WO2009080981A2 - Procede de criblage d'agents modulant l'activite de l'ubiquitine ligase de mdm2 et moyens destines a la mise en oeuvre dudit procede - Google Patents

Procede de criblage d'agents modulant l'activite de l'ubiquitine ligase de mdm2 et moyens destines a la mise en oeuvre dudit procede Download PDF

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WO2009080981A2
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mdm2
yeast cells
detectable
fusion protein
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Cécile BOUGERET
Jean-François BRIAND
Patrick Zarzov
Dominique Thomas
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Cytomics Pharmaceuticals
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
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    • G01N2333/90—Enzymes; Proenzymes
    • G01N2333/9015—Ligases (6)

Definitions

  • the present invention relates to the field of screening for biologically active agents capable of modulating the ubiquitin ligase activity of Mdm2, in particular agents of therapeutic interest intended to prevent or treat cancers.
  • the Mdm2 oncogene is the main negative regulator of the p53 tumor suppressor. Mdm2 amplification is observed in approximately 10% of cancers with a high frequency (35%) in soft tissue sarcomas. The overexpression of Mdm2 promotes the development of tumors by inhibiting in particular the anti-proliferative functions of the p53 transcriptional activator. Nevertheless, there is strong evidence for p53 independent Mdm2 oncogenic functions (Daujat et al., Trends Genet 2001 Aug; 17 (8): 459-64, Piette et al., 1997, Oncogene 15, 1001).
  • the p53 gene protein plays a major role in the formation of tumors. Half of the people inheriting a mutated copy of this gene develop tumors before the age of 30 (Li-Fraumeni syndrome), and 100% of mice lacking functional copies of this gene die of tumors before age 6 months. In patients with cancer but not carrying a germline mutation of the p53 gene, it has been demonstrated that 50% of tumors have acquired a somatic mutation of this gene.
  • Activation of the p53 protein by a wide variety of cellular stresses results in cessation of cell division cycles and ultimately leads to cell death (apoptosis).
  • the existence of such a mechanism thus protects the body against the proliferation of potentially oncogenic cells.
  • p53 is a transcription factor. It inhibits the development of tumors by activating the transcription of certain genes whose overexpression induces cell cycle arrest or apoptotic cell death. Like most transcription factors, p53 has multiple target genes. The first genes to increase their transcription in response to the activation of the protein are the p21 WAF1 / CIP1 and MDM2 genes. The protein p21Waf1 / Cip1, which belongs to the family of CDK inhibitors, Cyclin
  • the level of p21Waf1 / Cip1 decreases and the cell can then begin to divide again.
  • the resumption of cell divisions is favored by the existence of a negative feedback loop that includes another p53 target gene, the MDM2 gene.
  • the Mdm2 protein regulates the activity of the p53 transcriptional activator according to several mechanisms.
  • Mdm2 is able to bind to the activation domain of p53 transcription and thus blocks its interaction with general transcription factors.
  • the p53-Mdm2 complex thus formed is therefore incapable of activating the RNA polymerase II and initiating the transcription of the target genes.
  • the signaling pathway that activates p53 acts by inducing the phosphorylation of serine 20, which has the consequence of inhibiting the p53-Mdm2 interaction, and also the phosphorylation of serine 15, the latter modification promoting the interaction of p53 with the basic transcription machinery.
  • the phosphorylation of serine therefore has important functional consequences since it leads to a sharp increase in the synthesis of Mdm2, the p53 inhibitor.
  • Mdm2 In addition to its role in regulating the interaction established between p53 and general transcription factors, Mdm2 has the ability to permanently inactivate p53 by inducing its degradation. Mdm2 indeed belongs to the family of ubiquitin ligases and catalyzes the covalent addition of ubiquitin chains to certain lysine residues present in the carboxy-terminal part of p53. These modifications, by changing the structure of p53, induce the export of p53 from the nucleus to the cytoplasm where the protein is then recognized and degraded by the proteasome, a large multiprotein complex that recognizes ubiquitylated proteins and degrades them into small inactive polypeptides. In a healthy cell, the levels of p53 and Mdm2 are low and following the activation of p53, the level of these proteins is strongly elevated.
  • Mdm2 In addition to its role in the ubiquitination of p53, Mdm2, like some other ubiquitin ligases, catalyzes its own poly-ubiquitination and thus its own degradation by the proteasome. Thus, in response to DNA damage, the Mdm2 protein is phosphorylated at multiple sites by protein kinases specifically activated by this type of stress (such as ATM and ATR). These phosphorylations play a determining role in the destabilization of Mdm2 resulting from its auotubiquitination. Onco ⁇ ou ⁇ ues functions of Mdm2 independent of p53:
  • the present invention provides a mechanism for in vivo study of the degradation of Mdm2 induced by its self-ubiquitination.
  • the protein degradation pathway by the proteasome is a complex process involving many regulators.
  • the Applicant has shown that, surprisingly, it is possible to mimic, in yeast cells, the process of degradation of the Mdm2 ubiquitin ligase by the proteasome, a process that occurs naturally in human cells.
  • the subject of the invention is an in cellulo method for screening agents that modulate the ubiquitin ligase activity of the human protein Mdm2 on itself, comprising the following steps: a) contacting a candidate agent to be tested with recombinant yeast cells which express: i) a fusion protein comprising an Mdm2 polypeptide and at least one detectable protein. b) quantifying said first detectable protein in the yeast cells at the end of at least a predetermined period of time after contacting the candidate agent with said cells; c) comparing the value obtained in step (b) with a control value obtained when step (a) is performed in the absence of the candidate agent.
  • the process of the invention consists of a process which is carried out in cellulo, since the degradation of the target protein Mdm2 is carried out and visualized in yeast cells and not by reactions carried out in a cell-free system.
  • the total degradation of the fusion protein: detectable protein-Mdm2, observed in the yeast cells, makes it possible to measure the amount of fusion protein present in the yeast cells by quantifying the signal generated by the detectable protein included in said protein of yeast. fusion.
  • the above method allows one skilled in the art to determine whether a candidate agent to be tested is capable of modifying the rate of degradation, or degree of degradation, of the Mdm2 protein by the proteasome in yeast cells.
  • the inventive cellulo screening method in that it implements an artificial and humanized system for degradation of a target fusion protein in yeast cells, allows screening of agents which act specifically on the stability of the only human protein expressed in these cells.
  • a physiological test for the screening of active agents on a ubiquitin ligase pathway has been developed, by constructing in yeast a metabolic pathway of protein degradation mimicking the degradation pathway by the proteasome of human Mdm2 ligase.
  • the method of the invention is carried out under physiological conditions very close to the physiological conditions of degradation of proteins by the human proteasome.
  • an agent that "modulates" Mdm2 ubiquitin ligase activity includes, respectively, (i) an agent that inhibits or blocks Mdm2 ubiquitin ligase activity and (ii) an agent that activates or increases the activity of Mdm2 ubiquitin ligase.
  • inhibitory agents which can be identified by the process of the invention, because they will also inhibit the activity of the Mdm2 ligase in human cells, constitute agents of therapeutic interest capable of inhibiting or inhibiting block the proliferation of tumor cells, inhibit or block the activation of the expression of various genes involved in cancers, disrupt mechanisms for controlling cell death (apoptosis).
  • the above cellulo screening method may comprise an additional step (d) of positively selecting the inhibitory candidate agents for which the amount of detectable protein measured in step (b) is greater than the control value of comparison.
  • the method of the invention also makes it possible to identify agents capable of increasing the rate or degree of degradation of the Mdm2 polypeptide by the proteasome of yeast cells.
  • Such activating agents because they will also increase the self-ubiquitination activity of Mdm2 in human cells, constitute agents of therapeutic interest capable of inducing or increasing the activation of expression. of various genes involved in cancers.
  • Some of the agents selected according to the method are likely to have pro-apoptotic activities if they specifically increase, for example, the self-ubiquitination activity of Mdm2 without increasing the activity of Mdm2 ubiquitin ligase on its (or some of its) targets such as p53 for example.
  • the screening method according to the invention may comprise an additional step (d) which consists in positively selecting the activating candidate agents for which the amount of detectable protein measured in step (b) is less than to the comparison control value.
  • the agent modulating the ubiquitin ligase activity of Mdm2 can be of any kind.
  • the agent may be any organic or inorganic compound, and may be either a naturally occurring agent or an agent produced, at least in part, by chemical or biological synthesis.
  • Said agent may in particular be a peptide or a protein.
  • Said agent also includes any molecule already known to have a biological effect, including a therapeutic effect, or conversely a toxic effect demonstrated or suspected for the body.
  • a Mdm2 polypeptide according to the invention consists of a polypeptide having at least 90% amino acid identity with the Mdm2 polypeptide of sequence SEQ ID No. 1.
  • a Mdm2 polypeptide according to the invention may consist of the Mdm2 polypeptide of sequence SEQ ID No. 1.
  • nucleotide sequence may be used to denote either a polynucleotide or a nucleic acid.
  • nucleotide sequence encompasses the genetic material itself and is therefore not restricted to information about its sequence.
  • nucleic acid includes RNA sequences, DNA sequences, cDNA sequences or hybrid RNA / DNA sequences of more than one nucleotide, regardless of in the single-stranded form or in the form of duplex.
  • nucleotide refers to natural nucleotides (A, T, G, C and U).
  • a first polynucleotide is considered to be "complementary" to a second polynucleotide when each base of the first nucleotide is paired with the complementary base of the second polynucleotide whose orientation is reversed.
  • the complementary “bases” are A and T (or A and U), and C and G.
  • a first nucleic acid having at least 90% identity with a second reference nucleic acid will have at least 90%, preferably at least 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 97.5%, 98%, 98.3% 98.6%, 99%, 99.6% nucleotide identity with said second reference nucleic acid.
  • a first polypeptide having at least 90% identity with a second reference polypeptide will have at least 90%, preferably at least 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96% 97%, 97.5%, 98%, 98.3% 98.6%, 99%, 99.6% amino acid identity with said second reference polypeptide.
  • the "percent identity" between two nucleic acid sequences or between two polypeptide sequences in the sense of the present invention is determined by comparing the two optimally aligned sequences through a comparison window.
  • the part of the nucleotide or amino acid sequence in the comparison window may thus comprise additions or deletions (for example
  • the percent identity is calculated by determining the number of positions at which an identical nucleotide base, or identical amino acid residue, is observed for the two compared sequences, and then dividing the number of positions at which there is identity between the two nucleic bases, or between the two amino acid residues, by the total number of positions in the comparison window, then multiplying the result by one hundred to obtain the nucleotide identity percentage of the two sequences between them, or the percentage of amino acid identity of the two sequences between them.
  • the optimal alignment of the sequences for the comparison can be performed in a computer manner using known algorithms.
  • the step (1) it has been shown that the sensitivity of the screening method described above is increased when, prior to contacting the yeast cells with the agent to be tested, the expression of the target Mdm2 protein is stopped in the yeast cells, ie the Mdm2-detectable protein fusion protein.
  • the step (2) it has been shown that the sensitivity of the screening method described above is increased when, prior to contacting the yeast cells with the agent to be tested, the expression of the target Mdm2 protein is stopped in the yeast cells, ie the Mdm2-detectable protein fusion protein.
  • step (a3) contacting the yeast cells obtained at the end of step (a2) with the candidate agent to be tested.
  • the Mdm2-detectable protein fusion protein self-ubiquitin and is rapidly recognized and degraded by the proteasome in yeast cells.
  • the optimum conditions for carrying out the screening method according to the invention are the conditions under which an intracellular accumulation of a large quantity of the Mdm2-detectable protein fusion protein which is expressed in the yeast cells is induced.
  • the greater the intracellular quantity of Mdm2-detectable protein fusion protein at the beginning of step a) of the process the higher the value of the signal generated by the detectable protein, which can be measured with great accuracy at the time of detection. step b) of the process.
  • the greater the intracellular quantity of the Mdm2-detectable protein fusion protein at the beginning of step a) the more accurately the quantity variations of this fusion protein can be measured in step b) of the method .
  • yeast cells To obtain the accumulation of a large intracellular amount of the Mdm2-detectable protein fusion protein in yeast cells, it is advantageous to place the sequence coding for said fusion protein under the control of a strong repressible promoter and using yeast strains having multiple copies of a polynucleotide comprising (i) a strong repressible promoter, (ii) a nucleic acid encoding the detectable Mdm2-protein fusion protein.
  • yeast strains having multiple copies of a polynucleotide comprising (i) a strong repressible promoter, (ii) a nucleic acid encoding the detectable Mdm2-protein fusion protein.
  • yeast cells are used in which the copy or copies of the polynucleotide encoding the Mdm2-detectable protein fusion protein are (are) integrated into the chromosome.
  • This advantageous embodiment allows the intracellular accumulation of the Mdm2-detectable protein fusion protein at a high level in all cultured yeast cells for the implementation of the method.
  • This embodiment of the screening method of the invention is an advantage over the use of yeast cells transformed by plasmids in each of which one or more copies of the polynucleotide encoding the Mdm2-detectable protein fusion protein is ( are) inserted.
  • the yeast cells that express the Mdm2-detectable protein fusion protein consist of cells containing one or more recombinant vectors, in particular one or more recombinant plasmids, in which at least one copy of the polynucleotide encoding the protein is inserted.
  • Mdm2 fusion-detectable protein it may happen that the transmission of said recombinant vectors of interest is not achieved in a homogeneous manner, with successive generations of yeast cells.
  • the level of intracellular expression of the Mdm2- fusion protein detectable protein would be heterogeneous within all cultured yeast cells, which would be likely to reduce the sensitivity of the screening method of the invention.
  • the detectable protein which is included in the Mdm2-detectable protein fusion protein can be of any kind, since its presence can be specifically detected in the yeast cells before its proteolysis and the presence of proteolytic forms of the detectable protein, in particular peptide fragments produced by proteolysis of said detectable protein, are not detected by the specific detection means which is chosen.
  • the stability of the Mdm2 polypeptide is followed, according to the method of the invention, by measuring the stability of the Mdm2-detectable protein fusion protein. Thanks to the expression in yeast cells of the Mdm2 factor in the form of fusion protein, the degradation of the fusion protein containing Mdm2 can be monitored in real time, by detection of the non-proteolysed detectable protein.
  • degradation of the fusion protein may be followed by techniques known per se, including fluorescence measurement techniques using either a flow cytometer or a fluorescence flow cytometer. a microplate reader, either of a fluorimeter, or by means of a fluorescence microscope, or by colorimetric, enzymatic or immunological techniques.
  • the detectable protein may be chosen from an antigen, a fluorescent protein or a protein having an enzymatic activity.
  • the detectable protein when the detectable protein consists of an antigen, it can be any type of antigen, since antibodies specific for this antigen are already accessible or, alternatively, they can be prepared, according to any technique for obtaining antibodies, especially for polyclonal or monoclonal antibodies, well known to those skilled in the art.
  • the detectable protein consists of a small antigen, which is not likely to interfere with the self-ubiquitination activity of Mdm2 or the recognition of poly-ubiquitinated Mdm2 by the proteasome.
  • antigen a peptide having a chain of 7 to 100 amino acids in length, better 7 to 50 amino acids in length, and more preferably 7 to 30 amino acids in length, for example 10 acids.
  • amines of length By way of illustration, one can use the HA antigen of sequence [NH 2 -YPYDVPDYA-COOH] SEQ ID No. 4, or a FLAG antigen of sequence [NH 2 -DYKDDDDK-COOH] SEQ ID No. 5 (FLAG monomer ) or sequence [NH 2 -MDYKDHDGDYKDHDI DYKDDDDK-COOH] SEQ ID No. 6 (trimer FLAG).
  • an antibody which specifically recognizes the antigen included in the fusion protein is used to quantify the protein detectable in step (b) of the method, this antibody being labeled directly or indirectly.
  • step (b) when the first detectable protein is an antigen, said first detectable protein is quantified by detecting complexes formed between said protein and recognizing antibodies.
  • the detectable protein consists of an intrinsically fluorescent protein
  • it is especially chosen from the mAG protein, the GFP protein or one of its derivatives, the YFP protein or one of its derivatives, and the dsRED protein.
  • the proteins derived from the GFP protein it is possible to use in particular any of the proteins known under the names GFPMut3 (Cormack et al., Gene (1996) 173: 33-38),
  • the DsRed protein from Discosoma sp. and described by M. V. Matz et al (1999, Nature Biotech 17: 969-973).
  • the mAG protein also called "monomeric Azami-Green" originating from the coral of Galaxeidae, will be used; and described by Karasawa et al. (Karasawa et al., J. Biol Chem 2003 278: 34167-34171).
  • the detectable protein is quantified in step (b) of the method by measuring the fluorescence signal that is emitted by the Mdm2-fluorescent protein fusion protein using any adapted device.
  • the detectable protein is a fluorescent protein
  • said detectable protein is quantified by measuring the fluorescence signal emitted by said protein.
  • the detectable protein consists of a protein with enzymatic activity
  • said detectable protein is chosen in particular from luciferase and ⁇ -lactamase.
  • the detectable protein is quantified in step (b) of the process by measuring the amount of compound (s) produced by the conversion of the substrate by the enzyme.
  • step (b) when the first detectable protein is a protein having an enzymatic activity, said detectable protein is quantified by measuring the amount of substrate transformed by said protein.
  • the protein comprising the polypeptide
  • Mdm2 consists of the amino acid sequence protein SEQ ID No. 2, which can be encoded by the nucleic acid of sequence SEQ ID No. 3.
  • the protein of SEQ ID No. 2 sequence consists, from the 2 -terminal NH end to the COOH-terminal end, respectively in (i) the sequence of the detectable mAG protein ranging from the amino acid in position 1 to the at the amino acid at position 226, (ii) a first spacer peptide ranging from amino acid at position 227 to the amino acid at position 228 and (iii) the polypeptide Mdm2 from the amino acid in position 229 to the amino acid at position 719.
  • 3 consists, from the 5 'end to the 3' end, respectively in (i) the sequence coding for the detectable protein mAG ranging from the nucleotide at position 1 to the nucleotide at position 678, (ii) the sequence encoding a spacer peptide ranging from nucleotide at position 679 to the nucleotide at position 684 and (iii) the sequence encoding Mdm2 polypeptide ranging from nucleotide to position 685 to nucleotide at position 2160 (stop codon included).
  • the above polynucleotide may consist of the nucleic acid of sequence SEQ ID No. 3.
  • Nucleic acids which, when introduced into yeast cells, cause the expression of the Mdm2-detectable protein fusion protein, that is to say nucleic acids encoding the protein, are synthesized according to the invention.
  • Mdm2 fusion-detectable protein Each of the synthesized nucleic acids comprises a coding sequence, which is also referred to as an "open reading frame” or "ORF” which encodes the Mdm2-detectable protein fusion protein of interest.
  • An illustrative example of nucleic acids according to the invention are the nucleic acids of sequence SEQ ID No. 3 (Mdm2-detectable protein), whose structure has been described previously in the description.
  • Each of the nucleic acids also comprises a regulatory sequence comprising a promoter functional in yeast cells.
  • the functional promoter in yeast cells consists of a repressible promoter, that is to say a functional promoter in yeast cells and which is sensitive to the action of an inducing agent.
  • the inducing agent When the inducing agent is added to the culture medium of the yeast cells, it induces the repression or the blocking of the expression of the sequence encoding the protein of interest placed under its control.
  • This repressible promoter is advantageously chosen from the promoters CUP1, GAL1, GAUO, MET3, MET25, PHO5, PHO87 and THI4 of the yeast Saccharomyces cerevisiae.
  • the promoter sequence of the S. cerevisiae yeast GAL1 gene that may be used according to the invention may consist of that described by Johnston and Davis (Mol. IECI. Biol. (1984) 4: 1440-1448).
  • the promoter sequence of the S. cerevisiae yeast MET3 gene that can be used according to the invention may consist of that described by Cherest et al. (Mol Gen. Genet (1987) 210 (2): 307-313).
  • the promoter sequence of the THI4 gene of S. cerevisiae yeast which can be used according to the invention may consist of that described by Skala et al., Yeast (1995) 14: 1421-1427.
  • the nucleic acid or polynucleotide that encodes the Mdm2-detectable protein fusion protein comprises the regulatory sequence
  • the expression of the protein containing Mdm2 is specifically stopped (in an experiment known to those skilled in the art under the name of "promoter shut off") before to expose the cells to the molecules to be screened.
  • This termination of the expression is obtained by the addition in the culture medium of a molecule that can repress the activity of the promoter controlling the expression of the Mdm2-detectable protein fusion protein, or else by eliminating the presence, in the culture medium, of an agent or a molecule required for the activation of said promoter.
  • the Mdm2-detectable protein fusion protein when expressed under the control of the GAL1 gene promoter, then the expression of this promoter is repressed by adding glucose to the final concentration of 2% in the culture medium. Stopping the neo-synthesis of the fusion protein comprising Mdm2 makes it possible to measure its stability in real time, for example by determining the fluorescence of the yeast cells during the time after stopping synthesis, in the embodiment wherein said fusion protein contains a detectable intrinsically fluorescent protein, such as mAG or a GFP-derived protein.
  • a detectable intrinsically fluorescent protein such as mAG or a GFP-derived protein.
  • the invention also relates to a functional expression cassette in yeast cells comprising a polynucleotide which comprises an open reading frame encoding the fusion protein comprising the Mdm2 polypeptide and at least one detectable protein, and a regulatory sequence functional in yeast cells that directs the expression of said open reading frame.
  • a functional expression cassette in yeast cells comprising a polynucleotide which comprises an open reading frame encoding the fusion protein comprising the Mdm2 polypeptide and at least one detectable protein, and a regulatory sequence functional in yeast cells that directs the expression of said open reading frame.
  • Such an expression cassette may in particular be characterized in that the Mdm2 polypeptide is the Mdm2 polypeptide of sequence SEQ ID No. 1.
  • Such an expression cassette may in particular comprise or consist of the nucleic acid of sequence SEQ ID No. 3 according to the invention, which encodes the mAG-Mdm2 fusion protein of sequence SEQ ID No. 2.
  • the regulatory sequence comprises a repressible promoter functional in yeast cells, and which is sensitive to the action of an inducing agent, such as a promoter chosen from the promoters CUP1, GAL1, GAUO, MET3, MET25, PHO5, and THI4 of the yeast Saccharomyces cerevisiae.
  • the recombinant yeast cells possess the nucleic acid or the polynucleotide comprising the sequence coding for the Mdm2-protein fusion protein detectable in a form integrated into their genome, such as this is illustrated in the examples.
  • the yeast cells are transformed with the nucleic acid or the polynucleotide comprising the sequence coding for the Mdm2-detectable protein fusion protein which is in a non-integrated form. in the chromosomes, for example in the form of functional vectors in yeast cells and which carry at least one origin of functional replication in yeast cells.
  • yeast cells which have good membrane permeability, including good membrane permeability for the agents to be tested by the method.
  • yeast cells which have good membrane permeability for the "inducing" compounds to which said repressible promoters are sensitive.
  • yeast strains whose genome comprises one to several mutations which increase the permeability to the products to be tested, such as mutations inactivating the PDR1 and PDR3, two genes encoding transcriptional factors that in yeast control the expression of transporters inserted into the plasma membrane (Nourani et al., 1997).
  • the yeasts are preferably converted by plasmids constructed according to conventional molecular biology techniques, in particular according to the protocols described by Sambrook et al. (1989) and Ausubel et al. (1990-2004).
  • a vector according to the invention is the vector pCSYAQ6-MDM2 which is described in the examples, and which was used for the construction of yeast strains CYS361 and CYS424. [ Figure 1 A showing the vector map pCSYAQ6-MDM2]
  • the invention relates to recombinant yeast strains according to the above definition, which consists of the yeast strains CYS361 and CYS424, which express the fusion protein comprising the Mdm2 polypeptide and the detectable protein mAG, c that is, the fusion protein of sequence SEQ ID No. 2.
  • the screening method according to the invention makes it possible to visualize the Mdm2 ubiquitin ligase activity in yeast cells.
  • This method is particularly advantageous for screening molecules or agents capable of acting on the pathologies associated with excessive or insufficient degradation of Mdm2, such as certain cancers.
  • the main advantages of the screening method of the invention include the following:
  • the ubiquitin ligase activity of Mdm2 as it exists in the cells is visualized simply by virtue of the controlled expression of the wild-type human protein Mdm2 in yeast cells.
  • the Mdm2 protein is expressed as a fusion protein with an intrinsically fluorescent protein, such as mAG or GFP
  • the stability of Mdm2 is directly measured by the quantification of the fluorescence emitted by the hybrid protein.
  • the Mdm2 protein is expressed as a fusion protein with a protein such as luciferase
  • the stability of Mdm2 is directly measured by the quantification of the luminescence emitted by the hybrid protein in the presence of a substrate such as fluorescein. .
  • the suitability with a therapeutic context the stability of Mdm2 is monitored according to a functional test carried out in whole cells.
  • the inventive cellulo screening method thus makes it possible to select molecules capable of activating or inhibiting Mdm2 ubiquitin ligase activity in a context similar to that of their ultimate therapeutic use.
  • the screening method according to the invention is specific because it is based on the expression, in an organism heterologous to the human organism, of the human protein Mdm2.
  • the molecules selected by the screening method of the invention will be specific for the ubiquitin ligase activity of Mdm2, and therefore will not be selected molecules because, for example, of their ability to interfere with one of the many signaling pathways inducing the degradation of Mdm2 in human cells.
  • the degradation of Mdm2 by the proteasome is induced by a completely artificial and fully reproducible metabolic pathway, such as, for example, the addition of glucose to block the activity of the GAL 1 promoter, when Mdm2 is expressed under the control of this promoter.
  • a completely artificial and fully reproducible metabolic pathway such as, for example, the addition of glucose to block the activity of the GAL 1 promoter
  • Mdm2 is expressed under the control of this promoter.
  • the stability of the recombinant yeast strains the integration techniques in a chosen location of a yeast chromosome and targeted replacement of genes allow the construction of recombinant yeast strains expressing the fusion protein containing Mdm2 from the chromosomes of the yeast. These recombinant yeast strains are genetically stable and can be multiplied and stored indefinitely.
  • yeast is a fast-growing and high-yielding microorganism.
  • the screening method of the invention is preferably carried out by culturing the yeast cells in a complete culture medium, in which the growth of the yeast cells is particularly rapid and the yield is particularly high, which makes it possible to obtain a large amount of recombinant yeast cells for the simultaneous realization of a large number of screening tests.
  • the yeast is a microorganism whose culture, storage and characterization are inexpensive
  • the automation of the screening process of the invention the yeast is a microorganism whose culture, carried out in a low volume of medium, at low temperature, in a conventional atmosphere, in the air, is particularly suitable for the automation (robotization) of screening methods.
  • FIG. 1 represents the map of the recombinant plasmid encoding a Mdm2-detectable protein fusion protein: plasmid pCSYAQ6-MDM2 including an expression cassette coding for the mAG-Mdm2 fusion protein
  • Figure 2 depicts immunoblotting ("Western Blotting") images illustrating the degradation of fusion protein comprising mdm2 fused with mAG, in the presence or absence of a proteasome inhibitory agent, compound MG132. The results are illustrated for the recombinant yeast strain CYS361.
  • FIG. 1 represents the map of the recombinant plasmid encoding a Mdm2-detectable protein fusion protein: plasmid pCSYAQ6-MDM2 including an expression cassette coding for the mAG-Mdm2 fusion protein
  • Figure 2 depicts immunoblotting ("Western Blotting") images illustrating the degradation of fusion protein comprising mdm2 fused with mAG, in the presence or
  • FIG. 3 represents epifluorescence microscopy images, the degradation of the mAG-Mdm2 fusion protein in yeast cells of the recombinant strain CYS361, in the presence or in the absence of a proteasome inhibitory agent, the MG132 compound.
  • Figure 3A CYS361 cells at time 0;
  • FIGS. 3B CYS361 cells at time 120 minutes after induction by glucose;
  • Figure 3C CYS361 cells at time 120 minutes after stopping induction by glucose in the absence of MG132;
  • Figure 3D CYS361 cells at time 120 minutes after stopping induction by glucose in the presence of MG132;
  • FIG. 4 illustrates the cytometric quantification of the flow of yeast cells of strain CYS361, of the fluorescence signal emitted by these cells, during the culture time, respectively (i) during the induction of the production of the protein mAG-Mdm2 fusion in the presence of galactose and (ii) in the presence of glucose after stopping the production of the fusion protein.
  • the yeast cells were cultured in the presence or absence of the proteasome inhibitor MG132 (50 ⁇ M).
  • the sequence of the mAG (monomeric Azami-Green) gene of the Galaxeidae coral encoding the fluorescent protein referred to below as the mAG term is that deposited at GenBankTM / EBI Data Bank with the accession number AB108447.
  • the sequence of plasmid pRS306 is that deposited in the database
  • the promoter sequence of the S. cerevisiae yeast GAL1 gene used in the following descriptions is fully included in the sequence deposited in the EMBL databank, identifier "SCGAL10", accession number K021 15.
  • the promoter sequence The GAL 1 gene of the yeast S. cerevisiae, which may be used according to the invention, may consist of that described by Johnston and Davis (Mol., C. Biol., (1984) 4 (8): 1440-1448).
  • the promoter sequence of the gene MET3 ⁇ e the yeast S. cerevisiae may be used according to the invention may consist of that described by Cherest et al. (Mol Gen. Genet (1987) 210 (2): 307-313).
  • the promoter sequence of the S. cerevisiae yeast MET25 gene that can be used according to the invention may consist of that described in Kerjan et al. (Nucleic Acids Res (1986) 14 (20): 7861-7871).
  • the promoter sequence of the S. cerevisiae yeast PHO ⁇ gene that can be used according to the invention may consist of that described by Feldmann et al. (EMBO J. (1994) 13 (24): 5795-5809).
  • the promoter sequence of the THI4 gene of S. cerevisiae yeast, which can be used according to the invention may consist of that described by Skala et al., Yeast (1995) 14: 1421-1427.
  • the promoter sequence of the CUP1 gene of S. cerevisiae yeast, which can be used according to the invention may consist of that described by Karin et al. (PNAS (1984) 81 (2): 337-341).
  • the name of the protein is that of the gene that the code is given in lowercase, except the first letter which is in upper case ex Gal4 (alternatively we can use the same symbol followed by a p, example Gal4p).
  • the following plasmid allows the expression in the yeast Saccharomyces cerevisiae of a derivative of the human protein Mdm2 fused to the fluorescent protein mAG coral Galaxeidae.
  • a fragment of 614 base pairs (pb) corresponding to the promoter of the GAL 1 gene (pGAL1) of the yeast Saccharomyces cerevisiae was amplified by Polymerase Chain Reaction (PCR) from genomic DNA of a wild S. cerevisiae strain.
  • oligonucleotides (i) "pGAL.1 (Asp) Forw” of sequence ⁇ '-GCTGGGTACCTTAATAATCATATTACATGGCATTA-S '[SEQ ID NO: 7], and (ii) "pGAL.1 (Xho ) Sequence Rev ⁇ '-CGACCTCGAGTATAGTTTTTTCTCCTTGACGTTAA -S 'SEQ ID NO: 8].
  • the resulting fragment was digested with restriction enzymes Asp7 ' and XhoI and inserted into the S. cerevisiae-E shuttle plasmid.
  • coli pRS306 previously digested with the enzymes / 4sp7181 and Xho ⁇ , producing the vector pRS306-pGAL1.
  • ADH1 (tADH1) of the yeast Saccharomyces cerevisiae was amplified by Polymerase Chain Reaction (PCR) from genomic DNA of a wild strain of S.cerews / ae X2180-1A, using the following oligonucleotides:
  • a 1472 base pair (bp) fragment corresponding to the Homo sapiens MDM2 gene was amplified by Polymerase Chain Reaction from the plasmid pCDNA3-2FLAG-MDM2 using the following oligonucleotides: (i) "MDM2-EcoRI-Fw” from sequence ⁇ '-GCGCGAATTCATGTGCAATACCAACATGTCTG-S '[SEQ ID NO: 1 1] (ii) "MDM2-NotI-Rv” of sequence ⁇ '-GGCGGCGGCCGCCTAGGGGAAATAAGTTAGCACAATC-S' [SEQ ID NO: 12]
  • the resulting fragment was digested with restriction enzymes EcoRI and NotI.
  • the fragment was cloned into the plasmid pCSYAQ ⁇ prepared by digestion with restriction enzymes EcoRI and NotI.
  • the product vector was named pCSYAQ ⁇ -MDM2, the scheme of which is shown in Figure 1.
  • the plasmid pCSYAQ6-MDM2 was linearized using the StuI enzyme.
  • the StuI enzyme cleaves plasmid pCSYAQ6-MDM2 at a unique position localized in the gene sequence
  • the linearized plasmid pCSYAQ6-MDM2 integrates with the URA3 locus located on the left arm of chromosome 5 of the yeast Saccharomyces cerevisiae.
  • the yeast strain CYS361 was obtained by integration of the linearized plasmid pCSYAQ6-MDM2 in the yeast strain Saccharomyces cerevisiae CYS262, according to the general protocol described by Rohthstein (1991).
  • yeast strain CYS361 The genotype of yeast strain CYS361 according to the invention is shown in Table 1 below.
  • the plasmid pCSYAQ6-Mdm2 was linearized using the StuI enzyme.
  • the StuI enzyme cleaves plasmid pCSYAQ6-MDM2 at a unique position located in the URA3 gene sequence.
  • the linearized plasmid pCSYAQ6-MDM2 integrates with the URA3 locus located on the left arm of chromosome 5 of the yeast Saccharomyces cerevisiae.
  • the yeast strain CYS424 was obtained by integration of the linearized plasmid pCSYAQ6-MDM2 into the yeast strain Saccharomyces cerevisiae CC788-2B, according to the general protocol described by Rohthstein (1991).
  • the genotype of the yeast strain CYS424 according to the invention is shown in Table 1 below.
  • Table 1 Genotype of the yeast strain Saccharomyces cerevisiae constructed for the purposes of the present invention.
  • amino acid sequence coding for the fusion protein comprising the Mdm2 protein consists of the polypeptide of sequence SEQ ID No. 2 which may be encoded by the polynucleotide of sequence SEQ ID No. 3.
  • EXAMPLE 3 Degradation by the Cellular Proteasome of the Human Protein Mdm2 Expressed in Yeast Cells (Immunoblot Results)
  • proteasome degradation in the recombinant yeast cells of the CYS361 strain of the fusion protein comprising mdm2 fused with mAG was followed by an immunoblot technique, in the presence or absence of an inhibitory agent. proteasome, the compound MG132 (50 ⁇ M).
  • yeast strains employed were grown and analyzed identically. The cells were cultured in a minimum medium in the presence of galactose as carbon source for 120 minutes.
  • FIG. 3 presents the results obtained with the recombinant yeast strain CYS361.
  • the total proteins are prepared before the addition of galactose (0), 120 minutes after the addition of galactose (120) and 15, 30, 60, 90 and 150 minutes (15, 30, 60, 90, 150) after addition of glucose (+ Glucose).
  • FIG. 2 illustrate, by a biochemical analysis of Western blotting type, the degradation of the mAG-Mdm2 fusion protein.
  • FIG. 2 it is observed that the culture of the cells in the presence of glucose (indicated “+ Glu” in FIG. 3), since the production of the Mdm2 protein or of the mAG-Mdm2 fusion is no longer induced, allows to visualize the degradation of the Mdm2 protein or the mAG-Mdm2 fusion by the proteasome.
  • FIG. 2 it is observed that the culture of the cells in the presence of glucose and of a proteasome inhibitor, compound MG132 (indicated “+ 50 ⁇ M MG132" in FIG. 2) makes it possible to inhibit the degradation of the Mdm2 protein. or mAG-Mdm2 fusion which is observed in the absence of MG132.
  • Example 4 illustrates the results of an epifluorescence microscope analysis, the degradation of the mAG-Mdm2 fusion protein in yeast cells of the recombinant strain CYS361.
  • the yeast cells of strain CYS361 were cultured in a minimum medium in the presence of galactose as carbon source for 120 minutes.
  • the cells are observed under an epifluorescence microscope (Nikon Eclipse fluorescence microscope equipped with an Omega XF1 16 filter). All images were recorded using a Hamamastu® camera using identical settings and analyzed with LUCIA G software.
  • FIG. 3 illustrates the epifluorescence results obtained with cells of strain CYS361 cultured in 120 minutes in the presence of glucose and at the time 120 minutes after stopping of induction. the expression of the fusion protein in the presence (D120 + MG132) or not (D120) of 50 ⁇ M MG132.
  • FIG. 3 shows the fluorescence microscopy images making it possible to locate in the cells the expression of the mAG-Mdm2 fusion protein.
  • FIG. 3 a reduction of the fluorescence signal with the culture time is observed as the degradation of the fusion protein by the proteasome progresses while the presence of the MG132 proteasome inhibitor is observed.
  • a maintenance of the fluorescence signal intensity with the culture time which illustrates the blocking of the degradation activity of the fusion protein by the proteasome, a blocking which is induced by the inhibitor MG132.
  • Example 5 illustrates a quantization, by flow cytometry of the yeast cells of strain CYS361, of the fluorescence signal emitted by these cells, during the culture time, respectively (i) during the induction of the production of the fusion protein in the presence of galactose and (ii) in the presence of glucose after stopping the production of the fusion protein.
  • the yeast cells were cultured in the presence or absence of the MG132 proteasome inhibitor.
  • FIG. 4 illustrates a flow cytometric quantification (FACS) of the fluorescence emitted by the mAG-Mdm2 fusion protein produced by the strain CYS361, in the presence and absence of the proteasome inhibitor MG132.
  • FACS flow cytometric quantification
  • 2% glucose is added to the culture, in the presence and in the absence of 50 ⁇ M of a known proteasome inhibitor, MG132.
  • the fluorescence emitted by the cells was quantified using a FacsCalibur flow cytometer (Beckton-Dickinson), just before the addition of galactose (10), 30 minutes, 1 hour, 1 hour 30 minutes and 2 hours after the addition of galactose and 15 minutes, 30 minutes, 1 hour, 1 hour 30 minutes and 2 hours 30 minutes after the addition of glucose.
  • the presence of MG132 (at 50 ⁇ M) in the culture is indicated "+ MG132". Fluorescence is reported in arbitrary units
  • the results of FIG. 4 show that the fusion protein, which has accumulated in the cells in the presence of galactose, is progressively degraded during the time of culture in the absence of galactose and in the presence of glucose, in the presence of glucose. absence of the compound MG132 (time D1 h, D2h and intermediates).
  • the results of FIG. 4 show that, in the presence of the proteasome inhibitor MG132, the degradation of the fusion protein is strongly inhibited (time D1 h, D2h and intermediates).
  • Example 6 the localization, in the yeast cells of strain CYS361, of the mAG-Mdm2 protein was determined.
  • Yeast cells of the CYS361 strain comprising a polynucleotide allowing the expression of the mAG-Mdm2 fusion protein under the control of the GAL1 promoter were cultured in the presence of 2% galactose for 2 hours and were then observed by microscopy. fluorescence. The position of the nucleus was revealed by using a specific color indicator of the nucleus, the Hoescht 333-42.
  • the results show a co-localization of the cell nuclei (DNA) and the mAG-Mdm2 fusion protein (mAG-MDM2).

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Abstract

L'invention a pour objet un procédé in cellulo pour le criblage d'agents modulant l'activité de l'ubiquitine ligase Mdm2, ledit procédé comprenant les étapes suivantes : a) mettre en contact un agent candidat à tester avec des cellules de levure recombinantes qui expriment dans leur noyau une protéine de fusion comprenant : (i) un polypeptide MDM2 et (ii) au moins une protéine détectable. b) quantifier ladite première protéine détectable dans les cellules de levure, à la fin d'au moins une période de temps prédéterminée après la mise en contact de l'agent candidat avec lesdites cellules; c) comparer la valeur obtenue à l'étape (b) avec une valeur témoin obtenue lorsque l'étape (a) est réalisée en l'absence de l'agent candidat.

Description

TITRE DE L'INVENTION
Procédé de criblage d'agents modulant l'activité de l'ubiquitine ligase de Mdm2 et moyens destinés à la mise en œuvre dudit procédé
DOMAINE DE L'INVENTION
La présente invention se rapporte au domaine du criblage d'agents biologiquement actifs capables de moduler l'activité ligase d'ubiquitine de Mdm2, en particulier d'agents d'intérêt thérapeutique destinés à prévenir ou traiter des cancers.
ART ANTERIEUR
L'oncoqène Mdm2 :
L'oncogène Mdm2 est le principal régulateur négatif du suppresseur de tumeurs p53. L'amplification de Mdm2 est observée dans environ 10% des cancers avec une fréquence élevée (35%) dans les sarcomes de tissus mous. La surexpression de Mdm2 favorise le développement des tumeurs en inhibant notamment les fonctions anti- prolifératives de l'activateur transcriptionnel p53. Néanmoins, il existe des évidences solides pour des fonctions oncogéniques de Mdm2 indépendantes de p53 (Daujat et al. Trends Genêt. 2001 Aug;17(8):459-64. Piette ét al., 1997, Oncogene 15, 1001 ).
Mdm2 et p53 :
La protéine gène p53 joue un rôle majeur dans la formation des tumeurs. La moitié des personnes héritant d'une copie mutée de ce gène développent des tumeurs avant l'âge de 30 ans (syndrome de Li-Fraumeni), et 100 % des souris dépourvues de copies fonctionnelles de ce gène meurent de tumeurs avant l'âge de 6 mois. Chez les patients atteints de cancer mais ne portant pas de mutation germinale du gène p53, il a été démontré que 50% des tumeurs ont acquis une mutation somatique de ce gène.
L'activation de la protéine p53 par une grande variété de stress cellulaires entraîne un arrêt des cycles de division cellulaire et ultimement, conduit à la mort cellulaire (apoptose). L'existence d'un tel mécanisme protège ainsi l'organisme contre la prolifération de cellules potentiellement oncogéniques.
Sur le plan biochimique, p53 est un facteur de transcription. Il inhibe le développement des tumeurs en activant la transcription de certains gènes dont la surexpression induit l'arrêt du cycle de division cellulaire ou la mort cellulaire par apoptose. Comme la plupart des facteurs de transcription, p53 possède de multiples gènes cibles. Les premiers gènes qui voient leur transcription fortement augmenter en réponse à l'activation de la protéine sont les gènes p21 WAF1/CIP1 et MDM2. La protéine p21Waf1/Cip1 , qui appartient à la famille des inhibiteurs de CDK, Cyclin
Dépendent Kinases, inhibe spécifiquement l'activité du complexe Cdk2/Cycline E, cette inhibition bloquant la transition G1/S au point de restriction du cycle de division cellulaire. Si le signal activant p53 persiste, la production de p21 Waf1/Cip1 peut être maintenue pendant de longues périodes, conduisant à un état appelé sénescence cellulaire. Les cellules sénescentes restent viables mais sont incapables de se diviser (même si elles sont maintenues en culture pendant des années). Ce mécanisme constitue l'une des toutes premières stratégies mises en place par l'organisme pour empêcher le développement d'une tumeur à partir d'une cellule maligne.
Lorsque le signal activant la protéine p53 disparaît, le niveau de p21Waf1/Cip1 diminue et la cellule peut alors recommencer à se diviser. La reprise des divisions cellulaires est favorisée par l'existence d'une boucle de rétroaction négative qui comprend un autre gène cible de p53, le gène MDM2. La protéine Mdm2 régule l'activité de l'activateur transcriptionnel p53 selon plusieurs mécanismes. Mdm2 est notamment capable de se lier au domaine d'activation de la transcription de p53 et bloque ainsi son interaction avec les facteurs généraux de transcription. Le complexe p53-Mdm2 ainsi formé est donc incapable d'activer l'ARN-polymérase II et d'initier la transcription des gènes cibles. On peut noter au niveau moléculaire que la voie de signalisation qui active p53 agît en induisant la phosphorylation de la serine 20, ce qui a pour conséquence d'inhiber l'interaction p53 - Mdm2, et également la phosphorylation de la serine 15, cette dernière modification favorisant l'interaction de p53 avec la machinerie basale de transcription. La phosphorylation de la serine 20 a donc des conséquences fonctionnelles importantes puisqu'elle entraîne une forte augmentation de la synthèse de Mdm2, l'inhibiteur de p53.
Mdm2 : Ubiαuitine liαase :
Outre son rôle dans la régulation de l'interaction établie entre p53 et les facteurs généraux de transcription, Mdm2 possède la capacité d'inactiver définitivement p53 en induisant sa dégradation. Mdm2 appartient en effet à la famille des ubiquitine ligases et catalyse l'addition covalente de chaînes ubiquitines à certains résidus lysine présents dans la partie carboxy-terminale de p53. Ces modifications, en changeant la structure de p53, induisent l'export de p53 du noyau vers le cytoplasme où la protéine est alors reconnue et dégradée par le protéasome, un large complexe multiprotéique qui reconnaît les protéines ubiquitylées et les dégrade en petits polypeptides inactifs. Dans une cellule saine, les niveaux de p53 et de Mdm2 sont faibles et suite à l'activation de p53, le niveau de ces protéines est fortement élevé.
Outre son rôle dans l'ubiquitination de p53, Mdm2, comme certaines autres ubiquitine ligases, catalyse sa propre poly-ubiquitination et donc sa propre dégradation par le protéasome. Ainsi, en réponse à un endommagement de l'ADN, la protéine Mdm2 est phosphorylée en de multiples sites par des protéines kinases spécifiquement activées par ce type de stress (telles que ATM et ATR). Ces phosphorylations jouent un rôle déterminant dans la déstabilisation de Mdm2 résultant de son auotubiquitination. Fonctions oncoαéniαues de Mdm2 indépendantes de p53 :
Bien qu'il existe de nombreuses indications expérimentales qui démontrent l'existence de rôles de Mdm2 indépendants de p53, le fait que la létalité observée lors de la délétion de Mdm2 chez la souris soit annulée par l'inactivation simultanée du gène p53 démontre que ces rôles ne sont pas essentiels pour un développement cellulaire normal. Cependant, ces fonctions additionnelles contribuent fortement au développement des tumeurs induites par la surexpression de Mdm2 : par exemple, chez la souris, l'occurrence des sarcomes dus à la surexpression de Mdm2 est plus importante que celle résultant de l'inactivation de p53. Ceci montre que des mécanismes, autres que l'inactivation de p53, contribuent au développement de ces sarcomes.
Test de dégradation de Mdm2
La présente invention propose un mécanisme d'étude in vivo de la dégradation de Mdm2 induite par son auto-ubiquitination. La voie de dégradation des protéines par le protéasome est un processus complexe faisant intervenir de nombreux régulateurs.
La dégradation de Mdm2 ubiquitinée par le protéasome n'est que l'ultime étape de ce processus. Reconstituer in vivo ce mécanisme permet d'en suivre chaque étape, de l'ubiquitination à la dégradation en passant par la reconnaissance par le protéasome. Il existe des tests in vitro rapportant l'activité ligase à ubiquitine de Mdm2 (Yang et al,
2005 ; Davydov et al., 2004) mais ces tests ne s'attachent qu'à observer un mécanisme précis et non l'ensemble du processus de régulation de l'activité de la protéine Mdm2 par la voie ubiquitine-protéasome. La transposition en cellule vivante montre d'ailleurs la limite des observations décrites.
DESCRIPTION DE L'INVENTION
Selon l'invention, on a mis au point un procédé de criblage d'agents d'intérêt thérapeutique, qui sont sélectionnés pour leur spécificité d'action sur l'auto- ubiquitination et la dégradation dépendant du protéasome de la ligase d'ubiquitine humaine Mdm2.
Le demandeur a montré que, de manière surprenante, il était possible de mimer, dans des cellules de levure, le processus de dégradation de la ligase d'ubiquitine Mdm2 par le protéasome, processus qui a lieu naturellement dans les cellules humaines.
On a montré selon l'invention qu'il était possible de recréer artificiellement, dans des cellules de levure la réaction d'auto-ubiquitination de la ligase humaine Mdm2 suivie de sa reconnaissance et de sa dégradation par le protéasome de levure.
L'invention a pour objet un procédé in cellulo pour le criblage d'agents modulant l'activité ligase d'ubiquitine de la protéine humaine Mdm2 sur elle-même comprenant les étapes suivantes : a) mettre en contact un agent candidat à tester avec des cellules de levure recombinantes qui expriment : i) une protéine de fusion comprenant un polypeptide Mdm2 et au moins une protéine détectable. b) quantifier ladite première protéine détectable dans les cellules de levure, à la fin d'au moins une période de temps prédéterminée après la mise en contact de l'agent candidat avec lesdites cellules ; c) comparer la valeur obtenue à l'étape (b) avec une valeur témoin obtenue lorsque l'étape (a) est réalisée en l'absence de l'agent candidat. Le procédé de l'invention consiste en un procédé qui est réalisé in cellulo, du fait que la dégradation de la protéine cible Mdm2 est réalisée et visualisée dans des cellules de levures et non par des réactions réalisées dans un système acellulaire.
On a également montré que, dans des cellules de levure, la dégradation du polypeptide Mdm2 par le protéasome a lieu, même lorsque ce polypeptide est fusionné à une protéine détectable et notamment à une protéine auto-fluorescente. De façon surprenante, dans les cellules de levure, la dégradation de la protéine de fusion est totale, les polypeptides correspondant à la protéine Mdm2 et à la protéine détectable sont tous les deux dégradés.
La dégradation totale de la protéine de fusion : protéine détectable-Mdm2, observée dans les cellules de levure, permet de mesurer la quantité de protéine de fusion présente dans les cellules de levure en quantifiant le signal généré par la protéine détectable comprise dans ladite protéine de fusion.
Le procédé ci-dessus permet à l'homme du métier de déterminer si un agent candidat à tester est capable de modifier la vitesse de dégradation, ou le degré de dégradation, de la protéine Mdm2 par le protéasome dans les cellules de levure.
Le procédé de criblage in cellulo ci-dessus, du fait qu'il met en œuvre un système artificiel et humanisé de dégradation d'une protéine de fusion cible dans des cellules de levure, permet un criblage d'agents qui agissent de manière spécifique sur la stabilité de la seule protéine humaine exprimée dans ces cellules. De plus, grâce au procédé ci-dessus, on a mis au point un test physiologique de criblage d'agents actifs sur une voie ubiquitine ligase, en construisant chez la levure une voie métabolique de dégradation protéique mimant la voie de dégradation par le protéasome de la ligase Mdm2 humaine. Ainsi, du point de vue de la voie métabolique de dégradation des protéines qui est visée, le procédé de l'invention est réalisé dans des conditions physiologiques très proches des conditions physiologiques de dégradation des protéines par le protéasome humain.
Aux fins de la présente description, un agent qui « module » l'activité de ligase d'ubiquitine de Mdm2 englobe, respectivement, (i) un agent qui inhibe ou bloque l'activité de ligase d'ubiquitine de Mdm2 et (ii) un agent qui active ou augmente l'activité de ligase d'ubiquitine de Mdm2. Grâce au procédé ci-dessus, on peut identifier les agents capables d'inhiber la vitesse ou le degré de dégradation intracellulaire du polypeptide Mdm2 par le protéasome des cellules de levure. De tels agents inhibiteurs, qui peuvent être identifiés grâce au procédé de l'invention, du fait qu'ils vont inhiber également l'activité de la ligase Mdm2 dans les cellules humaines, constituent des agents d'intérêt thérapeutique susceptibles d'inhiber ou de bloquer la prolifération de cellules tumorales, d'inhiber ou bloquer l'activation de l'expression de divers gènes impliqués dans des cancers, de perturber des mécanismes de contrôle de la mort cellulaire (apoptose).
Ainsi, le procédé de criblage in cellulo ci-dessus peut comprendre une étape additionnelle (d) qui consiste à sélectionner positivement les agents candidats inhibiteurs pour lesquels la quantité de protéine détectable mesurée à l'étape (b) est supérieure à la valeur témoin de comparaison.
Le procédé de l'invention permet aussi d'identifier des agents capables d'augmenter la vitesse ou le degré de dégradation du polypeptide Mdm2 par le protéasome des cellules de levure. De tels agents activateurs, du fait qu'ils vont augmenter également l'activité d'auto-ubiquitination de Mdm2 dans les cellules humaines, constituent des agents d'intérêt thérapeutique susceptibles d'induire ou d'augmenter l'activation de l'expression de divers gènes impliqués dans des cancers. Certains des agents sélectionnés selon le procédé sont susceptibles d'avoir des activités pro-apoptotiques s'ils augmentent par exemple spécifiquement l'activité d'auto- ubiquitination de Mdm2 sans augmenter l'activité de ligase d'ubiquitine de Mdm2 sur ses (ou certaines de ses) cibles telle que p53 par exemple.
Ainsi, selon un autre aspect, le procédé de criblage selon l'invention peut comprendre une étape additionnelle (d) qui consiste à sélectionner positivement les agents candidats activateurs, pour lesquels la quantité de protéine détectable mesurée à l'étape (b) est inférieure à la valeur témoin de comparaison.
Comme on l'aura compris, l'agent modulant l'activité de ligase d'ubiquitine de Mdm2 peut être de toute nature. Ledit agent peut être tout composé organique ou minéral, et peut être soit un agent d'origine naturelle, soit un agent produit, au moins en partie, par synthèse chimique ou biologique. Ledit agent peut être notamment un peptide ou protéine. Ledit agent englobe aussi toute molécule déjà connue pour posséder un effet biologique, notamment un effet thérapeutique, ou à l'inverse un effet toxique démontré ou suspecté pour l'organisme.
Dans le procédé de l'invention, une fois que la protéine de fusion, comprenant le polypeptide Mdm2 fusionné à une protéine détectable, est exprimée dans les cellules de levure, la dite protéine de fusion est reconnue et subit une protéolyse qui est effectuée par le protéasome. La quantification de la protéine détectable contenue dans la cellule de levure, à un instant donné, permet de déterminer le degré de dégradation de ladite protéine de fusion Mdm2-protéine détectable à cet instant donné. Un polypeptide Mdm2 selon l'invention consiste en un polypeptide possédant au moins 90% d'identité en acides aminés avec le polypeptide Mdm2 de séquence SEQ ID N° 1. Un polypeptide Mdm2 selon l'invention peut consister en le polypeptide Mdm2 de séquence SEQ ID N° 1. Aux fins de la présente description, l'expression " séquence nucléotidique " peut être employée pour désigner indifféremment un polynucléotide ou un acide nucléique. L'expression " séquence nucléotidique " englobe le matériel génétique lui-même et n'est donc pas restreinte à l'information concernant sa séquence.
Les termes " acide nucléique ", " polynucléotide ", " oligonucléotide " ou encore " séquence nucléotidique " englobent des séquences d'ARN, d'ADN, d'ADNc ou encore des séquences hybrides ARN/ADN de plus d'un nucléotide, indifféremment sous la forme simple brin ou sous la forme de duplex.
Le terme " nucléotide " désigne les nucléotides naturels (A, T, G, C et U).
Aux fins de la présente invention, un premier polynucléotide est considéré comme étant " complémentaire " d'un second polynucléotide lorsque chaque base du premier nucléotide est appariée à la base complémentaire du second polynucléotide dont l'orientation est inversée. Les « bases », complémentaires sont A et T (ou A et U), et C et G.
Selon l'invention, un premier acide nucléique ayant au moins 90 % d'identité avec un second acide nucléique de référence, possédera au moins 90 %, de préférence au moins 91 %, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 97,5%, 98%, 98,3% 98,6%, 99%, 99,6% d'identité en nucléotides avec ledit second acide nucléique de référence.
Selon l'invention, un premier polypeptide ayant au moins 90 % d'identité avec un second polypeptide de référence, possédera au moins 90 %, de préférence au moins 91 %, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 97,5%, 98%, 98,3% 98,6%, 99%, 99,6% d'identité en acides aminés avec ledit second polypeptide de référence.
Le « pourcentage d'identité » entre deux séquences d'acide nucléique ou entre deux séquences de polypeptide, au sens de la présente invention, est déterminé en comparant les deux séquences alignées de manière optimale, à travers une fenêtre de comparaison.
La partie de la séquence nucléotidique ou d'acides aminés dans la fenêtre de comparaison peut ainsi comprendre des additions ou des délétions (par exemple des
« gaps ») par rapport à la séquence de référence (qui ne comprend pas ces additions ou ces délétions) de manière à obtenir un alignement optimal entre les deux séquences.
Le pourcentage d'identité est calculé en déterminant le nombre de positions auxquelles une base nucléique identique, ou un résidu d'acide aminé identique, est observé pour les deux séquences comparées, puis en divisant le nombre de positions auxquelles il y a identité entre les deux bases nucléiques, ou entre les deux résidus d'acides aminés, par le nombre total de positions dans la fenêtre de comparaison, puis en multipliant le résultat par cent afin d'obtenir le pourcentage d'identité en nucléotides des deux séquences entre elles, ou le pourcentage d'identité en acides aminés des deux séquences entre elles.
L'alignement optimal des séquences pour la comparaison peut être réalisé de manière informatique à l'aide d'algorithmes connus.
De manière tout à fait préférée, le pourcentage d'identité de séquence est déterminé à l'aide du logiciel CLUSTAL W (version 1.82) les paramètres étant fixés comme suit : (1 ) CPU MODE = ClustalW mp ; (2) ALIGNMENT = « full » ; (3) OUTPUT
FORMAT = « aln w/numbers » ; (4) OUTPUT ORDER = « aligned » ; (5) COLOR ALIGNMENT = « no » ; (6) KTUP (word size) = « default » ; (7) WINDOW LENGTH =
« default » ; (8) SCORE TYPE = « percent » ; (9) TOPDIAG = « default » ; (10)
PAIRGAP = « default » ; (1 1 ) PHYLOGENETIC TREE/TREE TYPE = « none » ; (12)
MATRIX = « default » ; (13) GAP OPEN = « default » ; (14) END GAPS = « default » ;
(15) GAP EXTENSION = « default » ; (16) GAP DISTANCES = « default » ; (17) TREE TYPE = « cladogram » et (18) TREE GRAP DISTANCES = « hide ».
Selon l'invention on a montré que la sensibilité du procédé de criblage décrit ci- dessus est accrue lorsque, préalablement à la mise en contact des cellules de levure avec l'agent à tester, on stoppe l'expression de la protéine Mdm2 cible dans les cellules de levure, c'est à dire la protéine de fusion Mdm2-protéine détectable. Ainsi, selon un premier mode de réalisation préféré du procédé ci-dessus, l'étape
(a) comprend elle-même les étapes suivantes :
(ai ) cultiver les cellules de levure qui expriment dans leur noyau ladite protéine de fusion comprenant le polypeptide Mdm2 et au moins une protéine détectable ; (a2) stopper l'expression de ladite protéine de fusion comprenant le polypeptide Mdm2 et au moins une protéine détectable par les cellules de levure ;
(a3) mettre en contact les cellules de levures obtenues à la fin de l'étape (a2) avec l'agent candidat à tester.
L'arrêt de l'expression de la protéine de fusion Mdm2-protéine détectable, à un moment choisi, peut être facilement réalisé par l'homme du métier, en utilisant, pour transformer les cellules de levure, une cassette d'expression dans laquelle le polynucléotide codant ladite protéine de fusion est placé sous le contrôle d'un promoteur fonctionnel dans les cellules de levure et dont l'activation, ou à l'inverse la répression, est induite par un agent inducteur. De nombreux promoteurs inductibles actifs dans des cellules de levure sont connus par l'homme du métier, dont certains d'entre eux sont décrits plus loin dans la description, y compris dans les exemples.
Dans la pratique, la protéine de fusion Mdm2-protéine détectable s'auto- ubiquitine et est rapidement reconnue et dégradée par le protéasome dans les cellules de levure. Les conditions optimales de mise en œuvre du procédé de criblage selon l'invention sont les conditions dans lesquelles on induit une accumulation intracellulaire d'une grande quantité de la protéine de fusion Mdm2-protéine détectable qui est exprimée dans les cellules de levure. Plus la quantité intracellulaire de protéine de fusion Mdm2-protéine détectable est grande au début de l'étape a) du procédé, plus la valeur du signal généré par la protéine détectable est élevée et peut être mesurée avec une grande précision au moment de l'étape b) du procédé. Ainsi, plus la quantité intracellulaire de la protéine de fusion Mdm2-protéine détectable est grande au début de l'étape a), plus les variations de quantité de cette protéine de fusion peuvent être mesurées avec précision, à l'étape b) du procédé.
Pour obtenir l'accumulation d'une grande quantité intracellulaire de la protéine de fusion Mdm2-protéine détectable dans les cellules de levure, il est avantageux de placer la séquence codant ladite protéine de fusion sous le contrôle d'un promoteur répressible fort et d'utiliser des souches de levure possédant plusieurs copies d'un polynucléotide comprenant (i) un promoteur répressible fort, (ii) un acide nucléique codant la protéine de fusion Mdm2-protéine détectable. La présence de plusieurs copies du polynucléotide codant d'intérêt permet l'obtention d'un fort signal de détection de la protéine détectable, à l'étape a) du procédé. Ces conditions de fort signal permettent de quantifier avec une grande sensibilité la protéine détectable pendant toute la durée du procédé, au fur et à mesure de la dégradation de la protéine de fusion Mdm2-protéine détectable par le protéasome. De manière évidente, plus le signal détectable de départ est fort, meilleure est la sensibilité des mesures lors de la mise en œuvre du procédé.
Selon un mode de réalisation avantageux du procédé de criblage selon l'invention, on utilise des cellules de levures dans lesquelles la ou les copies du polynucléotide codant la protéine de fusion Mdm2-protéine détectable est (sont) intégrée(s) dans le chromosome. Ce mode de réalisation avantageux permet l'accumulation intracellulaire de la protéine de fusion Mdm2-protéine détectable à un niveau élevé dans toutes les cellules de levure cultivées pour la mise en œuvre du procédé. Ce mode de réalisation du procédé de criblage de l'invention constitue un avantage, par rapport à l'utilisation de cellules de levures transformées par des plasmides dans chacune desquelles une ou plusieurs copies du polynucléotide codant la protéine de fusion Mdm2-protéine détectable est (sont) insérée(s). En effet, lorsque les cellules de levures qui expriment la protéine de fusion Mdm2-protéine détectable consistent en des cellules contenant un ou plusieurs vecteurs recombinants, en particulier un ou plusieurs plasmides recombinants, dans lesquels est insérée au moins une copie du polynucléotide codant la protéine de fusion Mdm2-protéine détectable, il peut arriver que la transmission desdits vecteurs recombinants d'intérêt ne se réalise pas de manière homogène, avec les générations successives de cellules de levure. Dans certains cas, le niveau d'expression intracellulaire de la protéine de fusion Mdm2- protéine détectable serait hétérogène au sein de l'ensemble des cellules de levure cultivées, ce qui serait susceptible de réduire la sensibilité du procédé de criblage de l'invention.
Description des modes de réalisation préférés du procédé de criblage
Les modes de réalisation préférés du procédé de criblage de l'invention sont décrits ci-dessous, notamment en relation avec la description des aspects fonctionnels et structurels des divers moyens permettant la mise en œuvre dudit procédé.
De manière générale, la protéine détectable qui est comprise dans la protéine de fusion Mdm2-protéine détectable peut être de toute nature, dès lors que sa présence peut être spécifiquement détectée dans les cellules de levure avant sa protéolyse et que la présence de formes protéolysées de la protéine détectable, notamment de fragments peptidiques produits par protéolyse de ladite protéine détectable, ne sont pas détectées par le moyen de détection spécifique qui est choisi. Comme cela se comprend aisément, la stabilité du polypeptide Mdm2 est suivie, selon le procédé de l'invention, en mesurant la stabilité de la protéine de fusion Mdm2- protéine détectable. Grâce à l'expression dans les cellules de levure du facteur Mdm2 sous forme de protéine fusion, la dégradation de la protéine de fusion contenant Mdm2 peut être suivie en temps réel, par détection de la protéine détectable non protéolysée. Selon la nature de la protéine détectable fusionnée à Mdm2, la dégradation de la protéine de fusion peut être suivie par des techniques connues en soi, notamment des techniques de mesure de fluorescence à l'aide, soit d'un cytomètre de flux, soit d'un lecteur de microplaques, soit d'un fluorimètre, soit grâce à un microscope à fluorescence, ou encore par des techniques colorimétriques, enzymatiques ou immunologiques. A titre illustratif, la protéine détectable peut être choisie parmi un antigène, une protéine fluorescente ou une protéine ayant une activité enzymatique.
Lorsque la protéine détectable consiste en un antigène, elle peut être tout type d'antigène, dès lors que des anticorps spécifiques de cet antigène sont déjà accessibles ou, alternativement, peuvent être préparés, selon toute technique d'obtention d'anticorps, notamment d'anticorps polyclonaux ou monoclonaux, bien connues de l'homme du métier. Préférentiellement, dans ce cas, la protéine détectable consiste en un antigène de faible taille, qui n'est pas susceptible d'interférer avec l'activité d'auto-ubiquitination de Mdm2 ou la reconnaissance de Mdm2 poly-ubiquitinée par le protéasome. Ainsi, préférentiellement, on utilise, comme antigène, un peptide ayant une chaîne de 7 à 100 acides aminés de longueur, mieux de 7 à 50 acides aminés de longueur, et encore mieux de 7 à 30 acides aminés de longueur, par exemple 10 acides aminés de longueur. A titre illustratif, on peut utiliser l'antigène HA de séquence [NH2-YPYDVPDYA-COOH] SEQ ID N° 4, OU encore un antigène FLAG de séquence [NH2-DYKDDDDK-COOH] SEQ ID N° 5 (monomère FLAG) ou de séquence [NH2-MDYKDHDGDYKDHDI DYKDDDDK-COOH] SEQ ID N° 6 (trimère FLAG). Dans ce cas, on utilise, pour quantifier la protéine détectable à l'étape (b) du procédé, un anticorps qui reconnaît spécifiquement l'antigène compris dans la protéine de fusion, cet anticorps étant marqué directement ou indirectement. La quantification est alors réalisée par mesure du signal détectable produit par les complexes formés, dans les cellules de levure, entre l'anticorps marqué et la protéine de fusion Mdm2-antigène. Ainsi, à l'étape (b), lorsque la première protéine détectable est un antigène, on quantifie ladite première protéine détectable par détection des complexes formés entre ladite protéine et des anticorps la reconnaissant.
Lorsque la protéine détectable consiste en une protéine à fluorescence intrinsèque, elle est notamment choisie parmi la protéine mAG, la protéine GFP ou l'un de ses dérivés, la protéine YFP ou l'un de ses dérivés, et la protéine dsRED. Parmi les protéines dérivées de la protéine GFP, on peut utiliser notamment l'une quelconque des protéines connues sous les noms GFPMut3 (Cormack et al. (Gène (1996) 173_: 33-38)),
Venus (Nagai et al., {Nat. Biotechnol. (2002) 20:87-90)) ou Sapphire (Zapata-Hommer and Griesbeck, BMC Biotechnol. (2003) 3:5).
La protéine à fluorescence intrinsèque peut aussi être choisie parmi les protéines auto-fluorescentes originaires de divers organismes, autres qu'Aequorea Victoria. Notamment, la protéine à fluorescence intrinsèque peut être choisie parmi les protéines suivantes : - la protéine CopGFP originaire de Pontellina plumata, et décrite par
D.A. Shagin et al.{2004, Mol. Biol. Evol. 21 :841 -850) ; la protéine TurboGFP, un variant de CopGFP ; et décrite par D.A. Shagin ét al., 2004 {Mol. Biol. Evol. 21 :841 -850) ; la protéine PhiYFP originaire de Phialidium sp. ; et décrite par D.A. Shagin et al.{ 2004, Mol. Biol. Evol. 21 :841 -850) ; la protéine AcGFP originaire de Aequorea coerulescens, ainsi que ses variants, et décrite par N. G. Gurskaya, (2003, Biochem. J. 373:403-408) ; et la protéine DsRed originaire de Discosoma sp. ; et décrite par M. V. Matz et al (1999, Nature Biotech. 17:969-973). Préférentiellement on utilisera, dans la protéine fusion Mdm2-protéine détectable, la protéine mAG, aussi appelée « monomeric Azami-Green », originaire du corail de Galaxeidae; et décrite par Karasawa et al. (Karasawa et al., J. Biol. Chem. 2003 278:34167-34171 ).
Lorsque la protéine détectable consiste en une protéine à fluorescence intrinsèque, on quantifie la protéine détectable à l'étape (b) du procédé par mesure du signal de fluorescence qui est émis par la protéine de fusion Mdm2-protéine fluorescente à l'aide de tout dispositif adapté. Ainsi, à l'étape (b), lorsque la protéine détectable est une protéine fluorescente, on quantifie ladite protéine détectable par une mesure du signal de fluorescence émis par ladite protéine. Lorsque la protéine détectable consiste en une protéine à activité enzymatique, ladite protéine détectable est choisie notamment parmi la luciférase et la β-lactamase. Dans ce cas, on quantifie la protéine détectable à l'étape (b) du procédé par mesure de la quantité du ou des composés produits par la conversion du substrat par l'enzyme. Lorsque le produit de l'activité enzymatique est coloré, la mesure peut être réalisée par colorimétrie. Lorsque le produit de l'activité enzymatique est fluorescent, on mesure l'intensité du signal de fluorescence qui est émis par ledit produit, à l'aide de tout dispositif de mesure de la fluorescence adapté. Ainsi, à l'étape (b), lorsque la première protéine détectable est une protéine ayant une activité enzymatique, on quantifie ladite protéine détectable par une mesure de la quantité de substrat transformé par ladite protéine.
Selon un mode de réalisation préféré, la protéine comprenant le polypeptide
Mdm2 consiste en la protéine de séquence en acides aminés SEQ ID N °2, qui peut être codée par l'acide nucléique de séquence SEQ ID N °3. La protéine de séquence SEQ ID N ° 2 consiste, de l'extrémité NH2-terminale vers l'extrémité COOH-terminale, respectivement en (i) la séquence de la protéine détectable mAG allant de l'acide aminé en position 1 jusqu'à l'acide aminé en position 226, (ii) un premier peptide espaceur allant de l'acide aminé en position 227 jusqu'à l'acide aminé en position 228 et (iii) le polypeptide Mdm2 allant de l'acide aminé en position 229 jusqu'à l'acide aminé en position 719. L'acide nucléique de séquence SEQ ID N °3 consiste, de l'extrémité 5' vers l'extrémité 3', respectivement en (i) la séquence codant la protéine détectable mAG allant du nucléotide en position 1 jusqu'au nucléotide en position 678, (ii) la séquence codant un peptide espaceur allant du nucléotide en position 679 jusqu'au nucléotide en position 684 et (iii) la séquence codant le polypeptide Mdm2 allant du nucléotide en position 685 jusqu'au nucléotide en position 2160 (codon stop compris).
Le procédé de criblage selon l'invention est caractérisé en ce que les cellules de levure recombinantes sont transformées avec un polynucléotide qui comprend :
(a) un cadre de lecture ouvert codant (i) la protéine de fusion comprenant le polypeptide Mdm2 et (ii) une protéine détectable, et (b) une séquence régulatrice fonctionnelle dans des cellules de levure qui dirige l'expression dudit cadre de lecture ouvert;
Le polynucléotide ci-dessus peut consister en l'acide nucléique de séquence SEQ ID N °3.
Acides nucléiques, vecteurs d'expression et cellules de levure transformées préférés selon l'invention.
On a synthétisé selon l'invention, des acides nucléiques, lesquels, lorsqu'ils sont introduits dans des cellules de levure, provoquent l'expression de la protéine de fusion Mdm2-protéine détectable, c'est à dire des acides nucléiques codant la protéine de fusion Mdm2-protéine détectable. Chacun des acides nucléiques synthétisés comprend une séquence codante, qui est aussi désignée « cadre de lecture ouvert » ou « ORF » qui code la protéine de fusion Mdm2-protéine détectable d'intérêt. Un exemple illustratif d'acides nucléiques selon l'invention sont les acides nucléiques de séquence SEQ ID N° 3 (Mdm2-protéine détectable), dont la structure a été décrite précédemment dans la description.
Chacun des acides nucléiques comprend aussi une séquence régulatrice comprenant un promoteur fonctionnel dans les cellules de levure.
Dans un mode de réalisation préféré, le promoteur fonctionnel dans les cellules de levure consiste en un promoteur répressible, c'est à dire un promoteur fonctionnel dans les cellules de levure et qui est sensible à l'action d'un agent inducteur. Lorsque l'agent inducteur est ajouté dans le milieu de culture des cellules de levure, il induit la répression ou le blocage de l'expression de la séquence codant la protéine d'intérêt placée sous son contrôle. Ce promoteur répressible est avantageusement choisi parmi les promoteurs CUP1, GAL 1, GAUO, MET3, MET25, PHO5, PHO87 et THI4 de la levure Saccharomyces cerevisae.
La séquence du promoteur du gène GAL 1 de la levure S. cerevisiae, susceptible d'être utilisée selon l'invention peut consister en celle décrite par Johnston et Davis {Mol. CeII. Biol. (1984) 4 : 1440-1448).
La séquence du promoteur du gène MET3 de la levure S. cerevisiae, susceptible d'être utilisée selon l'invention peut consister en celle décrite par Cherest et al. (Mol. Gen. Genêt. (1987) 210 (2) : 307-313).
La séquence du promoteur du gène MET25 de la levure S. cerevisiae, susceptible d'être utilisée selon l'invention peut consister en celle décrite dans Kerjan et al. (Nucleic Acids Res.(1986) 14(20) : 7861 -7871 ). La séquence du promoteur du gène PHOδ de la levure S. cerevisiae, susceptible d'être utilisée selon l'invention peut consister en celle décrite par Feldmann et al. (EMBO J. (1994) 13(24) : 5795-5809).
La séquence du promoteur du gène THI4 de la levure S. cerevisiae, susceptible d'être utilisée selon l'invention peut consister en celle décrite par Skala et al., Yeast (1995) 14:1421 -1427.
La séquence du promoteur du gène CUP1 de la levure S. cerevisiae, susceptible d'être utilisée selon l'invention peut consister en celle décrite par Karin et al. (PNAS (1984) 81 (2) : 337-341 ).
Dans un mode de réalisation préféré, l'acide nucléique ou le polynucléotide qui code la protéine de fusion Mdm2-protéine détectable comprend la séquence régulatrice
GAL 1. Cette séquence active l'expression du cadre de lecture ouvert codant la protéine de fusion comprenant le polypeptide Mdm2 lorsque les cellules de levure sont cultivées en présence de galactose. Par contre cette séquence réprime l'expression du cadre de lecture ouvert codant la protéine de fusion comprenant le polypeptide Mdm2 lorsque les cellules de levure sont cultivées en présence de glucose. Ainsi, dans un mode de réalisation avantageux du procédé de criblage de l'invention, l'expression de la protéine fusion comprenant le polypeptide Mdm2 est réalisée de manière temporaire durant l'essai de criblage. Après avoir été induite durant un temps fixé pouvant varier de 20 minutes à 24 heures, l'expression de la protéine contenant Mdm2 est spécifiquement stoppée (dans une expérience connue par l'homme du métier sous le nom de « promoter shut off ») avant d'exposer les cellules aux molécules devant être criblées. Cet arrêt de l'expression est obtenu par l'addition dans le milieu de culture d'une molécule pouvant réprimer l'activité du promoteur contrôlant l'expression de la protéine fusion Mdm2-protéine détectable, ou bien encore par l'élimination de la présence, dans le milieu de culture, d'un agent ou d'une molécule requise pour l'activation dudit promoteur.
Ainsi, lorsque la protéine de fusion Mdm2-protéine détectable est exprimée sous le contrôle du promoteur du gène GAL 1, alors l'expression de ce promoteur est réprimée en ajoutant du glucose à la concentration finale de 2 % dans le milieu de culture. L'arrêt de la néo-synthèse de la protéine de fusion comprenant Mdm2 permet de mesurer sa stabilité en temps réel, en déterminant par exemple la fluorescence des cellules de levure au cours du temps après l'arrêt de synthèse, dans le mode de réalisation dans lequel ladite protéine de fusion contient une protéine détectable à fluorescence intrinsèque, comme la mAG ou une protéine dérivée de la GFP. Ainsi, l'invention a aussi pour objet une cassette d'expression fonctionnelle dans les cellules de levure comprenant un polynucléotide qui comprend un cadre de lecture ouvert codant la protéine de fusion comprenant le polypeptide Mdm2 et au moins une protéine détectable, et une séquence régulatrice fonctionnelle dans des cellules de levure qui dirige l'expression dudit cadre de lecture ouvert. Une telle cassette d'expression peut notamment être caractérisée en ce que le polypeptide Mdm2 est le polypeptide Mdm2 de séquence SEQ ID N° 1 .
Une telle cassette d'expression peut notamment comprendre ou consister en l'acide nucléique de séquence SEQ ID N °3 selon l'invention, qui code la protéine de fusion mAG-Mdm2 de séquence SEQ ID N °2. Selon un mode de réalisation préféré d'une telle cassette d'expression, la séquence régulatrice comprend un promoteur répressible fonctionnel dans les cellules de levure, et qui est sensible à l'action d'un agent inducteur, tel qu'un promoteur choisi parmi les promoteurs CUP1, GAL 1, GAUO, MET3, MET25, PHO5, et THI4 de la levure Saccharomyces cerevisiae. Selon un autre mode de réalisation avantageux du procédé de criblage selon l'invention, les cellules de levure recombinantes possèdent l'acide nucléique ou le polynucléotide comprenant la séquence codant la protéine de fusion Mdm2-protéine détectable sous une forme intégrée dans leur génome, comme cela est illustré dans les exemples. Dans encore un autre mode de réalisation du procédé de criblage selon l'invention, les cellules de levure sont transformées par l'acide nucléique ou le polynucléotide comprenant la séquence codant la protéine de fusion Mdm2-protéine détectable qui se présente sous une forme non intégrée dans les chromosomes, par exemple sous la forme de vecteurs fonctionnels dans les cellules de levure et qui portent au moins une origine de réplication fonctionnelle dans les cellules de levure.
De manière générale, pour la mise en œuvre du procédé de criblage de l'invention, il est avantageux d'utiliser des cellules de levures qui possèdent une bonne perméabilité membranaire, notamment une bonne perméabilité membranaire pour les agents à tester par le procédé.
Pour la mise en œuvre du mode de réalisation préféré du procédé de criblage de l'invention dans lequel l'expression de la protéine de fusion est réalisée sous le contrôle d'un promoteur répressible, il est également avantageux d'utiliser des cellules de levures qui possèdent une bonne perméabilité membranaire pour les composés « inducteurs » vis-à-vis desquels lesdits promoteurs répressibles sont sensibles.
Ainsi, dans un autre mode de réalisation préféré du procédé de criblage de l'invention, on utilise des souches de levure dont le génome comprend une à plusieurs mutations qui augmentent la perméabilité aux produits à tester, telles que des mutations inactivant les gènes PDR1 et PDR3, deux gènes codant des facteurs transcriptionnels qui chez la levure contrôlent l'expression de transporteurs insérés dans la membrane plasmique (Nourani et ai, 1997).
Préférentiellement, on utilise des souches de levure possédant le fond génétique de la souche W303 de la levure Saccharomyces cerevisiae décrite par Bailis et al.
(1990), ou tout autre souche caractérisée de la dite levure Saccharomyces cerevisiae. La transformation des cellules de levure par de l'ADN exogène est préférentiellement réalisée en utilisant des techniques connues de l'homme du métier, notamment la technique décrite par Schiestl et al. (1989). Les constructions des différentes souches de levure ont été réalisées en employant des techniques de génétique (croisement, sporulation, dissection des asques et analyse phénotypique des spores) connues et décrites notamment par Sherman et al. (1979) et les techniques de génétique inverse décrites notamment par Rothstein (1991 ).
Conformément à l'invention, les levures sont transformées préférentiellement par des plasmides construits selon des techniques de biologie moléculaire classiques, notamment selon les protocoles décrits par Sambrook et al. (1989) et Ausubel et al. (1990-2004).
Ainsi, un autre objet de l'invention consiste en un vecteur d'expression caractérisé en ce qu'il comprend une cassette d'expression telle que définie dans la présente description. Un vecteur conforme à l'invention est le vecteur pCSYAQ6-MDM2 qui est décrit dans les exemples, et qui a servi à la construction des souches de levure CYS361 et CYS424. [Figure 1 A représentant la carte du vecteur pCSYAQ6-MDM2]
La présente invention est également relative à une souche de levure recombinante comprenant, sous une forme intégrée dans son génome, un polynucléotide qui comprend (a) un cadre de lecture ouvert codant la protéine de fusion comprenant un polypeptide Mdm2 et au moins une protéine détectable, et (b) une séquence régulatrice fonctionnelle dans des cellules de levure qui dirige l'expression dudit cadre de lecture ouvert. Une souche de levure recombinante selon l'invention peut consister en une souche de levure recombinante comprenant, sous une forme intégrée dans son génome, un polynucléotide qui comprend (a) un cadre de lecture ouvert codant la protéine de fusion comprenant un polypeptide Mdm2 de séquence SEQ ID N ° 1 et au moins une protéine détectable, et (b) une séquence régulatrice fonctionnelle dans des cellules de levure qui dirige l'expression dudit cadre de lecture ouvert.
En particulier, l'invention est relative à des souches de levure recombinantes conformes à la définition ci-dessus, qui consiste en les souches de levure CYS361 et CYS424, qui expriment la protéine de fusion comprenant le polypeptide Mdm2 et la protéine détectable mAG, c'est à dire la protéine de fusion de séquence SEQ ID N ° 2. Le procédé de criblage selon l'invention, permet de visualiser l'activité ligase d'ubiquitine de Mdm2 dans des cellules de levure.
Ce procédé est particulièrement avantageux pour cribler des molécules ou agents aptes à agir sur les pathologies associées à une dégradation excessive ou insuffisante de Mdm2, tels que certains cancers. Les principaux avantages du procédé de criblage de l'invention sont notamment les suivants :
- la simplicité de mise en œuvre: l'activité ligase d'ubiquitine de Mdm2 tel qu'elle existe dans les cellules est visualisée simplement grâce à l'expression contrôlée de la protéine humaine sauvage Mdm2 dans les cellules de levure. De plus, lorsque la protéine Mdm2 est exprimée en tant que protéine hybride en fusion avec une protéine à fluorescence intrinsèque, telle que la mAG ou la GFP, la stabilité de Mdm2 est directement mesurée par la quantification de la fluorescence émise par la protéine hybride. De même lorsque la protéine Mdm2 est exprimée en tant que protéine hybride en fusion avec une protéine telle que la luciférase, la stabilité de Mdm2 est directement mesurée par la quantification de la luminescence émise par la protéine hybride en présence d'un substrat comme la fluorescéine.
- l'adéquation avec un contexte thérapeutique : la stabilité de Mdm2 est suivie selon un test fonctionnel réalisé dans des cellules entières. Le procédé de criblage in cellulo selon l'invention permet donc de sélectionner des molécules capables d'activer ou d'inhiber l'activité ligase d'ubiquitine de Mdm2 dans un contexte semblable à celui de leur usage thérapeutique final.
- la spécificité: bien que réalisé in cellulo dans la cellule, le procédé de criblage selon l'invention est spécifique, car il repose sur l'expression, dans un organisme hétérologue à l'organisme humain, de la protéine humaine Mdm2. Les molécules sélectionnées grâce au procédé de criblage de l'invention seront spécifiques de l'activité ligase d'ubiquitine de Mdm2, et ne seront donc pas des molécules sélectionnées en raison, par exemple, de leur capacité à interférer avec l'une des nombreuses voies de signalisation induisant la dégradation de Mdm2 dans les cellules humaines. En effet, lors de la mise en œuvre du procédé de criblage selon l'invention, la dégradation de Mdm2 par le protéasome est induite par une voie métabolique tout à fait artificielle et totalement reproductible, comme par exemple, l'ajout de glucose pour bloquer l'activité du promoteur GAL 1, lorsque Mdm2 est exprimée sous le contrôle de ce promoteur. - la stabilité des souches de levure recombinantes: les techniques d'intégration dans un endroit choisi d'un chromosome de levure et de remplacement ciblé de gènes permettent la construction de souches de levures recombinantes exprimant la protéine de fusion contenant Mdm2 à partir des chromosomes de la levure. Ces souches de levure recombinantes sont donc génétiquement stables et peuvent être multipliées et conservées indéfiniment.
- la rapidité de croissance et de criblage: la levure est un micro-organisme à croissance rapide et rendement élevé. En particulier, le procédé de criblage de l'invention est préférentiellement réalisé en cultivant les cellules de levure dans un milieu de culture complet, dans lequel la croissance des cellules de levure est particulièrement rapide et le rendement particulièrement élevé, ce qui permet l'obtention d'une grande quantité de cellules de levure recombinantes pour la réalisation simultanée d'un nombre important de tests de criblage.
- le faible coût: la levure est un microorganisme dont la culture, le stockage et la caractérisation sont peu onéreux, - l'automatisation du procédé de criblage de l'invention: la levure est un micro-organisme dont la culture, réalisée dans un faible volume de milieu, à température basse, en atmosphère classique, dans l'air, est tout particulièrement adapté à l'automatisation (robotisation) des procédés de criblage.
La présente invention est en outre illustrée, sans pour autant être limitée, par les figures et les exemples suivants.
DESCRIPTION DES FIGURES
La Figure 1 représente la carte du plasmide recombinant codant une protéine de fusion Mdm2-protéine détectable : schéma du plasmide pCSYAQ6-MDM2 comprenant une cassette d'expression codant la protéine de fusion mAG-Mdm2 La Figure 2 représente des clichés d'immuno-empreintes (« Western Blotting ») illustrant la dégradation de la protéine de fusion comprenant Mdm2 fusionnée avec mAG, en présence ou en l'absence d'un agent inhibiteur du protéasome, le composé MG132. Les résultats sont illustrés pour la souche de levure recombinante CYS361 . La Figure 3 représente des clichés de microscopie d'épifluorescence, de la dégradation de la protéine de fusion mAG-Mdm2 dans des cellules de levure de la souche recombinante CYS361 , en présence ou en l'absence d'un agent inhibiteur du protéasome, le composé MG132. Figure 3A : cellules CYS361 au temps 0 ; Figures 3B : cellules CYS361 au temps 120 minutes après induction par le glucose ; Figure 3C : cellules CYS361 au temps 120 minutes après l'arrêt de l'induction par le glucose en absence de MG132 ; Figure 3D : cellules CYS361 au temps 120 minutes après l'arrêt de l'induction par le glucose en présence de MG132 ;
La Figure 4 illustre la quantification, par cytométhe de flux des cellules de levure de la souche CYS361 , du signal de fluorescence émis par ces cellules, au cours du temps de culture, respectivement (i) pendant l'induction de la production de la protéine de fusion mAG-Mdm2 en présence de galactose et (ii) en présence de glucose après arrêt de la production de la protéine de fusion. Les cellules de levure ont été cultivées en présence ou en l'absence de l'inhibiteur de protéasome MG132 (50μM).
EXEMPLES
MATERIEL ET METHODES DES EXEMPLES 1 A 6.
1. Récapitulatif des séquences de polynucléotide utilisées
Dans les descriptions qui suivent : La séquence de la protéine Mdm2 est celle déposée à la banque de données
EMBL, numéro d'accession AF527840.
La séquence du gène mAG (monomeric Azami-Green) du corail Galaxeidae codant pour la protéine fluorescente désignée ci-après sous le terme mAG est celle déposée à GenBankTM/EBI Data Bank avec le numéro d'accession AB108447. La séquence du plasmide pRS306 est celle déposée à la banque de données
EMBL, identificateur « PRS306 », numéro d'accession U03438.
La séquence du promoteur du gène GAL 1 de la levure S. cerevisiae utilisé dans les descriptions qui suivent est entièrement comprise dans la séquence déposée à la banque de données EMBL, identificateur « SCGAL10 », numéro d'accession K021 15. La séquence du promoteur du gène GAL 1 de la levure S. cerevisiae, susceptible d'être utilisée selon l'invention peut consister en celle décrite par Johnston et Davis (Mol. CeII. Biol. (1984) 4 (8) : 1440-1448).
La séquence du promoteur du gène MET3 άe la levure S. cerevisiae, susceptible d'être utilisée selon l'invention peut consister en celle décrite par Cherest et al. (Mol. Gen. Genêt. (1987) 210 (2) : 307-313). La séquence du promoteur du gène MET25 de la levure S. cerevisiae, susceptible d'être utilisée selon l'invention peut consister en celle décrite dans Kerjan et al. (Nucleic Acids Res.(1986) 14(20) : 7861 -7871 ).
La séquence du promoteur du gène PHOδ άe la levure S. cerevisiae, susceptible d'être utilisée selon l'invention peut consister en celle décrite par Feldmann et al. (EMBO J. (1994) 13(24) : 5795-5809).
La séquence du promoteur du gène THI4 de la levure S. cerevisiae, susceptible d'être utilisée selon l'invention peut consister en celle décrite Skala et al., Yeast (1995) 14:1421 -1427. La séquence du promoteur du gène CUP1 de la levure S. cerevisiae, susceptible d'être utilisée selon l'invention peut consister en celle décrite par Karin et al. (PNAS (1984) 81 (2) : 337-341 ).
2. Conventions utilisées Les descriptions sont faites en utilisant la nomenclature et les règles typographiques en usage dans la communauté des biologistes spécialistes de la levure Saccharomyces cerevisiae.
- le nom de la forme sauvage d'un gène est donné en majuscule italique ; exemple : GAL 1. - le nom d'une forme mutante d'un gène est donné en minuscule italique, le numéro d'allèle si il est connu est précisé à la suite d'un tiret ; exemple cup1-1.
- le nom d'un allèle inactivé d'un gène est donné en minuscule suivi de 2 fois deux points suivi du nom du gène inactivant ex ppr1::TRP1 (dans cet exemple le gène inactivé ppr1 a été interrompu par le gène actif TRP1).
Alternativement, le nom d'un gène inactivé peut être donné par le symbole « delta » ; exemple gal4A
- le nom de la protéine est celui du gène qui la code est donné en minuscule, excepté la première lettre qui est en majuscule ex Gal4 (alternativement on peut utiliser le même symbole suivi d'un p ; exemple Gal4p).
3. Remarques préliminaires concernant la construction des plasmides
L'ensemble des plasmides a été construit par des techniques de biologie moléculaire classiques selon des protocoles décrits par Sambrook et al. (in Molecular Cloning, Laboratory Manual, 2nd édition, (1989), CoId Spring Harbor, N. Y.) et Ausubel et al., ( in Current Protocols in Molecular Biology, (1990-2004), John Wiley and Sons Inc, N. Y.). Le clonage, la propagation et la production d'ADN plasmidiques ont été réalisés dans la souche ά'Escherichia coli DH 10B. EXEMPLE 1 : Construction des plasmides permettant l'expression chez la levure de la protéine de fusion m AG- Md m 2 et de la protéine sauvage Mdm2.
Le plasmide suivant permet l'expression chez la levure Saccharomyces cerevisiae d'un dérivé de la protéine humaine Mdm2 fusionné à la protéine fluorescente mAG du corail Galaxeidae.
Un fragment de 614 paires de bases (pb) correspondant au promoteur du gène GAL 1 (pGAL1 ) de la levure Saccharomyces cerevisiae a été amplifié par Polymerase Chain Reaction (PCR) à partir d'ADN génomique d'une souche sauvage de S. cerevisiae X2180-1 A, en utilisant les oligonucléotides suivants : (i) « pGAL.1 (Asp)Forw » de séquence δ'-GCTGGGTACCTTAATAATCATATTACATGGCATTA-S' [SEQ ID N° 7], et (ii) « pGAL.1 (Xho)Rev » de séquence δ'-CGACCTCGAGTATAGTTTTTTCTCCTTGACGTTAA-S' SEQ ID N° 8]. Le fragment obtenu a été digéré par les enzymes de restriction Asp7'\ 8\ et Xho\ et inséré dans le plasmide navette S. cerevisiae-E. coli pRS306 préalablement digéré par les enzymes /4sp718l et Xho\, produisant le vecteur pRS306-pGAL1.
Un fragment de 678 paires de bases (pb) correspondant à un variant du gène codant pour la protéine fluorescente monomérique Azami Green (mAG) du corail Galaxeidae, dont la séquence est optimisée pour l'expression en levures, a été obtenu par digestion enzymatique par les enzymes de restriction Xho\ et EcoR\ à partir du vecteur pPCR-Script-mAG. Le fragment obtenu a été inséré dans le plasmide pRS306- pGAL1 préalablement digéré par les enzymes Xho\ et EcoRI, produisant le vecteur pRS306-pGAL1 -mAG. Un fragment de 340 paires de bases (pb) correspondant au terminateur du gène
ADH1 (tADH1 ) de la levure Saccharomyces cerevisiae a été amplifié par Polymerase Chain Reaction (PCR) à partir d'ADN génomique d'une souche sauvage de S.cerews/ae X2180-1 A, en utilisant les oligonucléotides suivants :
(i) « TermADH1 (NotlBstXI)5' » de séquence 5'-GGCGGCGGCCGCCACCGCGGTGGGCGAATTTCTTATGATTTATG-
3' [SEQ ID N09] et
(ii) « TermADH1 (Sacl)3' » de séquence
5'-GGCGGAGCTCTGGAAGAACGATTACAACAG-S' [SEQ ID N° 10]. Le fragment obtenu a été digéré par les enzymes de restriction Sac\ et Not\ et inséré dans le plasmide pRS306-pGAL1 -mAG préalablement digéré par les enzymes Sac\ et Not\, produisant le vecteur pCSYAQ6.
Un fragment de 1472 paires de bases (pb) correspondant au gène MDM2 de Homo sapiens a été amplifié par Polymerase Chain Reaction à partir du plasmide pCDNA3-2FLAG-MDM2 en utilisant les oligonucléotides suivants : (i) « MDM2-EcoRI-Fw » de séquence δ'-GCGCGAATTCATGTGCAATACCAACATGTCTG-S' [SEQ ID N° 1 1 ] (ii) « MDM2-Notl-Rv » de séquence δ'-GGCGGCGGCCGCCTAGGGGAAATAAGTTAGCACAATC-S' [SEQ ID N° 12]
Le fragment obtenu a été digéré par les enzymes de restriction EcoR\ et Noti. Le fragment a été clone dans le plasmide pCSYAQβ préparé par une digestion par les enzymes de restriction EcoR\ et Noti. Le vecteur produit a été appelé pCSYAQβ- MDM2, dont le schéma est illustré sur la Figure 1.
Construction de la souche de levure CYS361
Pour l'obtention de la souche de levure CYS361 , le plasmide pCSYAQ6-MDM2, décrit ci-dessus, a été linéarisé en utilisant l'enzyme Stu\. L'enzyme Stu\ clive le plasmide pCSYAQ6-MDM2 à une position unique localisée dans la séquence du gène
URA3. Le plasmide pCSYAQ6-MDM2 linéarisé s'intègre au locus URA3 situé sur le bras gauche du chromosome 5 de la levure Saccharomyces cerevisiae.
La souche de levure CYS361 a été obtenue par intégration du plasmide linéarisé pCSYAQ6-MDM2 dans la souche de la levure Saccharomyces cerevisiae CYS262, conformément au protocole général décrit par Rohthstein (1991 ).
Le génotype de la souche de levure CYS361 selon l'invention est indiqué dans le Tableau 1 ci-dessous.
Construction de la souche de levure CYS424
Pour l'obtention de la souche de levure CYS424, le plasmide pCSYAQ6-Mdm2, décrit ci-dessus, a été linéarisé en utilisant l'enzyme Stu\. L'enzyme Stu\ clive le plasmide pCSYAQ6-MDM2 à une position unique localisée dans la séquence du gène URA3. Le plasmide pCSYAQ6-MDM2 linéarisé s'intègre au locus URA3 situé sur le bras gauche du chromosome 5 de la levure Saccharomyces cerevisiae.
La souche de levure CYS424 a été obtenue par intégration du plasmide linéarisé pCSYAQ6-MDM2 dans la souche de la levure Saccharomyces cerevisiae CC788-2B, conformément au protocole général décrit par Rohthstein (1991 ). Le génotype de la souche de levure CYS424 selon l'invention est indiqué dans le Tableau 1 ci-dessous.
Tableau 1 : Génotype de la souche de levure Saccharomyces cerevisiae construite pour les besoins de la présente invention.
Figure imgf000022_0001
EXEMPLES 2 A 6 : Mise au point du procédé de criblage selon l'invention. EXEMPLE 2: Séquences nucléotidique et protéique Mdm2 exprimée dans les cellules de levure.
La séquence d'acides aminés codant la protéine de fusion comprenant la protéine Mdm2 consiste en le polypeptide de séquence SEQ ID N° 2 qui peut être codé par le polynucléotide de séquence SEQ ID N° 3.
EXEMPLE 3: Dégradation par le protéasome cellulaire de la protéine humaine Mdm2 exprimée dans les cellules de levure (Résultats d'immuno- empreinte)
La dégradation, par le protéasome dans les cellules de levure recombinées de la souche CYS361 de la protéine de fusion comprenant Mdm2 fusionnée avec mAG a été suivie par une technique d'immuno-empreinte, en présence ou en l'absence d'un agent inhibiteur du protéasome, le composé MG132 (50μM).
A. Matériel et Méthodes
Toutes les souches de levure employées ont été cultivées et analysées de manière identique. Les cellules ont été cultivées en milieu minimum en présence de galactose comme source de carbone pendant 120 minutes.
A l'issue de ces 120 minutes, du glucose 2 % est ajouté à la culture, en présence et en absence de 50 μM d'un inhibiteur connu du protéasome, le MG132.
Les résultats sont présentés sur la Figure 3 La Figure 3 présente les résultats obtenus avec la souche de levure recombinante CYS361. Les protéines totales sont préparées avant l'ajout de galactose (0), 120 minutes après l'ajout de galactose (120) et 15, 30, 60, 90 et 150 minutes (15, 30, 60, 90, 150) après l'ajout de glucose (+Glucose).
Ces protéines sont analysées par la technique d'immuno-empreinte (« Western blotting ») en employant un anticorps reconnaissant la partie Mdm2 des protéines de fusion (indiquée « mAG-Mdm2» sur la Figure 2). La présence de MG132 dans la culture est indiquée « + MG132 » sur la Figure 2. Un contrôle de la quantité de protéines déposée dans chaque puits est réalisé en analysant les mêmes protéines à l'aide d'anticorps reconnaissant la Lysyl-ARNt- synthase de levure. Clichés de gels d'immuno-empreinte (« Western blotting ») révélés avec des anticorps anti-Mdm2.
B. Résultats
Les résultats sont illustrés pour la souche de levure recombinante CYS361.
Les résultats présentés sur la Figure 2 illustrent par une analyse biochimique de type Western blotting, la dégradation de la protéine de fusion mAG-Mdm2.
Sur la Figure 3, on observe que la présence de galactose durant la totalité du temps de culture provoque une induction continue de la production de la protéine Mdm2 fusionnée au rapporteur fluorescent mAG, qui pallie la dégradation des protéines Mdm2 ou de la fusion mAG-Mdm2 par le protéasome qui a simultanément lieu dans les cellules de levure.
Sur la Figure 2, on observe que la culture des cellules en présence de glucose (indiquée « + Glu » sur la Figure 3), du fait que la production de la protéine Mdm2 ou de la fusion mAG-Mdm2 n'est plus induite, permet de visualiser la dégradation de la protéine Mdm2 ou de la fusion mAG-Mdm2 par le protéasome. Sur la Figure 2, on observe que la culture des cellules en présence de glucose et d'un inhibiteur du protéasome, le composé MG132 (indiquée « + 50 μM MG132 » sur la Figure 2) permet d'inhiber la dégradation de la protéine Mdm2 ou de la fusion mAG- Mdm2 qui est observée en l'absence du composé MG132.
EXEMPLE 4 : Dégradation de la protéine m AG- M DM2 (microscopie d'épifluorescence)
L'exemple 4 illustre les résultats d'une analyse au microscope d'épifluorescence, de la dégradation de la protéine de fusion mAG-Mdm2 dans des cellules de levure de la souche recombinante CYS361.
A. Matériel et Méthodes
Les cellules de levure de la souche CYS361 ont été cultivées en milieu minimum en présence de galactose comme source de carbone pendant 120 minutes.
A l'issue de ces 120 minutes (1120), du glucose 2 % est ajouté à la culture, en présence et en absence de 50 μM d'un inhibiteur connu du protéasome, le MG132, pendant 120 minutes (D120).
Les cellules sont observées au microscope à épifluorescence (microscope à fluorescence Nikon Eclipse équipé d'un filtre Oméga XF1 16). Toutes les images ont été enregistrées en employant une caméra Hamamastu® en employant des réglages identiques et analysées avec le logiciel LUCIA G.
B. Résultats Les résultats sont représentés sur la Figure 3. La Figure 3 illustre les résultats d'épifluorescence obtenus avec les cellules de la souche CYS361 cultivées en 120 minutes en présence de glucose et au temps 120 minutes après l'arrêt de l'induction de l'expression de la protéine de fusion en présence (D120 + MG132) ou non (D120) de 50 μM de MG132. Sur la Figure 3 sont représentés les clichés de microscopie à fluorescence permettant de localiser dans les cellules l'expression de la protéine de fusion mAG- Mdm2.
Sur la Figure 3, on observe une réduction du signal de fluorescence avec la durée de culture, au fur et à mesure de la progression de la dégradation de la protéine de fusion par le protéasome alors qu'n présence de l'inhibiteur du protéasome MG132 on observe un maintien de l'intensité du signal de fluorescence avec la durée de culture, ce qui illustre le blocage de l'activité de dégradation de la protéine de fusion par le protéasome, blocage qui est induit par l'inhibiteur MG132.
EXEMPLE 5 : Dégradation de la protéine mAG-Mdm2 (quantification par cvtomètrie de flux)
L'exemple 5 illustre une quantification, par cytométrie de flux des cellules de levure de la souche CYS361 , du signal de fluorescence émis par ces cellules, au cours du temps de culture, respectivement (i) pendant l'induction de la production de la protéine de fusion en présence de galactose et (ii) en présence de glucose après arrêt de la production de la protéine de fusion. Les cellules de levure ont été cultivées en présence ou en l'absence de l'inhibiteur de protéasome MG132.
Les résultats sont illustrés par les courbes présentées sur la Figure 4.
La Figure 4 illustre une quantification en cytométrie de flux (FACS) de la fluorescence émise par la protéine de fusion mAG-Mdm2 produite par la souche CYS361 , en présence et en absence de l'inhibiteur du protéasome MG132.
A. Matériel et Méthodes
Toutes les cellules ont été cultivées en milieu minimum en présence de galactose comme source de carbone pendant 120 minutes.
A l'issue de ces 120 minutes, du glucose 2 % est ajouté à la culture, en présence et en absence de 50 μM d'un inhibiteur connu du protéasome, le MG132. La fluorescence émise par les cellules a été quantifiée en employant un cytomètre flux FacsCalibur (Beckton-Dickinson), juste avant l'ajout de galactose (10), 30 minutes, 1 heure, 1 heure 30 minutes et 2 heures après l'ajout de galactose et 15 minutes, 30 minutes, 1 heure, 1 heure 30 minutes et 2 heures 30 minutes après l'ajout de glucose. La présence de MG132 (à 50 μM) dans la culture est indiquée « + MG132 ». La fluorescence est rapportée en unités arbitraires
B. Résultats
Les résultats de la Figure 4 montrent que la protéine de fusion est activement produite par la souche de levure CYS361 , lorsque les cellules sont cultivées en présence de galactose (temps 10, M h et I2h).
Les résultats de la Figure 4 montrent que la protéine de fusion, qui s'est accumulée dans les cellules en présence de galactose, est progressivement dégradée au cours du temps de culture en l'absence de galactose et en présence de glucose, en l'absence du composé MG132 (Temps D1 h, D2h et intermédiaires).
Les résultats de la Figure 4 montrent que, en présence de l'inhibiteur du protéasome MG132, la dégradation de la protéine de fusion est fortement inhibée (Temps D1 h, D2h et intermédiaires).
EXEMPLE 6 : localisation, dans les cellules de levure des protéines de fusions mAG-Mdm2.
Dans l'exemple 6, on a déterminé la localisation, dans les cellules de levure de la souche CYS361 , de la protéine mAG-Mdm2.
A. Matériel et Méthodes
Des cellules de levures de la souche CYS361 comprenant un polynucléotide permettant l'expression de la protéine de fusion mAG-Mdm2 sous le contrôle du promoteur GAL 1 ont été cultivées en présence de galactose 2 % pendant 2 heures et ont été ensuite observées en microscopie à fluorescence. La position du noyau a été révélée en employant un indicateur coloré spécifique du noyau, le Hoescht 333-42.
On a réalisé des clichés de microscopie en lumière visible et des clichés de microscopie à fluorescence permettant de colorer l'ADN des noyaux cellulaires avec le colorant Hoechst 333-42. On a superposé les clichés de microscopie en lumière visible et les clichés de microscopie à fluorescence (non représenté). B. Résultats
Les résultats montrent une co-localisation des noyaux cellulaires (ADN) et de la protéine de fusion mAG-Mdm2 (mAG-MDM2).
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Claims

REVENDICATIONS
1. Procédé in cellulo pour le criblage d'agents modulant l'activité de l'ubiquitine ligase Mdm2, ledit procédé comprenant les étapes suivantes : a) mettre en contact un agent candidat à tester avec des cellules de levure recombinantes qui expriment dans leur noyau une protéine de fusion comprenant : (i) un polypeptide MDM2 et (ii) au moins une protéine détectable. b) quantifier ladite première protéine détectable dans les cellules de levure, à la fin d'au moins une période de temps prédéterminée après la mise en contact de l'agent candidat avec lesdites cellules ; c) comparer la valeur obtenue à l'étape (b) avec une valeur témoin obtenue lorsque l'étape (a) est réalisée en l'absence de l'agent candidat.
2. Procédé selon la revendication 1 , caractérisé en ce que l'étape (a) comprend les étapes suivantes :
(ai ) cultiver les cellules de levure qui expriment dans leur noyau ladite protéine de fusion comprenant le polypeptide MDM2 et au moins une protéine détectable ; (a2) stopper l'expression de ladite protéine de fusion comprenant le polypeptide MDM2 et au moins une protéine détectable par les cellules de levure ;
(a3) mettre en contact les cellules de levures obtenues à la fin de l'étape (a2) avec l'agent candidat à tester.
3. Procédé selon l'une des revendications 1 et 2, caractérisé en ce que la protéine détectable comprise dans la protéine de fusion comprenant le polypeptide MDM2 est choisie parmi un antigène, une protéine fluorescente et une protéine ayant une activité enzymatique.
4. Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce que la protéine détectable consiste en une protéine fluorescente choisie parmi la protéine mAG ou l'un de ses dérivés, et la protéine GFP ou l'un de ses dérivés.
5. Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce que la protéine détectable consiste en une protéine ayant une activité enzymatique choisie parmi la luciferase et la β-lactamase.
6. Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce que la protéine détectable consiste en un antigène choisi parmi le peptide Ha et le peptide Flag.
7. Procédé selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que la protéine comprenant le polypeptide MDM2 consiste en la protéine de séquence SEQ ID N°3.
8. Procédé selon l'une des revendications 1 à 7, caractérisé en ce qu'à l'étape (b), lorsque la première protéine détectable est un antigène, on quantifie ladite première protéine détectable par détection des complexes formés entre ladite protéine et des anticorps la reconnaissant.
9. Procédé selon l'une des revendications 1 à 7, caractérisé en ce qu'à l'étape (b), lorsque la première protéine détectable est une protéine fluorescente, on quantifie ladite protéine détectable par une mesure du signal de fluorescence émis par ladite protéine.
10. Procédé selon l'une des revendications 1 à 7, caractérisé en ce qu'à l'étape (b), lorsque la première protéine détectable est une protéine ayant une activité enzymatique, on quantifie ladite protéine détectable par une mesure de la quantité de substrat transformé par ladite protéine.
1 1. Procédé selon l'une des revendications 1 à 10, caractérisé en ce que les cellules de levures recombinantes sont transformées avec un polynucléotide qui comprend :
(a) un cadre de lecture ouvert codant (i) la protéine de fusion comprenant le polypeptide MDM2 et (ii) une protéine détectable, et
(b) une séquence régulatrice fonctionnelle dans des cellules de levure qui dirige l'expression dudit cadre de lecture ouvert;
12. Procédé selon la revendication 11 , caractérisé en ce que la séquence régulatrice contenue dans le premier polynucléotide comprenne un promoteur fonctionnel dans les cellules de levure et qui est sensible à l'action d'un agent inducteur.
13. Procédé selon la revendication 12, caractérisé en ce que le promoteur sensible à l'action d'un agent inducteur consiste en un promoteur répressible fonctionnel dans les cellules de levure choisi parmi CUP1, GAL 1, GAL W, MET3, MET25, PHO5, et THI4 de la levure Saccharomyces cerevisae.
14. Procédé selon la revendication 13, caractérisé en ce que ledit polynucléotide codant la protéine de fusion comprend la séquence régulatrice GAL 1, qui active l'expression du cadre de lecture ouvert codant ladite protéine de fusion.
15. Procédé selon l'une des revendications 1 à 14, caractérisé en en ce que les cellules de levure recombinantes possèdent le polynucléotide sous une forme insérée dans leur génome.
16. Procédé selon l'une des revendications 1 à 15, caractérisé en ce que les cellules de levure recombinantes possèdent ou non dans leur génome une forme inactivée d'un ou plusieurs gènes contrôlant l'expression de protéines transporteurs insérées dans la membrane plasmique.
17. Procédé selon la revendication 16, caractérisé en ce que le ou les gènes inactivés sont choisis parmi les gènes PDR1 et PDR3.
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