EP0977840A2 - Methodes de detection d'interactions entre plusieurs proteines - Google Patents

Methodes de detection d'interactions entre plusieurs proteines

Info

Publication number
EP0977840A2
EP0977840A2 EP98920567A EP98920567A EP0977840A2 EP 0977840 A2 EP0977840 A2 EP 0977840A2 EP 98920567 A EP98920567 A EP 98920567A EP 98920567 A EP98920567 A EP 98920567A EP 0977840 A2 EP0977840 A2 EP 0977840A2
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
protein
proteins
transcription
determined
host cells
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
EP98920567A
Other languages
German (de)
English (en)
Inventor
Jacques Camonis
Francisco Romero-Portillo
Ricardo Attar
Jean-Marc Egly
Franck Tirode
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
Original Assignee
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Centre National de la Recherche Scientifique CNRS, Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM filed Critical Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Publication of EP0977840A2 publication Critical patent/EP0977840A2/fr
Withdrawn legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1034—Isolating an individual clone by screening libraries
    • C12N15/1055—Protein x Protein interaction, e.g. two hybrid selection
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
    • C12N15/81—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6897—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids involving reporter genes operably linked to promoters
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide

Definitions

  • the present invention relates to methods of detecting or identifying proteins involved in the formation of a protein complex, or in inhibiting the formation of a protein complex.
  • the double-hybrid system is based on the reconstitution of a transcriptional activator in yeast (Fields S. and Song O., 1989; Chien C.-T. et al., 1991).
  • a first protein is cloned in fusion with the DNA binding domain, while a second protein is cloned in fusion with the transcription activation domain.
  • a transcriptional activator is formed allowing the transcription of reporter genes.
  • a triple-hybrid system repeating the principle of the double-hybrid, by inserting into the vectors used a DNA sequence coding for a third partner, has been developed by Zhang and Lautar (Zhang J. et al., 1996).
  • One of the aims of the present invention is precisely to provide new methods for studying interactions between proteins, not requiring the implementation of two separate experiments, these methods therefore being simpler to implement, faster. and more reliable than the methods currently proposed.
  • the subject of the invention is the use of at least one conditional promoter for the implementation of a method for detecting one (or more) protein (s) (or polypeptides) interacting directly or indirectly with at least two other proteins (or polypeptides) as part of the formation of a protein complex, or the inhibition of the formation of a protein complex.
  • any protein catalyzing the formation of a protein complex between at least two proteins without associating with the latter to form a protein complex, in particular by a mechanism of conformational modification of one or more of the partners of the protein complex .
  • conditional promoters capable of being used in the context of the present invention, there may be mentioned: - the Met25 promoter (Kerjan P. et al, 1986), which can be regulated as a function of the methionine concentration, or
  • the subject of the invention is also any method of detecting a protein as defined above interacting with at least two determined proteins, within the framework of the formation of a protein complex, or of the inhibition of the formation of '' a protein complex, characterized in that it
  • the method described above for detecting a protein interacting directly or indirectly with at least two determined proteins comprises: a step of transformation of host cells, the genome of which contains one or more reporter genes, with a or several vectors, so that the genome of these host cells contains:
  • the DNA sequence encoding said tested protein capable of interacting with at least two determined proteins, the transcription of this DNA sequence being placed under the control of a conditional promoter
  • transformation of host cells with a vector in the above and what follows, is meant any method making it possible to add to the genome of said cells, the content of DNA sequences of a vector, in particular of the plasmid type; the resulting host cells are designated in what piecede and what follows by the expression "transformed host cells"
  • genome of a cell one understands the whole of the DNA contained in a cell, has the DNA of chromosomes, mitochond ⁇ es and episomes
  • the method of the invention has the advantage of not comprising two separate experiments as described above, including one experiment serving as a negative control by parallel culture of host cells treated with vectors not containing a sequence. of DNA encoding the piote e tested, for the purpose of comparison with the step of culturing tianstorme host cells with vectors containing all of the DNA sequences encoding the pi oteins capable of interacting with each other
  • the host cells cultured in the method of the present invention either as a negative control (or an internal control), or for demonstrating an interaction between the proteins, are transformed by the same vectors, thus avoiding lead to erroneous results, as indicated above in the context of the methods currently proposed in this field
  • control is internal to the experiment, which makes these methods particularly suitable for screening a cDNA library, or a degenerate synthetic library.
  • oligonucleotides which may contain a
  • a more particular subject of the invention is any method such as above, in which ⁇ ⁇ - two of the proteins encoded by the DNA sequences contained in the
  • the other of these proteins, or at least one of the other proteins encoded by the DNA sequence or sequences contained in the above-mentioned vector (s), is encoded by a DNA sequence the transcription of which is under the control of
  • the two determined proteins, or at least two of said determined pioteins, encoded by the DNA sequences contained in the vector (s) used for the transformation of said host cells are in fusion, for one of them, with a DNA binding domain, and for the other, with a transcription activation domain, the transcription of the DNA sequences encoding these two fusion proteins being under the control of constitutive promoters.
  • the abovementioned method of the invention can be carried out using a vector containing all of the DNA sequences coding for the proteins in question, or preferably using several vectors constructed in such a way that:
  • - one of them contains the DNA sequence coding for the protein in fusion with the DNA binding domain, the transcription of which is under the control of a constitutive promoter, while another vector contains the DNA sequence coding for the protein in fusion with the activation domain, and the transcription of which is also under the control of a constitutive promoter,
  • one of the two above-mentioned vectors, or another vector contains a DNA sequence coding for a protein capable of interacting with the previous ones, and the transcription of which is under the control of a conditional promoter
  • one or more of the above-mentioned vectors, or one or more other vectors contain one or more DNA sequences coding for a protein capable of interacting with the preceding ones, and the transcription of which is under the control of a conditional promoter (advantageously different from the previous conditional promoter), or a constitutive promoter.
  • the aforementioned method of the invention is carried out using several vectors such as:
  • - one of them contains a DNA sequence coding for one of the determined proteins in fusion with the DNA binding domain, and whose transcription is under the control of a constitutive promoter
  • another vector contains a DNA sequence coding for another protein determined in fusion with the activation domain, and whose transcription is also under the control of a promoter constitutive,> - one of the two aforementioned vectors, or another vector, contains the DNA sequence coding for the tested protein capable of interacting with the previous ones, and whose transcription is under the control of a conditional promoter
  • one or more of the above-mentioned vectors, or one or more other vectors contain one or more DNA sequences coding for another determined protein capable of interacting with the preceding ones, and the transcription of which is under the control of '' a conditional promoter different from the previous conditional promoter, or under the control of a constitutive promoter.
  • the detection of an interaction between a protein tested and two determined proteins can be carried out using two vectors such as:
  • one of them contains the DNA sequence coding for the protein in fusion with the DNA binding domain
  • the other vector contains the DNA sequence coding for the protein in fusion with the activation domain
  • one of the two aforementioned vectors contains the DNA sequence coding for the tested protein capable of interacting with the previous ones, and whose transcription is under the control of a conditional promoter.
  • the above-mentioned method of the invention for the detection of an interaction between a tested protein and two determined proteins, can also be carried out using three vectors such as:
  • the first vector contains the DNA sequence coding for the protein in fusion with the DNA binding domain
  • the second vector contains the DNA sequence coding for the protein in fusion with the activation domain
  • the third vector contains the DNA sequence coding for the protein tested capable of interacting with the previous ones, and whose transcription is under the control of a conditional promoter.
  • the above-mentioned vectors also contain a DNA sequence corresponding to a selection gene, such as a gene encoding an enzyme of the metabolism of a particular amino acid for which the strain of transformed host cells is auxotrophic.
  • the host cells transformed by the above-mentioned vectors in the context of the implementation of a method according to the invention are advantageously such that their genome comprises one or more reporter genes, the transcription of which is placed, for each of them, under the control of an operator recognized by the DNA binding domain encoded by one of the above-mentioned vectors, the transcription of these reporter genes taking place when there is formation, if necessary under direct influence or indirect of the protein tested, of a protein complex between the determined proteins produced in the transformed host cells cultured.
  • the reporter genes which may be contained in the genome of host cells, there may be mentioned, by way of example:
  • ⁇ -galactosidase activity can, for example, result in a blue coloration using 5-bromo-4-chloro-3-indolyl ⁇ -D-galactoside (or Xgal) as substrate, or also in a yellow coloration in using O-nitrophenyl- ⁇ -galactoside (ONPG) as a substrate,
  • the host cells used are auxotrophic for the amino acids whose metabolism is dependent on the enzymes encoded by the selection genes contained in the above-mentioned vectors and, if appropriate, for the amino acid whose metabolism is dependent. of the enzyme encoded by a reporter gene contained in the genome of said host cells.
  • the host cell strain used is a yeast strain, in particular the yeast strain L40, the genome of which contains, as reporter genes, the HIS3 gene (coding for an enzyme of histidine metabolism) and the LacZ gene coding for ⁇ -galactosidase, the transcription of these reporter genes being under the control of an operator recognized by the LexA DNA binding domain.
  • yeast strain L40 the genome of which contains, as reporter genes, the HIS3 gene (coding for an enzyme of histidine metabolism) and the LacZ gene coding for ⁇ -galactosidase, the transcription of these reporter genes being under the control of an operator recognized by the LexA DNA binding domain.
  • the DNA sequences coding said determined proteins are chosen from those coding for proteins which form little or no protein complexes with one another.
  • the transcription of the reporter gene (s) of said host cells cultured by activating said conditional promoter, or even an increased transcription of this or these reporter gene (s) compared to the transcription of these same genes by repressing said conditional promoter, is then correlated with the detection. a direct or indirect interaction between the protein tested and said proteins determined within the framework of the formation of a protein complex.
  • sequences of DNA encoding said determined proteins are chosen from those encoding proteins forming a protein complex therebetween.
  • the conditional promoter is the Met25 promoter which can be regulated as a function of the concentration of methionine in the culture medium of the transformed host cells, said promoter being activated in the absence of methionine in the culture medium, and repressed in the presence of methionine, and - the reporter genes contained in the genome of the transformed host cells are:
  • a gene encoding an enzyme of the metabolism of a particular amino acid, for which the strain of said host cells is auxotrophic by mutation in said gene “a gene encoding an enzyme responsible for the coloring of culture medium when it reacts with its substrate, such as the LacZ gene encoding ⁇ -galactosidase.
  • the detection, or even the measurement, of the growth of the colonies of the strain of host cells transformed in a selective culture medium M1 which, on the one hand does not contain the amino acid whose metabolism is dependent on the enzyme encoded by the reporter gene contained in the genome of said host cells and, on the other hand, does not contain methionine, is correlable with the detection of an interaction between the protein tested and the proteins determined within the framework of the formation of 'A protein complex, insofar as the growth of these colonies in a selective culture medium M2 corresponding to the preceding medium Ml in which methionine is added, is zero or less than that measured in the absence of methionine.
  • the detection, or even the measurement, of a coloration in the culture medium of the transformed host cells is correlated with the detection.
  • a coloration in the culture medium of the transformed host cells in particular a blue coloration in a medium containing the XGal substrate, but not containing methionine
  • the detection is correlated with the detection. of an interaction between the protein tested and the proteins determined within the framework of the formation of a protein complex, insofar as this coloration, in the preceding culture medium in which methionine is added, is zero or less than that measured in the absence of methionine.
  • the absence of growth of the colonies of the strain of host cells transformed in the abovementioned Ml culture medium, or the detection of a weaker growth of these colonies in the Ml medium compared to the growth detected for these colonies in the aforementioned M2 medium is correlable to the detection of an interaction between the protein tested and the proteins determined within the framework of the inhibition of the formation of a protein complex.
  • the absence of staining in the culture medium of the transformed host cells containing the specific substrate for staining (in particular XGal) but not containing methionine, where the detection of a weaker staining in this culture medium by compared to the culture medium containing methionine, is correlable to the detection of an interaction between the protein tested and the proteins determined within the framework of the inhibition of the formation of a protein complex.
  • the present invention more particularly relates to the application of the methods described above to the screening of a cDNA library, or of a degenerate synthetic library of oligonucleotides, said libraries being capable of containing one (or more) sequence (s) of DNA encoding one (or more) protein (s) as described above, interacting directly or indirectly with at least two proteins determined within the framework of the formation of a protein complex , or inhibition of a protein complex.
  • the detection of a protein interacting directly or indirectly with two determined proteins A and B, within the framework of the formation of a protein complex, or of the inhibition of the formation of a protein complex is advantageously carried out according to the following method which comprises: the transformation of host cells with:
  • a selection gene encoding an enzyme responsible for the metabolism of an amino acid designated below AA2, AA2 being different from AA1, one of the two above-mentioned vectors containing a DNA sequence encoding the protein tested, the transcription of this DNA sequence being under the control of the conditional promoter Met25, said host cells being such that their genome comprises, a reporter gene, in particular the LacZ gene, as well as a gene encoding an enzyme of the. metabolism of an amino acid hereinafter referred to as AA3, AA3 being different from AA1 and AA2, and as they are auxotrophic for the amino acids AA1, AA2 and AA3.
  • the DNA sequence coding for the protein tested, or one of the DNA sequences coding for a determined protein is fused, in the vector (s) mentioned above, to a DNA sequence coding for a peptide capable of being recognized specifically by an antibody, in particular a DNA sequence coding for the hemagglutinin tag (HA tag) capable of being recognized by the anti-HA antibody (described in particular in Hanke et al ., 1992).
  • a DNA sequence coding for the hemagglutinin tag hemagglutinin tag
  • This immunoprecipitation makes it possible to separate and purify the protein complex from the culture medium of said cells, and, if necessary, to verify the structure and / or the biological activity of this complex, in particular to deduce the nature thereof.
  • interaction between the protein tested and the proteins determined in the context of the formation of this complex namely: direct or indirect interaction as described above.
  • the present invention is not limited to the study of the interaction between three proteins between them, and the method described above in the context of the study of interactions between three proteins, can be adapted to the study of the interaction between four or five proteins (or even more).
  • each DNA sequence coding for an additional protein to be tested is introduced into one of the two vectors used in the method described above, or even into other additional vectors, and is advantageously under the control of a conditional promoter preferably different from the other conditional promoter (s) already used to control the transcription of DNA sequences encoding other proteins within the above-mentioned vectors.
  • proteins of the multiprotein complex i ⁇ TFIIH essential for the transcription and repair of DNA (Svejstrup et al.,
  • pLex9-3H contains an expression cassette consisting of the inducible promoter Met25, a Hemagglutinin tag (HA tag), a localization signal
  • the plasmid pVP16 contains a selection marker LEU2 (gene coding for an enzyme of the leucine metabolism) and the transcriptional activator of VP16 cloned downstream of the promoter of ADH.
  • the L40 strain [MATa, trpl, his3, leu2, ade2, LYS2:: (LexAop) 4- HIS3, URA3:: (LexAop) g-LacZ] contains the reporter genes HIS3 (coding for an enzyme of histidine metabolism ) and LacZ in merger with an operator recognized by LexA.
  • the cells are cultured for 16 hours in complete medium (YPD medium) and transformed with Cdk7-pLex9-
  • Two types of controls are available: the growth test and the ⁇ -galactosidase activity test.
  • clones isolated from cultures established on HA medium, are suspended in 50 ⁇ ⁇ of sterile water and diluted in cascade from 10 to 10
  • a drop of each dilution is deposited on a selective medium for interaction at three (A, containing only adenine) as well as on a medium inhibiting the expression of cyclin H (AM, containing adenine and methionine ImM).
  • the ⁇ -galactosidase activity is evaluated on cells having grown overnight in the appropriate medium (the optical density will be measured at 600 nm
  • the DO420 is then measured.
  • the ⁇ -galactosidase activity (in ml-Lmin-1) is calculated by the formula: (D0 2 o) / [DO 6u0 ) x vol. of culture (ml) x reaction time (min)]. (Rose MD, 1990).
  • Ras and Raf are two oncogenic proteins which interact with each other with the consequence of a potential implication in the transduction of signals controlling the phenomena of cell growth and differentiation.
  • the contact inhibition of these two proteins can be studied either by screening an oligopeptide library or by involving a third partner identical to one of the two other polypeptides forming the transcriptional activator, but not containing a fusion sequence.
  • the third partner will be under the control of the inducible promoter Met25.
  • the expression of the Met25 promoter is repressed in the presence of 1 mM Methionine.
  • Plasmids derived from pGBT9-3H were constructed as follows: The reading frame (ORF) of H-Ras (V12) (EcoRI-SalI fragment of pBTM116-Ras (Vojtek et al., 1993)) was cloned in phase with the DNA binding domain of GAL4, the resulting plasmid being [pGBT-Ras / Met-0].
  • the plasmid [pGBT-Ras / Met-Raf] was obtained by adding on both sides of the EcoRI-BamHI fragment of cRaf-1 originating from the plasmid pGAD-Raf (Van Aelst et a, 1993) a binding sequence containing the NotI cloning site, and then cloning the resulting fragment into the NotI site of the Met25 expression cassette of [pGBT-Ras / Met-0].
  • the cells cotransformed with [pGBT-Ras / Met-Raf] and pGAD-Raf are LacZ + (transcription of the ⁇ -galactosidase gene) in the presence of methionine, that is to say under conditions of repression of the Met25 promoter .
  • the same cells are LacZ- in the absence of methionine, namely under conditions of derepression of the Met25 promoter.
  • the plasmids described above can be used to identify peptides inhibiting an interaction between proteins, for example by expressing a degenerate synthetic library of oligonucleotides under the control of the Met25 promoter.
  • the inhibition of the interaction can be detected by a LacZ test under conditions of derepression of the Met25 promoter; the LacZ + phenotype could be restored in the presence of methionine, proving that the inhibition is due to the expression of the Met25 promoter but not to other events such as a mutation.
  • pGBT935 the insertion of the cDNA coding for the Ras protein (ch-Ras; Vojtek. 1993) in phase with the coding region of the DNA binding domain GAL4 (GAL-DBD) leads to the plasmid [pGBT935, Met25 -0]; the cDNA coding for the Raf protein (c-Raf-1; Van Aelst, 1993) cloned in phase with the coding region of the nuclear localization site linked to the HA epitope (HA-NLS) in the plasmid [pGBT935, Met25 -0] leads to the plasmid [pGBT935. Met25-Raf].
  • the plasmid pGAD-Raf allows the expression of a protein c-Raf-1 fused to the activation domain GAL4 (AD-Raf).
  • the vector pLex9-3H derived from the vector pBTMl l ⁇ .
  • the pBTM1 l ⁇ part contains, in addition to the sequences necessary for its replication in E. coli, the selection marker TRP1 and the transcriptional activator LexA cloned downstream of the promoter (P) and upstream of the terminator (T) of ADH .
  • pLex9-3H also has an expression cassette containing the regulatable promoter Met25. an HA tag, a nuclear localization sequence (NLS), and a tPGK terminator. The insertion sites of the cDNA of interest are indicated.
  • the cDNA encoding Cdk7 is cloned in fusion with LexA, that of cyclin H is in fusion with the tag HA, downstream of the regulatable promoter Met25, in the plasmid pLex9-3H whereas the cDNA and MAT1 is cloned in fusion with VP16 in the plasmid pVPl ⁇ .
  • LexA that of cyclin H is in fusion with the tag HA, downstream of the regulatable promoter Met25, in the plasmid pLex9-3H
  • the cDNA and MAT1 is cloned in fusion with VP16 in the plasmid pVPl ⁇ .
  • the latter contains the selection marker
  • LEU2 and the activation domain of VP16 downstream of the constitutive promoter ADH.
  • A growth test of three yeast clones transformed by the plasmids Cdk7-pLex9-3H-Cyclin H and MAT1-pVP16 on a medium lacking (Met-: methionine derepression) and rich (Met + 1 mM: methionine repression) in methionine.
  • the different dilutions are indicated in the center of the figure.
  • the cells of the yeast strain HF7c cotransformed with pairs of plasmids are selected in a medium which does not contain tryptophan and leucine (Rose, 1990); the colonies are distributed in a medium which does not contain tryptophan or leucine, and which contains or does not contain methionine. After 24 hours at 30 ° C., the dishes were replicated to test for histidine hypotrophy (results not shown) and for the expression of LacZ (Chardin, 1993), in the presence or absence of metfjionine.

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Bioinformatics & Computational Biology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

L'invention a pour objet l'utilisation d'au moins un promoteur conditionnel pour la mise en oeuvre d'une méthode de détection d'une (ou plusieurs) protéine(s) interagissant directement ou indirectement avec au moins deux autres protéines dans le cadre de la formation d'un complexe protéique, ou de l'inhibition de la formation d'un complexe protéique.

Description

METHODES DE DETECTION D'INTERACTIONS ENTRE PLUSIEURS PROTEINES
5 La présente invention concerne des méthodes de détection ou d' identification de protéines impliquées dans la formation d'un complexe protéique, ou dans l' inhibition de la formation d'un complexe protéique.
Parmi les méthodes actuellement disponibles pour étudier des interactions entre protéines, le système double-hybride, et plus récemment celui i() du triple-hybride, s'avèrent être des méthodes particulièrement performantes.
Le système double-hybride est basé sur la reconstitution d'un activateur transcriptionnel dans la levure (Fields S. et Song O. , 1989 ; Chien C.-T. et al. , 1991). Une première protéine est clonée en fusion avec le domaine de liaison à l'ADN, alors qu'une deuxième protéine est clonée en fusion avec le domaine 15 d'activation de la transcription. Lorsque les deux protéines d'intérêt interagissent entre elles, un activateur transcriptionnel est formé permettant la transcription de gènes rapporteurs.
Un système triple-hybride, reprenant le principe du double-hybride, en insérant dans les vecteurs utilisés une séquence d'ADN codant un troisième 20 partenaire, a été développé par Zhang et Lautar (Zhang J. et al. , 1996).
Toutefois, les systèmes double-hybride et triple-hybride actuellement disponibles, présentent, comme inconvénient majeur, la nécessité de faire un test d' interaction avec un témoin négatif, ce qui correspond à effectuer les deux expériences distinctes suivantes : 25 - une première expérience où les cellules hôtes sont transformées avec des vecteurs contenant la séquence d'ADN codant la protéine testée, et les séquences d'ADN codant le ou les partenaires potentiels de cette protéine testée, et
- une deuxième expérience servant de témoin négatif, dans laquelle les 30 cellules hôtes sont transformées avec des vecteurs ne contenant pas la séquence d' ADN codant la protéine testée, mais seulement celles codant le ou les partenaires potentiels de cette protéine testée.
Ces deux expériences sont distinctes car les cellules hôtes sont transformées avec des vecteurs différents en fonction de l'expérience effectuée.
35 Outre le fait que cette nécessité d'effectuer ces deux expériences distinctes ne permet pas de contrôler rapidement l' influence de la protéine testée sur le ou les autres partenaires, il arrive fréquemment que l'absence de croissance de ces témoins négatifs, résulte de mutations ou de recombinaisons éventuelles dans un des vecteurs, ce qui conduit à des résultats erronés.
Un des buts de la présente invention, est précisément de fournir de nouvelles méthodes d'étude d'interactions entre protéines, ne nécessitant pas la mise en oeuvre de deux expériences distinctes, ces méthodes étant par conséquent plus simples à mettre en oeuvre, plus rapides et plus fiables que les méthodes actuellement proposées.
L' invention a pour objet l'utilisation d'au moins un promoteur conditionnel pour la mise en oeuvre d'une méthode de détection d'une (ou plusieurs) protéine(s) (ou polypeptides) interagissant directement ou indirectement avec au moins deux autres protéines (ou polypeptides) dans le cadre de la formation d'un complexe protéique, ou de l' inhibition de la formation d'un complexe protéique.
Par protéine interagissant directement avec au moins deux autres protéines dans le cadre de la formation d'un complexe protéique, on entend :
- toute protéine s 'associant à au moins deux autres protéines pour former avec ces dernières un complexe protéique constitué d'au moins trois protéines, ou
- toute protéine catalysant la formation d'un complexe protéique entre au moins deux protéines (sans pour autant s'associer à ces dernières pour former un complexe protéique), notamment par un mécanisme de modification conformationnelle d'un ou plusieurs des partenaires du complexe protéique.
Par protéine interagissant directement avec au moins deux autres protéines dans le cadre de l'inhibition de la formation d'un complexe protéique, on entend :
- toute protéine inhibant la formation du complexe protéique constitué d'au moins ces deux autres protéines susmentionnées, notamment par un mécanisme de compétition avec l'un des partenaires du complexe protéique. ou
- toute protéine catalysant l'inhibition de la formation du complexe protéique constitué d'au moins ces deux autres protéines, notamment par un mécanisme de modification conformationnelle d'un ou plusieurs des partenaires dudit complexe protéique.
Parmi les promoteurs conditionnels susceptibles d'être utilisés dans le cadre de la présente invention, on peut citer : - le promoteur Met25 (Kerjan P. et al , 1986), régulable en fonction de la concentration en méthionine, ou
- les promoteurs GAL1 ou GAL10 (Johnston and Davis, 1984), régulables en fonction de la concentration en galactose. L' invention a également pour objet toute méthode de détection d'une protéine telle que définie ci-dessus interagissant avec au moins deux protéines déterminées, dans le cadre de la formation d'un complexe protéique, ou de l ' inhibition de la formation d'un complexe protéique, caractérisée en ce qu'elle
5 comprend :
- une étape de transformation de cellules hôtes, dont le génome contient un ou plusieurs gènes rapporteurs, avec un ou plusieurs vecteurs, de manière à ce que le génome de ces cellules hôtes contienne la séquence d'ADN codant la protéine testée susceptible d'être détectée, ainsi que les séquences d'ADN
I O codant au moins deux protéines déterminées, la transcription de l 'une au moins des séquences d'ADN étant placée sous le contrôle d'un promoteur conditionnel,
- la comparaison des effets de la répression du promoteur conditionnel, avec les effets de l'activation de ce promoteur conditionnel, sur l'éventuelle transcription du ou des gènes rapporteurs susmentionnés, les résultats de cette
15 comparaison étant corrélables à la détection d'une interaction, ou au contraire d'une absence d' interaction entre la protéine testée et les protéines déterminées.
De préférence, la méthode décrite ci-dessus de détection d'une protéine interagissant directement ou indirectement avec au moins deux protéines déterminées, comprend : 20 - une étape de transformation de cellules hôtes, dont le génome contient un ou plusieurs gènes rapporteurs, avec un ou plusieurs vecteurs, de manière à ce que le génome de ces cellules hôtes contienne :
. d'une part la séquence d'ADN codant ladite protéine testée susceptible d' interagir avec au moins deux protéines déterminées, la 25 transcription de cette séquence d'ADN étant placée sous le contrôle d'un promoteur conditionnel,
. et, d'autre part, les séquences d'ADN codant lesdites protéines déterminées,
- la comparaison des effets de la répression du promoteur conditionnel, 30 avec les effets de l'activation de ce promoteur conditionnel, sur l'éventuelle transcription du ou des gènes rapporteurs susmentionnés, les résultats de cette comparaison étant corrélables à la détection d'une interaction, ou au contraire d'une absence d'interaction entre ladite protéine testée et lesdites protéines déterminées. 35 Par transformation de cellules hôtes avec un vecteur, dans ce qui précède et ce qui suit, on entend toute méthode permettant d'ajouter dans le génome desdites cellules, le contenu de séquences d'ADN d'un vecteur, notamment de type plasmide ; les cellules hôtes résultantes sont désignées dans ce qui piecede et ce qui suit par l'expression "cellules hôtes transformées" Par génome d'une cellule, on entend l'ensemble de l'ADN contenu dans une cellule, a savon l'ADN des chromosomes, des mitochondπes et des épisomes
Ainsi, la méthode de l'invention présente l'avantage de ne pas i compiendie deux expériences distinctes telles que décrites ci-dessus, dont une expei îence servant de témoin négatif par culture parallèle de cellules hôtes tianstoimees avec des vecteurs ne contenant pas de séquence d'ADN codant la piote e testée, aux fins de comparaison avec l'étape de culture des cellules hôtes tianstormees avec des vecteuis contenant l'ensemble des séquences 10 d'ADN codant les pi otéines susceptibles d' interagir entre elles
En effet, les cellules hôtes mises en culture dans la méthode de la piesente invention, soit a titie de témoin négatif (ou de témoin interne), soit poui mettre en évidence une interaction entre les protéines, sont transformées pat les mêmes vecteurs, évitant ainsi de conduire a des résultats erronés, comme \ ~ indique ci-dessus dans le cadre des méthodes actuellement proposées dans ce domaine
Ainsi, un des aspects particulièrement avantageux des méthodes de l'invention, est que le contrôle est interne à l'expérience, ce qui rend ces méthodes particulièrement adaptées au criblage d'une banque d'ADNc, ou d'une 20 banque synthétique dégénérée d'ohgonucléotides, susceptibles de contenir une
(ou plusieuis) séquence(s) d'ADN codant une (ou plusieurs) proteιne(s) tei agissant avec au moins deux autres piotéines déterminées
L' invention a plus particulièrement pour objet, toute méthode telle que decnte ci-dessus, dans laquelle ~ι - deux des protéines codées par les séquences d'ADN contenues dans le
(ou les) vecteur(s) utιhsé(s) pour la transformation desdites cellules hôtes, sont en fusion, pour l'une d'entre elles, avec un domaine de fixation à l'ADN, et poui l'autie, avec un domaine d'activation de la transcription, la transcription des séquences d'ADN codant ces deux protéines de fusion étant sous le contrôle 30 de piomoteurs constitutifs,
- l'autre de ces protéines, ou l'une au moins des autres protéines codées par la ou les séquences d'ADN contenues dans le ou les vecteurs susmentionnés, est codée par une séquence d'ADN dont la transcription est sous le contrôle d'un piomoteur conditionnel 5 Avantageusement, les deux protéines déterminées, ou au moins deux desdites piotéines déterminées, codées par les séquences d'ADN contenues dans le (ou les) vecteur(s) utιhsé(s) pour la transformation desdites cellules hôtes, sont en fusion, poui l'une d'entre elles, avec un domaine de fixation à l'ADN, et pour l'autre, avec un domaine d'activation de la transcription, la transcription des séquences d'ADN codant ces deux protéines de fusion étant sous le contrôle de promoteurs constitutifs.
Parmi les domaines de fixation à l'ADN susceptibles d'être utilisés dans le cadre de la présente invention, on peut citer :
- LexA (décrit notamment dans Vojtek A. et al. , 1993), ou
- GAL4 DBD (décrit notamment dans Fields S. and Song O. , 1989, et Chien C. -T. ét al. , 1991 , susmentionnés),
- ERE (Estrogen Response Elément) (décrit notamment dans Klein- Hitpass L. et al. , 1986, et dans le Douarin B. et al. , 1995).
Parmi les domaines d'activation de la transcription susceptibles d'être utilisés dans de cadre de la présente invention, on peut citer :
- l'activateur transcriptionnel de VP16 (décrit notamment dans Vojtek A. et al. susmentionné), ou - GAL4 AD (décrit notamment dans Fields S. and Song O. , 1989, et
Chien C.-T. ét al. , 1991 , susmentionnés).
La méthode susmentionnée de l' invention peut être effectuée à l'aide d'un vecteur contenant l'ensemble des séquences d'ADN codant pour les protéines en question, ou de préférence à l'aide de plusieurs vecteurs construits de telle manière que :
- l'un d'entre eux contient la séquence d'ADN codant la protéine en fusion avec le domaine de fixation à l'ADN, et dont la transcription est sous le contrôle d'un promoteur constitutif, tandis qu'un autre vecteur contient la séquence d'ADN codant la protéine en fusion avec le domaine d'activation, et dont la transcription est également sous le contrôle d'un promoteur constitutif,
- l'un des deux vecteurs susmentionnés, ou un autre vecteur, contient une séquence d'ADN codant une protéine susceptible d' interagir avec les précédentes, et dont la transcription est sous le contrôle d'un promoteur conditionnel, - le cas échéant, un ou plusieurs des vecteurs susmentionnés, ou un ou plusieurs autres vecteurs, contiennent une ou plusieurs séquences d'ADN codant une protéine susceptible d' interagir avec les précédentes, et dont la transcription est sous le contrôle d'un promoteur conditionnel (avantageusement différent du promoteur conditionnel précédent), ou d'un promoteur constitutif. Avantageusement, la méthode susmentionnée de l' invention est effectuée à l'aide de plusieurs vecteurs tels que :
- l'un d'entre eux contient une séquence d'ADN codant une des protéines déterminées en fusion avec le domaine de fixation à l'ADN , et dont la transcription est sous le contrôle d'un promoteur constitutif, tandis qu'un autre vecteur contient une séquence d'ADN codant une autre protéine déterminée en fusion avec le domaine d'activation, et dont la transcription est également sous le contrôle d'un promoteur constitutif, > - l'un des deux vecteurs susmentionnés, ou un autre vecteur, contient la séquence d'ADN codant la protéine testée susceptible d' interagir avec les précédentes, et dont la transcription est sous le contrôle d'un promoteur conditionnel,
- le cas échéant, un ou plusieurs des vecteurs susmentionnés, ou un ou m plusieurs autres vecteurs, contiennent une ou plusieurs séquences d'ADN codant une autre protéine déterminée susceptible d' interagir avec les précédentes, et dont la transcription est sous le contrôle d'un promoteur conditionnel différent du promoteur conditionnel précédent, ou sous le contrôle d'un promoteur constitutif. 15 A titre d'illustration, la détection d'une interaction entre une protéine testée et deux protéines déterminées peut être effectuée à l'aide de deux vecteurs tels que :
- l 'un d'entre eux contient la séquence d'ADN codant la protéine en fusion avec le domaine de fixation à l'ADN,
20 - l 'autre vecteur contient la séquence d'ADN codant la protéine en fusion avec le domaine d'activation,
- l'un des deux vecteurs susmentionnés contient la séquence d'ADN codant pour la protéine testée susceptible d' interagir avec les précédentes, et dont la transcription est sous le contrôle d'un promoteur conditionnel.
25 La méthode susmentionnée de l' invention, pour la détection d'une interaction entre une protéine testée et deux protéines déterminées, peut également être effectuée à l'aide de trois vecteurs tels que :
- le premier vecteur contient la séquence d'ADN codant la protéine en fusion avec le domaine de fixation à l'ADN,
30 - le deuxième vecteur contient la séquence d'ADN codant la protéine en fusion avec le domaine d'activation,
- le troisième vecteur contient la séquence d'ADN codant pour la protéine testée susceptible d' interagir avec les précédentes, et dont la transcription est sous le contrôle d'un promoteur conditionnel.
Î5 Avantageusement, les vecteurs susmentionnés contiennent également une séquence d'ADN correspondant à un gène de sélection, tel qu'un gène codant une enzyme du métabolisme d'un acide aminé particulier pour lequel la souche de cellules hôtes transformées est auxotrophe. Les cellules hôtes transformées par les vecteurs susmentionnés dans le cadre de la mise en oeuvre d'une méthode selon l'invention, sont avantageusement telles que leur génome comprend un ou plusieurs gènes rapporteurs dont la transcription est placée, pour chacun d'entre eux, sous le contrôle d'un opérateur reconnu par le domaine de fixation à l'ADN codé par l 'un des vecteurs susmentionnés, la transcription de ces gènes rapporteurs ayant lieu lorsqu' il y a formation, le cas échéant sous l'influence directe ou indirecte de la protéine testée, d'un complexe protéique entre les protéines déterminées produites dans les cellules hôtes transformées mises en culture. Parmi les gènes rapporteurs susceptibles d'être contenus dans le génome des cellules hôtes, on peut citer, à titre d'exemple :
- tout gène codant une enzyme susceptible de réagir avec un substrat déterminé dans des conditions permettant de détecter, voire de mesurer, le résultat de cette réaction enzymatique dans le milieu de culture des cellules transformées, notamment une enzyme réagissant avec un substrat dans le cadre d'une réaction colorée, par exemple le gène LacZ permettant de détecter, voire de mesurer, une activité β-galactosidase ; une telle activité β-galactosidase peut par exemple se traduire par une coloration bleue en utilisant le 5-bromo-4- chloro-3-indolyl β-D-galactoside (ou Xgal) à titre de substrat, ou encore par une coloration jaune en utilisant l'O-nitrophényl-β-galactoside (ONPG) à titre de substrat,
- tout gène codant une enzyme responsable du métabolisme d'un composé particulier, notamment d'un acide aminé, pour lequel la souche de cellules hôtes transformées est auxotrophe. Avantageusement, les cellules hôtes utilisées sont auxotrophes pour les acides aminés dont le métabolisme est sous la dépendance des enzymes codées par les gènes de sélection contenus dans les vecteurs susmentionnés et, le cas échéant, pour l'acide aminé dont le métabolisme est sous la dépendance de l'enzyme codée par un gène rapporteur contenu dans le génome desdites cellules hôtes.
A titre d'exemple, la souche de cellules hôtes utilisée est une souche de levures, notamment la souche de levure L40, dont le génome contient à titre de gènes rapporteurs le gène HIS3 (codant pour une enzyme du métabolisme de l 'histidine) et le gène LacZ codant la β-galactosidase, la transcription de ces gènes rapporteurs étant sous le contrôle d'un opérateur reconnu par le domaine de fixation à l'ADN LexA.
Avantageusement, dans le cadre de la détection d'une protéine telle que définie ci-dessus, susceptible d' interagir directement ou indirectement avec au moins deux protéines déterminées dans le cadre de la formation d'un complexe protéique, les séquences d'ADN codant lesdites protéines déterminées sont choisies parmi celles codant des protéines ne formant pas ou peu de complexes protéiques entre elles. Dans ce cas, il n'y a pas de transcription, voire une faible transcription, du ou des gènes rapporteurs des cellules hôtes transformées par le ou les vecteurs définis ci-dessus, lorsque ces cellules sont mises en culture en réprimant ledit promoteur conditionnel sous le contrôle duquel est placée la transcription de la séquence d'ADN codant la protéine testée, ou une des protéines déterminées.
La transcription du ou des gènes rapporteurs desdites cellules hôtes mises en culture en activant ledit promoteur conditionnel, voire une transcription accrue de ce ou ces gènes rapporteurs par rapport à la transcription de ces mêmes gènes en réprimant ledit promoteur conditionnel, est alors corrélable à la détection d'une interaction directe ou indirecte entre la protéine testée et lesdites protéines déterminées dans le cadre de la formation d'un complexe protéique.
Avantageusement, dans le cadre de la détection d'une protéine telle que définie ci-dessus, susceptible d'interagir directement ou indirectement avec au moins deux protéines déterminées dans le cadre de l' inhibition de la formation d'un complexe protéique, les séquences d'ADN codant lesdites protéines déterminées sont choisies parmi celles codant des protéines formant un complexe protéique entre elles.
Dans ce cas, il y a transcription du ou des gènes rapporteurs des cellules hôtes transformées par le ou les vecteurs définis ci-dessus, lorsque ces cellules sont mises en culture en réprimant ledit promoteur conditionnel sous le contrôle duquel est placée la transcription de la séquence d'ADN codant la protéine testée.
L'absence de transcription du ou des gènes rapporteurs desdites cellules hôtes mises en culture en activant ledit promoteur conditionnel, voire une transcription plus faible de ce ou ces gènes par rapport à la transcription de ces mêmes gènes en réprimant ledit promoteur conditionnel, est alors corrélable à la détection d'une interaction directe ou indirecte entre la protéine testée et lesdites protéines déterminées dans le cadre de l'inhibition de la formation d'un complexe protéique.
Selon un mode particulièrement avantageux de mise en oeuvre des méthodes décrites ci-dessus de l' invention : - le promoteur conditionnel est le promoteur Met25 régulable en fonction de la concentration de méthionine dans le milieu de culture des cellules hôtes transformées, ledit promoteur étant activé en l'absence de méthionine dans le milieu de culture, et réprimé en présence de méthionine, et - les gènes rapporteurs contenus dans le génome des cellules hôtes transformées sont :
• un gène codant une enzyme du métabolisme d'un acide aminé particulier, pour lequel la souche desdites cellules hôtes est auxotrophe par mutation dans ledit gène, « un gène codant une enzyme responsable de la coloration de milieu de culture lorsqu'elle réagit avec son substrat, tel que le gène LacZ codant la β- galactosidase.
Ainsi la détection, voire la mesure, de la croissance des colonies de la souche de cellules hôtes transformées dans un milieu de culture sélectif Ml qui, d'une part ne contient pas l'acide aminé dont le métabolisme est sous la dépendance de l'enzyme codée par le gène rapporteur contenu dans le génome desdites cellules hôtes et, d'autre part, ne contient pas de méthionine, est corrélable à la détection d'une interaction entre la protéine testée et les protéines déterminées dans le cadre de la formation d'un complexe protéique, dans la mesure où la croissance de ces colonies dans un milieu de culture sélectif M2 correspondant au milieu Ml précédent dans lequel de la méthionine est rajoutée, est nulle ou inférieure à celle mesurée en l'absence de méthionine.
De même, la détection, voire la mesure, d'une coloration dans le milieu de culture des cellules hôtes transformées, notamment d'une coloration bleue dans un milieu contenant le substrat XGal, mais ne contenant pas de méthionine, est corrélable à la détection d'une interaction entre la protéine testée et les protéines déterminées dans le cadre de la formation d'un complexe protéique, dans la mesure où cette coloration, dans le milieu de culture précédent dans lequel de la méthionine est rajoutée, est nulle ou inférieure à celle mesurée en absence de méthionine.
En revanche, l'absence de croissance des colonies de la souche de cellules hôtes transformées dans le milieu de culture Ml susmentionné, ou la détection d'une plus faible croissance de ces colonies dans le milieu Ml par rapport à la croissance détectée pour ces colonies dans le milieu M2 susmentionné, est corrélable à la détection d'une interaction entre la protéine testée et les protéines déterminées dans le cadre de l' inhibition de la formation d'un complexe protéique. De même, l'absence de coloration dans le milieu de culture des cellules hôtes transformées contenant le substrat spécifique de la coloration (notamment XGal) mais ne contenant pas de méthionine, où la détection d'une plus faible coloration dans ce milieu de culture par rapport au milieu de culture contenant de la méthionine, est corrélable à la détection d'un interaction entre la protéine testée et les protéines déterminées dans le cadre de l' inhibition de la formation d ' un complexe protéique.
La présente invention a plus particulièrement pour objet l 'application des méthodes décrites ci-dessus au criblage d'une banque d' ADNc, ou d'une banque synthétique dégénérée d'oligonucléotides, lesdites banques étant susceptibles de contenir une (ou plusieurs) séquence(s) d' ADN codant une (ou plusieurs) protéine(s) telle(s) que décrite(s) ci-dessus, interagissant directement ou indirectement avec au moins deux protéines déterminées dans le cadre de la formation d'un complexe protéique, ou de l' inhibition d'un complexe protéique. A titre d' illustration, la détection d'une protéine interagissant d irectement ou indirectement avec deux protéines déterminées A et B, dans le cadre de la formation d'un complexe protéique, ou de l ' inhibition de la formation d' un complexe protéique, est avantageusement effectuée selon la méthode suivante qui comprend : - la transformation de cellules hôtes avec :
• un vecteur contenant :
* une séquence d'ADN de fusion entre une séquence d' ADN codant une protéine déterminée A, et une séquence d' ADN codant un domaine d ' activation de la transcription à l'ADN, et * un gène de sélection codant une enzyme du métabolisme d ' un acide aminé désigné ci-après AA1 , . et un vecteur contenant :
* une séquence d'ADN de fusion entre une séquence d'ADN codant une protéine déterminée B différente de la précédente protéine A et une séquence d' ADN codant un domaine de fixation à l'ADN, et
* un gène de sélection codant une enzyme responsable du métabolisme d'un acide aminé désigné ci-après AA2, AA2 étant différent de AA1 , l 'un des deux vecteurs susmentionnés contenant une séquence d' ADN codant la protéine testée, la transcription de cette séquence d' ADN étant sous le contrôle du promoteur conditionnel Met25 , lesdites cellules hôtes étant telles que leur génome comprend, un gène rapporteur, notamment le gène LacZ, ainsi qu'un gène codant une enzyme du métabolisme d'un acide aminé désigné ci-après AA3, AA3 étant différent de AA1 et AA2, et telles qu'elles sont auxotrophes pour les acides aminés AA1 , AA2 et AA3.
- la sélection des cellules hôtes transformées par les deux vecteurs susmentionnés par mise en culture de ces dernières dans un milieu sélectif MO comprenant AA3 , mais ne contenant pas AA1 et AA2,
- la culture des cellules hôtes transformées sélectionnées lors de l'étape précédente, en activant ledit promoteur conditionnel dans un milieu de culture sélectif Ml ne contenant pas AA1 , AA2 et AA3, et ne contenant pas de méthionine,
- une étape de culture des cellules hôtes transformées dans un milieu de culture sélectif M2 en réprimant ledit promoteur conditionnel, M2 correspondant au milieu Ml auquel de la méthionine est rajoutée, cette étape de culture étant effectuée antérieurement, ou postérieurement, ou parallèlement à 1 ' étape de culture précédente ,
- la détection éventuelle d'une interaction entre la protéine testée et les protéines déterminées, de la manière indiquée ci-dessus.
Selon un mode de réalisation particulièrement avantageux des méthodes de l' invention, la séquence d'ADN codant la protéine testée, ou l'une des séquences d'ADN codant une protéine déterminée, est fusionnée, dans le ou les vecteurs susmentionnés, à une séquence d'ADN codant un peptide susceptible d'être reconnu spécifiquement par un anticorps, notamment une séquence d'ADN codant la tag Hémagglutinine (tag HA) susceptible d'être reconnue par l 'anticorps anti-HA (décrit notamment dans Hanke et al. , 1992). Ainsi, la formation d'un complexe protéique dans le cadre de la mise en oeuvre d'une méthode selon l' invention, peut encore être vérifiée par immunoprécipitation dudit complexe à partir d'un extrait total des cellules hôtes mises en culture et d'un anticorps tel que décrit ci-dessus. Cette immunoprécipitation permet de séparer et de purifier le complexe protéique à partir du milieu de culture desdites cellules, et, le cas échéant, de vérifier la structure et/ou l'activité biologique de ce complexe, notamment pour en déduire la nature de l' interaction entre la protéine testée et les protéines déterminées dans le cadre la formation de ce complexe (à savoir : interaction directe ou indirecte telle que décrite ci-dessus). Bien entendu, la présente invention ne se limite pas à l'étude de l' interaction entre trois protéines entre elles, et la méthode décrite ci-dessus dans le cadre de l'étude d' interactions entre trois protéines, peut être adaptée à l 'étude de l ' interaction entre quatre ou cinq protéines (voire plus encore). Dans ce cas, chaque séquence d'ADN codant une protéine - supplémentaire à tester, est introduite dans un des deux vecteurs utilisés dans la méthode décrite ci-dessus, voire dans d'autres vecteurs supplémentaires, et est avantageusement sous le contrôle d'un promoteur conditionnel de préférence différent du ou des autres promoteurs conditionnels déjà utilisés pour contrôler la transcription de séquences d'ADN codant d'autres protéines au sein des vecteurs susmentionnés.
L'invention sera davantage illustrée à l'aide des exemples qui suivent de l'étude d'interactions entre plusieurs protéines.
10
I - Etude de l'interaction entre les trois protéines Cdk7, Cycline H et MAT1.
Ces trois protéines sont des protéines du complexe multiprotéique i ^ TFIIH essentiel pour la transcription et la réparation de l ' ADN (Svejstrup et al. ,
1996) . Celui-ci peut se résoudre en deux sous-complexes : le "core" comportant 6 sous-unités et le complexe kinase formé des trois protéines, Cdk7 , Cycline H et MAT1. Ce dernier complexe existe également sous forme libre in vivo. Des expériences préalables de double-hybride et d' immunoprécipitation à partir 0 d ' extraits de cellules coinfectées avec des virus ayant intégré l'ADNc correspondant, ont montré que les protéines Cdk7 et Cycline H interagissent entre elles. Il n'a pas été possible avec le système double-hybride, de détecter des complexes de type Cdk7/MAT 1 ou Cycline H/MAT 1.
25 A ) Matériels et Méthodes
La souche de levure L40, auxotrophe pour l'histidine, la leucine, le tryptophane et l'adénine ainsi que les plasmides pLex9-3H dérivés du vecteur pBTM l l ό (Vojtek et ai , 1993), et pVP16 ont été utilisés . ι() En plus du marqueur de sélection TRP1 (gène codant pour une enzyme du métabolisme du tryptophane) et de LexA (contenant un domaine de liaison à l ' ADN) clone en aval du promoteur constitutif de l' alcool déshydrogènase (ADH), pLex9-3H comporte une cassette d'expression constituée du promoteur inductible Met25 , un tag Hémagglutinine (tag HA), un signal de localisation
3 nucléaire (NLS), les sites de clonage Notl et Srfl permettant d' intégrer l' ADN codant pour un polypeptide d' intérêt et le terminateur de transcription de la Phosphoglycérate kinase, tPGK (Figure 1) . La plasmide pVP16 contient un marqueur de sélection LEU2 (gène codant pour une enzyme du métabolisme de la leucine) et l' activateur transcriptionnel de VP16 clone en aval du promoteur de l'ADH.
Les ADNc codant pour Cdk7, Cycline H et MAT1 ont respectivement été clones en fusion avec LexA dans le plasmide pLex9-3H, sous la dépendance du promoteur Met25 dans pLex9-3H et en fusion avec VP16 dans le plasmide pVPlό (Figure 2).
a) Construction des plasmides Les ADNc codant pour chacune des trois protéines ont été amplifiés par
PCR à partir de constructions décrites dans Adamczewski J.P. et al. , 1996, avec des oligonucléotides spécifiques à chacun d'entre eux, avant d'être insérés dans les vecteurs adéquats.
La PCR permettant le clonage de Cdk7 en fusion avec LexA, dans le site EcoRI de pLex9-3H a été faite avec les oligonucléotides
5 ΑGTCGTGAATTCATGGCTCTGGACCTGAAG3 ' pour la partie 5' de l'ADNc et 5'GATCGTGAATTCTTAAAAAATTAGTTTCTTGGGCAA3' pour l'extrémité 3' , la protéine de fusion résultante étant LexA-Cdk7. La PCR permettant le clonage de cycline H en fusion avec le tag HA, dans le site Notl de pLex9-3H en aval du promoteur pMet25, a été faite avec les oligonucléotides
5'GATCGTGCGGCCGCAATGTACCACAACAGT3' pour la partie 5' de l'ADNc et 5'GATCGTGCGGCCGCTTAGAGAGATTCTACCAG pour l'extrémité 3' , la protéine de fusion résultante étant TagHA-Cycline H. Enfin, la PCR permettant le clonage de MAT1 en fusion avec VP16, dans le site EcoRI de pVPlό, a été faite avec les oligonucléotides
5 *GATCAGGAATTCCCATGGAGGATCAGGGTT3' pour la partie 5' de l'ADNc et 5'GATCAGGAATTCTTAACTGGGCTGCCAGAA3' pour l'extrémité 3' , la protéine de fusion résultante étant VP16-MAT1.
b) Transformation de la levure et sélection des transformants
La souche L40 [MATa, trpl , his3, leu2, ade2, LYS2: :(LexAop)4- HIS3, URA3: :(LexAop)g-LacZ] contient les gènes rapporteurs HIS3 (codant pour une enzyme du métabolisme de l'histidine) et LacZ en fusion avec un opérateur reconnu par LexA. Les cellules sont mises en culture pendant 16 heures dans du milieu complet (milieu YPD) et transformées par Cdk7-pLex9-
3H-CyclineH par la méthode à l'Acétate de Lithium (Schiestl R.H. et al. , 1993). pLex9-3H contenant le gène TRP1 , la sélection des transformants se fait sur milieu minimum HLA (contenant 0.06 g/1 d'histidine, 0.12 g/1 de leucine et 0. 12 g/1 d'adénine, en plus des 1.44 g/1 de "yeast nitrogen base without amino acids" et des 20 g/1 d'agarose, mais sans tryptophane). Un des clones transformés est alors remis en culture dans 20 ml de HLA pendant une nuit, puis transformé à son tour par MATlpVPlό de la même façon que précédemment. Puisque pVPlό comporte le gène LEU2, la sélection des doubles transformants se fera sur milieu minimum HA (contenant de l'adénine et de l'histidine mais pas de tryptophane ni de leucine).
c) Expression des protéines L'expression des protéines est contrôlée par immunoblots réalisés à partir des extraits de levures ayant poussé sur milieu HA, milieu sélectif pour la présence des plasmides. La répression induite par la présence de méthionine est également examinée (Rose M.D. , 1990).
d) Test d'interaction entre les trois partenaires
Deux types de contrôles sont disponibles : le test de croissance et le test d 'activité de la β-galactosidase.
Pour le test de croissance, trois clones différents, isolés à partir de cultures établies sur milieu HA, sont mis en suspension dans 50 μ\ d'eau stérile et dilués en cascade de 10 jusqu'à 10 Pour chacun des clones, une goutte de chaque dilution est déposée sur milieu sélectif pour l'interaction à trois (A, ne contenant que l'adénine) ainsi que sur un milieu inhibant l'expression de la cycline H (AM, contenant l'adénine et méthionine ImM).
L'activité β-galactosidase est évaluée sur des cellules ayant poussées une nuit dans le milieu adéquat (on mesurera la densité optique à 600nm
[D06oυ]) puis resuspendues dans un tampon phosphate (d'après Miller J. ,
1972) auquel sont ajoutées trois gouttes de chloroforme et 2 gouttes de détergent SDS 0, 1 % pour incubation de 5 minutes à 28°C ; la réactivation est initiée par 200/xl d'O-nitrophényl-β-galacatoside (ONPG) 4mg/ml puis arrêtée dès l'apparition d'une couleur jaune pâle par 500μl de bicarbonate Na2C03
1 niM. La DO420 est alors mesurée. L'activité β-galactosidase (en ml-Lmin-1) est calculée par la formule : (D0 2o) / [DO6u0) x vol. de culture (ml) x temps de réaction (min)] . (Rose M.D. , 1990).
B) Résultats
Dans un milieu dépourvu de méthionine (permettant l'expression non seulement de cdk7 et MATl mais également de la cycline H), on observe la croissance de colonies pour des dilutions allant de 10_1 à 10~4, alors que sur un milieu riche en méthionine (répression de la cycline H), on observe des colonies uniquement pour les deux premières dilutions (figure 3). De plus, la mesure de l 'activité β-galactosidase de la souche ayant poussé sur le milieu sans méthionine est de 1 15 ml-1 , min-1 alors que celle de la même souche ayant poussée en présence de méthionine, a une activité de 18 ml-1. min-1 , soit une inhibition de l 'activité β-Gal de plus de 6 fois (figure 4).
Ces résultats démontrent que le troisième polypeptide cycline H, catalyse (stabilise) la formation du couple d'activation Lex-cdk7/VP16-MATl , ce qui pourrait être dû à la formation d'un complexe à trois entre Cdk7, Cycline H et MATl .
La faible activité β-galactosidase visualisée lorsque la cycline H est réprimée, suggère une association faible entre MATl et Cdk7 ; ce qui ne peut être exclu d'après des expériences d' immunoprécipitation faites sur des extraits de cellules d' insectes, où une association faible Cdk7/MAT1 a été visualisée. Afin de vérifier la spécificité de l' interaction, Cdk7/cycline H/MAT1 , nous avons intégré dans le vecteur pVPlό, les autres sous unités du complexe TFIIH. Ainsi, cinq sous unités du core de TFIIH ont été testées pour une association avec Cdk7 en présence de cyline H. Aucune interaction n'a pu être visualisée que ce soit par le test de croissance ou le test β-galactosidase comme illustré (figure 4). L'expression de Cdk7 et de Cycline H (Cdk7-pLex9-3H-
Cycline H), d'une part et de VP16 seul (ne contenant pas de protéine fusionnée) d'autre part, donne une réponse équivalent au bruit de fond, que ce soit pour le test de croissance ou celui de l'activité β-galactosidase (figure 4).
Les résultats des tests d'interaction d'une part et la présence des trois protéines mise en évidence par western blot d'autre part, suggèrent fortement l 'existence d'un complexe ternaire contenant les protéines Cdk7, cycline H et MATl . Afin de visualiser un tel complexe ternaire, un extrait total de levure ayant poussé sur milieu A a été immunoprécipité par l'intermédiaire du peptide de fusion tag HA de la cycline H. Ainsi, l'anticorps anti-HA retient non seulement la cycline H, mais aussi Cdk7 et MATl . De plus, le complexe ainsi purifié possède le même type d'activité CTD kinase que le complexe isolé différemment.
II - Inhibition de l'interaction entre les protéines Ras et Raf
Ras et Raf sont deux protéines oncogènes qui interagissent entre elles avec pour conséquence une implication potentielle dans la transduction de signaux contrôlant les phénomènes de croissance et de différenciation cellulaire. L' inhibition de contact de ces deux protéines peut être étudiée soit par criblage de banque d'oligopeptides soit en impliquant un troisième partenaire identique à l 'un des deux autres polypeptides formant l' activateur transcriptionnel, mais ne contenant pas de séquence de fusion. Afin de contrôler la spécificité de 1 ' interaction Ras/Raf , le troisième partenaire sera sous le contrôle du promoteur inductible Met25.
A) Matériels et méthodes :
Une cassette contenant le promoteur Met25, un épitope HA et un fragment d'ADN codant une séquence de localisation nucléaire, un site Notl, soit un site Bgl2, soit un site Srfl , un codon Stop et le terminateur PGK, a été insérée au niveau du site unique PvuII des plasmides pGBT9 (Bartel et al. , 1993), pGBTIO (Chardin et al. , 1993), pHP5, pBTMl lό (Vojtek et al , 1993) and pVJLlO (Julien-Flores et al , 1995), en donnant les plasmides pGBT9-3H, pGBT10-3H, pGBTl l-3H, pLex9-3H et pLexl0-3H, respectivement. L'expression du promoteur Met25 est réprimée en présence de 1 mM Méthionine.
Les plasmides dérivés de pGBT9-3H ont été construits de la manière suivante : Le cadre de lecture (ORF) de H-Ras(V12) (Fragment EcoRI-Sall de pBTM116-Ras (Vojtek et al. , 1993)) a été clone en phase avec le domaine de liaison à l'ADN de GAL4, le plasmide résultant étant [pGBT-Ras/Met-0] . Le plasmide [pGBT-Ras/Met-Raf] a été obtenu en ajoutant de part et d'autre du fragment EcoRI-BamHI de cRaf-1 provenant du plasmide pGAD-Raf (Van Aelst et a , 1993) une séquence de liaison contenant le site de clonage Notl, et en clonant ensuite le fragment résultant dans le site Notl de la cassette d'expression Met25 de [pGBT-Ras/Met-0] .
B) Résultats
Les cellules cotransformées avec [pGBT-Ras/Met-Raf] et pGAD-Raf sont LacZ + (transcription du gène de la β-galactosidase) en présence de méthionine, c'est-à-dire dans des conditions de répression du promoteur Met25. Les mêmes cellules sont LacZ- en absence de méthionine, à savoir dans des conditions de dérépression du promoteur Met25. Cette observation peut s'expliquer par le fait que la protéine sauvage Raf exprimée à partir du promoteur Met25 entre en compétition pour l' interaction avec celle exprimée à partir de [pGBT9-Ras/Met-Raf] , inhibant ainsi l'interaction entre les protéines de fusion GAL4DBD-Ras et GAL4AD-Raf.
Des contrôles préalables ont montré que la présence du promoteur inductible Met25 n'affecte pas l'interaction entre les deux produits provenant des séquences de fusion, que celui-ci soit actif ou réprimé.
Les plasmides décrits ci-dessus peuvent être utilisés pour identifier des peptides inhibant une interaction entre des protéines, par exemple en exprimant une banque synthétique dégénérée d' oligonucléotides sous le contrôle du promoteur Met25.
L' inhibition de l'interaction peut être détectée par un test LacZ dans des conditions de dérépression du promoteur Met25 ; le phénotype LacZ+ pourrait être restauré en présence de méthionine, prouvant que l'inhibition est due à l'expression du promoteur Met25 mais pas à d'autres événements tels qu'une mutation.
Tableau 1 :
Légende du Tableau 1
Dans pGBT935, l'insertion de l'ADNc codant la protéine Ras (c-h-Ras ; Vojtek. 1993) en phase avec la région codante du domaine de fixation à l'ADN GAL4 (GAL-DBD) conduit au plasmide [pGBT935, Met25-0] ; l'ADNc codant pour la protéine Raf (c-Raf-1 ; Van Aelst, 1993) clone en phase avec la région codante du site de localisation nucléaire lié à l'épitope HA (HA-NLS) dans le plasmide [pGBT935, Met25-0] conduit au plasmide [pGBT935. Met25-Raf]. Le plasmide pGAD-Raf permet l'expression d'une protéine c-Raf-1 fusionnée au domaine d'activation GAL4 (AD-Raf). L é g e n d e s d e s f i g u r e s
Figure 1 :
Le vecteur pLex9-3H dérivé du vecteur pBTMl lό. La partie pBTMl lό contient, en plus des séquences nécessaires à sa réplication dans E.coli, le marqueur de sélection TRP1 et l' activateur transcriptionnel LexA clone en aval du promoteur (P) et en amont du terminateur (T) de l'ADH. pLex9-3H possède également une cassette d'expression contenant le promoteur régulable Met25. un tag HA, une séquence de localisation nucléaire (NLS), et un terminateur tPGK. Les sites d'insertion de l'ADNc d'intérêt sont indiqués.
Figure 2 :
L'ADNc codant Cdk7 est clone en fusion avec LexA, celui de la cycline H est en fusion avec le tag HA, en aval du promoteur régulable Met25, dans le plasmide pLex9-3H alors que l'ADNc et MATl est clone en fusion avec VP16 dans le plasmide pVPlό. Ce dernier contient le marqueur de sélection
LEU2 et le domaine d'activation de VP16 en aval du promoteur constitutif ADH.
Figure 3 :
A : test de croissance de trois clones de levures transformées par les plasmides Cdk7-pLex9-3H-Cycline H et MATl-pVP16 sur un milieu dépourvu (Met- : méthionine dérépression) et riche (Met+ 1 mM : méthionine répression) en méthionine. Les différentes dilutions sont indiquées au centre de la figure.
B : activité β-galactosidase des extraits de levures transformées par les vecteurs Cdk7-pLex9-3H-Cycline H d'une part et les vecteurs exprimant la protéine VP16 fusionnée à XPB, XPD, p62, p44, p34 ou MATl ou VP16 seul (VP16) d'autre part, ayant poussé en présence ( + ) ou en absence (-) de méthionine. Les unités β-gal sont indiquées en ml- 1. min" 1 . Figure 4 :
Les cellules de la souche de levure HF7c cotransformées avec des couples de plasmides sont sélectionnées dans un milieu ne contenant pas de tryptophane et de leucine (Rose, 1990) ; les colonies sont réparties dans un milieu ne contenant pas de tryptophane, ni de leucine, et contenant ou ne contenant pas de méthionine. Après 24 heures à 30°C, les boîtes ont été répliquées pour tester l'hypotrophie à l'histidine (résultats non montrés) et pour l'expression de LacZ (Chardin, 1993), en présence ou en absence de métfjionine.
Références
Adamczewski J.P., Rossignol M., Tasan J.P., Nigg E.A., Moncollin
V and Egly J.M. (1996), EMBOJ., 15, 1877-1884.
Bartel P.L., Chien C.T., Sternglantz R. and Fields S. (1993), in Cellular Interactions in development: A practical approach. (Hartley D.A., éd.).153-179, Oxford University Press, Oxford.
Chardin P., Camonis J.H., Gale N.W., Van Aelst L., Schlessinger L, Wigler M. H. and Bar-Sagi D. (1993), Science 260, 1338-1343.
Chien C.-T., Bartel P., Sternglanz R. and Fields S. (1991), Proc. Natl.
Acad. Sci 88, 9578-9582.
Fields S. and Song O. (1989), Nature (London), 340, 245-246.
Hanke et al. (1992), J. Gen. Virol., 73, 653-660.
Johnston M. and Davis R.W. (1984). Séquences that regulate the divergent GAL1-GAL10 promoter in Saccharomyces cerevisiae. Molecular and Cellular Biology, 4, 1440-1448.
Julien-Flores V., Dorseuil O., Romero F., Letourneur F., Saragosti S.. Berger R., Tavitian A., Gacon G. and Camonis J.H. (1995) J. Biol Chem.270,
22473-7.
Kerjan P., Cherest H. and Surdin-Kerjan Y. (1986) ; Nucléotide séquence of the Saccharomyces cerevisiae. Met25 gène - Nucleic Acids Research, 14, 7861-7871.
Klein-Hitpass L. et al (1986), Cell, 46, 1053-1061.
Le Douarin B. et al. (1995), Nucleic Acids Research, 23, 876-878 Miller J. (1972), Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor, NY ; Cold Spring Harbor Laboratory Press.
Rose M.D. , Winston F. and Hieter P. (1990), Methods in yeast i genetics A laboratory course manual Cold Spring Harbor, NY ; Cold Spring Harbor Laboratory Press.
Schiestl R.H. , Manivasakam P. , Woods R.A. and Gietz R.D. (1993),
Methods 5, 79-85. 0
Svejstrup J.Q. , Vichi P. and Egly J.M. (1996), The multiple rôles of transcription/repair factor TFIIH. Trend. Biol. Sci. 21, 346-350.
Van Aelst L. , Barr M. , Marcus S. , Polverino A. and Wigler M. n (1993), Froc. Natl. Acad. Sci. 90, 6213-6217.
Vojtek A. , Hollenberg S. M. , Cooper J.A. (1993), Cell, 74, 205-214.
Zhang J. and Lautar S. , A yeast three-hybrid method to clone ternary 0 protein complex components. Analytical biochemistry (1996), 242, 68-72.

Claims

R E V E N D I C A T I O N S
1. Méthode de détection d'une protéine interagissant directement ou indirectement avec au moins deux protéines déterminées, caractérisée en ce qu'elle comprend :
- une étape de transformation de cellules hôtes, dont le génome contient un ou plusieurs gènes rapporteurs, avec un ou plusieurs vecteurs, de manière à ce que le génome de ces cellules hôtes contienne :
. d'une part la séquence d'ADN codant ladite protéine testée susceptible d' interagir avec au moins deux protéines déterminées, la transcription de cette séquence d'ADN étant placée sous le contrôle d'un promoteur conditionnel, . et, d'autre part, les séquences d'ADN codant lesdites protéines déterminées,
- la comparaison des effets de la répression du promoteur conditionnel, avec les effets de l 'activation de ce promoteur conditionnel, sur l'éventuelle transcription du ou des gènes rapporteurs susmentionnés, les résultats de cette comparaison étant corrélables à la détection d'une interaction, ou au contraire d'une absence d' interaction entre ladite protéine testée et lesdites protéines déterminées.
2. Méthode selon la revendication 1 , caractérisée en ce que les deux protéines déterminées, ou au moins deux desdites protéines déterminées, codées par les séquences d'ADN contenues dans le (ou les) vecteur(s) utilisé(s) pour la transformation desdites cellules hôtes, sont en fusion, pour l'une d'entre elles, avec un domaine de fixation à l'ADN, et pour l'autre, avec un domaine d'activation de la transcription, la transcription des séquences d'ADN codant ces deux protéines de fusion étant sous le contrôle de promoteurs constitutifs.
3. Méthode selon la revendication 1 ou la revendication 2, caractérisée en ce qu'elle est effectuée à l'aide de plusieurs vecteurs tels que :
- l'un d'entre eux contient une séquence d'ADN codant une des protéines déterminées en fusion avec le domaine de fixation à l'ADN, et dont la transcription est sous le contrôle d'un promoteur constitutif, tandis qu'un autre vecteur contient une séquence d'ADN codant une autre protéine déterminée en fusion avec le domaine d'activation, et dont la transcription est également sous le contrôle d'un promoteur constitutif,
- l'un des deux vecteurs susmentionnés, ou un autre vecteur, contient la séquence d'ADN codant la protéine testée susceptible d' interagir avec les précédentes, et dont la transcription est sous le contrôle d'un promoteur conditionnel,
- le cas échéant, un ou plusieurs des vecteurs susmentionnés, ou un ou plusieurs autres vecteurs, contiennent une ou plusieurs séquences d'ADN codant une autre protéine déterminée susceptible d'interagir avec les précédentes, et dont la transcription est sous le contrôle d'un promoteur conditionnel différent du promoteur conditionnel précédent, ou sous le contrôle d'un promoteur constitutif.
4. Méthode selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisée en ce que les cellules hôtes transformées sont telles que leur génome comprend un ou plusieurs gènes rapporteurs dont la transcription est placée, pour chacun d'entre eux, sous le contrôle d'un opérateur reconnu par le domaine de fixation à l 'ADN codé par l'un des vecteurs susmentionnés, la transcription de ces gènes rapporteurs ayant lieu lorsqu'il y a formation, le cas échéant sous l' influence directe ou indirecte de la protéine testée, d'un complexe protéique entre les protéines déterminées produites dans les cellules hôtes transformées mises en culture.
5. Méthode selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisée en ce que :
- le promoteur conditionnel est le promoteur Met25 régulable en fonction de la concentration de méthionine dans le milieu de culture des cellules hôtes transformées, ledit promoteur étant activé en l'absence de méthionine dans le milieu de culture, et réprimé en présence de méthionine, et - les gènes rapporteurs contenus dans le génome des cellules hôtes transformées sont :
• tout gène codant une enzyme susceptible de réagir avec un substrat déterminé dans des conditions permettant de détecter, voire de mesurer, le résultat de cette réaction enzymatique dans le milieu de culture des cellules transformées, notamment une enzyme réagissant avec un substrat dans le cadre d'une réaction colorée, par exemple le gène LacZ permettant de détecter, voire de mesurer, une activité β-galactosidase, • tout gène codant une enzyme responsable du métabolisme d'un composé particulier, notamment d'un acide aminé, pour lequel la souche de cellules hôtes transformées est auxotrophe.
5 6. Méthode selon l'une des revendications 1 à 5, pour la détection :
- de toute protéine s 'associant à au moins deux autres protéines déterminées pour former avec ces dernières un complexe protéique constitué d 'au moins trois protéines, ou
- de toute protéine catalysant la formation d'un complexe protéique ι o entre au moins deux protéines déterminées, notamment par un mécanisme de modification conformationnelle d'un ou plusieurs des partenaires du complexe protéique.
7. Méthode selon l'une la revendication 6, caractérisée en ce que :
15 - les séquences d'ADN codant pour lesdites protéines déterminées sont choisies parmi celles codant pour des protéines ne formant pas ou peu de complexes protéiques entre elles,
- la transcription du ou des gènes rapporteurs desdites cellules hôtes mises en culture en activant ledit promoteur conditionnel, sous le contrôle
20 duquel est placée la transcription de la séquence d'ADN codant la protéine testée, voire une transcription accrue de ce ou ces gènes rapporteurs, par rapport à la transcription de ces mêmes gènes rapporteurs en réprimant ledit promoteur conditionnel, est alors corrélable à la détection d'une interaction directe ou indirecte entre la protéine testée et lesdites protéines déterminées dans
25 le cadre de la formation d'un complexe protéique.
8. Méthode selon l'une des revendications 1 à 6, pour la détection :
- de toute protéine inhibant la formation d'un complexe protéique constitué d'au moins deux autres protéines déterminées, notamment par un
30 mécanisme de compétition avec l'un des partenaires du complexe protéique, ou
- de toute protéine catalysant l'inhibition de la formation d'un complexe protéique constitué d'au moins deux autres protéines déterminées, notamment par un mécanisme de modification conformationnelle d'un ou plusieurs des partenaires dudit complexe protéique.
35
9. Méthode selon la revendication 8, caractérisée en ce que :
- les séquences d'ADN codant pour lesdites protéines déterminées sont choisies parmi celles codant pour des protéines formant un complexe protéique entre elles, et
- l'absence de transcription du ou des gènes rapporteurs desdites cellules hôtes mises en culture en activant ledit promoteur conditionnel, sous le contrôle duquel est placée la transcription de la séquence d'ADN codant la protéine testée, voire une transcription plus faible de ce ou ces gènes rapporteurs, par rapport à la transcription de ces mêmes gènes rapporteurs en réprimant ledit promoteur conditionnel, est alors corrélable à la détection d'une interaction directe ou indirecte entre la protéine testée et lesdites protéines déterminées dans le cadre de l'inhibition de la formation d'un complexe protéique.
EP98920567A 1997-04-03 1998-04-03 Methodes de detection d'interactions entre plusieurs proteines Withdrawn EP0977840A2 (fr)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
FR9704084 1997-04-03
FR9704084A FR2761697B1 (fr) 1997-04-03 1997-04-03 Methodes de detection d'interactions entre plusieurs proteines
PCT/FR1998/000685 WO1998044099A2 (fr) 1997-04-03 1998-04-03 Methodes de detection d'interactions entre plusieurs proteines

Publications (1)

Publication Number Publication Date
EP0977840A2 true EP0977840A2 (fr) 2000-02-09

Family

ID=9505488

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EP98920567A Withdrawn EP0977840A2 (fr) 1997-04-03 1998-04-03 Methodes de detection d'interactions entre plusieurs proteines

Country Status (7)

Country Link
US (1) US6479237B1 (fr)
EP (1) EP0977840A2 (fr)
JP (1) JP2001522237A (fr)
AU (1) AU7338298A (fr)
CA (1) CA2285623A1 (fr)
FR (1) FR2761697B1 (fr)
WO (1) WO1998044099A2 (fr)

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7074902B1 (en) 1998-04-27 2006-07-11 Warf Wisconsin Alumni Research Foundation Antibody specific for a DNA repair protein
US7122343B1 (en) * 1998-04-27 2006-10-17 Wisconsin Alumni Research Foundation Methods to alter levels of a DNA repair protein
US20030104427A1 (en) * 2001-06-25 2003-06-05 Petrini John H.J. Methods to modulate telomere structure and function
CN116875518A (zh) 2018-07-06 2023-10-13 科罗拉多州立大学董事会法人团体 用于构建和检测生物活性剂的基因编码系统

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5989808A (en) * 1994-06-14 1999-11-23 American Cyanamid Company Identification of compounds affecting specific interaction of peptide binding pairs
EP0817843A2 (fr) * 1995-03-31 1998-01-14 AMERSHAM INTERNATIONAL plc Vecteurs d'expression differentielle
CA2253433A1 (fr) * 1996-04-29 1997-11-06 The Johns Hopkins University School Of Medicine Regulateur de la degradation de l'arn chez les mammiferes induite par des transcrits non-sens

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
See references of WO9844099A2 *

Also Published As

Publication number Publication date
JP2001522237A (ja) 2001-11-13
AU7338298A (en) 1998-10-22
FR2761697B1 (fr) 1999-05-28
WO1998044099A3 (fr) 1998-12-30
CA2285623A1 (fr) 1998-10-08
US6479237B1 (en) 2002-11-12
WO1998044099A2 (fr) 1998-10-08
US20020164587A1 (en) 2002-11-07
FR2761697A1 (fr) 1998-10-09

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Kuras et al. A heteromeric complex containing the centromere binding factor 1 and two basic leucine zipper factors, Met4 and Met28, mediates the transcription activation of yeast sulfur metabolism.
Le et al. Two new S‐phase‐specific genes from Saccharomyces cerevisiae
Fulgosi et al. A novel multi-functional chloroplast protein: identification of a 40 kDa immunophilin-like protein located in the thylakoid lumen
JP3537141B2 (ja) 新種蛋白質分離のための相互作用を用いる補捉システム
Cid et al. Dynamic localization of the Swe1 regulator Hsl7 during the Saccharomyces cerevisiae cell cycle
Behrsin et al. Functionally important residues in the peptidyl-prolyl isomerase Pin1 revealed by unigenic evolution
JPH10500865A (ja) タンパク質−ｒｎａ相互作用の検出システム
CA2246300A1 (fr) Essai a base de cellules
El Bakkoury et al. Recruitment of the yeast MADS‐box proteins, ArgRI and Mcm1 by the pleiotropic factor ArgRIII is required for their stability
Weisman et al. A multicopy suppressor of a cell cycle defect in S. pombe encodes a heat shock‐inducible 40 kDa cyclophilin‐like protein.
JPH11506608A (ja) 細胞傷害性に基づく遺伝的選択システム（ｔｏｘｓｅｌ）
de Soultrait et al. HIV-1 integrase interacts with yeast microtubule-associated proteins
US6074829A (en) Relating to assay systems
US6326150B1 (en) Yeast interaction trap assay
Su-Jin et al. Role of RNA polymerase II carboxy terminal domain phosphorylation in DNA damage response
JPH08509132A (ja) ガゼインキナーゼ▲ｉ▼と相互作用するタンパク質に関連する方法および物質
EP0977840A2 (fr) Methodes de detection d'interactions entre plusieurs proteines
WO1999038969A1 (fr) PROTEINE HUMAINE β-TrCP
Ii et al. Mus81 functions in the quality control of replication forks at the rDNA and is involved in the maintenance of rDNA repeat number in Saccharomyces cerevisiae
JP2001501809A (ja) カンディダ アルビカンスからの新規ｔｆｉｉｂ転写ファクター、それをコード化する核酸配列、及びカンディダ アルビカンス増殖の阻害のためのスクリーニング方法
Hart et al. Analysis of the NF-κB p50 dimer interface by diversity screening
Cowell Yeast two-hybrid library screening
JP2003517307A (ja) ユビキチン−リガーゼｓｃｆ複合体の活性化を調節し得る化合物の細胞スクリーニング方法及びその使用
Bolger Molecular genetic approaches I: Two-hybrid systems
Nunez Recruitment of the Lipid Kinase Mss4 to the Meiotic Spindle Pole Body Promotes Membrane Formation in Saccharomyces cerevisiae

Legal Events

Date Code Title Description
PUAI Public reference made under article 153(3) epc to a published international application that has entered the european phase

Free format text: ORIGINAL CODE: 0009012

17P Request for examination filed

Effective date: 19990923

AK Designated contracting states

Kind code of ref document: A2

Designated state(s): AT BE CH CY DE DK ES FI FR GB GR IE IT LI LU MC NL PT SE

17Q First examination report despatched

Effective date: 20030502

STAA Information on the status of an ep patent application or granted ep patent

Free format text: STATUS: THE APPLICATION IS DEEMED TO BE WITHDRAWN

18D Application deemed to be withdrawn

Effective date: 20030913