FR2862983A1 - Moyens de criblage pour l'identification de regulateurs de l'activite gtpase - Google Patents

Abstract

La présente demande de brevet est relative à des moyens pour l'analyse de la régulation des voies d'activation des GTPases, qui sont spécialement adaptés à l'identification par criblage d'un composé capable d'exercer une activité inhibitrice sur une voie d'activation de GTPase.Ces moyens comprennent une levure à forte perméabilité membranaire (erg6) et au moins un système pour l'expression d'au moins une protéine hybride de type double hybride par cette levure, ou bien une levure et au moins un système pour l'expression d'au moins une protéine hybride de type double hybride intégré dans le génome de la levure, ou destiné à l'être.Ces moyens sont entièrement automatisables, et permettent la production de composés susceptibles de permettre de lutter contre une cellule tumorale, et/ou contre l'hypertension, et/ou contre une infection, contre le développement d'une maladie génétique.

Description

MOYENS DE CRIBLAGE POUR L'IDENTIFICATION DE

REGULATEURS DE L'ACTIVITE GTPase ARRIÈRE-PLAN TECHNOLOGIQUE Les petites GTPases de la superfamille Ras (Ras, Rho, Rab, Arf et Ran) sont des acteurs majeurs de la régulation des cascades de la signalisation cellulaire. Leur rôle essentiel dans la régulation des cascades de signaux se traduit par leur implication dans de nombreux cancers et pathologies (Oxford et Theodorescu, 28 janvier 2003,Cancer Lett. 189(2) :117-128).

Il existe chez l'homme 21 GTPases de la famille Rho. Elles régulent le remodelage du cytosquelette d'actine, contrôlant ainsi de nombreux phénomènes physiologiques comme la morphologie, l'adhérence et la migration des cellules, la transcription des gènes, le trafic intracellulaire, le développement embryonnaire, l'apoptose ou la transformation (Etienne-Manneville et Hall, 12 décembre 2002, Nature 420(6916) :629-635)). Les GTPases Rho sont impliquées dans plusieurs cancers et pathologies chez l'homme (Boettner et Van Aelst, février 2002, Nat. Rev. Cancer 2(2) :133-142; Sahai et Marshall, 20 mars 2002, Gene 286(2) :155-174).

Les GTPases existent sous deux formes: une forme active liée au GTP, et une forme inactive liée au GDP. Liée au GTP, la GTPase interagit avec des protéines effectrices activant ainsi la cascade de signalisation en aval. Liée au GDP, la GTPase est incapable de lier ses effecteurs, et aucune cascade de signalisation n'est enclenchée.

L'activation des GTPases est assurée par des protéines activatrices connues sous le nom de "Guanine nucleotide Exchange Factors" (GEF). Les GEF sont généralement des protéines de haut poids moléculaire, capables d'intégrer de nombreux signaux intra- ou extra-cellulaires. Par exemple, les protéines de la famille Dbl telles que LARG, TIAM, VAV, activent les GTPases de la famille Rho.

Il existe environ une soixantaine de RhoGEF chez l'homme, caractérisés par un domaine DH ("Dbl Homology") d'environ deux cents acides aminés et responsable de l'activation spécifique d'une ou plusieurs GTPases. Ce sont des molécules généralement complexes comportant de nombreux domaines participant à la régulation de leur activité et à leur localisation (Hoffman et Cerione, 20 février 2002, FEBS Lett. 513(1) :85-91). La dérégulation de l'activité de facteurs d'échange conduit à une signalisation anormale que l'on retrouve associée à des cancers et de nombreuses autres pathologies (Zheng, décembre 2001, Trends Biochem. Sci. 26(12) :724-732). Les différents membres de la famille Dbl, et notamment LARG, TIAM, VAV, sont ainsi connus pour leur potentiel transformant.

Les GTPases ont un large spectre d'expression dans les différents tissus, et participent à plusieurs cascades d'activation au sein d'une même cellule. Les facteurs d'échange présentent au contraire des profils d'expression plus spécifiques, et sont activés en réponse à des signaux définis par leur association avec des récepteurs particuliers dans la cellule. Les facteurs d'échange constituent donc des cibles de choix pour le développement de drogues, notamment anticancéreuses, présentant un spectre d'action restreint.

Bien que leur rôle dans la pathologie humaine soit depuis longtemps avéré, en particulier du fait de leurs propriétés oncogéniques comme dans le cas de la famille Dbl, il n'existe néanmoins à l'heure actuelle que deux composés connus pour inhiber l'activité de facteurs d'échange: - la Bréfeldine A, qui est un inhibiteur non compétitif des facteurs d'échange à domaine Sec7 activant les GTPases de la famille Arf (Chardin et MacCormick, 16 avril 1999, F. Cell 97(2) :153-155), et qui présente l'inconvénient d'être peu spécifique et surtout de stabiliser le complexe GTPase-activateur, provoquant des effets multiples, et - TRIPalpha, un peptide inhibiteur spécifique du deuxième domaine d'échange de TRIO, un activateur de RhoA, qui est spécifique du facteur d'échange et n'a pas d'effet sur la GTPase elle-même (Schmidt et al., 14 juillet 2002, FEBS Lett. 523(1-3) :35-42).

Disposer d'autres composés inhibiteurs présenterait un intérêt majeur pour le développement de drogues utilisables chez les patients, pour lesquels il est nécessaire de limiter les effets pléïotropes indésirables.

Or, les méthodologies actuellement disponibles à cet effet sont assez limitées.

La méthodologie de l'art antérieur pour l'identification inhibiteur comprend la mise en oeuvre d'un crible primaire qui consiste à identifier des composés capables de fixer la cible, par des mesures d'interaction en masse telles que le "phage display" (Scott et Smith, 1990, Science 249:386-390), et le "double hybride" (Fields et Song, 1989, Nature 340:245-246). Les composés positifs au crible primaire d'interaction sont alors ensuite analysés selon un crible secondaire pour leur capacité d'inhibition par des méthodes biochimiques sur des partenaires purifiés. Les composés positifs à l'issue du crible secondaire sont alors soumis à une analyse de confirmation fonctionnelle sur une lignée cellulaire, par suivi d'un changement phénotypique induit par exemple. Dans le cas des protéines activatrices des GTPases, l'activité enzymatique consiste à catalyser le remplacement du GDP de la GTPase cible par du GTP. Cette activité est alors déterminée biochimiquement sur des partenaires purifiés, par exemple en mesurant le taux d'incorporation de GTP radiomarqué sous forme acido-précipitable, puis soumise à confirmation fonctionnelle par étude sur une étude lignée cellulaire, par exemple par suivi de la croissance de neurites induite par le facteur de croissance NGF sur la lignée cellulaire PC 12 transfectée.

La première identification d'un inhibiteur de l'activité d'une protéine de la famille Dbl n'est pourtant que très récente (Schmidt et al., 2002, FEBS Lett. 523:35-42). Il s'agit d'un peptide de 42 acides aminés (peptide TRIP), isolé en crible d'interaction de type "double hybride" contre la protéine TRIO, et validé biochimiquement pour sa capacité à inhiber l'activité enzymatique d'échange de TRIO sur sa GTPase cible.

Cette méthodologie conduit néanmoins à de nombreux faux positifs issus de crible primaire, et l'identification d'un peptide à activité effectivement inhibitrice se révèle difficile.

La contrainte principale pour l'isolement d'inhibiteurs d'une fonction enzymatique réside en effet dans la mise au point d'une méthode de détection rapide et fiable de cette activité. Outre le problème de reproductibilité de la qualité de lots de protéines purifiées et de la conservation de leur activité enzymatique, ce type de mesures est difficile à automatiser.

Un deuxième type de méthodologie a par ailleurs été décrit: cf De Toledo et al., 2000, FEBS Lett. 480:287-292 ( The yeast exchange assay, a new complementary method to screen for Dbl-like protein specificity: identification of a novel RhoA exchange factor ).

Dans cet article, la méthodologie est décrite comme permettant l'identification de protéines activatrices de GTPase (recherche de GEF), et non comme permettant d'identifier par criblage des composés inhibiteurs des protéines activatrices.

La méthodologie est dérivée du système de levure "double hybride", dans lesquels les partenaires sont une GTPase Rho et un fragment effecteur. Ce test utilise une version sauvage de GTPase (non constitutionnellement activée) : en absence d'activation, la GTPase est majoritairement liée au GDP et n'interagit pas avec son effecteur. Aucune activité des gènes rapporteurs du "double hybride" n'est alors détectée. L'expression d'une protéine de la famille Dbl spécifique de la GTPase utilisée dans le test entraîne l'activation de celle-ci, et provoque l'interaction GTPase effecteur. Une activité des gènes rapporteurs est alors détectée.

Telle quelle, cette méthodologie est efficace pour déterminer de façon qualitative l'activité d'un facteur d'échange sur une GTPase. Ce système n'est cependant pas assez stable pour pouvoir être transposé à la recherche fiable d'inhibiteurs. Notamment, le taux des protéines exprimées à partir des plasmides n'est pas stable, et les activités mesurées fluctuent au cours du temps.

D'un point de vue industriel, l'utilisation d'une technique de criblage sur levure modifiée "double hybride" pose en outre des problèmes d'automatisation du procédé.

En effet, cette technique de "double hybride" met en oeuvre des gènes rapporteurs et des marqueurs de sélection dont les produits de transcription, qui sont synthétisés dans le milieu intracellulaire, doivent pouvoir avoir accès à leurs substrats respectifs. On utilise par exemple communément le gène LACZ (béta-galactosidase) comme gène rapporteur de l'activité double hybride testée: la béta-galactosidase produite par la levure doit alors pouvoir accéder à un substrat de type XGal.

Pour ce faire, il est actuellement procédé par cassure des levures utilisées, par exemple par choc thermique ou mécanique. La technique de double hybride sur levure modifiée actuellement disponible dans l'état de l'art ne permet donc une automatisation aisée. Son utilisation en application industrielle en est d'autant limitée.

Il n'existe donc actuellement aucun procédé industriel permettant d'identifier de manière fiable des composés qui soient capables de réguler, et plus particulièrement d'inhiber, les protéines activatrices des GTPases, et notamment les protéines activatrices de la famille Dbl.

RÉSUMÉ DE L'INVENTION La présente demande de brevet est relative à des moyens pour l'analyse de la régulation des voies d'activation des GTPases, qui sont spécialement adaptés à l'identification par criblage d'un composé capable d'exercer une activité inhibitrice sur une voie d'activation de GTPase (cf principe illustré en Figure 1).

Ces moyens comprennent une levure à forte perméabilité membranaire (erg6) et au moins un système pour l'expression d'au moins une protéine hybride de type double hybride par cette levure, ou bien une levure et au moins un système pour l'expression d'au moins une protéine hybride de type double hybride intégré dans le génome de la levure, ou destiné à l'être.

Ils permettent de s'affranchir de l'étape de lyse des levures à laquelle il faut procéder dans un test double hybride standard de l'art antérieur, pour donner aux produits des gènes rapporteurs du test accès à leurs substrats réactionnels (cf Figure 5). Les réactifs et composés tests mis en oeuvre peuvent être utilisés à des concentrations plus faibles, et donc moins toxiques et plus proches des conditions in vivo visées en application (thérapeutique), qu'ils ne le seraient en utilisant un test de double hybride classique.

Ils permettent de s'affranchir des pressions de sélection qui sont classiquement appliquées en test double hydride standard pour maintenir l'expression des partenaires doubles hybrides dans la cellule de levure (cf Figure 3). Les résultats obtenus avec les moyens selon l'invention sont ainsi plus fiables, et plus sensibles (cf Figure 4).

Enfin, les moyens sont entièrement automatisables, et permettent l'identification et la production de composés susceptibles de permettre de lutter contre une cellule tumorale, et/ou contre l'hypertension, et/ou contre une infection, contre le développement d'une maladie génétique.

DESCRIPTION DE L'INVENTION

La présente invention est relative à la régulation des voies d'activation des GTPases. Elle propose des moyens qui permettent d'identifier par criblage des composés qui présentent une activité régulatrice (stimulante ou inhibitrice) sur les protéines activatrices des petites GTPases.

Les moyens selon l'invention permettent ainsi d'identifier des composés qui, du fait de leur activité régulatrice, sont d'excellents candidats thérapeutiques pour lutter contre les pathologies dans lesquelles l'activation des petites GTPases doit être régulée. Il peut s'agir d'une activité stimulatrice ou bien d'une activité inhibitrice.

Les composés à activité stimulatrice sont d'excellents candidats pour la prévention, la palliation, ou le traitement de pathologies pour lesquelles on souhaite stimuler l'activation des petites GTPases.

Les composés à activité inhibitrice sont d'excellents candidats pour la prévention, la palliation, ou le traitement de pathologies pour lesquelles on souhaite inhiber l'activation des petites GTPases. C'est notamment le cas de l'hypertension, des maladies génétiques, des invasions par des pathogènes, et aussi de nombreux cancers, tels que les leucémies, le cancer de la prostate, le cancer du sein, les cancers généralisés par métastase ou en voie de l'être.

La présente invention vise plus particulièrement des moyens de criblage qui permettent d'identifier des composés inhibiteurs des protéines activatrices des petites GTPases.

Les moyens selon l'invention comprennent des kits et méthodes pour l'analyse de la régulation des voies d'activation des GTPases (cf Figure 1).

Ces kits et méthodes peuvent notamment être appliqués à l'identification de composés qui ont la capacité d'exercer une activité régulatrice sur ces voies d'activation. De ce fait, ils trouvent directement application en tant que outils de recherche et développement. De par les composés régulateurs qu'ils permettent d'identifier, ils peuvent en outre donner accès à des applications médicales d'intérêt, et notamment pour la lutte contre les pathologies sus mentionnées.

La présente invention propose, selon un premier aspect, de combiner en synergie les fonctions de perméabilité d'une levure, aux fonctions d'analyse réactionnelle de réactifs de type double hybride.

Les inventeurs démontrent en effet que cette combinaison est possible, à savoir que d'une part, les réactifs de type double hybride peuvent, sans perte ni biais, continuer à exercer les fonctions dans une cellule de levure à perméabilité accrue, et d'autre part la cellule de levure à perméabilité accrue reste tout à fait viable alors qu'on lui donne à exprimer une protéine hybride de type réactif double hybride.

Qui plus est, le choix opéré par les inventeurs d'une telle combinaison de fonctions apporte une solution avantageuse au problème de l'automatisation du criblage sur levure modifiée en double hybride.

En effet, comme indiqué ci-dessus, la technique de "double hybride" de l'art antérieur nécessite de lyser les levures utilisées dans le test, par exemple par choc thermique ou mécanique, de sorte à donner aux produits des gènes rapporteurs du test accès à leurs substrats réactionnels (par exemple, accès au X-Gal pour la béta-galactosidase). La technique de double hybride sur levure modifiée actuellement disponible dans l'état de l'art ne permet donc une automatisation aisée, et ses applications industrielles en sont d'autant limitées.

La combinaison de fonctions "perméabilité + double hybride" pour laquelle les inventeurs ont opté permet quant à elle d'automatiser complètement le procédé : il n'est plus nécessaire de lyser les levures utilisées pour lire les résultats du test (cf Figure 5). De ce fait, les moyens selon l'invention trouvent des applications industrielles auxquelles la technique de double hybride de l'art antérieur n'avait pas accès. En outre, comme, conformément à la présente invention, les substrats réactionnels pénètrent facilement dans la cellule de levure, on peut les utiliser en concentrations beaucoup plus faibles qu'ils ne le seraient en procédant par lyse cellulaire. Par ricochet, ceci permet d'utiliser des quantités également plus faibles de candidats régulateurs, et notamment des quantités plus faibles de candidats inhibiteurs. En résultante, outre le fait de s'affranchir de l'étape de lyse qui fait obstacle à l'automatisation et donc à l'application industrielle du procédé, la présente invention place la cellule de levure dans des conditions beaucoup moins toxiques qu'elle ne l'aurait été en suivant les techniques de l'art antérieur. Le système est ainsi plus facilement gérable, et, de manière particulièrement remarquable, l'interprétation des résultats atteint une sensibilité bien meilleure par rapport aux techniques de l'art antérieur.

Selon cet aspect, le kit selon l'invention (kit premier aspect ) comprend ainsi au moins une levure à forte perméabilité mais néanmoins cellulairement viable, et au moins un système pour l'expression d'une protéine hybride par cette levure.

Ce kit peut se présenter sous la forme d'un kit incorporé dans lequel ledit au moins un système d'expression est présent dans le milieu intracellulaire de la levure (sous forme simplement exprimée dans le cytoplasme, ou bien sous forme intégrée au génome de la levure).

Alternativement, le kit selon l'invention peut se présenter sous la forme d'un kit-of-parts (forme juxtaposée formant une unité fonctionnelle), dans lequel ledit au moins un système d'expression de protéine hybride est présent extracellulairement, hors de la levure. Il peut alors être accompagné de moyens adaptés à sa conservation. De préférence, ledit au moins un système d'expression est alors accompagné de moyens adaptés à son transfert dans la cellule de levure. Il peut par exemple être porté par un vecteur d'expression ou d'intégration adapté à la transfection de la levure du kit, et à l'expression dans cette levure dudit au moins système d'expression. Ce vecteur juxtaposé peut alors se trouver lui-même inclus dans un environnement favorisant ou facilitant sa multiplication avant transfection dans la levure. Ledit vecteur juxtaposé peut par exemple se trouver inclus dans un microorganisme procaryote adapté à sa réplication.

Dans la présente demande, on donne à chaque terme la signification et la portée que lui donne la personne du métier. En particulier, le terme vecteur d'expression implique classiquement, dans la mesure où, comme dans la présente demande, il est destiné à transformer une cellule de levure et à y exprimer le système d'expression qu'il porte, que ce vecteur comprend généralement au moins une origine de réplication adapté à la réplication autonome de ce vecteur dans la levure, un marqueur de sélection pour détecter la transformation du vecteur d'expression dans la levure, et le système d'expression dont il est le vecteur. Un tel vecteur d'expression comprend en outre généralement des moyens pour sa réplication dans une cellule hôte autre que la levure, telle que par exemple une cellule procaryote de type Escherichia coli: on trouve donc communément dans un vecteur d'expression non-intégratif une origine de réplication procaryote, et un marqueur de sélection, tel qu'un fragment de résistance à un antibiotique (par exemple ampicilline).

Le terme de vecteur d'intégration implique quant à lui que ce vecteur comprend des moyens permettant l'intégration de la séquence codante qu'il porte de manière opérationnelle dans le génome de la levure du kit. Comme il est destiné à une intégration génomique, un tel vecteur n'a pas besoin de présenter une origine de réplication de levure, mais il portera généralement une séquence qui permet l'intégration dans le génome de la levure, telle que par exemple une séquence présentant une homologie avec un locus chromosomique de la cellule hôte suffisante pour permettre une recombinaison.

Le système d'expression porté par ce type de vecteur est, dans le cadre de la présente invention, destiné à exprimer une protéine dans la levure du kit. Il comprend donc généralement un promoteur de levure, un site de démarrage de la traduction, un séquence codante et un signal de terminaison de transcription.

Des exemples de vecteurs comprennent notamment les plasmides.

Optionnellement, le kit selon l'invention peut également comprendre un support solide et/ou un milieu liquide et/ou un milieu gélifié, de manière à faciliter la manipulation et/ou le stockage de la levure.

Dans le kit selon l'invention, on choisit une levure qui a une forte 25 perméabilité membranaire, mais qui a conservé une intégrité membranaire suffisante pour être cellulairement viable.

Les levures communément disponibles, et dont la manipulation n'impose aucune contrainte particulière, telles que S. cerevisiae ou C. albicans, n'ont en général pas à leur état natif une forte perméabilité membranaire.

Il s'agira donc généralement d'une levure qui a été modifiée de sorte à augmenter sa perméabilité plasmique initiale, tout en veillant à conserver une intégrité cellulaire suffisante pour que la cellule de levure reste viable en culture in vitro.

Conformément à la présente invention, un moyen proposé pour aboutir à ce résultat est d'altérer la biosynthèse d'un composé de la membrane plasmique dont la présence n'est pas indispensable à la viabilité de la cellule de levure.

Comme il s'agit d'augmenter la perméabilité membranaire, sans pour autant détruire l'intégrité cellulaire, il convient de n'altérer la biosynthèse que de certains de ces composés, et non de tous. La personne du métier peut procéder par essai et erreur en fonction de la cellule de levure choisie, jusqu'à identifier un composé dont la biosynthèse peut être altérée sans que ne soit pour autant perdue la viabilité cellulaire nécessaire.

Parmi les composés envisageables, les stérols en général, et les ergostérols en particuliers, tels que Erg6, Erg2, Erg3, Erg4, sont des candidats de choix. De manière avantageuse, on pourra choisir de n'altérer que la biosynthèse de la protéine Erg6, étant donné que l'altération de la biosynthèse de cette seule protéine suffit à augmenter très significativement la perméabilité de la membrane plasmique, et que la viabilité cellulaire de la levure ainsi modifiée ne s'en trouve quant à elle pas significativement perturbée.

Pour altérer la biosynthèse d'un composé donné, la personne, du métier peut procéder selon toute technique adaptée à cet effet. Il peut par exemple être procédé en mutant le gène qui, dans la levure, code le composé concerné, de sorte que ce gène conduise à la synthèse d'une forme non fonctionnelle du composé. Alternativement, il peut être procédé en introduisant dans la levure un composé qui transforme le composé concerné d'une forme fonctionnelle sous une forme non fonctionnelle. Dans le cadre de la présente invention, une technique simple et efficace comprend la suppression, ou à tout le moins l'inhibition substantielle, de la transcription et/ou traduction du gène codant le composé concerné. Avantageusement, on procèdera par délétion du gène concerné.

Un mode préféré de réalisation de la présente invention comprend donc une levure, telle que S. cerevisiae ou C. albicans, qui ne dispose pas de copie fonctionnelle du gène ERG6, du fait par exemple d'une délétion de ce gène. On peut choisir une souche de levure haploïde, ou bien une souche de levure diploïde. Si l'on choisit une souche diploïde, il est préférable que les deux copies du gène ERG6 soient non fonctionnelles.

Le kit selon l'invention comprend également, en outre de la levure, au moins un système pour l'expression d'une protéine hybride par cette levure. Comme indiqué ci-dessus, ce système d'expression peut se trouver dans le milieu intracellulaire de la levure (kit incorporé ), ou bien être placé en juxtaposition hors de la levure ( kit-of-parts ).

La protéine hybride exprimée par ce système comprend deux composants (en fusion directe ou indirecte), à savoir un composant "réactif de la voie des GTPases", et un composant "réactif de double hybride".

Le composant "réactif de la voie des GTPases" est sélectionné parmi le groupe constitué par les GTPases, les effecteurs de GTPase, et les fragments de ces produits qui ont conservé une fonction de GTPase ou d'effecteur de GTPase.

Le composant "réactif de double hybride" est sélectionné parmi le groupe constitué par les domaines de liaison à l'ADN et les domaines d'activation des activateurs de transcription opérationnels dans ladite levure.

La présente demande vise donc plus particulièrement un kit pour l'analyse de la régulation des voies d'activation des GTPases, caractérisé en ce qu'il comprend: - au moins une levure, et - au moins un système pour l'expression d'au moins une protéine hybride par cette levure, - et, éventuellement, un support solide et/ou un milieu liquide et/ou un milieu gélifié, ladite levure présentant une expression altérée de la protéine Erg6, de sorte que la membrane plasmique de cette levure soit essentiellement dépourvue de protéine Erg6, et ladite protéine hybride comprenant deux composants (en fusion directe ou indirecte), à savoir un composant "réactif de la voie des GTPases", et un composant "réactif de double hybride", i. le composant "réactif de la voie des GTPases" étant sélectionné parmi le groupe constitué par les GTPases, les effecteurs de GTPase, et les fragments de ces produits qui ont conservé une fonction de GTPase ou d'effecteur de GTPase, et ii. le composant "réactif de double hybride" étant sélectionné parmi le groupe constitué par les domaines de liaison à l'ADN et les domaines d'activation des activateurs de transcription opérationnels dans ladite levure.

Ledit au moins un système d'expression d'au moins une protéine hybride peut être présent dans le kit à l'extérieur de la levure, sous forme juxtaposée formant une unité fonctionnelle. Il peut par exemple être inséré dans un vecteur d'expression adapté à l'expression intracellulaire de la protéine hybride dans ladite levure.

Très préférentiellement, ledit au moins un système d'expression d'au moins une protéine hybride sera en fait intégré dans le génome de la levure, ou destiné à l'être. Ce mode de réalisation assure un niveau quantitatif de précision au procédé : l'utilisateur sait que la levure ne contient alors qu'une copie du système d'expression par cellule (cf Figure 4, graphe de droite), qu'il n'est pas nécessaire d'imposer une pression de sélection pour assurer le maintien de ce système dans la levure (cf Figure 3), et les activités mesurées seront stables et reproductibles.

La présente demande vise donc un kit dans lequel ledit au moins un système d'expression d'au moins une protéine hybride est intégré dans le génome de ladite levure, ou est inséré dans un vecteur d'intégration adapté à l'intégration de ce système d'expression dans le génome de ladite levure. Des exemples de vecteurs d'intégration adaptés comprennent les vecteurs qui portent au moins une séquence permettant l'intégration dans le génome (par exemple, par recombinaison homologue).

Selon un deuxième aspect de l'invention, la présente demande de brevet vise également un kit (kit deuxième aspect ) pour l'analyse de la régulation des voies d'activation des GTPases, dans lequel une levure de type double hybride ou destinée à être utilisée en double hybride est présente, et dans laquelle le ou les systèmes d'expression de la ou des protéine(s) hybride(s) du test double hybride sont intégré(s) dans le génome de cette levure, ou à tout le moins destiné(s) à l'être. La présente invention propose donc également un kit, caractérisé en ce qu'il comprend: - au moins une levure, et - au moins un système pour l'expression d'au moins une protéine hybride dans cette levure, - et, éventuellement, un support solide et/ou un milieu liquide et/ou un milieu gélifié, ladite protéine hybride comprenant deux composants (en fusion directe ou indirecte), à savoir un composant "réactif de la voie des GTPases", et un composant "réactif de double hybride", i. le composant "réactif de la voie des GTPases" étant sélectionné parmi le groupeconstitué par les GTPases, les effecteurs de GTPase, et les fragments de ces produits qui ont conservé une fonction de GTPase ou d'effecteur de GTPase, et ii. le composant "réactif de double hybride" étant sélectionné parmi le groupe constitué par les domaines de liaison à l'ADN et les domaines d'activation des activateurs de transcription opérationnels dans ladite levure, et ledit au moins un système d'expression étant soit intégré dans le génome de ladite cellule eucaryote, soit porté par un vecteur d'intégration génomique adapté à l'intégration de ce système dans le génome de ladite cellule eucaryote.

Préférentiellement, comme ci-dessus indiqué, la levure de ce kit présente une forte perméabilité membranaire, tout en ayant conservé une intégrité cellulaire suffisante pour avoir la capacité à rester viable en culture in vitro. Très préférentiellement, la levure de ce kit présente une expression altérée de la protéine Erg6, de sorte que la membrane plasmique de cette levure soit essentiellement dépourvue de protéine Erg6.

Un kit selon l'invention comprendra généralement, ou sera destiné à comprendre, au moins un système pour l'expression d'au moins deux protéines hybrides différentes: - l'une comportant une GTPase, à titre de composant "réactif de la 10 voie des GTPases", et - l'autre comportant un effecteur de cette GTPase, à titre de composant "réactif de la voie des GTPases", le composant "réactif de double hybride" de chacune des deux protéines hybrides étant pour l'une le domaine de liaison à l'ADN, et pour l'autre le domaine d'activation, ou inversement, d'un même activateur de

transcription eucaryote.

Généralement, il y aura deux systèmes d'expression distincts, un pour chacune des deux protéines hybrides.

N'importe quelle GTPase ou molécule ayant une fonction de GTPase peut être choisie pour le kit selon l'invention. En perspective des applications médicales visées, on choisit de préférence une GTPase de mammifère, plus préférentiellement un GTPase que l'on trouve exprimée chez l'être humain. Il peut par exemple s'agir d'une petite GTPase de la superfamille Ras, telle que Ras, Rho, Rab, Arf ou Ran (cf Ridley 1999, Prog. Mol. Subcell. Biol. 22, 1-22; Fort 1999, Prog. Mol. Subcell. Biol. 22, 159-181). On connaît au moins 18 protéines de la famille Rho mammifère: Rho (A, B et C), Rac (1, 2 et 3), Cdc42, RhoD, RhoG, RhoH/TTF, TC10, et Rnd (1, 2 et 3), TCL, Wrch, Chp, Rif.

Il existe également des mutants dominants actifs de GTPase (DAGTPase), qui sont constitutionnellement activés, et qui n'ont pas pas besoin de la présence d'un facteur d'échange GEF pour se lier à leur effecteur. Dans le cadre de la présente invention, en perspective des applications médicales visées, on préférera néanmoins une GTPase non constitutionnellement activée, telle qu'une GTPase de type sauvage, de manière à être plus proche des cycles suivis in vivo pour l'activation des GTPases. Le kit selon l'invention permet en effet, comme cela sera décrit ci-après, d'introduire la présence efficace d'un GEF.

Les effecteurs de GTPase sont eux aussi bien connus de la personne du métier. On peut par exemple citer ROCK (aussi connu sous le nom de ROCKalpha et ROCKbeta) qui est un effecteur de RhoA; N-WASP et PAK qui sont des effecteurs de Rac et Cdc42; PAK1 qui est un effecteur de Cdc42Hs; la kinectine, qui est un effecteur de Racl et RhoG (cf Vignal et al. 2001, "Kinectin is a key effector of RhoG microtubule dependent cellular activity", Mol. Cell. Biol. 21, 8022 8034; Daniels et al. 1998, "Membrane targeting of p21-activated kinase 1 (PAK1) induces neurite outgrowth from PC12 tells", EMBO J. 17, 754 764; Obermeier et al. 1998, "PAK promotes morphological changes by acting upstream of Rac", EMBO J 17, 4327-4339).

Tout activateur de transcription eucaryote est a priori adapté à la mise en oeuvre d'un kit selon l'invention. On pourra notamment choisir n'importe quel activateur de transcription eucaryote classiquement utilisé en test double hybride, puis fusionner son domaine d'activation sur l'une des deux protéines hybrides et son domaine de liaison à l'ADN sur l'autre des deux protéines hybrides. Par exemple, on peut utiliser les domaines de l'activateur de transcription eucaryote GAL4, à savoir le domaine d'activation GAD, et le domaine de liaison à l'ADN LexA.

Préférentiellement et avantageusement, ledit au moins un système ou, le cas échéant chacun desdits systèmes, pour l'expression de chacune desdites au moins deux protéines hybrides est intégré dans le génome de ladite cellule eucaryote, ou est destiné à l'être.

Pour faciliter la détermination de l'état d'activation ou de nonactivation de la GTPase portée par l'une des deux protéines hybrides, ladite levure peut en outre comprendre au moins un gène rapporteur dont la transcription peut être activée par un complexe formé, directement ou indirectement, par le domaine de liaison à l'ADN et, respectivement, le domaine d'activation des desdites au moins deux protéines hybrides.

La levure présente dans un kit selon l'invention comprendra donc alors, préférentiellement sous forme intégré dans son génome, un gène rapporteur tel que par exemple lacZ (béta-galactosidase) dont la transcription est activée par l'activateur de transcription eucaryote GAL4.

Afin d'éliminer les éventuels faux positifs avec certitude, on préfèrera introduire en outre un deuxième gène rapporteur ou un marqueur de sélection, par exemple en créant une auxotrophie de la levure pour un élément donné (par exemple, auxotrophie pour l'histidine) et en apportant conjointement ou parallèlement à l'un des systèmes d'expression de protéines hybrides, le gène qui code l'élément pour laquelle la levure est auxotrophe, de sorte que sur un milieu de culture dépourvu de cet élément, seules les levures effectivement transformées pourront survivre.

Un kit selon l'invention pourra en outre comprendre une protéine GEF activatrice (ou facteur d'échange) de ladite GTPase, ou un fragment d'une telle protéine GEF qui a conservé une fonction activatrice vis-à-vis de ladite GTPase, ou un système pour l'expression de cette protéine GEF ou fragment dans ladite levure. Cette protéine GEF ou fragment peut optionnellement être sous la forme d'une protéine étiquetée ("tagged"), par exemple une étiquette myc ou HA. Le système d'expression de cette protéine GEF ou fragment de GEF peut être présent dans le milieu intracellulaire de la levure, ou être présent hors de la cellule de levure; il peut être porté par un vecteur d'expression adapté à l'expression de ce système GEF ou fragment de GEF dans ladite levure, ou bien être porté par un vecteur d'intégration adapté à l'intégration de ce système dans le génome de ladite levure. Préférentiellement, le système d'expression GEF ou fragment de GEF est intégré dans le génome de ladite levure, ou est destiné à l'être.

Un mode préféré de réalisation de la présente invention correspond au mode où les trois systèmes d'expression "réactif de la voie des GTPases" + "réactif de double hybride" + "GEF ou fragment de GEF" sont intégrés au génome de ladite levure, ou sont destinés à l'être.

Alternativement, un kit selon l'invention peut laisser à son utilisateur le choix de la protéine GEF ou fragment qu'il souhaite faire participer au test. Dans ce cas, un kit selon l'invention pourra comprendre un vecteur d'expression vide, c'est-à-dire ne portant pas de cassette d'expression GEF ou fragment de GEF, mais qui est adapté à recevoir une telle cassette d'expression et à l'exprimer dans ladite levure. Avantageusement, on choisira un vecteur qui sera un vecteur d'intégration dans le génome de ladite levure, de sorte que la cassette d'expression GEF ou fragment de GEF que l'utilisateur lui insèrera puisse être intégrée dans le génome de ladite levure. Un tel vecteur d'intégration vide comprend donc par exemple un site de clonage au niveau duquel peut être insérée une cassette d'expression protéique, tel qu'un site de clonage multiple, et au moins une séquence qui permet l'intégration dans le génome (par recombinaison homologue par

exemple).

Ce mode de réalisation alternatif est un autre mode de réalisation préféré de l'invention.

Les facteurs d'échange de GTPase (ou protéine activatrice, ou GEF) sont eux connus de la personne du métier. On peut par exemple citer les protéines de la famille Dbl, telles que LARG, TIAM, VAV, qui activent les GTPases de la famille Rho. Tiam-1 est ainsi connu pour être un GEF de Rac 1, et OPIX pour être un effecteur de Cdc42Hs (cf Michiels et al. 1997, Cell Biol. 137 387-398; Manser et al. 1998, Mol. Cell 1:183-192).

Le peptide TRIO est également un Rho-GEF, il contient deux domaines RhoGEF de spécificités différentes: le premier domaine, Trio-GEFD1, active la voie Rac via RhoG, et le second domaine, Trio-GEFD2, agit spécifiquement sur RhoA (cf. Debant et al. 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:5466-5471; Blangy et al. 2000, J. Cell Sci. 113:729-739).

On peut donc choisir de mettre en oeuvre un fragment de GEF qui a conservé une fonction de GEF, tel que par exemple Trio-GEFD1, ou Trio- GEFD2 (cf Schmidt et al. 2002, FEBS Lett. 523:35-42; De Toledo et al. 2000, FEBS Lett. 480:287-292).

Un kit d'analyse selon l'invention est spécialement adapté à l'identification par criblage d'un composé qui présente une activité régulatrice sur les voies d'activation GTPase présentes dans ladite levure.

Un tel composé peut être un composé peptidique ou protéique, tel que le peptide inhibiteur TRIPalpha décrit dans Schmidt et al. 2002, FEBS Lett. 523:35-42; séquence de TRIPalpha = ASEGADGAICGYNLATLVMLGPSERVFCPLCEPCSSDIYELM). Dans ce cas, un kit selon l'invention peut en outre comprendre au moins un vecteur d'expression eucaryote, adapté à recevoir un système d'expression d'un composé peptidique ou polypeptidique dont on voudrait tester l'influence sur l'activation des GTPases, et adapté à exprimer ce système d'expression dans ladite levure. L'intégration dans le génome du système d'expression de ce composé peptidique ou protéique n'est ici pas particulièrement nécessaire ou recherchée: une expression cytoplasmique suffit, et peut même être préférable si l'on souhaite tester non pas un composé peptidique ou protéique, mais une pluralité de tels composés.

Un kit selon l'invention peut en effet en outre comprendre une banque de vecteurs d'expression eucaryote, chacun adapté à l'expression, dans ladite levure, d'un composé peptidique ou polypeptidique candidat, dont on voudrait tester l'influence sur l'activation des GTPases.

Un composé qui présente une activité régulatrice sur les voies d'activation GTPase présentes dans ladite levure peut par ailleurs être un composé non purement peptide et non purement protéique: il peut par exemple s'agir d'un composé issu d'une chimiothèque, tel que la Bréfeldine A (1,6,7,8,9,11 a,12,13,14,14a-Décahydro-1,13-dihydroxy-6méthyl-41I-cyclopent[f]oxacyclotridécin-4-one; CAS Number CAS[20350-16-6] ; Merck Index 1996, 12:,1393; commercialisée par exemple par A.G. Scientific, Inc.). Un kit selon l'invention peut donc en outre comprendre une chimiothèque de composés candidats, dont on voudrait tester l'influence sur l'activation des GTPases.

Au vu de la description faite ci-dessus, il sera compris que la présente demande vise également tout kit spécialement adapté à l'expression d'au moins une protéine hybride, telle que précédemment définie, dans la levure d'un kit d'analyse selon l'invention.

Un tel kit comprend au moins un vecteur d'intégration: - qui comporte en insert un système d'expression de ladite au moins une protéine hybride, laquelle protéine hybride comprend deux composants: i. l'un étant sélectionné parmi le groupe des "réactifs de la voie des GTPases" constitué par les GTPases, les effecteurs de GTPase, et les fragments de ces produits qui ont conservé une fonction de GTPase ou d'effecteur de GTPase, et ii. l'autre parmi le groupe des "réactifs de double hybride" constitué par les domaines de liaison à l'ADN des activateurs de transcription eucaryote, et les domaines d'activation des activateurs de transcription eucaryote, et - qui comporte une région présentant une homologie avec un locus chromosomique de ladite cellule eucaryote suffisante pour permettre une recombinaison dudit système d'expression dans le génome de cette cellule eucaryote.

La présente demande comprend bien entendu dans sa portée toute utilisation d'un kit selon l'invention (qu'il s'agisse d'un kit ci-dessus décrit en premier aspect , ou d'un kit décrit ci-dessus en deuxième aspect ), pour l'identification d'un composé capable d'exercer une activité régulatrice, et plus particulièrement inhibitrice, sur une voie d'activation de GTPase, et/ou pour l'identification d'un composé permettant de lutter contre une cellule tumorale, contre l'hypertension, contre une infection, contre le développement d'une maladie génétique.

Ledit kit peut donc également comprendre des instructions pour une telle utilisation.

La présente demande vise ainsi tout procédé pour l'identification d'un composé capable d'exercer une activité régulatrice, et plus particulièrement inhibitrice, sur une voie d'activation GTPase, qui met en oeuvre un kit selon l'invention (qu'il s'agisse d'un kit ci-dessus décrit en premier aspect , ou d'un kit décrit ci-dessus en deuxième aspect ).

Plus particulièrement, la présente demande vise un procédé automatisable pour l'identification d'un composé capable d'exercer une activité régulatrice, et plus particulièrement inhibitrice, sur une voie d'activation GTPase, caractérisé en ce que: - on fournit une levure issue d'un kit selon l'invention (kit ci-dessus décrit en premier aspect ), laquelle levure présentant une expression altérée de la protéine Erg6, de sorte que la membrane plasmique de cette levure soit essentiellement dépourvue de protéine Erg6, et laquelle levure comprenant au moins deux protéines hybrides, telles que précédemment définies, - si nécessaire, on active la GTPase qui est portée par l'une des deux protéines hybrides mentionnées à l'étape précédente, de sorte que cette GTPase soit capable de se lier à son effecteur qui est porté par l'autre des deux protéines hybrides mentionnées à l'étape précédente, - on confronte le composé régulateur (le cas échéant, inhibiteur) candidat au 25 milieu intracellulaire de cette levure, - on détermine si ce composé candidat induit une régulation, et plus particulièrement une inhibition, de l'activation GTPasique, et le cas échéant, on identifie ce composé candidat comme étant un composé capable d'exercer une activité régulatrice (et plus particulièrement inhibitrice) sur une voie d'activation GTPase.

Ce procédé conforme à la présente invention présente l'avantage notable de d'être facilement entièrement automatisable, et est donc directement à l'échelle industrielle.

La présente demande vise également un procédé automatisable pour l'identification d'un composé capable d'exercer une activité régulatrice, et plus particulièrement inhibitrice, sur une voie d'activation GTPase, caractérisé en ce que: - on fournit une levure qui comprend, intégrés dans son génome, au moins deux protéines hybrides, telles que ci-dessus définies, - si nécessaire, on active la GTPase qui est portée par l'une des deux protéines hybrides mentionnées à l'étape précédente, de sorte que cette GTPase soit capable de se lier à son effecteur qui est porté par l'autre des deux protéines hybrides mentionnées à l'étape précédente, - on confronte le composé régulateur (le cas échéant, inhibiteur) candidat au milieu intracellulaire de cette levure, - on détermine si ce composé candidat induit une régulation, et plus particulièrement une inhibition, de l'activation GTPasique, et le cas échéant, on identifie ce composé candidat comme étant un composé capable d'exercer une activité régulatrice (et plus particulièrement inhibitrice) sur une voie d'activation GTPase.

Un moyen simple et efficace de déterminer si cette régulation, et plus particulièrement cette inhibition, de l'activation GTPasique, a lieu est d'utiliser une levure qui est comme définie dans la présente demande, et qui comporte en outre au moins un gène rapporteur dont la transcription est activée par le rapprochement du domaine d'activation et du domaine de liaison à l'ADN portés par chacune desdites deux protéines hydrides.

Ces procédés permettent d'identifier, notamment par criblage de composés peptidiques ou protéiques,et/ ou de composés issus de chimiothèques, des composés qui présentent une activité inhibitrice telle qu'ils peuvent être utilisés pour la fabrication de médicaments destinés à lutter contre des cancers (leucémie, cancer de la prostate, cancer du sein, cancer généralisé par métastase ou en voie de l'être), et/ou contre l'hypertension, et/ou contre une infection, et/ou contre le développement d'une maladie génétique.

La présente demande vise aussi un procédé pour la fabrication d'un composé susceptible de permettre de lutter contre une cellule tumorale, et/ou contre l'hypertension, et/ou contre une infection, contre le développement d'une maladie génétique, caractérisé en ce que: - l'on identifie un composé capable d'exercer une activité inhibitrice sur une voie d'activation GTPase, à l'aide d'un procédé selon l'invention, - l'on synthétise et/ou isole ce composé, et optionnellement on le place en présence de véhicules pharmaceutiquement acceptables.

Les exemples qui suivent sont donnés à titre illustratif: ils ne sont en aucun cas limitatifs. La personne du métier pourra en effet, à partir de ces illustrations, mettre en oeuvre des variantes rendues directement accessibles par cette divulgation.

Dans ces exemples, il fait référence aux figures suivantes: - Figure 1: illustration du principe de l'inhibition de la réaction d'échange reconstituée dans la levure, - Figure 2: illustration du principe de construction d'un vecteur pour l'expression de peptides inhibiteurs, Figure 3: illustration de la stabilité comparée en l'absence de pression de sélection de la cassette d'expression de RhoA portée par un 25 plasmide ou intégrée dans le génome de la levure, - Figure 4: illustration de l'activation de la GTPase RhoG par le facteur d'échange Trio-GEF1 dans une souche de levure où les trois partenaires sont portés par des plasmides ou intégrés dans le génome, - Figure 5: visualisation directe de l'activation de la GTPase par hydrolyse du X-Gal après pénétration dans les levures délétées du gène ERG6 (sans lyse), - Figure 6: séquence du plasmide pRS422-MT3 (SEQ ID NO:1; Genbank U93719).

EXEMPLES

MATERIEL ET METHODES: Vecteurs d'expression et souche de levure: Comme souche de levure, on peut par exemple utiliser: une souche de Saccharomyces cerevisiae de génotype MATa, his3 leu2 trpl ade2 LYS2::lex(op)-HIS3 ura3::lex(op)-LacZ) telle que TAT7, ou une souche de Saccharomyces cerevisiae de génotype MATa his3D200 trpl-90I leu2-3112 ade2 LYS2:: (4lexAop-HIS3) URA3:: (8lexAop-lacZ GAL4, telle que la souche L40 commercialisée par la société Invitrogen sous la référence C830-00 (http://www.invitrogen.com), ou une souche de Saccharomyces cerevisiae de génotype MATa his3delta200 trpl-901 leu2-3,112 ade2 LYS2::(lexAop)4-HIS3 URA3:: (lexAop)8-lacZ GAL4, telle que la souche DSY1 commercialisée par Dual system Biotech (http://www.dsbiotech.ch) sous la référence 5101001-1, ou - une souche de Saccharomyces cerevisiae de génotype MATalphahis3delta200 trpl-901 leu2-3,112 ade2 LYS2::(lexAop)4-HIS3 URA3:: (lexAop)8-lacZ GAL4, telle que la souche DSY-2 commercialisée par Dual system Biotech (http://www.dsbiotech.ch) sous la référence 5101002-1.

Les techniques de transformation et de sélection ont été décrites précédemment (De Toledo et al. 2000, FEBS Lett. 480:287-292). Les vecteurs d'expression pour les GTPases (pLexRhoA, pLexRhoC et pLexRhoG), les effecteurs (kinectine et ROCK) et les facteurs d'échange (TRIO GEF1 et GEF2) ont été décrits précédemment (De Toledo et al. 2000, FEBS Lett. 480:287-292; De Toledo et al. 2001, Oncogene 20:7307-7317).

Le vecteur pRS422MT3 a été obtenu en insérant le promoteur MET25 suivi de la séquence du tag myc et d'un site multiple de clonage dans le vecteur pRS422 (référence Genbank U93719). Il confère à la levure l'auxotrophie pour l'adénine. La séquence est fournie en Figure 6 (SEQ ID NO:1).

Le vecteur d'expression codant pour le peptide TRIP1 (figure 2) a été obtenu en insérant le fragment EcoRl-Notl du plasmide pEG202-TRIAPalpha, le peptide inhibiteur de TRIO-GEF2 isolé du crible 2 hybride, dans le vecteur pRS422MT3 digéré par EcoRl-Notl (Schmidt et al. 2002, FEBS Lett. 523:35-42).

Les vecteurs d'intégration pour Lex- RhoG et RhoA (YIPRhoA et YIPRhoG) ont été obtenus en insérant les fragments Sphl de pLexRhoA et pLexRhoG dans le vecteur YIplac204 digéré par Sphl (référence GenBank X75461).

Le vecteur d'intégration pour la kinectine a été obtenu par délétion de 15 l'origine de réplication du vecteur pGADkin66.

Le vecteur d'intégration pour TRIO-GEF1 a été obtenu en insérant le fragment (BssHl-Xhol) de pRSmycTRIOD1 (De Toledo et al. 2000, FEBS Lett. 480:287-292) dans le vecteur Yiplac211 (référence GenBank X75462) digéré par Smal-Sall.

Dosage de l'activité béta-galactosidase: L'activité béta-galactosidase a été détectée par hydrolyse du X-gal ou de l'ONPG comme décrit précédemment (De Toledo et al. 2000, FEBS Lett. 25 480:287-292).

Dans le cas des levures perméabilisées, les levures ont été mises à pousser sur des boîtes de culture additionnées de 100 l de X-gal (20 mg/ml dans du diméthyl formamide) et laissées à pousser 48 à 72 heures à 30 C. La coloration bleue des levures, témoin de la synthèse de bétagalactosidase, est visualisée directement sur la boîte.

Stabilité des plasmides: Les levures sont mises à pousser dans du milieu riche YPD pendant 0 à 100 générations. Au temps indiqué, les levures sont diluées dans de l'eau et la même quantité de levure est étalée en parallèle sur milieu riche et sur milieu sélectif et laissée à pousser 48 à 72 heures à 30 C.

Délétion du gène ERG6: La délétion du gène ERG6 a été réalisée dans la souche de levure TAT7.

Le fragment utilisé pour la délétion à été amplifié par PCR à partir d'ADN génomique de la souche YML008C délétée du gène ERG6 par insertion d'une cassette de résistance à la kanamycine (http://wwwsequence.stanford. edulgroup/yeast deletion projectf) à l'aide des oligonucléotides suivants: UPERG6: 5'-GCTGTTGCCGATAACTTCTTCATTGC-3' (SEQ ID NO:2) DOWNERG6: 5'-CTGATAGAAAATACTGGTCGTTTGCCACG-3' (SEQ ID NO:3) à l'aide de la Taq DNA polymerase Platinium High Fidelity (Invitrogen).

g de fragment purifié ont ensuite été introduits dans les levures d'intérêt par transformation au LiCI (De Toledo et al. 2000, FEBS Lett. 480:287-292), et les transformants ont été sélectionnés sur boîte de culture contenant 200 g/ml de G418.

L'insertion de la cassette de résistance à la kanamycine dans le gène ERG6 par recombinaison homologue est ensuite vérifiée par amplification par PCR 30 de l'ADN génomique des levures à l'aide des oligonucléotides: UPUPERG6: 5'-CGAAGATTGGTGAGAAACCTC-3' (SEQ ID NO:4), DWNDWNERG6: 5'-GTCAATACGTTTGTATGCAGTG-3' (SEQ ID NO:5), situés en amont et en aval de UPERG6 et DOWNERG6 respectivement. RESULTATS: 1- Elaboration d'un crible pour identifier des inhibiteurs spécifiques 10 l'activité d'un facteur d'échange cible: Afin de vérifier que l'on pouvait reproduire l'inhibition spécifique de TRIOGEF2 par le peptide TRIPalpha (Schmidt et al. 2002, FEBS Lett. 523:35-42) dans le test YEA (Yeast Exchange Assay), des levures: exprimant LexRhoC fusionné à LexA- DBD, - exprimant son effecteur ROCK fusionné à GAL4-AD, contenant le vecteur pRs426Met vide ou bien exprimant les facteurs d'échange de RhoA et RhoC: TRIO-GEF2 ou GEF337 (De Toledo et al. 2000, FEBS Lett. 480:287-292), ont été transformées avec le vecteur pRS422MT3 exprimant ou non le peptide inhibiteur (Figure 2). Les levures ont été ré-isolées sur un filtre de nylon déposé sur une boîte de milieu de culture et mises à pousser pendant 72 heures à 30 C. Les levures ont ensuite été cassées par un choc thermique en plongeant le filtre dans un bain d'azote liquide. L'activité bétagalactosidase a ensuite été révélée en incubant à 37 C le filtre de nylon sur un papier absorbant imbibé de X-gal.

En présence de facteur d'échange et en l'absence d'inhibiteur (isolats 1 à 3), on observe la production de béta-galactosidase, témoin de l'activation de RhoC par TRIO-GEF2 et GEF337 (isolats 2 et 3) ; en l'absence de facteur d'échange, RhoC n'est pas activée (isolat 1). Dans les levures exprimant TRIPalpha (isolats 4 à 6), on observe spécifiquement l'inhibition de TRIOGEF2 (isolat 4) alors que l'activation de RhoC par GEF337 n'est pas affectée (isolat 5). Cette méthodologie permet de reproduire l'inhibition d'un facteur d'échange et la spécificité de l'inhibiteur.

2- Elaboration de souches de levure génétiquement modifiées pour réaliser les cribles: Pour stabiliser l'expression de la GTPase RhoA, le vecteur d'intégration YIPRhoA a été inséré par recombinaison homologue dans le gène TRP1 du génome de la levure TAT7. Les levures transformées avec un plasmide réplicatif ou intégratif exprimant Lex-RhoA et le gène d'auxotrophie pour le tryptophane TRP1 ont été mises en croissance sur un milieu riche non sélectif pendant 0, 50 et 100 générations à 30 C. Les populations de levures ont ensuite été diluées et la même quantité de levure a été étalée sur milieu riche et sur milieu dépourvu de tryptophane.

On constate qu'en l'absence de pression de sélection, le plasmide réplicatif est rapidement perdu: dès 50 générations, on observe une importante proportion de levures ayant perdu l'auxotrophie pour le tryptophane et après 100 générations toutes les levures l'ont perdue (figure 3, comparer les étalements sur milieu complet et milieu de sélection pour la même dilution). En revanche dans les levures ayant intégré les transgènes, l'auxotrophie pour le tryptophane est stable même en l'absence de pression de sélection (comparer plasmide et intégrée pour le même nombre de générations en milieu non sélectif). On observe une stabilisation de l'expression du transgène indépendamment de l'application d'une pression de sélection. La GTPase RhoG, son effecteur: la kinectine et son facteur d'échange: TRIO-GEF1 sont intégrés ou présents sous forme de plasmide dans la levure.

Les protéines totales sont ensuite extraites par cassure mécanique des levures et l'activité béta-galactosidase est mesurée en suivant l'hydrolyse de son substrat, 1'ONPG, au cours du temps (figure 4). Les activités sont dosées sur 0,5 g d'extrait protéique dans le cas de plasmides et 50 gg dans le cas de transgènes intégrés. Dans les deux cas, on observe une augmentation significative de l'activité bétagalactosidase dans les extraits en présence du facteur d'échange. L'activité est moins importante dans les levures ayant intégré les trois partenaires (graphe de droite de la Figure 4), reflétant des niveaux d'expressions inférieurs à ceux que l'on observe dans le cas de plasmides réplicatifs multi-copies (graphe de gauche de la Figure 4).

3- Modification de la perméabilité des souches de levure en vue de l'automatisation des cribles: Afin de faciliter l'automatisation des cribles et de favoriser la pénétration des composés chimiques à tester, la perméabilité de la souche de levure a été modifiée par délétion du gèneERG6 qui est impliqué dans la voie de biosynthèse de l'ergostérol.

La cassette de délétion amplifiée à partir de la souche YML008C à l'aide des amorces UPERG6 et DOWNERG6 a été transformée dans des souches de levures exprimant RhoG et la kinectine avec ou sans le facteur d'échange TRIO-GEF1. Après sélection sur un milieu contenant du G418, les transformants sont isolés sur une boîte de culture contenant du X-gal, en parallèle avec les mêmes souches de levure n'ayant pas subi la délétion du gène ERG6. A bout de 48 heures de croissance à 30 C, on constate que les levures perméabilisées et exprimant TRIO-GEF1 sont bleues (figure 5, souche ERG6-, TRIO-GEF1) alors que les mêmes levures ayant un gène ERG6 sauvage restent blanches (figure 5, souche ERG6+, TRIO-GEF1).

Dans les deux cas et en l'absence de facteur d'échange, les levures restent blanches (figure 5, souche ERG6+ et -, pRs). La délétion du gène ERG6 permet donc au X-gal de pénétrer dans la levure et ainsi de révéler l'activation de RhoG par TRIO-GEF1 sans qu'il soit besoin au préalable de procéder à une cassure mécanique des levures.

Claims (16)

REVENDICATIONS

1. Kit pour l'analyse de la régulation des voies d'activation des GTPases, spécialement adapté à l'identification par criblage d'un composé capable d'exercer une activité inhibitrice sur une voie d'activation de GTPase, caractérisé en ce qu'il comprend: - au moins une levure, et - au moins un système pour l'expression d'au moins une protéine hybride par cette levure, - et, éventuellement, un support solide et/ou un milieu liquide et/ou un milieu gélifié, ladite levure présentant une expression altérée de la protéine Erg6, de sorte que la membrane plasmique de cette levure soit essentiellement dépourvue de protéine Erg6, et ladite protéine hybride comprenant deux composants, à savoir un 20 composant "réactif de la voie des GTPases", et un composant "réactif de double hybride", i. le composant "réactif de la voie des GTPases" étant sélectionné parmi le groupe constitué par les GTPases, les effecteurs de GTPase, et les fragments de ces produits qui ont conservé une fonction de GTPase ou d'effecteur de GTPase, et ii. le composant "réactif de double hybride" étant sélectionné parmi le groupe constitué par les domaines de liaison à l'ADN et les domaines d'activation des activateurs de transcription opérationnels dans ladite levure.

2. Kit selon la revendication 1, caractérisé en ce que ledit au moins un système d'expression d'au moins une protéine hybride est intégré dans le génome de ladite levure.

2862983, 31

3. Kit selon la revendication 1, caractérisé en ce que ledit au moins un système d'expression d'au moins une protéine hybride est inséré dans un vecteur d'intégration adapté à l'intégration de ce système d'expression dans le génome de ladite levure.

4. Kit selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'il comprend au moins un système pour l'expression d'au moins deux protéines hybrides différentes: - l'une comportant une GTPase, à titre de composant "réactif de la 10 voie des GTPases", et - l'autre comportant un effecteur de cette GTPase, à titre de composant "réactif de la voie des GTPases", le composant "réactif de double hybride" de chacune des deux protéines hybrides étant pour l'une le domaine de liaison à l'ADN, et pour l'autre le domaine d'activation, ou inversement, d'un même activateur de transcription eucaryote.

5. Kit selon la revendication 4, caractérisé en ce que ladite levure comprend en outre au moins un gène rapporteur dont la transcription peut être activée par un complexe formé, directement ou indirectement, par le domaine de liaison à l'ADN et, respectivement, le domaine d'activation des desdites au moins deux protéines hybrides.

6. Kit selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisé en ce qu'il comprend en outre un vecteur d'intégration qui présente au moins un site de clonage au niveau duquel peut être insérée une cassette d'expression protéique, et qui est adapté à l'intégration dans le génome de ladite levure de la cassette d'expression protéique qui serait insérée audit site de clonage.

7. Kit selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisé en ce qu'il comprend en outre: - une protéine GEF activatrice de ladite GTPase, éventuellement sous forme étiquetée, ou - un fragment d'une telle protéine GEF qui a conservé une fonction activatrice vis-à-vis de ladite GTPase, éventuellement sous forme étiquetée, ou - un système pour l'expression de cette protéine ou fragment, éventuellement sous forme étiquetée, dans ladite levure.

8. Kit selon la revendication 7, caractérisé en ce que ledit système d'expression de ladite protéine ou fragment GEF est inséré dans un vecteur d'intégration qui est adapté à l'intégration de ce système dans le génome de ladite levure.

9. Kit selon la revendication 7, caractérisé en ce que ledit système d'expression de ladite protéine ou fragment GEF est intégré dans le génome de ladite levure.

10. Kit selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, caractérisé en ce qu'il comprend en outre au moins un vecteur d'expression eucaryote, adapté à recevoir un système d'expression d'un composé peptidique ou polypeptidique dont on voudrait tester l'influence sur l'activation des GTPases, et adapté à exprimer ce système d'expression dans ladite levure.

11. Kit d'analyse selon l'une quelconque des revendications 1 à 10, caractérisé en ce qu'il comprend en outre une banque de vecteurs d'expression eucaryote, chacun adapté à l'expression, dans ladite levure, d'un composé peptidique ou polypeptidique candidat, dont on voudrait tester l'influence sur l'activation des GTPases.

12. Kit d'analyse selon l'une quelconque des revendications 1 à 11, caractérisé en ce qu'il comprend en outre une chimiothèque de composés candidats, dont on voudrait tester l'influence sur l'activation des GTPases.

Z

13. Kit pour l'expression d'au moins une protéine hybride, telle que définie en revendication 1, dans la levure du kit d'analyse des revendications 1 à 12, caractérisé en ce qu'il comprend un vecteur d'intégration: - qui comporte en insert un système d'expression de ladite au moins une protéine hybride, laquelle protéine hybride comprend deux composants: i. l'un étant sélectionné parmi le groupe des "réactifs de la voie des GTPases" constitué par les GTPases, les effecteurs de GTPase, et les fragments de ces produits qui ont conservé une fonction de GTPase ou d'effecteur de GTPase, et ii. l'autre parmi le groupe des "réactifs de double hybride" constitué par les domaines de liaison à l'ADN des activateurs de transcription eucaryote, et les domaines d'activation des activateurs de transcription eucaryote, et - qui comporte une région présentant une homologie avec un locus chromosomique de ladite levure suffisante pour permettre une recombinaison dudit système d'expression dans le génome de cette levure.

14. Utilisation du kit selon l'une quelconque des revendications 1 à 12, pour l'identification d'un composé capable d'exercer une activité inhibitrice sur une voie d'activation de GTPase.

15. Utilisation du kit selon l'une quelconque des revendications 1 à 12, pour l'identification d'un composé permettant de lutter contre une cellule tumorale, contre l'hypertension, contre une infection, contre le développement d'une maladie génétique.

16. Procédé automatisable pour l'identification d'un composé capable d'exercer une activité inhibitrice sur une voie d'activation GTPase, caractérisé en ce que: - on fournit une levure issue d'un kit selon l'une quelconque des revendications 4 à 12, c'est-à-dire une levure qui présente une expression altérée de la protéine Erg6, de sorte que la membrane plasmique de cette levure soit essentiellement dépourvue de protéine Erg6, et qui comprend au moins deux protéines hybrides, telles que définies en revendication 4, - si nécessaire, on active la GTPase qui est portée par l'une des deux protéines hybrides mentionnées à l'étape précédente, de sorte que cette GTPase soit capable de se lier à son effecteur qui est porté par l'autre des deux protéines hybrides mentionnées à l'étape précédente, - on confronte le composé inhibiteur candidat au milieu intracellulaire de cette levure, - on détermine si ce composé candidat induit une inhibition de l'activation GTPasique, et le cas échéant, on identifie ce composé candidat comme étant un composé capable d'exercer une activité inhibitrice sur une voie d'activation GTPase.