WO2005064007A2 - MOYENS DE CRIBLAGE POUR L’IDENTIFICATION DE REGULATEURS DE L’ACTIVITE GTPase - Google Patents

MOYENS DE CRIBLAGE POUR L’IDENTIFICATION DE REGULATEURS DE L’ACTIVITE GTPase Download PDF

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WO2005064007A2
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Audrey Salomon
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Definitions

  • the small GTPases of the Ras superfamily (Ras, Rho, Rab, Arf and Ran) are major players in the regulation of cell signaling cascades. Their essential role in the regulation of signal cascades is reflected in their involvement in many cancers and pathologies (Oxford and Theodorescu, January 28, 2003, Cancer Lett. 189 (2): 117-128).
  • Rho GTPases are implicated in several cancers and pathologies in humans (Boettner and Van Aelst, February 2002, Nat. Rev. Cancer 2 (2): 133-142; Sahai and Marshall, March 20, 2002, Gene 286 (2) : 155-174).
  • GTPases exist in two forms: an active form linked to GTP, and an inactive form linked to GDP. Linked to GTP, GTPase interacts with effector proteins thus activating the downstream signaling cascade. Linked to GDP, GTPase is unable to bind its effectors, and no signaling cascade is triggered. Activation of GTPases is provided by activating proteins known as "Guanine nucleotide Exchange Factors" (GEF).
  • GEF Guide Nucleotide Exchange Factors
  • GEFs are generally high molecular weight proteins, capable of integrating numerous intra- or extra-cellular signals.
  • proteins of the Dbl family such as LARG, TIAM, NAV, activate the GTPases of the Rho family.
  • RhoGEF There are approximately sixty RhoGEF in humans, characterized by a DH domain ("Dbl Homology") of about two hundred amino acids and responsible for the specific activation of one or more GTPases. They are generally complex molecules comprising many domains participating in the regulation of their activity and their localization (Hoffman and Cerione, February 20, 2002, FEBS Lett. 513 (1): 85-91).
  • GTPases have a wide spectrum of expression in different tissues, and participate in several activation cascades within the same cell. Exchange factors, on the contrary, have more specific expression profiles, and are activated in response to signals defined by their association with particular receptors in the cell. Exchange factors therefore constitute prime targets for the development of drugs, in particular anticancer drugs, with a limited spectrum of action.
  • the prior art methodology for inhibitor identification includes the implementation of a primary screen which consists in identifying compounds capable of fixing the target, by mass interaction measures such as the "phage display” ( Scott and Smith, 1990, Science 249: 386-390), and the “double hybrid” (Fields and Song, 1989, Nature 340: 245-246).
  • the compounds positive with the primary interaction screen are then then analyzed according to a secondary screen for their capacity of inhibition by biochemical methods on purified partners.
  • the positive compounds at the end of the secondary screen are then subjected to a functional confirmation analysis on a cell line, followed by an induced phenotypic change for example.
  • the enzymatic activity consists in catalyzing the replacement of the GDP of the target GTPase by GTP. This activity is then determined bi ⁇ chemically on purified partners, for example by measuring the rate of incorporation of radiolabelled GTP in acid-precipitable form, then subjected to functional confirmation by study on a cell line study, for example by monitoring the growth of neurites induced by growth factor NGF on the transfected PC 12 cell line.
  • the first identification of an inhibitor of the activity of a protein of the Dbl family is however only very recent (Schmidt et al, 2002, FEBS Lett. 523: 35-42).
  • TRIO peptide of 42 amino acids
  • biochemically validated for its ability to inhibit the enzymatic activity of TRIO exchange on its target GTPase.
  • This methodology nevertheless leads to many false positives from primary screen, and the identification of a peptide with effectively inhibitory activity proves difficult.
  • the main constraint for the isolation of inhibitors of an enzymatic function indeed resides in the development of a method of rapid and reliable detection of this activity. In addition to the problem of reproducibility of the quality of batches of purified proteins and the conservation of their enzymatic activity, this type of measurement is difficult to automate.
  • This test uses a wild version of GTPase (not constitutionally activated): in the absence of activation, GTPase is mainly linked to GDP and does not interact with its effector. No activity of the reporter genes of the "double hybrid” is then detected. The expression of a protein of the Dbl family specific for GTPase used in the test causes its activation, and causes the GTPase / effector interaction. Activity of the reporter genes is then detected. As such, this methodology is effective in qualitatively determining the activity of an exchange factor on a GTPase. However, this system is not stable enough to be able to be transposed to the reliable search for inhibitors. In particular, the level of proteins expressed from the plasmids is not stable, and the activities measured fluctuate over time.
  • this "double hybrid” technique uses reporter genes and selection markers whose transcription products, which are synthesized in the intracellular medium, must be able to have access to their respective substrates.
  • the LACZ (beta-galactosidase) gene is commonly used as a reporter gene for the double hybrid activity tested: the beta-galactosidase produced by the yeast must then be able to access an X-Gal type substrate. To do this, it is currently carried out by breaking the yeasts used, for example by thermal or mechanical shock.
  • the double hybrid technique on modified yeast currently available in the state of the art therefore does not allow easy automation. Its use in industrial applications is all the more limited.
  • the present patent application relates to means for analyzing the regulation of the activation pathways of GTPases, which are specially adapted for the identification by screening of a compound capable of exerting an inhibitory activity on a pathway.
  • activation of GTPase (see principle illustrated in Figure 1).
  • These means include a yeast with high membrane permeability (erg ⁇ ) and at least one system for the expression of at least a hybrid protein of the double hybrid type by this yeast, or else a yeast and at least one system for the expression of at least one hybrid protein of the double hybrid type integrated into the genome of the yeast, or intended to be so.
  • the reagents and test compounds used can be used at lower concentrations, and therefore less toxic and closer to the in vivo conditions targeted in (therapeutic) application, than they would be using a conventional double hybrid test. They make it possible to overcome the selection pressures which are conventionally applied in a standard double hydride test to maintain the expression of the double hybrid partners in the yeast cell (cf. FIG. 3). The results obtained with the means according to the invention are thus more reliable, and more sensitive (cf. FIG. 4). Finally, the means are fully automatable, and allow the identification and production of compounds capable of making it possible to fight against a tumor cell, and / or against hypertension, and / or against an infection, against the development of a disease. genetic.
  • the present invention relates to the regulation of GTPase activation pathways. It proposes means which make it possible to identify, by screening, the compounds which exhibit a regulatory activity (stimulating or inhibiting) on the activating proteins of small GTPases.
  • the means according to the invention thus make it possible to identify compounds which, because of their regulatory activity, are excellent therapeutic candidates for combating pathologies in which the activation of small GTPases must be regulated. It can be a stimulatory activity or an inhibitory activity.
  • Compounds with stimulatory activity are excellent candidates for the prevention, the palliation, or the treatment of pathologies for which it is desired to stimulate the activation of small GTPases.
  • the compounds with inhibitory activity are excellent candidates for the prevention, the palliation, or the treatment of pathologies for which it is desired to inhibit the activation of small GTPases. This is particularly the case of hypertension, genetic diseases, invasions by pathogens, and also many cancers, such as leukemia, prostate cancer, breast cancer, cancers generalized by metastasis or in way of being.
  • the present invention relates more particularly to screening means which make it possible to identify compounds which inhibit proteins which activate small GTPases.
  • kits and methods for analyzing the regulation of the GTPase activation pathways include kits and methods for analyzing the regulation of the GTPase activation pathways (cf. FIG. 1). These kits and methods can in particular be applied to the identification of compounds which have the capacity to exert a regulatory activity on these activation pathways. Therefore, they find direct application as research and development tools. Due to the regulatory compounds which they make it possible to identify, they can also give access to medical applications of interest, and in particular for the fight against the abovementioned pathologies.
  • the present invention proposes, according to a first aspect, to combine synergistically the functions of permeability of a yeast, with the functions of reaction analysis of reagents of the double hybrid type.
  • the inventors indeed demonstrate that this combination is possible, namely that on the one hand, the double hybrid type reagents can, without loss or bias, continue to exercise the functions in a yeast cell with increased permeability, and on the other hand apart from the yeast cell with increased permeability, it remains entirely viable whereas it is given to express a hybrid protein of the double hybrid reactive type.
  • the choice made by the inventors of such a combination of functions provides an advantageous solution to the problem of the automation of screening on yeast modified in a double hybrid.
  • the technique of "double hybrid" of the prior art requires to lyse the yeasts used in the test, for example by thermal or mechanical shock, so as to give the products reporter genes for the test access to their reaction substrates (for example, access to X-Gal for beta-galactosidase).
  • the double hybrid technique on modified yeast currently available in the state of the art therefore does not allow easy automation, and its industrial applications are all the more limited.
  • the combination of "permeability + double hybrid" functions for which the inventors have chosen makes it possible to completely automate the process: it is no longer necessary to lyse the yeasts used to read the test results (cf. FIG. 5) .
  • the means according to the invention find industrial applications to which the double hybrid technique of the prior art did not have access. Furthermore, since, in accordance with the present invention, the reaction substrates easily penetrate into the yeast cell, they can be used in much lower concentrations than they would be by cell lysis. In turn, this makes it possible to use also lower quantities of regulatory candidates, and in particular lower quantities of inhibiting candidates. As a result, in addition to overcoming the lysis step which obstructs the automation and therefore the industrial application of the process, the present invention places the yeast cell in conditions much less toxic than it would have been by following the techniques of the prior art. The system is thus more easily manageable, and, in a particularly remarkable manner, the integration of the results reaches a much better sensitivity compared to the techniques of the prior art.
  • the kit according to the invention (“first aspect” kit) thus comprises at least one yeast with high permeability but nevertheless cellulologically viable, and at least one system for the expression of a hybrid protein by this yeast.
  • kit can be in the form of an “inco ⁇ orated” kit in which said at least one expression system is present in the intracellular medium of the yeast (in the form simply expressed in the cytoplasm, or else in the form integrated into the genome yeast).
  • the kit according to the invention may be in the form of a “kit-of-parts” (juxtaposed form forming a functional unit), in which said at least one hybrid protein expression system is present extracellularly, out of yeast. It can then be accompanied by means suitable for its conservation.
  • said at least one expression system is then accompanied by means suitable for its transfer into the yeast cell.
  • This juxtaposed vector can then be itself included in an environment promoting or facilitating its multiplication before transfection into yeast.
  • Said juxtaposed vector can for example be included in a prokaryotic microorganism adapted to its replication.
  • each term is given the meaning and the scope given to it by the person skilled in the art.
  • expression vector conventionally implies, insofar as, as in the present application, it is intended to transform a yeast cell and to express therein the expression system which it carries, that this vector comprises generally at least one origin of replication suitable for the autonomous replication of this vector in yeast, a selection marker for detecting the transformation of the expression vector in yeast, and the expression system of which it is the vector.
  • Such an expression vector also generally comprises means for its replication in a host cell other than yeast, such as for example a prokaryotic cell of the Escherichia coli type: we therefore commonly find in a vector of non-integrative expression an origin of prokaryotic replication, and a selection marker, such as a fragment of resistance to an antibiotic (for example ampicillin).
  • the term integration vector meanwhile implies that this vector includes means allowing the integration of the coding sequence which it carries in an operational manner in the yeast genome of the kit.
  • such a vector does not need to present an origin of yeast replication, but it will generally carry a sequence which allows integration into the yeast genome, such as for example a sequence having a homology with a chromosomal locus of the host cell sufficient to allow recombination.
  • the expression system carried by this type of vector is, in the context of the present invention, intended for expressing a protein in the yeast of the kit. It therefore generally includes a yeast promoter, a translation start site, a coding sequence and a transcription termination signal.
  • vectors include plasmids in particular.
  • the kit according to the invention can also comprise a solid support and / or a liquid medium and / or a gelled medium, so as to facilitate the handling and / or storage of the yeast.
  • a yeast which has a high membrane permeability, but which has retained a sufficient membrane integrity to be cell viable.
  • a proposed means for achieving this result is to alter the biosynthesis of a compound of the plasma membrane whose presence is not essential to the viability of the yeast cell.
  • a simple and effective technique comprises the suppression, or at least the substantial inhibition, of the transcription and / or translation of the gene coding for the compound concerned.
  • a preferred embodiment of the present invention therefore comprises a yeast, such as S. cerevisiae or C.
  • albicans which does not have a functional copy of the ERG6 gene, due for example to a deletion of this gene.
  • the kit according to the invention also comprises, in addition to yeast, at least one system for the expression of a hybrid protein by this yeast.
  • this expression system can be found in the intracellular medium of the yeast (“inco ⁇ orated” kit), or can be placed in juxtaposition outside the yeast (“kit-of-parts”).
  • the hybrid protein expressed by this system comprises two components (direct or indirect fusion), namely a "reactive GTPase pathway” component, and a "reactive double hybrid” component.
  • the "GTPase pathway reagent” component is selected from the group consisting of GTPases, GTPase effectors, and fragments of these products which have retained GTPase or GTPase effector function.
  • the “double hybrid reagent” component is selected from the group consisting of the DNA binding domains and the activation domains of the operational transcription activators in said yeast.
  • the present application therefore relates more particularly to a kit for the analysis of the regulation of the GTPase activation pathways, characterized in that it comprises:
  • said yeast having an altered expression of the Erg6 protein, so that the plasma membrane of this yeast is essentially devoid of Erg6 protein
  • said hybrid protein comprising two components (direct or indirect fusion), namely a "reactive component of the GTPase pathway ", and a" double hybrid reagent "component, i. the "GTPase pathway reagent” component being selected from the group consisting of GTPases, GTPase effectors, and the fragments of these products which have retained a GTPase or GTPase effector function, and ii. the “double hybrid reagent” component being selected from the group consisting of DNA binding domains and activation domains of operational transcription activators in said yeast.
  • Said at least one expression system of at least one hybrid protein can be present in the kit outside the yeast, in juxtaposed form forming a functional unit. It can for example be inserted into an expression vector suitable for the intracellular expression of the hybrid protein in said yeast. Very preferably, said at least one expression system of at least one hybrid protein will in fact be integrated into the yeast genome, or intended to be.
  • This embodiment ensures a quantitative level of precision in the process: the user knows that the yeast only contains one copy of the expression system per cell (cf. Figure 4, graph on the right), which it does It is not necessary to impose a selection pressure to ensure the maintenance of this system in yeast (cf. Figure 3), and the activities measured will be stable and reproducible.
  • the present application therefore relates to a kit in which said at least one expression system of at least one hybrid protein is integrated into the genome of said yeast, or is inserted into an integration vector suitable for the integration of this system expression in the genome of said yeast.
  • suitable integration vectors include vectors which carry at least one sequence allowing integration into the genome (for example, by homologous recombination).
  • the present patent application also relates to a kit (“second aspect” kit) for the analysis of the regulation of the GTPase activation pathways, in which a yeast of the double hybrid type or intended to be used as a double hybrid is present, and in which the expression system (s) of the hybrid protein (s) of the double hybrid test are integrated (s) into the genome of this yeast, or to any least intended to be.
  • kit characterized in that it comprises:
  • hybrid protein comprising two components (in direct or indirect fusion), namely a “reactive GTPase pathway” component, and a "double hybrid reagent” component, i. the "GTPase pathway reagent” component being selected from the group consisting of GTPases, GTPase effectors, and the fragments of these products which have retained a GTPase or GTPase effector function, and ii.
  • the “double hybrid reagent” component being selected from the group consisting of DNA binding domains and activation domains of transcription activators operational in said yeast, and said at least one expression system being either integrated in the genome of said eukaryotic cell, or carried by a genomic integration vector adapted to the integration of this system in the genome of said eukaryotic cell.
  • the yeast in this kit has a high membrane permeability, while having retained a sufficient cell integrity to have the ability to remain viable in in vitro culture.
  • the yeast in this kit has an altered expression of the Erg6 protein, so that the plasma membrane of this yeast is essentially devoid of the Erg6 protein.
  • a kit according to the invention will generally comprise, or will be intended to comprise, at least one system for the expression of at least two different hybrid proteins: - one comprising a GTPase, as component "reactive of the pathway GTPases ", and the other comprising an effector of this GTPase, as component” reagent of the GTPase pathway ", the component” reactive double hybrid "of each of the two hybrid proteins being for one the domain of DNA binding, and for the other the activation domain, or vice versa, of the same eukaryotic transcription activator.
  • GTPase or molecule having a GTPase function can be chosen for the kit according to the invention.
  • a mammalian GTPase is preferably chosen, more preferably a GTPase which is found expressed in humans. It may for example be a small GTPase from the Ras superfamily, such as Ras, Rho, Rab, Arf or Ran (cf. Ridley 1999, Prog. Mol. Subcell. Biol. 22, 1-22; Fort 1999 , Prog. Mol. Subcell. Biol. 22, 159-181).
  • Rho A, B and C
  • Rac (1, 2 and 3)
  • Cdc42 Cdc42
  • RhoD RhoD
  • RhoG RhoH / TTF
  • TC10 TC10
  • Rnd (1, 2 and 3)
  • TCL Wrch
  • Chp Chp
  • D-GTPase active dominant GTPase mutants
  • a non constitutionally activated GTPase such as a wild type GTPase, will nevertheless be preferred, so as to be closer to the cycles followed in vivo for the activation of GTPases.
  • the kit according to the invention makes it possible, as will be described below, to introduce the effective presence of a GEF.
  • GTPase effectors are also well known to those skilled in the art.
  • ROCK also known under the name of ROCKalpha and ROCKbeta
  • RhoA an effector of RhoA
  • N-WASP and PAK which are effectors of Rac and Cdc42
  • PAK1 an effector of Cdc42Hs
  • kinectin which is an effector of Racl and RhoG (cf. Vignal et al. 2001, "Kinectin is a key effector of RhoG microtubule-dependent cellular activity", Mol. Cell Biol. 21, 8022-8034; Daniels et al.
  • Any eukaryotic transcription activator is a priori suitable for implementing a kit according to the invention.
  • the domains of the eukaryotic transcription activator GAL4 can be used, namely the activation domain GAD, and the DNA binding domain LexA.
  • said at least one system or, where appropriate each of said systems, for the expression of each of said at least two hybrid proteins is integrated into the genome of said eukaryotic cell, or is intended to be so.
  • said yeast can also comprise at least one reporter gene, the. transcription can be activated by a complex formed, directly or indirectly, by the DNA binding domain and, respectively, the activation domain of said at least two hybrid proteins.
  • the yeast present in a kit according to the invention will therefore therefore comprise, preferably in an integrated form in its genome, a reporter gene such as for example lacZ (beta-galactosidase) whose transcription is activated by the eukaryotic transcription activator GAL4.
  • a reporter gene such as for example lacZ (beta-galactosidase) whose transcription is activated by the eukaryotic transcription activator GAL4.
  • a second reporter gene or a selection marker for example by creating an auxotrophy of the yeast for a given element (for example, auxotrophy for histidine) and by providing jointly or parallel to one of the hybrid protein expression systems, the gene which codes for the element for which the yeast is auxotrophic, so that on a culture medium lacking this element, only the yeasts actually transformed will be able to survive.
  • a kit according to the invention may also comprise a GEF protein activating (or exchange factor) of said GTPase, or a fragment of such a GEF protein which has retained an activating function with respect to said GTPase, or a system for the expression of this GEF protein or fragment in said yeast.
  • This GEF protein or fragment can optionally be in the form of a tagged protein, for example a myc or HA tag.
  • the expression system for this GEF protein or GEF fragment may be present in the intracellular medium of the yeast, or may be present outside the yeast cell; it can be carried by an expression vector adapted to the expression of this GEF system or fragment of GEF in said yeast, or else it can be carried by an integration vector adapted to the integration of this system in the genome of said yeast.
  • the GEF expression system or GEF fragment is integrated into the genome of said yeast, or is intended to be.
  • a preferred embodiment of the present invention corresponds to the mode in which the three expression systems "GTPase reagent” + “double hybrid reagent” + “GEF or fragment of GEF” are integrated into the genome of said yeast, or are intended to be.
  • a kit according to the invention can leave its user the choice of the GEF protein or fragment that he wishes to participate in the test.
  • a kit according to the invention may comprise an empty expression vector, that is to say one not carrying a GEF expression cassette or GEF fragment, but which is adapted to receive such a cassette. expression and expressing it in said yeast.
  • a vector will be chosen which will be a vector for integration into the genome of said yeast, so that the GEF expression cassette or GEF fragment which the user will insert into it can be integrated into the genome of said yeast.
  • Such an “empty” integration vector therefore comprises, for example, a cloning site at the level of which a protein expression cassette, such as a multiple cloning site, can be inserted, and at least one sequence which allows integration into the genome (by homologous recombination for example).
  • This alternative embodiment is another preferred embodiment of the invention.
  • GTPase or activating protein, or GEF
  • GEF activating protein
  • Tiam-1 is thus known to be a GEF of Racl, and ⁇ PIX to be an effector of Cdc42Hs (cf. Michiels et al 1997, Cell Biol. 137 387-398; Manser et al 1998, Mol. Cell 1: 183- 192).
  • the TRIO peptide is also a Rho-GEF, it contains two Rho-GEF domains with different specificities: the first domain, Trio-GEFD1, activates the Rac pathway via RhoG, and the second domain, Trio-GEFD2, acts specifically on RhoA (cf. Debant et al. 1996, Proc. Nafl. Acad. Sci. USA 93: 5466-5471; Blangy et al. 2000, J. Cell Sci. 113: 729-739).
  • a fragment of GEF which has retained a GEF function, such as for example Trio-GEFD1, or Trio-GEFD2 (cf. Schmidt et al. 2002, FEBS Lett. 523: 35-42; De Toledo et al. 2000, FEBS Lett. 480: 287-292).
  • An analysis kit according to the invention is specially adapted for the identification by screening of a compound which exhibits regulatory activity on the GTPase activation pathways present in said yeast.
  • a compound can be a peptide or protein compound, such as the TRIPalpha inhibitor peptide described in Schmidt et al. 2002, FEBS Lett. 523: 35-42; TRIPalpha sequence
  • kits according to the invention can also comprise at least one eukaryotic expression vector, adapted to receive an expression system for a peptide or polypeptide compound the influence of which on the activation of GTPases, and adapted to express this expression system in said yeast. Integration into the genome of the expression system of this peptide or protein compound is not particularly necessary or sought here: a cytoplasmic expression is sufficient, and may even be preferable if one wishes to test not a peptide or protein compound , but a plurality of such compounds.
  • kits according to the invention can indeed in addition comprise a bank of eukaryotic expression vectors, each adapted to the expression, in said yeast, of a candidate peptide or polypeptide compound, the influence of which on would be tested activation of GTPases.
  • a compound which exhibits regulatory activity on the GTPase activation pathways present in said yeast may moreover be a compound which is not purely peptide and which is not purely protein-based: it may for example be a compound obtained from a chemical library, such as that Brefeldine A (1,6,7,8,9,1 la, 12,13,14,14a-Décahydro-1,13-dihydroxy-6-methyl-4H- cyclopent [fJoxacyclotridécin-4-one; CAS Number CAS [20350-16-6]; Merck Index 1996, 12 :, 1393; sold for example by AG Scientific, Inc.).
  • a kit according to the invention can therefore also comprise a library of candidate compounds, the influence of which on the activation of GTPases is to be tested.
  • kits specially adapted for the expression of at least one hybrid protein, as defined above, in the yeast of an analysis kit. includes at least one integration vector:
  • hybrid protein comprises two components: i. one being selected from the group of "GTPase pathway reagents" consisting of GTPases, GTPase effectors, and fragments of these products which have retained GTPase or GTPase effector function, and ii. the other from the group of “double hybrid reagents” constituted by the DNA binding domains of eukaryotic transcription activators, and the activation domains of eukaryotic transcription activators, and
  • kits according to the invention naturally includes within its scope any use of a kit according to the invention (whether it is a kit described above in “first aspect”, or a kit described above in “Second aspect”), for the identification of a compound capable of exerting a regulatory, and more particularly inhibitory, activity on a GTPase activation pathway, and / or for the identification of a compound making it possible to fight against a tumor cell, against hypertension, against infection, against the development of a genetic disease.
  • Said kit can therefore also include instructions for such use.
  • the present application thus relates to any process for the identification of a compound capable of exerting a regulatory, and more particularly inhibitory, activity on a GTPase activation pathway, which implements a kit according to the invention (which it be a kit described above in "first aspect", or a kit described above in “second aspect”). More particularly, the present application relates to an automated process for the identification of a compound capable of exerting a regulatory, and more particularly inhibitory, activity on a GTPase activation pathway, characterized in that:
  • kits described above in "first aspect"
  • yeast having an altered expression of the protein Erg6, so that the plasma membrane of this yeast is essentially devoid protein Erg6, and which yeast comprising at least two hybrid proteins, as defined above,
  • the GTPase which is carried by one of the two hybrid proteins mentioned in the previous step is activated, so that this GTPase is capable of binding to its effector which is carried by the other of the two hybrid proteins mentioned in the previous step,
  • this candidate compound induces a regulation, and more particularly an inhibition, of GTPase activation, and if necessary, this candidate compound is identified as being a compound capable of exerting a regulatory activity (and more particularly an inhibitor) on a GTPase activation pathway.
  • This process according to the present invention has the notable advantage of being easily fully automated, and is therefore directly on an industrial scale.
  • the present application also relates to an automated process for the identification of a compound capable of exerting a regulatory, and more particularly inhibiting, activity on a GTPase activation pathway, characterized in that:
  • - a yeast which comprises, integrated into its genome, at least two hybrid proteins, as defined above,
  • the GTPase which is carried by one of the two hybrid proteins mentioned in the previous step is activated, so that this GTPase is capable of binding to its effector which is carried by the other of the two hybrid proteins mentioned in the previous step,
  • this candidate compound induces a regulation, and more particularly an inhibition, of GTPase activation, and if necessary, this candidate compound is identified as being a compound capable of exerting a regulatory activity (and more particularly an inhibitor) on a GTPase activation pathway.
  • a simple and effective means of determining whether this regulation, and more particularly this inhibition, of GTPase activation, takes place is to use a yeast which is as defined in the present application, and which also comprises at least one reporter gene whose transcription is activated by bringing together the activation domain and the DNA binding domain carried by each of said two hydride proteins.
  • the present application also relates to a process for the manufacture of a compound capable of making it possible to fight against a tumor cell, and / or against hypertension, and / or against an infection, against the development of a genetic disease, characterized in what:
  • a compound capable of exerting an inhibitory activity on a GTPase activation pathway is identified, using a method according to the invention,
  • This compound is synthesized and / or isolated, and optionally placed in the presence of pharmaceutically acceptable vehicles.
  • yeast strain one can for example use: a strain of Saccharomyces cerevisiae of genotype MATa, his3 leu2 trpl ade2 LYS2:: lex (op) -HIS3 ura3 :: lex (op) -LacZ) such as TAT7, or a strain of Saccharomyces cerevisiae of genotype MATa his3D200 trpl-901 leu2-3112 ade2 LYS2: :( 4lexAop-HIS3) URA3: :( 8lexAop-lacZ GAL4, such as the strain L40 sold by the company Invitrogen under the reference C830-00 (http: //www.invitrogen.coml.
  • LYS2 :( lexAop) 4-HIS3 URA3: :( lexAop) 8-lacZ GAL4, such as strain DSY1 sold by Dual System Biotech (http://www.dsbiotech.ch) under the reference S 101001-1, or a strain of Saccharomyces cerevisiae of genotype MATalphahis3delta200 trpl-901 leu2-3,112 ade2 LYS2: :( lexAop) 4- HIS3 URA3 : :( lexAop) 8-lacZ GAL4, such as the strain DSY-2 sold by Dual System Biotech (http://www.dsbiotech.ch) under the reference S 101002-1.
  • the vector pRS422MT3 was obtained by inserting the MET25 promoter followed by the sequence of the myc tag and a multiple cloning site in the vector pRS422 (Genbank reference U93719). It gives the yeast auxotrophy for adenine. The sequence is provided in Figure 6 (SEQ ID NO: 1).
  • the expression vector coding for the peptide TRIP1 (FIG. 2) was obtained by inserting the EcoRl-Notl fragment of the plasmid pEG202-
  • TRIAPalpha the TRIO-GEF2 inhibitor peptide isolated from the hybrid screen 2, in the vector pRS422MT3 digested with EcoRl-Notl (Schmidt et al. 2002,
  • YIPRhoG were obtained by inserting the Sphl fragments of pLexRhoA and pLexRhoG into the vector YIplac204 digested with Sphl (GenBank reference
  • the integration vector for kinectin was obtained by deletion of the origin of replication of the vector pGADkin66.
  • TRIO-GEF1 The integration vector for TRIO-GEF1 was obtained by inserting the fragment (BssHl-Xhol) of pRSmycTRIODl (De Toledo et al. 2000, FEBS
  • Beta-galactosidase activity was detected by hydrolysis of X-gal or ONPG as described previously (De Toledo et al. 2000, FEBS Lett. 480: 287-292).
  • yeasts were grown on culture dishes supplemented with 100 ⁇ l of X-gal (20 mg / ml in dimethyl formamide) and left to grow 48 to 72 hours at 30 ° C. The blue coloration of the yeasts, a witness to the synthesis of beta-galactosidase, is displayed directly on the dish. Plasmid stability:
  • the yeasts are grown in rich YPD medium for 0 to 100 generations. At the indicated time, the yeasts are diluted in water and the same amount of yeast is spread in parallel on rich medium and on selective medium and allowed to grow 48 to 72 hours at 30 ° C.
  • the deletion of the ERG6 gene was carried out in the yeast strain TAT7.
  • the fragment used for the deletion was amplified by PCR from genomic DNA of the YML008C strain deleted from the ERG6 gene by insertion of a kanamycin resistance cassette (http: // www- sequence.stanford.edu/group / yeast deletion project 1 using the following oligonucleotides:
  • yeasts expressing LexRhoC fused to LexA-DBD, expressing its effector ROCK fused to GAL4-AD, containing the empty vector pRs426Met or else expressing the exchange factors of RhoA and RhoC: TRIO-GEF2 or GEF337 (De Toledo et al. 2000, FEBS Letters 480: 287-292), were transformed with the vector pRS422MT3 expressing or not expressing the inhibitory peptide (FIG.
  • the yeasts were re-isolated on a nylon filter placed on a culture medium dish and allowed to grow for 72 hours at 30 ° C. The yeasts were then broken by thermal shock by immersing the filter in a bath of liquid nitrogen. The beta-galactosidase activity was then revealed by incubating the nylon filter at 37 ° C. on absorbent paper soaked in X-gal.
  • the integration vector YIPRhoA was inserted by homologous recombination into the gene TRP1 of the genome of the yeast TAT7.
  • the yeasts transformed with a replicative or integrative plasmid expressing Lex-RhoA and the auxotrophy gene for tryptophan TRP1 were grown on a non-selective rich medium for 0, 50 and 100 generations at 30 ° C.
  • the yeast populations were then diluted and the same amount of yeast was spread on rich medium and on medium devoid of tryptophan.
  • the total proteins are then extracted by mechanical breaking of the yeasts and the beta-galactosidase activity is measured by following the hydrolysis of its substrate, the ONPG, over time (FIG. 4).
  • the activities are dosed on 0.5 ⁇ g of protein extract in the case of plasmids and 50 ⁇ g in the case of integrated transgenes. In both cases, a significant increase in beta-galactosidase activity is observed in the extracts in the presence of the exchange factor.
  • the activity is less important in the yeasts having integrated the three partners (right-hand graph of Figure 4), reflecting lower levels of expression than those observed in the case of replicative multi-copy plasmids (left graph of Figure 4).
  • the permeability of the yeast strain has been modified by deletion of the ERG6 gene which is involved in the pathway of ergosterol biosynthesis.
  • the deletion cassette amplified from the YML008C strain using the primers UPERG6 and DOWNERG6 was transformed into yeast strains expressing RhoG and kinectin with or without the exchange factor TRIO-GEF1.
  • the transformants After selection on a medium containing G418, the transformants are isolated on a culture dish containing X-gal, in parallel with the same yeast strains which have not undergone the deletion of the ERG6 gene. After 48 hours of growth at 30 ° C., it is observed that the permeabilized yeasts expressing TRIO-GEF1 are blue (FIG. 5, strain ERG6-, TRIO-GEF1) while the same yeasts having a wild ERG6 gene remain white ( Figure 5, strain ERG6 +, TRIO-GEF1).
  • yeasts remain white (FIG. 5, strain ERG6 + and -, pRs).
  • the deletion of the ERG6 gene therefore allows the X-gal to penetrate into the yeast and thus to reveal the activation of RhoG by TRIO-GEF1 without the need to first carry out a mechanical breakage of the yeasts.

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Abstract

La présente demande de brevet est relative à des moyens pour l’analyse de la régulation des voies d’activation des GTPases, qui sont spécialement adaptés à l’identification par criblage d’un composé capable d’exercer une activité inhibitrice sur une voie d’activation de GTPase. Ces moyens comprennent une levure à forte perméabilité membranaire (erg6) et au moins un système pour l’expression d’au moins une protéine hybride de type double hybride par cette levure, ou bien une levure et au moins un système pour l’expression d’au moins une protéine hybride de type double hybride intégré dans le génome de la levure, ou destiné à l’être. Ces moyens sont entièrement automatisables, et permettent la production de composés susceptibles de permettre de lutter contre une cellule tumorale, et/ou contre l’hypertension, et/ou contre une infection, contre le développement d’une maladie génétique.

Description

MOYENS DE CRIBLAGE POUR L'IDENTIFICATION DE REGULATEURS DE L'ACTIVITE GTPase
ARRIÈRE-PLAN TECHNOLOGIQUE
Les petites GTPases de la superfamille Ras (Ras, Rho, Rab, Arf et Ran) sont des acteurs majeurs de la régulation des cascades de la signalisation cellulaire. Leur rôle essentiel dans la régulation des cascades de signaux se traduit par leur implication dans de nombreux cancers et pathologies (Oxford et Theodorescu, 28 janvier 2003, Cancer Lett. 189(2) :117-128). Il existe chez l'homme 21 GTPases de la famille Rho. Elles régulent le remodelage du cytosquelette d'actine, contrôlant ainsi de nombreux phénomènes physiologiques comme la moφhologie, l'adhérence et la migration des cellules, la transcription des gènes, le trafic intracellulaire, le développement embryonnaire, l'apoptose ou la transformation (Etienne- Manneville et Hall, 12 décembre 2002, Nature 420(6916) :629-635)). Les GTPases Rho sont impliquées dans plusieurs cancers et pathologies chez l'homme (Boettner et Van Aelst, février 2002, Nat. Rev. Cancer 2(2) :133- 142 ; Sahai et Marshall, 20 mars 2002, Gène 286(2) :155-174). Les GTPases existent sous deux formes : une forme active liée au GTP, et une forme inactive liée au GDP. Liée au GTP, la GTPase interagit avec des protéines effectrices activant ainsi la cascade de signalisation en aval. Liée au GDP, la GTPase est incapable de lier ses effecteurs, et aucune cascade de signalisation n'est enclenchée. L'activation des GTPases est assurée par des protéines activatrices connues sous le nom de "Guanine nucleotide Exchange Factors" (GEF). Les GEF sont généralement des protéines de haut poids moléculaire, capables d'intégrer de nombreux signaux intra- ou extra-cellulaires. Par exemple, les protéines de la famille Dbl telles que LARG, TIAM, NAV, activent les GTPases de la famille Rho. Il existe environ une soixantaine de RhoGEF chez l'homme, caractérisés par un domaine DH ("Dbl Homology") d'environ deux cents acides aminés et responsable de l'activation spécifique d'une ou plusieurs GTPases. Ce sont des molécules généralement complexes comportant de nombreux domaines participant à la régulation de leur activité et à leur localisation (Hoffman et Cerione, 20 février 2002, FEBS Lett. 513(1) :85- 91). La dérégulation de l'activité de facteurs d'échange conduit à une signalisation anormale que l'on retrouve associée à des cancers et de nombreuses autres pathologies (Zheng, décembre 2001, Trends Biochem. Sci. 26(12) :724-732). Les différents membres de la famille Dbl, et notamment LARG, TIAM , VAV, sont ainsi connus pour leur potentiel transformant.
Les GTPases ont un large spectre d'expression dans les différents tissus, et participent à plusieurs cascades d'activation au sein d'une même cellule. Les facteurs d'échange présentent au contraire des profils d'expression plus spécifiques, et sont activés en réponse à des signaux définis par leur association avec des récepteurs particuliers dans la cellule. Les facteurs d'échange constituent donc des cibles de choix pour le développement de drogues, notamment anticancéreuses, présentant un spectre d'action restreint.
Bien que leur rôle dans la pathologie humaine soit depuis longtemps avéré, en particulier du fait de leurs propriétés oncogéniques comme dans le cas de la famille Dbl, il n'existe néanmoins à l'heure actuelle que deux composés connus pour inhiber l'activité de facteurs d'échange : - la Bréfeldine A, qui est un inhibiteur non compétitif des facteurs d'échange à domaine Sec7 activant les GTPases de la famille Arf (Chardin et MacCormick, 16 avril 1999, F. Cell 97(2) : 153-155), et qui présente l'inconvénient d'être peu spécifique et surtout de stabiliser le complexe GTPase-activateur, provoquant des effets multiples, et - TRIPalpha, un peptide inhibiteur spécifique du deuxième domaine d'échange de TRIO, un activateur de Rho A, qui est spécifique du facteur d'échange et n'a pas d'effet sur la GTPase elle-même (Schmidt et al., 14 juillet 2002, FEBS Lett. 523(1-3) :35-42).
Disposer d'autres composés inhibiteurs présenterait un intérêt majeur pour le développement de drogues utilisables chez les patients, pour lesquels il est nécessaire de limiter les effets pléïotropes indésirables.
Or, les méthodologies actuellement disponibles à cet effet sont assez limitées.
La méthodologie de l'art antérieur pour l'identification inhibiteur comprend la mise en œuvre d'un crible primaire qui consiste à identifier des composés capables de fixer la cible, par des mesures d'interaction en masse telles que le "phage display" (Scott et Smith, 1990, Science 249 :386-390), et le "double hybride" (Fields et Song, 1989, Nature 340 :245-246). Les composés positifs au crible primaire d'interaction sont alors ensuite analysés selon un crible secondaire pour leur capacité d'inhibition par des méthodes biochimiques sur des partenaires purifiés. Les composés positifs à l'issue du crible secondaire sont alors soumis à une analyse de confirmation fonctionnelle sur une lignée cellulaire, par suivi d'un changement phénotypique induit par exemple. Dans le cas des protéines activatrices des GTPases, l'activité enzymatique consiste à catalyser le remplacement du GDP de la GTPase cible par du GTP. Cette activité est alors déterminée biόchimiquement sur des partenaires purifiés, par exemple en mesurant le taux d'incorporation de GTP radiomarqué sous forme acido-précipitable, puis soumise à confirmation fonctionnelle par étude sur une étude lignée cellulaire, par exemple par suivi de la croissance de neurites induite par le facteur de croissance NGF sur la lignée cellulaire PC 12 transfectée. La première identification d'un inhibiteur de l'activité d'une protéine de la famille Dbl n'est pourtant que très récente (Schmidt et al, 2002, FEBS Lett. 523 :35-42). Il s'agit d'un peptide de 42 acides aminés (peptide TRIP), isolé en crible d'interaction de type "double hybride" contre la protéine TRIO, et validé biochimiquement pour sa capacité à inhiber l'activité enzymatique d'échange de TRIO sur sa GTPase cible. Cette méthodologie conduit néanmoins à de nombreux faux positifs issus de crible primaire, et l'identification d'un peptide à activité effectivement inhibitrice se révèle difficile. La contrainte principale pour l'isolement d'inhibiteurs d'une fonction enzymatique réside en effet dans la mise au point d'une méthode de détection rapide et fiable de cette activité. Outre le problème de reproductibilité de la qualité de lots de protéines purifiées et de la conservation de leur activité enzymatique, ce type de mesures est difficile à automatiser.
Un deuxième type de méthodologie a par ailleurs été décrit : cf. De Toledo et al, 2000, FEBS Lett. 480 :287-292 (« The yeast exchange assay, a new complementary method to screen for Dbl-like protein speciβcity : identification ofa novel RhoA exchange factor »). Dans cet article, la méthodologie est décrite comme permettant l'identification de protéines activatrices de GTPase (recherche de GEF), et non comme permettant d'identifier par criblage des composés inhibiteurs des protéines activatrices. La méthodologie est dérivée du système de levure "double hybride", dans lesquels les partenaires sont une GTPase Rho et un fragment effecteur. Ce test utilise une version sauvage de GTPase (non constitutionnellement activée) : en absence d'activation, la GTPase est majoritairement liée au GDP et n'interagit pas avec son effecteur. Aucune activité des gènes rapporteurs du "double hybride" n'est alors détectée. L'expression d'une protéine de la famille Dbl spécifique de la GTPase utilisée dans le test entraîne l'activation de celle-ci, et provoque l'interaction GTPase / effecteur. Une activité des gènes rapporteurs est alors détectée. Telle quelle, cette méthodologie est efficace pour déterminer de façon qualitative l'activité d'un facteur d'échange sur une GTPase. Ce système n'est cependant pas assez stable pour pouvoir être transposé à la recherche fiable d'inhibiteurs. Notamment, le taux des protéines exprimées à partir des plasmides n'est pas stable, et les activités mesurées fluctuent au cours du temps.
D'un point de vue industriel, l'utilisation d'une technique de criblage sur levure modifiée "double hybride" pose en outre des problèmes d'automatisation du procédé. En effet, cette technique de "double hybride" met en œuvre des gènes rapporteurs et des marqueurs de sélection dont les produits de transcription, qui sont synthétisés dans le milieu intracellulaire, doivent pouvoir avoir accès à leurs substrats respectifs. On utilise par exemple communément le gène LACZ (béta-galactosidase) comme gène rapporteur de l'activité double hybride testée : la béta-galactosidase produite par la levure doit alors pouvoir accéder à un substrat de type X-Gal. Pour ce faire, il est actuellement procédé par cassure des levures utilisées, par exemple par choc thermique ou mécanique. La technique de double hybride sur levure modifiée actuellement disponible dans l'état de l'art ne permet donc une automatisation aisée. Son utilisation en application industrielle en est d'autant limitée.
Il n'existe donc actuellement aucun procédé industriel permettant d'identifier de manière fiable des composés qui soient capables de réguler, et plus particulièrement d'inhiber, les protéines activatrices des GTPases, et notamment les protéines activatrices de la famille Dbl.
RÉSUMÉ DE L'INVENTION
La présente demande de brevet est relative à des moyens pour l'analyse de la régulation des voies d'activation des GTPases, qui sont spécialement adaptés à l'identification par criblage d'un composé capable d'exercer une activité inhibitrice sur une voie d'activation de GTPase (cf. principe illustré en Figure 1). Ces moyens comprennent une levure à forte perméabilité membranaire (ergβ) et au moins un système pour l'expression d'au moins une protéine hybride de type double hybride par cette levure, ou bien une levure et au moins un système pour l'expression d'au moins une protéine hybride de type double hybride intégré dans le génome de la levure, ou destiné à l'être. Ils permettent de s'affranchir de l'étape de lyse des levures à laquelle il faut procéder dans un test double hybride standard de l'art antérieur, pour donner aux produits des gènes rapporteurs du test accès à leurs substrats réactionnels (cf. Figure 5). Les réactifs et composés tests mis en œuvre peuvent être utilisés à des concentrations plus faibles, et donc moins toxiques et plus proches des conditions in vivo visées en application (thérapeutique), qu'ils ne le seraient en utilisant un test de double hybride classique. Ils permettent de s'affranchir des pressions de sélection qui sont classiquement appliquées en test double hydride standard pour maintenir l'expression des partenaires doubles hybrides dans la cellule de levure (cf. Figure 3). Les résultats obtenus avec les moyens selon l'invention sont ainsi plus fiables, et plus sensibles (cf. Figure 4). Enfin, les moyens sont entièrement automatisables, et permettent l'identification et la production de composés susceptibles de permettre de lutter contre une cellule tumorale, et/ou contre l'hypertension, et/ou contre une infection, contre le développement d'une maladie génétique.
DESCRIPTION DE L'INVENTION
La présente invention est relative à la régulation des voies d'activation des GTPases. Elle propose des moyens qui permettent d'identifier par criblage des composés qui présentent une activité régulatrice (stimulante ou inhibitrice) sur les protéines activatrices des petites GTPases. Les moyens selon l'invention permettent ainsi d'identifier des composés qui, du fait de leur activité régulatrice, sont d'excellents candidats thérapeutiques pour lutter contre les pathologies dans lesquelles l 'activation des petites GTPases doit être régulée. Il peut s'agir d'une activité stimulatrice ou bien d'une activité inhibitrice. Les composés à activité stimulatrice sont d'excellents candidats pour la prévention, la palliation, ou le traitement de pathologies pour lesquelles on souhaite stimuler l' activation des petites GTPases. Les composés à activité inhibitrice sont d'excellents candidats pour la prévention, la palliation, ou le traitement de pathologies pour lesquelles on souhaite inhiber l'activation des petites GTPases. C'est notamment le cas de l'hypertension, des maladies génétiques, des invasions par des pathogènes, et aussi de nombreux cancers, tels que les leucémies, le cancer de la prostate, le cancer du sein, les cancers généralisés par métastase ou en voie de l'être. La présente invention vise plus particulièrement des moyens de criblage qui permettent d'identifier des composés inhibiteurs des protéines activatrices des petites GTPases.
Les moyens selon l'invention comprennent des kits et méthodes pour l'analyse de la régulation des voies d'activation des GTPases (cf. Figure 1). Ces kits et méthodes peuvent notamment être appliqués à l'identification de composés qui ont la capacité d'exercer une activité régulatrice sur ces voies d'activation. De ce fait, ils trouvent directement application en tant que outils de recherche et développement. De par les composés régulateurs qu'ils permettent d'identifier, ils peuvent en outre donner accès à des applications médicales d'intérêt, et notamment pour la lutte contre les pathologies sus mentionnées.
La présente invention propose, selon un premier aspect, de combiner en synergie les fonctions de perméabilité d'une levure, aux fonctions d'analyse réactionnelle de réactifs de type double hybride. Les inventeurs démontrent en effet que cette combinaison est possible, à savoir que d'une part, les réactifs de type double hybride peuvent, sans perte ni biais, continuer à exercer les fonctions dans une cellule de levure à perméabilité accrue, et d'autre part la cellule de levure à perméabilité accrue reste tout à fait viable alors qu'on lui donne à exprimer une protéine hybride de type réactif double hybride. Qui plus est, le choix opéré par les inventeurs d'une telle combinaison de fonctions apporte une solution avantageuse au problème de l'automatisation du criblage sur levure modifiée en double hybride. En effet, comme indiqué ci-dessus, la technique de "double hybride" de l'art antérieur nécessite de lyser les levures utilisées dans le test, par exemple par choc thermique ou mécanique, de sorte à donner aux produits des gènes rapporteurs du test accès à leurs substrats réactionnels (par exemple, accès au X-Gal pour la béta-galactosidase). La technique de double hybride sur levure modifiée actuellement disponible dans l'état de l'art ne permet donc une automatisation aisée, et ses applications industrielles en sont d'autant limitées. La combinaison de fonctions "perméabilité + double hybride" pour laquelle les inventeurs ont opté permet quant à elle d'automatiser complètement le procédé : il n'est plus nécessaire de lyser les levures utilisées pour lire les résultats du test (cf. Figure 5). De ce fait, les moyens selon l'invention trouvent des applications industrielles auxquelles la technique de double hybride de l'art antérieur n'avait pas accès. En outre, comme, conformément à la présente invention, les substrats réactionnels pénètrent facilement dans la cellule de levure, on peut les utiliser en concentrations beaucoup plus faibles qu'ils ne le seraient en procédant par lyse cellulaire. Par ricochet, ceci permet d'utiliser des quantités également plus faibles de candidats régulateurs, et notamment des quantités plus faibles de candidats inhibiteurs. En résultante, outre le fait de s'affranchir de l'étape de lyse qui fait obstacle à l'automatisation et donc à l'application industrielle du procédé, la présente invention place la cellule de levure dans des conditions beaucoup moins toxiques qu'elle ne l'aurait été en suivant les techniques de l'art antérieur. Le système est ainsi plus facilement gérable, et, de manière particulièrement remarquable, l'inteφrétation des résultats atteint une sensibilité bien meilleure par rapport aux techniques de l'art antérieur.
Selon cet aspect, le kit selon l'invention (kit « premier aspect ») comprend ainsi au moins une levure à forte perméabilité mais néanmoins cellulairement viable, et au moins un système pour l'expression d'une protéine hybride par cette levure.
Ce kit peut se présenter sous la forme d'un kit « incoφoré » dans lequel ledit au moins un système d'expression est présent dans le milieu intracellulaire de la levure (sous forme simplement exprimée dans le cytoplasme, ou bien sous forme intégrée au génome de la levure). Alternativement, le kit selon l'invention peut se présenter sous la forme d'un « kit-of-parts » (forme juxtaposée formant une unité fonctionnelle), dans lequel ledit au moins un système d'expression de protéine hybride est présent extracellulairement, hors de la levure. Il peut alors être accompagné de moyens adaptés à sa conservation. De préférence, ledit au moins un système d'expression est alors accompagné de moyens adaptés à son transfert dans la cellule de levure. Il peut par exemple être porté par un vecteur d'expression ou d'intégration adapté à la transfection de la levure du kit, et à l'expression dans cette levure dudit au moins système d'expression. Ce vecteur juxtaposé peut alors se trouver lui-même inclus dans un environnement favorisant ou facilitant sa multiplication avant transfection dans la levure. Ledit vecteur juxtaposé peut par exemple se trouver inclus dans un microorganisme procaryote adapté à sa réplication.
Dans la présente demande, on donne à chaque terme la signification et la portée que lui donne la personne du métier. En particulier, le terme vecteur d'expression implique classiquement, dans la mesure où, comme dans la présente demande, il est destiné à transformer une cellule de levure et à y exprimer le système d'expression qu'il porte, que ce vecteur comprend généralement au moins une origine de réplication adapté à la réplication autonome de ce vecteur dans la levure, un marqueur de sélection pour détecter la transformation du vecteur d'expression dans la levure, et le système d'expression dont il est le vecteur. Un tel vecteur d'expression comprend en outre généralement des moyens pour sa réplication dans une cellule hôte autre que la levure, telle que par exemple une cellule procaryote de type Escherichia coli : on trouve donc communément dans un vecteur d'expression non-intégratif une origine de réplication procaryote, et un marqueur de sélection, tel qu'un fragment de résistance à un antibiotique (par exemple ampicilline). Le terme de vecteur d'intégration implique quant à lui que ce vecteur comprend des moyens permettant l'intégration de la séquence codante qu'il porte de manière opérationnelle dans le génome de la levure du kit. Comme il est destiné à une intégration génomique, un tel vecteur n'a pas besoin de présenter une origine de réplication de levure, mais il portera généralement une séquence qui permet l'intégration dans le génome de la levure, telle que par exemple une séquence présentant une homologie avec un locus chromosomique de la cellule hôte suffisante pour permettre une recombinaison. Le système d'expression porté par ce type de vecteur est, dans le cadre de la présente invention, destiné à exprimer une protéine dans la levure du kit. Il comprend donc généralement un promoteur de levure, un site de démarrage de la traduction, un séquence codante et un signal de terminaison de transcription. Des exemples de vecteurs comprennent notamment les plasmides.
Optionnellement, le kit selon l'invention peut également comprendre un support solide et/ou un milieu liquide et/ou un milieu gélifié, de manière à faciliter la manipulation et/ou le stockage de la levure.
Dans le kit selon l'invention, on choisit une levure qui a une forte perméabilité membranaire, mais qui a conservé une intégrité membranaire suffisante pour être cellulairement viable. Les levures communément disponibles, et dont la manipulation n'impose aucune contrainte particulière, telles que S. cerevisiae ou C. albicans, n'ont en général pas à leur état natif une forte perméabilité membranaire. Il s'agira donc généralement d'une levure qui a été modifiée de sorte à augmenter sa perméabilité plasmique initiale, tout en veillant à conserver une intégrité cellulaire suffisante pour que la cellule de levure reste viable en culture in vitro. Conformément à la présente invention, un moyen proposé pour aboutir à ce résultat est d'altérer la biosynthèse d'un composé de la membrane plasmique dont la présence n'est pas indispensable à la viabilité de la cellule de levure. Comme il s'agit d'augmenter la perméabilité membranaire, sans pour autant détruire l'intégrité cellulaire, il convient de n'altérer la biosynthèse que de certains de ces composés, et non de tous. La personne du métier peut procéder par essai et erreur en fonction de la cellule de levure choisie, jusqu'à identifier un composé dont la biosynthèse peut être altérée sans que ne soit pour autant perdue la viabilité cellulaire nécessaire. Parmi les composés envisageables, les stérols en général, et les ergostérols en particuliers, tels que Erg6, Erg2, Erg3, Erg4, sont des candidats de choix. De manière avantageuse, on pourra choisir de n'altérer que la biosynthèse de la protéine Erg6, étant donné que l'altération de la biosynthèse de cette seule protéine suffit à augmenter très significativement la perméabilité de la membrane plasmique, et que la viabilité cellulaire de la levure ainsi modifiée ne s'en trouve quant à elle pas significativement perturbée.
Pour altérer la biosynthèse d'un composé donné, la personne du métier peut procéder selon toute technique adaptée à cet effet. Il peut par exemple être procédé en mutant le gène qui, dans la levure, code le composé concerné, de sorte que ce gène conduise à la synthèse d'une forme non fonctionnelle du composé. Alternativement, il peut être procédé en introduisant dans la levure un composé qui transforme le composé concerné d'une forme fonctionnelle sous une forme non fonctionnelle. Dans le cadre de la présente invention, une technique simple et efficace comprend la suppression, ou à tout le moins l'inhibition substantielle, de la transcription et/ou traduction du gène codant le composé concerné. Avantageusement, on procédera par délétion du gène concerné. Un mode préféré de réalisation de la présente invention comprend donc une levure, telle que S. cerevisiae ou C. albicans, qui ne dispose pas de copie fonctionnelle du gène ERG6, du fait par exemple d'une délétion de ce gène. On peut choisir une souche de levure haploïde, ou bien une souche de levure diploïde. Si l'on choisit une souche diploïde, il est préférable que les deux copies du gène ERG6 soient non fonctionnelles.
Le kit selon l'invention comprend également, en outre de la levure, au moins un système pour l'expression d'une protéine hybride par cette levure. Comme indiqué ci-dessus, ce système d'expression peut se trouver dans le milieu intracellulaire de la levure (kit « incoφoré »), ou bien être placé en juxtaposition hors de la levure (« kit-of-parts »). La protéine hybride exprimée par ce système comprend deux composants (en fusion directe ou indirecte), à savoir un composant "réactif de la voie des GTPases", et un composant "réactif de double hybride". Le composant "réactif de la voie des GTPases" est sélectionné parmi le groupe constitué par les GTPases, les effecteurs de GTPase, et les fragments de ces produits qui ont conservé une fonction de GTPase ou d'effecteur de GTPase. Le composant "réactif de double hybride" est sélectionné parmi le groupe constitué par les domaines de liaison à l'ADN et les domaines d'activation des activateurs de transcription opérationnels dans ladite levure.
La présente demande vise donc plus particulièrement un kit pour l'analyse de la régulation des voies d'activation des GTPases, caractérisé en ce qu'il comprend :
- au moins une levure, et
- au moins un système pour l'expression d'au moins une protéine hybride par cette levure,
- et, éventuellement, un support solide et/ou un milieu liquide et/ou un milieu gélifié, ladite levure présentant une expression altérée de la protéine Erg6, de sorte que la membrane plasmique de cette levure soit essentiellement dépourvue de protéine Erg6, et ladite protéine hybride comprenant deux composants (en fusion directe ou indirecte), à savoir un composant "réactif de la voie des GTPases", et un composant "réactif de double hybride", i. le composant "réactif de la voie des GTPases" étant sélectionné parmi le groupe constitué par les GTPases, les effecteurs de GTPase, et les fragments de ces produits qui ont conservé une fonction de GTPase ou d'effecteur de GTPase, et ii. le composant "réactif de double hybride" étant sélectionné parmi le groupe constitué par les domaines de liaison à l'ADN et les domaines d'activation des activateurs de transcription opérationnels dans ladite levure.
Ledit au moins un système d'expression d'au moins une protéine hybride peut être présent dans le kit à l'extérieur de la levure, sous forme juxtaposée formant une unité fonctionnelle. Il peut par exemple être inséré dans un vecteur d'expression adapté à l'expression intracellulaire de la protéine hybride dans ladite levure. Très préférentiellement, ledit au moins un système d'expression d'au moins une protéine hybride sera en fait intégré dans le génome de la levure, ou destiné à l'être. Ce mode de réalisation assure un niveau quantitatif de précision au procédé : l'utilisateur sait que la levure ne contient alors qu'une copie du système d'expression par cellule (cf. Figure 4, graphe de droite), qu'il n'est pas nécessaire d'imposer une pression de sélection pour assurer le maintien de ce système dans la levure (cf. Figure 3), et les activités mesurées seront stables et reproductibles. La présente demande vise donc un kit dans lequel ledit au moins un système d'expression d'au moins une protéine hybride est intégré dans le génome de ladite levure, ou est inséré dans un vecteur d'intégration adapté à l'intégration de ce système d'expression dans le génome de ladite levure. Des exemples de vecteurs d'intégration adaptés comprennent les vecteurs qui portent au moins une séquence permettant l'intégration dans le génome (par exemple, par recombinaison homologue).
Selon un deuxième aspect de l'invention, la présente demande de brevet vise également un kit (kit « deuxième aspect ») pour l'analyse de la régulation des voies d'activation des GTPases, dans lequel une levure de type double hybride ou destinée à être utilisée en double hybride est présente, et dans laquelle le ou les systèmes d'expression de la ou des protéine(s) hybride(s) du test double hybride sont intégré(s) dans le génome de cette levure, ou à tout le moins destiné(s) à l'être. La présente invention propose donc également un kit, caractérisé en ce qu'il comprend :
- au moins une levure, et
- au moins un système pour l'expression d'au moins une protéine hybride dans cette levure,
- et, éventuellement, un support solide et/ou un milieu liquide et/ou un milieu gélifié, ladite protéine hybride comprenant deux composants (en fusion directe ou indirecte), à savoir un composant "réactif de la voie des GTPases", et un composant "réactif de double hybride", i. le composant "réactif de la voie des GTPases" étant sélectionné parmi le groupe constitué par les GTPases, les effecteurs de GTPase, et les fragments de ces produits qui ont conservé une fonction de GTPase ou d'effecteur de GTPase, et ii. le composant "réactif de double hybride" étant sélectionné parmi le groupe constitué par les domaines de liaison à l'ADN et les domaines d'activation des activateurs de transcription opérationnels dans ladite levure, et ledit au moins un système d'expression étant soit intégré dans le génome de ladite cellule eucaryote, soit porté par un vecteur d'intégration génomique adapté à l'intégration de ce système dans le génome de ladite cellule eucaryote. Préférentiellement, comme ci-dessus indiqué, la levure de ce kit présente une forte perméabilité membranaire, tout en ayant conservé une intégrité cellulaire suffisante pour avoir la capacité à rester viable en culture in vitro. Très préférentiellement, la levure de ce kit présente une expression altérée de la protéine Erg6, de sorte que la membrane plasmique de cette levure soit essentiellement dépourvue de protéine Erg6.
Un kit selon l'invention comprendra généralement, ou sera destiné à comprendre, au moins un système pour l'expression d'au moins deux protéines hybrides différentes : - l'une comportant une GTPase, à titre de composant "réactif de la voie des GTPases", et - l'autre comportant un effecteur de cette GTPase, à titre de composant "réactif de la voie des GTPases", le composant "réactif de double hybride" de chacune des deux protéines hybrides étant pour l'une le domaine de liaison à l'ADN, et pour l'autre le domaine d'activation, ou inversement, d'un même activateur de transcription eucaryote. Généralement, il y aura deux systèmes d'expression distincts, un pour chacune des deux protéines hybrides.
N'importe quelle GTPase ou molécule ayant une fonction de GTPase peut être choisie pour le kit selon l'invention. En perspective des applications médicales visées, on choisit de préférence une GTPase de mammifère, plus préférentiellement un GTPase que l'on trouve exprimée chez l'être humain. Il peut par exemple s'agir d'une petite GTPase de la superfamille Ras, telle que Ras, Rho, Rab, Arf ou Ran (cf. Ridley 1999, Prog. Mol. Subcell. Biol. 22, 1-22 ; Fort 1999, Prog. Mol. Subcell. Biol. 22, 159-181). On connaît au moins 18 protéines de la famille Rho mammifère : Rho (A, B et C), Rac (1, 2 et 3), Cdc42, RhoD, RhoG, RhoH/TTF, TC10, et Rnd (1, 2 et 3), TCL, Wrch, Chp, Rif. Il existe également des mutants dominants actifs de GTPase (DA- GTPase), qui sont constitutionnellement activés, et qui n'ont pas pas besoin de la présence d'un facteur d'échange GEF pour se lier à leur effecteur. Dans le cadre de la présente invention, en perspective des applications médicales visées, on préférera néanmoins une GTPase non constitutionnellement activée, telle qu'une GTPase de type sauvage, de manière à être plus proche des cycles suivis in vivo pour l' activation des GTPases. Le kit selon l'invention permet en effet, comme cela sera décrit ci-après, d'introduire la présence efficace d'un GEF.
Les effecteurs de GTPase sont eux aussi bien connus de la personne du métier. On peut par exemple citer ROCK (aussi connu sous le nom de ROCKalpha et ROCKbeta) qui est un effecteur de RhoA ; N-WASP et PAK qui sont des effecteurs de Rac et Cdc42 ; PAK1 qui est un effecteur de Cdc42Hs ; la kinectine, qui est un effecteur de Racl et RhoG (cf. Vignal et al. 2001, "Kinectin is a key effector of RhoG microtubule-dependent cellular activity", Mol. Cell Biol. 21, 8022-8034 ; Daniels et al. 1998, "Membrane targeting of p21 -activated kinase 1 (PAK1) induces neurite outgrowthfrom PCI 2 cells", EMBO J. 17, 754-764 ; Obermeier et al 1998, "PAK promûtes morphological changes by acting upstream ofRac", EMBO J. 17, 4327^1339).
Tout activateur de transcription eucaryote est a priori adapté à la mise en œuvre d'un kit selon l'invention. On pourra notamment choisir n'importe quel activateur de transcription eucaryote classiquement utilisé en test double hybride, puis fusionner son domaine d'activation sur l'une des deux protéines hybrides et son domaine de liaison à l'ADN sur l'autre des deux protéines hybrides. Par exemple, on peut utiliser les domaines de l' activateur de transcription eucaryote GAL4, à savoir le domaine d'activation GAD, et le domaine de liaison à l'ADN LexA.
Préférentiellement et avantageusement, ledit au moins un système ou, le cas échéant chacun desdits systèmes, pour l'expression de chacune desdites au moins deux protéines hybrides est intégré dans le génome de ladite cellule eucaryote, ou est destiné à l'être. Pour faciliter la détermination de l'état d'activation ou de non- activation de la GTPase portée par l'une des deux protéines hybrides, ladite levure peut en outre comprendre au moins un gène rapporteur dont la. transcription peut être activée par un complexe formé, directement ou indirectement, par le domaine de liaison à l'ADN et, respectivement, le domaine d'activation des desdites au moins deux protéines hybrides. La levure présente dans un kit selon l'invention comprendra donc alors, préférentiellement sous forme intégré dans son génome, un gène rapporteur tel que par exemple lacZ (béta-galactosidase) dont la transcription est activée par l' activateur de transcription eucaryote GAL4.
Afin d'éliminer les éventuels faux positifs avec certitude, on préférera introduire en outre un deuxième gène rapporteur ou un marqueur de sélection, par exemple en créant une auxotrophie de la levure pour un élément donné (par exemple, auxotrophie pour l'histidine) et en apportant conjointement ou parallèlement à l'un des systèmes d'expression de protéines hybrides, le gène qui code l'élément pour laquelle la levure est auxotrophe, de sorte que sur un milieu de culture dépourvu de cet élément, seules les levures effectivement transformées pourront survivre.
Un kit selon l'invention pourra en outre comprendre une protéine GEF activatrice (ou facteur d'échange) de ladite GTPase, ou un fragment d'une telle protéine GEF qui a conservé une fonction activatrice vis-à-vis de ladite GTPase, ou un système pour l'expression de cette protéine GEF ou fragment dans ladite levure. Cette protéine GEF ou fragment peut optionnellement être sous la forme d'une protéine étiquetée ("tagged"), par exemple une étiquette myc ou HA. Le système d'expression de cette protéine GEF ou fragment de GEF peut être présent dans le milieu intracellulaire de la levure, ou être présent hors de la cellule de levure ; il peut être porté par un vecteur d'expression adapté à l'expression de ce système GEF ou fragment de GEF dans ladite levure, ou bien être porté par un vecteur d'intégration adapté à l'intégration de ce système dans le génome de ladite levure. Préférentiellement, le système d'expression GEF ou fragment de GEF est intégré dans le génome de ladite levure, ou est destiné à l'être. Un mode préféré de réalisation de la présente invention correspond au mode où les trois systèmes d'expression "réactif de la voie des GTPases" + "réactif de double hybride" + "GEF ou fragment de GEF" sont intégrés au génome de ladite levure, ou sont destinés à l'être. Alternativement, un kit selon l'invention peut laisser à son utilisateur le choix de la protéine GEF ou fragment qu'il souhaite faire participer au test. Dans ce cas, un kit selon l'invention pourra comprendre un vecteur d'expression vide, c'est-à-dire ne portant pas de cassette d'expression GEF ou fragment de GEF, mais qui est adapté à recevoir une telle cassette d'expression et à l'exprimer dans ladite levure. Avantageusement, on choisira un vecteur qui sera un vecteur d'intégration dans le génome de ladite levure, de sorte que la cassette d'expression GEF ou fragment de GEF que l'utilisateur lui insérera puisse être intégrée dans le génome de ladite levure. Un tel vecteur d'intégration « vide » comprend donc par exemple un site de clonage au niveau duquel peut être insérée une cassette d'expression protéique, tel qu'un site de clonage multiple, et au moins une séquence qui permet l'intégration dans le génome (par recombinaison homologue par exemple). Ce mode de réalisation alternatif est un autre mode de réalisation préféré de l'invention.
Les facteurs d'échange de GTPase (ou protéine activatrice, ou GEF) sont eux connus de la personne du métier. On peut par exemple citer les protéines de la famille Dbl, telles que LARG, TIAM, VAV, qui activent les GTPases de la famille Rho. Tiam-1 est ainsi connu pour être un GEF de Racl, et αPIX pour être un effecteur de Cdc42Hs (cf. Michiels et al 1997, Cell Biol. 137 387-398 ; Manser ét al 1998, Mol. Cell 1 :183-192). Le peptide TRIO est également un Rho-GEF, il contient deux domaines Rho-GEF de spécificités différentes : le premier domaine, Trio- GEFD1, active la voie Rac via RhoG, et le second domaine, Trio-GEFD2, agit spécifiquement sur RhoA (cf. Debant et al. 1996, Proc. Nafl. Acad. Sci. USA 93 :5466-5471 ; Blangy et al. 2000, J. Cell Sci. 113 :729-739). On peut donc choisir de mettre en œuvre un fragment de GEF qui a conservé une fonction de GEF, tel que par exemple Trio-GEFDl, ou Trio- GEFD2 (cf. Schmidt et al. 2002, FEBS Lett. 523 :35-42 ; De Toledo et al. 2000, FEBS Lett. 480 :287-292).
Un kit d'analyse selon l'invention est spécialement adapté à l'identification par criblage d'un composé qui présente une activité régulatrice sur les voies d'activation GTPase présentes dans ladite levure. Un tel composé peut être un composé peptidique ou protéique, tel que le peptide inhibiteur TRIPalpha décrit dans Schmidt et al. 2002, FEBS Lett. 523 :35-42 ; séquence de TRIPalpha
ASEGADGAICGYNLATLVMLGPSERVFCPLCEPCSSDIYELM). Dans ce cas, un kit selon l'invention peut en outre comprendre au moins un vecteur d'expression eucaryote, adapté à recevoir un système d'expression d'un composé peptidique ou polypeptidique dont on voudrait tester l'influence sur l'activation des GTPases, et adapté à exprimer ce système d'expression dans ladite levure. L'intégration dans le génome du système d'expression de ce composé peptidique ou protéique n'est ici pas particulièrement nécessaire ou recherchée : une expression cytoplasmique suffit, et peut même être préférable si l'on souhaite tester non pas un composé peptidique ou protéique, mais une pluralité de tels composés. Un kit selon l'invention peut en effet en outre comprendre une banque de vecteurs d'expression eucaryote, chacun adapté à l'expression, dans ladite levure, d'un composé peptidique ou polypeptidique candidat, dont on voudrait tester l'influence sur l'activation des GTPases. Un composé qui présente une activité régulatrice sur les voies d'activation GTPase présentes dans ladite levure peut par ailleurs être un composé non purement peptide et non purement protéique : il peut par exemple s'agir d'un composé issu d'une chimiothèque, tel que la Bréfeldine A (1,6,7,8,9,1 la,12,13,14,14a-Décahydro-l, 13-dihydroxy-6-méthyl-4H- cyclopent[fJoxacyclotridécin-4-one ; CAS Number CAS[20350-16-6] ; Merck Index 1996, 12 :,1393 ; commercialisée par exemple par A.G. Scientific, Inc.). Un kit selon l'invention peut donc en outre comprendre une chimiothèque de composés candidats, dont on voudrait tester l'influence sur l'activation des GTPases.
Au vu de la description faite ci-dessus, il sera compris que la présente demande vise également tout kit spécialement adapté à l'expression d'au moins une protéine hybride, telle que précédemment définie, dans la levure d'un kit d'analyse selon l'invention. Un tel kit comprend au moins un vecteur d'intégration :
- qui comporte en insert un système d'expression de ladite au moins une protéine hybride, laquelle protéine hybride comprend deux composants : i. l'un étant sélectionné parmi le groupe des "réactifs de la voie des GTPases" constitué par les GTPases, les effecteurs de GTPase, et les fragments de ces produits qui ont conservé une fonction de GTPase ou d'effecteur de GTPase, et ii. l'autre parmi le groupe des "réactifs de double hybride" constitué par les domaines de liaison à l'ADN des activateurs de transcription eucaryote, et les domaines d'activation des activateurs de transcription eucaryote, et
- qui comporte une région présentant une homologie avec un locus chromosomique de ladite cellule eucaryote suffisante pour permettre une recombinaison dudit système d'expression dans le génome de cette cellule eucaryote.
La présente demande comprend bien entendu dans sa portée toute utilisation d'un kit selon l'invention (qu'il s'agisse d'un kit ci-dessus décrit en « premier aspect », ou d'un kit décrit ci-dessus en « deuxième aspect »), pour l'identification d'un composé capable d'exercer une activité régulatrice, et plus particulièrement inhibitrice, sur une voie d'activation de GTPase, et/ou pour l'identification d'un composé permettant de lutter contre une cellule tumorale, contre l'hypertension, contre une infection, contre le développement d'une maladie génétique. Ledit kit peut donc également comprendre des instructions pour une telle utilisation.
La présente demande vise ainsi tout procédé pour l'identification d'un composé capable d'exercer une activité régulatrice, et plus particulièrement inhibitrice, sur une voie d'activation GTPase, qui met en œuvre un kit selon l'invention (qu'il s'agisse d'un kit ci-dessus décrit en « premier aspect », ou d'un kit décrit ci-dessus en « deuxième aspect »). Plus particulièrement, la présente demande vise un procédé automatisable pour l'identification d'un composé capable d'exercer une activité régulatrice, et plus particulièrement inhibitrice, sur une voie d'activation GTPase, caractérisé en ce que :
- on fournit une levure issue d'un kit selon l'invention (kit ci-dessus décrit en « premier aspect »), laquelle levure présentant une expression altérée de la protéine Erg6, de sorte que la membrane plasmique de cette levure soit essentiellement dépourvue de protéine Erg6, et laquelle levure comprenant au moins deux protéines hybrides, telles que précédemment définies,
- si nécessaire, on active la GTPase qui est portée par l'une des deux protéines hybrides mentionnées à l'étape précédente, de sorte que cette GTPase soit capable de se lier à son effecteur qui est porté par l'autre des deux protéines hybrides mentionnées à l'étape précédente,
- on confronte le composé régulateur (le cas échéant, inhibiteur) candidat au milieu intracellulaire de cette levure,
- on détermine si ce composé candidat induit une régulation, et plus particulièrement une inhibition, de l'activation GTPasique, et le cas échéant, on identifie ce composé candidat comme étant un composé capable d'exercer une activité régulatrice (et plus particulièrement inhibitrice) sur une voie d'activation GTPase. Ce procédé conforme à la présente invention présente l'avantage notable de d'être facilement entièrement automatisable, et est donc directement à l'échelle industrielle. La présente demande vise également un procédé automatisable pour l'identification d'un composé capable d'exercer une activité régulatrice, et plus particulièrement inhibitrice, sur une voie d'activation GTPase, caractérisé en ce que :
- on fournit une levure qui comprend, intégrés dans son génome, au moins deux protéines hybrides, telles que ci-dessus définies,
- si nécessaire, on active la GTPase qui est portée par l'une des deux protéines hybrides mentionnées à l'étape précédente, de sorte que cette GTPase soit capable de se lier à son effecteur qui est porté par l'autre des deux protéines hybrides mentionnées à l'étape précédente,
- on confronte le composé régulateur (le cas échéant, inhibiteur) candidat au milieu intracellulaire de cette levure,
- on détermine si ce composé candidat induit une régulation, et plus particulièrement une inhibition, de l'activation GTPasique, et le cas échéant, on identifie ce composé candidat comme étant un composé capable d'exercer une activité régulatrice (et plus particulièrement inhibitrice) sur une voie d'activation GTPase.
Un moyen simple et efficace de déterminer si cette régulation, et plus particulièrement cette inhibition, de l'activation GTPasique, a lieu est d'utiliser une levure qui est comme définie dans la présente demande, et qui comporte en outre au moins un gène rapporteur dont la transcription est activée par le rapprochement du domaine d'activation et du domaine de liaison à l'ADN portés par chacune desdites deux protéines hydrides.
Ces procédés permettent d'identifier, notamment par criblage de composés peptidiques ou protéiques,et/ ou de composés issus de chimiothèques, des composés qui présentent une activité inhibitrice telle qu'ils peuvent être utilisés pour la fabrication de médicaments destinés à lutter contre des cancers (leucémie, cancer de la prostate, cancer du sein, cancer généralisé par métastase ou en voie de l'être), et/ou contre l'hypertension, et/ou contre une infection, et/ou contre le développement d'une maladie génétique.
La présente demande vise aussi un procédé pour la fabrication d'un composé susceptible de permettre de lutter contre une cellule tumorale, et/ou contre l'hypertension, et/ou contre une infection, contre le développement d'une maladie génétique, caractérisé en ce que :
- l'on identifie un composé capable d'exercer une activité inhibitrice sur une voie d'activation GTPase, à l'aide d'un procédé selon l'invention,
- l'on synthétise et/ou isole ce composé, et optionnellement on le place en présence de véhicules pharmaceutiquement acceptables.
Les exemples qui suivent sont donnés à titre illustratif : ils ne sont en aucun cas limitatifs. La personne du métier pourra en effet, à partir de ces illustrations, mettre en œuvre des variantes rendues directement accessibles par cette divulgation.
Dans ces exemples, il fait référence aux figures suivantes : - Figure 1 : illustration du principe de l'inhibition de la réaction d'échange reconstituée dans la levure, - Figure 2 : illustration du principe de construction d'un vecteur pour l'expression de peptides inhibiteurs, - Figure 3 : illustration de la stabilité comparée en l'absence de pression de sélection de la cassette d'expression de RhoA portée par un plasmide ou intégrée dans le génome de la levure, - Figure 4 : illustration de l'activation de la GTPase RhoG par le facteur d'échange Trio-GEFl dans une souche de levure où les trois partenaires sont portés par des plasmides ou intégrés dans le génome, - Figure 5 : visualisation directe de l'activation de la GTPase par hydrolyse du X-Gal après pénétration dans les levures délétées du gène ERG6 (sans lyse), - Figure 6 : séquence du plasmide pRS422-MT3 (SEQ ID NO :1 ; Genbank U93719). EXEMPLES
MATERIEL ET METHODES :
Vecteurs d'expression et souche de levure :
Comme souche de levure, on peut par exemple utiliser : une souche de Saccharomyces cerevisiae de génotype MATa, his3 leu2 trpl ade2 LYS2: :lex(op)-HIS3 ura3::lex(op)-LacZ) telle que TAT7, ou une souche de Saccharomyces cerevisiae de génotype MATa his3D200 trpl-901 leu2-3112 ade2 LYS2::(4lexAop-HIS3) URA3::(8lexAop-lacZ GAL4, telle que la souche L40 commercialisée par la société Invitrogen sous la référence C830-00 (http://www.invitrogen.coml. ou une souche de Saccharomyces cerevisiae de génotype MATa his3delta200 trpl-901 leu2-3,112 ade2 LYS2::(lexAop)4-HIS3 URA3::(lexAop)8-lacZ GAL4, telle que la souche DSY1 commercialisée par Dual System Biotech (http://www.dsbiotech.ch) sous la référence S 101001 - 1 , ou une souche de Saccharomyces cerevisiae de génotype MATalphahis3delta200 trpl-901 leu2-3,112 ade2 LYS2::(lexAop)4- HIS3 URA3::(lexAop)8-lacZ GAL4, telle que la souche DSY-2 commercialisée par Dual System Biotech (http://www.dsbiotech.ch) sous la référence S 101002-1.
Les techniques de transformation et de sélection ont été décrites précédemment (De Toledo et al. 2000, FEBS Lett. 480 :287-292).
Les vecteurs d'expression pour les GTPases (pLexRhoA, pLexRhoC et pLexRhoG), les effecteurs (kinectine et ROCK) et les facteurs d'échange
(TRIO GEF1 et GEF2) ont été décrits précédemment (De Toledo et al.
2000, FEBS Lett. 480 :287-292 ; De Toledo et al. 2001, Oncogene
20 :7307-7317). Le vecteur pRS422MT3 a été obtenu en insérant le promoteur MET25 suivi de la séquence du tag myc et d'un site multiple de clonage dans le vecteur pRS422 (référence Genbank U93719). Il confère à la levure l'auxotrophie pour l'adénine. La séquence est fournie en Figure 6 (SEQ ID NO :1).
Le vecteur d'expression codant pour le peptide TRIP1 (figure 2) a été obtenu en insérant le fragment EcoRl-Notl du plasmide pEG202-
TRIAPalpha, le peptide inhibiteur de TRIO-GEF2 isolé du crible 2 hybride, dans le vecteur pRS422MT3 digéré par EcoRl-Notl (Schmidt et al. 2002,
FEBS Lett. 523 :35-42).
Les vecteurs d'intégration pour Lex- RhoG et RhoA (YIPRhoA et
YIPRhoG) ont été obtenus en insérant les fragments Sphl de pLexRhoA et pLexRhoG dans le vecteur YIplac204 digéré par Sphl (référence GenBank
X754611.
Le vecteur d'intégration pour la kinectine a été obtenu par délétion de l'origine de réplication du vecteur pGADkin66.
Le vecteur d'intégration pour TRIO-GEF1 a été obtenu en insérant le fragment (BssHl-Xhol) de pRSmycTRIODl (De Toledo et al. 2000, FEBS
Lett. 480 :287-292) dans le vecteur Yiplac211 (référence GenBank X75462) digéré par Smal-Sall.
Dosage de l'activité béta-galactosidase :
L'activité béta-galactosidase a été détectée par hydrolyse du X-gal ou de l'ONPG comme décrit précédemment (De Toledo et al. 2000, FEBS Lett. 480 :287-292).
Dans le cas des levures perméabilisées, les levures ont été mises à pousser sur des boîtes de culture additionnées de 100 μl de X-gal (20 mg/ml dans du diméthyl formamide) et laissées à pousser 48 à 72 heures à 30°C. La coloration bleue des levures, témoin de la synthèse de béta-galactosidase, est visualisée directement sur la boîte. Stabilité des plasmides :
Les levures sont mises à pousser dans du milieu riche YPD pendant 0 à 100 générations. Au temps indiqué, les levures sont diluées dans de l'eau et la même quantité de levure est étalée en parallèle sur milieu riche et sur milieu sélectif et laissée à pousser 48 à 72 heures à 30°C.
Délétion du gène ERG6 :
La délétion du gène ERG6 a été réalisée dans la souche de levure TAT7. Le fragment utilisé pour la délétion à été amplifié par PCR à partir d'ADN génomique de la souche YML008C délétée du gène ERG6 par insertion d'une cassette de résistance à la kanamycine (http://www- sequence.stanford.edu/group/yeast deletion proiect 1 à l'aide des oligonucléotides suivants :
UPERG6 :
5 '-GCTGTTGCCGATAACTTCTTCATTGC-3 ' (SEQ ID NO :2)
DOWNERG6 :
5'-CTGATAGAAAATACTGGTCGTTTGCCACG-3' (SEQ ID NO :3)
à l'aide de la Taq DNA polymerase Platinium High Fidelity (Invitrogen). 5 μg de fragment purifié ont ensuite été introduits dans les levures d'intérêt par transformation au LiCl (De Toledo et al. 2000, FEBS Lett. 480 :287- 292), et les transformants ont été sélectionnés sur boîte de culture contenant 200 μg/ml de G418.
L'insertion de la cassette de résistance à la kanamycine dans le gène ERG6 par recombinaison homologue est ensuite vérifiée par amplification par PCR de l'ADN génomique des levures à l'aide des oligonucléotides :
UPUPERG6 :
5 '-CGAAGATTGGTGAGAAACCTC-3 ' (SEQ ID NO :4), DWNDWNERG6 :
5'-GTCAATACGTTTGTATGCAGTG-3 ' (SEQ ID NO :5),
situés en amont et en aval de UPERG6 et DOWNERG6 respectivement.
RESULTATS :
1- Elaboration d'un crible pour identifier des inhibiteurs spécifiques l'activité d'un facteur d'échange cible :
Afin de vérifier que l'on pouvait reproduire l'inhibition spécifique de TRIO- GEF2 par le peptide TRIPalpha (Schmidt et al. 2002, FEBS Lett. 523 :35- 42) dans le test YEA (Yeast Exchange Assay), des levures : exprimant LexRhoC fusionné à LexA-DBD, exprimant son effecteur ROCK fusionné à GAL4-AD, contenant le vecteur pRs426Met vide ou bien exprimant les facteurs d'échange de RhoA et RhoC : TRIO-GEF2 ou GEF337 (De Toledo et al. 2000, FEBS Lett. 480 :287-292), ont été transformées avec le vecteur pRS422MT3 exprimant ou non le peptide inhibiteur (Figure 2). Les levures ont été ré-isolées sur un filtre de nylon déposé sur une boîte de milieu de culture et mises à pousser pendant 72 heures à 30°C. Les levures ont ensuite été cassées par un choc thermique en plongeant le filtre dans un bain d'azote liquide. L'activité béta- galactosidase a ensuite été révélée en incubant à 37°C le filtre de nylon sur un papier absorbant imbibé de X-gal.
En présence de facteur d'échange et en l'absence d'inhibiteur (isolats 1 à 3), on observe la production de béta-galactosidase, témoin de l'activation de RhoC par TRIO-GEF2 et GEF337 (isolats 2 et 3) ; en l'absence de facteur d'échange, RhoC n'est pas activée (isolât 1). Dans les levures exprimant TRIPalpha (isolats 4 à 6), on observe spécifiquement l'inhibition de TRIO- GEF2 (isolât 4) alors que l'activation de RhoC par GEF337 n'est pas affectée (isolât 5). Cette méthodologie permet de reproduire l'inhibition d'un facteur d'échange et la spécificité de l'inhibiteur. 2- Elaboration de souches de levure génétiquement modifiées pour réaliser les cribles :
Pour stabiliser l'expression de la GTPase RhoA, le vecteur d'intégration YIPRhoA a été inséré par recombinaison homologue dans le gène TRP1 du génome de la levure TAT7. Les levures transformées avec un plasmide réplicatif ou intégratif exprimant Lex-RhoA et le gène d'auxotrophie pour le tryptophane TRP1 ont été mises en croissance sur un milieu riche non sélectif pendant 0, 50 et 100 générations à 30°C. Les populations de levures ont ensuite été diluées et la même quantité de levure a été étalée sur milieu riche et sur milieu dépourvu de tryptophane.
On constate qu'en l'absence de pression de sélection, le plasmide réplicatif est rapidement perdu : dès 50 générations, on observe une importante proportion de levures ayant perdu l' auxotrophie pour le tryptophane et après 100 générations toutes les levures l'ont perdue (figure 3, comparer les étalements sur milieu complet et milieu de sélection pour la même dilution). En revanche dans les levures ayant intégré les transgènes, l'auxotrophie pour le tryptophane est stable même en l'absence de pression de sélection (comparer plasmide et intégrée pour le même nombre de générations en milieu non sélectif). On observe une stabilisation de l'expression du transgène indépendamment de l'application d'une pression de sélection. La GTPase RhoG, son effecteur : la kinectine et son facteur d'échange : TRIO-GEF1 sont intégrés ou présents sous forme de plasmide dans la levure.
Les protéines totales sont ensuite extraites par cassure mécanique des levures et l'activité béta-galactosidase est mesurée en suivant l'hydrolyse de son substrat, l'ONPG, au cours du temps (figure 4). Les activités sont dosées sur 0,5 μg d'extrait protéique dans le cas de plasmides et 50 μg dans le cas de transgènes intégrés. Dans les deux cas, on observe une augmentation significative de l'activité béta-galactosidase dans les extraits en présence du facteur d'échange. L'activité est moins importante dans les levures ayant intégré les trois partenaires (graphe de droite de la Figure 4), reflétant des niveaux d'expressions inférieurs à ceux que l'on observe dans le cas de plasmides réplicatifs multi-copies (graphe de gauche de la Figure 4).
3- Modification de la perméabilité des souches de levure en vue de l'automatisation des cribles :
Afin de faciliter l'automatisation des cribles et de favoriser la pénétration des composés chimiques à tester, la perméabilité de la souche de levure a été modifiée par délétion du gène ERG6 qui est impliqué dans la voie de biosynthèse de l'ergostérol.
La cassette de délétion amplifiée à partir de la souche YML008C à l'aide des amorces UPERG6 et DOWNERG6 a été transformée dans des souches de levures exprimant RhoG et la kinectine avec ou sans le facteur d'échange TRIO-GEF1. Après sélection sur un milieu contenant du G418, les transformants sont isolés sur une boîte de culture contenant du X-gal, en parallèle avec les mêmes souches de levure n'ayant pas subi la délétion du gène ERG6. A bout de 48 heures de croissance à 30°C, on constate que les levures perméabilisées et exprimant TRIO-GEF1 sont bleues (figure 5, souche ERG6-, TRIO-GEF1) alors que les mêmes levures ayant un gène ERG6 sauvage restent blanches (figure 5, souche ERG6+, TRIO-GEF1). Dans les deux cas et en l'absence de facteur d'échange, les levures restent blanches (figure 5, souche ERG6+ et -, pRs). La délétion du gène ERG6 permet donc au X-gal de pénétrer dans la levure et ainsi de révéler l'activation de RhoG par TRIO-GEF1 sans qu'il soit besoin au préalable de procéder à une cassure mécanique des levures.

Claims

REVENDICATIONS
1. Kit pour l'analyse de la régulation des voies d'activation des GTPases, spécialement adapté à l'identification par criblage d'un composé capable d'exercer une activité inhibitrice sur une voie d'activation de GTPase, caractérisé en ce qu'il comprend :
- au moins une levure, et
- au moins un système pour l'expression d'au moins une protéine hybride par cette levure,
- et, éventuellement, un support solide et/ou un milieu liquide et/ou un milieu gélifié,
ladite levure présentant une expression altérée de la protéine Erg6, de sorte que la membrane plasmique de cette levure soit essentiellement dépourvue de protéine Erg6, et
ladite protéine hybride comprenant deux composants, à savoir un composant "réactif de la voie des GTPases", et un composant "réactif de double hybride", i. le composant "réactif de la voie des GTPases" étant sélectionné parmi le groupe constitué par les GTPases, les effecteurs de GTPase, et les fragments de ces produits qui ont conservé une fonction de GTPase ou d'effecteur de GTPase, et ii. le composant "réactif de double hybride" étant sélectionné parmi le groupe constitué par les domaines de liaison à l'ADN et les domaines d'activation des activateurs de transcription opérationnels dans ladite levure.
2. Kit selon la revendication 1, caractérisé en ce que ledit au moins un système d'expression d'au moins une protéine hybride est intégré dans le génome de ladite levure.
3. Kit selon la revendication 1, caractérisé en ce que ledit au moins un système d'expression d'au moins une protéine hybride est inséré dans un vecteur d'intégration adapté à l'intégration de ce système d'expression dans le génome de ladite levure.
4. Kit selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'il comprend au moins un système pour l'expression d'au moins deux protéines hybrides différentes : - l'une comportant une GTPase, à titre de composant "réactif de la voie des GTPases", et - l'autre comportant un effecteur de cette GTPase, à titre de composant "réactif de la voie des GTPases", le composant "réactif de double hybride" de chacune des deux protéines hybrides étant pour l'une le domaine de liaison à l'ADN, et pour l'autre le domaine d'activation, ou inversement, d'un même activateur de transcription eucaryote.
5. Kit selon la revendication 4, caractérisé en ce que ladite levure comprend en outre au moins un gène rapporteur dont la transcription peut être activée par un complexe formé, directement ou indirectement, par le domaine de liaison à l'ADN et, respectivement, le domaine d'activation des desdites au moins deux protéines hybrides.
6. Kit selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisé en ce qu'il comprend en outre un vecteur d'intégration qui présente au moins un site de clonage au niveau duquel peut être insérée une cassette d'expression protéique, et qui est adapté à l'intégration dans le génome de ladite levure de la cassette d'expression protéique qui serait insérée audit site de clonage.
7. Kit selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisé en ce qu'il comprend en outre : - une protéine GEF activatrice de ladite GTPase, éventuellement sous forme étiquetée, ou - un fragment d'une telle protéine GEF qui a conservé une fonction activatrice vis-à-vis de ladite GTPase, éventuellement sous forme étiquetée, ou - un système pour l'expression de cette protéine ou fragment, éventuellement sous forme étiquetée, dans ladite levure.
8. Kit selon la revendication 7, caractérisé en ce que ledit système d'expression de ladite protéine ou fragment GEF est inséré dans un vecteur d'intégration qui est adapté à l'intégration de ce système dans le génome de ladite levure.
9. Kit selon la revendication 7, caractérisé en ce que ledit système d'expression de ladite protéine ou fragment GEF est intégré dans le génome de ladite levure.
10. Kit selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, caractérisé en ce qu'il comprend en outre au moins un vecteur d'expression eucaryote, adapté à recevoir un système d'expression d'un composé peptidique ou polypeptidique dont on voudrait tester l'influence sur l'activation des GTPases, et adapté à exprimer ce système d'expression dans ladite levure.
11. Kit d'analyse selon l'une quelconque des revendications 1 à 10, caractérisé en ce qu'il comprend en outre une banque de vecteurs d'expression eucaryote, chacun adapté à l'expression, dans ladite levure, d'un composé peptidique ou polypeptidique candidat, dont on voudrait tester l'influence sur l'activation des GTPases.
12. Kit d'analyse selon l'une quelconque des revendications 1 à 11, caractérisé en ce qu'il comprend en outre une chimiothèque de composés candidats, dont on voudrait tester l'influence sur l'activation des GTPases.
13. Kit pour l'expression d'au moins une protéine hybride, telle que définie en revendication 1, dans la levure du kit d'analyse des revendications 1 à 12, caractérisé en ce qu'il comprend un vecteur d'intégration :
- qui comporte en insert un système d'expression de ladite au moins une protéine hybride, laquelle protéine hybride comprend deux composants : i. l'un étant sélectionné parmi le groupe des "réactifs de la voie des GTPases" constitué par les GTPases, les effecteurs de GTPase, et les fragments de ces produits qui ont conservé une fonction de GTPase ou d'effecteur de GTPase, et ii. l'autre parmi le groupe des "réactifs de double hybride" constitué par les domaines de liaison à l'ADN des activateurs de transcription eucaryote, et les domaines d'activation des activateurs de transcription eucaryote, et
- qui comporte une région présentant une homologie avec un locus chromosomique de ladite levure suffisante pour permettre une recombinaison dudit système d'expression dans le génome de cette levure.
14. Utilisation du kit selon l'une quelconque des revendications 1 à 12, pour l'identification d'un composé capable d'exercer une activité inhibitrice sur une voie d'activation de GTPase.
15. Utilisation du kit selon l'une quelconque des revendications 1 à 12, pour l'identification d'un composé permettant de lutter contre une cellule tumorale, contre l'hypertension, contre une infection, contre le développement d'une maladie génétique.
16. Procédé automatisable pour l'identification d'un composé capable d'exercer une activité inhibitrice sur une voie d'activation GTPase, caractérisé en ce que :
- on fournit une levure issue d'un kit selon l'une quelconque des revendications 4 à 12, c'est-à-dire une levure qui présente une expression altérée de la protéine Erg6, de sorte que la membrane plasmique de cette levure soit essentiellement dépourvue de protéine Erg6, et qui comprend au moins deux protéines hybrides, telles que définies en revendication 4,
- si nécessaire, on active la GTPase qui est portée par l'une des deux protéines hybrides mentionnées à l'étape précédente, de sorte que cette GTPase soit capable de se lier à son effecteur qui est porté par l'autre des deux protéines hybrides mentionnées à l'étape précédente,
- on confronte le composé inhibiteur candidat au milieu intracellulaire de cette levure,
- on détermine si ce composé candidat induit une inhibition de l'activation GTPasique, et le cas échéant, on identifie ce composé candidat comme étant un composé capable d'exercer une activité inhibitrice sur une voie d'activation GTPase.
17. Procédé pour la fabrication d'un composé susceptible de permettre de lutter contre une cellule tumorale, et/ou contre l'hypertension, et/ou contre une infection, contre le développement d'une maladie génétique, caractérisé en ce que :
- l'on identifie un composé capable d'exercer une activité inhibitrice sur une voie d'activation GTPase, à l'aide du procédé selon la revendication 16,
- l'on synthétise et/ou isole ce composé, et optionnellement on le place en présence de véhicules pharmaceutiquement acceptables.
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