EP1238079A2 - Fragments de proteines de la famille wasp (wiskott-aldrich syndrome protein), et leurs utilisations - Google Patents

Fragments de proteines de la famille wasp (wiskott-aldrich syndrome protein), et leurs utilisations

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Publication number
EP1238079A2
EP1238079A2 EP00988944A EP00988944A EP1238079A2 EP 1238079 A2 EP1238079 A2 EP 1238079A2 EP 00988944 A EP00988944 A EP 00988944A EP 00988944 A EP00988944 A EP 00988944A EP 1238079 A2 EP1238079 A2 EP 1238079A2
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EP
European Patent Office
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ala
ser
pro
gly
gin
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP00988944A
Other languages
German (de)
English (en)
Inventor
Vincent Noireaux
Jacques Prost
Cécile SYKES
Evelyne Friederich
Roy M. Golsteyn
Daniel Louvard
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Institut Curie
Original Assignee
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Institut Curie
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Filing date
Publication date
Application filed by Centre National de la Recherche Scientifique CNRS, Institut Curie filed Critical Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Publication of EP1238079A2 publication Critical patent/EP1238079A2/fr
Withdrawn legal-status Critical Current

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/37—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from fungi
    • C07K14/39—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from fungi from yeasts
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/37—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from fungi
    • C07K14/39—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from fungi from yeasts
    • C07K14/395—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from fungi from yeasts from Saccharomyces
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals

Definitions

  • the present invention relates to peptide fragments of proteins of the WASP family, or the peptides derived from these fragments, as well as their uses in particular in the context of methods for detecting molecules having an effect on cell mobility.
  • the cells of our body are able to move and sometimes they round and divide into two sister cells. All of these movements are based on the actin cytoskeleton.
  • the cytoskeleton plays an essential role for the organization of the body and for homeostasis. For example, cell migration is essential in embryogenesis and the immune response as well as in the repair of wounds where cells migrate to damaged regions. These movements are dependent on the normal functioning of the actin cytoskeleton. The consequences of disrupting the functioning of the cytoskeleton can be disastrous for the body. In metastatic processes, for example, the lack of control of the cytoskeleton of tumor cells can cause them to migrate outside their normal location, allowing them to proliferate in other parts of the body, which makes cancer treatment extremely difficult. .
  • the first step in all cytoskeleton-dependent processes, such as movement, is the production of actin, or F-actin, filaments.
  • actin or F-actin, filaments.
  • the mechanism of the formation of these biological polymers in the cell is still unknown, despite the identification of numerous actin-binding proteins and the extensive study of the polymerization of actin in vitro.
  • Wiskott-Aldrich syndrome is a disease of the cytoskeleton.
  • the human WASP protein expressed from the WAS gene which is mutated in patients affected by this syndrome, as well as the N-WASP protein of bovine origin (which has approximately 45% of sequence identity with the human WASP protein), have therefore been the subject of studies with the aim of clarifying the mechanism of functioning of the cytoskeleton in the cell (Yarar et al., Current Biology, 9: 555 - 558 (1999); Rohatgi et al., Cell, 97: 221 - 231 (1999); Miki et al, The EMBO Journal, 15 ( 19): 5326 - 5335 (1996)).
  • WASP and N-WASP proteins are composed of peptide domains having functional properties identifiable in biochemical tests.
  • these two proteins mainly have the following domains:
  • proline-rich region - a proline-rich region, - a domain of homology with verproline, a protein which also binds to proteins involved in the formation of actin filaments, this domain comprising a sequence homologous to verproline in the case of WASP human, and two sequences homologous to verproline in the case of N-WASP,
  • WASP and N-WASP proteins have been shown to interact with the Arp2 / 3 complex (protein complex involved in the polymerization of actin), and thus induce the polymerization of actin.
  • the WASP protein is sufficient to act on cellular motility based on actin, and that this function is dependent on the Arp2 / 3 complex (Yarar et al. 1999 mentioned above).
  • the authors of this article prepared microspheres coated with WASP protein and demonstrated that these microspheres polymerize actin, form actin tails, and are endowed with actin-based motility in cell extracts.
  • the microspheres coated with WASP protein no longer have motility and only have a residual actin polymerization activity.
  • the C-terminal part of N-WASP namely the C-terminal fragment of 114 amino acids comprising the domain of homology with verproline (region V containing the two sequences homologous to verproline), the domain of homology with cofilin (region C), and the C-terminal acid segment (region A), or VCA fragment, binds to the Arp2 / 3 complex and strongly stimulates the capacity of the latter to nucleate the polymerization of actin (Rohatgi et al. 1999 mentioned above).
  • the present invention follows from the discovery by the Inventors of the fact that, contrary to what the state of the art described above might have suggested, the fragments of these WASP and N-WASP proteins are sufficient to induce a actin polymerization such that it allows the displacement of supports to which said elements are linked in cell extracts.
  • the object of the present invention is to provide new fragments, or derived polypeptides, of the WASP and N-WASP proteins, as well as the nucleotide sequences coding for these fragments.
  • the invention also aims to provide new methods for detecting or screening molecules having an effect on the formation of the cytoskeleton, in particular cytotoxic molecules or drugs which can be used in the treatment of pathologies linked to an abnormal development of the cytoskeleton .
  • the invention also aims to provide new reagents and kits for carrying out the above-mentioned methods.
  • the subject of the present invention is the use:
  • peptide fragments of proteins of the WASP family in eukaryotic cells, in particular human or other mammal cells, or insect cells, or of microorganisms such as yeasts, said peptide fragments having the property of proteins of the WASP family to polymerize actin by inducing cell motility, - Or of peptide sequences derived from the above-mentioned peptide fragments of proteins of the WASP family, in particular by substitution of one or more amino acids of these fragments, said derived sequences having the above-mentioned property of proteins of the WASP family and of said fragments of the latter , for the preparation of reagents usable within the framework of the implementation of a method of detection or screening of molecules having an effect of inhibiting or stimulating the formation of the actin cytoskeleton, and therefore an effect of inhibition or stimulation of cell motility.
  • the subject of the invention is also the use of the peptide fragments or of the abovementioned derived sequences, within the framework of the implementation of a method of detection or screening of molecules capable of being able to be used as medicaments in the treatment pathologies linked to a dysfunction of the actin polymerization process in the context of the formation of the actin cytoskeleton.
  • a more particular subject of the invention is the use of the above-mentioned peptide fragments or derived sequences, within the framework of the implementation of a method for detecting or screening for molecules having an effect of inhibiting the formation of the cytoskeleton actin, and therefore an inhibiting effect on cell motility, said molecules being capable of being used:
  • a more particular subject of the invention is the use of the above-mentioned peptide fragments or derived sequences, within the framework of the implementation of a method for detecting side effects of molecules, in particular of drugs or molecules of the environment, namely a method for detecting molecules capable of having a cytotoxic effect corresponding to an inhibition or stimulation of the formation of the actin cytoskeleton.
  • proteins of the WASP family is meant, in the above and what follows, the protein produced by the WAS gene mutated in the context of Wiskott-Aldrich syndrome in humans, as well as proteins of human origin or no, having at least about 45% homology with the aforementioned human WASP protein, and being involved in the process of polymerization of cellular actin, and, where appropriate, of cellular motility.
  • this domain has structural characteristics similar to a domain of homology to pleckstrin (or pH domain), and is supposed to interact with the polymerized actin and with the phospholipids, a domain rich in prolines,
  • WH2 / A domain which is divided into three sub-domains, namely the subprofile of homology with verproline, the subdomain of homology with cofilin, and the acid sub-domain mentioned above.
  • the peptide fragments used in the context of the present invention are chosen from the fragments of the WASP, N-WASP, Scar and Las proteins, or the peptide sequences derived from the above-mentioned peptide fragments as defined above.
  • a more particular subject of the invention is the aforementioned use of peptide fragments chosen from the fragments:
  • N-WASP protein or other mammals, in particular bovine, or rat N-WASP protein,
  • the Scar subfamily such as the Scar 1 / WAVE protein of Dictyostellium discoidewn, or of Caenorhabditis elegans, or of Drosophila melanogaster, of mice, or of humans,
  • yeasts such as the Las17 / Beel protein of Saccharomyces cerevisiae, or the homologous protein
  • WASP Wsplp of Schizosaccharomyces ponibe.
  • the above-mentioned peptide fragments are chosen from those comprising:
  • the domain of homology with verproline contained in the proteins of the WASP family or in a protein derived from the latter, or at least one of the two sequences homologous to verproline when said proteins of the WASP family contain two of these sequences , or a peptide sequence derived from the aforementioned domain, in particular by substitution, addition or deletion of one or more amino acids, and retaining the property of this domain to bind to actin,
  • the aforementioned peptide fragments used in the context of the present invention also contain the C-terminal acid segment of said proteins
  • the abovementioned peptide fragments do not contain the domain of homology with plekstrin, and / or the binding domain to Cdc42, and / or the proline-rich region, defined above of said proteins of the WASP family.
  • a more particular subject of the invention is the aforementioned use of peptide fragments of proteins of the WASP family of human origin.
  • the peptide fragments of proteins of the WASP family of human origin used are chosen from fragments of the human WASP protein comprising: the domain of homology with verproline delimited by the amino acids located at positions 430 and 446 of the peptide sequence SEQ ID NO 2 of the protein
  • fragments of the human WASP protein used above are chosen from the following:
  • Trp Asp Asp * the 84 amino acid fragment delimited by the amino acids located at positions 404 and 487 in FIG. 1, namely the following peptide SEQ ID NO 6:
  • the peptide fragments of proteins of the WASP family of human origin used are chosen from fragments of the human N-WASP protein comprising: . the sequence homologous to verproline delimited by the amino acids located at positions 405 and 421 of the peptide sequence SEQ ID NO 12 of the human N-WASP protein represented in FIG. 2, or a peptide sequence derived from the above-mentioned domain as defined above -above, .
  • the domain of homology with the cofilin contained in the aforementioned N-WASP protein namely the domain delimited by the amino acids located at positions 470 and 488 of the peptide sequence SEQ ID NO 12 of the human N-WASP protein represented on Figure 2, or a peptide sequence derived from the above-mentioned domain as defined above.
  • fragments of the human N-WASP protein used above are chosen from the following:
  • the peptide fragments of proteins of the WASP family of human origin used are chosen from fragments of the human Scarl protein comprising:
  • the fragments of the human Scarl protein used above are chosen from the following:
  • a more particular subject of the invention is the aforementioned use of peptide fragments of proteins of the WASP family of non-human origin.
  • the peptide fragments of the proteins of the WASP family of non-human origin used are chosen from:
  • Asp Glu Trp Asp Asp * the fragment of 86 amino acids delimited by the amino acids located at positions 420 and 505 of FIG. 4, namely the following peptide SEQ ID NO 40:
  • Bovine N-WASP represented in FIG. 6, or a peptide sequence derived from the above-mentioned domain as defined above, * the fragments of which the N-terminal amino acid corresponds to that located in one of the positions 405 to 433 of FIG. 6, and the C-terminal amino acid corresponds to that located in one of the positions 488 to 505 in Figure 6,
  • WASP family protein fragments from microorganisms such as:
  • Wsplp WASP homologous protein
  • the invention also relates to the aforementioned use of peptide fragments, or of sequences derived from the latter, as defined above, fused on the N-terminal or C-terminal side with one or more peptide sequences facilitating the detection and the purification of the aforementioned peptide fragments or derived sequences, without however affecting the aforementioned property of the latter of polymerizing actin by inducing cell motility.
  • the invention also relates to the abovementioned peptide fragments, or the sequences derived therefrom, as such, namely more particularly the peptide fragments of the proteins of the WASP family of eukaryotic cells chosen from those comprising:
  • the domain of homology with verproline contained in the proteins of the WASP family or in a protein derived from the latter, or at least one of the two sequences homologous to verproline when said proteins of the WASP family contain two of these sequences , or a peptide sequence derived from the aforementioned domain, in particular by substitution, addition or deletion of one or more amino acids, and retaining the property of this domain to bind to actin,
  • a more particular subject of the invention is the above-mentioned peptide fragments of the human WASP protein, or the peptide sequences derived from the latter, said fragments being chosen from those comprising:
  • the invention relates more particularly still to the fragments of the human WASP protein chosen from the fragments whose N-terminal amino acid corresponds to that located at one of the positions 404 to 430 of FIG. 1, and the amino acid C -terminal corresponds to that located at one of positions 487 to 502 in FIG. 1, and more particularly the peptides SEQ ID NO 4, SEQ ID NO 6, SEQ ID NO 8, and SEQ ID NO 10 mentioned above, or the sequences derived from these as defined above.
  • a more particular subject of the invention is the above-mentioned peptide fragments of the human N-WASP protein, or the peptide sequences derived therefrom, said fragments being chosen from those comprising:
  • the domain of homology with the cofilin contained in the aforementioned N-WASP protein namely the domain delimited by the amino acids located at the positions 470 and 488 of the peptide sequence SEQ ID NO 12 of the human N-WASP protein shown in FIG. 2, or a peptide sequence derived from the above-mentioned domain as defined above.
  • the invention relates more particularly still to the fragments of the human N-WASP protein chosen from fragments whose N-terminal amino acid corresponds to that located at one of positions 392 to 433 in FIG. 2, and the acid C-terminal amino corresponds to that located at one of positions 488 to 505 in FIG. 2, and more particularly the peptides SEQ ID NO 16, SEQ ID NO 18, SEQ ID NO 20, SEQ ID NO 22, and SEQ ID NO 24 above, or the sequences derived therefrom as defined above.
  • a more particular subject of the invention is the above-mentioned peptide fragments of the human Scarl protein, or the peptide sequences derived from the latter, said fragments being chosen from those comprising:
  • the invention relates more particularly still to the fragments of the human Scarl protein chosen from fragments whose N-terminal amino acid corresponds to that located at one of positions 443 to 497 in FIG. 3, and amino acid C -terminal corresponds to that located at one of positions 546 to 559 in FIG. 3, and more particularly the peptides SEQ ID NO 28, SEQ ID NO 30, SEQ ID NO 32, and SEQ ID NO 34 mentioned above, or the sequences derived from these as defined above.
  • a more particular subject of the invention is the above-mentioned peptide fragments of the murine WASP protein, or the peptide sequences derived therefrom, said fragments being chosen from those comprising:
  • the invention relates more particularly still to the fragments of the murine WASP protein chosen from the fragments whose N-terminal amino acid corresponds to that located at one of the positions 420 to 448 of FIG. 4, and the amino acid C -terminal corresponds to that located at one of the positions 505 to 520 of FIG. 4, and more particularly the peptides
  • SEQ ID NO 38 SEQ ID NO 40, SEQ ID NO 42, and SEQ ID NO 44 above, or the sequences derived therefrom as defined above.
  • a more particular subject of the invention is the above-mentioned peptide fragments of the rat N-WASP protein, or the peptide sequences derived therefrom, said fragments being chosen from those comprising:
  • the invention relates more particularly still to the fragments of the rat N-WASP protein chosen from the fragments whose N-terminal amino acid corresponds to that located at one of positions 401 to 429 in FIG. 5, and the C-terminal amino acid corresponds to that located at one of positions 484 to 501 in FIG. 5, and more particularly the SEQ ID NO 48, SEQ ID NO 50, SEQ ID NO 52, and SEQ ID NO 54 peptides mentioned above, or the sequences derived therefrom as defined above.
  • a more particular subject of the invention is the abovementioned peptide fragments of the bovine N-WASP protein, or the peptide sequences derived from the latter, said fragments being chosen from those comprising:
  • Bovine N-WASP represented in FIG. 6, or a peptide sequence derived from the above-mentioned domain as defined above,
  • the invention relates more particularly still to the fragments of the bovine N-WASP protein chosen from the fragments whose N-terminal amino acid corresponds to that located at one of positions 405 to 433 in FIG. 6, and the acid C-terminal amine corresponds to that located at one of positions 488 to 505 in FIG. 6, and more particularly the peptides SEQ ID NO 58, SEQ ID NO 60, SEQ ID NO 62, and SEQ ID NO 64 mentioned above, or the sequences derived therefrom as defined above.
  • a more particular subject of the invention is the above-mentioned peptide fragments of the Las 17 protein of Saccharomyces cerevisiae, or the peptide sequences derived from the latter, said fragments being chosen from those comprising:
  • Las 17 represented in FIG. 7, or a peptide sequence derived from the above-mentioned domain as defined above,
  • the invention relates more particularly still to the fragments of the Las 17 protein of Saccharomyces cerevisiae chosen from the fragments whose N-terminal amino acid corresponds to that located at one of positions 422 to 447 in FIG. 7, and the amino acid C-terminal corresponds to that located at one of positions 624 to 633 in FIG. 7, and more particularly the peptides SEQ ID NO 68, SEQ ID NO 70, SEQ ID NO 72, and SEQ ID NO 74 above-mentioned, or the sequences derived therefrom as defined above.
  • a more particular subject of the invention is the above-mentioned peptide fragments of the Schizosaccharomyces pombe protein (Wsplp), or the peptide sequences derived from the latter, said fragments being chosen from those comprising: the domain of homology with verproline delimited by the amino acids located at positions 501 and 517 of the peptide sequence SEQ ID NO 76 of the homologous protein WASP (Wsplp) of Schizosaccharomyces pombe shown in FIG. 8, or a peptide sequence derived from above-mentioned domain as defined above,
  • the invention relates more particularly still to the fragments of the WASP homologous protein (Wsplp) of Schizosaccharomyces pombe chosen from fragments whose N-terminal amino acid corresponds to that located at one of positions 477 to 501 in FIG. 8, and the C-terminal amino acid corresponds to that located at one of positions 565 to 574 in FIG. 8, and more particularly the peptides SEQ ID NO 78, SEQ ID NO 80,
  • the invention also relates to the nucleotide sequences coding for the abovementioned peptide fragments, or for the proteins derived therefrom, or also for the fusion proteins as described above.
  • the subject of the invention is more particularly: - the nucleotide sequences whose 5 'end corresponds to the nucleotide located at one of positions 1244 to 1322 of the nucleotide sequence SEQ ID NO 1 shown in FIG. 1, and the 3' end corresponds to the nucleotide located at ' one of positions 1495 to 1540 in FIG. 1, said nucleotide sequences coding for the abovementioned fragments of the human WASP protein, the N-terminal amino acid of which corresponds to that located in one of positions 404 to 430 of FIG. 1, and the C-terminal amino acid corresponds to that located at one of positions 487 to 502 in FIG. 1,
  • nucleotide sequence SEQ ID NO 3 delimited by the nucleotides located at positions 1244 and 1540 of FIG. 1, and coding for the peptide fragment of the human WASP protein corresponding to the peptide SEQ ID NO 4 mentioned above,
  • nucleotide sequence SEQ ID NO 5 delimited by the nucleotides located at positions 1244 and 1495 of FIG. 1, and coding for the peptide fragment of the human WASP protein corresponding to the peptide SEQ ID NO 6 mentioned above,
  • nucleotide sequence SEQ ID NO 7 delimited by the nucleotides located at positions 1322 and 1540 of FIG. 1, and coding for the peptide fragment of the protein
  • nucleotide sequence SEQ ID NO 9 delimited by the nucleotides located at positions 1322 and 1495 of FIG. 1, and coding for the peptide fragment of the human WASP protein corresponding to the peptide SEQ ID NO 10 mentioned above, - the nucleotide sequences derived by degeneration the genetic code of the above-mentioned nucleotide sequences, and coding for the above-mentioned peptide fragments,
  • nucleotide sequences derived from the abovementioned nucleotide sequences and coding for the sequences derived from said peptide fragments as defined above.
  • the invention relates more particularly still:
  • nucleotide sequences whose 5 'end corresponds to the nucleotide located at one of positions 1174 to 1299 of the nucleotide sequence SEQ ID NO 11 shown in FIG. 2, and the 3' end corresponds to the nucleotide located at ' one of positions 1464 to 1515 in FIG. 2, said nucleotide sequences coding for the abovementioned fragments of the protein N-WASP, the N-terminal amino acid of which corresponds to that located in one of positions 392 to 433 in FIG. 2 , and the C-terminal amino acid corresponds to that located at one of positions 488 to 505 in FIG.
  • nucleotide sequence delimited by the nucleotides located in positions 1174 to 1515 coding for the peptide fragment of the protein N-WASP delimited by acids amines located at positions 392 to 505 of the peptide sequence represented in FIG. 2 - the nucleotide sequence SEQ ID NO 15 delimited by the nucleotides located at positions 1174 and 1464 coding for the peptide fragment of the N-WASP protein corresponding to the peptide SEQ ID NO 16 mentioned above,
  • nucleotide sequence SEQ ID NO 17 delimited by the nucleotides located at positions 1213 and 1515 coding for the peptide fragment of the protein N-WASP corresponding to the peptide SEQ ID NO 18 mentioned above,
  • nucleotide sequence SEQ ID NO 19 delimited by the nucleotides located at positions 1213 and 1464 coding for the peptide fragment of the protein N-WASP corresponding to the peptide SEQ ID NO 20 mentioned above,
  • nucleotide sequence SEQ ID NO 21 delimited by the nucleotides located at positions 1297 and 1515 coding for the peptide fragment of the protein N-WASP corresponding to the peptide SEQ ID NO 22 mentioned above,
  • nucleotide sequence SEQ ID NO 23 delimited by the nucleotides located at positions 1297 and 1464 encoding the peptide fragment of the protein N-WASP corresponding to the peptide SEQ ID NO 24 above, - the nucleotide sequences derived by degeneration of the genetic code of the sequences aforementioned nucleotides, and coding for the aforementioned peptide fragments,
  • nucleotide sequences derived from the abovementioned nucleotide sequences and coding for the sequences derived from said peptide fragments as defined above.
  • the subject of the invention is more particularly:
  • nucleotide sequences whose 5 'end corresponds to the nucleotide located at one of the positions 1327 to 1489 of the nucleotide sequence SEQ ID NO 26 shown in FIG. 3, and the 3' end corresponds to the nucleotide located at ' one of positions 1638 to 1677 in FIG. 3, said nucleotide sequences coding for the abovementioned fragments of the human Scarl protein whose N-terminal amino acid corresponds to that located at one of positions 546 to 497 in FIG. 3, and the C-terminal amino acid corresponds to that located at one of positions 487 to 559 in FIG. 3,
  • nucleotide sequence SEQ ID NO 27 delimited by the nucleotides located at positions 1327 and 1677 of FIG. 3, and coding for the peptide fragment of the human Scarl protein corresponding to the peptide SEQ ID NO 28 mentioned above,
  • nucleotide sequence SEQ ID NO 29 delimited by the nucleotides located at positions 1327 and 1638 in FIG. 3, and coding for the peptide fragment of the human Scarl protein corresponding to the peptide SEQ ID NO 30 mentioned above,
  • nucleotide sequence SEQ ID NO 33 delimited by the nucleotides located at positions 1489 and 1638 of FIG. 3, and coding for the peptide fragment of the human Scarl protein corresponding to the peptide SEQ ID NO 34 mentioned above, - the nucleotide sequences derived by degeneration the genetic code of the above-mentioned nucleotide sequences, and coding for the above-mentioned peptide fragments,
  • nucleotide sequences derived from the abovementioned nucleotide sequences and coding for the sequences derived from said peptide fragments as defined above.
  • the subject of the invention is more particularly:
  • nucleotide sequences whose 5 'end corresponds to the nucleotide located at one of positions 1282 to 1366 of the nucleotide sequence SEQ ID NO 36 shown in FIG. 4, and the 3' end corresponds to the nucleotide located at ' one of positions 1539 to 1584 in FIG. 4, said nucleotide sequences coding for the abovementioned fragments of the murine WASP protein, the N-terminal amino acid of which corresponds to that located in one of positions 420 to 448 in FIG. 4, and the C-terminal amino acid corresponds to that located at one of the positions 505 to 520 of FIG. 4,
  • Murine WASP corresponding to the peptide SEQ ID NO 38 mentioned above the nucleotide sequence SEQ ID NO 39 delimited by the nucleotides located at positions 1282 and 1584 of FIG. 4, and coding for the peptide fragment of the murine WASP protein corresponding to the peptide SEQ ID NO 40 mentioned above,
  • nucleotide sequence SEQ ID NO 43 delimited by the nucleotides located at positions 1366 and 1539 of FIG. 4, and coding for the peptide fragment of the murine WASP protein corresponding to the peptide SEQ ID NO 44 mentioned above, - the nucleotide sequences derived by degeneration the genetic code of the above-mentioned nucleotide sequences, and coding for the above-mentioned peptide fragments,
  • nucleotide sequences derived from the abovementioned nucleotide sequences and coding for the sequences derived from said peptide fragments as defined above.
  • the subject of the invention is more particularly:
  • nucleotide sequences whose 5 'end corresponds to the nucleotide located at one of positions 1272 to 1356 of the nucleotide sequence SEQ ID NO 46 shown in FIG. 5, and the 3' end corresponds to the nucleotide located at one of positions 1523 to 1574 in FIG. 5, said nucleotide sequences coding for the abovementioned fragments of the rat N-WASP protein, the N-terminal amino acid of which corresponds to that located in one of positions 401 to 429 of the FIG. 5, and the C-terminal amino acid corresponds to that located at one of positions 484 to 501 in FIG. 5,
  • nucleotide sequence SEQ ID NO 49 delimited by the nucleotides located at positions 1272 and 1523 in FIG. 5, and coding for the peptide fragment of the rat N-WASP protein corresponding to the peptide SEQ ID NO 50 mentioned above
  • nucleotide sequence SEQ ID NO 51 delimited by the nucleotides located at positions 1356 and 1574 of FIG. 5, and coding for the peptide fragment of the rat N-WASP protein corresponding to the peptide SEQ ID NO 52 mentioned above
  • nucleotide sequence SEQ ID NO 53 delimited by the nucleotides located at positions 1356 and 1523 of FIG. 5, and coding for the peptide fragment of the rat N-WASP protein corresponding to the peptide SEQ ID NO 54 mentioned above
  • nucleotide sequences derived by degeneration of the genetic code of the above-mentioned nucleotide sequences, and coding for the above-mentioned peptide fragments
  • nucleotide sequences derived from the abovementioned nucleotide sequences and coding for the sequences derived from said peptide fragments as defined above.
  • the subject of the invention is more particularly:
  • nucleotide sequences whose 5 'end corresponds to the nucleotide located at one of positions 1500 to 1584 of the nucleotide sequence SEQ ID NO 56 shown in FIG. 6, and the 3' end corresponds to the nucleotide located at ' one of positions 1751 to 1802 in FIG. 6, said nucleotide sequences coding for the abovementioned fragments of the bovine N-WASP protein, the N-terminal amino acid of which corresponds to that located in one of positions 405 to 433 in the figure 6, and the C-terminal amino acid corresponds to that located at one of positions 488 to 505 in FIG. 6,
  • nucleotide sequence SEQ ID NO 57 delimited by the nucleotides located at positions 1500 and 1802 in FIG. 6, and coding for the peptide fragment of the bovine N-WASP protein corresponding to the peptide SEQ ID NO 58 mentioned above,
  • nucleotide sequence SEQ ID NO 59 delimited by the nucleotides located at positions 1500 and 1751 in FIG. 6, and coding for the peptide fragment of the bovine N-WASP protein corresponding to the peptide SEQ ID NO 60 mentioned above,
  • nucleotide sequence SEQ ID NO 61 delimited by the nucleotides located at positions 1584 and 1802 of FIG. 6, and coding for the peptide fragment of the protein
  • nucleotide sequence SEQ ID NO 63 delimited by the nucleotides located at positions 1584 and 1751 in FIG. 6, and coding for the peptide fragment of the bovine N-WASP protein corresponding to the peptide SEQ ID NO 64 mentioned above, - the nucleotide sequences derived by degeneration of the genetic code of the abovementioned nucleotide sequences, and coding for the abovementioned peptide fragments, the nucleotide sequences derived from the abovementioned nucleotide sequences, and coding for the sequences derived from said peptide fragments as defined above.
  • the subject of the invention is more particularly: - the nucleotide sequences whose 5 'end corresponds to the nucleotide located at one of the positions 2035 to 2110 of the nucleotide sequence SEQ ID NO 66 shown in FIG. 7, and the end 3 'corresponds to the nucleotide located at one of the positions 2643 to 2670 in FIG. 7, said nucleotide sequences coding for the abovementioned fragments of the Las 17 protein of Saccharomyces cerevisiae whose N-terminal amino acid corresponds to that located at l one of positions 422 to 447 in FIG. 7, and the C-terminal amino acid corresponds to that located in one of positions 624 to 633 in FIG. 7,
  • nucleotide sequence SEQ ID NO 67 delimited by the nucleotides located at positions 2035 and 2670 of FIG. 7, and coding for the peptide fragment of the Las 17 protein of Saccharomyces cerevisiae corresponding to the peptide SEQ ID NO 68 mentioned above,
  • nucleotide sequence SEQ ID NO 69 delimited by the nucleotides located at positions 2035 and 2643 of FIG. 7, and coding for the peptide fragment of the protein Las 17 of Saccharomyces cerevisiae corresponding to the peptide SEQ ID NO 70 above
  • nucleotide sequence SEQ ID NO 71 delimited by the nucleotides located at positions 2110 and 2670 of FIG. 7, and coding for the peptide fragment of the protein Las 17 of Saccharomyces cerevisiae corresponding to the peptide SEQ ID NO 72 mentioned above
  • nucleotide sequence SEQ ID NO 73 delimited by the nucleotides located at positions 2110 and 2643 of FIG. 7, and coding for the peptide fragment of the protein
  • the subject of the invention is more particularly: - the nucleotide sequences whose 5 'end corresponds to the nucleotide located at one of the positions 1429 to 1501 of the nucleotide sequence SEQ ID NO 76 shown in FIG. 8, and the end 3 'corresponds to the nucleotide located at one of positions 1695 to 1722 in FIG. 8, said nucleotide sequences coding for the abovementioned fragments of the homologous protein WASP (Wsplp) of Schizosaccharomyces pombe whose N-terminal amino acid corresponds to that located at one of positions 477 to 501 in FIG. 8, and the C-terminal amino acid corresponds to that located at one of positions 565 to 574 in FIG. 8,
  • nucleotide sequence SEQ ID NO 79 delimited by the nucleotides located at positions 1429 and 1695 of FIG. 8, and coding for the peptide fragment of the protein (Wsplp) of Schizosaccharomyces pombe corresponding to the peptide SEQ ID NO 80 mentioned above,
  • nucleotide sequence SEQ ID NO 81 delimited by the nucleotides located at positions 1501 and 1722 of FIG. 8, and coding for the peptide fragment of the homologous protein WASP (Wsplp) of Schizosaccharomyces pombe corresponding to the peptide SEQ ID NO 82 mentioned above
  • nucleotide sequence SEQ ID NO 83 delimited by the nucleotides located at positions 1501 and 1695 of FIG. 8, and coding for the peptide fragment of the homologous protein WASP (Wsplp) of Schizosaccharomyces pombe corresponding to the peptide SEQ ID NO 84 mentioned above
  • the subject of the invention is also the vectors, in particular the plasmids, containing a nucleotide sequence as defined above.
  • the invention also relates to host cells transformed with an above-mentioned vector, said cells expressing the above-mentioned peptide fragments, or the derivative sequences described above, in recombinant form.
  • the above-mentioned host cells are chosen from the following: Escherichia coli D5 ⁇ and Escherichia coli BL21.
  • a subject of the invention is also reagents for implementing a method for detecting or screening molecules having an inhibiting or stimulating effect on the formation of the actin cytoskeleton, and therefore an inhibiting effect. or for stimulating cell mobility, said reagent comprising at least one peptide fragment defined above, linked or adsorbed to a support capable of moving under the effect of actin polymerization, when said support linked to said fragment is placed in a medium containing the elements necessary for the polymerization of actin, in particular when said support is added to a medium containing mainly the Arp2 / 3 complex, the VASP protein (stimulated phosphoprotein vasodilator), cofilin, and styling proteins , this medium can for example be an extract prepared from supernatants of lysed cells of the organism.
  • Styling protein is an essential part of WASP-dependent motility. These proteins are capable of converting the polymerization of actin into an actin-dependent movement by spatially limiting the polymerization to certain sites of the cell cytoskeleton. In comparison, in the absence of styling proteins the actin polymerization still takes place, but since uncontrolled, can no longer generate a force. Styling proteins are composed of two subunits, alpha (p34) and beta (p32) which are both required for styling activity. The dimer associates with the plus end of the filament which is normally favored for the addition of actin monomers and thus blocks the addition of monomers. Genes coding for styling proteins have been identified in all the species studied to date and have been shown to be essential for the survival of organisms. In humans, Cap beta 1, beta2, G and CapZ have been identified to date. Also know that multifunctional proteins such as gelsoline and villin also have styling activity in addition to their other actin-modifying activities.
  • a more particular subject of the invention is the reagents as defined above, chosen from microspheres whose diameter is advantageously between approximately
  • the material constituting the microspheres itself being preferably chosen from polystyrenes or latex, said microspheres each advantageously containing approximately 5,000 to approximately 50,000 molecules of the abovementioned peptide fragment or of a sequence derived according to the invention.
  • the above-mentioned peptide fragment, or its derived sequence are adsorbed on the surface of said microspheres, said reagent being obtained by simple mixing of said microspheres with said peptide fragment or with its derived sequence.
  • a more particular subject of the invention is the reagents as defined above, chosen from drops of oil, in particular oil from C14 to C18, such as palmitic acid, the diameter of which is advantageously between approximately 1 ⁇ m and approximately
  • the subject of the invention is also any method of detecting or screening molecules as defined above, having an effect of inhibiting or stimulating the formation of the actin cytoskeleton, and therefore an effect of inhibiting or stimulation of cell motility, said method comprising:
  • the abovementioned medium in which the molecule tested is placed in the presence of said reagent contains a compound marked in particular by fluorescence, making it possible to detect the displacement of said reagent.
  • the compound marked above is a fluorescent derivative of actin, such as actin-rhodamine (commercially available), making it possible to visualize the polymerization of actin by epifluorescence microscopy.
  • a subject of the invention is also the application of the method as defined above, to the detection or screening of molecules, as defined above, capable of being able to be used as medicaments in the treatment of related pathologies to a dysfunction of the actin polymerization process in the context of the formation of the actin cytoskeleton, or likely to have a cytotoxic effect corresponding to an inhibition or stimulation of the formation of the actin cytoskeleton.
  • the subject of the invention is also a kit or kit for implementing a process mentioned above, comprising
  • the invention will be further illustrated by means of the following detailed description of the preparation of microspheres coated with a peptide fragment of the invention, and of the detection of the polymerization of actin on the surface of these microspheres in a cell supernatant extract.
  • the sequence coding for the WH2 / A domain of the human WASP protein (namely the 99 amino acid fragment delimited by the amino acids located at positions 404 and 502 in FIG. 1, also designated peptide SEQ ID NO 4), and that encoding the epitope myc9E10 were amplified by PCR.
  • the myc epitope fused to the carboxy-terminal portion of the protein serves as a molecular label, allowing detection of the protein by immunological approaches without the need for an anti-WASP antibody.
  • This DNA sequence was introduced into the vector pGEX2T (Pharmacia), downstream of the sequence coding for glutathione-S-transferase (GST), generating the plasmid WH2 / A- pGEX2T.
  • the GST domain was chosen in this work because it facilitates the purification of the recombinant protein, and it has been shown that this domain does not inhibit the ability to polymerize the actin of the GST-VCA protein derived from N-WASP in a pyrene actin test (Rohatgi et al., 1999).
  • Figure 3 shows the organization of GST-WH2 domains. This recombinant protein is composed of GST and WH2 / A domains, of 237 and
  • E. coli bacteria (strain BL21) were transformed with the plasmid WH2 / 1 pG ⁇ X2T.
  • the bacteria were cultured in standard LB medium containing the antibiotic ampicillin to maintain the bacteria comprising the plasmid under selection pressure.
  • the bacteria were grown in suspension at 37 ° C until the culture reached an optical density of 0.8 at 600 nm.
  • isopropylthio- ⁇ -D-galactoside (IPTG) was added to the medium at a final concentration of 1 mM to induce the production of the protein. After 2 hours, the bacteria were collected by centrifugation and the pellets were stored at -80 ° C.
  • the pellets were thawed and added to extraction buffer (phosphate-buffered saline pH 7.2, 200 NaCl, 2 mM EDTA (ethylenediamine tetra acid), containing 1 ⁇ g / ml of each of the following protease inhibitors, leupeptin, benzamidine, pepstatin, at a ratio of 1 g of pellet per 10 volumes of extraction buffer.
  • extraction buffer phosphate-buffered saline pH 7.2, 200 NaCl, 2 mM EDTA (ethylenediamine tetra acid)
  • the suspension was sonicated until it was no longer viscous.
  • the extract was centrifuged at 20,000 xg for 10 minutes at 4 ° C.
  • the protein GST-WH2 / A was purified from the bacterial extract by affinity chromatography on resin coupled with Glutathione (Pharmacia) and eluted with 20 mM reduced glutathione according to manufacturers' recommendations. Purification was confirmed by analysis of GST-
  • WH2 / A by electrophoresis on acrylamide gel.
  • the presence of the myc epitope in the GST-WH2 / A sequence was confirmed by immunoblotting with an antibody directed against this epitope.
  • the GST-WH2 / A protein was absorbed on 500 nm latex beads (Polyscience
  • a water-oil emulsion is prepared as follows: 100 ⁇ l of oil are mixed with 900 ⁇ l of borate buffer
  • 0.1 MpH 8.5 (boric acid buffered with NaOH).
  • the solution is sonicated (probe) for a few seconds and a white foam is obtained.
  • the size of the oil drops is between 20 ⁇ m and l ⁇ m.
  • 20 ⁇ l of this solution are mixed with 100 ⁇ l of the aforementioned GST-WH2 / A protein (also designated GST-WA) (1 mg / ml in borate buffer). This solution is incubated at room temperature for 12 hours
  • GST-WA according to the supplier's protocol.
  • the particles are resuspended to 1% solid in PBS (Phosphate Buffer Saline) and stored on ice.
  • PBS Phosphate Buffer Saline
  • Each sample contains 15 ⁇ l of HeLa extracts (supplemented with ATP, creatine phosphate and rhodamine-labeled actin), 0.5 ⁇ l of GST-WA particles and 1.5 ⁇ l of PBS (A ), or 1.5 ⁇ l of GST-WA protein at 1 mg / ml (B) or 1.5 ⁇ l of GST-PRO protein (PRO corresponding to the fragment delimited by the amino acids located at positions 235 to 584 of the ActA protein Listeria monocytogenes) at 1 mg / ml (C). 6 ⁇ l of the final mixture of these three solutions are sealed between slide and coverslip.
  • the present invention provides an in vitro test for testing the polymerization of actin on the surface of beads, and shows that this system reproduces the essential characteristics of the polymerization of actin in human cells.
  • these beads recruit proteins important for the polymerization of actin in cells, such as the Arp2 / 3 complex and cofilin.
  • components recruited from the surface of the beads are targets for signaling pathways involving tyrosine kinases. Thanks to this in vitro system, it is now possible to study the conditions necessary for the polymerization of actin in the cell, a process which until now was not accessible to direct experimental manipulation. a) Method for screening anti-metastatic components
  • the bead system described here relies on human proteins which are necessary for the polymerization of actin in human cells. However, these proteins are kept during evolution, from yeast to humans, including amoebas. Despite the conservation of their basic function, these proteins also exhibit divergences in their primary sequence, suggesting significant functional differences. Analogous to metastatic cancers, the actin cytoskeleton of parasites is rarely the target of drugs used in the treatment of parasitoses, despite the important role it plays during the infectious cycle of many parasites (amoebae for example). It is conceivable that drugs which affect the human actin cytoskeleton only when used in high concentrations, affect that of parasites at much lower concentrations. This is why, thanks to the universal nature of the evolution of the actin cytoskeleton, the bead system of the present invention also makes it possible to search for drugs which can be used in the treatment of parasitoses. c) Detection of drug side effects
  • the beads are used to check and confirm that drugs have no side effects on the polymerization of cellular actin.
  • drugs have no side effects on the polymerization of cellular actin.
  • the most effective screening tests for testing new drugs have the following properties: they are simple, inexpensive and rapid.
  • the polymerization test of cellular actin of the present invention has all of these characteristics. 200-500nm beads can be produced by absorbing the purified recombinant protein GST-WH2 / A on their surface. Once prepared, the beads are stable for several months at 4 ° C. The beads are then added to extracts prepared from supernatants of lysed culture cells. The volume of extract necessary for an experiment is of the order of a few microliters, reducing the cost of the experiment. These extracts have the advantage of being able to be produced in large quantities and stored in the long term, at -80 ° C.
  • a fluorescent actin derivative (commercial actin-rhodamine) is added to the extract in order to visualize the polymerization of actin by epifluorescence microscopy. Actin polymerization is observed 15 min after the addition of the beads, resulting in an accumulation of fluorescent actin around the beads.
  • the experiment takes less than 30 min and one person is able to process several samples in parallel. This procedure can be automated, allowing rapid screening of a large number of samples.
  • the inventors have shown that the small amounts of solvents used to dissolve these products (water, ethanol, dimethylsulphoxide) do not disturb the system of the invention.
  • this screening test has been validated by showing that it is sensitive to currently known drugs for inhibiting the polymerization of actin, such as latrunculin and cytochalasin D.

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Abstract

La présente invention a pour objet des fragments peptidiques de protéines de la famille WASP, ou les peptides dérivés de ces fragments, ainsi que leurs utilisations notamment pour la préparation de réactifs utilisables dans le cadre de la mise en oeuvre d'un procédé de détection ou de criblage de molécules ayant un effet d'inhibition ou de stimulation de la formation du cytosquelette d'actine, et donc un effet d'inhibition ou de stimulation de la motilité cellulaire.

Description

FRAGMENTS DE PROTEINES DE LA FAMILLE WASP, ET LEURS UTILISATIONS
La présente invention a pour objet des fragments peptidiques de protéines de la famille WASP, ou les peptides dérivés de ces fragments, ainsi que leurs utilisations notamment dans le cadre de procédés de détection de molécules ayant un effet sur la mobilité cellulaire.
Les cellules de notre corps sont capables de se déplacer et, parfois, elles s'arrondissent et se divisent en deux cellules sœur. Tous ces mouvements sont basés sur le cytosquelette d'actine. A un stade multicellulaire, le cytosquelette joue un rôle essentiel pour l'organisation du corps et pour l'homéostasie. Par exemple, la migration cellulaire est essentielle dans l'embryogenèse et la réponse immunitaire ainsi que lors de la réparation de blessures où les cellules migrent vers les régions endommagées. Ces mouvements sont dépendants du fonctionnement normal du cytosquelette d'actine. Les conséquences de la perturbation du fonctionnement du cytosquelette peuvent être désastreuses pour l'organisme. Dans les processus métastatiques, par exemple, l'absence de contrôle du cytosquelette des cellules tumorales peut provoquer leur migration en dehors de leur localisation normale, leur permettant de proliférer dans d'autres parties du corps, ce qui rend le traitement du cancer extrêmement difficile.
La caractérisation des protéines capables de polymériser l'actine, et la compréhension du mécanisme par lequel cette polymérisation génère une force, représentent les éléments clés pour comprendre le fonctionnement du cytosquelette dans la cellule. Toutefois, les propriétés dynamiques du cytosquelette rendent son étude extrêmement difficile. De plus, les approches actuellement disponibles pour analyser le cytosquelette sont compliquées ou fastidieuses.
La première étape de tous les processus dépendants du cytosquelette, tel que le mouvement, est la production de filaments d'actine, ou F-actine. Le mécanisme de la formation de ces polymères biologiques dans la cellule n'est toujours pas connu, malgré l'identification de nombreuses protéines liant l'actine et l'étude extensive de la polymérisation de l'actine in vitro.
Le syndrome de Wiskott-Aldrich est une maladie du cytosquelette. La protéine WASP humaine, exprimée à partir du gène WAS qui est muté chez les patients affectés par ce syndrome, de même que le protéine N-WASP d'origine bovine (qui a environ 45% d'identité de séquence avec la protéine WASP humaine), ont donc fait l'objet d'études dans le but d'éclaircir le mécanisme du fonctionnement du cytosquelette dans la cellule (Yarar et al., Current Biology, 9 : 555 - 558 (1999); Rohatgi et al., Cell, 97 : 221 - 231 (1999); Miki et al, The EMBO Journal, 15(19) : 5326 - 5335 (1996)).
Ces protéines WASP et N-WASP sont composées de domaines peptidiques ayant des propriétés fonctionnelles identifiables dans des essais biochimiques. Ainsi, ces deux protéines possèdent principalement les domaines suivants :
- un domaine d'homologie avec la plekstrine qui se lie au phosphatidylinositol (4,5) biphosphate, ce dernier se liant lui même à des protéines intervenant dans la formation de filaments d'actine,
- un domaine de liaison à Cdc42, une protéine à activité GTPase induisant la polymérisation de l'actine, et par conséquent régulant le cytosquelette,
- une région riche en proline, - un domaine d'homologie avec la verproline, une protéine se liant également à des protéines intervenant dans la formation de filaments d'actine, ce domaine comprenant une séquence homologue à la verproline dans le cas de la WASP humaine, et deux séquences homologues à la verproline dans le cas de la N-WASP,
- un domaine d'homologie avec la cofiline, une protéine de liaison à l'actine ayant une activité de dépolymérisation de l'actine dépendante du pH,
- un segment acide C-terminal.
De plus, il a été montré que ces protéines WASP et N-WASP interagissent avec le complexe Arp2/3 (complexe protéique impliqué dans la polymérisation de l'actine), et induisent ainsi la polymérisation de l'actine. A ce titre, il a été démontré que la protéine WASP est suffisante pour agir sur la motilité cellulaire basée sur l'actine, et que cette fonction est sous la dépendance du complexe Arp2/3 (Yarar et al. 1999 susmentionné). Pour effectuer cette démonstration, les auteurs de cet article ont préparé des microsphères recouvertes de protéine WASP et ont démontré que ces microsphères polymérisent l'actine, forment des queues d'actine, et sont douées d'une motilité basée sur l'actine dans des extraits cellulaires. Dans les extraits cellulaires dans lesquels le complexe Arp2/3 a été supprimé, les microsphères recouvertes de protéine WASP n'ont plus de motilité et possèdent seulement une activité résiduelle de polymérisation de l'actine. S'agissant de la protéine N-WASP, il a été démontré que la partie C-terminale de N- WASP, à savoir le fragment C-terminal de 114 acides aminés comprenant le domaine d'homologie avec la verproline (région V contenant les deux séquences homologues à la verproline), le domaine d'homologie avec la cofiline (région C), et le segment acide C- terminal (région A), ou fragment VCA, se lie au complexe Arp2/3 et stimule fortement la capacité de ce dernier de nucléer la polymérisation de l'actine (Rohatgi et al. 1999 susmentionné).
Selon des études récentes, les protéines WASP et N-WASP entières seraient requises pour la motilité cellulaire dépendante de l'actine, dans la mesure où non seulement la partie C-terminale de ces protéines interagit avec l'actine, mais également la partie N-terminale qui maintient le filament d'actine en cours de formation à proximité de la surface cellulaire (Loisel et al., Nature, 401 : 613-616 (1999); Egile et al., The Journal of Cell Biology, 145 : 1319-1332 (1999)).
La présente invention découle de la mise en évidence par les Inventeurs du fait que, contrairement à ce que pouvait le laisser supposer l'état de la technique décrit ci-dessus, les fragments de ces protéines WASP et N-WASP sont suffisants pour induire une polymérisation de l'actine telle qu'elle permette le déplacement de supports auxquels sont liés lesdits f agments dans des extraits cellulaires.
La présente invention a pour but de fournir de nouveaux fragments, ou polypeptides dérivés, des protéines WASP et N-WASP, ainsi que les séquences nucléotidiques codant pour ces fragments.
L'invention a également pour but de fournir de nouveaux procédés de détection ou de criblage de molécules ayant un effet sur la formation du cytosquelette, notamment de molécules cytotoxiques ou de médicaments utilisables dans le cadre du traitement de pathologies liées à un développement anormal du cytosquelette.
L'invention a également pour but de fournir de nouveaux réactifs et kits pour la mise en oeuvre des procédés susmentionnés.
La présente invention a pour objet l'utilisation :
- de fragments peptidiques de protéines de la famille WASP chez les cellules eucaryotes, notamment les cellules humaines ou d'autres mammifères, ou les cellules d'insectes, ou de micro-organismes telles que les levures, lesdits fragments peptidiques ayant la propriété des protéines de la famille WASP de polymériser l'actine en induisant la motilité cellulaire, - ou de séquences peptidiques dérivées des fragments peptidiques susmentionnés de protéines de la famille WASP, notamment par substitution d'un ou plusieurs acides aminés de ces fragments, lesdites séquences dérivées ayant la propriété susmentionnée des protéines de la famille WASP et desdits fragments de ces dernières, pour la préparation de réactifs utilisables dans le cadre de la mise en œuvre d'un procédé de détection ou de criblage de molécules ayant un effet d'inhibition ou de stimulation de la formation du cytosquelette d'actine, et donc un effet d'inhibition ou de stimulation de la motilité cellulaire.
Par propriété de polymérisation de l'actine en induisant la motilité cellulaire, on entend dans ce qui précède et ce qui suit la propriété des protéines de la famille WASP, ou des fragments ou séquences dérivées de ces derniers de polymériser l'actine en induisant le déplacement de cellules de l'organisme, ou de supports appropriés, telles que les microsphères décrites ci-après, in vivo ou in vitro.
L'invention a également pour objet l'utilisation des fragments peptidiques ou des séquences dérivées susmentionnés, dans le cadre de la mise en œuvre d'un procédé de détection ou de criblage de molécules susceptibles de pouvoir être utilisées en tant que médicaments dans le traitement de pathologies liées à un dysfonctionnement du processus de polymérisation de l'actine dans le cadre de la formation du cytosquelette d'actine.
L'invention a plus particulièrement pour objet l'utilisation des fragments peptidiques ou des séquences dérivées susmentionnés, dans le cadre de la mise en œuvre d'un procédé de détection ou de criblage de molécules ayant un effet d'inhibition de la formation du cytosquelette d'actine, et donc un effet d'inhibition de la motilité cellulaire, lesdites molécules étant susceptibles d'être utilisées :
- en tant que médicaments dans le traitement de cancers métastatiques, - ou en tant qu'antibiotiques anti-parasitaires.
L'invention a plus particulièrement pour objet l'utilisation des fragments peptidiques ou des séquences dérivées susmentionnés, dans le cadre de la mise en œuvre d'un procédé de détection d'effets secondaires de molécules, notamment de médicaments ou de molécules de l'environnement, à savoir d'un procédé de détection de molécules susceptibles d'avoir un effet cytotoxique correspondant à une inhibition ou une stimulation de la formation du cytosquelette d'actine. Par protéines de la famille WASP, on entend, dans ce qui précède et ce qui suit, la protéine produite par le gène WAS muté dans le cadre du syndrome de Wiskott-Aldrich chez l'homme, ainsi que les protéines d'origine humaine ou non, présentant au moins environ 45% d'homologie avec la protéine WASP humaine susmentionnée, et étant impliquée dans le processus de polymérisation de l'actine cellulaire, et, le cas échéant, de la motilité cellulaire.
Les protéines susmentionnées de la famille WASP possèdent également la caractéristique commune de posséder au moins trois domaines majeurs :
- un domaine WHl/Scar dans la partie N-terminale ; ce domaine a des caractéristiques structurales similaires à un domaine d'homologie à la pleckstrine (ou domaine pH), et est supposé interagir avec l'actine polymérisée et avec les phospholipides, -un domaine riche en prolines,
- un domaine WH2/A qui est divisé en trois sous-domaines, à savoir le sous-domaine d'homologie à la verproline, le sous-domaine d'homologie à la cofiline, et le sous-domaine acide susmentionnés.
Avantageusement, les fragments peptidiques utilisés dans le cadre de la présente invention sont choisis parmi les fragments des protéines WASP, N-WASP, Scar et Las, ou les séquences peptidiques dérivées des fragments peptidiques susmentionnés telles que définies ci-dessus. L'invention a plus particulièrement pour objet l'utilisation susmentionnée, de fragments peptidiques choisis parmi les fragments :
- de la protéine WASP humaine, ou d'autres mammifères, notamment la protéine WASP bovine ou murine,
- de la protéine N-WASP humaine, ou d'autres mammifères, notamment la protéine N-WASP bovine, ou de rat,
- des protéines de la sous-famille Scar, telle que la protéine Scar 1 /WAVE de Dictyostellium discoidewn, ou de Caenorhabditis elegans, ou de Drosophila melanogaster, de souris, ou humaine,
- des protéines de la sous-famille Las des micro-organismes, notamment des levures, telle que la protéine Lasl7/Beel de Saccharomyces cerevisiae, ou la protéine homologue
WASP (Wsplp) de Schizosaccharomyces ponibe. Avantageusement, les fragments peptidiques susmentionnés sont choisis parmi ceux comprenant :
- le domaine d'homologie avec la verproline contenu dans les protéines de la famille WASP, ou dans une protéine dérivée de ces dernières, ou au moins une des deux séquences homologues à la verproline lorsque lesdites protéines de la famille WASP contiennent deux de ces séquences, ou une séquence peptidique dérivée du domaine susmentionné, notamment par substitution, addition ou suppression d'un ou plusieurs acides aminés, et conservant la propriété de ce domaine de se lier à l'actine,
- et le domaine d'homologie avec la cofiline contenu dans les protéines de la famille WASP ou dans une protéine dérivée de ces dernières, ou une séquence peptidique dérivée du domaine susmentionné, notamment par substitution, addition ou suppression d'un ou plusieurs acides aminés, et conservant la propriété de ce domaine d'intervenir dans le cadre de la polymérisation de l'actine.
Le cas échéant, les fragments peptidiques susmentionnés utilisés dans le cadre de la présente invention, contiennent également le segment acide C-terminal desdites protéines
WASP ou dérivées.
Avantageusement les fragments peptidiques susmentionnés ne contiennent pas le domaine d'homologie avec la plekstrine, et/ou le domaine de liaison à Cdc42, et/ou la région riche en proline, définis ci-dessus desdites protéines de la famille WASP. L'invention a plus particulièrement pour objet l'utilisation susmentionnée de fragments peptidiques des protéines de la famille WASP d'origine humaine.
Avantageusement, les fragments peptidiques des protéines de la famille WASP d'origine humaine utilisés sont choisis parmi les fragments de la protéine WASP humaine comprenant : . le domaine d'homologie avec la verproline délimité par les acides aminés situés aux positions 430 et 446 de la séquence peptidique SEQ ID NO 2 de la protéine
WASP humaine représentée sur la figure 1 , ou une séquence peptidique dérivée du domaine susmentionné telle que définie ci-dessus,
. et le domaine d'homologie avec la cofiline délimité par les acides aminés situés aux positions 469 et 487 de la séquence peptidique SEQ ID NO 2 de la protéine
WASP humaine représentée sur la figure 1, ou une séquence peptidique dérivée du domaine susmentionné telle que définie ci-dessus. De préférence, les fragments de la protéine WASP humaine utilisés susmentionnés sont choisis parmi les suivants :
* les fragments dont l'acide aminé N-terminal correspond à celui situé à l'une des positions 404 à 430 de la figure 1, et l'acide aminé C-terminal correspond à celui situé à l'une des positions 487 à 502 de la figure 1,
* le fragment de 99 acides aminés délimité par les acides aminés situés aux positions 404 et 502 de la figure 1, à savoir le peptide SEQ ID NO 4 suivant :
Pro Ser Ser Gly Asn Gly Pro Ala Pro Pro Pro Leu Pro Pro Ala Leu
Val Pro Ala Gly Gly Leu Ala Pro Gly Gly Gly Arg Gly Ala Leu Leu Asp Gin Ile Arg Gin Gly Ile Gin Leu Asn Lys Thr Pro Gly Ala Pro
Glu Ser Ser Ala Leu Gin Pro Pro Pro Gin Ser Ser Glu Gly Leu Val
Gly Ala Leu Met His Val Met Gin Lys Arg Ser Arg Ala Ile His Ser
Ser Asp Glu Gly Glu Asp Gin Ala Gly Asp Glu Asp Glu Asp Asp Glu
Trp Asp Asp * le fragment de 84 acides aminés délimité par les acides aminés situés aux positions 404 et 487 de la figure 1, à savoir le peptide SEQ ID NO 6 suivant :
Pro Ser Ser Gly Asn Gly Pro Ala Pro Pro Pro Leu Pro Pro Ala Leu
Val Pro Ala Gly Gly Leu Ala Pro Gly Gly Gly Arg Gly Ala Leu Leu
Asp Gin Ile Arg Gin Gly Ile Gin Leu Asn Lys Thr Pro Gly Ala Pro Glu Ser Ser Ala Leu Gin Pro Pro Pro Gin Ser Ser Glu Gly Leu Val
Gly Ala Leu Met His Val Met Gin Lys Arg Ser Arg Ala Ile His Ser
Ser Asp Glu Gly
* le fragment de 73 acides aminés délimité par les acides aminés situés aux positions 430 et 502 de la figure 1, à savoir le peptide SEQ ID NO 8 suivant : Gly Arg Gly Ala Leu Leu Asp Gin Ile Arg Gin Gly Ile Gin Leu Asn
Lys Thr Pro Gly Ala Pro Glu Ser Ser Ala Leu Gin Pro Pro Pro Gin
Ser Ser Glu Gly Leu Val Gly Ala Leu Met His Val Met Gin Lys Arg
Ser Arg Ala Ile His Ser Ser Asp Glu Gly Glu Asp Gin Ala Gly Asp
Glu Asp Glu Asp Asp Glu Trp Asp Asp * le fragment de 58 acides aminés délimité par les acides aminés situés aux positions 430 et 487 de la figure 1, à savoir le peptide SEQ ID NO 10 suivant :
Gly Arg Gly Ala Leu Leu Asp Gin Ile Arg Gin Gly Ile Gin Leu Asn Lys Thr Pro Gly Ala Pro Glu Ser Ser Ala Leu Gin Pro Pro Pro Gin Ser Ser Glu Gly Leu Val Gly Ala Leu Met His Val Met Gin Lys Arg Ser Arg Ala Ile His Ser Ser Asp Glu Gly
* ou les séquences peptidiques dérivées des fragments peptidiques susmentionnés, notamment par substitution, addition ou suppression d'un ou plusieurs acides aminés de ces fragments, lesdites séquences dérivées ayant la propriété définies ci- dessus des protéines de la famille WASP et desdits fragments de ces dernières. Avantageusement, les fragments peptidiques des protéines de la famille WASP d'origine humaine utlisés sont choisis parmi les fragments de la protéine N-WASP humaine comprenant : . la séquence homologue à la verproline délimitée par les acides aminés situés aux positions 405 et 421 de la séquence peptidique SEQ ID NO 12 de la protéine N- WASP humaine représentée sur la figure 2, ou une séquence peptidique dérivée du domaine susmentionné telle que définie ci-dessus, . et/ou la séquence homologue à la verproline délimitée par les acides aminés situés aux positions 433 et 449 de la séquence peptidique SEQ ID NO 12 de la protéine N-WASP humaine représentée sur la figure 2, ou une séquence peptidique dérivée du domaine susmentionné telle que définie ci-dessus,
. et le domaine d'homologie avec la cofiline contenu dans la protéine N- WASP susmentionnée, à savoir le domaine délimité par les acides aminés situés aux positions 470 et 488 de la séquence peptidique SEQ ID NO 12 de la protéine N-WASP humaine représentée sur la figure 2, ou une séquence peptidique dérivée du domaine susmentionné telle que définie ci-dessus.
De préférence, les fragments de la protéine N-WASP humaine utilisés susmentionnés sont choisis parmi les suivants :
* les fragments dont l'acide aminé N-terminal correspond à celui situé à l'une des positions 392 à 433 de la figure 2, et l'acide aminé C-terminal correspond à celui situé à l'une des positions 488 à 505 de la figure 2,
* le fragment de 114 acides aminés délimité par les acides aminés situés aux positions 392 et 505 de la figure 2, à savoir le peptide SEQ ID NO 14 suivant :
Pro Ser Asp Gly Asp His Gin Val Pro Thr Thr Ala Gly Asn Lys Ala
Ala Leu Leu Asp Gin Ile Arg Glu Gly Ala Gin Leu Lys Lys Val Glu
Gin Asn Ser Arg Pro Val Ser Cys Ser Gly Arg Asp Ala Leu Leu Asp
Gin Ile Arg Gin Gly Ile Gin Leu Lys Ser Val Ala Asp Gly Gin Glu Ser Thr Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ser Gly Ile Val Gly Ala Leu
Met Glu Val Met Gin Lys Arg Ser Lys Ala Ile His Ser Ser Asp Glu
Asp Glu Asp Glu Asp Asp Glu Glu Asp Phe Glu Asp Asp Asp Glu Trp
Glu Asp
* le fragment de 97 acides aminés délimité par les acides aminés situés aux positions 392 et 488 de la figure 2, à savoir le peptide SEQ ID NO 16 suivant :
Pro Ser Asp Gly Asp His Gin Val Pro Thr Thr Ala Gly Asn Lys Ala Ala Leu Leu Asp Gin Ile Arg Glu Gly Ala Gin Leu Lys Lys Val Glu Gin Asn Ser Arg Pro Val Ser Cys Ser Gly Arg Asp Ala Leu Leu Asp Gin Ile Arg Gin Gly Ile Gin Leu Lys Ser Val Ala Asp Gly Gin Glu Ser Thr Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ser Gly Ile Val Gly Ala Leu Met Glu Val Met Gin Lys Arg Ser Lys Ala Ile His Ser Ser Asp Glu Asp * le fragment de 101 acides aminés délimité par les acides aminés situés aux positions 405 et 505 de la figure 2, à savoir le peptide SEQ ID NO 18 suivant :
Asn Lys Ala Ala Leu Leu Asp Gin Ile Arg Glu Gly Ala Gin Leu Lys
Lys Val Glu Gin Asn Ser Arg Pro Val Ser Cys Ser Gly Arg Asp Ala Leu Leu Asp Gin Ile Arg Gin Gly Ile Gin Leu Lys Ser Val Ala Asp
Gly Gin Glu Ser Thr Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ser Gly Ile Val
Gly Ala Leu Met Glu Val Met Gin Lys Arg Ser Lys Ala Ile His Ser
Ser Asp Glu Asp Glu Asp Glu Asp Asp Glu Glu Asp Phe Glu Asp Asp
Asp Glu Trp Glu Asp * le fragment de 84 acides aminés délimité par les acides aminés situés aux positions 405 et 488 de la figure 2, à savoir le peptide SEQ ID NO 20 suivant :
Asn Lys Ala Ala Leu Leu Asp Gin Ile Arg Glu Gly Ala Gin Leu Lys
Lys Val Glu Gin Asn Ser Arg Pro Val Ser Cys Ser Gly Arg Asp Ala
Leu Leu Asp Gin Ile Arg Gin Gly Ile Gin Leu Lys Ser Val Ala Asp Gly Gin Glu Ser Thr Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ser Gly Ile Val
Gly Ala Leu Met Glu Val Met Gin Lys Arg Ser Lys Ala Ile His Ser
Ser Asp Glu Asp
* le fragment de 73 acides aminés délimité par les acides aminés situés aux positions 433 et 505 de la figure 2, à savoir le peptide SEQ ID NO 22 suivant : Gly Arg Asp Ala Leu Leu Asp Gin Ile Arg Gin Gly Ile Gin Leu Lys
Ser Val Ala Asp Gly Gin Glu Ser Thr Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr
Ser Gly Ile Val Gly Ala Leu Met Glu Val Met Gin Lys Arg Ser Lys
Ala Ile His Ser Ser Asp Glu Asp Glu Asp Glu Asp Asp Glu Glu Asp
Phe Glu Asp Asp Asp Glu Trp Glu Asp * le fragment de 56 acides aminés délimité par les acides aminés situés aux positions 433 et 488 de la figure 2, à savoir le peptide SEQ ID NO 24 suivant :
Gly Arg Asp Ala Leu Leu Asp Gin Ile Arg Gin Gly Ile Gin Leu Lys Ser Val Ala Asp Gly Gin Glu Ser Thr Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ser Gly Ile Val Gly Ala Leu Met Glu Val Met Gin Lys Arg Ser Lys Ala Ile His Ser Ser Asp Glu Asp
* ou les séquences peptidiques dérivées des fragments peptidiques susmentionnés, notamment par substitution, addition ou suppression d'un ou plusieurs acides aminés de ces fragments, lesdites séquences dérivées ayant la propriété définies ci- dessus des protéines de la famille WASP et desdits fragments de ces dernières. Avantageusement, les fragments peptidiques des protéines de la famille WASP d'origine humaine utilisés sont choisis parmi les fragments de la protéine Scarl humaine comprenant :
. le domaine d'homologie avec la verproline délimité par les acides aminés situés aux positions 497 et 513 de la séquence peptidique SEQ ID NO 26 de la protéine Scarl humaine représentée sur la figure 3, ou une séquence peptidique dérivée du domaine susmentionné telle que définie ci-dessus, . et le domaine d'homologie avec la cofiline délimité par les acides aminés situés aux positions 531 et 546 de la séquence peptidique SEQ ID NO 26 de la protéine Scarl humaine représentée sur la figure 3, ou une séquence peptidique dérivée du domaine susmentionné telle que définie ci-dessus. De préférence, les fragments de la protéine Scarl humaine utilisés susmentionnés sont choisis parmi les suivants :
* les fragments dont l'acide aminé N-terminal correspond à celui situé à l'une des positions 443 à 497 de la figure 3, et l'acide aminé C-terminal correspond à celui situé à l'une des positions 546 à 559 de la figure 3, * le fragment de 117 acides aminés délimité par les acides aminés situés aux positions 443 et 559 de la figure 3, à savoir le peptide SEQ ID NO 28 suivant :
Val Thr Val Thr Ala Leu Ala His Pro Pro Ser Gly Leu His Pro Thr
Pro Ser Thr Ala Pro Gly Pro His Val Pro Leu Met Pro Pro Ser Pro
Pro Ser Gin Val Ile Pro Ala Ser Glu Pro Lys Arg His Pro Ser Thr Leu Pro Val Ile Ser Asp Ala Arg Ser Val Leu Leu Glu Ala Ile Arg
Lys Gly Ile Gin Leu Arg Lys Val Glu Glu Gin Arg Glu Gin Glu Ala
Lys His Glu Arg Ile Glu Asn Asp Val Ala Thr Ile Leu Ser Arg Arg
Ile Ala Val Glu Tyr Ser Asp Ser Glu Asp Asp Ser Glu Phe Asp Glu Val Asp Trp Leu Glu * le fragment de 104 acides aminés délimité par les acides aminés situés aux positions 443 et 546 de la figure 3, à savoir le peptide SEQ ID NO 30 suivant :
Val Thr Val Thr Ala Leu Ala His Pro Pro Ser Gly Leu His Pro Thr
Pro Ser Thr Ala Pro Gly Pro His Val Pro Leu Met Pro Pro Ser Pro
Pro Ser Gin Val Ile Pro Ala Ser Glu Pro Lys Arg His Pro Ser Thr Leu Pro Val Ile Ser Asp Ala Arg Ser Val Leu Leu Glu Ala Ile Arg
Lys Gly Ile Gin Leu Arg Lys Val Glu Glu Gin Arg Glu Gin Glu Ala
Lys His Glu Arg Ile Glu Asn Asp Val Ala Thr Ile Leu Ser Arg Arg Ile Ala Val Glu Tyr Ser Asp Ser
* le fragment de 63 acides aminés délimité par les acides aminés situés aux positions 497 et 559 de la figure 3, à savoir le peptide SEQ ID NO 32 suivant :
Ala Arg Ser Val Leu Leu Glu Ala Ile Arg Lys Gly Ile Gin Leu Arg
Lys Val Glu Glu Gin Arg Glu Gin Glu Ala Lys His Glu Arg Ile Glu
Asn Asp Val Ala Thr Ile Leu Ser Arg Arg Ile Ala Val Glu Tyr Ser
Asp Ser Glu Asp Asp Ser Glu Phe Asp Glu Val Asp Trp Leu Glu * le fragment de 50 acides aminés délimité par les acides aminés situés aux positions 497 et 546 de la figure 3, à savoir le peptide SEQ ID NO 34 suivant :
Ala Arg Ser Val Leu Leu Glu Ala Ile Arg Lys Gly Ile Gin Leu Arg
Lys Val Glu Glu Gin Arg Glu Gin Glu Ala Lys His Glu Arg Ile Glu
Asn Asp Val Ala Thr Ile Leu Ser Arg Arg Ile Ala Val Glu Tyr Ser Asp Ser
* ou les séquences peptidiques dérivées des fragments peptidiques susmentionnés, notamment par substitution, addition ou suppression d'un ou plusieurs acides aminés de ces fragments, lesdites séquences dérivées ayant la propriété définies ci- dessus des protéines de la famille WASP et desdits fragments de ces dernières.
L'invention a plus particulièrement pour objet l'utilisation susmentionnée de fragments peptidiques des protéines de la famille WASP d'origine non humaine. Avantageusement, les fragments peptidiques des protéines de la famille WASP d'origine non humaine utilisés sont choisis parmi :
• les fragments des protéines de la famille WASP de mammifères non humains, tels que :
- les fragment de la protéine WASP murine, eux-mêmes choisis parmi :
* ceux comprenant : . le domaine d'homologie avec la verproline délimité par les acides aminés situés aux positions 448 et 465 de la séquence peptidique SEQ ID NO 36 de la protéine WASP murine représentée sur la figure 4, ou une séquence peptidique dérivée du domaine susmentionné telle que définie ci-dessus,
. et le domaine d'homologie avec la cofiline délimité par les acides aminés situés aux positions 487 et 505 de la séquence peptidique SEQ ID NO 36 de la protéine
WASP murine représentée sur la figure 4, ou une séquence peptidique dérivée du domaine susmentionné telle que définie ci-dessus,
* les fragments dont l'acide aminé N-terminal correspond à celui situé à l'une des positions 420 à 448 de la figure 4, et l'acide aminé C-terminal correspond à celui situé à l'une des positions 505 à 520 de la figure 4,
* le fragment de 101 acides aminés délimité par les acides aminés situés aux positions 420 et 520 de la figure 4, à savoir le peptide SEQ ID NO 38 suivant :
Pro Pro Pro Cys Pro Gly Ser Gly Pro Ala Pro Pro Pro Leu Pro Pro
Thr Pro Val Ser Gly Gly Ser Pro Ala Pro Gly Gly Gly Arg Gly Ala Leu Leu Asp Gin Ile Arg Gin Gly Ile Gin Leu Asn Lys Thr Pro Gly
Ala Leu Glu Asn Ser Val Gin Gin Pro Pro Ala Gin Gin Ser Glu Gly
Leu Val Gly Ala Leu Met His Val Met Gin Lys Arg Ser Arg Val Ile
His Ser Ser Asp Glu Gly Glu Asp Gin Thr Gly Glu Asp Glu Glu Asp
Asp Glu Trp Asp Asp * le fragment de 86 acides aminés délimité par les acides aminés situés aux positions 420 et 505 de la figure 4, à savoir le peptide SEQ ID NO 40 suivant :
Pro Pro Pro Cys Pro Gly Ser Gly Pro Ala Pro Pro Pro Leu Pro Pro
Thr Pro Val Ser Gly Gly Ser Pro Ala Pro Gly Gly Gly Arg Gly Ala
Leu Leu Asp Gin Ile Arg Gin Gly Ile Gin Leu Asn Lys Thr Pro Gly Ala Leu Glu Asn Ser Val Gin Gin Pro Pro Ala Gin Gin Ser Glu Gly
Leu Val Gly Ala Leu Met His Val Met Gin Lys Arg Ser Arg Val Ile
His Ser Ser Asp Glu Gly * le fragment de 73 acides aminés délimité par les acides aminés situés aux positions 448 et 520 de la figure 4, à savoir le peptide SEQ ID NO 42 suivant :
Gly Arg Gly Ala Leu Leu Asp Gin Ile Arg Gin Gly Ile Gin Leu Asn Lys Thr Pro Gly Ala Leu Glu Asn Ser Val Gin Gin Pro Pro Ala Gin Gin Ser Glu Gly Leu Val Gly Ala Leu Met His Val Met Gin Lys Arg Ser Arg Val Ile His Ser Ser Asp Glu Gly Glu Asp Gin Thr Gly Glu Asp Glu Glu Asp Asp Glu Trp Asp Asp
* le fragment de 58 acides aminés délimité par les acides aminés situés aux positions 448 et 505 de la figure 4, à savoir le peptide SEQ ID NO 44 suivant : Gly Arg Gly Ala Leu Leu Asp Gin Ile Arg Gin Gly Ile Gin Leu Asn
Lys Thr Pro Gly Ala Leu Glu Asn Ser Val Gin Gin Pro Pro Ala Gin Gin Ser Glu Gly Leu Val Gly Ala Leu Met His Val Met Gin Lys Arg Ser Arg Val Ile His Ser Ser Asp Glu Gly
- les fragment de la protéine N-WASP de rat, eux-mêmes choisis parmi : * ceux comprenant :
. la séquence homologue à la verproline délimitée par les acides aminés situés aux positions 401 et 417 de la séquence peptidique SEQ ID NO 46 de la protéine N-WASP de rat représentée sur la figure 5, ou une séquence peptidique dérivée du domaine susmentionné telle que définie ci-dessus, . et/ou la séquence homologue à la verproline délimitée par les acides aminés situés aux positions 429 et 444 de la séquence peptidique SEQ ID NO 46 de la protéine N-WASP de rat représentée sur la figure 5, ou une séquence peptidique dérivée du domaine susmentionné telle que définie ci-dessus,
. et le domaine d'homologie avec la cofiline contenu dans la protéine N- WASP susmentionnée, à savoir le domaine délimité par les acides aminés situés aux positions 466 et 484 de la séquence peptidique SEQ ID NO 46 de la protéine N-WASP de rat représentée sur la figure 5, ou une séquence peptidique dérivée du domaine susmentionné telle que définie ci-dessus,
* les fragments dont l'acide aminé N-terminal correspond à celui situé à l'une des positions 401 à 429 de la figure 5, et l'acide aminé C-terminal correspond à celui situé à l'une des positions 484 à 501 de la figure 5,
* le fragment de 101 acides aminés délimité par les acides aminés situés aux positions 401 et 501 de la figure 5, à savoir le peptide SEQ ID NO 48 suivant :
Asn Lys Ala Ala Leu Leu Asp Gin Ile Arg Glu Gly Ala Gin Leu Lys Lys Val Glu Gin Asn Ser Arg Pro Val Ser Cys Ser Gly Arg Asp Ala
Leu Leu Asp Gin Ile Arg Gin Gly Ile Gin Leu Lys Ser Val Ser Asp
Gly Gin Glu Ser Thr Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ser Gly Ile Val
Gly Ala Leu Met Glu Val Met Gin Lys Arg Ser Lys Ala Ile His Ser Ser Asp Glu Asp Glu Asp Asp Asp Asp Glu Glu Asp Phe Gin Asp Asp Asp Glu Trp Glu Asp
* le fragment de 84 acides aminés délimité par les acides aminés situés aux positions 401 et 484 de la figure 5, à savoir le peptide SEQ ID NO 50 suivant : Asn Lys Ala Ala Leu Leu Asp Gin Ile Arg Glu Gly Ala Gin Leu Lys
Lys Val Glu Gin Asn Ser Arg Pro Val Ser Cys Ser Gly Arg Asp Ala
Leu Leu Asp Gin Ile Arg Gin Gly Ile Gin Leu Lys Ser Val Ser Asp
Gly Gin Glu Ser Thr Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ser Gly Ile Val
Gly Ala Leu Met Glu Val Met Gin Lys Arg Ser Lys Ala Ile His Ser Ser Asp Glu Asp
* le fragment de 73 acides aminés délimité par les acides aminés situés aux positions 429 et 501 de la figure 5, à savoir le peptide SEQ ID NO 52 suivant :
Gly Arg Asp Ala Leu Leu Asp Gin Ile Arg Gin Gly Ile Gin Leu Lys Ser Val Ser Asp Gly Gin Glu Ser Thr Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ser Gly Ile Val Gly Ala Leu Met Glu Val Met Gin Lys Arg Ser Lys Ala Ile His Ser Ser Asp Glu Asp Glu Asp Asp Asp Asp Glu Glu Asp Phe Gin Asp Asp Asp Glu Trp Glu Asp
* le fragment de 56 acides aminés délimité par les acides aminés situés aux positions 429 et 484 de la figure 5, à savoir le peptide SEQ ID NO 54 suivant : Gly Arg Asp Ala Leu Leu Asp Gin Ile Arg Gin Gly Ile Gin Leu Lys
Ser Val Ser Asp Gly Gin Glu Ser Thr Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ser Gly Ile Val Gly Ala Leu Met Glu Val Met Gin Lys Arg Ser Lys Ala Ile His Ser Ser Asp Glu Asp
- les fragment de la protéine N-WASP bovine, eux-mêmes choisis parmi : * ceux comprenant :
. le domaine d'homologie avec la verproline délimité par les acides aminés situés aux positions 405 et 421 de la séquence peptidique SEQ ID NO 56 de la protéine
N-WASP bovine représentée sur la figure 6, ou une séquence peptidique dérivée du domaine susmentionné telle que définie ci-dessus, . et/ou le domaine d'homologie avec la verproline délimité par les acides aminés situés aux positions 433 et 488 de la séquence peptidique SEQ ID NO 56 de la protéine N-WASP bovine représentée sur la figure 6, ou une séquence peptidique dérivée du domaine susmentionné telle que définie ci-dessus,
. et le domaine d'homologie avec la cofiline délimité par les acides aminés situés aux positions 470 et 488 de la séquence peptidique SEQ ID NO 56 de la protéine
N-WASP bovine représentée sur la figure 6, ou une séquence peptidique dérivée du domaine susmentionné telle que définie ci-dessus, * les fragments dont l'acide aminé N-terminal correspond à celui situé à l'une des positions 405 à 433 de la figure 6, et l'acide aminé C-terminal correspond à celui situé à l'une des positions 488 à 505 de la figure 6,
* le fragment de 101 acides aminés délimité par les acides aminés situés aux positions 405 et 505 de la figure 6, à savoir le peptide SEQ ID NO 58 suivant :
Ser Lys Ala Ala Leu Leu Asp Gin Ile Arg Glu Gly Ala Gin Leu Lys
Lys Val Glu Gin Asn Ser Arg Pro Val Ser Cys Ser Gly Arg Asp Ala
Leu Leu Asp Gin Ile Arg Gin Gly Ile Gin Leu Lys Ser Val Thr Asp
Ala Pro Glu Ser Thr Pro Pro Ala Pro Ala Pro Thr Ser Gly Ile Val Gly Ala Leu Met Glu Val Met Gin Lys Arg Ser Lys Ala Ile His Ser
Ser Asp Glu Asp Glu Asp Glu Asp Asp Asp Glu Asp Phe Glu Asp Asp
Asp Glu Trp Glu Asp
* le fragment de 84 acides aminés délimité par les acides aminés situés aux positions 405 et 488 de la figure 6, à savoir le peptide SEQ ID NO 60 suivant : Ser Lys Ala Ala Leu Leu Asp Gin Ile Arg Glu Gly Ala Gin Leu Lys
Lys Val Glu Gin Asn Ser Arg Pro Val Ser Cys Ser Gly Arg Asp Ala
Leu Leu Asp Gin Ile Arg Gin Gly Ile Gin Leu Lys Ser Val Thr Asp
Ala Pro Glu Ser Thr Pro Pro Ala Pro Ala Pro Thr Ser Gly Ile Val
Gly Ala Leu Met Glu Val Met Gin Lys Arg Ser Lys Ala Ile His Ser Ser Asp Glu Asp
* le fragment de 73 acides aminés délimité par les acides aminés situés aux positions 433 et 488 de la figure 6, à savoir le peptide SEQ ID NO 62 suivant :
Gly Arg Asp Ala Leu Leu Asp Gin Ile Arg Gin Gly Ile Gin Leu Lys Ser Val Thr Asp Ala Pro Glu Ser Thr Pro Pro Ala Pro Ala Pro Thr Ser Gly Ile Val Gly Ala Leu Met Glu Val Met Gin Lys Arg Ser Lys
Ala Ile His Ser Ser Asp Glu Asp Glu Asp Glu Asp Asp Asp Glu Asp Phe Glu Asp Asp Asp Glu Trp Glu Asp
* le fragment de 56 acides aminés délimité par les acides aminés situés aux positions 433 et 488 de la figure 6, à savoir le peptide SEQ ID NO 64 suivant : Gly Arg Asp Ala Leu Leu Asp Gin Ile Arg Gin Gly Ile Gin Leu Lys
Ser Val Thr Asp Ala Pro Glu Ser Thr Pro Pro Ala Pro Ala Pro Thr
Ser Gly Ile Val Gly Ala Leu Met Glu Val Met Gin Lys Arg Ser Lys
Ala Ile His Ser Ser Asp Glu Asp
• les fragments des protéines de la famille WASP de micro-organismes, tels que :
- les fragment de la protéine Las 17 de Saccharomyces cerevisiae, eux-mêmes choisis parmi :
* ceux comprenant :
. le domaine d'homologie avec la verproline délimité par les acides aminés situés aux positions 447 et 466 de la séquence peptidique SEQ ID NO 66 de la protéine
Las 17 représentée sur la figure 7, ou une séquence peptidique dérivée du domaine susmentionné telle que définie ci-dessus, . et le domaine d'homologie avec la cofiline délimité par les acides aminés situés aux positions 607 et 624 de la séquence peptidique SEQ ID NO 66 de la protéine Las 17 représentée sur la figure 7, ou une séquence peptidique dérivée du domaine susmentionné telle que définie ci-dessus, * les fragments dont l'acide aminé N-terminal correspond à celui situé à l'une des positions 422 à 447 de la figure 7, et l'acide aminé C-terminal correspond à celui situé à l'une des positions 624 à 633 de la figure 7,
* le fragment de 212 acides aminés délimité par les acides aminés situés aux positions 422 et 633 de la figure 7, à savoir le peptide SEQ ID NO 68 suivant : Ser Asn Met Ser Ser Pro Pro Pro Pro Pro Val Thr Thr Phe Asn Thr
Leu Thr Pro Gin Met Thr Ala Ala Thr Gly Gin Pro Ala Val Pro Leu
Pro Gin Asn Thr Gin Ala Pro Ser Gin Ala Thr Asn Val Pro Val Ala
Pro Pro Pro Pro Pro Ala Ser Leu Gly Gin Ser Gin Ile Pro Gin Ser
Ala Pro Ser Ala Pro Ile Pro Pro Thr Leu Pro Ser Thr Thr Ser Ala Ala Pro Pro Pro Pro Pro Ala Phe Leu Thr Gin Gin Pro Gin Ser Gly
Gly Ala Pro Ala Pro Pro Pro Pro Pro Gin Met Pro Ala Thr Ser Thr
Ser Gly Gly Gly Ser Phe Ala Glu Thr Thr Gly Asp Ala Gly Arg Asp
Ala Leu Leu Ala Ser Ile Arg Gly Ala Gly Gly Ile Gly Ala Leu Arg
Lys Val Asp Lys Ser Gin Leu Asp Lys Pro Ser Val Leu Leu Gin Glu Ala Arg Gly Glu Ser Ala Ser Pro Pro Ala Ala Ala Gly Asn Gly Gly
Thr Pro Gly Gly Pro Pro Ala Ser Leu Ala Asp Ala Leu Ala Ala Ala
Leu Asn Lys Arg Lys Thr Lys Val Gly Ala His Asp Asp Met Asp Asn Gly Asp Asp Trp
* le fragment de 203 acides aminés délimité par les acides aminés situés aux positions 422 et 624 de la figure 7, à savoir le peptide SEQ ID NO 70 suivant :
Ser Asn Met Ser Ser Pro Pro Pro Pro Pro Val Thr Thr Phe Asn Thr
Leu Thr Pro Gin Met Thr Ala Ala Thr Gly Gin Pro Ala Val Pro Leu
Pro Gin Asn Thr Gin Ala Pro Ser Gin Ala Thr Asn Val Pro Val Ala
Pro Pro Pro Pro Pro Ala Ser Leu Gly Gin Ser Gin Ile Pro Gin Ser Ala Pro Ser Ala Pro Ile Pro Pro Thr Leu Pro Ser Thr Thr Ser Ala
Ala Pro Pro Pro Pro Pro Ala Phe Leu Thr Gin Gin Pro Gin Ser Gly
Gly Ala Pro Ala Pro Pro Pro Pro Pro Gin Met Pro Ala Thr Ser Thr
Ser Gly Gly Gly Ser Phe Ala Glu Thr Thr Gly Asp Ala Gly Arg Asp
Ala Leu Leu Ala Ser Ile Arg Gly Ala Gly Gly Ile Gly Ala Leu Arg Lys Val Asp Lys Ser Gin Leu Asp Lys Pro Ser Val Leu Leu Gin Glu
Ala Arg Gly Glu Ser Ala Ser Pro Pro Ala Ala Ala Gly Asn Gly Gly
Thr Pro Gly Gly Pro Pro Ala Ser Leu Ala Asp Ala Leu Ala Ala Ala
Leu Asn Lys Arg Lys Thr Lys Val Gly Ala His
* le fragment de 187 acides aminés délimité par les acides aminés situés aux positions 447 et 633 de la figure 7, à savoir le peptide SEQ ID NO 72 suivant :
Gly Gin Pro Ala Val Pro Leu Pro Gin Asn Thr Gin Ala Pro Ser Gin
Ala Thr Asn Val Pro Val Ala Pro Pro Pro Pro Pro Ala Ser Leu Gly
Gin Ser Gin Ile Pro Gin Ser Ala Pro Ser Ala Pro Ile Pro Pro Thr
Leu Pro Ser Thr Thr Ser Ala Ala Pro Pro Pro Pro Pro Ala Phe Leu Thr Gin Gin Pro Gin Ser Gly Gly Ala Pro Ala Pro Pro Pro Pro Pro
Gin Met Pro Ala Thr Ser Thr Ser Gly Gly Gly Ser Phe Ala Glu Thr Thr Gly Asp Ala Gly Arg Asp Ala Leu Leu Ala Ser Ile Arg Gly Ala
Gly Gly Ile Gly Ala Leu Arg Lys Val Asp Lys Ser Gin Leu Asp Lys
Pro Ser Val Leu Leu Gin Glu Ala Arg Gly Glu Ser Ala Ser Pro Pro
Ala Ala Ala Gly Asn Gly Gly Thr Pro Gly Gly Pro Pro Ala Ser Leu Ala Asp Ala Leu Ala Ala Ala Leu Asn Lys Arg Lys Thr Lys Val Gly
Ala His Asp Asp Met Asp Asn Gly Asp Asp Trp
* le fragment de 178 acides aminés délimité par les acides aminés situés aux positions 447 et 624 de la figure 7, à savoir le peptide SEQ ID NO 74 suivant :
Gly Gin Pro Ala Val Pro Leu Pro Gin Asn Thr Gin Ala Pro Ser Gin Ala Thr Asn Val Pro Val Ala Pro Pro Pro Pro Pro Ala Ser Leu Gly
Gin Ser Gin Ile Pro Gin Ser Ala Pro Ser Ala Pro Ile Pro Pro Thr
Leu Pro Ser Thr Thr Ser Ala Ala Pro Pro Pro Pro Pro Ala Phe Leu
Thr Gin Gin Pro Gin Ser Gly Gly Ala Pro Ala Pro Pro Pro Pro Pro
Gin Met Pro Ala Thr Ser Thr Ser Gly Gly Gly Ser Phe Ala Glu Thr Thr Gly Asp Ala Gly Arg Asp Ala Leu Leu Ala Ser Ile Arg Gly Ala
Gly Gly Ile Gly Ala Leu Arg Lys Val Asp Lys Ser Gin Leu Asp Lys
Pro Ser Val Leu Leu Gin Glu Ala Arg Gly Glu Ser Ala Ser Pro Pro
Ala Ala Ala Gly Asn Gly Gly Thr Pro Gly Gly Pro Pro Ala Ser Leu
Ala Asp Ala Leu Ala Ala Ala Leu Asn Lys Arg Lys Thr Lys Val Gly Ala His
- les fragment de la protéine homologue WASP (Wsplp) de Schizosaccharomyces pombe, eux-mêmes choisis parmi :
* ceux comprenant :
. le domaine d'homologie avec la verproline délimité par les acides aminés situés aux positions 501 et 517 de la séquence peptidique SEQ ID NO 76 de la protéine homologue WASP (Wsplp) de Schizosaccharomyces pombe représentée sur la figure 8, ou une séquence peptidique dérivée du domaine susmentionné telle que définie ci-dessus,
. et le domaine d'homologie avec la cofiline délimité par les acides aminés situés aux positions 548 et 565 de la séquence peptidique SEQ ID NO 76 de la protéine homologue WASP (Wsplp) de Schizosaccharomyces pombe représentée sur la figure 8, ou une séquence peptidique dérivée du domaine susmentionné telle que définie ci-dessus,
* les fragments dont l'acide aminé N-terminal correspond à celui situé à l'une des positions 477 à 501 de la figure 8, et l'acide aminé C-terminal correspond à celui situé à l'une des positions 565 à 574 de la figure 8, * le fragment de 98 acides aminés délimité par les acides aminés situés aux positions 477 et 574 de la figure 8, à savoir le peptide SEQ ID NO 78 suivant :
Pro Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Val Ala Ser Ile Ala
Glu Leu Pro Gin Gin Asp Gly Arg Ala Asn Leu Met Ala Ser Ile Arg
Ala Ser Gly Gly Met Asp Leu Leu Lys Ser Arg Lys Val Ser Ala Ser Pro Ser Val Ala Ser Thr Lys Thr Ser Asn Pro Pro Val Glu Ala Pro
Pro Ser Asn Asn Leu Met Asp Ala Leu Ala Ser Ala Leu Asn Gin Arg
Lys Thr Lys Val Ala Gin Ser Asp Glu Glu Asp Glu Asp Asp Asp Glu Trp Asp
* le fragment de 89 acides aminés délimité par les acides aminés situés aux positions 477 et 565 de la figure 8, à savoir le peptide SEQ ID NO 80 suivant :
Pro Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Val Ala Ser Ile Ala Glu Leu Pro Gin Gin Asp Gly Arg Ala Asn Leu Met Ala Ser Ile Arg
Ala Ser Gly Gly Met Asp Leu Leu Lys Ser Arg Lys Val Ser Ala Ser
Pro Ser Val Ala Ser Thr Lys Thr Ser Asn Pro Pro Val Glu Ala Pro
Pro Ser Asn Asn Leu Met Asp Ala Leu Ala Ser Ala Leu Asn Gin Arg Lys Thr Lys Val Ala Gin Ser Asp Glu * le fragment de 74 acides aminés délimité par les acides aminés situés aux positions 501 et 574 de la figure 8, à savoir le peptide SEQ ID NO 82 suivant :
Ala Asn Leu Met Ala Ser Ile Arg Ala Ser Gly Gly Met Asp Leu Leu Lys Ser Arg Lys Val Ser Ala Ser Pro Ser Val Ala Ser Thr Lys Thr Ser Asn Pro Pro Val Glu Ala Pro Pro Ser Asn Asn Leu Met Asp Ala Leu Ala Ser Ala Leu Asn Gin Arg Lys Thr Lys Val Ala Gin Ser Asp Glu Glu Asp Glu Asp Asp Asp Glu Trp Asp
- le fragment de 65 acides aminés délimité par les acides aminés situés aux positions 501 et 565 de la figure 8, à savoir le peptide SEQ ID NO 84 suivant :
Ala Asn Leu Met Ala Ser Ile Arg Ala Ser Gly Gly Met Asp Leu Leu Lys Ser Arg Lys Val Ser Ala Ser Pro Ser Val Ala Ser Thr Lys Thr Ser Asn Pro Pro Val Glu Ala Pro Pro Ser Asn Asn Leu Met Asp Ala Leu Ala Ser Ala Leu Asn Gin Arg Lys Thr Lys Val Ala Gin Ser Asp Glu
• les séquences peptidiques dérivées des fragments peptidiques susmentionnés, notamment par substitution, addition ou suppression d'un ou plusieurs acides aminés de ces fragments, lesdites séquences dérivées ayant la propriété définies ci-dessus des protéines de la famille WASP et desdits fragments de ces dernières.
L'invention a également pour objet l'utilisation susmentionnée de fragments peptidiques, ou de séquences dérivées de ces derniers, tels que définis ci-dessus, fusionnés du côté N-terminal ou C-terminal avec une ou plusieurs séquences peptidiques facilitant la détection et la purification des fragments peptidiques ou séquences dérivées susmentionnés, sans pour autant affecter la propriété susmentionnée de ces derniers de polymériser l'actine en induisant la motilité cellulaire. Parmi de telles séquences peptidiques fusionnées aux fragments peptidiques, ou aux séquences dérivées de ces derniers, de l'invention, on peut citer celle de la glutathione-S-transférase (GST, décrit dans Smith D.B. and Johnson K.S. , Gène 67 : 31-41 (1988)) fusionnée à la partie N-terminale des fragments peptidiques ou séquences dérivées susmentionnés, ou celles d'épitopes reconnus par des anticorps spécifiques, telle que celle de l'épitope myc9E10 (décrit dans Evan G.I. et al. , Molecular and Cellular Biology 5 : 3610-3616 (1985)) fusionnée à la partie C-terminale des fragments peptidiques ou séquences dérivées susmentionnés.
L'invention concerne également les fragments peptidiques susmentionnés, ou les séquences dérivées de ces derniers, en tant que tels, à savoir plus particulièrement les fragments peptidiques des protéines de la famille WASP des cellules eucaryotes choisis parmi ceux comprenant :
- le domaine d'homologie avec la verproline contenu dans les protéines de la famille WASP, ou dans une protéine dérivée de ces dernières, ou au moins une des deux séquences homologues à la verproline lorsque lesdites protéines de la famille WASP contiennent deux de ces séquences, ou une séquence peptidique dérivée du domaine susmentionné, notamment par substitution, addition ou suppression d'un ou plusieurs acides aminés, et conservant la propriété de ce domaine de se lier à l'actine,
- et le domaine d'homologie avec la cofiline contenu dans les protéines de la famille WASP ou dans une protéine dérivée de ces dernières, ou une séquence peptidique dérivée du domaine susmentionné, notamment par substitution, addition ou suppression d'un ou plusieurs acides aminés, et conservant la propriété de ce domaine d'intervenir dans le cadre de la polymérisation de l'actine, ou les séquences peptidiques dérivées des fragments peptidiques susmentionnés des protéines de la famille WASP, notamment par substitution d'un ou plusieurs acides aminés de ces fragments, lesdites séquences dérivées ayant la propriété susmentionnée de la protéine WASP et desdits fragments, à l'exclusion :
- du fragment peptidique de la protéine WASP humaine délimité par les acides aminés situés aux positions 429 à 503 de la séquence peptidique représentée sur la figure 1 , - du fragment peptidique de la protéine WASP humaine délimité par les acides aminés situés aux positions 187 à 489 de la séquence peptidique représentée sur la figure 1 ,
- du fragment peptidique de la protéine WASP humaine délimité par les acides aminés situés aux positions 422 à 489 de la séquence peptidique représentée sur la figure 1,
- du fragment peptidique de la protéine N-WASP humaine délimité par les acides aminés situés aux positions 392 à 505 de la séquence peptidique représentée sur la figure 2,
- du fragment peptidique de la protéine Scarl humaine délimité par les acides aminés situés aux positions 443 à 559 de la séquence peptidique représentée sur la figure 3, - du fragment peptidique de la protéine N-WASP bovine délimité par les acides aminés situés aux positions 392 à 505, et de celui délimité par les acides aminés situés aux positions 392 à 485, de la séquence peptidique représentée sur la figure 6.
L'invention a plus particulièrement pour objet les fragments peptidiques susmentionnés de la protéine WASP humaine, ou les séquences peptidiques dérivées de ces derniers, lesdits fragments étant choisis parmi ceux comprenant :
. le domaine d'homologie avec la verproline délimité par les acides aminés situés aux positions 430 et 446 de la séquence peptidique SEQ ID NO 2 de la protéine WASP humaine représentée sur la figure 1 , ou une séquence peptidique dérivée du domaine susmentionné telle que définie ci-dessus,
. et le domaine d'homologie avec la cofiline délimité par les acides aminés situés aux positions 469 et 487 de la séquence peptidique SEQ ID NO 2 de la protéine WASP humaine représentée sur la figure 1 , ou une séquence peptidique dérivée du domaine susmentionné telle que définie ci-dessus. L'invention concerne plus particulièrement encore les fragments de la protéine WASP humaine choisis parmi les fragments dont l'acide aminé N-terminal correspond à celui situé à l'une des positions 404 à 430 de la figure 1, et l'acide aminé C-terminal correspond à celui situé à l'une des positions 487 à 502 de la figure 1, et plus particulièremenent les peptides SEQ ID NO 4, SEQ ID NO 6, SEQ ID NO 8, et SEQ ID NO 10 susmentionnés, ou les séquences dérivées de ces derniers telles que définies ci-dessus.
L'invention a plus particulièrement pour objet les fragments peptidiques susmentionnés de la protéine N-WASP humaine, ou les séquences peptidiques dérivées de ces derniers, lesdits fragments étant choisis parmi ceux comprenant :
. la séquence homologue à la verproline délimitée par les acides aminés situés aux positions 405 et 421 de la séquence peptidique SEQ ID NO 12 de la protéine N-
WASP humaine représentée sur la figure 2, ou une séquence peptidique dérivée du domaine susmentionné telle que définie ci-dessus,
. et/ou la séquence homologue à la verproline délimitée par les acides aminés situés aux positions 433 et 449 de la séquence peptidique SEQ ID NO 12 de la protéine N-WASP humaine représentée sur la figure 2, ou une séquence peptidique dérivée du domaine susmentionné telle que définie ci-dessus,
. et le domaine d'homologie avec la cofiline contenu dans la protéine N- WASP susmentionnée, à savoir le domaine délimité par les acides aminés situés aux positions 470 et 488 de la séquence peptidique SEQ ID NO 12 de la protéine N-WASP humaine représentée sur la figure 2, ou une séquence peptidique dérivée du domaine susmentionné telle que définie ci-dessus.
L'invention concerne plus particulièrement encore les fragments de la protéine N- WASP humaine choisis parmi les fragments dont l'acide aminé N-terminal correspond à celui situé à l'une des positions 392 à 433 de la figure 2, et l'acide aminé C-terminal correspond à celui situé à l'une des positions 488 à 505 de la figure 2, et plus particulièrement les peptides SEQ ID NO 16, SEQ ID NO 18, SEQ ID NO 20, SEQ ID NO 22, et SEQ ID NO 24 susmentionnés, ou les séquences dérivées de ces derniers telles que définies ci-dessus.
L'invention a plus particulièrement pour objet les fragments peptidiques susmentionnés de la protéine Scarl humaine, ou les séquences peptidiques dérivées de ces derniers, lesdits fragments étant choisis parmi ceux comprenant :
. le domaine d'homologie avec la verproline délimité par les acides aminés situés aux positions 497 et 513 de la séquence peptidique SEQ ID NO 26 de la protéine
Scarl humaine représentée sur la figure 3, ou une séquence peptidique dérivée du domaine susmentionné telle que définie ci-dessus,
. et le domaine d'homologie avec la cofiline délimité par les acides aminés situés aux positions 531 et 546 de la séquence peptidique SEQ ID NO 26 de la protéine Scarl humaine représentée sur la figure 3, ou une séquence peptidique dérivée du domaine susmentionné telle que définie ci-dessus.
L'invention concerne plus particulièrement encore les fragments de la protéine Scarl humaine choisis parmi les fragments dont l'acide aminé N-terminal correspond à celui situé à l'une des positions 443 à 497 de la figure 3, et l'acide aminé C-terminal correspond à celui situé à l'une des positions 546 à 559 de la figure 3, et plus particulièrement les peptides SEQ ID NO 28, SEQ ID NO 30, SEQ ID NO 32, et SEQ ID NO 34 susmentionnés, ou les séquences dérivées de ces derniers telles que définies ci-dessus.
L'invention a plus particulièrement pour objet les fragments peptidiques susmentionnés de la protéine WASP murine, ou les séquences peptidiques dérivées de ces derniers, lesdits fragments étant choisis parmi ceux comprenant :
. le domaine d'homologie avec la verproline délimité par les acides aminés situés aux positions 448 et 465 de la séquence peptidique SEQ ID NO 36 de la protéine WASP murine représentée sur la figure 4, ou une séquence peptidique dérivée du domaine susmentionné telle que définie ci-dessus,
. et le domaine d'homologie avec la cofiline délimité par les acides aminés situés aux positions 487 et 505 de la séquence peptidique SEQ ID NO 36 de la protéine WASP murine représentée sur la figure 4, ou une séquence peptidique dérivée du domaine susmentionné telle que définie ci-dessus.
L'invention concerne plus particulièrement encore les fragments de la protéine WASP murine choisis parmi les fragments dont l'acide aminé N-terminal correspond à celui situé à l'une des positions 420 à 448 de la figure 4, et l'acide aminé C-terminal correspond à celui situé à l'une des positions 505 à 520 de la figure 4, et plus particulièrement les peptides
SEQ ID NO 38, SEQ ID NO 40, SEQ ID NO 42, et SEQ ID NO 44 susmentionnés, ou les séquences dérivées de ces derniers telles que définies ci-dessus.
L'invention a plus particulièrement pour objet les fragments peptidiques susmentionnés de la protéine N-WASP de rat, ou les séquences peptidiques dérivées de ces derniers, lesdits fragments étant choisis parmi ceux comprenant :
. la séquence homologue à la verproline délimitée par les acides aminés situés aux positions 401 et 417 de la séquence peptidique SEQ ID NO 46 de la protéine N-WASP de rat représentée sur la figure 5, ou une séquence peptidique dérivée du domaine susmentionné telle que définie ci-dessus, . et/ou la séquence homologue à la verproline délimitée par les acides aminés situés aux positions 429 et 444 de la séquence peptidique SEQ ID NO 46 de la protéine N-WASP de rat représentée sur la figure 5, ou une séquence peptidique dérivée du domaine susmentionné telle que définie ci-dessus,
. et le domaine d'homologie avec la cofiline contenu dans la protéine N- WASP susmentionnée, à savoir le domaine délimité par les acides aminés situés aux positions 466 et 484 de la séquence peptidique SEQ ID NO 46 de la protéine N-WASP de rat représentée sur la figure 5, ou une séquence peptidique dérivée du domaine susmentionné telle que définie ci-dessus.
L'invention concerne plus particulièrement encore les fragments de la protéine N- WASP de rat choisis parmi les fragments dont l'acide aminé N-terminal correspond à celui situé à l'une des positions 401 à 429 de la figure 5, et l'acide aminé C-terminal correspond à celui situé à l'une des positions 484 à 501 de la figure 5, et plus particulièrement les peptides SEQ ID NO 48, SEQ ID NO 50, SEQ ID NO 52, et SEQ ID NO 54 susmentionnés, ou les séquences dérivées de ces derniers telles que définies ci-dessus.
L'invention a plus particulièrement pour objet les fragments peptidiques susmentionnés de la protéine N-WASP bovine, ou les séquences peptidiques dérivées de ces derniers, lesdits fragments étant choisis parmi ceux comprenant :
. le domaine d'homologie avec la verproline délimité par les acides aminés situés aux positions 405 et 421 de la séquence peptidique SEQ ID NO 56 de la protéine N-WASP bovine représentée sur la figure 6, ou une séquence peptidique dérivée du domaine susmentionné telle que définie ci-dessus, . et/ou le domaine d'homologie avec la verproline délimité par les acides aminés situés aux positions 433 et 488 de la séquence peptidique SEQ ID NO 56 de la protéine N-WASP bovine représentée sur la figure 6, ou une séquence peptidique dérivée du domaine susmentionné telle que définie ci-dessus,
. et le domaine d'homologie avec la cofiline délimité par les acides aminés situés aux positions 470 et 488 de la séquence peptidique SEQ ID NO 56 de la protéine
N-WASP bovine représentée sur la figure 6, ou une séquence peptidique dérivée du domaine susmentionné telle que définie ci-dessus,
L'invention concerne plus particulièrement encore les fragments de la protéine N- WASP bovine choisis parmi les fragments dont l'acide aminé N-terminal correspond à celui situé à l'une des positions 405 à 433 de la figure 6, et l'acide aminé C-terminal correspond à celui situé à l'une des positions 488 à 505 de la figure 6, et plus particulièrement les peptides SEQ ID NO 58, SEQ ID NO 60, SEQ ID NO 62, et SEQ ID NO 64 susmentionnés, ou les séquences dérivées de ces derniers telles que définies ci-dessus.
L'invention a plus particulièrement pour objet les fragments peptidiques susmentionnés de la protéine Las 17 de Saccharomyces cerevisiae, ou les séquences peptidiques dérivées de ces derniers, lesdits fragments étant choisis parmi ceux comprenant:
. le domaine d'homologie avec la verproline délimité par les acides aminés situés aux positions 447 et 466 de la séquence peptidique SEQ ID NO 66 de la protéine
Las 17 représentée sur la figure 7, ou une séquence peptidique dérivée du domaine susmentionné telle que définie ci-dessus,
. et le domaine d'homologie avec la cofiline délimité par les acides aminés situés aux positions 607 et 624 de la séquence peptidique SEQ ID NO 66 de la protéine Las 17 représentée sur la figure 7, ou une séquence peptidique dérivée du domaine susmentionné telle que définie ci-dessus.
L'invention concerne plus particulièrement encore les fragments de la protéine Las 17 de Saccharomyces cerevisiae choisis parmi les fragments dont l'acide aminé N-terminal correspond à celui situé à l'une des positions 422 à 447 de la figure 7, et l'acide aminé C- terminal correspond à celui situé à l'une des positions 624 à 633 de la figure 7, et plus particulièrement les peptides SEQ ID NO 68, SEQ ID NO 70, SEQ ID NO 72, et SEQ ID NO 74 susmentionnés, ou les séquences dérivées de ces derniers telles que défîmes ci- dessus. L'invention a plus particulièrement pour objet les fragments peptidiques susmentionnés de la protéine (Wsplp) de Schizosaccharomyces pombe, ou les séquences peptidiques dérivées de ces derniers, lesdits fragments étant choisis parmi ceux comprenant: . le domaine d'homologie avec la verproline délimité par les acides aminés situés aux positions 501 et 517 de la séquence peptidique SEQ ID NO 76 de la protéine homologue WASP (Wsplp) de Schizosaccharomyces pombe représentée sur la figure 8, ou une séquence peptidique dérivée du domaine susmentionné telle que définie ci-dessus,
. et le domaine d'homologie avec la cofiline délimité par les acides aminés situés aux positions 548 et 565 de la séquence peptidique SEQ ID NO 76 de la protéine homologue WASP (Wsplp) de Schizosaccharomyces pombe représentée sur la figure 8, ou une séquence peptidique dérivée du domaine susmentionné telle que définie ci-dessus.
L'invention concerne plus particulièrement encore les fragments de la protéine homologue WASP (Wsplp) de Schizosaccharomyces pombe choisis parmi les fragments dont l'acide aminé N-terminal correspond à celui situé à l'une des positions 477 à 501 de la figure 8, et l'acide aminé C-terminal correspond à celui situé à l'une des positions 565 à 574 de la figure 8, et plus particulièrement les peptides SEQ ID NO 78, SEQ ID NO 80,
SEQ ID NO 82, et SEQ ID NO 84 susmentionnés, ou les séquences dérivées de ces derniers telles que définies ci-dessus.
L'invention concerne également les séquences nucléotidiques codant pour les fragments peptidiques susmentionnés, ou pour les protéines dérivées de ces derniers, ou encore pour les protéines de fusion telles que décrites ci-dessus.
L'invention a plus particulièrement pour objet : - les séquences nucléotidiques dont l'extrémité 5' correspond au nucleotide situé à l'une des positions 1244 à 1322 de la séquence nucléotidique SEQ ID NO 1 représentée sur la figure 1, et l'extrémité 3 ' correspond au nucleotide situé à l'une des positions 1495 à 1540 de la figure 1 , lesdites séquences nucléotidiques codant pour les fragments susmentionnés de la protéine WASP humaine dont l'acide aminé N-terminal correspond à celui situé à l'une des positions 404 à 430 de la figure 1, et l'acide aminé C-terminal correspond à celui situé à l'une des positions 487 à 502 de la figure 1,
- la séquence nucléotidique SEQ ID NO 3 délimitée par les nucléotides situés aux positions 1244 et 1540 de la figure 1, et codant pour le fragment peptidique de la protéine WASP humaine correspondant au peptide SEQ ID NO 4 susmentionné,
- la séquence nucléotidique SEQ ID NO 5 délimitée par les nucléotides situés aux positions 1244 et 1495 de la figure 1 , et codant pour le fragment peptidique de la protéine WASP humaine correspondant au peptide SEQ ID NO 6 susmentionné,
- la séquence nucléotidique SEQ ID NO 7 délimitée par les nucléotides situés aux positions 1322 et 1540 de la figure 1, et codant pour le fragment peptidique de la protéine
WASP humaine correspondant au peptide SEQ ID NO 8 susmentionné,
- la séquence nucléotidique SEQ ID NO 9 délimitée par les nucléotides situés aux positions 1322 et 1495 de la figure 1, et codant pour le fragment peptidique de la protéine WASP humaine correspondant au peptide SEQ ID NO 10 susmentionné, - les séquences nucléotidiques dérivées par dégénérescence du code génétique des séquences nucléotidiques susmentionnées, et codant pour les fragments peptidiques susmentionnés,
- les séquences nucléotidiques dérivées des séquences nucléotidiques susmentionnées, et codant pour les séquences dérivées desdits fragments peptidiques telles que définies ci- dessus.
L'invention concerne plus particulièrement encore :
- les séquences nucléotidiques dont l'extrémité 5' correspond au nucleotide situé à l'une des positions 1174 à 1299 de la séquence nucléotidique SEQ ID NO 11 représentée sur la figure 2, et l'extrémité 3' correspond au nucleotide situé à l'une des positions 1464 à 1515 de la figure 2, lesdites séquences nucléotidiques codant pour les fragments susmentionnés de la protéine N-WASP dont l'acide aminé N-terminal correspond à celui situé à l'une des positions 392 à 433 de la figure 2, et l'acide aminé C-terminal correspond à celui situé à l'une des positions 488 à 505 de la figure 2, à l'exclusion de la séquence nucléotidique délimitée par les nucléotides situés aux positions 1174 à 1515 codant pour le fragment peptidique de la protéine N-WASP délimité par les acides aminés situés aux positions 392 à 505 de la séquence peptidique représentée sur la figure 2, - la séquence nucléotidique SEQ ID NO 15 délimitée par les nucléotides situés aux positions 1174 et 1464 codant pour le fragment peptidique de la protéine N-WASP correspondant au peptide SEQ ID NO 16 susmentionné,
- la séquence nucléotidique SEQ ID NO 17 délimitée par les nucléotides situés aux positions 1213 et 1515 codant pour le fragment peptidique de la protéine N-WASP correspondant au peptide SEQ ID NO 18 susmentionné,
- la séquence nucléotidique SEQ ID NO 19 délimitée par les nucléotides situés aux positions 1213 et 1464 codant pour le fragment peptidique de la protéine N-WASP correspondant au peptide SEQ ID NO 20 susmentionné,
- la séquence nucléotidique SEQ ID NO 21 délimitée par les nucléotides situés aux positions 1297 et 1515 codant pour le fragment peptidique de la protéine N-WASP correspondant au peptide SEQ ID NO 22 susmentionné,
- la séquence nucléotidique SEQ ID NO 23 délimitée par les nucléotides situés aux positions 1297 et 1464 codant pour le fragment peptidique de la protéine N-WASP correspondant au peptide SEQ ID NO 24 susmentionné, - les séquences nucléotidiques dérivées par dégénérescence du code génétique des séquences nucléotidiques susmentionnées, et codant pour les fragments peptidiques susmentionnés,
- les séquences nucléotidiques dérivées des séquences nucléotidiques susmentionnées, et codant pour les séquences dérivées desdits fragments peptidiques telles que définies ci- dessus.
L'invention a plus particulièrement pour objet :
- les séquences nucléotidiques dont l'extrémité 5' correspond au nucleotide situé à l'une des positions 1327 à 1489 de la séquence nucléotidique SEQ ID NO 26 représentée sur la figure 3, et l'extrémité 3' correspond au nucleotide situé à l'une des positions 1638 à 1677 de la figure 3, lesdites séquences nucléotidiques codant pour les fragments susmentionnés de la protéine Scarl humaine dont l'acide aminé N-terminal correspond à celui situé à l'une des positions 546 à 497 de la figure 3, et l'acide aminé C-terminal correspond à celui situé à l'une des positions 487 à 559 de la figure 3,
- la séquence nucléotidique SEQ ID NO 27 délimitée par les nucléotides situés aux positions 1327 et 1677 de la figure 3, et codant pour le fragment peptidique de la protéine Scarl humaine correspondant au peptide SEQ ID NO 28 susmentionné,
- la séquence nucléotidique SEQ ID NO 29 délimitée par les nucléotides situés aux positions 1327 et 1638 de la figure 3, et codant pour le fragment peptidique de la protéine Scarl humaine correspondant au peptide SEQ ID NO 30 susmentionné,
- la séquence nucléotidique SEQ ID NO 31 délimitée par les nucléotides situés aux positions 1489 et 1677 de la figure 3, et codant pour le fragment peptidique de la protéine
Scarl humaine correspondant au peptide SEQ ID NO 32 susmentionné,
- la séquence nucléotidique SEQ ID NO 33 délimitée par les nucléotides situés aux positions 1489 et 1638 de la figure 3, et codant pour le fragment peptidique de la protéine Scarl humaine correspondant au peptide SEQ ID NO 34 susmentionné, - les séquences nucléotidiques dérivées par dégénérescence du code génétique des séquences nucléotidiques susmentionnées, et codant pour les fragments peptidiques susmentionnés,
- les séquences nucléotidiques dérivées des séquences nucléotidiques susmentionnées, et codant pour les séquences dérivées desdits fragments peptidiques telles que définies ci- dessus.
L'invention a plus particulièrement pour objet :
- les séquences nucléotidiques dont l'extrémité 5' correspond au nucleotide situé à l'une des positions 1282 à 1366 de la séquence nucléotidique SEQ ID NO 36 représentée sur la figure 4, et l'extrémité 3 ' correspond au nucleotide situé à l'une des positions 1539 à 1584 de la figure 4, lesdites séquences nucléotidiques codant pour les fragments susmentionnés de la protéine WASP murine dont l'acide aminé N-terminal correspond à celui situé à l'une des positions 420 à 448 de la figure 4, et l'acide aminé C-terminal correspond à celui situé à l'une des positions 505 à 520 de la figure 4,
- la séquence nucléotidique SEQ ID NO 37 délimitée par les nucléotides situés aux positions 1282 et 1584 de la figure 4, et codant pour le fragment peptidique de la protéine
WASP murine correspondant au peptide SEQ ID NO 38 susmentionné, - la séquence nucléotidique SEQ ID NO 39 délimitée par les nucléotides situés aux positions 1282 et 1584 de la figure 4, et codant pour le fragment peptidique de la protéine WASP murine correspondant au peptide SEQ ID NO 40 susmentionné,
- la séquence nucléotidique SEQ ID NO 41 délimitée par les nucléotides situés aux positions 1366 et 1584 de la figure 4, et codant pour le fragment peptidique de la protéine
WASP murine correspondant au peptide SEQ ID NO 42 susmentionné,
- la séquence nucléotidique SEQ ID NO 43 délimitée par les nucléotides situés aux positions 1366 et 1539 de la figure 4, et codant pour le fragment peptidique de la protéine WASP murine correspondant au peptide SEQ ID NO 44 susmentionné, - les séquences nucléotidiques dérivées par dégénérescence du code génétique des séquences nucléotidiques susmentionnées, et codant pour les fragments peptidiques susmentionnés,
- les séquences nucléotidiques dérivées des séquences nucléotidiques susmentionnées, et codant pour les séquences dérivées desdits fragments peptidiques telles que définies ci- dessus.
L'invention a plus particulièrement pour objet :
- les séquences nucléotidiques dont l'extrémité 5' correspond au nucleotide situé à l'une des positions 1272 à 1356 de la séquence nucléotidique SEQ ID NO 46 représentée sur la figure 5, et l' extrémité 3' correspond au nucleotide situé à l'une des positions 1523 à 1574 de la figure 5, lesdites séquences nucléotidiques codant pour les fragments susmentionnés de la protéine N-WASP de rat dont l'acide aminé N-terminal correspond à celui situé à l'une des positions 401 à 429 de la figure 5, et l'acide aminé C-terminal correspond à celui situé à l'une des positions 484 à 501 de la figure 5,
- la séquence nucléotidique SEQ ID NO 47 délimitée par les nucléotides situés aux positions 1272 et 1574 de la figure 5, et codant pour le fragment peptidique de la protéine
N-WASP de rat correspondant au peptide SEQ ID NO 48 susmentionné,
- la séquence nucléotidique SEQ ID NO 49 délimitée par les nucléotides situés aux positions 1272 et 1523 de la figure 5, et codant pour le fragment peptidique de la protéine N-WASP de rat correspondant au peptide SEQ ID NO 50 susmentionné, - la séquence nucléotidique SEQ ID NO 51 délimitée par les nucléotides situés aux positions 1356 et 1574 de la figure 5, et codant pour le fragment peptidique de la protéine N-WASP de rat correspondant au peptide SEQ ID NO 52 susmentionné, - la séquence nucléotidique SEQ ID NO 53 délimitée par les nucléotides situés aux positions 1356 et 1523 de la figure 5, et codant pour le fragment peptidique de la protéine N-WASP de rat correspondant au peptide SEQ ID NO 54 susmentionné,
- les séquences nucléotidiques dérivées par dégénérescence du code génétique des séquences nucléotidiques susmentionnées, et codant pour les fragments peptidiques susmentionnés,
- les séquences nucléotidiques dérivées des séquences nucléotidiques susmentionnées, et codant pour les séquences dérivées desdits fragments peptidiques telles que définies ci- dessus. L'invention a plus particulièrement pour objet :
- les séquences nucléotidiques dont l'extrémité 5' correspond au nucleotide situé à l'une des positions 1500 à 1584 de la séquence nucléotidique SEQ ID NO 56 représentée sur la figure 6, et l'extrémité 3' correspond au nucleotide situé à l'une des positions 1751 à 1802 de la figure 6, lesdites séquences nucléotidiques codant pour les fragments susmentionnés de la protéine N-WASP bovine dont l'acide aminé N-terminal correspond à celui situé à l'une des positions 405 à 433 de la figure 6, et l'acide aminé C-terminal correspond à celui situé à l'une des positions 488 à 505 de la figure 6,
- la séquence nucléotidique SEQ ID NO 57 délimitée par les nucléotides situés aux positions 1500 et 1802 de la figure 6, et codant pour le fragment peptidique de la protéine N-WASP bovine correspondant au peptide SEQ ID NO 58 susmentionné,
- la séquence nucléotidique SEQ ID NO 59 délimitée par les nucléotides situés aux positions 1500 et 1751 de la figure 6, et codant pour le fragment peptidique de la protéine N-WASP bovine correspondant au peptide SEQ ID NO 60 susmentionné,
- la séquence nucléotidique SEQ ID NO 61 délimitée par les nucléotides situés aux positions 1584 et 1802 de la figure 6, et codant pour le fragment peptidique de la protéine
N-WASP bovine correspondant au peptide SEQ ID NO 62 susmentionné,
- la séquence nucléotidique SEQ ID NO 63 délimitée par les nucléotides situés aux positions 1584 et 1751 de la figure 6, et codant pour le fragment peptidique de la protéine N-WASP bovine correspondant au peptide SEQ ID NO 64 susmentionné, - les séquences nucléotidiques dérivées par dégénérescence du code génétique des séquences nucléotidiques susmentionnées, et codant pour les fragments peptidiques susmentionnés, - les séquences nucléotidiques dérivées des séquences nucléotidiques susmentionnées, et codant pour les séquences dérivées desdits fragments peptidiques telles que définies ci- dessus.
L'invention a plus particulièrement pour objet : - les séquences nucléotidiques dont l'extrémité 5' correspond au nucleotide situé à l'une des positions 2035 à 2110 de la séquence nucléotidique SEQ ID NO 66 représentée sur la figure 7, et l'extrémité 3' correspond au nucleotide situé à l'une des positions 2643 à 2670 de la figure 7, lesdites séquences nucléotidiques codant pour les fragments susmentionnés de la protéine Las 17 de Saccharomyces cerevisiae dont l'acide aminé N- terminal correspond à celui situé à l'une des positions 422 à 447 de la figure 7, et l'acide aminé C-terminal correspond à celui situé à l'une des positions 624 à 633 de la figure 7,
- la séquence nucléotidique SEQ ID NO 67 délimitée par les nucléotides situés aux positions 2035 et 2670 de la figure 7, et codant pour le fragment peptidique de la protéine Las 17 de Saccharomyces cerevisiae correspondant au peptide SEQ ID NO 68 susmentionné,
- la séquence nucléotidique SEQ ID NO 69 délimitée par les nucléotides situés aux positions 2035 et 2643 de la figure 7, et codant pour le fragment peptidique de la protéine Las 17 de Saccharomyces cerevisiae correspondant au peptide SEQ ID NO 70 susmentionné, - la séquence nucléotidique SEQ ID NO 71 délimitée par les nucléotides situés aux positions 2110 et 2670 de la figure 7, et codant pour le fragment peptidique de la protéine Las 17 de Saccharomyces cerevisiae correspondant au peptide SEQ ID NO 72 susmentionné,
- la séquence nucléotidique SEQ ID NO 73 délimitée par les nucléotides situés aux positions 2110 et 2643 de la figure 7, et codant pour le fragment peptidique de la protéine
Las 17 de Saccharomyces cerevisiae correspondant au peptide SEQ ID NO 74 susmentionné,
- les séquences nucléotidiques dérivées par dégénérescence du code génétique des séquences nucléotidiques susmentionnées, et codant pour les fragments peptidiques susmentionnés, - les séquences nucléotidiques dérivées des séquences nucléotidiques susmentionnées, et codant pour les séquences dérivées desdits fragments peptidiques telles que définies ci- dessus.
L'invention a plus particulièrement pour objet : - les séquences nucléotidiques dont l'extrémité 5' correspond au nucleotide situé à l'une des positions 1429 à 1501 de la séquence nucléotidique SEQ ID NO 76 représentée sur la figure 8, et l'extrémité 3' correspond au nucleotide situé à l'une des positions 1695 à 1722 de la figure 8, lesdites séquences nucléotidiques codant pour les fragments susmentionnés de la protéine homologue WASP (Wsplp) de Schizosaccharomyces pombe dont l'acide aminé N-terminal correspond à celui situé à l'une des positions 477 à 501 de la figure 8, et l'acide aminé C-terminal correspond à celui situé à l'une des positions 565 à 574 de la figure 8,
- la séquence nucléotidique SEQ ID NO 77 délimitée par les nucléotides situés aux positions 1429 et 1722 de la figure 8, et codant pour le fragment peptidique de la protéine homologue WASP (Wsplp) de Schizosaccharomyces pombe correspondant au peptide SEQ
ID NO 78 susmentionné,
- la séquence nucléotidique SEQ ID NO 79 délimitée par les nucléotides situés aux positions 1429 et 1695 de la figure 8, et codant pour le fragment peptidique de la protéine (Wsplp) de Schizosaccharomyces pombe correspondant au peptide SEQ ID NO 80 susmentionné,
- la séquence nucléotidique SEQ ID NO 81 délimitée par les nucléotides situés aux positions 1501 et 1722 de la figure 8, et codant pour le fragment peptidique de la protéine homologue WASP (Wsplp) de Schizosaccharomyces pombe correspondant au peptide SEQ ID NO 82 susmentionné, - la séquence nucléotidique SEQ ID NO 83 délimitée par les nucléotides situés aux positions 1501 et 1695 de la figure 8, et codant pour le fragment peptidique de la protéine homologue WASP (Wsplp) de Schizosaccharomyces pombe correspondant au peptide SEQ ID NO 84 susmentionné,
- les séquences nucléotidiques dérivées par dégénérescence du code génétique des séquences nucléotidiques susmentionnées, et codant pour les fragments peptidiques susmentionnés, - les séquences nucléotidiques dérivées des séquences nucléotidiques susmentionnées, et codant pour les séquences dérivées desdits fragments peptidiques telles que définies ci- dessus.
L'invention a également pour objet les vecteurs, notamment les plasmides, contenant une séquence nucléotidique telle que définie ci-dessus.
L'invention concerne également les cellules hôtes transformées par un vecteur susmentionné, lesdites cellules exprimant les fragments peptidiques susmentionnés, ou les séquences dérivées décrites ci-dessus, sous forme recombinante. Avantageusement, les cellules hôtes susmentionnées sont choisies parmi les suivantes : Escherichia coli D5α et Escherichia coli BL21.
L'invention a également pour objet des réactifs pour la mise en œuvre d'un procédé de détection ou de criblage de molécules ayant un effet d'inhibition ou de stimulation de la formation du cytosquelette d'actine, et donc un effet d'inhibition ou de stimulation de la mobilité cellulaire, ledit réactif comprenant au moins un fragment peptidique défini ci- dessus, lié ou adsorbé à un support susceptible de se déplacer sous l'effet de la polymérisation de l'actine, lorsque ledit support lié audit fragment est placé dans un milieu contenant les éléments nécessaires à la polymérisation de l'actine, notamment lorsque ledit support est ajouté à un milieu contenant principalement le complexe Arp2/3, la protéine VASP (phosphoprotéine stimulée vasodilatatrice), la cofiline, et des protéines de coiffage, ce milieu pouvant par exemple être un extrait préparé à partir de surnageants de cellules lysées de l'organisme.
La protéine de coiffage est un élément essentiel de la motilité dépendant de WASP. Ces protéines sont capables de convertir la polymérisation de l'actine en mouvement dépendant de l'actine en limitant spatialement la polymérisation à certains sites du cytosquelette cellulaire. En comparaison, en absence de protéines de coiffage la polymérisation de l'actine a encore lieu, mais puisque incontrôlée, ne peut plus générer une force. Les protéines de coiffage sont composées de deux sous-unités, alpha (p34) et bêta (p32) qui sont toutes les deux requises pour l'activité de coiffage. Le dimère s'associe à l'extrémité plus du filament qui est normalement favorisé pour l'additon des monomères d'actine et bloque ainsi l'addition de monomères. Des gènes codant pour des protéines de coiffage ont été identifiés dans toutes les espèces étudiées à ce jour et ont été montrés indispensables pour la survie d'organismes. Chez l'homme, Cap beta 1, beta2, G et CapZ ont été identifiées à ce jour. A savoir également que des protéines multifonctionnelles telles que la gelsoline et la villine ont aussi une activité de coiffage en plus de leurs autres activités modifiant l'actine.
L'invention a plus particulièrement pour objet les réactifs tels que définis ci-dessus, choisis parmi les microsphères dont le diamètre est avantageusement compris entre environ
100 nm et environ 10 000 nm, le matériau constituant les microsphères étant lui même choisi de préférence parmi les polystyrènes ou le latex, lesdites microsphères contenant avantageusement chacune environ 5 000 à environ 50 000 molécules de fragment peptidique susmentionné ou d'une séquence dérivée selon l'invention. Avantageusement le fragment peptidique susmentionné, ou sa séquence dérivée, sont adsorbés à la surface desdites microsphères, ledit réactif étant obtenu par simple mélange desdites microsphères audit fragment peptidique ou à sa séquence dérivée.
L'invention a plus particulièrement pour objet les réactifs tels que définis ci-dessus, choisis parmi les gouttes d'huile, notamment d'huile en C14 à C18, tel que l'acide palmitique, dont le diamètre est avantageusement compris entre environ 1 μm et environ
20 μm.
L'invention a également pour objet tout procédé de détection ou de criblage de molécules telles que définies ci-dessus, ayant un effet d'inhibition ou de stimulation de la formation du cytosquelette d'actine, et donc un effet d'inhibition ou de stimulation de la motilité cellulaire, ledit procédé comprenant :
- une étape de mise en présence de la molécule testée avec un réactif tel que décrit ci- dessus dans un milieu contenant de l'actine et les éléments nécessaires à la polymérisation de l'actine, notamment dans un extrait de surnageant cellulaire ou autre milieu tel que défini ci-dessus, - suivie de la détection éventuelle d'une inhibition ou d'une activation du processus de polymérisation de l'actine à la surface dudit réactif, par rapport à un témoin (à savoir un milieu tel que décrit ci-dessus ne contenant pas la molécule testée, et dans lequel se trouve ledit réactif), témoignant respectivement d'un effet d'inhibition ou de stimulation de la formation du cytosquelette d'actine. Avantageusement, le milieu susmentionné dans lequel la molécule testée est mise en présence dudit réactif, contient un composé marqué notamment par fluorescence, permettant de détecter le déplacement dudit réactif. A titre d'illustration, le composé marqué susmentionné est un dérivé fluorescent de l'actine, telle que l'actine-rhodamine (disponible commercialement), permettant de visualiser la polymérisation de l'actine par microscopie à épifluorescence.
L'invention a également pour objet l'application du procédé tel que défini ci-dessus, à la détection ou au criblage de molécules, telles que définies ci-dessus, susceptibles de pouvoir être utilisées en tant que médicaments dans le traitement de pathologies liées à un dysfonctionnement du processus de polymérisation de l'actine dans le cadre de la formation du cytosquelette d'actine, ou susceptibles d'avoir un effet cytotoxique correspondant à une inhibition ou une stimulation de la formation du cytosquelette d'actine. L'invention a également pour objet une trousse ou kit pour la mise en œuvre d'un procédé susmentionné, comprenant
- un réactif tel que défini ci-dessus,
- le cas échéant un composé marqué défini ci-dessus permettant de visualiser la polymérisation de l'actine, notamment de l'actine marquée par fluorescence, - le cas échéant un milieu approprié contenant les éléments nécessaires à la polymérisation de l'actine, notamment un extrait de surnageant cellulaire tel que défini ci- dessus.
L'invention sera davantage illustrée à l'aide de la description détaillée qui suit de la préparation de microsphères enduites d'un fragment peptidique de l'invention, et de la détection de la polymérisation de l'actine à la surface de ces microsphères dans un extrait de surnageant cellulaire.
I) Matériel et méthodes
La séquence codant pour le domaine WH2/A de la protéine WASP humaine (à savoir le fragment de 99 acides aminés délimité par les acides aminés situés aux positions 404 et 502 de la figure 1, encore désigné peptide SEQ ID NO 4), et celle codant pour l'épitope myc9E10 ont été amplifiées par PCR. L'épitope myc fusionné à la portion carboxy- terminale de la protéine sert d'étiquette moléculaire, permettant la détection de la protéine par des approches immunologiques sans avoir besoin d'un anticorps anti WASP. Cette séquence d'ADN a été introduit dans le vecteur pGEX2T (Pharmacia), en aval de la séquence codant pour la glutathione-S-transferase (GST), générant le plasmide WH2/A- pGEX2T. Le domaine GST a été choisi dans ce travail car il facilite la purification de la protéine recombinante, et il a été montré que ce domaine n'inhibe pas la capacité de polymériser l'actine de la protéine GST-VCA dérivée de N-WASP dans un test d'actine pyrène (Rohatgi et al., 1999). La Figure 3 montre l'organisation en domaines de GST- WH2. Cette protéine recombinante est composée de domaines GST et WH2/A, de 237 et
99 résidus, respectivement et d'un épitope myc9E10 de 9 résidus.
La purification et caractérisation de la protéine GST-WH2/A ont été effectuées de la manière suivante.
Des bactéries E. coli (souche BL21) ont été transformées avec le plasmide WH2/1- pGΕX2T. Les bactéries ont été cultivées dans du milieu LB standard contenant l'antibiotique ampicilline pour maintenir sous pression de sélection les bactéries comportant le plasmide. Les bactéries ont été cultivées en suspension à 37°C jusqu'à ce que la culture atteigne une densité optique de 0.8 à 600 nm. Ensuite, l'isopropylthio-β-D-galactoside (IPTG) a été ajouté au milieu à une concentration finale de 1 mM pour induire la production de la protéine. Après 2 heures, les bactéries ont été collectées par centrifugation et les culots ont été stockés à -80°C. Les culots ont été décongelés et ajoutés à du tampon d'extraction (solution saline tamponnée au phosphate pH 7.2, 200 NaCl, 2 mM EDTA (acide ethylènediamine tetra acide), contenant 1 μg/ml de chacun des inhibiteurs de protéase suivants, leupeptine, benzamidine, pepstatine, à un rapport de 1 gr de culot par 10 volumes de tampon d'extraction. La suspension a été soniquée jusqu'à ce que elle ne soit plus visqueuse. L'extrait a été centrifugé à 20.000 x g pendant 10 minutes à 4°C et le surnageant contenant la protéine GST-WH2/A a été conservé. La protéine GST-WH2/A a été purifiée à partir de l'extrait bactérien par chromatographie d'affinité sur résine couplée à la Glutathione (Pharmacia) et éluée avec 20 mM glutathione réduit selon les recommandations des fabricants. La purification a été confirmée par analyse de la GST-
WH2/A par electrophorese sur gel d'acrylamide. La présence de l'épitope myc dans la séquence GST-WH2/A a été confirmée par empreinte immunologique avec un anticorps dirigé contre cet épitope.
La protéine GST-WH2/A a été absorbée sur des billes latex de 500 nm (Polyscience
Inc, 400 Valley Road, Warrington Pa, USA) suivant les instructions des fabricants. Ces billes, ajoutées aux extraits préparés à partir de cellules, sont capables de polymériser l'actine de façon suffisante pour entraîner le mouvement de ces billes.
Adsorption de la protéine GST-WA sur des gouttes d'huile : une émulsion eau-huile est préparée de la façon suivante : 100 μl d'huile sont mélangés avec 900 μl de tampon borate
0.1 MpH = 8.5 (acide borique tamponné avec NaOH). La solution est soniquée (sonde) quelques secondes et l'on obtient une mousse blanche. La taille des gouttes d'huile est située entre 20μm et lμm. Dans un eppendorf 1.5ml, 20 μl de cette solution sont mélangés avec 100 μl de protéine GST-WH2/A susmentionnée (encore désignée GST-WA) (1 mg/ml dans du tampon borate). On laisse incuber cette solution à température ambiante pendant 12h
(overnight) sur un agitateur rotatif. Après incubation, la solution est centrifugée environ une minute à 5000 rpm avec une petite centrifugeuse de table. Les gouttes d'huile sont situées dans la partie haute de la solution. Une centrifugation trop forte et/ou trop prolongée induit la fusion des gouttes d'huile. Le bas de la solution (tampon uniquement) est prélevé avec une pipette et la partie haute de la solution est resuspendue dans du PB S (Phosphate Buffer
Saline). Les gouttes d'huile sont nettoyées au moins quatre fois de cette façon et finalement resuspendues dans 100 μl de PBS. 1 μl de cette solution est mélangé à 10 μl d'extraits HeLa.
Inhibition delà polymérisation d'actine induite par la protéine GST-WA : Des particules de 10 μm en polystyrène (Polysciences inc.) sont recouvertes en saturation avec la protéine
GST-WA selon le protocole du fournisseur. Les particules sont resuspendues à 1% solide dans du PBS (Phosphate Buffer Saline) et stockées sur glace. Pour tester l'indépendance du mécanisme de polymérisation de l'actine induit par GST-WA nous avons préparé trois solutions. Chaque échantillon contient 15 μl d'extraits HeLa (supplémentés avec de l'ATP, de la créatine phosphate et de l'actine marquée à la rhodamine), 0,5 μl de particules GST-WA et 1,5 μl de PBS (A), ou 1,5 μl de protéine GST-WA à 1 mg/ml (B) ou 1,5 μl de protéine GST-PRO (PRO correspondant au fragment délimité par les acides aminés situés aux positions 235 à 584 de la protéine ActA de Listeria monocytogenes) à 1 mg/ml (C). 6 μl du mélange final de ces trois solutions sont scellés entre lame et lamelle. Nous avons observé la fluorescence (actine rhodamine) autour des particules pendant trente minutes et mesuré l'intensité de fluorecence sur une population de quarante billes à l'aide d'un microscope (Leica) et d'une caméra digitale linéaire (Micromax Princeton instrument). La moyenne des intensité M (unité arbitraire) est de 95000 ± 13000 pour l'échantillon A (contrôle positif). Pour l'échantillon B, M = 0 ±1000, la polymérisation de l'actine à la surface des particules est inhibée par l'ajout de GST-WA en solution. Pour l'échantillon C, M = 4000 ± 1500, l'ajout en solution de la protéine GST-PRO n'inhibe pas la polymérisation de l'actine à la surface des particules. L'intensité est plus faible que dans le cas A (PBS), ceci est probablement dû à l'activité induite par GST-PRO dans les extraits qui se traduit par une très forte consommation de l'actine rhodamine. Ces résultats montrent que le mécanisme de polymérisation de l'actine induit par la protéine GST-WA est indépendant du mécanisme GST-PRO de polymérisation de l'actine.
B) Applications
1) Les applications des billes GST-WH2/A et de l'essai de polymérisation de l'actine cellulaire
Le mouvement cellulaire dépendant du cytosquelette d'actine intervient lors du développement embryonnaire, de la réponse immunitaire et de la réparation de blessures. Toutefois, le mécanisme moléculaire par lequel le cytosquelette participe dans les processus physiologiques ou physio-pathologiques demeure mal compris. Ceci est dû au fait que peu de systèmes expérimentaux in vitro sont disponibles pour étudier ces processus.
La présente invention propose un essai in vitro pour tester la polymérisation de l'actine à la surface de billes, et montre que ce système reproduit les caractéristiques essentielles de la polymérisation de l'actine dans les cellules de l'Homme. Par exemple, ces billes recrutent des protéines importantes pour la polymérisation de l'actine dans les cellules, tels que le complexe Arp2/3 et la cofiline. De plus, les composants recrutés à la surface des billes sont des cibles pour les voies de signalisation impliquant des tyrosine kinases. Grâce à ce système in vitro, il est maintenant possible d'étudier les conditions nécessaires à la polymérisation de l'actine dans la cellule, un processus qui jusqu'à présent n'était pas accessible à une manipulation expérimentale directe. a) Procédé de criblage de composants anti-métastatiques
Actuellement, des drogues anti-métastatiques ayant comme cible le cytosquelette d'actine n'ont pas pu être développées, puis que des tests simples permettant de cribler des banques de produits chimiques n'étaient pas disponibles. Les billes de la présente invention " miment " le cytosquelette dynamique de cellules en mouvement et constituent donc un essai idéal pour rechercher des molécules qui affectant la dynamique du cytosquelette. Les produits chimiques ainsi identifiés serviront ensuite pour développer des médicaments destinés au traitement des cancers métastatiques. b) Procédé de criblage d'antibiotiques anti-parasites
Le système des billes décrit ici, repose sur des protéines humaines qui sont nécessaires à la polymérisation de l'actine dans les cellules humaines. Toutefois, ces protéines sont conservées durant l'évolution, de la levure à l'Homme, en passant par les , amibes. Malgré la conservation de leur fonction de base, ces protéines présentent également des divergences au niveau de leur séquence primaire, suggérant des différences fonctionnelles notables. De façon analogue aux cancers métastatiques, le cytosquelette d'actine des parasites est rarement la cible des drogues utilisées dans le traitement des parasitoses, malgré le rôle important qu'il joue lors du cycle infectieux de nombreux parasites (les amibes par exemple). Il est concevable, que des drogues qui n'affectent le cytosquelette d'actine humain que lorsqu'elles sont utilisées à forte concentration, affectent celui des parasites à des concentrations beaucoup plus faibles. C'est pourquoi, grâce à la nature universelle de l'évolution du cytosquelette d'actine, le système des billes de la présente invention permet également de rechercher des drogues utilisables dans le traitement de parasitoses. c) Détection d'effets secondaires de médicaments
Dans un autre test, les billes servent à vérifier et à confirmer que des médicaments n'ont pas d'effets secondaires sur la polymérisation d'actine cellulaire. Ainsi il est possible d'éviter les conséquences désastreuses de traitements médicamenteux qui affectent de façon non intentionnelle la migration cellulaire pendant le développement de l'embryon chez la femme enceinte. Par exemple, après quelles années d'utilisation, il a été montré que les propriétés tératogènes de l'acide valproïque, une drogue anti-épileptique, sont dues à ses effets secondaires sur le cytosquelette d'actine.
2) procédure pour cribler des molécules affectant la polymérisation d'actine cellulaire
Les essais de criblage les plus effectifs pour tester des drogues nouvelles ont les propriétés suivantes: ils sont simples, bon marché et rapides. Le test de polymérisation d'actine cellulaire de la présente invention a toutes ces caractéristiques. Les billes de 200- 500 nm peuvent être produites en absorbant la protéine recombinante GST-WH2/A purifiée à leur surface. Une fois préparées, les billes sont stables pour plusieurs mois à 4°C. Les billes sont ensuite ajoutées à des extraits préparés à partir de surnageants de cellules en culture lysées. Le volume d'extrait nécessaire pour une expérience est de l'ordre de quelques microlitres, réduisant le coût de l'expérience. Ces extraits ont l'avantage de pouvoir être produits en quantité importante et stockés à long terme, à -80°C. Avant l'addition des billes, un dérivé fluorescent de l'actine (l'actine-rhodamine commerciale) est ajouté à l'extrait afin de visualiser la polymérisation de l'actine par microscopie à épifluorescence. La polymérisation de l'actine est observée 15 min après l'addition des billes, se traduisant par une accumulation de l'actine fluorescente autour des billes. En partant d'un stock de réactifs standardisés, l'expérience prend moins de 30 min et une personne est capable de traiter plusieurs échantillons en parallèle. Cette procédure peut être automatisée, permettant le criblage rapide d'un nombre important d'échantillons. Afin d'identifier des composants actifs, il est nécessaire de tester les produits chimiques à des concentrations variables. Les inventeurs montré que les quantités faibles des solvants servant à dissoudre ces produits (eau, éthanol, dimethylsulphoxide) ne perturbent pas le système de l'invention. De plus, cet essai de criblage a été validé en montrant qu'il est sensible aux drogues inhibant la polymérisation de l'actine actuellement connues, telles que la latrunculine et la cytochalasine D.

Claims

REVENDICATIONS
1. Utilisation : - de fragments peptidiques de protéines de la famille WASP chez les cellules eucaryotes, notamment les cellules humaines ou d'autres mammifères, ou les cellules d'insectes, ou de micro-organismes telles que les levures, lesdits fragments peptidiques ayant la propriété des protéines de la famille WASP de polymériser l'actine en induisant la motilité cellulaire, - ou de séquences peptidiques dérivées des fragments peptidiques susmentionnés de protéines de la famille WASP, notamment par substitution d'un ou plusieurs acides aminés de ces fragments, lesdites séquences dérivées ayant la propriété susmentionnée des protéines de la famille WASP et desdits fragments de ces dernières, pour la préparation de réactifs utilisables dans le cadre de la mise en œuvre d'un procédé de détection ou de criblage de molécules ayant un effet d'inhibition ou de stimulation de la formation du cytosquelette d'actine, et donc un effet d'inhibition ou de stimulation de la motilité cellulaire.
2. Utilisation selon la revendication 1, de fragments peptidiques choisis parmi les fragments :
- de la protéine WASP humaine, ou d'autres mammifères, notamment la protéine WASP bovine ou murine,
- de la protéine N-WASP humaine, ou d'autres mammifères, notamment la protéine N-WASP bovine, ou de rat, - des protéines de la sous-famille Scar, telle que la protéine Scarl/WAVE de
Dictyostellium discoideum, ou de Caenorhabditis elegans, ou de Drosophila melanogaster, de souris, ou humaine,
- des protéines de la sous-famille Las des micro-organismes, notamment des levures, telle que la protéine Lasl7/Beel de Saccharomyces cerevisiae, ou la protéine homologue WASP (Wsplp) de Schizosaccharomyces pombe.
3. Utilisation selon la revendication 1 ou 2, caractérisée en ce que les fragments peptidiques sont choisis parmi ceux comprenant : - le domaine d'homologie avec la verproline contenu dans les protéines de la famille WASP, ou dans une protéine dérivée de ces dernières, ou au moins une des deux séquences homologues à la verproline lorsque lesdites protéines de la famille WASP contiennent deux de ces séquences, ou une séquence peptidique dérivée du domaine susmentionné, notamment par substitution, addition ou suppression d'un ou plusieurs acides aminés, et conservant la propriété de ce domaine de se lier à l'actine,
- et le domaine d'homologie avec la cofiline contenu dans les protéines de la famille WASP ou dans une protéine dérivée de ces dernières, ou une séquence peptidique dérivée du domaine susmentionné, notamment par substitution, addition ou suppression d'un ou plusieurs acides aminés, et conservant la propriété de ce domaine d'intervenir dans le cadre de la polymérisation de l'actine.
4. Utilisation selon l'une des revendications 1 à 3, de fragments peptidiques des protéines de la famille WASP d'origine humaine, choisis parmi les suivants : - les fragments de la protéine WASP humaine, eux-mêmes choisis parmi :
* ceux comprenant :
. le domaine d'homologie avec la verproline délimité par les acides aminés situés aux positions 430 et 446 de la séquence peptidique SEQ ID NO 2 de la protéine WASP humaine représentée sur la figure 1 , ou une séquence peptidique dérivée du domaine susmentionné telle que définie dans la revendication 3,
. et le domaine d'homologie avec la cofiline délimité par les acides aminés situés aux positions 469 et 487 de la séquence peptidique SEQ ID NO 2 de la protéine WASP humaine représentée sur la figure 1, ou une séquence peptidique dérivée du domaine susmentionné telle que définie dans la revendication 3, * les fragments dont l'acide aminé N-terminal correspond à celui situé à l'une des positions 404 à 430 de la figure 1, et l'acide aminé C-terminal correspond à celui situé à l'une des positions 487 à 502 de la figure 1,
* le fragment de 99 acides aminés délimité par les acides aminés situés aux positions 404 et 502 de la figure 1, à savoir le peptide SEQ ID NO 4 suivant : Pro Ser Ser Gly Asn Gly Pro Ala Pro Pro Pro Leu Pro Pro Ala Leu
Val Pro Ala Gly Gly Leu Ala Pro Gly Gly Gly Arg Gly Ala Leu Leu
Asp Gin Ile Arg Gin Gly Ile Gin Leu Asn Lys Thr Pro Gly Ala Pro
Glu Ser Ser Ala Leu Gin Pro Pro Pro Gin Ser Ser Glu Gly Leu Val
Gly Ala Leu Met His Val Met Gin Lys Arg Ser Arg Ala Ile His Ser Ser Asp Glu Gly Glu Asp Gin Ala Gly Asp Glu Asp Glu Asp Asp Glu Trp Asp Asp
* le fragment de 84 acides aminés délimité par les acides aminés situés aux positions 404 et 487 de la figure 1, à savoir le peptide SEQ ID NO 6 suivant : Pro Ser Ser Gly Asn Gly Pro Ala Pro Pro Pro Leu Pro Pro Ala Leu
Val Pro Ala Gly Gly Leu Ala Pro Gly Gly Gly Arg Gly Ala Leu Leu
Asp Gin Ile Arg Gin Gly Ile Gin Leu Asn Lys Thr Pro Gly Ala Pro
Glu Ser Ser Ala Leu Gin Pro Pro Pro Gin Ser Ser Glu Gly Leu Val
Gly Ala Leu Met His Val Met Gin Lys Arg Ser Arg Ala Ile His Ser Ser Asp Glu Gly
* le fragment de 73 acides aminés délimité par les acides aminés situés aux positions 430 et 502 de la figure 1, à savoir le peptide SEQ ID NO 8 suivant :
Gly Arg Gly Ala Leu Leu Asp Gin Ile Arg Gin Gly Ile Gin Leu Asn Lys Thr Pro Gly Ala Pro Glu Ser Ser Ala Leu Gin Pro Pro Pro Gin Ser Ser Glu Gly Leu Val Gly Ala Leu Met His Val Met Gin Lys Arg Ser Arg Ala Ile His Ser Ser Asp Glu Gly Glu Asp Gin Ala Gly Asp Glu Asp Glu Asp Asp Glu Trp Asp Asp
* le fragment de 58 acides aminés délimité par les acides aminés situés aux positions 430 et 487 de la figure 1, à savoir le peptide SEQ ID NO 10 suivant : Gly Arg Gly Ala Leu Leu Asp Gin Ile Arg Gin Gly Ile Gin Leu Asn
Lys Thr Pro Gly Ala Pro Glu Ser Ser Ala Leu Gin Pro Pro Pro Gin Ser Ser Glu Gly Leu Val Gly Ala Leu Met His Val Met Gin Lys Arg Ser Arg Ala Ile His Ser Ser Asp Glu Gly
- les fragments de la protéine N-WASP humaine, eux-mêmes choisis parmi : * ceux comprenant :
. la séquence homologue à la verproline délimitée par les acides aminés situés aux positions 405 et 421 de la séquence peptidique SEQ ID NO 12 de la protéine N- WASP humaine représentée sur la figure 2, ou une séquence peptidique dérivée du domaine susmentionné telle que définie dans la revendication 3, . et/ou la séquence homologue à la verproline délimitée par les acides aminés situés aux positions 433 et 449 de la séquence peptidique SEQ ID NO 12 de la protéine N-WASP humaine représentée sur la figure 2, ou une séquence peptidique dérivée du domaine susmentionné telle que définie dans la revendication 3,
. et le domaine d'homologie avec la cofiline contenu dans la protéine N- WASP susmentionnée, à savoir le domaine délimité par les acides aminés situés aux positions 470 et 488 de la séquence peptidique SEQ ID NO 12 de la protéine N-WASP humaine représentée sur la figure 2, ou une séquence peptidique dérivée du domaine susmentionné telle que définie dans la revendication 3, * les fragments dont l'acide aminé N-terminal correspond à celui situé à l'une des positions 392 à 433 de la figure 2, et l'acide aminé C-terminal correspond à celui situé à l'une des positions 488 à 505 de la figure 2,
* le fragment de 114 acides aminés délimité par les acides aminés situés aux positions 392 et 505 de la figure 2, à savoir le peptide SEQ ID NO 14 suivant :
Pro Ser Asp Gly Asp His Gin Val Pro Thr Thr Ala Gly Asn Lys Ala
Ala Leu Leu Asp Gin Ile Arg Glu Gly Ala Gin Leu Lys Lys Val Glu
Gin Asn Ser Arg Pro Val Ser Cys Ser Gly Arg Asp Ala Leu Leu Asp
Gin Ile Arg Gin Gly Ile Gin Leu Lys Ser Val Ala Asp Gly Gin Glu Ser Thr Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ser Gly Ile Val Gly Ala Leu
Met Glu Val Met Gin Lys Arg Ser Lys Ala Ile His Ser Ser Asp Glu
Asp Glu Asp Glu Asp Asp Glu Glu Asp Phe Glu Asp Asp Asp Glu Trp Glu Asp
* le fragment de 97 acides aminés délimité par les acides aminés situés aux positions 392 et 488 de la figure 2, à savoir le peptide SEQ ID NO 16 suivant :
Pro Ser Asp Gly Asp His Gin Val Pro Thr Thr Ala Gly Asn Lys Ala
Ala Leu Leu Asp Gin Ile Arg Glu Gly Ala Gin Leu Lys Lys Val Glu
Gin Asn Ser Arg Pro Val Ser Cys Ser Gly Arg Asp Ala Leu Leu Asp
Gin Ile Arg Gin Gly Ile Gin Leu Lys Ser Val Ala Asp Gly Gin Glu Ser Thr Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ser Gly Ile Val Gly Ala Leu
Met Glu Val Met Gin Lys Arg Ser Lys Ala Ile His Ser Ser Asp Glu Asp
* le fragment de 101 acides aminés délimité par les acides aminés situés aux positions 405 et 505 de la figure 2, à savoir le peptide SEQ ID NO 18 suivant : Asn Lys Ala Ala Leu Leu Asp Gin Ile Arg Glu Gly Ala Gin Leu Lys
Lys Val Glu Gin Asn Ser Arg Pro Val Ser Cys Ser Gly Arg Asp Ala
Leu Leu Asp Gin Ile Arg Gin Gly Ile Gin Leu Lys Ser Val Ala Asp
Gly Gin Glu Ser Thr Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ser Gly Ile Val
Gly Ala Leu Met Glu Val Met Gin Lys Arg Ser Lys Ala Ile His Ser Ser Asp Glu Asp Glu Asp Glu Asp Asp Glu Glu Asp Phe Glu Asp Asp Asp Glu Trp Glu Asp
* le fragment de 84 acides aminés délimité par les acides aminés situés aux positions 405 et 488 de la figure 2, à savoir le peptide SEQ ID NO 20 suivant :
Asn Lys Ala Ala Leu Leu Asp Gin Ile Arg Glu Gly Ala Gin Leu Lys Lys Val Glu Gin Asn Ser Arg Pro Val Ser Cys Ser Gly Arg Asp Ala
Leu Leu Asp Gin Ile Arg Gin Gly Ile Gin Leu Lys Ser Val Ala Asp
Gly Gin Glu Ser Thr Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ser Gly Ile Val
Gly Ala Leu Met Glu Val Met Gin Lys Arg Ser Lys Ala Ile His Ser Ser Asp Glu Asp * le fragment de 73 acides aminés délimité par les acides aminés situés aux positions 433 et 505 de la figure 2, à savoir le peptide SEQ ID NO 22 suivant :
Gly Arg Asp Ala Leu Leu Asp Gin Ile Arg Gin Gly Ile Gin Leu Lys
Ser Val Ala Asp Gly Gin Glu Ser Thr Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr
Ser Gly Ile Val Gly Ala Leu Met Glu Val Met Gin Lys Arg Ser Lys Ala Ile His Ser Ser Asp Glu Asp Glu Asp Glu Asp Asp Glu Glu Asp
Phe Glu Asp Asp Asp Glu Trp Glu Asp * le fragment de 56 acides aminés délimité par les acides aminés situés aux positions 433 et 488 de la figure 2, à savoir le peptide SEQ ID NO 24 suivant :
Gly Arg Asp Ala Leu Leu Asp Gin Ile Arg Gin Gly Ile Gin Leu Lys Ser Val Ala Asp Gly Gin Glu Ser Thr Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ser Gly Ile Val Gly Ala Leu Met Glu Val Met Gin Lys Arg Ser Lys
Ala Ile His Ser Ser Asp Glu Asp
- les fragments de la protéine Scarl humaine, eux-mêmes choisis parmi :
* ceux comprenant :
. le domaine d'homologie avec la verproline délimité par les acides aminés situés aux positions 497 et 513 de la séquence peptidique SEQ ID NO 26 de la protéine
Scarl humaine représentée sur la figure 3, ou une séquence peptidique dérivée du domaine susmentionné telle que définie dans la revendication 3,
. et le domaine d'homologie avec la cofiline délimité par les acides aminés situés aux positions 531 et 546 de la séquence peptidique SEQ ID NO 26 de la protéine Scarl humaine représentée sur la figure 3, ou une séquence peptidique dérivée du domaine susmentionné telle que définie dans la revendication 3,
* les fragments dont l'acide aminé N-terminal correspond à celui situé à l'une des positions 443 à 497 de la figure 3, et l'acide aminé C-terminal correspond à celui situé à l'une des positions 546 à 559 de la figure 3, * le fragment de 117 acides aminés délimité par les acides aminés situés aux positions 443 et 559 de la figure 3, à savoir le peptide SEQ ID NO 28 suivant :
Val Thr Val Thr Ala Leu Ala His Pro Pro Ser Gly Leu His Pro Thr
Pro Ser Thr Ala Pro Gly Pro His Val Pro Leu Met Pro Pro Ser Pro
Pro Ser Gin Val Ile Pro Ala Ser Glu Pro Lys Arg His Pro Ser Thr Leu Pro Val Ile Ser Asp Ala Arg Ser Val Leu Leu Glu Ala Ile Arg
Lys Gly Ile Gin Leu Arg Lys Val Glu Glu Gin Arg Glu Gin Glu Ala
Lys His Glu Arg Ile Glu Asn Asp Val Ala Thr Ile Leu Ser Arg Arg
Ile Ala Val Glu Tyr Ser Asp Ser Glu Asp Asp Ser Glu Phe Asp Glu
Val Asp Trp Leu Glu * le fragment de 104 acides aminés délimité par les acides aminés situés aux positions 443 et 546 de la figure 3, à savoir le peptide SEQ ID NO 30 suivant :
Val Thr Val Thr Ala Leu Ala His Pro Pro Ser Gly Leu His Pro Thr
Pro Ser Thr Ala Pro Gly Pro His Val Pro Leu Met Pro Pro Ser Pro
Pro Ser Gin Val Ile Pro Ala Ser Glu Pro Lys Arg His Pro Ser Thr Leu Pro Val Ile Ser Asp Ala Arg Ser Val Leu Leu Glu Ala Ile Arg
Lys Gly Ile Gin Leu Arg Lys Val Glu Glu Gin Arg Glu Gin Glu Ala
Lys His Glu Arg Ile Glu Asn Asp Val Ala Thr Ile Leu Ser Arg Arg
Ile Ala Val Glu Tyr Ser Asp Ser
* le fragment de 63 acides aminés délimité par les acides aminés situés aux positions 497 et 559 de la figure 3, à savoir le peptide SEQ ID NO 32 suivant : Ala Arg Ser Val Leu Leu Glu Ala Ile Arg Lys Gly Ile Gin Leu Arg
Lys Val Glu Glu Gin Arg Glu Gin Glu Ala Lys His Glu Arg Ile Glu
Asn Asp Val Ala Thr Ile Leu Ser Arg Arg Ile Ala Val Glu Tyr Ser
Asp Ser Glu Asp Asp Ser Glu Phe Asp Glu Val Asp Trp Leu Glu * le fragment de 50 acides aminés délimité par les acides aminés situés aux positions 497 et 546 de la figure 3, à savoir le peptide SEQ ID NO 34 suivant :
Ala Arg Ser Val Leu Leu Glu Ala Ile Arg Lys Gly Ile Gin Leu Arg Lys Val Glu Glu Gin Arg Glu Gin Glu Ala Lys His Glu Arg Ile Glu Asn Asp Val Ala Thr Ile Leu Ser Arg Arg Ile Ala Val Glu Tyr Ser Asp Ser
- ou les séquences peptidiques dérivées des fragments peptidiques susmentionnés, notamment par substitution, addition ou suppression d'un ou plusieurs acides aminés de ces fragments, lesdites séquences dérivées ayant la propriété définies dans la revendication 1 des protéines de la famille WASP et desdits fragments de ces dernières.
5. Utilisation selon l'une des revendications 1 à 3, de fragments peptidiques des protéines de la famille WASP d'origine non humaine, choisis parmi les suivants :
• les fragments des protéines de la famille WASP de mammifères non humains, tels que :
- les fragment de la protéine WASP murine, eux-mêmes choisis parmi : * ceux comprenant :
. le domaine d'homologie avec la verproline délimité par les acides aminés situés aux positions 448 et 465 de la séquence peptidique SEQ ID NO 36 de la protéine WASP murine représentée sur la figure 4, ou une séquence peptidique dérivée du domaine susmentionné telle que définie dans la revendication 3, . et le domaine d'homologie avec la cofiline délimité par les acides aminés situés aux positions 487 et 505 de la séquence peptidique SEQ ID NO 36 de la protéine WASP murine représentée sur la figure 4, ou une séquence peptidique dérivée du domaine susmentionné telle que définie dans la revendication 3,
* les fragments dont l'acide aminé N-terminal correspond à celui situé à l'une des positions 420 à 448 de la figure 4, et l'acide aminé C-terminal correspond à celui situé à l'une des positions 505 à 520 de la figure 4,
* le fragment de 101 acides aminés délimité par les acides aminés situés aux positions 420 et 520 de la figure 4, à savoir le peptide SEQ ID NO 38 suivant :
Pro Pro Pro Cys Pro Gly Ser Gly Pro Ala Pro Pro Pro Leu Pro Pro Thr Pro Val Ser Gly Gly Ser Pro Ala Pro Gly Gly Gly Arg Gly Ala
Leu Leu Asp Gin Ile Arg Gin Gly Ile Gin Leu Asn Lys Thr Pro Gly
Ala Leu Glu Asn Ser Val Gin Gin Pro Pro Ala Gin Gin Ser Glu Gly Leu Val Gly Ala Leu Met His Val Met Gin Lys Arg Ser Arg Val Ile His Ser Ser Asp Glu Gly Glu Asp Gin Thr Gly Glu Asp Glu Glu Asp Asp Glu Trp Asp Asp
* le fragment de 86 acides aminés délimité par les acides aminés situés aux positions 420 et 505 de la figure 4, à savoir le peptide SEQ ID NO 40 suivant :
Pro Pro Pro Cys Pro Gly Ser Gly Pro Ala Pro Pro Pro Leu Pro Pro
Thr Pro Val Ser Gly Gly Ser Pro Ala Pro Gly Gly Gly Arg Gly Ala
Leu Leu Asp Gin Ile Arg Gin Gly Ile Gin Leu Asn Lys Thr Pro Gly
Ala Leu Glu Asn Ser Val Gin Gin Pro Pro Ala Gin Gin Ser Glu Gly Leu Val Gly Ala Leu Met His Val Met Gin Lys Arg Ser Arg Val Ile
His Ser Ser Asp Glu Gly
* le fragment de 73 acides aminés délimité par les acides aminés situés aux ' positions 448 et 520 de la figure 4, à savoir le peptide SEQ ID NO 42 suivant :
Gly Arg Gly Ala Leu Leu Asp Gin Ile Arg Gin Gly Ile Gin Leu Asn Lys Thr Pro Gly Ala Leu Glu Asn Ser Val Gin Gin Pro Pro Ala Gin Gin Ser Glu Gly Leu Val Gly Ala Leu Met His Val Met Gin Lys Arg Ser Arg Val Ile His Ser Ser Asp Glu Gly Glu Asp Gin Thr Gly Glu Asp Glu Glu Asp Asp Glu Trp Asp Asp
* le fragment de 58 acides aminés délimité par les acides aminés situés aux positions 448 et 505 de la figure 4, à savoir le peptide SEQ ID NO 44 suivant :
Gly Arg Gly Ala Leu Leu Asp Gin Ile Arg Gin Gly Ile Gin Leu Asn Lys Thr Pro Gly Ala Leu Glu Asn Ser Val Gin Gin Pro Pro Ala Gin Gin Ser Glu Gly Leu Val Gly Ala Leu Met His Val Met Gin Lys Arg Ser Arg Val Ile His Ser Ser Asp Glu Gly - les fragment de la protéine N-WASP de rat, eux-mêmes choisis parmi :
* ceux comprenant :
. la séquence homologue à la verproline délimitée par les acides aminés situés aux positions 401 et 417 de la séquence peptidique SEQ ID NO 46 de la protéine N-WASP de rat représentée sur la figure 5, ou une séquence peptidique dérivée du domaine susmentionné telle que définie dans la revendication 3,
. et/ou la séquence homologue à la verproline délimitée par les acides aminés situés aux positions 429 et 444 de la séquence peptidique SEQ ID NO 46 de la protéine N-WASP de rat représentée sur la figure 5, ou une séquence peptidique dérivée du domaine susmentionné telle que définie dans la revendication 3, . et le domaine d'homologie avec la cofiline contenu dans la protéine N-
WASP susmentionnée, à savoir le domaine délimité par les acides aminés situés aux positions 466 et 484 de la séquence peptidique SEQ ID NO 46 de la protéine N-WASP de rat représentée sur la figure 5, ou une séquence peptidique dérivée du domaine susmentionné telle que définie dans la revendication 3, * les fragments dont l'acide aminé N-terminal correspond à celui situé à l'une des positions 401 à 429 de la figure 5, et l'acide aminé C-terminal correspond à celui situé à l'une des positions 484 à 501 de la figure 5,
* le fragment de 101 acides aminés délimité par les acides aminés situés aux positions 401 et 501 de la figure 5, à savoir le peptide SEQ ID NO 48 suivant :
Asn Lys Ala Ala Leu Leu Asp Gin Ile Arg Glu Gly Ala Gin Leu Lys
Lys Val Glu Gin Asn Ser Arg Pro Val Ser Cys Ser Gly Arg Asp Ala
Leu Leu Asp Gin Ile Arg Gin Gly Ile Gin Leu Lys Ser Val Ser Asp
Gly Gin Glu Ser Thr Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ser Gly Ile Val
Gly Ala Leu Met Glu Val Met Gin Lys Arg Ser Lys Ala Ile His Ser
Ser Asp Glu Asp Glu Asp Asp Asp Asp Glu Glu Asp Phe Gin Asp Asp
Asp Glu Trp Glu Asp
* le fragment de 84 acides aminés délimité par les acides aminés situés aux positions 401 et 484 de la figure 5, à savoir le peptide SEQ ID NO 50 suivant : Asn Lys Ala Ala Leu Leu Asp Gin Ile Arg Glu Gly Ala Gin Leu Lys
Lys Val Glu Gin Asn Ser Arg Pro Val Ser Cys Ser Gly Arg Asp Ala
Leu Leu Asp Gin Ile Arg Gin Gly Ile Gin Leu Lys Ser Val Ser Asp
Gly Gin Glu Ser Thr Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ser Gly Ile Val
Gly Ala Leu Met Glu Val Met Gin Lys Arg Ser Lys Ala Ile His Ser Ser Asp Glu Asp
* le fragment de 73 acides aminés délimité par les acides aminés situés aux positions 429 et 501 de la figure 5, à savoir le peptide SEQ ID NO 52 suivant :
Gly Arg Asp Ala Leu Leu Asp Gin Ile Arg Gin Gly Ile Gin Leu Lys Ser Val Ser Asp Gly Gin Glu Ser Thr Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ser Gly Ile Val Gly Ala Leu Met Glu Val Met Gin Lys Arg Ser Lys Ala Ile His Ser Ser Asp Glu Asp Glu Asp Asp Asp Asp Glu Glu Asp Phe Gin Asp Asp Asp Glu Trp Glu Asp
* le fragment de 56 acides aminés délimité par les acides aminés situés aux positions 429 et 484 de la figure 5, à savoir le peptide SEQ ID NO 54 suivant : Gly Arg Asp Ala Leu Leu Asp Gin Ile Arg Gin Gly Ile Gin Leu Lys
Ser Val Ser Asp Gly Gin Glu Ser Thr Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ser Gly Ile Val Gly Ala Leu Met Glu Val Met Gin Lys Arg Ser Lys Ala Ile His Ser Ser Asp Glu Asp
- les fragment de la protéine N-WASP bovine, eux-mêmes choisis parmi : * ceux comprenant :
. le domaine d'homologie avec la verproline délimité par les acides aminés situés aux positions 405 et 421 de la séquence peptidique SEQ ID NO 56 de la protéine
N-WASP bovine représentée sur la figure 6, ou une séquence peptidique dérivée du domaine susmentionné telle que définie dans la revendication 3 , . et/ou le domaine d'homologie avec la verproline délimité par les acides aminés situés aux positions 433 et 488 de la séquence peptidique SEQ ID NO 56 de la protéine N-WASP bovine représentée sur la figure 6, ou une séquence peptidique dérivée du domaine susmentionné telle que définie dans la revendication 3,
. et le domaine d'homologie avec la cofiline délimité par les acides aminés situés aux positions 470 et 488 de la séquence peptidique SEQ ID NO 56 de la protéine N-WASP bovine représentée sur la figure 6, ou une séquence peptidique dérivée du domaine susmentionné telle que définie dans la revendication 3,
* les fragments dont l'acide aminé N-terminal correspond à celui situé à l'une des positions 405 à 433 de la figure 6, et l'acide aminé C-terminal correspond à celui situé à l'une des positions 488 à 505 de la figure 6, * le fragment de 101 acides aminés délimité par les acides aminés situés aux positions 405 et 505 de la figure 6, à savoir le peptide SEQ ID NO 58 suivant :
Ser Lys Ala Ala Leu Leu Asp Gin Ile Arg Glu Gly Ala Gin Leu Lys
Lys Val Glu Gin Asn Ser Arg Pro Val Ser Cys Ser Gly Arg Asp Ala
Leu Leu Asp Gin Ile Arg Gin Gly Ile Gin Leu Lys Ser Val Thr Asp Ala Pro Glu Ser Thr Pro Pro Ala Pro Ala Pro Thr Ser Gly Ile Val
Gly Ala Leu Met Glu Val Met Gin Lys Arg Ser Lys Ala Ile His Ser
Ser Asp Glu Asp Glu Asp Glu Asp Asp Asp Glu Asp Phe Glu Asp Asp
Asp Glu Trp Glu Asp
* le fragment de 84 acides aminés délimité par les acides aminés situés aux positions 405 et 488 de la figure 6, à savoir le peptide SEQ ID NO 60 suivant :
Ser Lys Ala Ala Leu Leu Asp Gin Ile Arg Glu Gly Ala Gin Leu Lys
Lys Val Glu Gin Asn Ser Arg Pro Val Ser Cys Ser Gly Arg Asp Ala
Leu Leu Asp Gin Ile Arg Gin Gly Ile Gin Leu Lys Ser Val Thr Asp
Ala Pro Glu Ser Thr Pro Pro Ala Pro Ala Pro Thr Ser Gly Ile Val Gly Ala Leu Met Glu Val Met Gin Lys Arg Ser Lys Ala Ile His Ser Ser Asp Glu Asp
* le fragment de 73 acides aminés délimité par les acides aminés situés aux positions 433 et 488 de la figure 6, à savoir le peptide SEQ ID NO 62 suivant :
Gly Arg Asp Ala Leu Leu Asp Gin Ile Arg Gin Gly Ile Gin Leu Lys Ser Val Thr Asp Ala Pro Glu Ser Thr Pro Pro Ala Pro Ala Pro Thr Ser Gly Ile Val Gly Ala Leu Met Glu Val Met Gin Lys Arg Ser Lys Ala Ile His Ser Ser Asp Glu Asp Glu Asp Glu Asp Asp Asp Glu Asp Phe Glu Asp Asp Asp Glu Trp Glu Asp
* le fragment de 56 acides aminés délimité par les acides aminés situés aux positions 433 et 488 de la figure 6, à savoir le peptide SEQ ID NO 64 suivant :
Gly Arg Asp Ala Leu Leu Asp Gin Ile Arg Gin Gly Ile Gin Leu Lys
Ser Val Thr Asp Ala Pro Glu Ser Thr Pro Pro Ala Pro Ala Pro Thr
Ser Gly Ile Val Gly Ala Leu Met Glu Val Met Gin Lys Arg Ser Lys Ala Ile His Ser Ser Asp Glu Asp • les fragments des protéines de la famille WASP de micro-organismes, tels que : - les fragment de la protéine Las 17 de Saccharomyces cerevisiae, eux-mêmes choisis parmi :
* ceux comprenant :
. le domaine d'homologie avec la verproline délimité par les acides aminés situés aux positions 447 et 466 de la séquence peptidique SEQ ID NO 66 de la protéine
Las 17 représentée sur la figure 7, ou une séquence peptidique dérivée du domaine susmentionné telle que définie dans la revendication 3,
. et le domaine d'homologie avec la cofiline délimité par les acides aminés situés aux positions 607 et 624 de la séquence peptidique SEQ ID NO 66 de la protéine Las 17 représentée sur la figure 7, ou une séquence peptidique dérivée du domaine susmentionné telle que définie dans la revendication 3,
* les fragments dont l'acide aminé N-terminal correspond à celui situé à l'une des positions 422 à 447 de la figure 7, et l'acide aminé C-terminal correspond à celui situé à l'une des positions 624 à 633 de la figure 7, * le fragment de 212 acides aminés délimité par les acides aminés situés aux positions 422 et 633 de la figure 7, à savoir le peptide SEQ ID NO 68 suivant :
Ser Asn Met Ser Ser Pro Pro Pro Pro Pro Val Thr Thr Phe Asn Thr
Leu Thr Pro Gin Met Thr Ala Ala Thr Gly Gin Pro Ala Val Pro Leu
Pro Gin Asn Thr Gin Ala Pro Ser Gin Ala Thr Asn Val Pro Val Ala Pro Pro Pro Pro Pro Ala Ser Leu Gly Gin Ser Gin Ile Pro Gin Ser
Ala Pro Ser Ala Pro Ile Pro Pro Thr Leu Pro Ser Thr Thr Ser Ala
Ala Pro Pro Pro Pro Pro Ala Phe Leu Thr Gin Gin Pro Gin Ser Gly
Gly Ala Pro Ala Pro Pro Pro Pro Pro Gin Met Pro Ala Thr Ser Thr
Ser Gly Gly Gly Ser Phe Ala Glu Thr Thr Gly Asp Ala Gly Arg Asp Ala Leu Leu Ala Ser Ile Arg Gly Ala Gly Gly Ile Gly Ala Leu Arg
Lys Val Asp Lys Ser Gin Leu Asp Lys Pro Ser Val Leu Leu Gin Glu
Ala Arg Gly Glu Ser Ala Ser Pro Pro Ala Ala Ala Gly Asn Gly Gly
Thr Pro Gly Gly Pro Pro Ala Ser Leu Ala Asp Ala ' Leu Ala Ala Ala
Leu Asn Lys Arg Lys Thr Lys Val Gly Ala His Asp Asp Met Asp Asn Gly Asp Asp Trp
* le fragment de 203 acides aminés délimité par les acides aminés situés aux positions 422 et 624 de la figure 7, à savoir le peptide SEQ ID NO 70 suivant :
Ser Asn Met Ser Ser Pro Pro Pro Pro Pro Val Thr Thr Phe Asn Thr
Leu Thr Pro Gin Met Thr Ala Ala Thr Gly Gin Pro Ala Val Pro Leu Pro Gin Asn Thr Gin Ala Pro Ser Gin Ala Thr Asn Val Pro Val Ala
Pro Pro Pro Pro Pro Ala Ser Leu Gly Gin Ser Gin Ile Pro Gin Ser
Ala Pro Ser Ala Pro Ile Pro Pro Thr Leu Pro Ser Thr Thr Ser Ala
Ala Pro Pro Pro Pro Pro Ala Phe Leu Thr Gin Gin Pro Gin Ser Gly
Gly Ala Pro Ala Pro Pro Pro Pro Pro Gin Met Pro Ala Thr Ser Thr Ser Gly Gly Gly Ser Phe Ala Glu Thr Thr Gly Asp Ala Gly Arg Asp
Ala Leu Leu Ala Ser Ile Arg Gly Ala Gly Gly Ile Gly Ala Leu Arg
Lys Val Asp Lys Ser Gin Leu Asp Lys Pro Ser Val Leu Leu Gin Glu Ala Arg Gly Glu Ser Ala Ser Pro Pro Ala Ala Ala Gly Asn Gly Gly Thr Pro Gly Gly Pro Pro Ala Ser Leu Ala Asp Ala Leu Ala Ala Ala Leu Asn Lys Arg Lys Thr Lys Val Gly Ala His
* le fragment de 187 acides aminés délimité par les acides aminés situés aux positions 447 et 633 de la figure 7, à savoir le peptide SEQ ID NO 72 suivant :
Gly Gin Pro Ala Val Pro Leu Pro Gin Asn Thr Gin Ala Pro Ser Gin
Ala Thr Asn Val Pro Val Ala Pro Pro Pro Pro Pro Ala Ser Leu Gly
Gin Ser Gin Ile Pro Gin Ser Ala Pro Ser Ala Pro Ile Pro Pro Thr
Leu Pro Ser Thr Thr Ser Ala Ala Pro Pro Pro Pro Pro Ala Phe Leu Thr Gin Gin Pro Gin Ser Gly Gly Ala Pro Ala Pro Pro Pro Pro Pro
Gin Met Pro Ala Thr Ser Thr Ser Gly Gly Gly Ser Phe Ala Glu Thr
Thr Gly Asp Ala Gly Arg Asp Ala Leu Leu Ala Ser Ile Arg Gly Ala
Gly Gly Ile Gly Ala Leu Arg Lys Val Asp Lys Ser Gin Leu Asp Lys
Pro Ser Val Leu Leu Gin Glu Ala Arg Gly Glu Ser Ala Ser Pro Pro Ala Ala Ala Gly Asn Gly Gly Thr Pro Gly Gly Pro Pro Ala Ser Leu
Ala Asp Ala Leu Ala Ala Ala Leu Asn Lys Arg Lys Thr Lys Val Gly Ala His Asp Asp Met Asp Asn Gly Asp Asp Trp
* le fragment de 178 acides aminés délimité par les acides aminés situés aux positions 447 et 624 de la figure 7, à savoir le peptide SEQ ID NO 74 suivant : Gly Gin Pro Ala Val Pro Leu Pro Gin Asn Thr Gin Ala Pro Ser Gin
Ala Thr Asn Val Pro Val Ala Pro Pro Pro Pro Pro Ala Ser Leu Gly
Gin Ser Gin Ile Pro Gin Ser Ala Pro Ser Ala Pro Ile Pro Pro Thr
Leu Pro Ser Thr Thr Ser Ala Ala Pro Pro Pro Pro Pro Ala Phe Leu
Thr Gin Gin Pro Gin Ser Gly Gly Ala Pro Ala Pro Pro Pro Pro Pro Gin Met Pro Ala Thr Ser Thr Ser Gly Gly Gly Ser Phe Ala Glu Thr
Thr Gly Asp Ala Gly Arg Asp Ala Leu Leu Ala Ser Ile Arg Gly Ala
Gly Gly Ile Gly Ala Leu Arg Lys Val Asp Lys Ser Gin Leu Asp Lys
Pro Ser Val Leu Leu Gin Glu Ala Arg Gly Glu Ser Ala Ser Pro Pro
Ala Ala Ala Gly Asn Gly Gly Thr Pro Gly Gly Pro Pro Ala Ser Leu Ala Asp Ala Leu Ala Ala Ala Leu Asn Lys Arg Lys Thr Lys Val Gly
Ala His
- les fragment de la protéine homologue WASP (Wsplp) de Schizosaccharomyces pombe, eux-mêmes choisis parmi :
* ceux comprenant : . le domaine d'homologie avec la verproline délimité par les acides aminés situés aux positions 501 et 517 de la séquence peptidique SEQ ID NO 76 de la protéine homologue WASP (Wsplp) de Schizosaccharomyces pombe représentée sur la figure 8, ou une séquence peptidique dérivée du domaine susmentionné telle que définie dans la revendication 3, . et le domaine d'homologie avec la cofiline délimité par les acides aminés situés aux positions 548 et 565 de la séquence peptidique SEQ ID NO 76 de la protéine homologue WASP (Wsplp) de Schizosaccharomyces pombe représentée sur la figure 8, ou une séquence peptidique dérivée du domaine susmentionné telle que définie dans la revendication 3, * les fragments dont l'acide aminé N-terminal correspond à celui situé à l'une des positions 477 à 501 de la figure 8, et l'acide aminé C-terminal correspond à celui situé à l'une des positions 565 à 574 de la figure 8,
* le fragment de 98 acides aminés délimité par les acides aminés situés aux positions 477 et 574 de la figure 8, à savoir le peptide SEQ ID NO 78 suivant :
Pro Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Val Ala Ser Ile Ala
Glu Leu Pro Gin Gin Asp Gly Arg Ala Asn Leu Met Ala Ser Ile Arg
Ala Ser Gly Gly Met Asp Leu Leu Lys Ser Arg Lys Val Ser Ala Ser
Pro Ser Val Ala Ser Thr Lys Thr Ser Asn Pro Pro Val Glu Ala Pro Pro Ser Asn Asn Leu Met Asp Ala Leu Ala Ser Ala Leu Asn Gin Arg
Lys Thr Lys Val Ala Gin Ser Asp Glu Glu Asp Glu Asp Asp Asp Glu Trp Asp
* le fragment de 89 acides aminés délimité par les acides aminés situés aux positions 477 et 565 de la figure 8, à savoir le peptide SEQ ID NO 80 suivant : Pro Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Val Ala Ser Ile Ala
Glu Leu Pro Gin Gin Asp Gly Arg Ala Asn Leu Met Ala Ser Ile Arg
Ala Ser Gly Gly Met Asp Leu Leu Lys Ser Arg Lys Val Ser Ala Ser
Pro Ser Val Ala Ser Thr Lys Thr Ser Asn Pro Pro Val Glu Ala Pro
Pro Ser Asn Asn Leu Met Asp Ala Leu Ala Ser Ala Leu Asn Gin Arg Lys Thr Lys Val Ala Gin Ser Asp Glu
* le fragment de 74 acides aminés délimité par les acides aminés situés aux positions 501 et 574 de la figure 8, à savoir le peptide SEQ ID NO 82 suivant :
Ala Asn Leu Met Ala Ser Ile Arg Ala Ser Gly Gly Met Asp Leu Leu Lys Ser Arg Lys Val Ser Ala Ser Pro Ser Val Ala Ser Thr Lys Thr Ser Asn Pro Pro Val Glu Ala Pro Pro Ser Asn Asn Leu Met Asp Ala Leu Ala Ser Ala Leu Asn Gin Arg Lys Thr Lys Val Ala Gin Ser Asp Glu Glu Asp Glu Asp Asp Asp Glu Trp Asp
- le fragment de 65 acides aminés délimité par les acides aminés situés aux positions 501 et 565 de la figure 8, à savoir le peptide SEQ ID NO 84 suivant : Ala Asn Leu Met Ala Ser I le Arg Ala Ser Gly Gly Met Asp Leu Leu
Lys Ser Arg Lys Val Ser Ala Ser Pro Ser Val Ala Ser Thr Lys Thr Ser Asn Pro Pro Val Glu Ala Pro Pro Ser Asn Asn Leu Met Asp Ala Leu Ala Ser Ala Leu Asn Gin Arg Lys Thr Lys Val Ala Gin Ser Asp Glu • les séquences peptidiques dérivées des fragments peptidiques susmentionnés, notamment par substitution, addition ou suppression d'un ou plusieurs acides aminés de ces fragments, lesdites séquences dérivées ayant la propriété définies dans la revendication 1 des protéines de la famille WASP et desdits fragments de ces dernières.
6. Fragments peptidiques des protéines de la famille WASP des cellules eucaryotes, notamment des cellules humaines ou d'autres mammifères, ou des cellules d'insectes, ou de micro-organismes telles que les levures, choisis parmi ceux comprenant : - le domaine d'homologie avec la verproline contenu dans les protéines de la famille WASP, ou dans une protéine dérivée de ces dernières, ou au moins une des deux séquences homologues à la verproline lorsque lesdites protéines de la famille WASP contiennent deux de ces séquences, ou une séquence peptidique dérivée du domaine susmentionné, notamment par substitution, addition ou suppression d'un ou plusieurs acides aminés, et conservant la propriété de ce domaine de se lier à l'actine,
- et le domaine d'homologie avec la cofiline contenu dans les protéines de la famille WASP ou dans une protéine dérivée de ces dernières, ou une séquence peptidique dérivée du domaine susmentionné, notamment par substitution, addition ou suppression d'un ou plusieurs acides aminés, et conservant la propriété de ce domaine d'intervenir dans le cadre de la polymérisation de l'actine, ou les séquences peptidiques dérivées telles que définies dans la revendication 1 des fragments peptidiques susmentionnés des protéines de la famille WASP, à l'exclusion : - du fragment peptidique de la protéine WASP humaine délimité par les acides aminés situés aux positions 429 à 503 de la séquence peptidique représentée sur la figure 1 ,
- du fragment peptidique de la protéine WASP humaine délimité par les acides aminés situés aux positions 187 à 489 de la séquence peptidique représentée sur la figure 1,
- du fragment peptidique de la protéine WASP humaine délimité par les acides aminés situés aux positions 422 à 489 de la séquence peptidique représentée sur la figure 1,
- du fragment peptidique de la protéine N-WASP humaine délimité par les acides aminés simés aux positions 392 à 505 de la séquence peptidique représentée sur la figure 2,
- du fragment peptidique de la protéine Scarl humaine délimité par les acides aminés situés aux positions 443 à 559 de la séquence peptidique représentée sur la figure 3, - du fragment peptidique de la protéine N-WASP bovine délimité par les acides aminés situés aux positions 392 à 505, et de celui délimité par les acides aminés situés aux positions 392 à 485, de la séquence peptidique représentée sur la figure 6.
7. Fragments peptidiques selon la revendication 6, de la protéine WASP humaine, lesdits fragments étant choisis parmi :
- ceux comprenant :
. le domaine d'homologie avec la verproline délimité par les acides aminés situés aux positions 430 et 446 de la séquence peptidique SEQ ID NO 2 de la protéine WASP humaine représentée sur la figure 1 , ou une séquence peptidique dérivée du domaine susmentionné telle que définie dans la revendication 3 , . et le domaine d'homologie avec la cofiline délimité par les acides aminés situés aux positions 469 et 487 de la séquence peptidique SEQ ID NO 2 de la protéine WASP humaine représentée sur la figure 1, ou une séquence peptidique dérivée du domaine susmentionné telle que définie dans la revendication 3,
- les fragments dont l'acide aminé N-terminal correspond à celui situé à l'une des positions 404 à 430 de la figure 1, et l'acide aminé C-terminal correspond à celui situé à l'une des positions 487 à 502 de la figure 1,
- les peptides SEQ ID NO 4, SEQ ID NO 6, SEQ ID NO 8, et SEQ ID NO 10, ou les séquences dérivées de ces derniers, tels que définis dans la revendication 4.
8. Fragments peptidiques selon la revendication 6, de la protéine N-WASP humaine, lesdits fragments étant choisis parmi :
- ceux comprenant :
. la séquence homologue à la verproline délimitée par les acides aminés situés aux positions 405 et 421 de la séquence peptidique SEQ ID NO 12 de la protéine N- WASP humaine représentée sur la figure 2, ou une séquence peptidique dérivée du domaine susmentionné telle que définie dans la revendication 3,
. et/ou la séquence homologue à la verproline délimitée par les acides aminés simés aux positions 433 et 449 de la séquence peptidique SEQ ID NO 12 de la protéine N-WASP humaine représentée sur la figure 2, ou une séquence peptidique dérivée du domaine susmentionné telle que définie dans la revendication 3,
. et le domaine d'homologie avec la cofiline contenu dans la protéine N-
WASP susmentionnée, à savoir le domaine délimité par les acides aminés simés aux positions 470 et 488 de la séquence peptidique SEQ ID NO 12 de la protéine N-WASP humaine représentée sur la figure 2, ou une séquence peptidique dérivée du domaine susmentionné telle que définie dans la revendication 3 ,
- les fragments dont l'acide aminé N-terminal correspond à celui situé à l'une des positions 392 à 433 de la figure 2, et l'acide aminé C-terminal correspond à celui situé à l'une des positions 488 à 505 de la figure 2, - les peptides SEQ ID NO 16, SEQ ID NO 18, SEQ ID NO 20, SEQ ID NO 22, et SEQ ID NO 24 susmentionnés, ou les séquences dérivées de ces derniers, tels que définis dans la revendication 4.
9. Fragments peptidiques selon la revendication 6, de la protéine Scarl humaine, lesdits fragments étant choisis parmi :
- ceux comprenant :
. le domaine d'homologie avec la verproline délimité par les acides aminés situés aux positions 497 et 513 de la séquence peptidique SEQ ID NO 26 de la protéine Scarl humaine représentée sur la figure 3, ou une séquence peptidique dérivée du domaine susmentionné telle que définie dans la revendication 3,
. et le domaine d'homologie avec la cofiline délimité par les acides aminés situés aux positions 531 et 546 de la séquence peptidique SEQ ID NO 26 de la protéine Scarl humaine représentée sur la figure 3, ou une séquence peptidique dérivée du domaine susmentionné telle que définie dans la revendication 3,
- les fragments dont l'acide aminé N-terminal correspond à celui simé à l'une des positions 443 à 497 de la figure 3, et l'acide aminé C-terminal correspond à celui simé à l'une des positions 546 à 559 de la figure 3,
- les peptides SEQ ID NO 28, SEQ ID NO 30, SEQ ID NO 32, et SEQ ID NO 34 susmentionnés, ou les séquences dérivées de ces derniers, tels que définis dans la revendication 4.
10. Fragments peptidiques selon la revendication 6, de la protéine WASP murine, lesdits fragments étant choisis parmi : - ceux comprenant :
. le domaine d'homologie avec la verproline délimité par les acides aminés simés aux positions 448 et 465 de la séquence peptidique SEQ ID NO 36 de la protéine WASP murine représentée sur la figure 4, ou une séquence peptidique dérivée du domaine susmentionné telle que définie dans la revendication 3, . et le domaine d'homologie avec la cofiline délimité par les acides aminés situés aux positions 487 et 505 de la séquence peptidique SEQ ID NO 36 de la protéine WASP murine représentée sur la figure 4, ou une séquence peptidique dérivée du domaine susmentionné telle que définie dans la revendication 3,
- les fragments dont l'acide aminé N-terminal correspond à celui simé à l'une des positions 420 à 448 de la figure 4, et l'acide aminé C-terminal correspond à celui simé à l'une des positions 505 à 520 de la figure 4,
- les peptides SEQ ID NO 38, SEQ ID NO 40, SEQ ID NO 42, et SEQ ID NO 44 susmentionnés, ou les séquences dérivées de ces derniers, tels que définis dans la revendication 4.
11. Fragments peptidiques selon la revendication 6, de la protéine N-WASP de rat, lesdits fragments étant choisis parmi :
- ceux comprenant :
. la séquence homologue à la verproline délimitée par les acides aminés simés aux positions 401 et 417 de la séquence peptidique SEQ ID NO 46 de la protéine N-WASP de rat représentée sur la figure 5, ou une séquence peptidique dérivée du domaine susmentionné telle que définie dans la revendication 3,
. et/ou la séquence homologue à la verproline délimitée par les acides aminés simés aux positions 429 et 444 de la séquence peptidique SEQ ID NO 46 de la protéine N-WASP de rat représentée sur la figure 5, ou une séquence peptidique dérivée du domaine susmentionné telle que définie dans la revendication 3,
. et le domaine d'homologie avec la cofiline contenu dans la protéine N-
WASP susmentionnée, à savoir le domaine délimité par les acides aminés simés aux positions 466 et 484 de la séquence peptidique SEQ ID NO 46 de la protéine N-WASP de rat représentée sur la figure 5, ou une séquence peptidique dérivée du domaine susmentionné telle que définie dans la revendication 3 ,
- les fragments dont l'acide aminé N-terminal correspond à celui simé à l'une des positions 401 à 429 de la figure 5, et l'acide aminé C-terminal correspond à celui simé à l'une des positions 484 à 501 de la figure 5,
- les peptides SEQ ID NO 48, SEQ ID NO 50, SEQ ID NO 52, et SEQ ID NO 54 susmentionnés, ou les séquences dérivées de ces derniers telles que définies dans la revendication 4.
12. Fragments peptidiques selon la revendication 6, de la protéine N-WASP bovine, lesdits fragments étant choisis parmi :
- ceux comprenant :
. le domaine d'homologie avec la verproline délimité par les acides aminés simés aux positions 405 et 421 de la séquence peptidique SEQ ID NO 56 de la protéine
N-WASP bovine représentée sur la figure 6, ou une séquence peptidique dérivée du domaine susmentionné telle que définie dans la revendication 3,
. et/ou le domaine d'homologie avec la verproline délimité par les acides aminés simés aux positions 433 et 488 de la séquence peptidique SEQ ID NO 56 de la protéine N-WASP bovine représentée sur la figure 6, ou une séquence peptidique dérivée du domaine susmentionné telle que définie dans la revendication 3,
. et le domaine d'homologie avec la cofiline délimité par les acides aminés simés aux positions 470 et 488 de la séquence peptidique SEQ ID NO 56 de la protéine N-WASP bovine représentée sur la figure 6, ou une séquence peptidique dérivée du domaine susmentionné telle que définie dans la revendication 3,
- les fragments dont l'acide aminé N-terminal correspond à celui simé à l'une des positions 405 à 433 de la figure 6, et l'acide aminé C-terminal correspond à celui simé à l'une des positions 488 à 505 de la figure 6,
- les peptides SEQ ID NO 58, SEQ ID NO 60, SEQ ID NO 62, et SEQ ID NO 64 susmentionnés, ou les séquences dérivées de ces derniers, tels que définis dans la revendication 4.
13. Fragments peptidiques selon la revendication 6, de la protéine Las 17 de Saccharomyces cerevisiae, lesdits fragments étant choisis parmi : - ceux comprenant :
. le domaine d'homologie avec la verproline délimité par les acides aminés simés aux positions 447 et 466 de la séquence peptidique SEQ ID NO 66 de la protéine
Las 17 représentée sur la figure 7, ou une séquence peptidique dérivée du domaine susmentionné telle que définie dans la revendication 3, . et le domaine d'homologie avec la cofiline délimité par les acides aminés simés aux positions 607 et 624 de la séquence peptidique SEQ ID NO 66 de la protéine Las 17 représentée sur la figure 7, ou une séquence peptidique dérivée du domaine susmentionné telle que définie dans la revendication 3,
- les fragments dont l'acide aminé N-terminal correspond à celui simé à l'une des positions 422 à 447 de la figure 7, et l'acide aminé C-terminal correspond à celui simé à l'une des positions 624 à 633 de la figure 7, et plus particulièrement les peptides SEQ ID
NO 68, SEQ ID NO 70, SEQ ID NO 72, et SEQ ID NO 74 susmentionnés, ou les séquences dérivées de ces derniers, tels que définis dans la revendication 4.
14. Fragments peptidiques selon la revendication 6, de la protéine homologue WASP (Wsplp) de Schizosaccharomyces pombe, lesdits fragments étant choisis parmi :
- ceux comprenant :
. le domaine d'homologie avec la verproline délimité par les acides aminés simés aux positions ??? et ??? de la séquence peptidique SEQ ID NO 76 de la protéine homologue WASP (Wsplp) de Schizosaccharomyces pombe représentée sur la figure 8, ou une séquence peptidique dérivée du domaine susmentionné telle que définie dans la revendication 3,
. et le domaine d'homologie avec la cofiline délimité par les acides aminés simés aux positions ??? et ??? de la séquence peptidique SEQ ID NO 76 de la protéine homologue WASP (Wsplp) de Schizosaccharomyces pombe représentée sur la figure 8, ou une séquence peptidique dérivée du domaine susmentionné telle que définie dans la revendication 3,
- les fragments dont l'acide aminé N-terminal correspond à celui simé à l'une des positions ??? à ??? de la figure 8, et l'acide aminé C-terminal correspond à celui simé à l'une des positions ??? à ??? de la figure 8, - les peptides SEQ ID NO 78, SEQ ID NO 80, SEQ ID NO 82, et SEQ ID NO 84 susmentionnés, ou les séquences dérivées de ces derniers, tels que définis dans la revendication 4.
15. Séquences nucléotidiques codant pour les fragments peptidiques, ou pour les protéines dérivées de ces derniers, définis dans l'une des revendications 6 à 14.
16. Réactif pour la mise en œuvre d'un procédé de détection ou de criblage de molécules ayant un effet d'inhibition ou de stimulation de la formation du cytosquelette d'actine, et donc un effet d'inhibition ou de stimulation de la mobilité cellulaire, ledit réactif comprenant au moins un fragment peptidique défini dans l'une des revendications 1 à 14, lié ou adsorbé à un support susceptible de se déplacer sous l'effet de la polymérisation de l'actine, lorsque ledit support lié audit fragment est placé dans un milieu contenant les éléments nécessaires à la polymérisation de l'actine, notamment lorsque ledit support est ajouté à un extrait préparé à partir de surnageants de cellules lysées de l'organisme.
17. Réactif selon la revendication 16, caractérisé en ce qu'il est choisi parmi les microsphères dont le diamètre est compris entre environ 100 et environ 10 000 nm, le matériau constituant les microsphères étant lui même choisi parmi les polystyrènes ou le latex, lesdites microsphères contenant chacune environ 5 000 à environ 50 000 molécules de fragment ou séquence dérivée définis dans l'une des revendications 1 à 14.
18. Procédé de détection ou de criblage de molécules ayant un effet d'inhibition ou de stimulation de la formation du cytosquelette d'actine, et donc un effet d'inhibition ou de stimulation de la motilité cellulaire, ledit procédé comprenant :
- une étape de mise en présence de la molécule testée avec un réactif selon la revendication 16 ou 17, dans un milieu contenant de l'actine et les éléments nécessaires à la polymérisation de l'actine, notamment dans un extrait de surnageant de cellules lysées,
- suivie de la détection éventuelle d'une inhibition ou d'une activation du processus de polymérisation de l'actine à la surface dudit réactif, par rapport à un témoin, témoignant respectivement d'un effet d'inhibition ou de stimulation de la formation du cytosquelette d'actine.
19. Procédé selon la revendication 18, appliqué à la détection ou au criblage de molécules :
- susceptibles de pouvoir être utilisées en tant que médicaments dans le traitement de pathologies liées à un dysfonctionnement du processus de polymérisation de l'actine dans le cadre de la formation du cytosquelette d'actine, notamment en tant que médicaments dans le traitement de cancers métastatiques, ou en tant qu'antibiotiques anti-parasitaires, - ou susceptibles d'avoir un effet cytotoxique correspondant à une inhibition ou une stimulation de la formation du cytosquelette d'actine.
20. Trousse ou kit pour la mise en œuvre d'un procédé selon la revendication 18 ou 19, comprenant
- un réactif selon la revendication 16 ou 17,
- le cas échéant un composé marqué permettant de visualiser la polymérisation de l'actine, notamment de l'actine marquée par fluorescence,
- le cas échéant un milieu approprié contenant les éléments nécessaires à la polymérisation de l'actine, notamment un extrait de cellules lysées.
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