FR2924721A1 - Procede de criblage d'agents modulant l'activite de l'ubiquitine ligase mdm2 et moyens destines a la mise en oeuvre dudit procede - Google Patents

Abstract

L'invention a pour objet un procédé in cellulo pour le criblage d'agents modulant l'activité de l'ubiquitine ligase Mdm2, ledit procédé comprenant les étapes suivantes :a) mettre en contact un agent candidat à tester avec des cellules de levure recombinantes qui expriment dans leur noyau une protéine de fusion comprenant :(i) un polypeptide MDM2 et(ii) au moins une protéine détectable.b) quantifier ladite première protéine détectable dans les cellules de levure, à la fin d'au moins une période de temps prédéterminée après la mise en contact de l'agent candidat avec lesdites cellules ;c) comparer la valeur obtenue à l'étape (b) avec une valeur témoin obtenue lorsque l'étape (a) est réalisée en l'absence de l'agent candidat.

Description

TITRE DE L'INVENTION Procédé de criblage d'agents modulant l'activité ubiquitine-ligase de Mdm2 et moyens destinés à la mise en oeuvre dudit procédé DOMAINE DE L'INVENTION La présente invention se rapporte au domaine du criblage d'agents biologiquement actifs capables de moduler l'activité ligase d'ubiquitine de Mdm2, en particulier d'agents d'intérêt thérapeutique destinés à prévenir ou traiter des cancers.

ART ANTERIEUR

L'oncogène Mdm2 : L'oncogène Mdm2 est le principal régulateur négatif du suppresseur de tumeurs p53. L'amplification de Mdm2 est observée dans environ 10% des cancers avec une fréquence élevée (35%) dans les sarcomes de tissus mous. La surexpression de Mdm2 favorise le développement des tumeurs en inhibant notamment les fonctions anti-prolifératives de l'activateur transcriptionnel p53. Néanmoins, il existe des évidences solides pour des fonctions oncogéniques de Mdm2 indépendantes de p53 (Daujat et al. Trends Genet. 2001 Aug;17(8):459-64. Piette et al., 1997, Oncogene 15, 1001).

Mdm2 et p53 : La protéine gène p53 joue un rôle majeur dans la formation des tumeurs. La moitié des personnes héritant d'une copie mutée de ce gène développent des tumeurs avant l'âge de 30 ans (syndrome de Li-Fraumeni), et 100 % des souris dépourvues de copies fonctionnelles de ce gène meurent de tumeurs avant l'âge de 6 mois. Chez les patients atteints de cancer mais ne portant pas de mutation germinale du gène p53, il a été démontré que 50% des tumeurs ont acquis une mutation somatique de ce gène. L'activation de la protéine p53 par une grande variété de stress cellulaires entraîne un arrêt des cycles de division cellulaire et ultimement, conduit à la mort cellulaire (apoptose). L'existence d'un tel mécanisme protège ainsi l'organisme contre la prolifération de cellules potentiellement oncogéniques. Sur le plan biochimique, p53 est un facteur de transcription. Il inhibe le développement des tumeurs en activant la transcription de certains gènes dont la surexpression induit l'arrêt du cycle de division cellulaire ou la mort cellulaire par apoptose. Comme la plupart des facteurs de transcription, p53 possède de multiples gènes cibles. Les premiers gènes qui voient leur transcription fortement augmenter en réponse à l'activation de la protéine sont les gènes p21 WAF1/CIP1 et MDM2. La protéine p21 Wafl /Cipl , qui appartient à la famille des inhibiteurs de CDK, Cyclin Dependent Kinases, inhibe spécifiquement l'activité du complexe Cdk2/Cycline E, cette inhibition bloquant la transition G1/S au point de restriction du cycle de division cellulaire. Si le signal activant p53 persiste, la production de p21 Wafl /Cipl peut être maintenue pendant de longues périodes, conduisant à un état appelé sénescence cellulaire. Les cellules sénescentes restent viables mais sont incapables de se diviser (même si elles sont maintenues en culture pendant des années). Ce mécanisme constitue l'une des toutes premières stratégies mises en place par l'organisme pour empêcher le développement d'une tumeur à partir d'une cellule maligne.

Lorsque le signal activant la protéine p53 disparaît, le niveau de p21Wafl/Cipl diminue et la cellule peut alors recommencer à se diviser. La reprise des divisions cellulaires est favorisée par l'existence d'une boucle de rétroaction négative qui comprend un autre gène cible de p53, le gène MDM2. La protéine Mdm2 régule l'activité de l'activateur transcriptionnel p53 selon plusieurs mécanismes. Mdm2 est notamment capable de se lier au domaine d'activation de la transcription de p53 et bloque ainsi son interaction avec les facteurs généraux de transcription. Le complexe p53-Mdm2 ainsi formé est donc incapable d'activer l'ARN-polymérase Il et d'initier la transcription des gènes cibles. On peut noter au niveau moléculaire que la voie de signalisation qui active p53 agît en induisant la phosphorylation de la sérine 20, ce qui a pour conséquence d'inhiber l'interaction p53 û Mdm2, et également la phosphorylation de la sérine 15, cette dernière modification favorisant l'interaction de p53 avec la machinerie basale de transcription. La phosphorylation de la sérine 20 a donc des conséquences fonctionnelles importantes puisqu'elle entraîne une forte augmentation de la synthèse de Mdm2, l'inhibiteur de p53.

Mdm2 : Ubiquitine ligase : Outre son rôle dans la régulation de l'interaction établie entre p53 et les facteurs généraux de transcription, Mdm2 possède la capacité d'inactiver définitivement p53 en induisant sa dégradation. Mdm2 appartient en effet à la famille des ubiquitine ligases et catalyse l'addition covalente de chaînes ubiquitines à certains résidus lysine présents dans la partie carboxy- terminale de p53. Ces modifications, en changeant la structure de p53, induisent l'export de p53 du noyau vers le cytoplasme où la protéine est alors reconnue et dégradée par le protéasome, un large complexe multiprotéique qui reconnait les protéines ubiquitylées et les dégrade en petits polypeptides inactifs. Dans une cellule saine, les niveaux de p53 et de Mdm2 sont faibles et suite à l'activation de p53, le niveau de ces protéines est fortement élevé. Outre son rôle dans l'ubiquitination de p53, Mdm2, comme certaines autres ubiquitine ligases, catalyse sa propre poly-ubiquitination et donc sa propre dégradation par le protéasome. Ainsi, en réponse à un endommagement de l'ADN, la protéine Mdm2 est phosphorylée en de multiples sites par des protéines kinases spécifiquement activées par ce type de stress (telles que ATM et ATR). Ces phosphorylations jouent un rôle déterminant dans la déstabilisation de Mdm2 résultant de son auotubiquitination.

Fonctions oncogéniques de Mdm2 indépendantes de p53 : Bien qu'il existe de nombreuses indications expérimentales qui démontrent l'existence de rôles de Mdm2 indépendants de p53, le fait que la létalité observée lors de la délétion de Mdm2 chez la souris soit annulée par l'inactivation simultanée du gène p53 démontre que ces rôles ne sont pas essentiels pour un développement cellulaire normal. Cependant, ces fonctions additionnelles contribuent fortement au développement des tumeurs induites par la surexpression de Mdm2 : par exemple, chez la souris, l'occurrence des sarcomes dus à la surexpression de Mdm2 est plus importante que celle résultant de l'inactivation de p53. Ceci montre que des mécanismes, autres que l'inactivation de p53, contribuent au développement de ces sarcomes.

Test de dégradation de Mdm2 La présente invention propose un mécanisme d'étude in vivo de la dégradation de Mdm2 induite par son auto-ubiquitination. La voie de dégradation des protéines par le protéasome est un processus complexe faisant intervenir de nombreux régulateurs. La dégradation de Mdm2 ubiquitinée par le protéasome n'est que l'ultime étape de ce processus.

Reconstituer in vivo ce mécanisme permet d'en suivre chaque étape, de l'ubiquitination à la dégradation en passant par la reconnaissance par le protéasome. Il existe des tests in vitro rapportant l'activité ligase à ubiquitine de Mdm2 (Yang et aI, 2005 ; Davydov et al., 2004) mais ces tests ne s'attachent qu'à observer un mécanisme précis et non l'ensemble du processus de régulation de l'activité de la protéine Mdm2 par la voie ubiquitine-protéasome. La transposition en cellule vivante montre d'ailleurs la limite des observations décrites.

DESCRIPTION DE L'INVENTION Selon l'invention, on a mis au point un procédé de criblage d'agents d'intérêt thérapeutique, qui sont sélectionnés pour leur spécificité d'action sur l'auto-ubiquitination et la dégradation dépendant du protéasome de la ligase d'ubiquitine humaine Mdm2. Le demandeur a montré que, de manière surprenante, il était possible de mimer, dans des cellules de levure, le processus de dégradation de la ligase d'ubiquitine Mdm2 par le protéasome, processus qui a lieu naturellement dans les cellules humaines. On a montré selon l'invention qu'il était possible de recréer artificiellement, dans des cellules de levure la réaction d'auto-ubiquitination de la ligase humaine Mdm2 suivie de sa reconnaissance et de sa dégradation par le protéasome de levure. L'invention a pour objet un procédé in cellulo pour le criblage d'agents modulant l'activité ligase d'ubiquitine de la protéine humaine Mdm2 sur elle-même comprenant les étapes suivantes : a) mettre en contact un agent candidat à tester avec des cellules de levure recombinantes qui expriment : i) une protéine de fusion comprenant un polypeptide Mdm2 et au moins une protéine détectable. b) quantifier ladite première protéine détectable dans les cellules de levure, à la fin d'au moins une période de temps prédéterminée après la mise en contact de l'agent candidat avec lesdites cellules ; c) comparer la valeur obtenue à l'étape (b) avec une valeur témoin obtenue lorsque l'étape (a) est réalisée en l'absence de l'agent candidat.

Le procédé de l'invention consiste en un procédé qui est réalisé in cellulo, du fait que la dégradation de la protéine cible Mdm2 est réalisée et visualisée dans des cellules de levures et non par des réactions réalisées dans un système acellulaire. On a également montré que, dans des cellules de levure, la dégradation du polypeptide Mdm2 par le protéasome a lieu, même lorsque ce polypeptide est fusionné à une protéine détectable et notamment à une protéine auto-fluorescente. De façon surprenante, dans les cellules de levure, la dégradation de la protéine de fusion est totale, les polypeptides correspondant à la protéine Mdm2 et à la protéine détectable sont tous les deux dégradés. La dégradation totale de la protéine de fusion : protéine détectable-Mdm2, observée dans les cellules de levure, permet de mesurer la quantité de protéine de fusion présente dans les cellules de levure en quantifiant le signal généré par la protéine détectable comprise dans ladite protéine de fusion. Le procédé ci-dessus permet à l'homme du métier de déterminer si un agent candidat à tester est capable de modifier la vitesse de dégradation, ou le degré de dégradation, de la protéine Mdm2 par le protéasome dans les cellules de levure.

Le procédé de criblage in cellulo ci-dessus, du fait qu'il met en oeuvre un système artificiel et humanisé de dégradation d'une protéine de fusion cible dans des cellules de levure, permet un criblage d'agents qui agissent de manière spécifique sur la stabilité de la seule protéine humaine exprimée dans ces cellules.

De plus, grâce au procédé ci-dessus, on a mis au point un test physiologique de criblage d'agents actifs sur une voie ubiquitine ligase, en construisant chez la levure une voie métabolique de dégradation protéique mimant la voie de dégradation par le protéasome de la ligase Mdm2 humaine. Ainsi, du point de vue de la voie métabolique de dégradation des protéines qui est visée, le procédé de l'invention est réalisé dans des conditions physiologiques très proches des conditions physiologiques de dégradation des protéines par le protéasome humain. Aux fins de la présente description, un agent qui module l'activité de ligase d'ubiquitine de Mdm2 englobe, respectivement, (i) un agent qui inhibe ou bloque l'activité de ligase d'ubiquitine de Mdm2 et (ii) un agent qui active ou augmente l'activité de ligase d'ubiquitine de Mdm2. Grâce au procédé ci-dessus, on peut identifier les agents capables d'inhiber la vitesse ou le degré de dégradation intracellulaire du polypeptide Mdm2 par le protéasome des cellules de levure. De tels agents inhibiteurs, qui peuvent être identifiés grâce au procédé de l'invention, du fait qu'ils vont inhiber également l'activité de la ligase Mdm2 dans les cellules humaines, constituent des agents d'intérêt thérapeutique susceptibles d'inhiber ou de bloquer la prolifération de cellules tumorales, d'inhiber ou bloquer l'activation de l'expression de divers gènes impliqués dans des cancers, de perturber des mécanismes de contrôle de la mort cellulaire (apoptose). Ainsi, le procédé de criblage in cellulo ci-dessus peut comprendre une étape additionnelle (d) qui consiste à sélectionner positivement les agents candidats inhibiteurs pour lesquels la quantité de protéine détectable mesurée à l'étape (b) est supérieure à la valeur témoin de comparaison. Le procédé de l'invention permet aussi d'identifier des agents capables d'augmenter la vitesse ou le degré de dégradation du polypeptide Mdm2 par le protéasome des cellules de levure. De tels agents activateurs, du fait qu'ils vont augmenter également l'activité d'auto-ubiquitination de Mdm2 dans les cellules humaines, constituent des agents d'intérêt thérapeutique susceptibles d'induire ou d'augmenter l'activation de l'expression de divers gènes impliqués dans des cancers. Certains des agents sélectionnés selon le procédé sont susceptibles d'avoir des activités pro-apoptotiques s'ils augmentent par exemple spécifiquement l'activité d'auto-ubiquitination de Mdm2 sans augmenter l'activité de ligase d'ubiquitine de Mdm2 sur ses (ou certaines de ses) cibles telle que p53 par exemple. Ainsi, selon un autre aspect, le procédé de criblage selon l'invention peut comprendre une étape additionnelle (d) qui consiste à sélectionner positivement les agents candidats activateurs, pour lesquels la quantité de protéine détectable mesurée à l'étape (b) est inférieure à la valeur témoin de comparaison. Comme on l'aura compris, l'agent modulant l'activité de ligase d'ubiquitine de Mdm2 peut être de toute nature. Ledit agent peut être tout composé organique ou minéral, et peut être soit un agent d'origine naturelle, soit un agent produit, au moins en partie, par synthèse chimique ou biologique. Ledit agent peut être notamment un peptide ou protéine. Ledit agent englobe aussi toute molécule déjà connue pour posséder un effet biologique, notamment un effet thérapeutique, ou à l'inverse un effet toxique démontré ou suspecté pour l'organisme. Dans le procédé de l'invention, une fois que la protéine de fusion, comprenant le polypeptide Mdm2 fusionné à une protéine détectable, est exprimée dans les cellules de levure, la dite protéine de fusion est reconnue et subit une protéolyse qui est effectuée par le protéasome. La quantification de la protéine détectable contenue dans la cellule de levure, à un instant donné, permet de déterminer le degré de dégradation de ladite protéine de fusion Mdm2-protéine détectable à cet instant donné. Un polypeptide Mdm2 selon l'invention consiste en un polypeptide possédant au moins 90% d'identité en acides aminés avec le polypeptide Mdm2 de séquence SEQ ID N° 1. Un polypeptide Mdm2 selon l'invention peut consister en le polypeptide Mdm2 de séquence SEQ ID N° 1. Aux fins de la présente description, l'expression " séquence nucléotidique " peut être employée pour désigner indifféremment un polynucléotide ou un acide nucléique. L'expression " séquence nucléotidique " englobe le matériel génétique lui-même et n'est donc pas restreinte à l'information concernant sa séquence. Les termes " acide nucléique ", " polynucléotide ", " oligonucléotide " ou encore " séquence nucléotidique " englobent des séquences d'ARN, d'ADN, d'ADNc ou encore des séquences hybrides ARN/ADN de plus d'un nucléotide, indifféremment sous la forme simple brin ou sous la forme de duplex. Le terme " nucléotide " désigne les nucléotides naturels (A, T, G, C et U).

Aux fins de la présente invention, un premier polynucléotide est considéré comme étant " complémentaire " d'un second polynucléotide lorsque chaque base du premier nucléotide est appariée à la base complémentaire du second polynucléotide dont l'orientation est inversée. Les bases , complémentaires sont A et T (ou A et U), et C et G.

Selon l'invention, un premier acide nucléique ayant au moins 90 0/0 d'identité avec un second acide nucléique de référence, possèdera au moins 90 %, de préférence au moins 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 97,5%, 98%, 98,3% 98,6%, 99%, 99,6% d'identité en nucléotides avec ledit second acide nucléique de référence.

Selon l'invention, un premier polypeptide ayant au moins 90 0/0 d'identité avec un second polypeptide de référence, possèdera au moins 90 %, de préférence au moins 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 97,5%, 98%, 98,3% 98,6%, 99%, 99,6% d'identité en acides aminés avec ledit second polypeptide de référence.

Le pourcentage d'identité entre deux séquences d'acide nucléique ou entre deux séquences de polypeptide, au sens de la présente invention, est déterminé en comparant les deux séquences alignées de manière optimale, à travers une fenêtre de comparaison. La partie de la séquence nucléotidique ou d'acides aminés dans la fenêtre de comparaison peut ainsi comprendre des additions ou des délétions (par exemple des gaps ) par rapport à la séquence de référence (qui ne comprend pas ces additions ou ces délétions) de manière à obtenir un alignement optimal entre les deux séquences. Le pourcentage d'identité est calculé en déterminant le nombre de positions auxquelles une base nucléique identique, ou un résidu d'acide aminé identique, est observé pour les deux séquences comparées, puis en divisant le nombre de positions auxquelles il y a identité entre les deux bases nucléiques, ou entre les deux résidus d'acides aminés, par le nombre total de positions dans la fenêtre de comparaison, puis en multipliant le résultat par cent afin d'obtenir le pourcentage d'identité en nucléotides des deux séquences entre elles, ou le pourcentage d'identité en acides aminés des deux séquences entre elles. L'alignement optimal des séquences pour la comparaison peut être réalisé de manière informatique à l'aide d'algorithmes connus.

De manière tout à fait préférée, le pourcentage d'identité de séquence est déterminé à l'aide du logiciel CLUSTAL W (version 1.82) les paramètres étant fixés comme suit : (1) CPU MODE = ClustalW mp ; (2) ALIGNMENT = full ; (3) OUTPUT FORMAT = aln w/numbers ; (4) OUTPUT ORDER = aligned ; (5) COLOR ALIGNMENT = no ; (6) KTUP (word size) = default ; (7) WINDOW LENGTH = default ; (8) SCORE TYPE = percent ; (9) TOPDIAG = default ; (10) PAIRGAP = default ; (11) PHYLOGENETIC TREE/TREE TYPE = none ; (12) MATRIX = default ; (13) GAP OPEN = default ; (14) END CAPS = default (15) GAP EXTENSION = default ; (16) GAP DISTANCES = default ; (17) TREE TYPE = cladogram et (18) TREE GRAP DISTANCES = hide . Selon l'invention on a montré que la sensibilité du procédé de criblage décrit ci-dessus est accrue lorsque, préalablement à la mise en contact des cellules de levure avec l'agent à tester, on stoppe l'expression de la protéine Mdm2 cible dans les cellules de levure, c'est à dire la protéine de fusion Mdm2-protéine détectable. Ainsi, selon un premier mode de réalisation préféré du procédé ci-dessus, l'étape (a) comprend elle-même les étapes suivantes : (a1) cultiver les cellules de levure qui expriment dans leur noyau ladite protéine de fusion comprenant le polypeptide Mdm2 et au moins une protéine détectable ; (a2) stopper l'expression de ladite protéine de fusion comprenant le polypeptide Mdm2 et au moins une protéine détectable par les cellules de levure ; (a3) mettre en contact les cellules de levures obtenues à la fin de l'étape (a2) avec l'agent candidat à tester. L'arrêt de l'expression de la protéine de fusion Mdm2-protéine détectable, à un moment choisi, peut être facilement réalisé par l'homme du métier, en utilisant, pour transformer les cellules de levure, une cassette d'expression dans laquelle le polynucléotide codant ladite protéine de fusion est placé sous le contrôle d'un promoteur fonctionnel dans les cellules de levure et dont l'activation, ou à l'inverse la répression, est induite par un agent inducteur. De nombreux promoteurs inductibles actifs dans des cellules de levure sont connus par l'homme du métier, dont certains d'entre eux sont décrits plus loin dans la description, y compris dans les exemples. Dans la pratique, la protéine de fusion Mdm2-protéine détectable s'auto-ubiquitine et est rapidement reconnue et dégradée par le protéasome dans les cellules de levure. Les conditions optimales de mise en oeuvre du procédé de criblage selon l'invention sont les conditions dans lesquelles on induit une accumulation intracellulaire d'une grande quantité de la protéine de fusion Mdm2-protéine détectable qui est exprimée dans les cellules de levure. Plus la quantité intracellulaire de protéine de fusion Mdm2-protéine détectable est grande au début de l'étape a) du procédé, plus la valeur du signal généré par la protéine détectable est élevée et peut être mesurée avec une grande précision au moment de l'étape b) du procédé. Ainsi, plus la quantité intracellulaire de la protéine de fusion Mdm2-protéine détectable est grande au début de l'étape a), plus les variations de quantité de cette protéine de fusion peuvent être mesurées avec précision, à l'étape b) du procédé.

Pour obtenir l'accumulation d'une grande quantité intracellulaire de la protéine de fusion Mdm2-protéine détectable dans les cellules de levure, il est avantageux de placer la séquence codant ladite protéine de fusion sous le contrôle d'un promoteur répressible fort et d'utiliser des souches de levure possédant plusieurs copies d'un polynucléotide comprenant (i) un promoteur répressible fort, (ii) un acide nucléique codant la protéine de fusion Mdm2-protéine détectable. La présence de plusieurs copies du polynucléotide codant d'intérêt permet l'obtention d'un fort signal de détection de la protéine détectable, à l'étape a) du procédé. Ces conditions de fort signal permettent de quantifier avec une grande sensibilité la protéine détectable pendant toute la durée du procédé, au fur et à mesure de la dégradation de la protéine de fusion Mdm2-protéine détectable par le protéasome. De manière évidente, plus le signal détectable de départ est fort, meilleure est la sensibilité des mesures lors de la mise en oeuvre du procédé. Selon un mode de réalisation avantageux du procédé de criblage selon l'invention, on utilise des cellules de levures dans lesquelles la ou les copies du polynucléotide codant la protéine de fusion Mdm2-protéine détectable est (sont) intégrée(s) dans le chromosome. Ce mode de réalisation avantageux permet l'accumulation intracellulaire de la protéine de fusion Mdm2-protéine détectable à un niveau élevé dans toutes les cellules de levure cultivées pour la mise en oeuvre du procédé. Ce mode de réalisation du procédé de criblage de l'invention constitue un avantage, par rapport à l'utilisation de cellules de levures transformées par des plasmides dans chacune desquelles une ou plusieurs copies du polynucléotide codant la protéine de fusion Mdm2-protéine détectable est (sont) insérée(s). En effet, lorsque les cellules de levures qui expriment la protéine de fusion Mdm2-protéine détectable consistent en des cellules contenant un ou plusieurs vecteurs recombinants, en particulier un ou plusieurs plasmides recombinants, dans lesquels est insérée au moins une copie du polynucléotide codant la protéine de fusion Mdm2-protéine détectable, il peut arriver que la transmission desdits vecteurs recombinants d'intérêt ne se réalise pas de manière homogène, avec les générations successives de cellules de levure. Dans certains cas, le niveau d'expression intracellulaire de la protéine de fusion Mdm2-protéine détectable serait hétérogène au sein de l'ensemble des cellules de levure cultivées, ce qui serait susceptible de réduire la sensibilité du procédé de criblage de l'invention.

Description des modes de réalisation préférés du procédé de criblage Les modes de réalisation préférés du procédé de criblage de l'invention sont décrits ci-dessous, notamment en relation avec la description des aspects fonctionnels et structurels des divers moyens permettant la mise en oeuvre dudit procédé. De manière générale, la protéine détectable qui est comprise dans la protéine de fusion Mdm2-protéine détectable peut être de toute nature, dès lors que sa présence peut être spécifiquement détectée dans les cellules de levure avant sa protéolyse et que la présence de formes protéolysées de la protéine détectable, notamment de fragments peptidiques produits par protéolyse de ladite protéine détectable, ne sont pas détectées par le moyen de détection spécifique qui est choisi.

Comme cela se comprend aisément, la stabilité du polypeptide Mdm2 est suivie, selon le procédé de l'invention, en mesurant la stabilité de la protéine de fusion Mdm2-protéine détectable. Grâce à l'expression dans les cellules de levure du facteur Mdm2 sous forme de protéine fusion, la dégradation de la protéine de fusion contenant Mdm2 peut être suivie en temps réel, par détection de la protéine détectable non protéolysée. Selon la nature de la protéine détectable fusionnée à Mdm2, la dégradation de la protéine de fusion peut être suivie par des techniques connues en soi, notamment des techniques de mesure de fluorescence à l'aide, soit d'un cytomètre de flux, soit d'un lecteur de microplaques, soit d'un fluorimètre, soit grâce à un microscope à fluorescence, ou encore par des techniques colorimétriques, enzymatiques ou immunologiques. A titre illustratif, la protéine détectable peut être choisie parmi un antigène, une protéine fluorescente ou une protéine ayant une activité enzymatique.

Lorsque la protéine détectable consiste en un antigène, elle peut être tout type d'antigène, dès lors que des anticorps spécifiques de cet antigène sont déjà accessibles ou, alternativement, peuvent être préparés, selon toute technique d'obtention d'anticorps, notamment d'anticorps polyclonaux ou monoclonaux, bien connues de l'homme du métier. Préférentiellement, dans ce cas, la protéine détectable consiste en un antigène de faible taille, qui n'est pas susceptible d'interférer avec l'activité d'auto-ubiquitination de Mdm2 ou la reconnaissance de Mdm2 poly-ubiquitinée par le protéasome. Ainsi, préférentiellement, on utilise, comme antigène, un peptide ayant une chaîne de 7 à 100 acides aminés de longueur, mieux de 7 à 50 acides aminés de longueur, et encore mieux de 7 à 30 acides aminés de longueur, par exemple 10 acides aminés de longueur. A titre illustratif, on peut utiliser l'antigène HA de séquence [NH2-YPYDVPDYA-COOH] SEQ ID N° 4, ou encore un antigène FLAC de séquence [NH2-DYKDDDDK-COOH] SEQ ID N° 5 (monomère FLAC) ou de séquence [NH2-MDYKDHDGDYKDHDIDYKDDDDK-COOH] SEQ ID N° 6 (trimère FLAC). Dans ce cas, on utilise, pour quantifier la protéine détectable à l'étape (b) du procédé, un anticorps qui reconnaît spécifiquement l'antigène compris dans la protéine de fusion, cet anticorps étant marqué directement ou indirectement. La quantification est alors réalisée par mesure du signal détectable produit par les complexes formés, dans les cellules de levure, entre l'anticorps marqué et la protéine de fusion Mdm2-antigène. Ainsi, à l'étape (b), lorsque la première protéine détectable est un antigène, on quantifie ladite première protéine détectable par détection des complexes formés entre ladite protéine et des anticorps la reconnaissant.

Lorsque la protéine détectable consiste en une protéine à fluorescence intrinsèque, elle est notamment choisie parmi la protéine mAG, la protéine GFP ou l'un de ses dérivés, la protéine YFP ou l'un de ses dérivés, et la protéine dsRED. Parmi les protéines dérivées de la protéine GFP, on peut utiliser notamment l'une quelconque des protéines connues sous les noms GFPMut3 (Cormack et al. (Gene (1996) 173_: 33-38)), Venus (Nagai et al., (Nat. Biotechnol. (2002) 20:87-90)) ou Sapphire (Zapata-Hommer and Griesbeck, BMC Biotechnol. (2003) 3:5). La protéine à fluorescence intrinsèque peut aussi être choisie parmi les protéines auto-fluorescentes originaires de divers organismes, autres qu'Aequorea victoria. Notamment, la protéine à fluorescence intrinsèque peut être choisie parmi les protéines suivantes : - la protéine CopGFP originaire de Pontellina plumata, et décrite par D.A. Shagin et al.(2004, Mol. Biol. Evol. 21:841-850) ; - la protéine TurboGFP, un variant de CopGFP ; et décrite par D.A. Shagin et al., 2004 (Mol. Biol. Evol. 21:841-850) ; - la protéine PhiYFP originaire de Phialidium sp. ; et décrite par D.A. Shagin et al.( 2004, Mol. Biol. Evol. 21:841-850) ; - la protéine AcGFP originaire de Aequorea coerulescens, ainsi que ses variants, et décrite par N.G. Gurskaya, (2003, Biochem.

J. 373:403-408) ; et - la protéine DsRed originaire de Discosoma sp. ; et décrite par M.V. Matz et al (1999, Nature Biotech. 17:969-973). Préférentiellement on utilisera, dans la protéine fusion Mdm2-protéine détectable, la protéine mAG, aussi appelée monomeric Azami-Green , originaire du corail de Galaxeidae; et décrite par Karasawa et al. (Karasawa et al., J. Biol. Chem. 2003 278:34167-34171). Lorsque la protéine détectable consiste en une protéine à fluorescence intrinsèque, on quantifie la protéine détectable à l'étape (b) du procédé par mesure du signal de fluorescence qui est émis par la protéine de fusion Mdm2-protéine fluorescente à l'aide de tout dispositif adapté. Ainsi, à l'étape (b), lorsque la protéine détectable est une protéine fluorescente, on quantifie ladite protéine détectable par une mesure du signal de fluorescence émis par ladite protéine. Lorsque la protéine détectable consiste en une protéine à activité enzymatique, ladite protéine détectable est choisie notamment parmi la luciférase et la R-lactamase. Dans ce cas, on quantifie la protéine détectable à l'étape (b) du procédé par mesure de la quantité du ou des composés produits par la conversion du substrat par l'enzyme. Lorsque le produit de l'activité enzymatique est coloré, la mesure peut être réalisée par colorimétrie. Lorsque le produit de l'activité enzymatique est fluorescent, on mesure l'intensité du signal de fluorescence qui est émis par ledit produit, à l'aide de tout dispositif de mesure de la fluorescence adapté. Ainsi, à l'étape (b), lorsque la première protéine détectable est une protéine ayant une activité enzymatique, on quantifie ladite protéine détectable par une mesure de la quantité de substrat transformé par ladite protéine. Selon un mode de réalisation préféré, la protéine comprenant le polypeptide Mdm2 consiste en la protéine de séquence en acides aminés SEQ ID N°2, qui peut être codée par l'acide nucléique de séquence SEQ ID N°3. La protéine de séquence SEQ ID N° 2 consiste, de l'extrémité NH2- terminale vers l'extrémité COOH-terminale, respectivement en (i) la séquence de la protéine détectable mAG allant de l'acide aminé en position 1 jusqu'à l'acide aminé en position 226, (ii) un premier peptide espaceur allant de l'acide aminé en position 227 jusqu'à l'acide aminé en position 228 et (iii) le polypeptide Mdm2 allant de l'acide aminé en position 229 jusqu'à l'acide aminé en position 719. L'acide nucléique de séquence SEQ ID N°3 consiste, de l'extrémité 5' vers l'extrémité 3', respectivement en (i) la séquence codant la protéine détectable mAG allant du nucléotide en position 1 jusqu'au nucléotide en position 678, (ii) la séquence codant un peptide espaceur allant du nucléotide en position 679 jusqu'au nucléotide en position 684 et (iii) la séquence codant le polypeptide Mdm2 allant du nucléotide en position 685 jusqu'au nucléotide en position 2160 (codon stop compris). Le procédé de criblage selon l'invention est caractérisé en ce que les cellules de levure recombinantes sont transformées avec un polynucléotide qui comprend : (a) un cadre de lecture ouvert codant (i) la protéine de fusion comprenant le polypeptide Mdm2 et (ii) une protéine détectable, et (b) une séquence régulatrice fonctionnelle dans des cellules de levure qui dirige l'expression dudit cadre de lecture ouvert; Le polynucléotide ci-dessus peut consister en l'acide nucléique de séquence SEQ I D N°3.

Acides nucléiques, vecteurs d'expression et cellules de levure transformées préférés selon l'invention.

On a synthétisé selon l'invention, des acides nucléiques, lesquels, lorsqu'ils sont introduits dans des cellules de levure, provoquent l'expression de la protéine de fusion Mdm2-protéine détectable, c'est à dire des acides nucléiques codant la protéine de fusion Mdm2-protéine détectable. Chacun des acides nucléiques synthétisés comprend une séquence codante, qui est aussi désignée cadre de lecture ouvert ou ORF qui code la protéine de fusion Mdm2-protéine détectable d'intérêt. Un exemple illustratif d'acides nucléiques selon l'invention sont les acides nucléiques de séquence SEQ ID N° 3 (Mdm2-protéine détectable), dont la structure a été décrite précédemment dans la description.

Chacun des acides nucléiques comprend aussi une séquence régulatrice comprenant un promoteur fonctionnel dans les cellules de levure. Dans un mode de réalisation préféré, le promoteur fonctionnel dans les cellules de levure consiste en un promoteur répressible, c'est à dire un promoteur fonctionnel dans les cellules de levure et qui est sensible à l'action d'un agent inducteur. Lorsque l'agent inducteur est ajouté dans le milieu de culture des cellules de levure, il induit la répression ou le blocage de l'expression de la séquence codant la protéine d'intérêt placée sous son contrôle. Ce promoteur répressible est avantageusement choisi parmi les promoteurs CUP1, GAL 1, GAL 10, MET3, MET25, PHO5, PHO87 et THI4 de la levure Saccharomyces cerevisae. La séquence du promoteur du gène GAL 1 de la levure S. cerevisiae, susceptible d'être utilisée selon l'invention peut consister en celle décrite par Johnston et Davis (Mol. Gel/. Biol. (1984) 4 : 1440-1448).

La séquence du promoteur du gène MET3 de la levure S. cerevisiae, susceptible d'être utilisée selon l'invention peut consister en celle décrite par Cherest et al. (Mol. Gen. Genet. (1987) 210 (2) : 307-313). La séquence du promoteur du gène MET25 de la levure S. cerevisiae, susceptible d'être utilisée selon l'invention peut consister en celle décrite dans Kerjan et al. (Nucleic Acids Res.(1986) 14(20) : 7861-7871). La séquence du promoteur du gène PHO5 de la levure S. cerevisiae, susceptible d'être utilisée selon l'invention peut consister en celle décrite par Feldmann et al. (EMBO J. (1994) 13(24) : 5795-5809).

La séquence du promoteur du gène THI4 de la levure S. cerevisiae, susceptible d'être utilisée selon l'invention peut consister en celle décrite par Skala et al., Yeast (1995) 14:1421-1427. La séquence du promoteur du gène CUP1 de la levure S. cerevisiae, susceptible d'être utilisée selon l'invention peut consister en celle décrite par Karin et al. (PNAS (1984) 81(2) : 337-341). Dans un mode de réalisation préféré, l'acide nucléique ou le polynucléotide qui code la protéine de fusion Mdm2-protéine détectable comprend la séquence régulatrice GAL 1. Cette séquence active l'expression du cadre de lecture ouvert codant la protéine de fusion comprenant le polypeptide Mdm2 lorsque les cellules de levure sont cultivées en présence de galactose. Par contre cette séquence réprime l'expression du cadre de lecture ouvert codant la protéine de fusion comprenant le polypeptide Mdm2 lorsque les cellules de levure sont cultivées en présence de glucose. Ainsi, dans un mode de réalisation avantageux du procédé de criblage de l'invention, l'expression de la protéine fusion comprenant le polypeptide Mdm2 est réalisée de manière temporaire durant l'essai de criblage. Après avoir été induite durant un temps fixé pouvant varier de 20 minutes à 24 heures, l'expression de la protéine contenant Mdm2 est spécifiquement stoppée (dans une expérience connue par l'homme du métier sous le nom de promoter shut off ) avant d'exposer les cellules aux molécules devant être criblées. Cet arrêt de l'expression est obtenu par l'addition dans le milieu de culture d'une molécule pouvant réprimer l'activité du promoteur contrôlant l'expression de la protéine fusion Mdm2-protéine détectable, ou bien encore par l'élimination de la présence, dans le milieu de culture, d'un agent ou d'une molécule requise pour l'activation dudit promoteur.

Ainsi, lorsque la protéine de fusion Mdm2-protéine détectable est exprimée sous le contrôle du promoteur du gène GAL1, alors l'expression de ce promoteur est réprimée en ajoutant du glucose à la concentration finale de 2 % dans le milieu de culture. L'arrêt de la néo-synthèse de la protéine de fusion comprenant Mdm2 permet de mesurer sa stabilité en temps réel, en déterminant par exemple la fluorescence des cellules de levure au cours du temps après l'arrêt de synthèse, dans le mode de réalisation dans lequel ladite protéine de fusion contient une protéine détectable à fluorescence intrinsèque, comme la mAG ou une protéine dérivée de la GFP.

Ainsi, l'invention a aussi pour objet une cassette d'expression fonctionnelle dans les cellules de levure comprenant un polynucléotide qui comprend un cadre de lecture ouvert codant la protéine de fusion comprenant le polypeptide Mdm2 et au moins une protéine détectable, et une séquence régulatrice fonctionnelle dans des cellules de levure qui dirige l'expression dudit cadre de lecture ouvert. Une telle cassette d'expression peut notamment être caractérisée en ce que le polypeptide Mdm2 est le polypeptide Mdm2 de séquence SEQ ID N°1 Une telle cassette d'expression peut notamment comprendre ou consister en l'acide nucléique de séquence SEQ ID N°3 selon l'invention, qui code la protéine de fusion mAG-Mdm2 de séquence SEQ ID N°2. Selon un mode de réalisation préféré d'une telle cassette d'expression, la séquence régulatrice comprend un promoteur répressible fonctionnel dans les cellules de levure, et qui est sensible à l'action d'un agent inducteur, tel qu'un promoteur choisi parmi les promoteurs CUP1, GAL 1, GAL 10, MET3, MET25, PHO5, et THI4 de la levure Saccharomyces cerevisiae. Selon un autre mode de réalisation avantageux du procédé de criblage selon l'invention, les cellules de levure recombinantes possèdent l'acide nucléique ou le polynucléotide comprenant la séquence codant la protéine de fusion Mdm2-protéine détectable sous une forme intégrée dans leur génome, comme cela est illustré dans les exemples. Dans encore un autre mode de réalisation du procédé de criblage selon l'invention, les cellules de levure sont transformées par l'acide 35 nucléique ou le polynucléotide comprenant la séquence codant la protéine de fusion Mdm2-protéine détectable qui se présente sous une forme non intégrée dans les chromosomes, par exemple sous la forme de vecteurs fonctionnels dans les cellules de levure et qui portent au moins une origine de réplication fonctionnelle dans les cellules de levure.

De manière générale, pour la mise en oeuvre du procédé de criblage de l'invention, il est avantageux d'utiliser des cellules de levures qui possèdent une bonne perméabilité membranaire, notamment une bonne perméabilité membranaire pour les agents à tester par le procédé. Pour la mise en oeuvre du mode de réalisation préféré du procédé de criblage de l'invention dans lequel l'expression de la protéine de fusion est réalisée sous le contrôle d'un promoteur répressible, il est également avantageux d'utiliser des cellules de levures qui possèdent une bonne perméabilité membranaire pour les composés inducteurs vis-à-vis desquels lesdits promoteurs répressibles sont sensibles.

Ainsi, dans un autre mode de réalisation préféré du procédé de criblage de l'invention, on utilise des souches de levure dont le génome comprend une à plusieurs mutations qui augmentent la perméabilité aux produits à tester, telles que des mutations inactivant les gènes PDR1 et PDR3, deux gènes codant des facteurs transcriptionnels qui chez la levure contrôlent l'expression de transporteurs insérés dans la membrane plasmique (Nourani et al., 1997). Préférentiellement, on utilise des souches de levure possédant le fond génétique de la souche W303 de la levure Saccharomyces cerevisiae décrite par Bailis et al. (1990), ou tout autre souche caractérisée de la dite levure Saccharomyces cerevisiae. La transformation des cellules de levure par de l'ADN exogène est préférentiellement réalisée en utilisant des techniques connues de l'homme du métier, notamment la technique décrite par Schiestl et al. (1989). Les constructions des différentes souches de levure ont été réalisées en employant des techniques de génétique (croisement, sporulation, dissection des asques et analyse phénotypique des spores) connues et décrites notamment par Sherman et al. (1979) et les techniques de génétique inverse décrites notamment par Rothstein (1991). Conformément à l'invention, les levures sont transformées préférentiellement par des plasmides construits selon des techniques de biologie moléculaire classiques, notamment selon les protocoles décrits par Sambrook et al. (1989) et Ausubel et al. (1990-2004). Ainsi, un autre objet de l'invention consiste en un vecteur d'expression caractérisé en ce qu'il comprend une cassette d'expression telle que définie dans la présente description. Un vecteur conforme à l'invention est le vecteur pCSYAQ6-MDM2 qui est décrit dans les exemples, et qui a servi à la construction des souches de levure CYS361 et CYS424. [Figure 1A représentant la carte du vecteur pCSYAQ6-MDM2] La présente invention est également relative à une souche de levure recombinante comprenant, sous une forme intégrée dans son génome, un polynucléotide qui comprend (a) un cadre de lecture ouvert codant la protéine de fusion comprenant un polypeptide Mdm2 et au moins une protéine détectable, et (b) une séquence régulatrice fonctionnelle dans des cellules de levure qui dirige l'expression dudit cadre de lecture ouvert. Une souche de levure recombinante selon l'invention peut consister en une souche de levure recombinante comprenant, sous une forme intégrée dans son génome, un polynucléotide qui comprend (a) un cadre de lecture ouvert codant la protéine de fusion comprenant un polypeptide Mdm2 de séquence SEQ ID N° 1 et au moins une protéine détectable, et (b) une séquence régulatrice fonctionnelle dans des cellules de levure qui dirige l'expression dudit cadre de lecture ouvert. En particulier, l'invention est relative à des souches de levure recombinantes conformes à la définition ci-dessus, qui consiste en les souches de levure CYS361 et CYS424, qui expriment la protéine de fusion comprenant le polypeptide Mdm2 et la protéine détectable mAG, c'est à dire la protéine de fusion de séquence SEQ I D N ° 2. Le procédé de criblage selon l'invention, permet de visualiser l'activité ligase d'ubiquitine de Mdm2 dans des cellules de levure.

Ce procédé est particulièrement avantageux pour cribler des molécules ou agents aptes à agir sur les pathologies associées à une dégradation excessive ou insuffisante de Mdm2, tels que certains cancers. Les principaux avantages du procédé de criblage de l'invention sont notamment les suivants : - la simplicité de mise en oeuvre: l'activité ligase d'ubiquitine de Mdm2 tel qu'elle existe dans les cellules est visualisée simplement grâce à l'expression contrôlée de la protéine humaine sauvage Mdm2 dans les cellules de levure. De plus, lorsque la protéine Mdm2 est exprimée en tant que protéine hybride en fusion avec une protéine à fluorescence intrinsèque, telle que la mAG ou la GFP, la stabilité de Mdm2 est directement mesurée par la quantification de la fluorescence émise par la protéine hybride. De même lorsque la protéine Mdm2 est exprimée en tant que protéine hybride en fusion avec une protéine telle que la luciférase, la stabilité de Mdm2 est directement mesurée par la quantification de la luminescence émise par la protéine hybride en présence d'un substrat comme la fluorescéine. - l'adéquation avec un contexte thérapeutique : la stabilité de Mdm2 est suivie selon un test fonctionnel réalisé dans des cellules entières. Le procédé de criblage in cellulo selon l'invention permet donc de sélectionner des molécules capables d'activer ou d'inhiber l'activité ligase d'ubiquitine de Mdm2 dans un contexte semblable à celui de leur usage thérapeutique final. - la spécificité: bien que réalisé in cellulo dans la cellule, le procédé de criblage selon l'invention est spécifique, car il repose sur l'expression, dans un organisme hétérologue à l'organisme humain, de la protéine humaine Mdm2. Les molécules sélectionnées grâce au procédé de criblage de l'invention seront spécifiques de l'activité ligase d'ubiquitine de Mdm2, et ne seront donc pas des molécules sélectionnées en raison, par exemple, de leur capacité à interférer avec l'une des nombreuses voies de signalisation induisant la dégradation de Mdm2 dans les cellules humaines. En effet, lors de la mise en oeuvre du procédé de criblage selon l'invention, la dégradation de Mdm2 par le protéasome est induite par une voie métabolique tout à fait artificielle et totalement reproductible, comme par exemple, l'ajout de glucose pour bloquer l'activité du promoteur GAL 1, lorsque Mdm2 est exprimée sous le contrôle de ce promoteur. - la stabilité des souches de levure recombinantes: les techniques d'intégration dans un endroit choisi d'un chromosome de levure et de remplacement ciblé de gènes permettent la construction de souches de levures recombinantes exprimant la protéine de fusion contenant Mdm2 à partir des chromosomes de la levure. Ces souches de levure recombinantes sont donc génétiquement stables et peuvent être multipliées et conservées indéfiniment. - la rapidité de croissance et de criblage: la levure est un micro-organisme à croissance rapide et rendement élevé. En particulier, le procédé de criblage de l'invention est préférentiellement réalisé en cultivant les cellules de levure dans un milieu de culture complet, dans lequel la croissance des cellules de levure est particulièrement rapide et le rendement particulièrement élevé, ce qui permet l'obtention d'une grande quantité de cellules de levure recombinantes pour la réalisation simultanée d'un nombre important de tests de criblage. - le faible coût: la levure est un microorganisme dont la culture, le stockage et la caractérisation sont peu onéreux, -l'automatisation du procédé de criblage de l'invention: la levure est un micro-organisme dont la culture, réalisée dans un faible volume de milieu, à température basse, en atmosphère classique, dans l'air, est tout particulièrement adapté à l'automatisation (robotisation) des procédés de criblage.

La présente invention est en outre illustrée, sans pour autant être limitée, par les figures et les exemples suivants.

DESCRIPTION DES FIGURES La Figure 1 représente la carte du plasmide recombinant codant une protéine de fusion Mdm2-protéine détectable : schéma du plasmide pCSYAQ6-MDM2 comprenant une cassette d'expression codant la protéine de fusion mAG-Mdm2 La Figure 2 représente des clichés d'immuno-empreintes ( Western Blotting ) illustrant la dégradation de la protéine de fusion comprenant Mdm2 fusionnée avec mAG, en présence ou en l'absence d'un agent inhibiteur du protéasome, le composé MG132. Les résultats sont illustrés pour la souche de levure recombinante CYS361. La Figure 3 représente des clichés de microscopie d'épifluorescence, de la dégradation de la protéine de fusion mAG-Mdm2 dans des cellules de levure de la souche recombinante CYS361, en présence ou en l'absence d'un agent inhibiteur du protéasome, le composé MG132. Figure 3A : cellules CYS361 au temps 0 ; Figures 3B : cellules CYS361 au temps 120 minutes après induction par le glucose ; Figure 3C : cellules CYS361 au temps 120 minutes après l'arrêt de l'induction par le glucose en absence de MG132 ; Figure 3D : cellules CYS361 au temps 120 minutes après l'arrêt de l'induction par le glucose en présence de MG132 ; La Figure 4 illustre la quantification, par cytométrie de flux des cellules de levure de la souche CYS361, du signal de fluorescence émis par ces cellules, au cours du temps de culture, respectivement (i) pendant l'induction de la production de la protéine de fusion mAG-Mdm2 en présence de galactose et (ii) en présence de glucose après arrêt de la production de la protéine de fusion. Les cellules de levure ont été cultivées en présence ou en l'absence de l'inhibiteur de protéasome MG132 (50 M).

EXEMPLES

MATERIEL ET METHODES DES EXEMPLES 1 A 6. 1. Récapitulatif des séquences de polynucléotide utilisées Dans les descriptions qui suivent : La séquence de la protéine Mdm2 est celle déposée à la banque de données EMBL, numéro d'accession AF527840. La séquence du gène mAG (monomeric Azami-Green) du corail Galaxeidae codant pour la protéine fluorescente désignée ci-après sous le terme mAG est celle déposée à GenBankTM/EBI Data Bank avec le numéro d'accession AB108447. La séquence du plasmide pRS306 est celle déposée à la banque de données EMBL, identificateur PRS306 , numéro d'accession UO3438. La séquence du promoteur du gène GAL 1 de la levure S. cerevisiae utilisé dans les descriptions qui suivent est entièrement comprise dans la séquence déposée à la banque de données EMBL, identificateur SCGALI O , numéro d'accession K02115. La séquence du promoteur du gène GAL 1 de la levure S. cerevisiae, susceptible d'être utilisée selon l'invention peut consister en celle décrite par Johnston et Davis (Mol. Cell. Biol. (1984) 4 (8) : 1440-1448).

La séquence du promoteur du gène MET3 de la levure S. cerevisiae, susceptible d'être utilisée selon l'invention peut consister en celle décrite par Cherest et al. (Mol. Gen. Genet. (1987) 210 (2) : 307-313). La séquence du promoteur du gène MET25 de la levure S. cerevisiae, susceptible d'être utilisée selon l'invention peut consister en celle décrite dans Kerjan et al. (Nucleic Acids Res.(1986) 14(20) : 7861-7871). La séquence du promoteur du gène PHO5 de la levure S. cerevisiae, susceptible d'être utilisée selon l'invention peut consister en celle décrite par Feldmann et al. (EMBO J. (1994) 13(24) : 5795-5809).

La séquence du promoteur du gène THI4 de la levure S. cerevisiae, susceptible d'être utilisée selon l'invention peut consister en celle décrite Skala et al., Yeast (1995) 14:1421-1427. La séquence du promoteur du gène CUP1 de la levure S. cerevisiae, susceptible d'être utilisée selon l'invention peut consister en celle décrite par Karin et al. (PNAS (1984) 81(2) : 337-341).

2. Conventions utilisées Les descriptions sont faites en utilisant la nomenclature et les règles typographiques en usage dans la communauté des biologistes spécialistes 20 de la levure Saccharomyces cerevisiae. - le nom de la forme sauvage d'un gène est donné en majuscule italique ; exemple : GAL 1. - le nom d'une forme mutante d'un gène est donné en minuscule italique, le numéro d'allèle si il est connu est précisé à la suite d'un 25 tiret ; exemple cupl-1. - le nom d'un allèle inactivé d'un gène est donné en minuscule suivi de 2 fois deux points suivi du nom du gène inactivant ex pprl::TRP1 (dans cet exemple le gène inactivé pprl a été interrompu par le gène actif TRP1). 30 Alternativement, le nom d'un gène inactivé peut être donné par le symbole delta ; exemple gal4A - le nom de la protéine est celui du gène qui la code est donné en minuscule, excepté la première lettre qui est en majuscule ex Gal4 (alternativement on peut utiliser le même symbole suivi d'un p ; exemple Gal4p).

3. Remarques préliminaires concernant la construction des 5 plasmides L'ensemble des plasmides a été construit par des techniques de biologie moléculaire classiques selon des protocoles décrits par Sambrook et al. (in Molecular Cloning, Laboratory Manual, 2nd edition, (1989), Cold Spring Harbor, N. Y.) et Ausubel et al., (in Current Protocols in Molecular Biology, 10 (1990-2004), John Wiley and Sons Inc, N.Y.). Le clonage, la propagation et la production d'ADN plasmidiques ont été réalisés dans la souche d' Escherichia col/ D H 10 B.

EXEMPLE 1 : Construction des plasmides permettant 15 l'expression chez la levure de la protéine de fusion mAG-Mdm2 et de la protéine sauvaqe Mdm2. Le plasmide suivant permet l'expression chez la levure Saccharomyces cerevisiae d'un dérivé de la protéine humaine Mdm2 fusionné à la protéine fluorescente mAG du corail Galaxeidae. 20 Un fragment de 614 paires de bases (pb) correspondant au promoteur du gène GAL 1 (pGAL1) de la levure Saccharomyces cerevisiae a été amplifié par Polymerase Chain Reaction (PCR) à partir d'ADN génomique d'une souche sauvage de S.cerevisiae X2180-1A, en utilisant les oligonucléotides suivants : 25 (i) pGAL1(Asp)Forw de séquence 5'-GCTGGGTACCTTAATAATCATATTACATGGCATTA-3' [SEQ ID N° 7], et (ii) pGAL1(Xho)Rev de séquence 5'-CGACCTCGAGTATAGTTTTTTCTCCTTGACGTTAA-3' SEQ I D N° 30 8]. Le fragment obtenu a été digéré par les enzymes de restriction Asp7181 et Xhol et inséré dans le plasmide navette S.cerevisiae-E.coli pRS306 préalablement digéré par les enzymes Asp7181 et Xhol, produisant le vecteur pRS306-pGAL1.

Un fragment de 678 paires de bases (pb) correspondant à un variant du gène codant pour la protéine fluorescente monomérique Azami Green (mAG) du corail Galaxeidae, dont la séquence est optimisée pour l'expression en levures, a été obtenu par digestion enzymatique par les enzymes de restriction Xhol et EcoRl à partir du vecteur pPCR-Script-mAG. Le fragment obtenu a été inséré dans le plasmide pRS306-pGAL1 préalablement digéré par les enzymes Xhol et EcoRl, produisant le vecteur pRS306-pGAL1-mAG. Un fragment de 340 paires de bases (pb) correspondant au terminateur du gène ADH1 (tADH1) de la levure Saccharomyces cerevisiae a été amplifié par Polymérase Chain Reaction (PCR) à partir d'ADN génomique d'une souche sauvage de S.cerevisiae X2180-1A, en utilisant les oligonucléotides suivants : (i) TermADH1(NotlBstXl)5' de séquence 5'-GGCGGCGGCCGCCACCGCGGTGGGCGAATTTCTTATGATTTATG-3' [SEQ I D N°9] et (ii) TermADH1(Sacl)3' de séquence 5'-GGCGGAGCTCTGGAAGAACGATTACAACAG-3' [SEQ ID N°10].

Le fragment obtenu a été digéré par les enzymes de restriction Sacl et Notl et inséré dans le plasmide pRS306-pGAL1-mAG préalablement digéré par les enzymes Sacl et Notl, produisant le vecteur pCSYAQ6. Un fragment de 1472 paires de bases (pb) correspondant au gène MDM2 de Homo sapiens a été amplifié par Polymérase Chain Reaction à partir du plasmide pCDNA3-2FLAG-MDM2 en utilisant les oligonucléotides suivants : (i) MDM2-EcoRl-Fw de séquence 5'-GCGCGAATTCATGTGCAATACCAACATGTCTG-3' [SEQ ID N° 11] (ii) MDM2-Notl-Rv de séquence 5'-GGCGGCGGCCGCCTAGGGGAAATAAGTTAGCACAATC-3' [SEQ ID N°12]

Le fragment obtenu a été digéré par les enzymes de restriction EcoRl 35 et Notl. Le fragment a été cloné dans le plasmide pCSYAQ6 préparé par une digestion par les enzymes de restriction EcoRl et Notl. Le vecteur produit a été appelé pCSYAQ6-MDM2, dont le schéma est illustré sur la Figure 1. Construction de la souche de levure CYS361 Pour l'obtention de la souche de levure CYS361, le plasmide pCSYAQ6-MDM2, décrit ci-dessus, a été linéarisé en utilisant l'enzyme Stul. L'enzyme Stul clive le plasmide pCSYAQ6-MDM2 à une position unique localisée dans la séquence du gène URA3. Le plasmide pCSYAQ6-MDM2 linéarisé s'intègre au locus URA3 situé sur le bras gauche du chromosome 5 de la levure Saccharomyces cerevisiae. La souche de levure CYS361 a été obtenue par intégration du plasmide linéarisé pCSYAQ6-MDM2 dans la souche de la levure Saccharomyces cerevisiae CYS262, conformément au protocole général décrit par Rohthstein (1991).

Le génotype de la souche de levure CYS361 selon l'invention est indiqué dans le Tableau 1 ci-dessous. Construction de la souche de levure CYS424 Pour l'obtention de la souche de levure CYS424, le plasmide pCSYAQ6-Mdm2, décrit ci-dessus, a été linéarisé en utilisant l'enzyme Stul.

L'enzyme Stul clive le plasmide pCSYAQ6-MDM2 à une position unique localisée dans la séquence du gène URA3. Le plasmide pCSYAQ6-MDM2 linéarisé s'intègre au locus URA3 situé sur le bras gauche du chromosome 5 de la levure Saccharomyces cerevisiae. La souche de levure CYS424 a été obtenue par intégration du plasmide linéarisé pCSYAQ6-MDM2 dans la souche de la levure Saccharomyces cerevisiae CC788-2B, conformément au protocole général décrit par Rohthstein (1991). Le génotype de la souche de levure CYS424 selon l'invention est indiqué dans le Tableau 1 ci-dessous.30 Tableau 1 : Génotype de la souche de levure Saccharomyces cerevisiae construite pour les besoins de la présente invention. Souche Génotype CYS262 Mat-a, his3, leu2, ura3, trp1, pdrlA, pdr34 CC788- Mat--a, his3, leu2, ura3, trpl 2B CYS361 Mat-a, his3, leu2, trp1, ura3::pGAL1-mAG-MDM2::URA3, pdrlA, pdr34 CYS424 Mat-a, his3, leu2, trp1, ura3::pGAL1-mAG-MDM2::URA3 EXEMPLES 2 A 6 : Mise au point du procédé de criblage selon l'invention. EXEMPLE 2: Séquences nucléotidique et protéique Mdm2 exprimée dans les cellules de levure.

La séquence d'acides aminés codant la protéine de fusion comprenant la protéine Mdm2 consiste en le polypeptide de séquence SEQ I D N ° 2 qui peut être codé par le polynucléotide de séquence SEQ I D N ° 3.

EXEMPLE 3: Déqradation par le protéasome cellulaire de la 15 protéine humaine Mdm2 exprimée dans les cellules de levure (Résultats d'immuno-empreinte) La dégradation, par le protéasome dans les cellules de levure recombinées de la souche CYS361 de la protéine de fusion comprenant Mdm2 fusionnée avec mAG a été suivie par une technique d'immuno- 20 empreinte, en présence ou en l'absence d'un agent inhibiteur du protéasome, le composé MG132 (50 M). A. Matériel et Méthodes Toutes les souches de levure employées ont été cultivées et analysées de manière identique. 25 Les cellules ont été cultivées en milieu minimum en présence de galactose comme source de carbone pendant 120 minutes.

A l'issue de ces 120 minutes, du glucose 2 % est ajouté à la culture, en présence et en absence de 50 M d'un inhibiteur connu du protéasome, le MG132. Les résultats sont présentés sur la Figure 3 La Figure 3 présente les résultats obtenus avec la souche de levure recombinante CYS361. Les protéines totales sont préparées avant l'ajout de galactose (0), 120 minutes après l'ajout de galactose (120) et 15, 30, 60, 90 et 150 minutes (15, 30, 60, 90, 150) après l'ajout de glucose (+Glucose). Ces protéines sont analysées par la technique d'immuno-empreinte ( Western blotting ) en employant un anticorps reconnaissant la partie Mdm2 des protéines de fusion (indiquée mAG- Mdm2 sur la Figure 2). La présence de MG132 dans la culture est indiquée + MG132 sur la Figure 2. Un contrôle de la quantité de protéines déposée dans chaque puits est réalisé en analysant les mêmes protéines à l'aide d'anticorps reconnaissant la Lysyl-ARNt-synthase de levure. Clichés de gels d'immuno- empreinte ( Western blotting ) révélés avec des anticorps anti-Mdm2. B. Résultats Les résultats sont illustrés pour la souche de levure recombinante 20 CYS361. Les résultats présentés sur la Figure 2 illustrent par une analyse biochimique de type Western blotting, la dégradation de la protéine de fusion mAG-Mdm2. Sur la Figure 3, on observe que la présence de galactose durant la 25 totalité du temps de culture provoque une induction continue de la production de la protéine Mdm2 fusionnée au rapporteur fluorescent mAG, qui pallie la dégradation des protéines Mdm2 ou de la fusion mAG-Mdm2 par le protéasome qui a simultanément lieu dans les cellules de levure. Sur la Figure 2, on observe que la culture des cellules en présence de 30 glucose (indiquée + Glu sur la Figure 3), du fait que la production de la protéine Mdm2 ou de la fusion mAG-Mdm2 n'est plus induite, permet de visualiser la dégradation de la protéine Mdm2 ou de la fusion mAG-Mdm2 par le protéasome.

Sur la Figure 2, on observe que la culture des cellules en présence de glucose et d'un inhibiteur du protéasome, le composé MG132 (indiquée + 50 M MG132 sur la Figure 2) permet d'inhiber la dégradation de la protéine Mdm2 ou de la fusion mAG-Mdm2 qui est observée en l'absence du composé MG132.

EXEMPLE 4: Déqradation de la protéine mAG-MDM2 (microscopie d'épifluorescence) L'exemple 4 illustre les résultats d'une analyse au microscope 10 d'épifluorescence, de la dégradation de la protéine de fusion mAG-Mdm2 dans des cellules de levure de la souche recombinante CYS361. A. Matériel et Méthodes Les cellules de levure de la souche CYS361 ont été cultivées en 15 milieu minimum en présence de galactose comme source de carbone pendant 120 minutes. A l'issue de ces 120 minutes (1120), du glucose 2 % est ajouté à la culture, en présence et en absence de 50 M d'un inhibiteur connu du protéasome, le MG132, pendant 120 minutes (D120). 20 Les cellules sont observées au microscope à épifluorescence (microscope à fluorescence Nikon Eclipse équipé d'un filtre Omega XF116). Toutes les images ont été enregistrées en employant une caméra Hamamastu en employant des réglages identiques et analysées avec le logiciel LUCIA G. 25 B. Résultats Les résultats sont représentés sur la Figure 3. La Figure 3 illustre les résultats d'épifluorescence obtenus avec les cellules de la souche CYS361 cultivées en 120 minutes en présence de glucose et au temps 120 minutes 30 après l'arrêt de l'induction de l'expression de la protéine de fusion en présence (D120 + MG132) ou non (D120) de 50 M de MG132. Sur la Figure 3 sont représentés les clichés de microscopie à fluorescence permettant de localiser dans les cellules l'expression de la protéine de fusion mAG-Mdm2.

Sur la Figure 3, on observe une réduction du signal de fluorescence avec la durée de culture, au fur et à mesure de la progression de la dégradation de la protéine de fusion par le protéasome alors qu'n présence de l'inhibiteur du protéasome MG132 on observe un maintien de l'intensité du signal de fluorescence avec la durée de culture, ce qui illustre le blocage de l'activité de dégradation de la protéine de fusion par le protéasome, blocage qui est induit par l'inhibiteur MG132.

EXEMPLE 5: Déqradation de la protéine mAG-Mdm2 (quantification par cytomètrie de flux) L'exemple 5 illustre une quantification, par cytométrie de flux des cellules de levure de la souche CYS361, du signal de fluorescence émis par ces cellules, au cours du temps de culture, respectivement (i) pendant l'induction de la production de la protéine de fusion en présence de galactose et (ii) en présence de glucose après arrêt de la production de la protéine de fusion. Les cellules de levure ont été cultivées en présence ou en l'absence de l'inhibiteur de protéasome MG132. Les résultats sont illustrés par les courbes présentées sur la Figure 4. La Figure 4 illustre une quantification en cytométrie de flux (FACS) de la fluorescence émise par la protéine de fusion mAG-Mdm2 produite par la souche CYS361, en présence et en absence de l'inhibiteur du protéasome MG132. A. Matériel et Méthodes Toutes les cellules ont été cultivées en milieu minimum en présence de galactose comme source de carbone pendant 120 minutes. A l'issue de ces 120 minutes, du glucose 2 % est ajouté à la culture, en présence et en absence de 50 M d'un inhibiteur connu du protéasome, le MG132.

La fluorescence émise par les cellules a été quantifiée en employant un cytomètre flux FacsCalibur (Beckton-Dickinson), juste avant l'ajout de galactose (10), 30 minutes, 1 heure, 1 heure 30 minutes et 2 heures après l'ajout de galactose et 15 minutes, 30 minutes, 1 heure, 1 heure 30 minutes et 2 heures 30 minutes après l'ajout de glucose. La présence de MG132 (à 50 M) dans la culture est indiquée + MG132 . La fluorescence est rapportée en unités arbitraires B. Résultats Les résultats de la Figure 4 montrent que la protéine de fusion est activement produite par la souche de levure CYS361, lorsque les cellules sont cultivées en présence de galactose (temps 10, 11 h et 12h). Les résultats de la Figure 4 montrent que la protéine de fusion, qui s'est accumulée dans les cellules en présence de galactose, est progressivement dégradée au cours du temps de culture en l'absence de galactose et en présence de glucose, en l'absence du composé MG132 (Temps Dl h, D2h et intermédiaires). Les résultats de la Figure 4 montrent que, en présence de l'inhibiteur du protéasome MG132, la dégradation de la protéine de fusion est fortement inhibée (Temps Dl h, D2h et intermédiaires).

EXEMPLE 6: localisation, dans les cellules de levure des protéines de fusions mAG-Mdm2. Dans l'exemple 6, on a déterminé la localisation, dans les cellules de 20 levure de la souche CYS361, de la protéine mAG-Mdm2. A. Matériel et Méthodes Des cellules de levures de la souche CYS361 comprenant un polynucléotide permettant l'expression de la protéine de fusion mAG-Mdm2 25 sous le contrôle du promoteur GAL 1 ont été cultivées en présence de galactose 2 % pendant 2 heures et ont été ensuite observées en microscopie à fluorescence. La position du noyau a été révélée en employant un indicateur coloré spécifique du noyau, le Hoescht 333-42. 30 On a réalisé des clichés de microscopie en lumière visible et des clichés de microscopie à fluorescence permettant de colorer l'ADN des noyaux cellulaires avec le colorant Hoechst 333-42. On a superposé les clichés de microscopie en lumière visible et les clichés de microscopie à fluorescence (non représenté).

B. Résultats Les résultats montrent une co-localisation des noyaux cellulaires (ADN) et de la protéine de fusion mAG-Mdm2 (mAG-MDM2).

REFERENCES Ausubel et al., 1990-2004, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons Inc, N.Y. Bailis et Rothstein, 1990, Genetics Nov ; 126(3) :535-47 Cherest et aL, 1987, Mol. Gen. Genet. 210 (2) : 307-313 Cormack et al., 1996, Gene 173 : 33-38 Daujat et al., 2001, Trends Genet. Aug;17(8):459-64 Davydov et aL, 2004, Journal of Biomolecular Screening. 9(8): 695-703 Feldmann et al., 1994, EMBO J. 13(24) : 5795-5809 Gurskaya, 2003, Biochem. J. 373:403-408 Johnston et Davis, 1984, Mol. Cell. Biol. 4 : 1440-1448 Karasawa et al., 2003, J. Biol. Chem. 278:34167-34171 Karin et al., 1984, PNAS 81(2) : 337-341 Kerjan et al., 1986, Nucleic Acids Res 14(20) : 7861-7871 Matz et al, 1999, Nature Biotech. 17:969-973 Nagai et al., 2002, Nat. Biotechnol.20:87-90 Nourani et al., 1997, Mol. Cell. Biol. 17(9) : 5453- 60 Piette et al., 1997, Oncogene 15, 1001 Rothstein, 1991, Methods in Enzymology, 194:281-301 Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning, Laboratory Manual, 2nd edition, Cold Spring Harbor, N. Y. Schiestl et Gietz, 1989, Curr. Genet. Dec; 16(5-6):339-46 Shagin et al., 2004, Mol. Biol. Evol. 21:841-850 Sherman et al., 1979, Methods in Yeast Genetics : a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, N. Y. Skala et al., 1995, Yeast 14:1421-1427 Yang et al., 2005, Cancer Cell. 7(6): 547-549 Zapata-Hommer and Griesbeck, 2003, BMC Biotechnol. 3:530

Claims (17)

REVENDICATIONS

1. Procédé in cellulo pour le criblage d'agents modulant l'activité de l'ubiquitine ligase Mdm2, ledit procédé comprenant les étapes suivantes : a) mettre en contact un agent candidat à tester avec des cellules de levure recombinantes qui expriment dans leur noyau une protéine de fusion comprenant : (i) un polypeptide MDM2 et (ii) au moins une protéine détectable. b) quantifier ladite première protéine détectable dans les cellules de levure, à la fin d'au moins une période de temps prédéterminée après la mise en contact de l'agent candidat avec lesdites cellules ; c) comparer la valeur obtenue à l'étape (b) avec une valeur témoin obtenue lorsque l'étape (a) est réalisée en l'absence de l'agent candidat.

2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'étape (a) comprend les étapes suivantes : (a1) cultiver les cellules de levure qui expriment dans leur noyau ladite protéine de fusion comprenant le polypeptide MDM2 et au moins une protéine détectable ; (a2) stopper l'expression de ladite protéine de fusion comprenant le polypeptide MDM2 et au moins une protéine détectable par les cellules de levure ; (a3) mettre en contact les cellules de levures obtenues à la fin de l'étape (a2) avec l'agent candidat à tester.

3. Procédé selon l'une des revendications 1 et 2, caractérisé en ce que la protéine détectable comprise dans la protéine de fusion comprenant le polypeptide MDM2 est choisie parmi un antigène, une protéine fluorescente et une protéine ayant une activité enzymatique.

4. Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce que la protéine détectable consiste en une protéine fluorescente choisie parmi la protéine mAG ou l'un de ses dérivés, et la protéine GFP ou l'un de ses dérivés.

5. Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce que la protéine détectable consiste en une protéine ayant une activité enzymatique choisie parmi la luciferase et la R-lactamase.

6. Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce que la protéine détectable consiste en un antigène choisi parmi le peptide Ha et le peptide Flag.

7. Procédé selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que la protéine comprenant le polypeptide MDM2 consiste en la protéine de 15 séquence SEQ I D N°3.

8. Procédé selon l'une des revendications 1 à 7, caractérisé en ce qu'à l'étape (b), lorsque la première protéine détectable est un antigène, on quantifie ladite première protéine détectable par détection des complexes 20 formés entre ladite protéine et des anticorps la reconnaissant.

9. Procédé selon l'une des revendications 1 à 7, caractérisé en ce qu'à l'étape (b), lorsque la première protéine détectable est une protéine fluorescente, on quantifie ladite protéine détectable par une mesure du signal 25 de fluorescence émis par ladite protéine.

10. Procédé selon l'une des revendications 1 à 7, caractérisé en ce qu'à l'étape (b), lorsque la première protéine détectable est une protéine ayant une activité enzymatique, on quantifie ladite protéine détectable par 30 une mesure de la quantité de substrat transformé par ladite protéine.

11. Procédé selon l'une des revendications 1 à 10, caractérisé en ce que les cellules de levures recombinantes sont transformées avec un polynucléotide qui comprend :(a) un cadre de lecture ouvert codant (i) la protéine de fusion comprenant le polypeptide MDM2 et (ii) une protéine détectable, et (b) une séquence régulatrice fonctionnelle dans des cellules de levure qui dirige l'expression dudit cadre de lecture ouvert;

12. Procédé selon la revendication 11, caractérisé en ce que la séquence régulatrice contenue dans le premier polynucléotide comprenne un promoteur fonctionnel dans les cellules de levure et qui est sensible à l'action d'un agent inducteur. 10

13. Procédé selon la revendication 12, caractérisé en ce que le promoteur sensible à l'action d'un agent inducteur consiste en un promoteur répressible fonctionnel dans les cellules de levure choisi parmi CUP1, GAL 1, GAL 10, MET3, MET25, PHO5, et THI4 de la levure Saccharomyces 15 cerevisae.

14. Procédé selon la revendication 13, caractérisé en ce que ledit polynucléotide codant la protéine de fusion comprend la séquence régulatrice GAL 1, qui active l'expression du cadre de lecture ouvert codant 20 ladite protéine de fusion.

15. Procédé selon l'une des revendications 1 à 14, caractérisé en en ce que les cellules de levure recombinantes possèdent le polynucléotide sous une forme insérée dans leur génome.

16. Procédé selon l'une des revendications 1 à 15, caractérisé en ce que les cellules de levure recombinantes possèdent ou non dans leur génome une forme inactivée d'un ou plusieurs gènes contrôlant l'expression de protéines transporteurs insérées dans la membrane plasmique. 30

17. Procédé selon la revendication 16, caractérisé en ce que le ou les gènes inactivés sont choisis parmi les gènes PDR1 et PDR3. 25