprising the ⁇ -TrCP polypeptide.
  • the It B ⁇ -detectable protein fusion protein accumulates in the nucleus of yeast cells during step (ai), in the absence of the ⁇ -TrCP polypeptide. Then, in step (a2), the l ⁇ Boc-detectable protein fusion protein which is no longer produced is brought into the presence, in the cell nucleus, of the artificial SCF complex which comprises the ⁇ -TrCP protein whose expression has been induced.
  • the target fusion protein comprising IKBOC is first accumulated, then the ubiquitination effector protein is expressed, namely the protein comprising the ⁇ -TrCP polypeptide, which will initiate the degradation process. of the l ⁇ Boc-detectable protein fusion protein. And the degradation process of the Iv B ⁇ -detectable protein fusion protein, which can be modulated by the agent to be tested, is measured in step (b) of the screening method of the invention.
  • the yeast cells express the protein comprising the ⁇ -TrCP polypeptide during all of the steps (a2) and (a3), and (i) n ' do not express the protein comprising the ⁇ -TrCP polypeptide for a predetermined duration, at the start of step (ai); (ii) (ii) express the protein comprising the ⁇ -TrCP polypeptide for the remaining duration of step (ai).
  • the l ⁇ Bcc-detectable protein fusion protein is expressed during the whole of step (ai) of the method, and the expression of said fusion protein is stopped in step (a2) of the method.
  • the expression of the protein comprising the ⁇ -TrCP polypeptide is activated at a chosen time during the duration of step (ai). Under these conditions, in part (ii) of step (ai), the l ⁇ Boc-detectable protein fusion protein and the protein comprising the ⁇ -TrCP polypeptide are simultaneously expressed in yeast cells.
  • the fusion protein l ⁇ B ⁇ -detectable protein accumulates in large quantity in the nucleus of yeast cells during the whole of step (ai) and the effector protein comprising the polypeptide ⁇ -TrCP is expressed early in the during step (ai) and continues to accumulate during steps (a2) and (a3) during which the target fusion protein is no longer synthesized.
  • the expression of the fusion protein l ⁇ Bcc-detectable protein is activated for a duration T1 of between 0.25 hours and 10 hours, better between 0.5 hour and 6 hours, and even better between 1 hour and 4 hours.
  • the expression of the fusion protein l ⁇ Boc-detectable protein is stopped. From this moment, only the expression of the effector protein comprising the ⁇ -TrCP polypeptide is kept activated in the yeast cells, and this for the entire duration of the screening process, ie up to at the end of the process.
  • the detectable protein which is included in the l ⁇ Boc-detectable protein fusion protein can be of any kind, since its presence can be specifically detected in yeast cells before its proteolysis, and that the presence of proteolysed forms of the detectable protein, in particular peptide fragments produced by proteolysis of said detectable protein, are not detected by the specific detection means which is chosen.
  • the ubiquitin ligase activity of the artificial protein complex comprising the ⁇ -TrCP protein is followed, according to the method of the invention, by measuring its effect on the stability of the l ⁇ B ⁇ -detectable protein fusion protein.
  • the addition of poly-ubiquitin chains to the IKBOC factor by the artificial human / yeast SCF complex results in the recognition of the factor l k Boc ubiquitin by the proteasome and its rapid degradation by the latter. Thanks to the expression in yeast cells of the IKBOC factor in the form of a fusion protein, the degradation of the fusion protein containing IKBOC can be monitored in real time, by detection of the detectable protein which is not proteolysed.
  • the degradation of the fusion protein can be followed by techniques known per se, in particular techniques for measuring fluorescence using either a flow cytometer or a microplate reader, either with a fluorimeter, or with a fluorescence microscope, or by colorimetric, enzymatic or immunological techniques.
  • the detectable protein can be chosen from an antigen, a fluorescent protein or a protein having an enzymatic activity.
  • the detectable protein when the detectable protein consists of an antigen, it can be any type of antigen, since antibodies specific for this antigen are already accessible or, alternatively, can be prepared, according to any technique for obtaining antibodies, in particular d polyclonal or monoclonal antibodies, well known to those skilled in the art job.
  • the detectable protein consists of a small antigen, which is not likely to interfere with the recognition of the factor IKBOC by the polypeptide ⁇ -TrCP.
  • a peptide having a chain of 7 to 100 amino acids in length, better from 7 to 50 amino acids in length, and even better still from 7 to 30 amino acids in length, for example 10 acids is used as antigen.
  • amines in length a peptide having a chain of 7 to 100 amino acids in length, better from 7 to 50 amino acids in length, and even better still from 7 to 30 amino acids in length, for example 10 acids.
  • HA antigen of sequence [NH 2 -YPYDVPDYA-COOH] SEQ ID No. 17 or else a FLAG antigen of sequence [NH 2 -DYKDDDDK- COOH] SEQ ID No. 18 (monomer FLAG ) or of sequence [NH 2 - MDYKDHDGDYKDHDIDYKDDDDK-COOH] SEQ ID No. 19 (trimer FLAG)
  • an antibody which specifically recognizes the is used to quantify the protein detectable in step (b) of the process antigen included in the fusion protein, this antibody being labeled directly or indirectly.
  • step (b) when the first detectable protein is an antigen, said first detectable protein is quantified by detection of the complexes formed between said protein and antibodies recognizing it.
  • the detectable protein consists of an intrinsically fluorescent protein
  • it is in particular chosen from the GFP protein or one of its derivatives, the YFP protein or one of its derivatives, and the dsRED protein.
  • the proteins derived from the GFP protein use may in particular be any of the proteins known under the names GFPMut3, Venus, Sapphire etc.
  • An illustrative list of GFP proteins capable of being used in the process of the invention is presented in Table 3, at the end of this description.
  • the intrinsically fluorescent protein can also be chosen from auto-fluorescent proteins originating from various organisms, other than Aequorea Victoria.
  • the intrinsically fluorescent protein can be chosen from the following proteins: - the CopGFP protein originating from Pontellina plumata, and described by DA Shagin et al. (2004, Mol. Biol. Evol. 21: 841-850); TurboGFP protein, a variant of CopGFP; and described by DA Shagin et al., 2004 (Mol. Biol. Evol. 21: 841 -850); the J-Red protein, originating from Anthomedusae); and described by DA Shagin et al., 2004 (Mol. Biol. Evol. 21: 841 -850); the protein PhiYFP originating from Phialidium sp.
  • the detectable protein in step (b) of the method is quantified by measuring the fluorescence signal which is emitted by the fusion protein l ⁇ B ⁇ -fluorescent protein using any adapted device.
  • the detectable protein in step (b) of the method is quantified by measuring the fluorescence signal emitted by said protein.
  • the detectable protein consists of a protein with enzymatic activity
  • said detectable protein is chosen in particular from luciferase and ⁇ -lactamase.
  • the protein detectable in step (b) of the method is quantified by measuring the amount of the compound or compounds produced by the conversion of the substrate by the enzyme.
  • the product of the enzymatic activity is colored, the measurement can be carried out by colorimetry.
  • the product of the enzymatic activity is fluorescent, the intensity of the fluorescence signal which is emitted by said product is measured, using any suitable fluorescence measurement device.
  • the first detectable protein is a protein having an enzymatic activity
  • said detectable protein is quantified by measuring the amount of substrate transformed by said protein.
  • the protein comprising the ⁇ -TrCP polypeptide also consists of a fusion protein comprising, in addition to the ⁇ -TrCP polypeptide, also a detectable protein.
  • the level of expression of the ⁇ -TrCP polypeptide in the yeast cells can be monitored over time, by detecting, and optionally by quantifying, the detectable protein contained in the protein comprising the ⁇ -TrCP polypeptide.
  • This particular embodiment is mainly implemented when the expression of the protein comprising the ⁇ -TrCP polypeptide is controlled positively or negatively, at the different substeps of step (a) of the method.
  • the detectable protein contained in the polypeptide comprising the ⁇ -TrCP polypeptide is chosen from an antigen, a fluorescent protein and a protein having enzymatic activity.
  • the detectable protein contained in the protein comprising the ⁇ -TrCP polypeptide is distinct from the detectable protein contained in the l ⁇ Boc-detectable protein fusion protein, which allows the expression of factor I BCC and the expression of the ⁇ -TrCP polypeptide to be monitored separately in yeast cells.
  • the degradation of the human IKBOC target polypeptide by the proteasome of yeast cells is carried out only when the fusion protein l ⁇ Boc-detectable protein and the protein comprising the human ⁇ -TrCP polypeptide are both co-located in the nucleus of yeast cells.
  • the factor IKBOC is phosphorylated on the serine residue at position 32 exclusively in the nucleus of yeast cells, whereas it does not undergo phosphorylation in the cytoplasm .
  • a posteriori the event of phosphorylation of the serine residue in position 32 of the factor l ⁇ B ⁇ , in the yeast cells, makes it possible to explain, at least partially, the reason why, in the yeast cells, the ubiquitination of this factor can only be performed in the cell nucleus.
  • any means is used allowing nuclear localization of both the l ⁇ Bcc-detectable protein fusion protein and the protein comprising the ⁇ -TrCP polypeptide.
  • the l ⁇ B-detectable protein fusion protein and the protein comprising the ⁇ -TrCP polypeptide both comprise a peptide making it possible to localize these two proteins in the nucleus of yeast cells.
  • the l ⁇ Bcc-detectable protein fusion protein and the protein comprising the ⁇ -TrCP polypeptide both comprise, in their amino acid sequence, at least one nuclear localization peptide (“NLS”) which is functional in eukaryotic cells, and more particularly in yeast cells.
  • NLS nuclear localization peptide
  • Each of the proteins comprises, independently of one another, 1, 2, 3 or 4 nuclear localization peptides.
  • each of these proteins comprises, independently of one another, from 1 to 4 copies of a nuclear localization peptide.
  • the nuclear localization peptide (s) are chosen from the following peptides: the NLS peptide derived from the large antigen of the SV40 virus having the amino acid sequence SEQ ID No. 24; the nucleoplasmin NLS peptide having the amino acid sequence SEQ ID No. 20; an NLS peptide of the yeast alpha 2 repressor chosen from the sequences SEQ ID No. 21 and SEQ ID No. 22; - an NLS peptide of the yeast Gal4 protein having the amino acid sequence SEQ ID No. 23.
  • the l ⁇ B-detectable protein fusion protein and the protein comprising the ⁇ -TrCP polypeptide both comprise the nuclear localization peptide with sequence SEQ ID No. 24.
  • the l k Boc-detectable protein fusion polypeptide consists of an amino acid chain which comprises, from the NH 2 - terminal end to the COOH-terminal end, respectively (i) the sequence of the detectable protein , (ii) the NLS nuclear localization sequence and (iii) the sequence of l k B ⁇ .
  • the GFP sequence and the NLS sequence can be linked directly to each other, by a peptide bond.
  • the NLS sequence and the 1 k Boc sequence can be linked directly to each other, by a peptide bond.
  • the GFP sequence and the NLS sequence can be separated, in the sequence of the fusion polypeptide, by a first spacer peptide.
  • the NLS sequence and the 1 k B ⁇ sequence can be separated, in the sequence of the fusion polypeptide, by a second spacer peptide.
  • the spacer peptide (s), when it is (are) present, has (have) a size ranging from 1 to 30 amino acids, preferably from 1 to 15 amino acids, and most preferably 2 to 10 amino acids in length.
  • the protein comprising the IKBOC polypeptide consists of the amino acid sequence protein
  • SEQ ID N ° 2 which can be encoded by the nucleic acid of sequence SEQ
  • the protein of sequence SEQ ID No. 2 consists, from the end
  • the protein comprising the ⁇ TrCP polypeptide consists of an amino acid chain which comprises, from the NH 2 - terminal end to the COOH-terminal end, respectively (i) the sequence of a second detectable protein, (ii ) the nuclear localization NLS sequence, and (iii) the ⁇ TrCP sequence.
  • the protein comprising the ⁇ -TrCP polypeptide consists of the amino acid sequence protein SEQ ID No. 4, which is encoded by the nucleic acid of sequence
  • the protein with sequence SEQ ID No. 4 consists, from the NH 2 -terminal end towards the COOH-terminal end, respectively in (i) the sequence of the detectable protein GFP (yEGFP3) ranging from the amino acid in position 1 to the amino acid at position 240, (ii) a first spacer peptide ranging from amino acid at position 241 to amino acid at position 243, (iii) the NLS peptide of the large T antigen of SV40 going from amino acid at position 244 to amino acid at position 250, (iv) a second spacer peptide going from amino acid at position 251 to amino acid at position
  • the nucleic acid of sequence SEQ ID No. 3 consists, from the 5 ′ end towards the 3 ′ end, respectively in (i) the sequence coding for the detectable protein GFP ( yEGFP3) going from the nucleotide in position 1 to the nucleotide in position 714, (ii) the sequence coding for a first spacer peptide going from the nucleotide in position 715 to the nucleotide in position 729, (iii) the sequence coding for the NLS peptide of SV40 large T antigen ranging from the nucleotide at position 730 to the nucleotide at position 750, (iv) the sequence coding for a second spacer peptide ranging from the nucleotide at position 751 to the nucleotide at position 765 and (v) the sequence coding for ⁇ -Tr
  • the screening method according to the invention is characterized in that the recombinant yeast cells are transformed with:
  • a first polynucleotide which comprises (a) an open reading frame encoding (i) the fusion protein comprising the IKBOC polypeptide, (ii) a nuclear localization sequence and (iii) a first detectable protein, and (b) a functional regulatory sequence in yeast cells which directs expression of said open reading frame; and
  • a second polynucleotide which comprises (a) an open reading frame encoding (i) a protein comprising the ⁇ -TrCP polypeptide, (ii) a nuclear localization sequence, and (iii) a functional regulatory sequence in cells of yeast which directs the expression of said open reading frame;
  • the above polynucleotide (1) can consist of the nucleic acid of sequence SEQ ID No. 1.
  • the above polynucleotide (2) may consist of the nucleic acid of sequence SEQ ID No. 3.
  • Preferred nucleic acids, expression vectors and transformed yeast cells according to the invention are Preferred nucleic acids, expression vectors and transformed yeast cells according to the invention.
  • Nucleic acids are synthesized according to the invention, which, when introduced into yeast cells, cause the expression of the l ⁇ Boc-detectable protein fusion protein and of the protein comprising the ⁇ -TrCP polypeptide respectively in these cells. , and more particularly in the nucleus of yeast cells.
  • each of the nucleic acids synthesized comprises a coding sequence, which is also designated “open reading frame” or “ORF”. which codes for the protein of interest, respectively the l ⁇ Boc-detectable protein fusion protein, or the protein comprising the ⁇ -TrCP polypeptide, said protein of interest also comprising in its sequence at least the sequence of a nuclear localization peptide .
  • Illustrative examples of the nucleic acids according to the invention are the nucleic acids of sequence SEQ ID No. 1 and SEQ ID No. 3, the structure of which has been described previously in the description.
  • Each of the nucleic acids also comprises a regulatory sequence comprising a promoter functional in yeast cells.
  • the promoter functional in yeast cells consists of a constitutive promoter which can be chosen from the promoters PGK1, ADH1, TDH3, LEU2 and TEFL
  • each of the nucleic acids comprises, as promoter, a promoter called "inducible” , ie a promoter which is functional in yeast cells and which is sensitive to the action of an inducing agent.
  • a promoter can be used which, when the inducing agent is added to the culture medium of yeast cells, activates the expression of the sequence coding for the protein of interest placed under its control. It is also possible to use a promoter which, when the inducing agent is added to the culture medium of yeast cells, represses or blocks the expression of the sequence coding for the protein of interest placed under its control.
  • the inducible promoter which is contained in the nucleic acids of the invention is chosen from CUP1, GAL1, MET3, MET25, MET28, SAM4 and PH05.
  • the nucleic acid or the polynucleotide which codes for the fusion protein l ⁇ B ⁇ -detectable protein comprises the regulatory sequence GAL1, which activates the expression of the open reading frame coding for the fusion protein comprising the polypeptide the polypeptide IKBOC in the presence of glucose.
  • the expression of the fusion protein comprising the factor IKBOC is carried out temporarily during the screening test.
  • the expression of the protein containing l ⁇ B ⁇ is specifically stopped (in an experiment known to those skilled in the art as name of "promoter shut off") before exposing the cells to the molecules to be screened.
  • This stopping of expression is obtained by the addition (or deletion) in the culture medium of a molecule capable of repressing the activity of the promoter controlling the expression of the tripartite protein containing IKBOC.
  • the l ⁇ B ⁇ -detectable protein fusion protein when expressed under the control of the promoter of the GAL1 gene, then the expression of this promoter is repressed by adding glucose to the final concentration of 2% in the culture medium.
  • the stopping of the neosynthesis of the fusion protein comprising IKBOC makes it possible to measure its stability in real time, by determining for example the fluorescence of the yeast cells over time after the stopping of synthesis, in the embodiment in which said fusion protein contains a detectable intrinsically fluorescent protein, such as GFP or a protein derived from GFP.
  • the temporary expression of the fusion protein comprising the factor IKBOC is associated with an also temporary expression of the protein comprising the ⁇ -TrCP polypeptide.
  • the fusion protein comprising the IKBOC polypeptide is expressed during the chosen time period T1, for example by using yeast cells which express the fusion protein comprising the IKBOC polypeptide UNDER the control of the GAL1 promoter and which are cultivated in the presence of 0.5 to 4% galactose for the duration T1.
  • the expression of the protein comprising the ⁇ -TrCP polypeptide is induced.
  • This induction is, for example, obtained in cells expressing the protein containing ⁇ -TrCP under the control of the promoter of the CUP1 gene, by adding in the medium of culture a concentration of copper sulphate between 0.05 mM and 5 mM.
  • the expression of the fusion protein comprising IKBOC is stopped by adding glucose to the culture medium at a concentration of between 0.5 and 2%.
  • This addition of glucose has no effect on the expression of the protein comprising ⁇ -TrCP from the promoter of the CUP1 gene.
  • the accumulation of ubiquitin ligase comprising ⁇ -TrCP is continued, while the neo-synthesis of the fusion protein comprising IKBOC is stopped.
  • the nucleic acid or the polynucleotide which codes for the protein comprising the ⁇ -TrCP polypeptide comprises the regulatory sequence CUP1, which activates the expression of the open reading frame encoding a protein comprising the ⁇ -TrCP polypeptide in the presence of copper sulfate.
  • the subject of the invention is also a cassette for expression functional in yeast cells comprising a coding polynucleotide which comprises an open reading frame coding the fusion protein comprising the polypeptide the polypeptide IKBOC and at least one first detectable protein, and a functional regulatory sequence in yeast cells which directs expression of said open reading frame.
  • Such an expression cassette may in particular consist of the nucleic acid of sequence SEQ ID No. 1 according to the invention, which codes for the fusion protein GFP-NLS-1 k B ⁇ of sequence SEQ ID No. 2.
  • the invention also relates to a functional expression cassette in yeast cells comprising a polynucleotide which comprises an open reading frame encoding a protein comprising the ⁇ -TrCP polypeptide and a regulatory sequence functional in yeast cells which directs expression. said open reading frame.
  • Such an expression cassette can in particular comprise the nucleic acid of sequence SEQ ID No. 3 according to the invention, which codes for the fusion protein GFP-NLS- ⁇ TrCP of sequence SEQ ID No. 4.
  • the regulatory sequence comprises an inducible promoter functional in yeast cells, such as a promoter chosen from the promoters PGK1, ADH1, TDH3, LEU2 and TEFL
  • the regulatory sequence contained in said polynucleotide, the regulatory sequence contained in the second polynucleotide, or the two regulatory sequences comprises (s) a promoter which is functional in yeast cells and which is sensitive to the action of an inducing agent, which is also called an inducible promoter.
  • the inducible functional promoter in yeast cells is chosen from CUP1, GAL1, MET3, MET25, MET28, SAM4 and PH05.
  • the yeast cells are transformed with (i) the nucleic acid or the polynucleotide comprising the sequence coding for the fusion protein l ⁇ B ⁇ -detectable protein as well as with (ii ) acid nucleic acid or polynucleotide encoding the protein comprising the ⁇ -TrCP polypeptide, which are in a non-integrated form, for example in the form of functional vectors in yeast cells and which carry at least one origin of functional replication in the cells of yeast.
  • the recombinant yeast cells have the nucleic acid or the polynucleotide comprising the sequence coding for the l ⁇ Boc-detectable protein fusion protein as well as the nucleic acid or the polynucleotide encoding the protein comprising the ⁇ -TrCP polypeptide in a form integrated into their genome, as illustrated in the examples.
  • yeast cells which have good membrane permeability, in particular good membrane permeability for the agents to be tested by the method.
  • yeast cells which have good membrane permeability for inducing compounds to which said inducible promoters are sensitive
  • yeast strains are used whose genome comprises one or more mutations which increase the permeability to the products to be tested, such as mutations inactivating the PDR1 and PDR3, two genes encoding transcriptional factors which in the yeast control the expression of transporters inserted into the plasma membrane (Vidal et al, 1999, Nourani et al, 1997).
  • yeast strains having the genetic background of the strain W303 of the yeast Saccharomyces cerevisiae described by Bailis et al are used. (1990), or any other characterized strain of the so-called Saccharomyces cerevisiae yeast.
  • the transformation of yeast cells with exogenous DNA is preferably using techniques known to those skilled in the art, in particular the technique described by Schiestl et al. (1989).
  • the constructions of the different yeast strains were carried out using genetic techniques (crossing, sporulation, dissection of asci and phenotypic analysis of spores) known and described in particular by Sherman et al. (1979) and the reverse genetics techniques described in particular by Rothstein (1991).
  • the yeasts are preferably transformed by plasmids constructed according to conventional molecular biology techniques, in particular according to the protocols described by Sambrook et al. (1989) and Ausubel et al. (1990-2004).
  • Another object of the invention consists of an expression vector characterized in that it comprises an expression cassette as defined in the present description.
  • a first vector in accordance with the invention is the vector pCSY226-NLS-IKBOC which is described in the examples, and which was used for the construction of the yeast strain CYS135 deposited in the National Collection of Cultures of Microorganisms of the Institut Pasteur from Paris under the access number 1-3187.
  • a second vector in accordance with the invention is the vector pCSY226-NLS- ⁇ -TrCP which is described in the examples, and which was used for the construction of the yeast strain CYS135 deposited in the National Collection of Cultures of Microorganisms of the Institut Pasteur de Paris under access number 1-3187.
  • the present invention also relates to a recombinant yeast strain comprising, in a form integrated into its genome,
  • a first polynucleotide which comprises an open reading frame coding for the fusion protein comprising the polypeptide the polypeptide IKBOC and at least a first detectable protein, and a regulatory sequence functional in yeast cells which directs the expression of said framework open reading;
  • a second polynucleotide which comprises an open reading frame encoding a protein comprising the ⁇ -TrCP polypeptide and a functional regulatory sequence in yeast cells which directs the expression of said open reading frame;
  • the invention relates to a recombinant yeast strain conforming to the definition above, which consists of the yeast strain CYS135 deposited in the National Collection of Cultures of Microorganisms of the Institut Pasteur de Paris (CNCM) under access number 1-3187.
  • the invention also relates to a kit or kit for the screening of agents modulating the ubiquitination of the IkBoc protein by a functional protein complex ubiquitin ligase comprising the protein ⁇ -TrCP, characterized in that it comprises: (i) a first expression vector comprising an expression cassette encoding the fusion protein comprising the IkBoc polypeptide as defined above; and
  • the invention also relates to a kit or kit for the screening of agents modulating the ubiquitination of the IkBoc protein by a functional protein complex ubiquitin ligase comprising the protein ⁇ -TrCP, characterized in that it comprises yeast cells recombinant comprising, in a form inserted into their genome, respectively:
  • the above kit or kit comprises recombinant yeast cells of the yeast strain CYS 135 deposited at the CNCM under the access number 11-3187.
  • the screening method according to the invention makes it possible to visualize the activity of the ubiquitin ligase SCF ⁇ "TrCP with respect to the human IKBOC factor, substrate of the ubiquitin proteasome pathway for protein degradation.
  • This method is particularly advantageous for screening molecules or agents capable of acting on pathologies linked to the activation of NF- ⁇ B factors and to dysfunctions of the NF- ⁇ B pathway in humans such as inflammatory and immune syndromes, certain cancers, certain diseases like reperfusion injury and fungal, bacterial and viral infections.
  • the main advantages of the screening method of the invention are in particular the following: the simplicity of implementation: the induction of the activity of the ubiquitin ligase SCF ⁇ 'TrCP with respect to the factor IKBOC is carried out simply thanks to the controlled expression of human factors IKBOC and ⁇ -TrCP in yeast cells.
  • the IKBOC factor is expressed as a fusion fusion protein with an intrinsically fluorescent protein, such as GFP, the activity of artificial SCF ⁇ TrCP ubiquitin ligase with respect to the IKBOC factor is directly measured by the. quantification of the fluorescence emitted by the hybrid protein.
  • the IKBOC factor when expressed as a fusion protein fusion with a protein such as luciferase, the activity of the artificial SCF ⁇ "TrCP ubiquitin ligase with respect to the IKBOC factor is directly measured by the quantification. of the luminescence emitted by the hybrid protein in the presence of a substrate such as fluorescein.
  • adequacy with a therapeutic context the activity of ubiquitin ligase SCF ⁇ 'TrCP artificial with respect to the IKBOC factor is monitored according to a functional test carried out on whole cells
  • the in vitro screening method according to the invention therefore makes it possible to select molecules capable of activating or inhibiting the degradation of l ⁇ Boc in a context similar to that of their final therapeutic use.
  • specificity although carried out in vitro in the cell, the screening method according to the invention is specific, because it is based on co-expression, in a heterologous organism with the human organism, of the two human proteins l ⁇ Bcc and ⁇ -TrCP.
  • the molecules selected using the screening method of the invention will be specific for this ubiquitin ligase ⁇ -TrCP / IKBOC substrate protein pair, and will therefore not be molecules selected because of, for example, their ability to interfere with one numerous signaling pathways inducing the degradation of l ⁇ Bcc in human cells.
  • the degradation of IB via the artificial ubiquitin ligase SCF ⁇ TrCP , is induced by a completely artificial and totally metabolic pathway reproducible, such as the addition of glucose to block the activity of the GAL1 promoter, when IKBOC is expressed under the control of this promoter, the stability of the recombinant yeast strains: integration techniques in a chosen place of a yeast chromosome, and targeted replacement of genes allow the construction of recombinant yeast strains expressing hybrid human proteins containing either IKBOC or ⁇ -TrCP from the yeast chromosomes. These recombinant yeast strains are therefore genetically stable and can be multiplied and stored indefinitely.
  • yeast is a microorganism with rapid growth and high yield.
  • the screening method of the invention is preferably carried out by culturing the yeast cells in a complete culture medium, in which the growth of the yeast cells is particularly rapid and the yield particularly high, which makes it possible to obtain a large quantity of recombinant yeast cells for the simultaneous performance of a large number of screening tests.
  • the low cost yeast is a microorganism whose culture, storage and characterization are inexpensive
  • the automation of the screening process of the invention yeast is a microorganism whose culture, carried out in a small volume of medium , at low temperature, in a conventional atmosphere, in the air, is particularly suitable for the automation (robotization) of screening processes.
  • the screening methods according to the invention are useful in particular for selecting and characterizing active agents such as anti-inflammatory, anti-cancer, anti-viral agents, agents against fungal, bacterial or viral infections.
  • FIG. 1 illustrates the possibility for the yeast Skp1 proteins and human ⁇ -TrCP to interact in yeast cells.
  • FIG. 2 illustrates the localizations in yeast cells of the human proteins IKBOC and ⁇ -TrCP depending on whether or not they are fused to an NLS sequence of SV40.
  • Upper line fluorescence microscopy images of DNA staining of cell nuclei with the dye Hoechst 333-42.
  • Lower line fluorescence microscopy images allowing the localization of GFP expression in the cells.
  • A Cells transformed by the vector GFP-NLS- ⁇ -TrCP; B: cells transformed with the vector GFP- ⁇ -TrCP; C: cells transformed with the vector GFP-NLS-1 ⁇ Bcc; D: cells transformed by the vector GFP-IKBOC.
  • FIG. 3 illustrates how the addressing of the human protein IKBOC in the nucleus of yeast cells induces its phosphorylation on serines 32 and 36.
  • the figure represents an electrophoresis gel of the cellular proteins of the recombinant yeast strains CYS22 and CYS126, respectively.
  • FIG. 4 illustrates by an epifluorescence microscope analysis, the degradation of the tripartite fusion protein GFP-NLS-1 ⁇ B ⁇ in yeast cells when these also express the tripartite fusion protein Flag-NLS- ⁇ -TrCP.
  • FIGS. 4A to 4D represent pictures of fluorescence microscopy: upper line, staining of the DNA of the cell nuclei with the dye Hoechst 333-42; lower line, fluorescence microscopy images allowing the localization of GFP expression in the cells.
  • Figure 4A results obtained with the recombinant yeast strain CYS22;
  • Figure 4B results obtained with the recombinant yeast strain CYS61.
  • Figure 4C results obtained with the recombinant yeast strain CYS 126.
  • Figure 4D results obtained with the recombinant yeast strain CYS 135.
  • FIG. 5 illustrates, by quantification of the fluorescence emitted, the degradation of the tripartite fusion protein GFP-NLS-1 ⁇ Boc in yeast cells when these latter express or not the tripartite fusion protein Flag-NLS- ⁇ -TrCP.
  • FIG. 6 illustrates by a Western Blotting type biochemical analysis, the degradation of the tripartite fusion protein GFP-NLS-1 ⁇ Bcc in yeast cells when these also express the tripartite fusion protein Flag-NLS- ⁇ -TrCP.
  • Immunoblotting gel shots (“Western blotting”) revealed with anti-GFP antibodies and anti-FLAG peptide antibodies
  • FIG. 7 illustrates by a Western blotting biochemical analysis, the degradation of the mutant tripartite fusion protein GFP-NLS-1 ⁇ Bcc [S3236A] in which the phosphorylation sites Ser32 and Ser36 have been replaced by Ala residues, mutations which in human cells make the protein non-degradable.
  • Immunoblotting gel shots (“Western blotting”) revealed with anti-GFP antibodies and anti-FLAG peptide antibodies
  • FIG. 8 illustrates by an epifluorescence microscope analysis, the degradation of the tripartite fusion protein GFP-NLS-l ⁇ Boc [S3236A] in yeast cells when these also express the tripartite fusion protein Flag-NLS- ⁇ -TrCP .
  • FIGS. 8A and 8B represent fluorescence microscopy images: upper line, staining of the DNA of the cell nuclei with the dye Hoechst 333-42; lower line, fluorescence microscopy images allowing the localization of GFP expression in the cells.
  • Figure 8A results obtained with the recombinant yeast strain CYS138
  • Figure 8B results obtained with the recombinant yeast strain CYS139.
  • FIG. 9 illustrates, by quantification of the fluorescence emitted, the degradation of the tripartite fusion protein GFP-NLS-1 ⁇ Bcc [S3236A] in the yeast strains described above.
  • Examples 1 to 3 Construction of the recombinant vectors according to the invention.
  • the sequence of the IKBOC protein is that described in Strausberg et al. (PNAS (1999), 99 (26): 16899-16903).
  • the sequence of the ⁇ -TrCP receptor subunit of the ubiquitin ligase SCF ⁇ "TrCP complex is that described in Yaron et al. (Nature (1998) 396 (6711): 590-594).
  • GFP Green Fluorescent Protein mut3
  • the nuclear localization sequence “NLS” of the large T antigen encoded by the SV40 virus is the translation of the nucleic sequence
  • the sequence of the plasmid pRS306 is that described in Sikorski and Hieter (Genetics (1989) 122 (1): 19-27).
  • the sequence of the plasmid pRS304 is that described in Sikorski and Hieter (Genetics (1989) 122 (1): 19-27).
  • the sequence of the plasmid pRS314 is that described in Sikorski and Hieter (Genetics (1989) 122 (1): 19-27).
  • the sequence of the plasmid pRS316 is that described in Sikorski and Hieter (Genetics (1989) 122 (1): 19-27).
  • the sequence of the plasmid pSH 18-34 which contains four LexA operators placed upstream of the LacZ gene is that described by Hanes and Brent (Cell (1989), 57: 1275-1293)
  • the sequence of the plasmid pLexSkp1-1, which allows the expression of the yeast protein Skp1 fused to the bacterial protein LexA, is that described in Patton et al. (Genes & Dev (1998), 12: 692-705)
  • the sequence of the plasmid pGAD ⁇ TrCP, which allows the expression of the human protein ⁇ -TrCP fused to the activating domain of the yel Gal4 transcription factor nel is that described in Margottin et al. (Molec. Cell (1998), 1: 565-574).
  • TEF1 gene promoter from the yeast S. cerevisiae used in the descriptions which follow is that described by Schaaff-Gerstenschlager et al. (Eur. J. Biochem. (1993) 217 (1): 487-492).
  • the sequence of the promoter of the MET25 gene of the yeast S. cerevisiae used in the descriptions which follow is that described in Kerjan et al. (Nucleic Acids Res. (1986) 14 (20): 7861-7871).
  • the sequence of the promoter of the PH05 gene of the yeast S. cerevisiae used in the descriptions which follow is that described by Feldmann et al. (EMBO J. (1994) 13 (24): 5795-5809).
  • the names are made using the nomenclature and the typographic rules in use in the community of biologists specialized in the yeast Saccharomyces cerevisiae.
  • the name of the wild form of a gene is given in capital letters; example: GAL1.
  • the name of a mutant form of a gene is given in lowercase italics, the allele number if known is specified after a dash; example cup1-1.
  • the name of an inactivated allele of a gene is given in lower case followed by 2 colon followed by the name of the inactivating gene ex ppr1 :: TRP1 (in this example the inactivated gene pprl was interrupted by the active gene TRP1).
  • the name of an inactivated gene can be given by the symbol "delta"; example gal4A the name of the protein is that of the gene which codes it is given in lower case, except the first letter which is in upper case ex Gal4 (alternatively one can use the same symbol followed by a p; example Gal4p).
  • EXAMPLE 1 Construction of the plasmids allowing expression in yeast of the fusion proteins GFP-l ⁇ Boc and GFP-NLS-l ⁇ B ⁇ .
  • the following plasmids allow the expression in yeast Saccharomyces cerevisiae of derivatives of the human protein IKBOC fused with a variant of Green Fluorescent Protein (GFP) to Aequora Victoria.
  • GFP Green Fluorescent Protein
  • the fusion proteins constructed may or may not include the nuclear localization sequence of the large T antigen of the SV40 virus. The introduction of this sequence makes it possible to address fusion proteins which comprise it in the nuclear compartment.
  • a fragment of 620 base pairs (bp) corresponding to the promoter of the GAL1 gene (pGAL1) of the yeast Saccharomyces cerevisiae was amplified by Polymerase Chain Reaction (PCR) from genomic DNA of a wild strain of S. cerevisiae X2180 -1A, using the oligonucleotides "pGAL1 (Asp) Forw" of sequence
  • the fragment obtained was digested with the restriction enzymes Asp718l and EcoRI and inserted into the shuttle plasmid S.ce ⁇ ev / s / ae-E.co // pRS306 previously digested with the enzymes AspT'IB and EcoRI, producing the vector pRS306- pGAL1.
  • the fragment obtained was digested with the restriction enzymes SamHI and EcoRI and inserted into the plasmid pRS306-pGAL1 previously digested with the enzymes SamHI and EcoRI, producing the vector pRS306-pGAL1-yEGFP3.
  • a fragment of 340 base pairs (bp) corresponding to the terminator of the ADH1 gene (tADH1) of the yeast Saccharomyces cerevisiae was amplified by Polymerase Chain Reaction (PCR) from genomic DNA of a wild strain of S. cerevisiae X2180 -1A, using the oligonucleotides "TermADH1 (NotlBstXI) 5 '" of sequence 5'- GGCGGCGGCCGCCACCGCGGTGGGCGAATTTCTTATGATTTATG-3' [SEQ ID N ° 10] and "TermADHI (Sacl) 3 '" of sequence 5'-GGCGGACAGAGCTGA' SEQ ID No. 11].
  • PCR Polymerase Chain Reaction
  • the fragment obtained was digested with the restriction enzymes Sac1 and Noti and inserted into the plasmid pRS306-pGAL1-yEGFP3 previously digested with the enzymes Sac1 and Noti, producing the vector pCSY226.
  • the gene coding for the protein IKBOC was purified from the plasmid pGad1318-lkBa by digestion with the restriction enzyme Xba ⁇ followed by treatment with the Klenow fragment of DNA polymerase I in order to transform the cohesive end in 3 ′ of the blunt-ended fragment, then of a second digestion with the Bam ⁇ restriction enzyme for the 5 ′ end of the gene.
  • the fragment was cloned into the plasmid pCSY226 prepared by digestion with the restriction enzyme Kpn ⁇ , followed by treatment with the Klenow fragment, then digestion with the restriction enzyme Bam ⁇ .
  • the vector produced was called pCSY226-l ⁇ Bcc.
  • a version of this vector additionally contains the NLS nuclear addressing sequence. This was obtained by synthesizing a pair of oligonucleotides complementary to sequence
  • EXAMPLE 2 Construction of the plasmids allowing expression in yeast of the fusion proteins GFP- ⁇ -TrCP and GFP-NLS- ⁇ -TrCP.
  • the following plasmids allow the expression in yeast Saccharomyces cerevisiae of derivatives of the human protein ⁇ -TrCP fused with a variant of the Green Fluorescent Protein (GFP) to Aequora Victoria.
  • GFP Green Fluorescent Protein
  • the fusion proteins constructed may or may not include the nuclear localization sequence of the large T antigen of the SV40 virus. The introduction of this sequence makes it possible to address fusion proteins which comprise it in the nuclear compartment.
  • a fragment of 620 base pairs (bp) corresponding to the promoter of the GAL1 gene (pGAL1) from the yeast Saccharomyces cerevisiae was amplified by Polymerase Chain Reaction (PCR) from genomic DNA from a wild strain of S.cerevisiae X2180-1A, using the oligonucleotides "pGAL1 (Asp) Forw” of sequence 5'-GCTGGGTACCTTAATAATCATATTACATGGCATTA-3 '[SEQ ID N ° 6] and
  • the fragment obtained was digested with the restriction enzymes Asp7 ⁇ 8 and EcoRI and inserted into the shuttle plasmid S.cerevisiae-E.coli pRS306 previously digested with the enzymes Asp7181 and EcoRI, producing the vector pRS306-pGAL1.
  • the fragment obtained was digested with the restriction enzymes ⁇ amHI and EcoRI and inserted into the plasmid pRS306-pGAL1 previously digested with the enzymes SamHI and EcoRI, producing the vector pRS306-pGAL1-yEGFP3.
  • a fragment of 340 base pairs (bp) corresponding to the terminator of the ADH1 gene (tADH1) of the yeast Saccharomyces cerevisiae was amplified by Polymerase Chain Reaction (PCR) from genomic DNA of a wild strain of S.
  • the fragment obtained was digested with the restriction enzymes Sac1 and Noti and inserted into the plasmid pRS306-pGAL1-yEGFP3 previously digested with the enzymes Sac1 and Noti, producing the vector pCSY226.
  • the gene coding for the protein ⁇ TrCP was purified from the plasmid pGad1318- ⁇ TrCP by digestion with the restriction enzymes SamHI and Noti.
  • the fragment was cloned into the plasmid pCSY226 prepared by digestion with the restriction enzymes ⁇ amHI and Noti.
  • the vector produced was called pCSY226- ⁇ TrCP.
  • a version of this vector additionally contains the NLS nuclear addressing sequence. This was obtained by synthesizing a pair of oligonucleotides complementary to sequence
  • NLS-3 ' 5'-AATTCGACCTTTCTCTTCTTTTTTGGAGGT-3' [SEQ ID No. 26] rehybridized to form double stranded DNA.
  • This DNA fragment was then incorporated into the vector pCSY226- ⁇ TrCP digested with the restriction enzyme ScrFI to give the vector pCSY226-NLS- ⁇ TrCP.
  • EXAMPLE 3 Construction of the plasmids allowing expression in yeast of the fusion proteins GFP- ⁇ -TrCP and GFP-NLS- ⁇ -TrCP.
  • the following plasmids allow the expression in yeast Saccharomyces cerevisiae of derivatives of the ⁇ -TrCP protein comprising a repetition of three Flag antigenic motifs at their amino terminus.
  • the expression of these fusion proteins is induced by culturing the yeast cells hosting these plasmids in the presence of 2 to 5% of galactose in the culture medium for 1 to 10 hours.
  • a 700 base pair (bp) fragment corresponding to the promoter of the PGK1 gene (pPGK1) from the yeast Saccharomyces cerevisiae was amplified by Polymerase Chain Reaction (PCR) from genomic DNA of a wild strain of S. cerevisiae X2180 -1A, using the oligonucleotides "pPGK1-Asp718-5 '" of sequence 5'-GGCGGGTACCGTGAGTAAGGAAAGAGTGAGG-3' [SEQ ID No. 13] and "pPGK-EcoRI-3 '" of sequence 5'-GGCGGAATTCTGTTTTATATTTGTTGTAAAAAG-3 SEQ ID No. 14].
  • the fragment obtained was digested with the restriction enzymes Asp718l and EcoRI and inserted into the shuttle plasmid S.cerevisiae-E.coli pRS304 previously digested with the enzymes Asp718l and EcoRI, producing the vector pRS304-pPGK1.
  • a fragment of 100 base pairs (bp) corresponding to a succession of 3 FLAG reporter sequences (3FLAG) was amplified by Polymerase Chain Reaction (PCR) from the vector p3XFLAG-myc-CMV-24 5Sigma Aldrich), using the "3FLAG- EcoRI-5 '" oligonucleotides of sequence 5'-GGCGGAATTCATGGACTACAAAGACCATGACGG-3 '[SEQ ID N ° 15] and “3FLAGBamHI (Smal / Srfl Pstl) 3'” of sequence 5'-
  • the fragment obtained was digested with the restriction enzymes ⁇ amHI and EcoRI and inserted into the plasmid pRS304-pPGK1 previously digested with the enzymes SamHI and EcoRI, producing the vector pRS304-pPGK1-3FLAG.
  • a fragment of 340 base pairs (bp) corresponding to the terminator of the ADH1 gene (tADH1) of the yeast Saccharomyces cerevisiae was amplified by Polymerase Chain Reaction (PCR) from genomic DNA of a wild strain of S. cerevisiae X2180 -1A, using the oligonucleotides "TermADH1 (NotlBstXI) 5 '" of sequence 5'- GGCGGCGGCCGCCACCGCGGTGGGCGAATTTCTTATGATTTATG-3' [SEQ ID No. 10] and "TermADH1 (Sacl) 3 '" of sequence 5'-GGCGAAGAGATTG SEQ ID No. 11].
  • PCR Polymerase Chain Reaction
  • the fragment obtained was digested with the restriction enzymes Sac1 and Noti and inserted into the plasmid pRS304-pPGK1 -3FLAG previously digested with the enzymes Sac1 and Noti, producing the vector pCSY614.
  • the gene coding for the protein ⁇ TrCP was purified from the plasmid pGad1318- ⁇ TrCP by digestion with the restriction enzymes ⁇ amHI and Noti. The fragment was cloned into the plasmid pCSY614 prepared by digestion with the restriction enzymes BamHI and Noti. The vector produced was called pCSY614- ⁇ TrCP. A version of this vector additionally contains the NLS nuclear addressing sequence. This was obtained by synthesizing a pair of oligonucleotides complementary to sequence
  • EXAMPLE 4 Interaction between the yeast Skp1 proteins and human ⁇ -TrCP in yeast cells.
  • ⁇ -galactosidase activity in cellular extracts produced in such cells demonstrates that the expression of this reporter gene is induced by a factor 15, in comparison with its expression in cells expressing only one of the two fusion proteins described above.
  • This induction of expression of the reporter gene indicates that the Skp1 protein of the yeast Saccharomyces cerevisiae is capable of interacting with the human ⁇ -TrCP protein.
  • the ⁇ -galactosidase activity is expressed in nmoles of substrate transformed per minute and per mg of proteins (nmoles / min / mg).
  • EXAMPLE 5 localization, in yeast cells, of human proteins l ⁇ B ⁇ and ⁇ -TrCP depending on whether or not they are fused to an NLS sequence of SV40.
  • Yeast cells comprising plasmids allowing expression of the hybrid proteins either GPF-1 ⁇ Boc, or GFP-NLS-1 ⁇ Bcc, or GFP- ⁇ -TrCP, or GFP-NLS- ⁇ -TrCP from the promoter GAL1 were cultured in presence of 2% galactose for 2 hours and were then observed under fluorescence microscopy. The position of the nucleus was revealed using a specific color indicator of the nucleus, the Hoescht 333-42.
  • EXAMPLE 6 Phosphorylation of the IKBOC protein in the nucleus of yeast cells.
  • Example 6 illustrates how the addressing of the human protein IKBOC in the nucleus of yeast cells induces its phosphorylation on serines 32 and 36.
  • Example 7 illustrates, by an epifluorescence microscope analysis, the degradation of the tripartite fusion protein GFP-NLS-1 ⁇ Bcc in yeast cells when these also express the tripartite fusion protein Flag-NLS- ⁇ -TrCP.
  • yeast strain CYS22 MA Ta, his3, Ieu2, trpl, ura3 :: pGAL1- GFP-l ⁇ Ba :: URA3 expressing the fusion protein GFP-l ⁇ Bcc without NLS and localized in the cytoplasm of yeast cells;
  • yeast strain CYS61 (MATa, his3, Ieu2, ura3 :: pGAL1-GFP- l ⁇ B ⁇ :: URA3, trp1 :: pGAL1-3Flag- ⁇ TrCP :: TRP1) expressing the fusion proteins GFP-l ⁇ Boc and Flag- ⁇ -TrCP , located in the cytoplasm of yeast cells;
  • yeast strain CYS126 (MATa, his3, Ieu2, trpl, ura3 :: pGAL1- GFP-NLS-l ⁇ B ⁇ :: URA3) expressing the fusion protein GFP-NLS-l ⁇ Bcc located in the nucleus of yeast cells;
  • yeast strain CYS135 (MATa, his3, Ieu2, ura3 :: pGAL1-GFP- NLS-l ⁇ B ⁇ :: URA3, trp1 :: pGAL1-3Flag-NLS- ⁇ TrCP :: TRP1) expressing the fusion proteins GFP-NLS-l ⁇ Bcc and Flag-NLS- ⁇ -TrCP localized in the nucleus of yeast cells.
  • Example 8 illustrates, by quantification of the fluorescence emitted, the degradation of the tripartite fusion protein GFP-NLS-1 ⁇ Boc in yeast cells when these latter express or not the tripartite fusion protein Flag-NLS- ⁇ -TrCP.
  • the yeast strains identical to those described in FIG. 4, and cultivated under the same conditions as those described in FIG. 4, were analyzed by fluorescence microscopy. For each strain, the fluorescence of 200 cells (at least) was measured just before (t 0) and 10, 20, 30 and 60 minutes after the addition of glucose, using the LUCIA G software. The results are given in quantity of fluorescence measured per cell in arbitrary unit.
  • proteins are analyzed by the Western blotting technique using an antibody recognizing the GFP part of the fusion proteins containing I KBOC (indicated “GFP-NLS-l ⁇ B ⁇ ”) and an antibody recognizing the Flag part of the fusion protein Flag-NLS- ⁇ -TrCP (indicated "Flag-NLS- ⁇ -TrCP”).
  • the quantity of proteins deposited in each well is checked by analyzing the same proteins using antibodies recognizing the yeast Lysyl-tRNA synthase (indicated “LysRS”). Proteins from the parental yeast strain expressing no fusion protein (indicated as "control”) serve as a control for specificity.
  • yeast strain CYS22 (MATa, his3, Ieu2, trpl, ura3 :: pGAL1- GFP-l ⁇ B ⁇ :: URA3) expressing the fusion protein GFP-l ⁇ Bcc without NLS and localized in the cytoplasm of yeast cells
  • yeast strain CYS61 (MATa, his3, Ie ⁇ 2, ura3 :: pGAL1-GFP- l ⁇ B ⁇ :: URA3, trp1 :: pGAL1-3Flag- ⁇ TrCP :: TRP1) expressing the fusion proteins GFP-l ⁇ Boc and Flag- ⁇ -TrCP , located in the cytoplasm of yeast cells
  • yeast strain CYS126 (MATa, his3, Ieu2, trpl, ura3 :: pGAL1- GFP-NLS-l ⁇ B ⁇ :: URA3) expressing the fusion protein GFP-NLS-l ⁇ Boc located in the nu
  • Example 10 illustrates by a Western blotting biochemical analysis, the degradation of the mutant tripartite fusion protein GFP-NLS-1 ⁇ Boc [S3236A] in which the phosphorylation sites Ser32 and Ser36 have been replaced by Ala residues, mutations which in human cells make the protein non-degradable.
  • the analysis was carried out in yeast cells also or not expressing the flag-NLS- ⁇ -TrCP tripartite fusion protein. All the strains used were cultivated and analyzed in an identical manner. The cells were cultured in a rich medium in the presence of galactose as a carbon source for 120 minutes.
  • yeast strain CYS138 (MATa, his3, Ieu2, trpl, ura3 :: pGAL1- GFP-NLS-l ⁇ B ⁇ [S3236A] :: URA3) expressing the mutant fusion protein GFP-NLS-l ⁇ B ⁇ [S3236A] located in the nucleus of yeast cells;
  • yeast strain CYS 139 (MATa, his3, Ieu2, ura3 :: pGAL1-GFP- NLS-l ⁇ B ⁇ [S3236A] :: URA3, trp1 :: pGAL1-3Flag-NLS- ⁇ TrCP :: TRP1) expressing the GFP fusion proteins -NLS-l ⁇ B ⁇ [S3236A] and Flag- NLS- ⁇ -TrCP located in the nucleus of yeast cells.
  • Example 11 illustrates, by an epifluorescence microscope analysis, the degradation of the tripartite fusion protein GFP-NLS-l ⁇ B ⁇ [S3236A] in yeast cells when these also express the tripartite fusion protein Flag-NLS- ⁇ - TrCP.
  • the fluorescence of the fusion proteins GFP-1ccBcc or GFP-NLS-1 ⁇ Boc is indicated “GFP”.
  • the position of the nucleus (indicated "DNA") in the cells was revealed by using a specific nucleus colored indicator, Hoescht 333-42.
  • Example 12 illustrates, by quantification of the fluorescence emitted, the degradation of the tripartite fusion protein GFP-NLS-1 ⁇ Bcc [S3236A] in the yeast strains described above.
  • Table 1 Genotype of the Saccharomyces cerevisiae yeast strains constructed for the purposes of the present invention.
  • Kuras et al. (EMBO J. (1996) 15 (10): 2519-2529). Kuras et al. (Mol. Cell (2002), 10: 69-80).
  • Patton et al. (Genes & Dev (1998), 12: 692-705) Patton et al. Genes & Dev (1998), 12: 692-705.

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Abstract

Procédé pour le criblage d’agents modulant l’ubiquitination de la protéine IκBα par un complexe protéique fonctionnel ubiquitine ligase comprenant la protéine β-TrCP, ledit procédé comprenant les étapes suivantes: (a) mettre en contact un agent candidat à tester avec des cellules de levure recombinantes qui expriment dans leur noyau : (i) une protéine de fusion comprenant le polypeptide IκBα et au moins une première protéine détectable ; et (ii) une protéine comprenant le polypeptide β-TrCP ; (b) quantifier ladite première protéine détectable dans les cellules de levure, à la fin d’au moins une période de temps prédéterminée après la mise en contact de l’agent candidat avec lesdites cellules ; (c) comparer la valeur obtenue à l’étape (b) avec une valeur témoin obtenue lorsque l’étape (a) est réalisée en l’absence de l’agent candidat.

Description

Procédé de criblage d'agents modulant l'ubiquitination de la protéine IkB et moyens destinés à la mise en œuyre dudit procédé
DOMAINE DE L'INVENTION
La présente invention se rapporte au domaine du criblage d'agents biologiquement actifs capables de moduler l'ubiquitination de la protéine IKBCC, en particulier d'agents d'intérêt thérapeutique, et encore plus spécifiquement d'agents thérapeutiques destinés à prévenir ou traiter des affections inflammatoires, des affections auto-immunes ou des cancers.
ETAT DE LA TECHNIQUE
L'un des grands problèmes médicaux non résolu demeure la mise au point de traitements effectifs des syndromes inflammatoires et auto- immuns. Ces pathologies sont actuellement traitées à l'aide de molécules comme des anti-inflammatoires non stéroïdiens tels que l'aspirine et l'ibuprofène, et les corticostéroïdes, molécules à l'efficacité limitée et présentant des effets toxiques non négligeables. Les inhibiteurs plus spécifiques des cyclooxygénases, comme le réfécoxib et les agents bloquant le facteur de nécrose tumorale (TNF), apparus plus récemment sur le marché, se sont révélés présenter les mêmes inconvénients.
Les facteurs de transcription de la famille NF-κB font partie des premiers moyens de défense de l'organisme lors d'infections virales, bactériennes ou fongiques et également lors de situations physiologiques de stress. Ces facteurs transcriptionnels dirigent l'expression d'un nombre important de gènes, et notamment de nombreux gènes codant pour des médiateurs de l'inflammation. Parmi ces gènes, on peut citer les gènes codant le facteur TNF-α, les interleukines IL-1 , IL-6, IL-8, les molécules d'adhésion ICAM-1 , VCAM-1 et la E-Sélectine, la NO synthase ou encore la prostaglandine synthase Cox2.
Les facteurs de la famille NF-κB sont activés par une grande variété de stimuli pathogènes, aussi bien endogènes qu'exogènes, ce qui inclut des protéines ou lipides bactériens, les cytokines, les facteurs de croissance et des molécules liées à des situations de stress oxydatif. L'activation des facteurs NF-κB, en réponse à ces stimuli pathogènes, est observée pour la presque totalité des cellules impliquées dans la réponse immune, telles que les cellules épithéliales, les cellules du mésenchyme, les lymphocytes, les cellules neutrophiles et les macrophages.
Bien que l'étiologie exacte de la plupart des syndromes inflammatoires chroniques reste indéterminée à ce jour, des résultats expérimentaux, y compris des résultats d'études cliniques, ont montré le rôle important de l'activation du facteur NF-κB, à la fois dans l'initiation de l'inflammation et dans l'installation d'un état d'inflammation chronique. Le blocage de l'activation des facteurs appartenant à la famille NF-κB constitue donc une voie efficace pour traiter des syndromes inflammatoires tels que l'asthme, l'arthrite rhumatoïde, les colopathies inflammatoires, telle que la maladie de Crohn, les scléroses multiples ou le psoriasis (Bal lard, 2001 ; Baud et Karin, 2001).
Il est maintenant établi que la réponse inflammatoire et l'activation du facteur NF-κB est étroitement liée à la destruction du facteur lκBα par la voie ubiquitine protéasome (Kroll et al, 1999; Winston et al, 1999). En effet dans des cellules non stimulées ou non-activées, le facteur NF-κB est séquestré dans le cytoplasme des cellules. Dans des cellules non stimulées ou non activées, le facteur NF-kB est donc incapable d'activer l'expression des gènes cibles de ce facteur. L'activation des gènes cibles nécessite tout d'abord la translocation du facteur NFkB du cytoplasme vers le noyau. Cette translocation est déclenchée par la dégradation du facteur lκBα par la voie ubiquitine protéasome. Le facteur lκBα est en effet une protéine qui séquestre les facteurs NF-κB dans le cytoplasme des cellules non stimulées (Hay et al., 1999).
Des stimuli inflammatoires exogènes, telle qu'une infection virale ou bactérienne, activent une voie de signalisation qui provoque la phosphorylation du facteur IKBOC. Cette phosphorylation a lieu spécifiquement sur les résidus Serine en positions 32 et 36 de la séquence d'acides aminés du facteur lκBα. Le facteur lκBα est phosphorylé par le complexe protéique kinase lκ . Lorsqu'il est ainsi phosphorylé, le facteur lκBα est reconnu par l'ubiquitine ligase SCFβ TrCp (Kroll et al, 1999; Winston et al, 1999). La reconnaissance du facteur IKBCC par l'ubiquitine ligase SCFβ TrCp provoque la poly-ubiquitination de ce facteur. Après ubiquitination, le facteur lκBα est alors reconnu et dégradé par le protéasome. La destruction du facteur lκBα provoque la libération du facteur cytoplasmique NF-κB. Le facteur NF-κB subit une translocation du cytoplasme vers le noyau. Une fois localisé dans le noyau des cellules stimulées, le facteur NF-κB reconnaît spécifiquement les promoteurs de gènes cibles et active fortement leur transcription: la réponse inflammatoire est installée (Ben Neriah, 2002).
De nombreuses données expérimentales semblent confirmer que la libération du facteur NF-κB, qui est induite par la dégradation du facteur lκBα phosphorylé, constitue une étape essentielle pour l'initiation de l'inflammation et également pour l'installation d'une situation d'inflammation chronique (Magnani et al, 2000; Lewis et Manning, 1999).
Il existe un besoin dans l'état de la technique pour de nouveaux composés anti-inflammatoires, que ce soit pour le traitement d'un état inflammatoire aigu ou d'un état inflammatoire chronique. En particulier, il existe un besoin pour des composés anti-inflammatoires qui soient à la fois plus efficaces et plus spécifiques que les composés anti- inflammatoires connus. De tels composés anti-inflammatoires, du fait de leur spécificité vis-à-vis d'une cible biologique, seraient susceptibles de posséder des effets secondaires indésirables réduits, voire d'être exempts de tout effet secondaire indésirable.
Il existe aussi un besoin pour la mise au point de procédés pour identifier des composés d'intérêt thérapeutique, plus spécifiquement des composés anti-inflammatoires à effet amélioré, du type de ceux ci- dessus.
DESCRIPTION DE L'INVENTION Description générale du procédé de criblage de l'invention
Selon l'invention, on a mis au point un procédé de criblage d'agents d'intérêt thérapeutique, qui sont sélectionnés pour leur spécificité d'action sur l'ubiquitination de la protéine humaine lκB par un complexe ubiquitine ligase comprenant la protéine humaine β-TrCP. Le demandeur a montré que, de manière surprenante, il était possible de mimer, dans des cellules de levure, le processus de dégradation du facteur h B par le protéasome, processus qui a lieu naturellement dans les cellules humaines.
De manière surprenante, on a montré selon l'invention qu'il était possible de créer artificiellement, dans des cellules de levure, un complexe protéique possédant l'activité ubiquitine ligase et la spécificité de reconnaissance du complexe SCFβ TrCp qui est produit naturellement dans les cellules humaines. Ainsi, selon l'invention, on a reconstitué, dans des cellules de levure, un complexe ubiquitine ligase artificiel comprenant des protéines de levure auxquelles est associée la protéine humaine β-TrCP. En particulier, on a montré que la protéine humaine β- TrCP , lorsqu'elle est artificiellement exprimée dans les cellules de levure, s'associe à la protéine Skp1 de levure, laquelle protéine Skp1 de levure est contenue dans un complexe protéique ubiquitine ligase de levure. Ainsi, dans une cellule de levure dans laquelle on inséré une cassette d'expression codant la protéine humaine β-TrCP, la protéine β- TrCP s'associe au complexe protéique SCF de levure qui comprend (i) un cœur catalytique constitué de l'association des protéines Skp1 , Cdc53 et Hrt1 , ledit cœur catalytique étant lui-même associé à l'enzyme E2 Cdc34. On a montré que ce complexe protéique hybride levure/homme est capable de mimer, dans des cellules de levure, l'activité ubiquitine ligase exercée dans des cellules humaines par le complexe SCFβ~TrCp humain naturel.
De manière tout aussi surprenante, on a montré selon l'invention que, dans les cellules de levure, ce complexe protéique artificiel possédant l'activité ubiquitine ligase du complexe SCFβ'TrC humain n'est biologiquement actif que lorsque ce complexe artificiel est localisé dans le noyau cellulaire. Au contraire, dans les cellules humaines, le complexe SCFβ TrCp naturel exerce son activité biologique dans le cytoplasme des cellules humaines, compartiment cellulaire dans lequel il réalise l'ubiquitination d'une seconde protéine également localisée dans le cytoplasme, le facteur IKBOC. On a aussi montré selon l'invention que le complexe artificiel ubiquitine ligase qui a été mis au point n'est actif, dans le processus de dégradation du facteur lκB , que lorsque le facteur IKBOC est co-localisé dans le noyau avec ledit complexe artificiel ubiquitine ligase.
Ainsi, on a montré selon l'invention que, dans des cellules de levure, le complexe protéique artificiel ubiquitine ligase comprenant la protéine humaine β-TrCP est capable de réaliser l'ubiquitination du facteur lκBα humain, lorsque la protéine β-TrCP et le facteur IKBOC sont artificiellement exprimés dans le noyau cellulaire.
Enfin, on a également montré que, dans des cellules de levure, l'ubiquitination du facteur lκBα par le complexe ubiquitine ligase artificiel nouveau, bien que cette ubiquitination soit réalisée dans le noyau de la cellule, et non dans le cytoplasme cellulaire, provoque néanmoins la dégradation du facteur lκBα ubiquitine par le protéasome.
L'ensemble des résultats surprenants ci-dessus a permis au demandeur de mettre au point un procédé de criblage d'agents capables de moduler la dégradation du facteur lκBα dans les cellules de levure, en présence d'un complexe ubiquitine ligase artificiel mimant l'activité biologique du complexe ubiquitine ligase humain SCFβ TrCp naturel.
L'invention a pour objet un procédé pour le criblage in vitro d'agents modulant l'ubiquitination de la protéine lκBα par un complexe protéique fonctionnel ubiquitine ligase comprenant la protéine β-TrCP, ledit procédé comprenant les étapes suivantes : (a) mettre en contact un agent candidat à tester avec des cellules de levure recombinantes qui expriment dans leur noyau : (i) une protéine de fusion comprenant le polypeptide It Bα et au moins une première protéine détectable ; et (ii) une protéine comprenant le polypeptide β-TrCP ; (b) quantifier ladite première protéine détectable dans les cellules de levure, à la fin d'au moins une période de temps prédéterminée après la mise en contact de l'agent candidat avec lesdites cellules ; (c) comparer la valeur obtenue à l'étape (b) avec une valeur témoin obtenue lorsque l'étape (a) est réalisée en l'absence de l'agent candidat.
Le procédé ci-dessus permet à l'homme du métier de déterminer si un agent à tester est capable de modifier la vitesse de dégradation, ou le degré de dégradation, du facteur IKBOC par le protéasome, dans les cellules de levure exprimant à la fois la protéine β-TrCP et le facteur IkBoc humains.
Le procédé de criblage in vitro ci -dessus, du fait qu'il met en œuvre un système d'ubiquitination artificiel humanisé dans des cellules de levure, permet un criblage d'agents qui agissent de manière spécifique sur l'activité des seules protéines humaines exprimées dans ces cellules.
De plus, grâce au procédé ci-dessus, on a mis au point un test physiologique de criblage d'agents actifs sur la voie ubiquitine ligase, en construisant chez la levure une voie métabolique de dégradation protéique mimant la voie de dégradation par le protéasome du facteur IKBOC humain. Ainsi, du point de vue de la voie métabolique de dégradation des protéines qui est visée, le procédé de l'invention est réalisé dans des conditions physiologiques très proches des conditions physiologiques de dégradation des protéines par le protéasome humain.
Grâce au procédé ci-dessus, on peut identifier les agents capables d'inhiber la vitesse ou le degré de dégradation du facteur IKBOC par le protéasome des cellules de levure. De tels agents inhibiteurs, identifiés grâce au procédé de l'invention, du fait qu'ils vont inhiber également la dégradation du facteur IKBOC dans les cellule humaines, constituent des agents d'intérêt thérapeutique susceptibles d'inhiber ou de bloquer la translocation du facteur NF-κB dans le noyau cellulaire et, en conséquence, inhiber ou bloquer l'activation, par NF-κB, de divers gènes impliqués dans l'inflammation, des pathologies d'auto-immunité ou encore des cancers.
Ainsi, le procédé de criblage in vitro ci -dessus peut comprendre une étape additionnelle (d) qui consiste à sélectionner positivement les agents candidats inhibiteurs pour lesquels la quantité de protéine détectable mesurée à l'étape (b) est inférieure à la valeur témoin de comparaison.
Le procédé de l'invention permet aussi d'identifier des agents capables d'augmenter la vitesse ou le degré de dégradation du facteur IKBOC par le protéasome des cellules de levure. De tels agents activateurs sont susceptibles d'induire ou d'augmenter la translocation du facteur NF-κB dans le noyau cellulaire et, en conséquence, d'induire ou d'augmenter l'activation, par NF-κB, de divers gènes impliqués dans l'inflammation, des pathologies d'auto-immunité ou des cancers. Ainsi, selon ce second aspect, le procédé de criblage in vitro de l'invention permet de cribler des agents pro-inflammatoires. Certains des agents pro-inflammatoires sélectionnés selon le procédé sont susceptibles de revêtir un intérêt thérapeutique lorsqu'ils sont utilisés à faible dose ou lorsqu'ils sont administrés pendant une courte durée, par exemple en tant qu'agents inducteurs d'une réponse immune précoce, telle que l'induction d'une réaction de résistance non spécifique à l'infection ou encore telle que l'activation des cellules présentatrices de l'antigène, pour l'initiation d'une réponse immunitaire spécifique d'un antigène, qu'elle soit à médiation humorale ou à médiation cellulaire. Certains autres agents pro- inflammatoires sélectionnés selon le procédé de criblage in vitro de l'invention peuvent consister en des principes actifs connus, notamment des principes actifs de médicament, dont un effet pro-inflammatoire indésirable est identifié, et pour lesquels des précautions d'emploi particulières vis-à-vis de la santé humaine devront être observées.
Ainsi, selon un autre aspect, le procédé de criblage selon l'invention peut comprendre une étape additionnelle (d) qui consiste à sélectionner positivement les agents candidats activateurs, pour lesquels la quantité de protéine détectable mesurée à l'étape (b) est supérieure à la valeur témoin de comparaison.
Ainsi, un agent qui « module » l'ubiquitination de la protéine β-TrCP consiste (i) en un agent qui augmente ou au contraire consiste (ii) en un agent qui inhibe ou bloque la dégradation de la protéine β-TrCP qui est détectée à l'étape (b) du procédé de criblage de l'invention, par rapport à une situation témoin de dégradation de cette protéine, lorsque le procédé est réalisé en l'absence de l'agent testé.
Comme on l'aura compris, l'agent modulant l'ubiquitination de la protéine β-TrCP peut être de toute nature. Ledit agent peut être tout composé organique ou minéral, et peut être soit un agent d'origine naturelle, soit un agent produit, au moins en partie, par synthèse chimique ou biologique. Ledit agent peut être notamment un peptide ou protéine. Ledit agent englobe aussi toute molécule déjà connue pour posséder un effet biologique, notamment un effet thérapeutique, ou à l'inverse un effet toxique démontré ou suspecté pour l'organisme.
Dans le procédé de l'invention, une fois que la protéine de fusion IKBOC- protéine détectable est ubiquitinylée par le complexe SCF artificiel comprenant le polypeptide β-TrCP, ladite protéine de fusion subit une protéolyse qui est effectuée par le complexe multi -catalytique du protéasome. La quantification de la protéine détectable contenue dans la cellule de levure, à un instant donné, permet de déterminer le degré de dégradation de ladite protéine de fusion lκBα-protéine détectable, à cet instant donné.
Selon l'invention on a montré que la sensibilité du procédé de criblage décrit ci-dessus est accrue lorsque, préalablement à la mise en contact des cellules de levure avec l'agent à tester, on favorise l'accumulation de la protéine cible de fusion lκBα-protéine détectable dans le noyau cellulaire.
Ainsi, selon un premier mode de réalisation préféré du procédé ci- dessus, l'étape (a) comprend elle-même les étapes suivantes :
(ai) cultiver les cellules de levure qui expriment dans leur noyau une protéine de fusion comprenant le polypeptide IKBOC et au moins une première protéine détectable ; (a2) stopper l'expression de ladite protéine de fusion comprenant le polypeptide I KBOC et au moins une première protéine détectable par les cellules de levure ; (a3) mettre en contact les cellules de levures obtenues à la fin de l'étape (a2) avec l'agent candidat à tester.
L'arrêt de l'expression de la protéine de fusion lκBα-protéine détectable, à un moment choisi, peut être facilement réalisé par l'homme du métier, en utilisant, pour transformer les cellules de levure, une cassette d'expression dans laquelle le polynucléotide codant ladite protéine de fusion est placé sous le contrôle d'un promoteur fonctionnel dans les cellules de levure et dont l'activation, ou à l'inverse la répression, est induite par un agent inducteur. De nombreux promoteurs inductibles actifs dans des cellules de levure sont connus par l'homme du métier, dont certains d'entre eux sont décrits plus loin dans la description, y compris dans les exemples. L'accumulation de la protéine de fusion lκBoc-protéine détectable dans le noyau des cellules de levure, pendant l'étape (ai) du procédé, permet l'obtention d'un fort signal de détection de la protéine détectable, au début du procédé. Ces conditions de fort signal permettent de quantifier avec une grande sensibilité la protéine détectable pendant toute la durée du procédé, au fur et à mesure de la dégradation de la protéine de fusion ItcBoc-protéine détectable par le protéasome, après qu'elle ait été ubiquitinylée par le complexe SCF artificiel comprenant la protéine β- TrCP. De manière évidente, plus le signal détectable de départ est fort, meilleure est la sensibilité des mesures lors de la mise en œuvre du procédé.
Selon un premier aspect du mode de réalisation ci-dessus, les cellules de levure expriment la protéine comprenant le polypeptide β-TrCP durant la totalité des étapes (ai ), (a2) et (a3).
Selon un second aspect du mode de réalisation ci-dessus, les cellules de levure expriment la protéine comprenant le polypeptide β-TrCP durant la totalité des étapes (a2) et (a3) et n'expriment pas la protéine comprenant le polypeptide β-TrCP durant l'étape (ai).
Selon ce second aspect, le contrôle de l'expression de la protéine comprenant le polypeptide β-TrCP est facilement réalisé, en utilisant, pour transformer les cellules de levure, une cassette d'expression dans laquelle le polynucléotide codant la protéine comprenant le polypeptide β-TrCP est placé sous le contrôle d'un promoteur fonctionnel dans les cellules de levure et dont l'activation, ou à l'inverse la répression, est induite par un agent inducteur. De nombreux promoteurs inductibles actifs dans des cellules de levure sont connus par l'homme du métier, dont certains d'entre eux sont décrits plus loin dans la description, y compris dans les exemples. De manière tout à fait préférée, le promoteur inductible inclus dans la cassette d'expression codant la protéine comprenant le polypeptide β-TrCP est distinct du promoteur inductible inclus dans la cassette d'expression codant la protéine de fusion I KBOC- protéine détectable. Selon ce mode de réalisation préférentiel, on réalise un contrôle séparé respectivement (i) de l'expression de la protéine de fusion lκBoc-protéine détectable et (ii) de l'expression de la protéine comprenant le polypeptide β-TrCP.
Selon ce second aspect, la protéine de fusion It Bα-protéine détectable s'accumule dans le noyau des cellules de levure pendant l'étape (ai ), en l'absence de polypeptide β-TrCP. Puis, à l'étape (a2) la protéine de fusion lκBoc-protéine détectable qui n'est plus produite est mise en présence, dans le noyau cellulaire, du complexe SCF artificiel qui comprend la protéine β-TrCP dont l'expression a été induite. Dans ce mode de réalisation du procédé, on accumule d'abord la protéine de fusion cible comprenant IKBOC, puis on exprime la protéine effectrice de l'ubiquitination, à savoir la protéine comprenant le polypeptide β-TrCP, laquelle va initier le processus de dégradation de la protéine de fusion lκBoc-protéine détectable. Et le processus de dégradation de la protéine de fusion Iv Bα-protéine détectable, qui peut être modulé par l'agent à tester, est mesuré à l'étape (b) du procédé de criblage de l'invention.
Selon un troisième aspect du mode de réalisation préféré du procédé de criblage de l'invention, les cellules de levure expriment la protéine comprenant le polypeptide β-TrCP durant la totalité des étapes (a2) et (a3), et (i) n'expriment pas la protéine comprenant le polypeptide β-TrCP pendant une durée prédéterminée, au début de l'étape (ai ) ; (ii) (ii) expriment la protéine comprenant le polypeptide β-TrCP pendant la durée restante de l'étape (ai).
Selon ce troisième aspect également, la protéine de fusion lκBcc-protéine détectable est exprimée durant la totalité de l'étape (ai) du procédé, et l'expression de ladite protéine de fusion est stoppée à l'étape (a2) du procédé.
Selon ce troisième aspect, on active l'expression de la protéine comprenant le polypeptide β-TrCP à un moment choisi pendant la durée de l'étape (ai ). Dans ces conditions, dans la partie (ii) de l'étape (ai ), la protéine de fusion lκBoc-protéine détectable et la protéine comprenant le polypeptide β-TrCP sont simultanément exprimées dans les cellules de levure.
Selon ce troisième aspect, la protéine de fusion lκBα-protéine détectable s'accumule en grande quantité dans le noyau des cellules de levure durant la totalité de l'étape (ai ) et la protéine effectrice comprenant le polypeptide β-TrCP est exprimée précocement au cours de l'étape (ai) et continue de s'accumuler durant les étapes (a2) et (a3) pendant lesquelles la protéine de fusion cible n'est plus synthétisée. Dans ces conditions, du fait de la grande quantité de le protéine effectrice comprenant le polypeptide β-TrCP accumulée dans le noyau des cellules de levure, on favorise un haut niveau de réaction d'ubiquitination de la protéine de fusion cible et donc aussi une forte activité de dégradation de la protéine de fusion cible par le protéasome, ce qui accroît considérablement la sensibilité du procédé de criblage, lorsqu'on teste des agents candidats potentiellement inhibiteurs de l'ubiquitination du polypeptide IKBOC. Préférentiellement, selon ce troisième aspect du procédé de l'invention, pendant l'étape (ai), l'expression de la protéine de fusion lκBcc-protéine détectable est activée pendant une durée T1 comprise entre 0,25 heure et 10 heures, mieux entre 0,5 heure et 6 heures, et encore mieux entre 1 heure et 4 heures.
Puis, à un instant t2 déterminé, situé pendant la durée T1 , on active l'expression de la protéine effectrice comprenant le polypeptide β-TrCP. Préférentiellement, l'instant t2 est situé entre [T1 - 8 heures] et [T1 - 0,1 heure], mieux entre [T1 - 5 heures] et [T1 - 0,25 heure], et encore mieux entre [T1 - 3 heures] et [T1 - 0,5 heure], l'instant t2 étant, par définition, choisi à l'intérieur des limites de la durée T1 préalablement sélectionnée.
Puis, à la fin de la période de temps T1 , c'est à dire au début de l'étape (a2), on stoppe l'expression de la protéine de fusion lκBoc-protéine détectable. A partir de cet instant, seule l'expression de la protéine effectrice comprenant le polypeptide β-TrCP est maintenue activée dans les cellules de levure, et ce pour la totalité de la durée restante du procédé de criblage, c'est à dire jusqu'à la fin du procédé.
Description des modes de réalisation préférés du procédé de criblage
Les modes de réalisation préférés du procédé de criblage de l'invention sont décrits ci-dessous, notamment en relation avec la description des aspects fonctionnels et structurels des divers moyens permettant la mise en œuvre dudit procédé.
De manière générale, la protéine détectable qui est comprise dans la protéine de fusion lκBoc-protéine détectable peut être de toute nature, dès lors que sa présence, peut être spécifiquement détectée dans les cellules de levure avant sa protéolyse, et que la présence de formes protéolysées de la protéine détectable, notamment de fragments peptidiques produits par protéolyse de ladite protéine détectable, ne sont pas détectées par le moyen de détection spécifique qui est choisi.
Comme cela se comprend aisément, l'activité ubiquitine ligase du complexe protéique artificiel comprenant la protéine β-TrCP est suivie, selon le procédé de l'invention, en mesurant son effet sur la stabilité de la protéine de fusion lκBα-protéine détectable. L'ajout de chaînes de poly-ubiquitine sur le facteur IKBOC, par le complexe SCF artificiel homme/levure, entraîne la reconnaissance du facteur lkBoc ubiquitine par le protéasome et sa dégradation rapide par ce dernier. Grâce à l'expression dans les cellules de levure du facteur IKBOC SOUS forme de protéine fusion, la dégradation de la protéine fusion contenant IKBOC peut être suivie en temps réel, par détection de la protéine détectable non protéolysée. Selon la nature de la protéine détectable fusionnée à IKBOC, la dégradation de la protéine fusion peut être suivie par des techniques connues en soi, notamment des techniques de mesure de fluorescence à l'aide, soit d'un cytomètre de flux, soit d'un lecteur de microplaques, soit d'un fluorimètre, soit grâce à un microscope à fluorescence, ou encore par des techniques colorimétriques, enzymatiques ou immunologiques. A titre illustratif, la protéine détectable peut être choisie parmi un antigène, une protéine fluorescente ou une protéine ayant une activité enzymatique.
Lorsque la protéine détectable consiste en un antigène, elle peut être tout type d'antigène, dès lors que des anticorps spécifiques de cet antigène sont déjà accessibles ou, alternativement, peuvent être préparés, selon toute technique d'obtention d'anticorps, notamment d'anticorps polyclonaux ou monoclonaux, bien connues de l'homme du métier. Préférentiellement, dans ce cas, la protéine détectable consiste en un antigène de faible taille, qui n'est pas susceptible d'interférer avec la reconnaissance du facteur IKBOC par le polypeptide β-TrCP. Ainsi, préférentiellement, on utilise, comme antigène, un peptide ayant une chaîne de 7 à 100 acides aminés de longueur, mieux de 7 à 50 acides aminés de longueur, et encore mieux de 7 à 30 acides aminés de longueur, par exemple 10 acides aminés de longueur. A titre illustratif, on peut utiliser l'antigène HA de séquence [NH2-YPYDVPDYA-COOH] SEQ ID N° 17, ou encore un antigène FLAG de séquence [NH2-DYKDDDDK- COOH] SEQ ID N°18 (monomère FLAG) ou de séquence [NH2- MDYKDHDGDYKDHDIDYKDDDDK-COOH] SEQ ID N° 19 (trimère FLAG) Dans ce cas, on utilise, pour quantifier la protéine détectable à l'étape (b) du procédé, un anticorps qui reconnaît spécifiquement l'antigène compris dans la protéine de fusion, cet anticorps étant marqué directement ou indirectement. La quantification est alors réalisée par mesure du signal détectable produit par les complexes formés, dans les cellules de levure, entre l'anticorps marqué et la protéine de fusion I KBOC- antigène. Ainsi, à l'étape (b), lorsque la première protéine détectable est un antigène, on quantifie ladite première protéine détectable par détection des complexes formés entre ladite protéine et des anticorps la reconnaissant.
Lorsque la protéine détectable consiste en une protéine à fluorescence intrinsèque, elle est notamment choisie parmi la protéine GFP ou l'un de ses dérivés, la protéine YFP ou l'un de ses dérivés, et la protéine dsRED. Parmi les protéines dérivées de la protéine GFP, on peut utiliser notamment l'une quelconque des protéines connues sous les noms GFPMut3, Venus, Sapphire etc. Une liste illustrative des protéines GFP susceptibles d'être utilisées dans le procédé de l'invention est présentée dans le Tableau 3, à la fin de la présente description. La protéine à fluorescence intrinsèque peut aussi être choisie parmi les protéines auto-fluorescentes originaires de divers organismes, autres que Aequorea Victoria. Notamment, la protéine à fluorescence intrinsèque peut être choisie parmi les protéines suivantes : - la protéine CopGFP originaire de Pontellina plumata, et décrite par D.A. Shagin et al.(2004, Mol. Biol. Evol. 21:841-850) ; la protéine TurboGFP, un variant de CopGFP ; et décrite par D.A. Shagin et al., 2004 (Mol. Biol. Evol. 21:841 -850) ; la protéine J-Red, originaire de Anthomedusae) ; et décrite par D.A. Shagin et al., 2004 (Mol. Biol. Evol. 21:841 -850) ; la protéine PhiYFP originaire de Phialidium sp. ; et décrite par D.A. Shagin et al.( 2004, Mol. Biol. Evol. 21:841-850) ; la protéine mAG, aussi appelée « monomeric Azami-Green », originaire du corail de Galaxeidae; et décrite par S. Karasawa et al.(2003, J. Biol. Chem. 278:34167-34171 ) ; la protéine AcGFP originaire de Aequorea coerυlescens, ainsi que ses variants, et décrite par N.G. Gurskaya, (2003, Biochem. J. 373:403-408) ; et la protéine DsRed originaire de Discosoma sp. ; et décrite par M.V. Matz et al (1999, Nature Biotech. 17:969-973).
Lorsque la protéine détectable consiste en une protéine à fluorescence intrinsèque, on quantifie la protéine détectable à l'étape (b) du procédé par mesure du signal de fluorescence qui est émis par la protéine de fusion lκBα-protéine fluorescente à l'aide de tout dispositif adapté. Ainsi, à l'étape (b), lorsque la première protéine détectable est une protéine fluorescente, on quantifie ladite protéine détectable par une mesure du signal de fluorescence émis par ladite protéine.
Lorsque la protéine détectable consiste en une protéine à activité enzymatique, ladite protéine détectable est choisie notamment parmi la luciférase et la β-lactamase. Dans ce cas, on quantifie la protéine détectable à l'étape (b) du procédé par mesure de la quantité du ou des composés produits par la conversion du substrat par l'enzyme . Lorsque le produit de l'activité enzymatique est coloré, la mesure peut être réalisée par colorimétrie. Lorsque le produit de l'activité enzymatique est fluorescent, on mesure l'intensité du signal de fluorescence qui est émis par ledit produit, à l'aide de tout dispositif de mesure de la fluorescence adapté. Ainsi, à l'étape (b), lorsque la première protéine détectable est une protéine ayant une activité enzymatique, on quantifie ladite protéine détectable par une mesure de la quantité de substrat transformé par ladite protéine.
Dans un mode de réalisation particulier du procédé de criblage selon l'invention, la protéine comprenant le polypeptide β-TrCP consiste également en une protéine de fusion comprenant, outre le polypeptide β- TrCP, également une protéine détectable. Dans ce mode de réalisation particulier, on peut suivre dans le temps le niveau d'expression du polypeptide β-TrCP dans les cellules de levure, en détectant, et facultativement en quantifiant, la protéine détectable contenue dans la protéine comprenant le polypeptide β-TrCP. Ce mode de réalisation particulier est principalement mis en œuvre lorsque l'on contrôle positivement ou négativement l'expression de la protéine comprenant le polypeptide β-TrCP, aux différentes sous-étapes de l'étape (a) du procédé. La protéine détectable contenue dans le polypeptide comprenant le polypeptide β-TrCP est choisie parmi un antigène, une protéine fluorescente et une protéine ayant une activité enzymatique. Préférentiellement, la protéine détectable contenue dans la protéine comprenant le polypeptide β-TrCP est distincte de la protéine détectable contenue dans la protéine de fusion lκBoc-protéine détectable, ce qui permet de suivre séparément l'expression du facteur I BCC et l'expression du polypeptide β-TrCP dans les cellules de levure.
Comme cela a déjà été précédemment dans la description, la dégradation du polypeptide cible IKBOC humain par le protéasome des cellules de levure est réalisée uniquement lorsque la protéine de fusion lκBoc-protéine détectable et la protéine comprenant le polypeptide β- TrCP humain sont toutes les deux co-localisées dans le noyau des cellules de levure.
En particulier, le demandeur a montré, comme cela est illustré dans les exemples, que le facteur IKBOC est phosphorylé sur le résidu serine en position 32 exclusivement dans le noyau des cellules de levure, alors qu'il ne subit pas de phosphorylation dans le cytoplasme. A posteriori, l'événement de phosphorylation du résidu serine en position 32 du facteur lκBα, dans les cellules de levure, permet d'expliquer, au moins partiellement, la raison pour laquelle, dans les cellules de levure, l'ubiquitination de ce facteur ne peut être réalisée que dans le noyau cellulaire.
En conséquence, pour réaliser le procédé de criblage de l'invention, on met en œuvre tout moyen permettant la localisation nucléaire à la fois de la protéine de fusion lκBcc-protéine détectable et de la protéine comprenant le polypeptide β-TrCP.
Préférentiellement, la protéine de fusion lκB -protéine détectable et la protéine comprenant le polypeptide β-TrCP comprennent toutes les deux un peptide permettant de localiser ces deux protéines dans le noyau des cellules de levure. Ainsi, de manière préférée, la protéine de fusion lκBcc-protéine détectable et la protéine comprenant le polypeptide β-TrCP comprennent toutes les deux, dans leur séquence en acides aminés, au moins un peptide de localisation nucléaire (« NLS ») qui est fonctionnel dans les cellules eucaryotes, et plus particulièrement dans les cellules de levure. Chacune des protéines comprend, indépendamment l'une de l'autre, 1 , 2, 3 ou 4 peptides de localisation nucléaire. Selon un autre aspect, chacune de ces protéines comprend, indépendamment l'une de l'autre de 1 à 4 copies d'un peptide de localisation nucléaire.
Préférentiellement, le ou les peptide(s) de localisation nucléaire sont choisis parmi les peptides suivants : le peptide NLS dérivé du grand antigène du virus SV40 ayant la séquence en acides aminés SEQ ID N°24 ; le peptide NLS de la nucléoplasmine ayant la séquence en acides aminés SEQ ID N° 20 ; un peptide NLS du répresseur alpha 2 de levure choisi parmi les séquences SEQ ID N° 21 et SEQ ID N° 22 ; - un peptide NLS de la protéine Gal4 de levure ayant la séquence en acides aminés SEQ ID N° 23.
Dans les exemples, la protéine de fusion lκB -protéine détectable et la protéine comprenant le polypeptide β-TrCP comprennent toutes les deux le peptide de localisation nucléaire de séquence SEQ ID N°24.
De préférence, le polypeptide de fusion lkBoc-protéine détectable consiste en une chaîne d'acides aminés qui comprend, de l'extrémité NH2- terminale vers l'extrémité COOH-terminale, respectivement (i) la séquence de la protéine détectable, (ii) la séquence NLS de localisation nucléaire et (iii) la séquence de lkBα. Tout d'abord, dans le polypeptide fusion, la séquence de la GFP et la séquence NLS peuvent être liées directement entre elles, par une liaison peptidique. Egalement, la séquence NLS et la séquence de lkBoc peuvent être liées directement entre elles, par une liaison peptidique.
Selon un autre aspect, la séquence de GFP et la séquence NLS peuvent être séparées, dans la séquence du polypeptide de fusion, par un premier peptide espaceur.
Selon encore un autre aspect, la séquence NLS et la séquence de lkBα peuvent être séparées, dans la séquence du polypeptide de fusion, par un second peptide espaceur.
Avantageusement, le ou les peptide(s) espaceur(s), lorsqu'il est (sont) présent(s), a (ont) une taille allant de 1 à 30 acides aminés, préférentiellement de 1 à 15 acides aminés, et de manière tout à fait préférée de 2 à 10 acides aminés de longueur.
Selon un mode de réalisation préféré, la protéine comprenant le polypeptide IKBOC consiste en la protéine de séquence en acides aminés
SEQ ID N°2, qui peut être codée par l'acide nucléique de séquence SEQ
ID N°1. La protéine de séquence SEQ ID N° 2 consiste, de l'extrémité
NH2-terminale vers l'extrémité COOH-terminale, respectivement en (i) la séquence de la protéine détectable GFP(yEGFP3) allant de l'acide aminé en position 1 jusqu'à l'acide aminé en position 240, (ii) un premier peptide espaceur allant de l'acide aminé en position 241 jusqu'à l'acide aminé en position 243, (iii) le peptide NLS du grand antigène T de SV40 allant de l'acide aminé en position 244 jusqu'à l'acide aminé en position
250, (iv) un second peptide espaceur allant de l'acide aminé en position 251 jusqu'à l'acide aminé en position 255 et (v) le polypeptide I KBOC allant de l'acide aminé en position 256 jusqu'à l'acide aminé en position 572. L'acide nucléique de séquence SEQ ID N°1 consiste, de l'extrémité 5' vers l'extrémité 3', respectivement en (i) la séquence codant la protéine détectable GFP(yEGFP3) allant du nucléotide en position 1 jusqu'au nucléotide en position 714, (ii) la séquence codant un premier peptide espaceur allant du nucléotide en position 715 jusqu'au nucléotide en position 729, (iii) la séquence codant le peptide NLS du grand antigène T de SV40 allant du nucléotide en position 730 jusqu'au nucléotide en position 750, (iv) la séquence codant un second peptide espaceur allant du nucléotide en position 751 jusqu'au nucléotide en position 765 et (v) la séquence codant le polypeptide IKBOC allant du nucléotide en position 766 jusqu'au nucléotide en position 1719.
Préférentiellement, la protéine comprenant le polypeptide βTrCP consiste en une chaîne d'acides aminés qui comprend, de l'extrémité NH2- terminale vers l'extrémité COOH-terminale, respectivement (i) la séquence d'une seconde protéine détectable, (ii) la séquence NLS de localisation nucléaire, et (iii) la séquence de βTrCP.
Selon un mode de réalisation préféré, la protéine comprenant le polypeptide β-TrCP consiste en la protéine de séquence en acides aminés SEQ ID N° 4, qui est codée par l'acide nucléique de séquence
SEQ ID N°3. La protéine de séquence SEQ ID N° 4 consiste, de l'extrémité NH2-terminale vers l'extrémité COOH-terminale, respectivement en (i) la séquence de la protéine détectable GFP(yEGFP3) allant de l'acide aminé en position 1 jusqu'à l'acide aminé en position 240, (ii) un premier peptide espaceur allant de l'acide aminé en position 241 jusqu'à l'acide aminé en position 243, (iii) le peptide NLS du grand antigène T de SV40 allant de l'acide aminé en position 244 jusqu'à l'acide aminé en position 250, (iv) un second peptide espaceur allant de l'acide aminé en position 251 jusqu'à l'acide aminé en position
255 et (v) le polypeptide β-TrCP allant de l'acide aminé en position 256 jusqu'à l'acide aminé en position 860. L'acide nucléique de séquence SEQ ID N°3 consiste, de l'extrémité 5' vers l'extrémité 3', respectivement en (i) la séquence codant la protéine détectable GFP(yEGFP3) allant du nucléotide en position 1 jusqu'au nucléotide en position 714, (ii) la séquence codant un premier peptide espaceur allant du nucléotide en position 715 jusqu'au nucléotide en position 729, (iii) la séquence codant le peptide NLS du grand antigène T de SV40 allant du nucléotide en position 730 jusqu'au nucléotide en position 750, (iv) la séquence codant un second peptide espaceur allant du nucléotide en position 751 jusqu'au nucléotide en position 765 et (v) la séquence codant le polypeptide β-TrCP allant du nucléotide en position 766 jusqu'au nucléotide en position 2538.
Selon encore un autre aspect, le procédé de criblage selon l'invention est caractérisé en ce que les cellules de levure recombinantes sont transformées avec :
(1) un premier polynucléotide qui comprend (a) un cadre de lecture ouvert codant (i) la protéine de fusion comprenant le polypeptide IKBOC, (ii) une séquence de localisation nucléaire et (iii) une première protéine détectable, et (b) une séquence régulatrice fonctionnelle dans des cellules de levure qui dirige l'expression dudit cadre de lecture ouvert; et
(2) un second polynucléotide qui comprend (a) un cadre de lecture ouvert codant (i) une protéine comprenant le polypeptide β-TrCP, (ii)une séquence de localisation nucléaire, et (iii) une séquence régulatrice fonctionnelle dans des cellules de levure qui dirige l'expression dudit cadre de lecture ouvert;
Le polynucléotide (1 ) ci-dessus peut consister en l'acide nucléique de séquence SEQ ID N°1. Le polynucléotide (2) ci-dessus peut consister en l'acide nucléique de séquence SEQ ID N°3.
Acides nucléiques, vecteurs d'expression et cellules de levure transformées préférés selon l'invention.
On synthétisé selon l'invention des acides nucléiques, lesquels, lorsqu'ils sont introduits dans des cellules de levure, provoquent l'expression respectivement de la protéine de fusion lκBoc-protéine détectable et de la protéine comprenant le polypeptide β-TrCP dans ces cellules, et plus particulièrement dans le noyau des cellules de levure.
Tout d'abord, chacun des acides nucléiques synthétisés comprend une séquence codante, qui est aussi désignée « cadre de lecture ouvert » ou « ORF ». qui code la protéine d'intérêt, respectivement soit la protéine de fusion lκBoc-protéine détectable, soit la protéine comprenant le polypeptide β-TrCP, ladite protéine d'intérêt comprenant aussi dans sa séquence au moins la séquence d'un peptide de localisation nucléaire. Des exemples illustratifs des acides nucléiques selon l'invention sont les acides nucléiques de séquence SEQ ID N°1 et SEQ ID N°3, dont la structure a été décrite précédemment dans la description.
Chacun des acides nucléiques comprend aussi une séquence régulatrice comprenant un promoteur fonctionnel dans les cellules de levure.
Selon un premier mode de réalisation préféré, le promoteur fonctionnel dans les cellules de levure consiste en un promoteur constitutif qui peut être choisi parmi les promoteurs PGK1, ADH1, TDH3, LEU2 et TEFL Préférentiellement, dans le but de contrôler précisément les périodes durant lesquelles sont exprimées respectivement la protéine de fusion lκBoc-protéine détectable et la protéine comprenant le polypeptide β- TrCP, chacun des acides nucléiques comprend, en tant que promoteur, un promoteur dit « inductible », c'est à dire un promoteur fonctionnel dans les cellules de levure et qui est sensible à l'action d'un agent inducteur. On peut utiliser un promoteur lequel, lorsque l'agent inducteur est ajouté dans le milieu de culture des cellules de levure, active l'expression de la séquence codant la protéine d'intérêt placée sous son contrôle. On peut aussi utiliser un promoteur lequel, lorsque l'agent inducteur est ajouté dans le milieu de culture des cellules de levure, réprime ou bloque l'expression de la séquence codant la protéine d'intérêt placée sous son contrôle.
Ainsi, selon un second mode de réalisation préféré d'un promoteur, le promoteur inductible qui est contenu dans les acides nucléiques de l'invention est choisi parmi CUP1, GAL1, MET3, MET25, MET28, SAM4 et PH05.
Dans un mode de réalisation préféré, l'acide nucléique ou le polynucléotide qui code la protéine de fusion lκBα-protéine détectable comprend la séquence régulatrice GAL1, qui active l'expression du cadre de lecture ouvert codant la protéine de fusion comprenant le polypeptide le polypeptide IKBOC en présence de glucose.
Ainsi, dans un mode de réalisation avantageux du procédé de criblage de l'invention, l'expression de la protéine fusion comprenant le facteur IKBOC est réalisée de manière temporaire durant l'essai de criblage. Apres avoir été induite durant un temps fixé pouvant varier de 20 minutes à 24 heures, l'expression de la protéine contenant lκBα est spécifiquement stoppée (dans une expérience connue par l'homme du métier sous le nom de « promoter shut off ») avant d'exposer les cellules aux molécules devant être criblées. Cet arrêt de l'expression est obtenu par l'addition (ou la suppression) dans le milieu de culture d'une molécule pouvant réprimer l'activité du promoteur contrôlant l'expression de la protéine tripartite contenant IKBOC.
Ainsi, lorsque la protéine de fusion lκBα-protéine détectable est exprimée sous le contrôle du promoteur du gène GAL1, alors l'expression de ce promoteur est réprimée en ajoutant du glucose à la concentration finale de 2 % dans le milieu de culture. L'arrêt de la néosynthèse de la protéine de fusion comprenant IKBOC permet de mesurer sa stabilité en temps réel, en déterminant par exemple la fluorescence des cellules de levure au cours du temps après l'arrêt de synthèse, dans le mode de réalisation dans lequel ladite protéine de fusion contient une protéine détectable à fluorescence intrinsèque, comme la GFP ou une protéine dérivée de la GFP.
Dans un autre mode particulièrement avantageux du procédé de criblage selon l'invention, l'expression temporaire de la protéine fusion comprenant le facteur IKBOC est associée à une expression également temporaire de la protéine comprenant le polypeptide β-TrCP. Dans ce mode de réalisation, la protéine de fusion comprenant le polypeptide IKBOC est exprimée pendant la période de temps T1 choisie, par exemple en utilisant des cellules de levure qui expriment la protéine de fusion comprenant le polypeptide IKBOC SOUS le contrôle du promoteur GAL1 et qui sont cultivées en présence de 0, 5 à 4 % de galactose pendant la durée T1. A l'instant t2, l'expression de la protéine comprenant le polypeptide β-TrCP est induite. Cette induction est par exemple obtenue, chez des cellules exprimant la protéine contenant β-TrCP sous le contrôle du promoteur du gène CUP1, en ajoutant dans le milieu de culture une concentration de sulfate de cuivre comprise entre 0.05 mM et 5 mM. A la fin de la période de temps T1 , l'expression de la protéine de fusion comprenant IKBOC est stoppée en ajoutant dans le milieu de culture du glucose à une concentration comprise entre 0.5 et 2 %. Cet ajout de glucose n'a pas d'effet sur l'expression de la protéine comprenant β-TrCP à partir du promoteur du gène CUP1. Ainsi dans ce mode de mise œuvre du procédé, l'accumulation de l'ubiquitine ligase comprenant β-TrCP est poursuivie, alors que la néo-synthèse de la protéine de fusion comprenant IKBOC est stoppée.
Ainsi, dans un mode de réalisation particulier du procédé de criblage selon l'invention, l'acide nucléique ou le polynucléotide qui code la protéine comprenant le polypeptide β-TrCP comprend la séquence régulatrice CUP1, qui active l'expression du cadre de lecture ouvert codant une protéine comprenant le polypeptide β-TrCP en présence de sulfate de cuivre.
Ainsi, l'invention a aussi pour objet une cassette d'expression fonctionnelle dans les cellules de levure comprenant un polynucléotide codant qui comprend un cadre de lecture ouvert codant la protéine de fusion comprenant le polypeptide le polypeptide IKBOC et au moins une première protéine détectable, et une séquence régulatrice fonctionnelle dans des cellules de levure qui dirige l'expression dudit cadre de lecture ouvert.
Une telle cassette d'expression peut notamment consister en l'acide nucléique de séquence SEQ ID N°1 selon l'invention, qui code la protéine de fusion GFP-NLS-lkBα de séquence SEQ ID N°2. L'invention concerne aussi une cassette d'expression fonctionnelle dans les cellules de levure comprenant un polynucléotide qui comprend un cadre de lecture ouvert codant une protéine comprenant le polypeptide β-TrCP et une séquence régulatrice fonctionnelle dans des cellules de levure qui dirige l'expression dudit cadre de lecture ouvert.
Une telle cassette d'expression peut notamment comprendre l'acide nucléique de séquence SEQ ID N°3 selon l'invention, qui code la protéine de fusion GFP-NLS-βTrCP de séquence SEQ ID N°4.
Selon un premier mode de réalisation préféré d'une telle cassette d'expression, la séquence régulatrice comprend un promoteur inductible fonctionnel dans les cellules de levure, tel qu'un promoteur choisi parmi les promoteurs PGK1, ADH1, TDH3, LEU2 et TEFL
Selon un second mode préféré d'une telle cassette d'expression, dans l'une ou l'autre des cassettes d'expression ci-dessus, ou dans les deux, la séquence régulatrice contenue dans ledit polynucléotide, la séquence régulatrice contenue dans le second polynucléotide, ou les deux séquences régulatrices, comprenne(nt) un promoteur fonctionnel dans les cellules de levure et qui est sensible à l'action d'un agent inducteur, qui est aussi appelé promoteur inductible.
De manière tout à fait préférée, le promoteur inductible fonctionnel dans les cellules de levure est choisi parmi CUP1, GAL1, MET3, MET25, MET28, SAM4 et PH05.
Selon un autre mode de réalisation avantageux du procédé de criblage selon l'invention, les cellules de levure sont transformées par (i) l'acide nucléique ou le polynucléotide comprenant la séquence codant la protéine de fusion lκBα-protéine détectable ainsi que par (ii) l'acide nucléique ou le polynucléotide codant la protéine comprenant le polypeptide β-TrCP, qui se présentent sous une forme non intégrée, par exemple sous la forme de vecteurs fonctionnels dans les cellules de levure et qui portent au moins une origine de réplication fonctionnelle dans les cellules de levure.
Dans encore une autre mode de réalisation du procédé de criblage selon l'invention, les cellules de levure recombinantes possèdent l'acide nucléique ou le polynucléotide comprenant la séquence codant la protéine de fusion lκBoc-protéine détectable ainsi que l'acide nucléique ou le polynucléotide codant la protéine comprenant le polypeptide β-TrCP sous une forme intégrée dans leur génome, comme cela est illustré dans les exemples.
De manière générale, pour la mise en œuvre du procédé de criblage de l'invention, il est avantageux d'utiliser des cellules de levures qui possèdent une bonne perméabilité membranaire, notamment une bonne perméabilité membranaire pour les agents à tester par le procédé.
Pour la mise en œuvre du mode de réalisation préféré du procédé de criblage de l'invention dans lequel l'expression des deux protéines d'intérêt est réalisée sous le contrôle de promoteurs inductibles, il est également avantageux d'utiliser des cellules de levures qui possèdent une bonne perméabilité membranaire pour les composés inducteurs vis- à-vis desquels lesdits promoteurs inductibles sont sensibles
Ainsi, dans un autre mode de réalisation préféré du procédé de criblage de l'invention, on utilise des souches de levure dont le génome comprend une à plusieurs mutations qui augmentent la perméabilité aux produits à tester, telles que des mutations inactivant les gènes PDR1 et PDR3, deux gènes codant des facteurs transcriptionnels qui chez la levure contrôlent l'expression de transporteurs insérés dans la membrane plasmique (Vidal ét al, 1999, Nourani ét al, 1997).
Préférentiellement, on utilise des souches de levure possédant le fond génétique de la souche W303 de la levure Saccharomyces cerevisiae décrite par Bailis et al. (1990), ou tout autre souche caractérisée de la dite levure Saccharomyces cerevisiae.
La transformation des cellules de levure par de l'ADN exogène est préférentiellement en utilisant des techniques connues de l'homme du métier, notamment la technique décrite par Schiestl et al. (1989). Les constructions des différentes souches de levure ont été réalisées en employant des techniques de génétique (croisement, sporulation dissection des asques et analyse phénotypique des spores) connues et décrites notamment par Sherman et al. (1979) et les techniques de génétique inverse décrites notamment par Rothstein (1991).
Conformément à l'invention, les levures sont transformées préférentiellement par des plasmides construits selon des techniques de biologie moléculaire classiques, notamment selon les protocoles décrits par Sambrook et al. (1989) et Ausubel et al. (1990-2004).
Ainsi, un autre objet de l'invention consiste en un vecteur d'expression caractérisé en ce qu'il comprend une cassette d'expression telle que définie dans la présente description.
Un premier vecteur conforme à l'invention est le vecteur pCSY226-NLS- IKBOC qui est décrit dans les exemples, et qui a servi à la construction de la souche de levure CYS135 déposée à la Collection Nationale de Cultures de microorganismes de l'Institut Pasteur de Paris sous le numéro d'accès 1-3187. Un second vecteur conforme à l'invention est le vecteur pCSY226-NLS- β-TrCP qui est décrit dans les exemples, et qui a servi à la construction de la souche de levure CYS135 déposée à la Collection Nationale de Cultures de microorganismes de l'Institut Pasteur de Paris sous le numéro d'accès 1-3187.
La présente invention est également relative à une souche de levure recombinante comprenant, sous une forme intégrée dans son génome,
(i) un premier polynucléotide qui comprend un cadre de lecture ouvert codant la protéine de fusion comprenant le polypeptide le polypeptide IKBOC et au moins une première protéine détectable, et une séquence régulatrice fonctionnelle dans des cellules de levure qui dirige l'expression dudit cadre de lecture ouvert; et
(ii) un second polynucléotide qui comprend un cadre de lecture ouvert codant une protéine comprenant le polypeptide β-TrCP et une séquence régulatrice fonctionnelle dans des cellules de levure qui dirige l'expression dudit cadre de lecture ouvert;
En particulier, l'invention est relative à une souche de levure recombinante conforme à la définition ci-dessus, qui consiste en la souche de levure CYS135 déposée à la Collection Nationale de Cultures de microorganismes de l'Institut Pasteur de Paris (CNCM) sous le numéro d'accès 1-3187.
L'invention concerne aussi une trousse ou kit pour le criblage d'agents modulant l'ubiquitination de la protéine IkBoc par un complexe protéique fonctionnel ubiquitine ligase comprenant la protéine β-TrCP, caractérisé en ce qu'il comprend : (i) un premier vecteur d'expression comprenant une cassette d'expression codant la protéine de fusion comprenant le polypeptide IkBoc telle que définie ci-dessus ; et
(iii) un second vecteur d'expression comprenant une cassette d'expression codant la protéine comprenant le polypeptide BTrCP telle que définie ci-dessus.
L'invention est aussi relative à une trousse ou kit pour le criblage d'agents modulant l'ubiquitination de la protéine IkBoc par un complexe protéique fonctionnel ubiquitine ligase comprenant la protéine β-TrCP, caractérisé en ce qu'il comprend des cellules de levures recombinantes comprenant, sous une forme insérée dans leur génome, respectivement :
(i) une cassette d'expression codant la protéine de fusion comprenant le polypeptide IkBoc telle que définie ci-dessus ; et
(ii) une cassette d'expression codant la protéine comprenant le polypeptide BTrCP telle que définie ci-dessus.
Préférentiellement, la trousse ou kit ci-dessus comprend des cellules de levures recombinantes de la souche de levure CYS 135 déposée à la CNCM sous le numéro d'accès 11-3187.
Le procédé de criblage selon l'invention, permet de visualiser l'activité de l'ubiquitine ligase SCFβ"TrCP vis à vis du facteur IKBOC humain, substrat de la voie ubiquitine protéasome de dégradation des protéines. Ce procédé est particulièrement avantageux pour cribler des molécules ou agents aptes à agir sur les pathologies liées à l'activation des facteurs NF-κB et aux dysfonctionnements de la voie NF-κB chez l'homme tels que les syndromes inflammatoires et immuns, certains cancers, certaines maladies comme la « reperfusion injury » et les infections fongiques, bactériennes et virales.
Les principaux avantages du procédé de criblage de l'invention sont notamment les suivants : la simplicité de mise en œuvre: l'induction de l'activité de l'ubiquitine ligase SCFβ'TrCP vis -à-vis du facteur IKBOC est réalisée simplement grâce à l'expression contrôlée des facteurs humains IKBOC et β-TrCP dans les cellules de levure. De plus, lorsque le facteur IKBOC est exprimé en tant que protéine hybride en fusion avec une protéine à fluorescence intrinsèque, telle que la GFP, l'activité de l'ubiquitine ligase SCFβ TrCP artificielle vis-à-vis du facteur IKBOC est directement mesurée par la. quantification de la fluorescence émise par la protéine hybride. De même lorsque le facteur IKBOC est exprimé en tant que protéine hybride en fusion avec une protéine telle que la luciférase, l'activité de l'ubiquitine ligase SCFβ"TrCP artificielle vis-à-vis du facteur IKBOC est directement mesurée par la quantification de la luminescence émise par la protéine hybride en présence d'un substrat comme la fluorescéine. l'adéquation avec un contexte thérapeutique: l'activité de l'ubiquitine ligase SCFβ'TrCP artificielle vis-à-vis du facteur IKBOC est suivie selon un test fonctionnel réalisé dans des cellules entières. Le procédé de criblage in vitro selon l'invention permet donc de sélectionner des molécules capables d'activer ou d'inhiber la dégradation d'lκBoc dans un contexte semblable à celui de leur usage thérapeutique final. la spécificité: bien que réalisé in vitro dans la cellule, le procédé de criblage selon l'invention est spécifique, car il repose sur la co- expression, dans un organisme hétérologue à l'organisme humain, des deux protéines humaines lκBcc et β-TrCP. Les molécules sélectionnées grâce au procédé de criblage de l'invention seront spécifiques de ce couple ubiquitine ligase β-TrCP / protéine substrat IKBOC, et ne seront donc pas des molécules sélectionnées en raison, par exemple, de leur capacité à interférer avec l'une des nombreuses voies de signalisation induisant la dégradation d'lκBcc dans les cellules humaines. En effet, lors de la mise en œuvre du procédé de criblage selon l'invention, la dégradation d'lκB , par l'intermédiaire de l'ubiquitine ligase SCFβ TrCP artificielle, est induite par une voie métabolique tout à fait artificielle et totalement reproductible, comme par exemple, l'ajout de glucose pour bloquer l'activité du promoteur GAL1, lorsque IKBOC est exprimé sous le contrôle de ce promoteur, la stabilité des souches de levure recombinantes: les techniques d'intégration dans un endroit choisi d'un chromosome de levure, et de remplacement ciblé de gènes permettent la construction de souches de levures recombinantes exprimant les protéines humaines hybrides contenant soit IKBOC soit β-TrCP à partir des chromosomes de la levure. Ces souches de levure recombinantes sont donc génétiquement stables et peuvent être multipliées et conservées indéfiniment. la rapidité de croissance et de criblage: la levure est un microorganisme à croissance rapide et rendement élevé. En particulier, le procédé de criblage de l'invention est préférentiellement réalisé en cultivant les cellules de levure dans un milieu de culture complet, dans lequel la croissance des cellules de levure est particulièrement rapide et le rendement particulièrement élevé, ce qui permet l'obtention d'une grande quantité de cellules de levure recombinantes pour la réalisation simultanée d'un nombre important de tests de criblage. le faible coût: la levure est un microorganisme dont la culture, le stockage et la caractérisation sont peu onéreux, l'automatisation du procédé de criblage de l'invention: la levure est un microorganisme dont la culture, réalisée dans un faible volume de milieu, à température basse, en atmosphère classique, dans l'air, est tout particulièrement adapté à l'automatisation (robotisation) des procédés de criblage.
Le procédés de criblage selon l'invention sont utiles notamment pour sélectionner et caractériser des agents actifs tels que des agents anti- inflammatoires, anticancéreux, anti-viraux, des agents contre des infections fongiques, bactériennes ou virales.
La présente invention est en outre illustrée, sans pour autant être limitée, par les figures et les exemples suivants.
FIGURES
La figure 1 illustre la possibilité pour les protéines Skp1 de levure et β-TrCP humaine d'interagir dans les cellules de levure.
En abscisse : les plasmides présents dans les cellules de levure transformées ; En ordonnée, l'activité β-galactosidase, exprimée en nanomoles de substrat transformé par minute et par mg de protéines cellulaires.
La figure 2 illustre les localisations dans les cellules de levures des protéines humaines IKBOC et β-TrCP selon qu'elles sont fusionnées ou non à une séquence NLS de SV40. Ligne supérieure : clichés de microscopie à fluorescence de coloration de l'ADN des noyaux cellulaires avec le colorant Hoechst 333-42. Ligne inférieure : clichés de microscopie à fluorescence permettant de localiser dans les cellules l'expression de la GFP.
A : Cellules transformées par le vecteur GFP-NLS-β-TrCP ; B : cellules transformées par le vecteur GFP-β-TrCP ; C : cellules transformée par le vecteur GFP-NLS-lκBcc ; D : cellules transformées par le vecteur GFP- IKBOC.
La figure 3 illustre comment l'adressage de la protéine humaine IKBOC dans le noyau des cellules de levure induit sa phosphorylation sur les serines 32 et 36.
La figure représente un gel d'électrophorèse des protéines cellulaires des souches de levure recombinantes CYS22 et CYS126, respectivement.
La figure 4 illustre par une analyse au microscope d'épifluorescence, la dégradation de la protéine fusion tripartite GFP-NLS-lκBα dans des cellules de levure lorsque celles-ci expriment également la protéine fusion tripartite Flag-NLS-β-TrCP.
Les figures 4A à 4D représentent des clichés de microscopie par fluorescence : ligne supérieure, coloration de l'ADN des noyaux cellulaires avec le colorant Hoechst 333-42 ; ligne inférieure, clichés de microscopie à fluorescence permettant de localiser dans les cellules l'expression de la GFP.
Figure 4A : résultats obtenus avec la souche de levure recombinante CYS22 ; Figure 4B : résultats obtenus avec la souche de levure recombinante CYS61. Figure 4C : résultats obtenus avec la souche de levure recombinante CYS 126.
Figure 4D : résultats obtenus avec la souche de levure recombinante CYS 135.
En ordonnées : les différents temps après l'ajout de glucose dans les cultures cellulaires, exprimés en minutes.
La figure 5 illustre par une quantification de la fluorescence émise, la dégradation de la protéine fusion tripartite GFP-NLS-lκBoc dans des cellules de levure lorsque celles-ci expriment ou non la protéine fusion tripartite Flag-NLS-β-TrCP.
Les résultats sont illustrés pour les souches de levure recombinantes CYS135, CYS126, CYS61 et CYS22, respectivement, qui sont indiquées par des encadrés sur la figure.
En abscisse : temps écoulé après l'addition de glucose dans les cultures cellulaires, exprimé en minutes ; en ordonnée : moyenne de l'intensité du signal de fluorescence, exprimée en unités arbitraires de fluorescence.
La figure 6 illustre par une analyse biochimique de type Western Blotting, la dégradation de la protéine fusion tripartite GFP-NLS-lκBcc dans des cellules de levure lorsque celles-ci expriment également la protéine fusion tripartite Flag-NLS-β-TrCP.
Clichés de gels d'immuno-empreinte (« Western blotting ») révélés avec des anticorps anti-GFP et des anticorps anti-peptide FLAG
En abscisse : temps écoulé après l'addition de glucose dans les cultures cellulaires, exprimé en minutes. Les résultats sont illustrés pour les souches de levure recombinantes suivantes : CYS22 (Figure 6A), CYS61 (Figure 6B), CYS126 (Figure 6C) et CYS135 (Figure 6D).
La figure 7 illustre par une analyse biochimique de type Western blotting, la dégradation de la protéine fusion tripartite mutante GFP-NLS- lκBcc[S3236A] dans laquelle les sites de phosphorylation Ser32 et Ser36 ont été remplacés par des résidus Ala, mutations qui dans des cellules humaines rendent la protéine non-dégradable.
Clichés de gels d'immuno-empreinte (« Western blotting ») révélés avec des anticorps anti-GFP et des anticorps anti-peptide FLAG
En abscisse : temps écoulé après l'addition de glucose dans les cultures cellulaires, exprimé en minutes.
Les résultats sont illustrés pour les souches de levure recombinantes suivantes : CYS138 (Figure 7A) et CYS139 (Figure 7B).
La figure 8 illustre par une analyse au microscope d'épifluorescence, la dégradation de la protéine fusion tripartite GFP-NLS-lκBoc[S3236A] dans des cellules de levure lorsque celles-ci expriment également la protéine fusion tripartite Flag-NLS-β-TrCP.
Les figures 8A et 8B représentent des clichés de microscopie à fluorescence : ligne supérieure, coloration de l'ADN des noyaux cellulaires avec le colorant Hoechst 333-42 ; ligne inférieure, clichés de microscopie à fluorescence permettant de localiser dans les cellules l'expression de la GFP. Figure 8A : résultats obtenus avec la souche de levure recombinante CYS138 ; Figure 8B : résultats obtenus avec la souche de levure recombinante CYS139.
En ordonnées : les différents temps après l'ajout de glucose dans les cultures cellulaires, exprimés en minutes.
La figure 9 illustre par une quantification de la fluorescence émise, la dégradation de la protéine fusion tripartite GFP-NLS-lκBcc[S3236A] dans les souches de levure décrites ci-dessus.
Les résultats sont illustrés pour les souches de levure recombinantes CYS138 et CYS139, respectivement, qui sont indiquées par des encadrés sur la figure.
En abscisse : temps écoulé après l'addition de glucose dans les cultures cellulaires, exprimé en minutes ; en ordonnée : moyenne de l'intensité du signal de fluorescence, exprimée en unités arbitraires de fluorescence.
EXEMPLES
Exemples 1 à 3 : Construction des vecteurs recombinants selon l'invention.
A. MATERIEL ET METHODES DES EXEMPLES 1 A 3. A.1. Récapitulatif des séquences de polynucléotide utilisées
La séquence de la protéine IKBOC est celle décrite dans Strausberg et al. (PNAS (1999), 99(26) : 16899-16903). La séquence de la sous unité réceptrice β-TrCP du complexe ubiquitine ligase SCFβ"TrCP est celle décrite dans Yaron et al. (Nature (1998) 396(6711 ) : 590-594).
La séquence du gène GFP à'Aequora Victoria et de son produit la Green Fluorescent Protein mut3 dont la séquence est optimisée pour l'expression en levures (yEGFP3) (désignée ci-après sous le terme GFP) est celle décrite dans Cormack et al. (Gène (1996) 173 (1) : 33-38).
La séquence de localisation nucléaire « NLS » du grand antigène T codée par le virus SV40 est la traduction de la séquence nucléique ;
« 5' ACCTCCAAAAAAGAAGAGAAAGGTCGAATT 3' » (SEQ ID N°25).
La séquence du plasmide pRS306 est celle décrite dans Sikorski et Hieter (Genetics (1989) 122(1) : 19-27).
La séquence du plasmide pRS304 est celle décrite dans Sikorski et Hieter (Genetics (1989) 122(1) : 19-27).
La séquence du plasmide pRS314 est celle décrite dans Sikorski et Hieter (Genetics (1989) 122(1) : 19-27).
La séquence du plasmide pRS316 est celle décrite dans Sikorski et Hieter (Genetics (1989) 122(1) : 19-27).
La séquence du plasmide pSH 18-34 qui contient quatre opérateurs LexA placé en amont du gène LacZ est celle décrite par Hanes et Brent (Cell (1989), 57:1275-1293) La séquence du plasmide pLexSkp1-1 , qui permet l'expression de la protéine Skp1 de levure fusionnée à la protéine bactérienne LexA, est celle décrite dans Patton et al. (Gènes & Dev (1998), 12 :692-705)
La séquence du plasmide pGADβTrCP, qui permet l'expression de la protéine humaine β-TrCP fusionnée au domaine activateur du facteur transcription nel Gal4 de levure est celle décrite dans Margottin et al. (Molec. Cell (1998), 1 :565-574).
La séquence du promoteur du gène GAL1 de la levure S. cerevisiae utilisé dans les descriptions qui suivent est celle décrite par Johnston et Davis (Mol. Cell. Biol. (1984) 4 (8) : 1440-1448).
La séquence du promoteur du gène MET3 de la levure S. cerevisiae utilisé dans les descriptions qui suivent est celle décrite dans Cherest et al. (Mol. Gen. Genêt. (1987) 210 (2) : 307-313).
La séquence du promoteur du gène MET28 de la levure S. cerevisiae utilisé dans les descriptions qui suivent est celle décrite dans Kuras et al. (EMBO J. (1996) 15(10) : 2519-2529).
La séquence du promoteur du gène TEF1 de la levure S. cerevisiae utilisé dans les descriptions qui suivent est celle décrite par Schaaff- Gerstenschlager et al. (Eur. J. Biochem. (1993) 217 (1) : 487-492).
La séquence du promoteur du gène SAM4 de la levure S. cerevisiae utilisé dans les descriptions qui suivent est celle décrite par Thomas et al. (J. Biol. Chem. (2000) 275(52) : 40718-40724).
La séquence du promoteur du gène MET25 de la levure S. cerevisiae utilisé dans les descriptions qui suivent est celle décrite dans Kerjan et al. (Nucleic Acids Res.(1986) 14(20) : 7861-7871). La séquence du promoteur du gène PH05 de la levure S. cerevisiae utilisé dans les descriptions qui suivent est celle décrite par Feldmann et al. (EMBO J. (1994) 13(24) : 5795-5809).
La séquence du promoteur du gène CUP1 de la levure S. cerevisiae utilisé dans les descriptions qui suivent est celle décrite par Karin et al. (PNAS (1984) 81(2) : 337-341).
La séquence du promoteur du gène PGK1 de la levure S. cerevisiae utilisé dans les descriptions qui suivent est celle décrite par Bolle et al. (Yeast (1992) 8(3) : 205-213).
La séquence du promoteur du gène ADH1 de la levure S. cerevisiae utilisé dans les descriptions qui suivent est celle décrite par Bennetzen et Hall (J. Biol. Chem. (1982) 257(6) : 3018-3025).
La séquence du promoteur du gène TDH3 de la levure S. cerevisiae utilisé dans les descriptions qui suivent est celle décrite par Arroyo et al. Non publié (1996) soumission directe au MIPS).
La séquence du promoteur du gène LEU2 de la levure S. cerevisiae utilisé dans les descriptions qui suivent est celle décrite par Rad et al. (Yeast (1991 ) 7(5) : 533-538).
A.2. Conventions utilisées
Les descriptions sont faites en utilisant la nomenclature et les règles typographiques en usage dans la communauté des biologistes spécialistes de la levure Saccharomyces cerevisiae. le nom de la forme sauvage d'un gène est donné en majuscule italique ; exemple : GAL1. le nom d'une forme mutante d'un gène est donné en minuscule italique, le numéro d'allèle si il est connu est précisé à la suite d'un tiret ; exemple cup1-1. le nom d'un allèle inactivé d'un gène est donné en minuscule suivi de 2 fois deux points suivi du nom du gène inactivant ex ppr1::TRP1 (dans cet exemple le gène inactivé pprl a été interrompu par le gène actif TRP1).
Alternativement, le nom d'un gène inactivé peut être donné par le symbole « delta » ; exemple gal4A le nom de la protéine est celui du gène qui la code est donné en minuscule, excepté la première lettre qui est en majuscule ex Gal4 (alternativement on peut utiliser le même symbole suivi d'un p ; exemple Gal4p).
A.3. Remarques préliminaires concernant la construction des plasmides
L'ensemble des plasmides a été construit par des techniques de biologie moléculaire classiques selon des protocoles décrits par Sambrook et al. (in Molecular Cloning, Laboratory Manual, 2nd édition, (1989), Cold Spring Harbor, N. Y.) et Ausubel et al., ( in Current Protocols in Molecular Biology, (1990-2004), John Wiley and Sons Inc, N.Y.). Le clonage, la propagation et la production d'ADN plasmidiques ont été réalisés dans la souche d' Escherichia coli DH10B.
EXEMPLE 1 : Construction des plasmides permettant l'expression chez la levure des protéines fusions GFP-lκBoc et GFP-NLS-lκBα.
Les plasmides suivants permettent l'expression chez la levure Saccharomyces cerevisiae de dérivés de la protéine humaine IKBOC fusionnés à un variant de la Green Fluorescente Protéine (GFP) à'Aequora Victoria. Selon le plasmide construit, les protéines fusions construites comprennent ou non la séquence de localisation nucléaire du grand antigène T du virus SV40. L'introduction de cette séquence permet l'adressage dans le compartiment nucléaire des protéines fusion qui la comprennent.
Un fragment de 620 paires de bases (pb) correspondant au promoteur du gène GAL1 (pGAL1) de la levure Saccharomyces cerevisiae a été amplifié par Polymerase Chain Reaction (PCR) à partir d'ADN génomique d'une souche sauvage de S.cerevisiae X2180-1A, en utilisant les oligonucléotides « pGAL1 (Asp)Forw » de séquence
5'-GCTGGGTACCTTAATAATCATATTACATGGCATTA-3 [SEQ ID N°6] et « pGAL1 (EcoRI)Rev » de séquence
5'- GGCGGAATTCTATAGTTTTTTCTCCTTGACGTTA-3' [SEQ ID N°7].
Le fragment obtenu a été digéré par les enzymes de restriction Asp718l et EcoRI et inséré dans le plasmide navette S.ceΛev/s/ae-E.co// pRS306 préalablement digéré par les enzymes AspT'IB et EcoRI, produisant le vecteur pRS306-pGAL1.
Un fragment de 720 paires de bases (pb) correspondant à un variant du gène codant pour la Green Fluorescent Protein (GFP) à'Aequora Victoria, dont la séquence est optimisée pour l'expression en levures (yEGFP3), a été amplifié par Polymérase Chain Reaction (PCR) à partir du vecteur pUC19-yEGFP3, en utilisant les oligonucléotides « GFPEcoRlδ' » de séquence 5'-GGTCGGAATTCATGTCTAAAGGTGAAGAATTATTC-3' [SEQ ID N° 8] et « PBamHI(Smal/Srfl Pstl)3' » de séquence 5'- GGCGGGATCCGCCCGGGCTCTGCAGTTTGTACAATTCATCCATACC -3' [SEQ ID N°9] . Le fragment obtenu a été digéré par les enzymes de restriction SamHI et EcoRI et inséré dans le plasmide pRS306-pGAL1 préalablement digéré par les enzymes SamHI et EcoRI, produisant le vecteur pRS306-pGAL1-yEGFP3.
Un fragment de 340 paires de bases (pb) correspondant au terminateur du gène ADH1 (tADH1) de la levure Saccharomyces cerevisiae a été amplifié par Polymérase Chain Reaction (PCR) à partir d'ADN génomique d'une souche sauvage de S.cerevisiae X2180-1A, en utilisant les oligonucléotides « TermADH1(NotlBstXI)5' » de séquence 5'- GGCGGCGGCCGCCACCGCGGTGGGCGAATTTCTTATGATTTATG-3' [SEQ ID N°10] et « TermADHI (Sacl)3' » de séquence 5'-GGCGGAGCTCTGGAAGAACGATTACAACAG-3' [SEQ ID N°11]. Le fragment obtenu a été digéré par les enzymes de restriction Sacl et Noti et inséré dans le plasmide pRS306-pGAL1-yEGFP3 préalablement digéré par les enzymes Sacl et Noti, produisant le vecteur pCSY226.
Le gène codant pour la protéine IKBOC a été purifiée à partir du plasmide pGad1318-lkBa par digestion par l'enzyme de restriction Xba\ suivi d'un traitement avec le fragment de Klenow de l'ADN polymérase I afin de transformer l'extrémité cohésive en 3' du fragment en extrémité franche, puis d'une seconde digestion par l'enzyme de restriction Bam \ pour l'extrémité 5' du gène. Le fragment a été clone dans le plasmide pCSY226 préparé par une digestion par l'enzyme de restriction Kpn\, suivie d'un traitement avec le fragment de Klenow, puis d'une digestion par l'enzyme de restriction Bam \. Le vecteur produit a été appelé pCSY226-lκBcc.
Une version de ce vecteur contient en plus la séquence d'adressage nucléaire NLS. Celle-ci a été obtenue en synthétisant une paire d'oligonucléotides complémentaire de séquence
« NLS-5' » : 5ΑCCTCCAAAAAAGAAGAGAAAGGTCGAATT-3' [SEQ ID N°12], et
« NLS-3' » : 5'-AATTCGACCTTTCTCTTCTTTTTTGGAGGT-3' [SEQ ID
N°26]. réhybridés pour former un ADN double brin. Ce fragment d'ADN a ensuite été incorporé dans le vecteur pCSY226-lκBα digéré par l'enzyme de restriction ScrFI pour donner le vecteur pCSY226-NLS-lκBoc.
EXEMPLE 2 : Construction des plasmides permettant l'expression chez la levure des protéines fusions GFP-β-TrCP et GFP-NLS- β-TrCP.
Les plasmides suivants permettent l'expression chez la levure Saccharomyces cerevisiae de dérivés de la protéine humaine β-TrCP fusionnés à un variant de la Green Fluorescente Protéine (GFP) à'Aequora Victoria. Selon le plasmide construit, les protéines fusions construites comprennent ou non la séquence de localisation nucléaire du grand antigène T du virus SV40. L'introduction de cette séquence permet l'adressage dans le compartiment nucléaire des protéines fusion qui la comprennent.
Un fragment de 620 paires de bases (pb) correspondant au promoteur du gène GAL1 (pGAL1) de la levure Saccharomyces cerevisiae a été amplifié par Polymérase Chain Reaction (PCR) à partir d'ADN génomique d'une souche sauvage de S.cerevisiae X2180-1A, en utilisant les oligonucléotides « pGAL1 (Asp)Forw » de séquence 5'-GCTGGGTACCTTAATAATCATATTACATGGCATTA-3' [SEQ ID N°6] et
« pGAL1 (EcoRI)Rev » de séquence 5'- GGCGGAATTCTATAGTTTTTTCTCCTTGACGTTA-3' [SEQ ID N°7].
Le fragment obtenu a été digéré par les enzymes de restriction Asp7^8 et EcoRI et inséré dans le plasmide navette S.cerevisiae-E.coli pRS306 préalablement digéré par les enzymes Asp718l et EcoRI, produisant le vecteur pRS306-pGAL1.
Un fragment de 720 paires de bases (pb) correspondant à un variant du gène codant pour la Green Fluorescent Protein (GFP) à'Aequora Victoria, dont la séquence est optimisée pour l'expression en levures (yEGFP3), a été amplifié par Polymérase Chain Reaction (PCR) à partir du vecteur pUC19-yEGFP3, en utilisant les oligonucléotides « GFPEcoRlδ' » de séquence 5'-GGTCGGAATTCATGTCTAAAGGTGAAGAATTATTC-3' [SEQ ID N°8] et « GFPBamHI(Smaι7Srfl Pstl)3' » de séquence 5'-
GGCGGGATCCGCCCGGGCTCTGCAGTTTGTACAATTCATCCATACC
-3' [SEQ ID N°9].
Le fragment obtenu a été digéré par les enzymes de restriction βamHI et EcoRI et inséré dans le plasmide pRS306-pGAL1 préalablement digéré par les enzymes SamHI et EcoRI, produisant le vecteur pRS306- pGAL1-yEGFP3. Un fragment de 340 paires de bases (pb) correspondant au terminateur du gène ADH1 (tADH1 ) de la levure Saccharomyces cerevisiae a été amplifié par Polymérase Chain Reaction (PCR) à partir d'ADN génomique d'une souche sauvage de S.cerevisiae X2180-1A, en utilisant les oligonucléotides « TermADH1(NotlBstXI)5' » de séquence 5'- GGCGGCGGCCGCCACCGCGGTGGGCGAATTTCTTATGATTTATG-3' [SEQ ID N°10] et « TermADH1(Sacl)3' » de séquence 5'-GGCGGAGCTCTGGAAGAACGATTACAACAG-3' [SEQ ID N°11].
Le fragment obtenu a été digéré par les enzymes de restriction Sacl et Noti et inséré dans le plasmide pRS306-pGAL1-yEGFP3 préalablement digéré par les enzymes Sacl et Noti, produisant le vecteur pCSY226. Le gène codant pour la protéine βTrCP a été purifiée à partir du plasmide pGad1318-βTrCP par digestion par les enzymes de restriction SamHI et Noti. Le fragment a été clone dans le plasmide pCSY226 préparé par une digestion par les enzymes de restriction βamHI et Noti. Le vecteur produit a été appelé pCSY226-βTrCP.
Une version de ce vecteur contient en plus la séquence d'adressage nucléaire NLS. Celle-ci a été obtenue en synthétisant une paire d'oligonucléotides complémentaire de séquence
« NLS-5' » : 5'-ACCTCCAAAAAAGAAGAGAAAGGTCGAATT-3' [SEQ ID
N°12], et
« NLS-3' » : 5'-AATTCGACCTTTCTCTTCTTTTTTGGAGGT-3' [SEQ ID N°26] réhybridés pour former un ADN double brin. Ce fragment d'ADN a ensuite été incorporé dans le vecteur pCSY226-βTrCP digéré par l'enzyme de restriction ScrFI pour donner le vecteur pCSY226-NLS- βTrCP. EXEMPLE 3 : Construction des plasmides permettant l'expression chez la levure des protéines fusions GFP-β-TrCP et GFP-NLS- β-TrCP.
Les plasmides suivants permettent l'expression chez la levure Saccharomyces cerevisiae de dérivés de la protéine β-TrCP comprenant une répétition de trois motifs antigénique Flag à leur extrémité amino- terminale. L'expression de ces protéines fusions est induite en cultivant les cellules de levures hébergeant ces plasmides en présence de 2 à 5 % de galactose dans le milieu de culture pendant 1 à 10 heures.
Un fragment de 700 paires de bases (pb) correspondant au promoteur du gène PGK1 (pPGK1) de la levure Saccharomyces cerevisiae a été amplifié par Polymérase Chain Reaction (PCR) à partir d'ADN génomique d'une souche sauvage de S.cerevisiae X2180-1A, en utilisant les oligonucléotides « pPGK1-Asp718-5' » de séquence 5'-GGCGGGTACCGTGAGTAAGGAAAGAGTGAGG-3' [SEQ ID N°13] et « pPGK-EcoRI-3' » de séquence 5'-GGCGGAATTCTGTTTTATATTTGTTGTAAAAAG-3' [SEQ ID N°14].
Le fragment obtenu a été digéré par les enzymes de restriction Asp718l et EcoRI et inséré dans le plasmide navette S.cerevisiae-E.coli pRS304 préalablement digéré par les enzymes Asp718l et EcoRI, produisant le vecteur pRS304-pPGK1.
Un fragment de 100 paires de bases (pb) correspondant à une succession de 3 séquences rapporteuses FLAG (3FLAG) a été amplifié par Polymérase Chain Reaction (PCR) à partir du vecteur p3XFLAG- myc-CMV-24 5Sigma Aldrich), en utilisant les oligonucléotides « 3FLAG- EcoRI-5' » de séquence 5'-GGCGGAATTCATGGACTACAAAGACCATGACGG-3' [SEQ ID N°15] et « 3FLAGBamHI(Smal/Srfl Pstl)3' » de séquence 5'-
GGCGGGATCCGCCCGGGCTCTGCAGCTTGTCATCGTCATCCTTGTA -3' [SEQ ID N°16]..
Le fragment obtenu a été digéré par les enzymes de restriction βamHI et EcoRI et inséré dans le plasmide pRS304-pPGK1 préalablement digéré par les enzymes SamHI et EcoRI, produisant le vecteur pRS304-pPGK1- 3FLAG.
Un fragment de 340 paires de bases (pb) correspondant au terminateur du gène ADH1 (tADH1 ) de la levure Saccharomyces cerevisiae a été amplifié par Polymérase Chain Reaction (PCR) à partir d'ADN génomique d'une souche sauvage de S.cerevisiae X2180-1A, en utilisant les oligonucléotides « TermADH1(NotlBstXI)5' » de séquence 5'- GGCGGCGGCCGCCACCGCGGTGGGCGAATTTCTTATGATTTATG-3' [SEQ ID N°10] et « TermADH1(Sacl)3' » de séquence 5'-GGCGGAGCTCTGGAAGAACGATTACAACAG-3' [SEQ ID N°11].
Le fragment obtenu a été digéré par les enzymes de restriction Sacl et Noti et inséré dans le plasmide pRS304-pPGK1 -3FLAG préalablement digéré par les enzymes Sacl et Noti, produisant le vecteur pCSY614.
Le gène codant pour la protéine βTrCP a été purifiée à partir du plasmide pGad1318-βTrCP par digestion par les enzymes de restriction βamHI et Noti. Le fragment a été clone dans le plasmide pCSY614 préparé par une digestion par les enzymes de restriction BamHI et Noti. Le vecteur produit a été appelé pCSY614-βTrCP. Une version de ce vecteur contient en plus la séquence d'adressage nucléaire NLS. Celle-ci a été obtenue en synthétisant une paire d'oligonucléotides complémentaire de séquence
5ΑCCTCCAAAAAAGAAGAGAAAGGTCGAATT-3' [SEQ ID N°12]. réhybridés pour former un ADN double brin. Ce fragment d'ADN a ensuite été incorporé dans le vecteur pCSY614-βTrCP digéré par l'enzyme de restriction ScrFI pour donner le vecteur pCSY614-NLS- βTrCP.
Exemples 4 à 12 : Mise au point du procédé de criblage selon l'invention.
EXEMPLE 4 : Interaction entre les protéines Skp1 de levure et β-TrCP humaine dans les cellules de levure.
L'interaction entre les protéines Skp1 et β-TrCP est visualisée par la technique du double hybride Bartel et al. (in Cellular Interactions in Development : a practical approach (1991), Oxford University Press, Oxford, pp153-179). Des cellules de levure ont été simultanément transformées par le plasmide pGAD-βTrCP, qui permet l'expression de la protéine humaine β-TrCP fusionnée au domaine activateur Gal4, par le plasmide pLexSkp1-1 qui permet l'expression de le protéine de levure Skp1 fusionnée au domaine de fixation à l'ADN de la protéine bactérienne LexA, et par le plasmide pSH18-34 qui comprend le gène rapporteur LacZ codant la β-galactosidase, placé sous le contrôle d'opérateurs LexA. La mesure de l'activité β-galactosidase dans des extraits cellulaires réalisées dans de telles cellules démontre que l'expression de ce gène rapporteur est induite par un facteur 15, en comparaison de son expression chez des cellules n'exprimant que l'une des deux protéines de fusion décrites ci-dessus. Cette induction de l'expression du gène rapporteur indique que la protéine Skp1 de la levure Saccharomyces cerevisiae est capable d'interagir avec la protéine β-TrCP humaine. L'activité β-galactosidase est exprimée en nmoles de substrat transformé par minute et par mg de protéines (nmoles/ min /mg).
EXEMPLE 5 : localisation, dans les cellules de levure, des protéines humaines lκBα et β-TrCP selon qu'elles sont fusionnées ou non à une séguence NLS de SV40.
Des cellules de levures comportant des plasmides permettant l'expression des protéines hybrides soit GPF-lκBoc, soit GFP-NLS-lκBcc, soit GFP-β-TrCP, soit GFP-NLS-β-TrCP à partir du promoteur GAL1 ont été cultivées en présence de galactose 2 % pendant 2 heures et ont été ensuite observées en microscopie à fluorescence. La position du noyau a été révélée en employant un indicateur coloré spécifique du noyau, le Hoescht 333-42.
EXEMPLE 6 : Phosphorylation de la protéine IKBOC dans le noyau des cellules de levure.
L'exemple 6 illustre comment l'adressage de la protéine humaine IKBOC dans le noyau des cellules de levure induit sa phosphorylation sur les serines 32 et 36.
Des cellules exprimant soit la protéine fusion GFP-lκBcc, soit la protéine fusion tripartite GFP-NLS-lκBoc à partir du promoteur GAL1 sont cultivées en milieu minimum en présence de 2% galactose pendant 2 heures. Les protéines de ces cellules sont alors préparées selon le protocole décrit par Kuras et al. (Mol. Cell (2002), 10:69-80). Les protéines sont ensuite analysées par la technique de Western blotting à l'aide premièrement, d'anticorps reconnaissant spécifiquement la protéine GFP (indiquée « GFP-lκBcc ») et deuxièmement, d'anticorps reconnaissant spécifiquement la forme phosphorylée sur la serine 32 de la protéine humaine IKBOC (indiquée « P-lκBoc »). Un contrôle de la quantité de protéines totales déposée dans chaque puit a été réalisé en analysant ces mêmes protéines à l'aide d'anticorps reconnaissant spécifiquement la Lysyl-ARNt-synthase de levure (indiquée par « LysRS »). Les protéines issues de la souche de levure parentale n'exprimant aucune protéine fusion (indiquée « contrôle ») servent de témoin de spécificité.
EXEMPLE 7 : Dégradation de la protéine GFP-NLS-lκB
L'exemple 7 illustre par une analyse au microscope d'épifluorescence, la dégradation de la protéine fusion tripartite GFP-NLS-lκBcc dans des cellules de levure lorsque celles-ci expriment également la protéine fusion tripartite Flag-NLS-β-TrCP.
Toutes les souches employées ont été cultivées et analysées en microscopie à fluorescence de manière identique. Les cellules ont été cultivées en milieu riche en présence de galactose comme source de carbone pendant 120 minutes. Au temps t=0, du glucose 2 % est ajouté à la culture et les cellules sont observées au microscope à épifluorescence (microscope à fluorescence Nikon Eclipse équipé d'un filtre Oméga XF116). Toutes les images ont été enregistrées en employant une caméra Hamamastu® en employant des réglages identiques et analysées avec le logiciel LUCIA G, juste avant (t = 0) et 10, 20 , 30 et 60 minutes après l'addition de glucose. La fluorescence des protéines fusions GFP-lκBcc ou GFP-NLS-lκBα est indiquée « GFP ». La position du noyau (indiquée « DNA ») dans les cellules a été révélée en employant un indicateur coloré spécifique du noyau, le Hoescht 333-42.
A) souche de levure CYS22 (MA Ta, his3, Ieu2, trpl, ura3::pGAL1- GFP-lκBa::URA3) exprimant la protéine fusion GFP-lκBcc sans NLS et localisée dans le cytoplasme des cellules de levure;
B) souche de levure CYS61 (MATa, his3, Ieu2, ura3::pGAL1-GFP- lκBα::URA3, trp1::pGAL1-3Flag-βTrCP::TRP1) exprimant les protéines fusions GFP-lκBoc et Flag-β-TrCP, localisées dans le cytoplasme des cellules de levure;
C) souche de levure CYS126 (MATa, his3, Ieu2, trpl, ura3::pGAL1- GFP-NLS-lκBα::URA3) exprimant la protéine fusion GFP-NLS-lκBcc localisée dans le noyau des cellules de levure;
D) souche de levure CYS135 (MATa, his3, Ieu2, ura3::pGAL1-GFP- NLS-lκBα::URA3, trp1::pGAL1-3Flag-NLS-βTrCP::TRP1) exprimant les protéines fusions GFP-NLS-lκBcc et Flag-NLS-β-TrCP localisées dans le noyau des cellules de levure.
EXEMPLE 8 : Dégradation de GFP-NLS-lκBoc avec ou non co- expression de Flag-NLS-β-TrCP (Résultats par fluorescence).
L'exemple 8 illustre par une quantification de la fluorescence émise, la dégradation de la protéine fusion tripartite GFP-NLS-lκBoc dans des cellules de levure lorsque celles-ci expriment ou non la protéine fusion tripartite Flag-NLS-β-TrCP.
Les souches de levure identiques à celles décrites dans la figure 4, et cultivées dans les mêmes conditions que celles décrites figure 4, ont été analysées par microscopie à fluorescence. Pour chaque souche, la fluorescence de 200 cellules (au moins) a été mesurée juste avant (t=0) et 10, 20, 30 et 60 minutes après l'addition de glucose, à l'aide du logiciel LUCIA G. Les résultats sont donnés en quantité de fluorescence mesurée par cellule en unité arbitraire.
EXEMPLE 9 : Dégradation de GFP-NLS-lκBoc avec ou non co- expression de Flag-NLS-β-TrCP (Résultats d'immuno-empreinte)
L'exemple 9 illustre par une analyse biochimique de type Western Blotting, la dégradation de la protéine fusion tripartite GFP-NLS-lκBoc dans des cellules de levure lorsque celles-ci expriment également la protéine fusion tripartite Flag-NLS-β-TrCP. Toutes les souches employées ont été cultivées et analysées de manière identique. Les cellules ont été cultivées en milieu riche en présence de galactose comme source de carbone pendant 120 minutes. Au temps t=0, du glucose 2 % est ajouté à la culture et les protéines totales sont préparées juste avant (t =0) et 10, 20, 30 et 60 minutes après l'addition de glucose. Ces protéines sont analysées par la technique de Western blotting en employant un anticorps reconnaissant la partie GFP des protéines fusions contenant I KBOC (indiquée « GFP-NLS-lκBα ») et un anticorps reconnaissant la partie Flag de la protéine fusion Flag-NLS-β-TrCP (indiquée « Flag-NLS-β-TrCP »). Un contrôle de la quantité de protéines déposée dans chaque puit est réalisé en analysant les mêmes protéines à l'aide d'anticorps reconnaissant la Lysyl-ARNt-synthase de levure (indiquée « LysRS »). Les protéines issues de la souche de levure parentale n'exprimant aucune protéine fusion (indiquée « contrôle ») servent de témoin de spécificité.
A) souche de levure CYS22 (MATa, his3, Ieu2, trpl, ura3::pGAL1- GFP-lκBα::URA3) exprimant la protéine fusion GFP-lκBcc sans NLS et localisée dans le cytoplasme des cellules de levure; B) souche de levure CYS61 (MATa, his3, Ieυ2, ura3::pGAL1-GFP- lκBα::URA3, trp1::pGAL1-3Flag-βTrCP::TRP1) exprimant les protéines fusions GFP-lκBoc et Flag-β-TrCP, localisées dans le cytoplasme des cellules de levure; C) souche de levure CYS126 (MATa, his3, Ieu2, trpl, ura3::pGAL1- GFP-NLS-lκBα::URA3) exprimant la protéine fusion GFP-NLS-lκBoc localisée dans le noyau des cellules de levure; D) souche de levure CYS 135 (MATa, his3, Ieu2, ura3::pGAL1-GFP- NLS-lκBα::URA3, trp1::pGAL1-3Flag-NLS-βTrCP::TRP1) exprimant les protéines fusions GFP-NLS-lκBcc et Flag-NLS-β-TrCP localisées dans le noyau des cellules de levure. EXEMPLE 10 : Dégradation de GFP-NLS-lκBα mutée sur les résidus serine 32 et 36 avec ou non co-expression de Flag-NLS-β-TrCP (Résultats d'immuno-empreinte)
L'exemple 10 illustre par une analyse biochimique de type Western blotting, la dégradation de la protéine fusion tripartite mutante GFP-NLS- lκBoc[S3236A] dans laquelle les sites de phosphorylation Ser32 et Ser36 ont été remplacés par des résidus Ala, mutations qui dans des cellules humaines rendent la protéine non-dégradable. L'analyse a été faite dans des cellules de levure exprimant également ou non la protéine fusion tripartite Flag-NLS-β-TrCP. Toutes les souches employées ont été cultivées et analysées de manière identique. Les cellules ont été cultivées en milieu riche en présence de galactose comme source de carbone pendant 120 minutes. Au temps t=0, du glucose 2 % est ajouté à la culture et les protéines totales sont préparées juste avant (t=0) et 10, 20, 30 et 60 minutes après l'addition de glucose. Ces protéines sont analysées par la technique de Western blotting en employant un anticorps reconnaissant la partie GFP des protéines fusions contenant lκBoc[S3236A] (indiqué « GFP-NLS-lκBcc[S3236A] ») et un anti-corps reconnaissant la partie Flag des protéines fusions Flag-NLS-β-TrCP (indiqué « Flag-NLS-β-TrCP »). Un contrôle de la quantité de protéines déposée dans chaque puit est réalisé en analysant les mêmes protéines à l'aide d'anticorps reconnaissant la Lysyl-ARNt-synthase de levure (indiquée « LysRS »). Les protéines issues de la souche de levure parentale n'exprimant aucune protéine fusion (indiquée « contrôle ») servent de témoin de spécificité.
A) souche de levure CYS138 (MATa, his3, Ieu2, trpl, ura3::pGAL1- GFP-NLS-lκBα[S3236A]::URA3) exprimant la protéine fusion mutante GFP-NLS-lκBα[S3236A] localisée dans le noyau des cellules de levure;
B) souche de levure CYS 139 (MATa, his3, Ieu2, ura3::pGAL1-GFP- NLS-lκBα[S3236A]::URA3, trp1::pGAL1-3Flag-NLS-βTrCP::TRP1) exprimant les protéines fusions GFP-NLS-lκBα[S3236A] et Flag- NLS-β-TrCP localisées dans le noyau des cellules de levure.
EXEMPLE 11 : Dégradation de GFP-NLS-lκBα avec ou non co- expression de Flag-NLS-β-TrCP (Résultats par fluorescence)
L'exemple 11 illustre par une analyse au microscope d'épifluorescence, la dégradation de la protéine fusion tripartite GFP-NLS-lκBα[S3236A] dans des cellules de levure lorsque celles-ci expriment également la protéine fusion tripartite Flag-NLS-β-TrCP. Les 2 souches employées
(CYS138 et CYS139) ont été cultivées et analysées en microscopie à fluorescence de manière identique. Les cellules sont observées au microscope à épifluorescence (microscope à fluorescence Nikon Eclipse équipé d'un filtre Oméga XF116. Toutes les images ont été enregistrées en employant une caméra Hamamastu® en employant des réglages identiques et analysées avec le logiciel LUCIA G, juste avant (t=0) et 10,
20 , 30 et 60 minutes après l'addition de glucose. La fluorescence des protéines fusions GFP-lκBcc ou GFP-NLS-lκBoc est indiquée « GFP ». La position du noyau (indiquée « DNA ») dans les cellules a été révélée en employant un indicateur coloré spécifique du noyau, le Hoescht 333-42.
EXEMPLE 12 : Dégradation de GFP-NLS-lκBoc avec ou non co- expression de Flag-NLS-β-TrCP (Résultats par fluorescence)
L'exemple 12 illustre par une quantification de la fluorescence émise, la dégradation de la protéine fusion tripartite GFP-NLS-lκBcc[S3236A] dans les souches de levure décrites ci-dessus. Pour chaque souche, la fluorescence de 200 cellules (au moins) a été mesurée juste avant (t=0) et 10, 20, 30 et 60 minutes après l'addition de glucose à l'aide du logiciel LUCIA G. Les résultats sont donnés en quantité de fluorescence mesurée par cellule en unité arbitraire. Tableau 1 : Génotype des souches de levure Saccharomyces cerevisiae construites pour les besoins de la présente invention.
TABLEAU 2 (SEQUENCES)
Tableau 3 : Liste des GFP utilisables selon l'invention
Tableau 3 (suite) : Liste des GFP utilisables selon l'invention
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Claims

REVENDICATIONS
1. Procédé pour le criblage d'agents modulant l'ubiquitination de la protéine IKBOC par un complexe protéique fonctionnel ubiquitine ligase comprenant la protéine β-TrCP, ledit procédé comprenant les étapes suivantes : (a) mettre en contact un agent candidat à tester avec des cellules de levure recombinantes qui expriment dans leur noyau : (i) une protéine de fusion comprenant le polypeptide lκBα et au moins une première protéine détectable ; et (ii) une protéine comprenant le polypeptide β-TrCP ; (b) quantifier ladite première protéine détectable dans les cellules de levure, à la fin d'au moins une période de temps prédéterminée après la mise en contact de l'agent candidat avec lesdites cellules ;
(c) comparer la valeur obtenue à l'étape (b) avec une valeur témoin obtenue lorsque l'étape (a) est réalisée en l'absence de l'agent candidat.
2. Procédé selon la revendication 1 , caractérisé en ce que l'étape (a) comprend les étapes suivantes :
(ai) cultiver les cellules de levure qui expriment dans leur noyau une protéine de fusion comprenant le polypeptide IKBOC et au moins une première protéine détectable ; (a2) stopper l'expression de ladite protéine de fusion comprenant le polypeptide IKBOC et au moins une première protéine détectable par les cellules de levure ; (a3) mettre en contact les cellules de levures obtenues à la fin de l'étape (a2) avec l'agent candidat à tester.
3. Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que les cellules de levure expriment la protéine comprenant le polypeptide β-TrCP durant la totalité des étapes (ai ), (a2) et (a3).
4. Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que les cellules de levure expriment la protéine comprenant le polypeptide β-TrCP durant la totalité des étapes (a2) et (a3) et n'expriment pas la protéine comprenant le polypeptide β-TrCP durant l'étape (ai).
5. Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que les cellules de levure expriment la protéine comprenant le polypeptide β-TrCP durant la totalité des étapes (a2) et (a3), et
(i) n'expriment pas la protéine comprenant le polypeptide β-TrCP pendant une durée prédéterminée, au début de l'étape (ai ) ; (ii) expriment la protéine comprenant le polypeptide β-TrCP pendant la durée restante de l'étape (ai).
6. Procédé selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que la protéine détectable comprise dans la protéine de fusion comprenant le polypeptide IKBOC est choisie parmi un antigène, une protéine fluorescente et une protéine ayant une activité enzymatique.
7. Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce que la protéine détectable consiste en une protéine fluorescente choisie parmi la protéine GFP ou l'un de ses dérivés, la protéine YFP ou l'un de ses dérivés, et la protéine dsRED.
8. Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce que la protéine détectable consiste en une protéine ayant une activité enzymatique choisie parmi la luciferase et la β-lactamase.
9. Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce que la protéine détectable consiste en un antigène choisi parmi le peptide Ha et le peptide Flag.
10. Procédé selon l'une des revendications 1 à 9, caractérisé en ce que la protéine comprenant le polypeptide β-TrCP consiste en une protéine de fusion comprenant aussi une seconde protéine détectable.
11. Procédé selon la revendication 10, caractérisé en ce que la seconde protéine détectable comprise dans la protéine de fusion comprenant le polypeptide β-TrCP est choisie parmi un antigène, une protéine fluorescente et une protéine ayant une activité enzymatique.
12. Procédé selon l'une des revendications 10 et 11 , caractérisé en ce que (i) la première protéine détectable comprise dans la protéine de fusion comprenant le polypeptide IxBα et (ii) la seconde protéine détectable comprise dans la protéine de fusion comprenant le polypeptide β-TrCP sont distinctes l'une de l'autre.
13. Procédé selon l'une des revendications 1 à 12, caractérisé en ce que la protéine comprenant le polypeptide IKBOC comprend de plus un peptide de localisation nucléaire.
14. Procédé selon l'une des revendications 1 à 13, caractérisé en ce que la protéine comprenant le polypeptide β-TrCP comprend de plus un peptide de localisation nucléaire.
15. Procédé selon l'une des revendications 1 à 14, caractérisé en ce que la protéine comprenant le polypeptide IKBOC consiste en la protéine de séquence SEQ ID N°2.
16. Procédé selon l'une des revendications 1 à 15 ; caractérisé en ce que la protéine comprenant le polypeptide β-TrCP consiste en la protéine de séquence SEQ ID N° 4.
17. Procédé selon l'une des revendications 1 à 16, caractérisé en ce qu'à l'étape (b), lorsque la première protéine détectable est un antigène, on quantifie ladite première protéine détectable par détection des complexes formés entre ladite protéine et des anticorps la reconnaissant.
18. Procédé selon l'une des revendications 1 à 16, caractérisé en ce qu'à l'étape (b), lorsque la première protéine détectable est une protéine fluorescente, on quantifie ladite protéine détectable par une mesure du signal de fluorescence émis par ladite protéine.
19. Procédé selon l'une des revendications 1 à 16, caractérisé en ce qu'à l'étape (b), lorsque la première protéine détectable est une protéine ayant une activité enzymatique, on quantifie ladite protéine détectable par une mesure de la quantité de substrat transformé par ladite protéine.
20. Procédé selon l'une des revendications 1 à 19, caractérisé en ce que les cellules de levures recombinantes sont transformées avec : respectivement :
(1) un premier polynucléotide qui comprend (a) un cadre de lecture ouvert codant (i) la protéine de fusion comprenant le polypeptide le polypeptide IKBOC et (iii) une première protéine détectable, et une séquence régulatrice fonctionnelle dans des cellules de levure qui dirige l'expression dudit cadre de lecture ouvert; et (2) un second polynucléotide qui comprend (a) un cadre de lecture ouvert codant (i) une protéine comprenant le polypeptide β-TrCP, (ii) une séquence de localisation nucléaire et (iii) une séquence régulatrice fonctionnelle dans des cellules de levure qui dirige l'expression dudit cadre de lecture ouvert ;
21. Procédé selon la revendication 20, caractérisé en ce que la séquence régulatrice contenue dans le premier polynucléotide, la séquence régulatrice contenue dans le second polynucléotide, ou les deux séquences régulatrices, comprenne(nt) un promoteur fonctionnel dans les cellules de levure et qui est sensible à l'action d'un agent inducteur.
22. Procédé selon la revendication 21 , caractérisé en ce le promoteur inductible fonctionnel dans les cellules de levure est choisi parmi PGK1,
ADH1, TDH3, LEU2 et TEFL
23. Procédé selon la revendication 21 , caractérisé en ce le promoteur inductible fonctionnel dans les cellules de levure est choisi parmi CUP1, GALL MET3, MET25, MET28, SAM4 et PH05.
24. Procédé selon l'une des revendications 20 à 23, caractérisé en ce que le premier polynucléotide comprend la séquence régulatrice GAL1, qui active l'expression du cadre de lecture ouvert codant la protéine de fusion comprenant le polypeptide le polypeptide lκBoc en présence de glucose.
25. Procédé selon la revendication 20 à 23, caractérisé en ce que le second polynucléotide comprend la séquence régulatrice CUP1, qui active l'expression du cadre de lecture ouvert codant une protéine comprenant le polypeptide β-TrCP en présence de sulfate de cuivre.
26. Procédé selon l'une des revendications 20 à 25, caractérisé en en ce que les cellules de levure recombinantes possèdent le premier et le second polynucléotide sous une forme insérée dans leur génome.
27. Procédé selon l'une des revendications 1 à 26, caractérisé en ce que les cellules de levure recombinantes possèdent dans leur génome une forme inactivée d'un ou plusieurs gènes contrôlant l'expression de protéines transporteurs insérées dans la membrane plasmique.
28. Procédé selon la revendication 27, caractérisé en ce que le ou les gènes inactivés sont choisis parmi les gènes PDR1 et PDR3.
29. Cassette d'expression fonctionnelle dans les cellules de levure comprenant un polynucléotide codant qui comprend un cadre de lecture ouvert codant la protéine de fusion comprenant le polypeptide le polypeptide IKBOC et au moins une première protéine détectable, et une séquence régulatrice fonctionnelle dans des cellules de levure qui dirige l'expression dudit cadre de lecture ouvert.
30. Cassette d'expression fonctionnelle dans les cellules de levure comprenant un polynucléotide qui comprend un cadre de lecture ouvert codant une protéine comprenant le polypeptide β-TrCP et une séquence régulatrice fonctionnelle dans des cellules de levure qui dirige l'expression dudit cadre de lecture ouvert.
31. Cassette d'expression selon l'une des revendications 29 et 30, caractérisée en ce que la séquence régulatrice contenue dans ledit polynucléotide, la séquence régulatrice contenue dans le second polynucléotide, ou les deux séquences régulatrices, comprenne(nt) un promoteur fonctionnel dans les cellules de levure et qui est sensible à l'action d'un agent inducteur.
32. Cassette d'expression selon la revendication 31 , caractérisée en ce le promoteur inductible fonctionnel dans les cellules de levure est choisi parmi PGK1, TEF1, PH05, MET3, MET28, CUP1, GAL1 et SAM4.
33. Vecteur d'expression caractérisé en ce qu'il comprend une cassette d'expression selon l'une des revendications 29 à 32.
34. Vecteur d'expression selon la revendication 33, caractérisé en ce qu'il s'agit du vecteur pCSY226-NLS-lκBcc.
35. Vecteur d'expression selon la revendication 33, caractérisé en ce qu'il s'agit du vecteur pCSY226-NLS-β-TrCP.
36. Souche de levure recombinante comprenant, sous une forme intégrée dans son génome,
(i) un premier polynucléotide qui comprend un cadre de lecture ouvert codant la protéine de fusion comprenant le polypeptide le polypeptide IKBOC et au moins une première protéine détectable, et une séquence régulatrice fonctionnelle dans des cellules de levure qui dirige l'expression dudit cadre de lecture ouvert ; et
(ii) un second polynucléotide qui comprend un cadre de lecture ouvert codant une protéine comprenant le polypeptide β-TrCP et une séquence régulatrice fonctionnelle dans des cellules de levure qui dirige l'expression dudit cadre de lecture ouvert ;
37. Souche de levure recombinante selon la revendication 36, caractérisée en ce qu'elle consiste en la souche de levure CYS135 déposée à la Collection Nationale de Cultures de microorganismes de l'Institut Pasteur de Paris (CNCM) sous le numéro d'accès 1-3187.
38. Trousse ou kit pour le criblage d'agents modulant l'ubiquitination de la protéine lκB par un complexe protéique fonctionnel ubiquitine ligase comprenant la protéine β-TrCP, caractérisé en ce qu'il comprend :
(i) un premier vecteur d'expression comprenant une cassette d'expression selon la revendication 29; et (ii) un second vecteur d'expression comprenant une cassette d'expression selon la revendication 30.
39. Trousse ou kit pour le criblage d'agents modulant l'ubiquitination de la protéine IKBOC par un complexe protéique fonctionnel ubiquitine ligase comprenant la protéine β-TrCP, caractérisé en ce qu'il comprend des cellules de levures recombinantes comprenant, sous une forme insérée dans leur génome, respectivement : (i) une cassette d'expression selon la revendication 29; et (ii) une cassette d'expression selon la revendication 30.
40. Trousse ou kit selon la revendication 39, caractérisé en ce qu'il comprend des cellules de levures recombinantes de la souche de levure CYS 135 déposée à la CNCM sous le numéro d'accès 1-3187.
EP05739597A 2004-03-16 2005-03-15 Procede de criblage d'agents modulant l'ubiquitination de la proteine lkb alpha et moyens destines a la mise en oeuvre dudit procede Withdrawn EP1730297A1 (fr)

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