JP2001522237A

JP2001522237A - 数種のタンパク質間の相互作用を検出する方法

Info

Publication number: JP2001522237A
Application number: JP54126398A
Authority: JP
Inventors: カモニ，ジャック; ロメロ−ポルティーヨ，フランシスコ; アタ，リカルド; エグリ，ジャン−マルク; ティロード，フランク
Original assignee: アンスティチュ・ナショナル・ドゥ・ラ・サンテ・エ・ドゥ・ラ・ルシェルシュ・メディカル（インセルム）; サントル・ナショナル・ドゥ・ラ・ルシェルシェ・シャンティフィク
Priority date: 1997-04-03
Filing date: 1998-04-03
Publication date: 2001-11-13
Also published as: AU7338298A; FR2761697B1; WO1998044099A3; CA2285623A1; US6479237B1; EP0977840A2; WO1998044099A2; US20020164587A1; FR2761697A1

Abstract

(57)【要約】本発明の目的は、タンパク質複合体生成の間又はタンパク質複合体生成の阻害間に少なくともの２種の他のタンパク質と直接又は間接的に相互作用するタンパク質の１種以上を検出する方法を実施するために、少なくとも１種の条件プロモータを使用することである。

Description

【発明の詳細な説明】数種のタンパク質間の相互作用を検出する方法本発明は、タンパク質複合体生成又はタンパク質複合体生成の阻害において、含まれるタンパク質を検出又は同定する方法に関する。タンパク質間の相互作用を研究するための現在可能な方法の中で、ツーハイブリッドシステム及び更に最近にはスリーハイブリッドシステムが特に有効な方法であることが分かった。ツーハイブリッドシステムは、酵母中の転写アクチベーターの再構成に基づいている(Fields S．and Song O.，1989;Chien C.-T．et al.，1991)。第一のタンパク質はＤＮＡ結合ドメインとの融合によりクローン化されるが、第二のタンパク質は転写活性化ドメインとの融合によりクローン化される。問題の２種のタンパク質が共に相互作用すると、レポーター遺伝子の転写を可能にする転写アクチベーターが形成される。再びツーハイブリッド原理を用いて、使用されるベクターへ第三のパートナーをコードするＤＮＡ配列を挿入することにより、スリーハイブリッドシステムが Zhang及びLauter（Zhang J．et al.，1996）により開発された。しかし、現在入手可能なツーハイブリッド及びスリーハイブリッドシステムは負の制御による相互作用の試験を行う必要のある主要な欠点を有し、それは次の二つの別々の実験を行うことに対応している： −宿主細胞が試験タンパク質をコードするＤＮＡ配列、及びこのタンパク質のパートナーをコードするＤＮＡ配列を含むベクターにより形質転換される第一の実験、及び −宿主細胞が試験タンパク質をコードするＤＮＡ配列を含まないが、この試験タンパク質の可能性のあるパートナーをコードするものだけを含むベクターにより形質転換される、負の制御として働く第二の実験。宿主細胞は行われる実験に依存して異なるベクターにより形質転換されるので、これらの二つの実験は明確に異なる。これらの二つの別々の実験行うことが必要である事実は他のパートナー（類）での試験タンパク質の影響の迅速な監視を可能にしないという事実の他に、これらの負の制御の増殖の欠如がしばしばベクターの一つにおいて可能な突然変異又は組換えから生じ、したがって誤った結果に導く。本発明の目的の一つは、特異的に、行われるべき二つの別々の実験を必要とせず、結果的に行うことが簡単で、迅速で、現在提供される方法より信頼性がある、タンパク質間の相互作用を研究するための新しい方法を提供することである。本発明は、タンパク質複合体生成又はタンパク質複合体生成の阻害において、少なくとも２種の他のタンパク質（又はポリペプチド）と直接的又は間接的に相互作用する１種（又はそれ以上）のタンパク質（又はポリペプチド）を検出するための方法を行うための少なくとも１種の条件プロモータの使用に関する。表現「タンパク質複合体の生成の間に少なくとも他の２種のタンパク質と直接相互作用するタンパク質」は： −少なくとも２種の他のタンパク質と結合して、後者により３種のタンパク質からなるタンパク質複合体を生成するいかなるタンパク質も、又は −少なくとも２種のタンパク質間のタンパク質複合体の生成を(しかしタンパク質複合体を生成するためにこれらのタンパク質と結合せずに)、特にタンパク質複合体の１種以上のパートナーのコンフォーメーションの改変によって、触媒するいかなるタンパク質をも意味する。表現「タンパク質複合体生成の阻害の間に少なくとも他の２種のタンパク質と直接相互作用するタンパク質」は： −少なくともこれらの２種の他の上述のタンパク質からなるタンパク質複合体の生成を、特にタンパク質複合体のパートナーの一つとの競合機構によって、阻害するいかなるタンパク質も、又は −少なくともこれらの２種の他のタンパク質からなるタンパク質複合体生成の阻害を、特に該タンパク質複合体の一つつ以上のパートナーのコンフォーメーションの改変機構によって、触媒するいかなるタンパク質をも意味する。本発明に関連しての用いられる条件プロモータの中では： −メチオニン濃度の関数として調節される、プロモータＭｅｔ２５(Kerjan et al.，1986)、又は −ガラクトース濃度の関数として調節される、プロモータＧＡＬ１又はＧＡＬ１０(Johnston and Davis，1984)、について言及することができる。本発明は、タンパク質複合体生成又はタンパク質複合体生成の阻害において、少なくとも与えられた２種のタンパク質と相互作用する、上に定義したタンパク質を検出するいかなる方法にも関し、 −そのゲノムが、これらの宿主細胞のゲノムが検出できる試験タンパク質をコードするＤＮＡ配列及び少なくとも２種の与えられたタンパク質をコードするＤＮＡ配列、条件プロモータの制御下におかれるＤＮＡ配列の少なくとも一つの転写を含むような、１種以上のベクターを有する１種以上のレポーター遺伝子を含む宿主細胞を形質転換する段階、 −上述のレポーター遺伝子（類）の可能性のある転写において、条件プロモータの抑制の効果のこの条件プロモータの活性化の効果との比較を含み、それは相互作用の検出によるこの比較の結果に関連するか、又は、これに反して、試験タンパク質と与えられたタンパク質の相互作用の欠如に相関させることができることにより特徴づけられる。少なくとも２種の与えられたタンパク質と直接又は間接に相互作用するタンパク質を検出するための上記の方法は、好適には、 −そのゲノムが、宿主細胞のゲノムが・一方では、少なくとも２種の与えられたタンパク質と相互作用できる該試験タンパク質をコードするＤＮＡ配列(このＤＮＡ転写は条件プロモータの制御下に置かれている)、及び・他方では、該与えられたタンパク質をコードするＤＮＡ配列を含むような１種以上のベクターを有する１種以上のレポーター遺伝子を含む宿主細胞を形質転換する段階 −上述のレポーター遺伝子（類）の可能な転写において、この条件プロモータの活性化の効果の条件プロモータの抑制の効果との比較を含み、それは相互作用の検出とこの比較の結果、又は、反対に該試験タンパク質と該与えられたタンパク質の相互作用の欠如に相関することが可能である。上記及び下記の本文において、表現「ベクターによる宿主細胞の形質転換」は、ベクター、特にプラスミド型のベクターのＤＮＡ配列の内容を、該細胞のゲノムに挿入するためのいかなる方法をも意味し；得られる宿主細胞は、表現「形質転換された宿主細胞」により上記及び下記で表される。表現「細胞のゲノム」は、細胞に含まれるすべてのＤＮＡ、すなわち染色体、ミトコンドリア及びエピソームＤＮＡを意味する。このように、本発明の方法は、上記のように二つの別々の実験を含まない利点を有し、その一つは、互に相互作用できるタンパク質をコードするすべてのＤＮＡ配列を含むベクターにより形質転換された宿主細胞の培養の段階と、比較の目的で試験タンパク質をコードするいかなるＤＮＡ配列をも含まないベクターにより形質転換された宿主細胞の平行培養による負の制御として働いている。これに対する理由は、本発明の方法で培養された宿主細胞が、負の制御（又は内部制御）又はタンパク質間の相互作用を示すことのいずれかで、同じベクターで形質転換され、したがってこの分野で現在提供される方法に関連して上に示したように、誤った結果の発生を回避している。このように、本発明の方法の特に有利な特徴の一つは、制御が実験に固有であり、それによって、少なくとも２種の他の与えられたタンパク質と相互作用する１種（又はそれ以上）のタンパク質（類）をコードする１種（又はそれ以上）のＤＮＡ配列を含みやすいオリゴヌクレオチドのｃＤＮＡライブラリー又は縮重合成ライブラリーをスクリーニングするためにこれらの方法を特に適当にする。本発明は、更に特に上記のようないかなる方法にも関し、 −該宿主細胞の形質転換のために用いられるベクターに含まれるＤＮＡ配列によりコードされるタンパク質の２種について、一つは、ＤＮＡ結合ドメインに融合され、他は転写活性化ドメインに融合され、これら二つの融合タンパク質をコードするＤＮＡ配列の転写は構成的プロモータの制御下にあり、 −上述のベクター（類）に含まれるＤＮＡ配列によりコードされるこれらの他のタンパク質、又は少なくとも他のタンパク質の一つは、その転写が条件プロモータの制御下にあるＤＮＡ配列によりコードされる。有利なことに、該宿主細胞の形質転換のために使用されるベクター（類）に含まれるＤＮＡ配列でコードされる、２種の与えられたタンパク質、又は該与えられたタンパク質の少なくとも２種について、一つは、ＤＮＡ結合ドメインに融合され、他は転写活性化ドメインに融合され、これら２種の融合タンパク質をコードするＤＮＡ配列の転写は構成的プロモータの制御下にある。本発明に関連して使用することができるＤＮＡ結合ドメインのうちでは、 −ＬｅｘＡ(特に、Vojtek A．et al.，1993に記載)、又は −ＧＡＬ４ＤＢＤ(特に、上述のFields S．and Song O.，1989及びChien C. -T．et al.，1991に記載)、又は −ＥＲＥ（エストロゲン応答要素）(特に、Klein-Hitpass L．et al.，1986及びLe Douarin R．et al.，1995に記載)に言及することができる。本発明に関連して用いられる転写活性化ドメインのうちでは、 −ＶＰ１６転写アクチベーター(特に、上述のVojtek A.，に記載)、又は −ＧＡＬ４ＡＤ（特に、上述のFields S．and Song O.，1989及びChien C.- T．et al.，1991に記載）に言及することができる。本発明の上述の方法は、研究中のタンパク質をコードするＤＮＡ配列のすべてを含むベクターを用いてか、又は、好適には、 −それらの一つが、ＤＮＡ結合ドメインと融合するタンパク質をコードするＤＮＡ配列を含み、その転写は構成的プロモータの制御下にあるが、別のベクターは、活性化ドメインと融合するタンパク質をコードするＤＮＡ配列を含み、その転写は構成的プロモータの制御下にあり、 −上述の２種のベクターの一つ、又は別のベクターが、上記タンパク質と相互作用できるタンパク質をコードするＤＮＡ配列を含み、その転写は構成的プロモータの制御下にあり、 −適切ならば、上述のベクターの１種以上、又は他のベクターの１種以上が、上記タンパク質と相互作用できるタンパク質をコードする一つ又はそれ以上のＤＮＡ配列を含み、その転写は条件プロモータ（それは、好都合には上記条件プロモータとは異なる）又は構成的プロモータの制御下にあるように構築される数種のベクターを用いて行われる。本発明の上述の方法は、 −それらの一つが、ＤＮＡ結合ドメインと融合する与えられたタンパク質の一つをコードするＤＮＡ配列を含み、その転写は構成的プロモータの制御下にあるが、別のベクターが、活性化ドメインと融合する別の与えられたタンパク質をコードするＤＮＡ配列を含み、その転写も構成プロモータの制御下にあり、 −２種の上述のベクターの一つ、又は別のベクターが上記タンパク質と相互作用できる試験タンパク質をコードするＤＮＡ配列を含み、その転写は条件プロモータの制御下にあり、 −適切ならば、上述のベクターの１種以上、又は１種以上の他のベクターが、上記タンパク質と相互作用できる別の与えられたタンパク質をコードする一つ又はそれ以上のＤＮＡ配列を含み、その転写は上記条件プロモータとは異なる条件プロモータの制御下、又は構成的プロモータの制御下にあるような数種のベクターを用いて有利に行われる説明のために、試験タンパク質と２種の与えられたタンパク質の相互作用の検出は、 −それらの一つが、ＤＮＡ結合ドメインと融合するタンパク質をコードするＤＮＡ配列を含み、 −他のベクターが、活性化ドメインと融合するタンパク質をコードするＤＮＡ配列を含み、 −２種の上述のベクターの一つが上記タンパク質と相互作用できる試験タンパク質をコードするＤＮＡ配列を含み、その転写は条件プロモータの制御下にあるような二つのベクターを用いて行われる。試験タンパク質と２種の与えられたタンパク質の相互作用を検出するための本発明による上述の方法は、 −第一のベクターが、ＤＮＡ結合ドメインと融合するタンパク質をコードするＤＮＡ配列を含み、 −第二のベクターが、活性化ドメインと融合するタンパク質をコードするＤＮＡ配列を含み、 −第三のベクターが、上記タンパク質と相互作用できる試験タンパク質をコードするＤＮＡ配列を含み、その転写は条件プロモータの制御下にあるような二つのベクターを用いて行われる。上述のベクターは、好都合には、形質転換宿主細胞株が栄養素要求性であるために特異的アミノ酸の代謝酵素をコードする遺伝子のような、選択遺伝子に対応するＤＮＡ配列も含む。上述のベクターで形質転換された宿主細胞は、本発明による方法の実施に関連して、それらのゲノムが１種以上のレポーター遺伝子を含み、その転写のそれぞれが、上述のベクターの一つによりコードされるＤＮＡ結合ドメインにより認識されるオペレーターの制御下におかれ、これらのレポーター遺伝子の転写は、適切ならば、試験タンパク質の直接的又は間接的影響下で、培養した形質転換した宿主細胞に調製される与えられたタンパク質間のタンパク質複合体生成があるときに起こる。宿主細胞のゲノムに含まれることができるレポーター遺伝子のうちでは、例えば、 −形質転換細胞が培養される培地中のこの酵素反応の結果を検出又は測定さえも可能にする条件下で与えられた基質と反応できる酵素、特に着色反応において基質と反応する酵素をコードするいかなる遺伝子、例えばβ−ガラクトシダーゼ活性を検出、又は測定さえも可能にするＬａｃＺ遺伝子(そのようなβ−ガラクトシダーゼ活性は、例えば基質として５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル −β−Ｄ−ガラクトシド（又はＸｇａｌ）を用いる青色着色によって、又は代替では、基質としてＯ−ニトロフェニル−β−ガラクトシド（ＯＮＰＧ）を用いる黄色着色により反映される)、 −特異的化合物、特にアミノ酸の代謝に対応する酵素をコードするいかなる遺伝子（そのために形質転換宿主細胞株は栄養素必要性である）にも言及できる。用いられる宿主細胞は、好都合にはその代謝が上述のベクターに含まれる選択遺伝子でコードされる酵素に依存するアミノ酸に対して、及び適切ならば、その代謝が該宿主細胞のゲノムに含まれるレポーター遺伝子でコードされる酵素に依存するアミノ酸に対して、栄養素要求性である。例として、使用された宿主細胞株は、酵母株、特にＬ４０酵母株であり、そのゲノムは、レポーター遺伝子によって、ＨＩＳ３遺伝子（ヒスチジンの代謝に対して酵素をコードする）及びβ−ガラクトシダーゼをコードするＬａｃＺ遺伝子を含み、これらのレポーター遺伝子の転写はＬｅｘＡＤＮＡ結合ドメインで認識されるオペレーターの制御下にある。タンパク質複合体生成の間に少なくとも２種の与えられたタンパク質と直接又は間接に相互作用できる、上記に定義したようなタンパク質の検出において、該与えられたタンパク質をコードするＤＮＡ配列は、好都合には互にほとんど又は全くタンパク質複合体を生成しないタンパク質をコードするものから選ばれる。この場合には、試験タンパク質又は与えられたタンパク質類の一つをコードするＤＮＡ配列の転写が、その制御下に置かれ、該条件プロモータを抑制しながらそれらの細胞が培養されるとき、上に定義されたベクター（類）で形質転換された宿主細胞のレポーター遺伝子の転写は全く無いか、又はほとんど無い。該条件プロモータを活性化しながら培養された該宿主細胞のレポーター遺伝子（類）の転写、又は該条件プロモータを抑制しながらこれらの同じ遺伝子の転写と比較して、これ又はこれらのレポーター遺伝子の転写の増加さえをも、タンパク質複合体生成の間に、試験タンパク質と該与えられたタンパク質の直接又は間接相互作用の検出に関連させることができる。タンパク質複合体生成の阻害の間に、少なくとも２種の与えられたタンパク質と直接又は間接に相互作用できる、上に定義したようなタンパク質の検出に関連して、該与えられたタンパク質をコードするＤＮＡ配列は、好都合には相互にタンパク質複合体を生成するタンパク質をコードするものから選ばれる。この場合には、試験タンパク質をコードするＤＮＡ配列の転写が、その制御下に置かれ、該条件プロモータを抑制しながらこれらの細胞が培養されるとき、上に定義したベクター（類）により形質転換された宿主細胞のレポーター遺伝子の転写が存在する。該条件プロモータを活性化しながら培養した該宿主細胞のレポーター遺伝子の転写の欠如、又はこれ若しくはこれらの遺伝子の僅かな転写でさえも、該条件プロモータを抑制しながらこれらの同じ遺伝子の転写と比較して、タンパク質複合体生成の阻害の間に試験タンパク質と該与えられたタンパク質の直接又は間接相互作用に関連させることができる。上に記載されている本発明の方法の一つの特に有利な実施態様によって： −条件プロモータは、形質転換された宿主細胞の培養培地中のメチオニンの濃度の関数として調節することができる、プロモータＭｅｔ２５であり、該プロモータは、培養培地中のメチオニンの欠如で活性化され、メチオニンの存在で抑制され、そして −形質転換宿主細胞のゲノムに含まれるレポーター遺伝子は：・それに対して該宿主細胞の株が該遺伝子の変異により栄養素要求性である特異的アミノ酸の代謝に対する酵素をコードする遺伝子、・β−ガラクトシダーゼをコードするＬａｃＺ遺伝子のような、その基質と反応するとき、培養培地の着色に対応する酵素をコードする遺伝子コードである。このように、メチオニンが加えられる上記培養培地Ｍ１に対応する選択的培養培地Ｍ２中のこれらのコロニーの増殖が、ゼロ又はメチオニンの欠如で測定したものより低いので、選択的培養培地Ｍ１中の形質転換宿主細胞の株のコロニーの増殖の検出、又は測定さえもが、一方では、その代謝が該宿主細胞のゲノムに含まれるレポーター遺伝子によりコードされる酵素に依存するアミノ酸を含まず、他方では、タンパク質複合体生成の間に試験タンパク質と与えられたタンパク質の相互作用の検出に相関することができるメチオニンを含まない。同様に、メチオニンが加えられる上記培養培地中のこの着色が、ゼロ又はメチオニンの欠如で測定されたものより低いので、形質転換された宿主細胞の培養培地中の着色、特にメチオニンを含まないが、基質Ｘｇａｌを含む培地中の青色着色の検出、又は測定さえもが、タンパク質複合体生成の間に試験タンパク質と与えられたタンパク質の相互作用の検出に相関させることができる。他方、上述の培地Ｍ１中の形質転換された宿主細胞の株のコロニーの増殖の欠如、又は上述の培地Ｍ２中のこれらのコロニーで検出された増殖と比較して、培地Ｍ１中のこれらのコロニーの小さい増殖の検出は、タンパク質複合体生成の阻害の間に試験タンパク質と与えられたタンパク質の相互作用の検出に関連させることができる。同様に、メチオニンを含まないが、着色のために特異的基質（特にＸＧａｌ）を含む形質転換された宿主細胞の培養媒体における着色の欠如、又はメチオニン含む培養培地中よりこの培養培地中の弱い着色の検出は、タンパク質複合体生成の阻害の間に試験タンパク質と与えられたタンパク質の相互作用の検出と相関させることができる。本発明は、更に特に、タンパク質複合体生成又はタンパク質複合体生成の阻害の間に少なくとも二つの与えられたタンパク質と直接又は間接に相互作用する上記のような１種（又はそれ以上）のタンパク質をコードする一つ（又はそれ以上）の配列を含みやすいｃＤＮＡライブラリー又はオリゴヌクレオチドの縮退合成ライブラリーのスクリーニングへの上記の方法の適用に関する。説明のために、タンパク質複合体生成又はタンパク質複合体生成の阻害の間に２種の与えられたタンパク質Ａ及びＢと直接又は間接に相互作用するタンパク質の検出は次の方法によって好都合に行われ、それは： −宿主細胞の以下のベクターによる形質転換：・以下を含むベクター：＊与えられたタンパク質ＡをコードするＤＮＡ配列とＤＮＡ転写活性化ドメインをコードするＤＮＡ配列間の融合ＤＮＡ配列、及び＊ＡＡ１として以下に示されるアミノ酸の代謝のための酵素をコードする選択遺伝子、及び・以下を含むベクター：＊上記タンパク質Ａと異なる与えられたタンパク質ＢをコードするＤＮＡ配列とＤＮＡ結合ドメインをコードするＤＮＡ配列の間の融合ＤＮＡ、及び＊ＡＡ２として以下に示されるアミノ酸の代謝に応答する酵素をコードする選択遺伝子で、ＡＡ２はＡＡ１とは異なり、試験タンパク質をコードするＤＮＡ配列を含む二つの上述のベクターの一つ、このＤＮＡ配列の転写は条件プロモータＭｅｔ２５の制御下にあり、該宿主細胞は、それらのゲノムがレポーター遺伝子、特にＬａｃＺ遺伝子、及び以下にＡＡ３として示されるアミノ酸の代謝のための酵素をコードする遺伝子からなり、ＡＡ３はＡＡ１及びＡＡ２と異なるようなものであり、それらはアミノ酸ＡＡ１、ＡＡ２及びＡＡ３に対して栄養素要求性であるようなものであり、 −ＡＡ１又はＡＡ２を含まないが、ＡＡ３を含む選択的培地（ＭＯ）中でこれらの細胞の培養により二つの上述のベクターで形質転換された宿主細胞の選択、 −ＡＡ１、ＡＡ２又はＡＡ３を含まず、メチオニンを含まない、選択的培養培地Ｍ１中で該条件プロモータの活性化で、上記段階中に選択された形質転換宿主細胞の培養、及び該条件プロモータを抑制しながら選択的培地Ｍ２中で形質転換宿主細胞を培養する段階、ここでＭ２はメチオニンが加えられる培地Ｍ１に対応し、この培養段階は上記培養段階の前、後又は平行で行われ、 −上に示した方法で試験タンパク質と与えられたタンパク質間の相互作用の可能な検出を含む。本発明の方法の特に有利な実施態様によって、試験タンパク質をコードするＤＮＡ配列又は与えられたタンパク質をコードするＤＮＡ配列が、上記ベクター（類）で抗体によって特異的に認識されるペプチドをコードするＤＮＡ配列、特に抗−ＨＡ抗体（Hanke et al.，1992に特に記載）により認識されるタグヘムアグルチニン（ｔａｇＨＡ）をコードするＤＮＡ配列で、上述のベクター（類）に融合される。このように、本発明による方法の実施中にタンパク質複合体の生成は、培養した宿主細胞の全抽出物及び上記のような抗体を用いる該複合体の免疫沈降反応により検査することもできる。この免疫沈降反応は、該細胞の培養培地からタンパク質複合体の分離及び精製を可能にし、適切ならば、この複合体の構造及び／又は生物学的活性を試験すること、特にそのためにこの複合体生成の間に試験タンパク質と与えられたタンパク質間の相互作用の性質を推論することを可能にする (すなわち、：上記のような直接又は間接相互作用)。言うまでもなく、本発明は３種のタンパク質間の相互作用の研究に限定されず、３種のタンパク質間の相互作用に関連して、上記の方法は４又は５種（又はそれ以上さえも）のタンパク質間の相互作用の研究に適用される。この場合に、追加の試験タンパク質をコードする各ＤＮＡ配列は、上記の方法で用いた二つのベクターの一つ、又は他の追加のベクターにさえも導入され、好都合には、上述のベクターにおいて他のタンパク質をコードするＤＮＡ配列の転写を監視するために既に用いた他の条件プロモータと好適に異なる条件プロモータの制御下においてである。本発明は、数種のタンパク質間の相互作用の研究の以下の実施例の助けで更に説明されるだろう。Ｉ−３種のタンパク質Ｃｄｋ７、サイクリンＨ及びＭＡＴＩ間の相互作用の研究これらの３種のタンパク質はＤＮＡ転写及び修復に対して必須である多重タンパク質複合体ＴＦＩＴＨのタンパク質である(Svejstrup et al.，1996)。この複合体は二つのサブ複合体に分解することができ：「コア」は、６個のサブユニット及び３種のタンパク質、Ｃｄｋ７、サイクリン及びＭＡＴ１から形成されるキナーゼ複合体を含む。この後者の複合体もin vivoで遊離の形で存在する。対応するｃＤＮＡを取り込んだウイルスで共感染した細胞の抽出物を用いる以前のツーハイブリッド及び免疫沈降反応実験は、タンパク質Ｃｄｋ７とサイクリンＨが互に相互作用することを示した。Ｃｄｋ７／ＭＡＴ１又はサイクリン／ＭＡＴ１型の複合体の検出はツーハイブリッドシステムでは可能でなかった。Ａ）材料及び方法酵母株Ｌ４０、それはヒスチジン、ロイシン、トリプトファン、及びアデニンに対して栄養素要求性であり、ベクターｐＢＴＭ１１６（Vojtek et al.，1993 ）から誘導されるプラスミドｐＬｅｘ９−３Ｈ及びｐＶＰ１６を用いた。アルコール脱水素酵素（ＡＤＨ）構成的プロモータの下流にクローン化された選択標識ＴＲＰ１（トリプトファン代謝に対する酵素をコードする遺伝子）及びＬｅｘＡ（ＤＮＡ結合ドメインを含む）に加えて、ｐＬｅｘ９−３Ｈは、誘導性プロモータＭｅｔ２５、タグヘムアグルチニン(ｔａｇＨＡ)、核局在性信号(ＮＬＳ)、問題のポリペプチドをコードするＤＮＡを取り込むためのクローン化部位ＮｏｔＩ及びＳｒｆＩ及びホスホグリセリン酸キナーゼ転写ターミネーター、ｔＡＰＧＫ（図１）からなる発現カセットからなる。プラスミドｐＶＰ１６は、選択標識ＬＥＵ２（ロイシン代謝に対する酵素をコードする遺伝子コーディング）及びＡＤＨプロモータの下流にクローン化されたＶＰ１６転写アクチベーターを含む。Ｃｄｋ７、サイクリンＨ及びＭＡＴ１をコードするｃＤＮＡを、プラスミドｐＬｅｘ９−３ＨへのＬｅｘＡによる融合、ｐＬｅｘ９−３Ｈ中のプロモータＭｅｔ２５の依存性下で、及びプラスミドｐＶＰ１６へのＶＰ１６による融合によりそれぞれクローン化した(図２)。ａ）プラスミドの構築３種のタンパク質のそれぞれをコードするｃＤＮＡを、適当なベクターに挿入した後、それらのそれぞれに特異的なヌクレオチドにより、Adamczewski J．P． et al.，1996に記載の構成体を用いてＰＣＲにより増幅した。ｐＬｅｘ９−３ＨのＥｃｏＲＩ部位へのＬｅｘＡによる融合によりＣｄｋ７のクローン化を可能にするＰＣＲを、ｃＤＮＡの５’部分に対するオリゴヌクレオチド５’ＡＧＴＣＧＴＧＡＡＴＴＣＡＴＧＧＣＴＣＴＧＧＡＣＣＴＧＡＡＧ３’ 及び３’末端に対する５’ＧＡＴＣＧＴＧＡＡＴＴＣＴＴＡＡＡＡＡＡＴＴＡＧＴＴＴＣＴＴＧＧＧＣＡＡ３’で行い、生じる融合タンパク質はＬｅｘＡ−Ｃｄｋ７であった。プロモータｐＭｅｔ２５の下流でｐＬｅｘ９−３ＨのＮｏｔＩ部位へのｔａｇＨＡによる融合によりサイクリンＨのクローン化を可能にするＰＣＲを、ｃＤＮＡの５’部分に対するオリゴヌクレオチド５’ＧＡＴＣＧＴＧＣＧＧＣＣＧＣＡＡＴＧＴＡＣＣＡＣＡＡＣＡＧＴ３’及び３’末端に対する５’ ＧＡＴＣＧＴＧＣＧＧＣＣＧＣＴＴＡＧＡＧＡＧＡＴＴＣＴＡＣＣＡＧ３’で行い、生じる融合タンパク質はＴａｇＨＡ−サイクリンＨである。最後に、ｐＶＰ１６のＥｃｏＲＩ部位へのＶＰ１６による融合によりＭＡＴ１のクローン化を可能にするＰＣＲを、ｃＤＮＡの５’部分に対するオリゴヌクレオチド５’ＧＡＴＣＡＧＧＡＡＴＴＣＣＣＡＴＧＧＡＧＧＡＴＣＡＧＧＧＴＴ３’及び３’末端に対する５’ＧＡＴＣＡＧＧＡＡＴＴＣＴＴＡＡＣＴＧＧＧＣＴＧＣＣＡＧＡＡ３ ’行い、生じる融合タンパク質はＶＰ１６−ＭＡＴ１である。ｂ）酵母の形質転換及び形質転換体の選択株Ｌ４０［ＭＡＴａ、ｔｒｐｌ、ｈｉｓ３、ｌｅｕ２、ａｄｅ２、ＬＹＳ２：：(ＬｅｘＡｏｐ)₄−ＨＩＳ３、ＵＲＡ３：：(ＬｅｘＡｏｐ)₈−ＬａｃＺ］はレポーター遺伝子ＨＩＳ３（ヒスチジン代謝に対する酵素をコードする）及びＬｅｘＡにより認識されるオペレーターにより融合したＬａｃＺを含む。細胞を完全な培地（ＹＰＤ培地）中で１６時間培養し、酢酸リチウム法（Schiestl R.H．et al.，1993）によりＣｄｋ７−ｐＬｅｘ９−３Ｈ−サイクリンＨで形質転換した。ｐＬｅｘ９−３ＨはＴＲＰ１遺伝子を含むので、形質転換体の選択を、ＨＬＡ最少培地（１．４４g/ｌの「アミノ酸無しの酵母窒素塩基」及び２０g/l のアガロースへの添加で、０．０６g/lのヒスチジン、０．１２g/lのロイシン及び０．１２g/lのアデニンを含み、トリプトファンを含まない）で行った。形質転換クローンの一つを、２０mlのＨＬＡ中で一夜再培養し、ついで前と同じ方法でＭＡＴ１ｐＶＰ１６に代えて形質転換した。ｐＶＰ１６はＬＥＵ２遺伝子からなるので、二重形質転換体の選択をＨＡ最少培地（アデニン及びヒスチジンを含み、トリプトファンＭＡＴａはロイシンを含まない）で行う。ｃ）タンパク質の発現タンパク質の発現を、ＨＡ培地で発育した酵母の抽出物を用いて行う免疫ブロットで監視し、それはプラスミドの存在に対して選択的である培地であった。メチオニンの存在で誘起した抑制も試験した(Rose M.D.，1990)。ｄ）３種のパートナー間の相互作用の試験二つのタイプの監視が可能である：増殖試験及びβ−ガラクトシダーゼ活性の試験。増殖試験では、ＨＡ培地で確立した培養から分離した、３種の異なるクローンを、５０μｌの滅菌水にけん濁し、１０から１０^-4までのカスケードで希釈した。クローンのそれぞれで、各希釈液の一滴を三重相互作用に選択的な培地（Ａ、アデニンのみ含有）及びサイクリンＨの発現を阻害する培地（ＡＭ、１mMメチオニン及びアデニン含有）に加えた。 β−ガラクトシダーゼ活性を適当な培地中で一夜増殖させた細胞で評価し(６００nmにおける光学密度［ＯＤ₆₀₀］を測定するだろう)、ついでリン酸緩衝液に再けん濁し(Miller J.，1972)、そこへ３滴のクロロホルム及び２滴の０．１％ＳＤＳ界面活性剤を２８℃で５分間温置のために加え；４mg/mlのＯ−ニトロフェニル−β−ガラクトシド（ＯＮＰＧ）の２００μｌで再活性化を開始し、次いで５００μｌの１mM炭酸水素塩Ｎａ₂ＣＯ₃で停止し、直ちに淡黄色が現れた。次いで、ＯＤ₄₂₀を測定した。式：(ＯＤ４２０)／［(ＯＤ６００)×培養液の体積（ml）×反応時間(分)］(Rose M.D.，1990)によりβ−ガラクトシダーゼ活性（m l^-1・min^-1）を計算した。Ｂ）結果メチオニンの無い培地（Ｃｄｋ７及びＭＡＴ１だけでなく、サイクリンＨも発現を可能にする）では、コロニーの増殖を１０^-1〜１０^-4の範囲の希釈液で観察したが、メチオニンに富んだ培地（サイクリンＨの抑制）では最初の二つの希釈液でのみ観察した(図３)。更に、メチオニンの無い培地で増殖した株のβ−ガラクトシダーゼ活性の測定は１１５ml^-1・min^-1であったが、メチオニンの存在で増殖した同じ株のものは18ml^-1・min^-1、すなわちβ−Ｇａｌ活性の６倍以上の阻害を示した(図４)。これらの結果は、第三のポリペプチドサイクリンＨが活性化ペアＬｅｘ−Ｃｄｋ７／ＶＰ１６−ＭＡＴ１の生成を触媒（安定化）することを示し、それはＣｄｋ７、サイクリンＨ及びＭＡＴ１の三重複合体の生成による。サイクリンＨが抑制されるとき、可視化する低いβ−ガラクトシダーゼ活性は、ＭＡＴ１とＣｄｋ７の弱い結合を示唆した；これは昆虫抽出物で行われた免疫沈降反応実験に基づいて排除できず、そこでは弱いＣｄｋ７／ＭＡＴ１結合を可視化した。相互作用：Ｃｄｋ７／サイクリンＨ／ＭＡＴ１の特異性を検査するために、我々は、ＴＦＩＩＨ複合体の他のサブユニットをベクターｐＶＰ１６に取り込んだ。このように、ＴＦＩＩＨコアの五個のサブユニットをサイクリンＨの存在でＣｄｋ７との相互結合に対して試験した。図示したように増殖試験によっても、β −ガラクトシダーゼ試験によっても相互作用を可視化できなかった(図４)。一方で、Ｃｄｋ７及びサイクリンＨ（Ｃｄｋ７−ｐＬｅｘ９−３Ｈ−サイクリンＨ）の発現、他方で、ＶＰ１６単独の発現（いかなる融合タンパク質も含まない）は、増殖試験及びβ−ガラクトシダーゼ活性の試験の両方に対して背景ノイズに等価な応答を与えた(図４)。一方、相互作用試験の結果、及び他方、Westernブロッティングで示された３種のタンパク質の存在は、タンパク質Ｃｄｋ７、サイクリンＨ及びＭＡＴ１を含む３成分複合体の存在を示唆した。このような３成分複合体を可視化するために、培地Ａで増殖した酵母の全抽出物を、サイクリンＨの融合ペプチドｔａｇＨＡによって免疫沈降させた。このように、抗−ＨＡ抗体は、サイクリンＨだけでなく、Ｃｄｋ７及びＭＡＴ１も保持しなかった。更に、このように生成した複合体は、他の方法で分離した複合体と同種のＣＴＤキナーゼ活性を有した。 II．タンパク質ＲａｓとＧａｆの間の相互作用の阻害Ｒａｓ及びＲａｆは、結果として細胞増殖及び分化の現象を制御する信号の翻訳で可能性のある関与で相互作用する二つの癌遺伝子タンパク質である。これら２種のタンパク質の接触の阻害を、オリゴペプチドライブラリーのスクリーニング又は転写アクチベーターを形成する他の２種のポリペプチドの一つと同等であるが、融合配列を含まない第三のパートナーを含むことのいずれかで研究した。Ｒａｓ／Ｒａｆ相互作用の特異性を監視するために、第三のパートナーは、誘導プロモータＭｅｔ２５の制御下にあるだろう。Ａ）材料及び方法プロモータＭｅｔ２５、ＨＡエピトープ及び核局在性配列をコードするＤＮＡ断片、Ｎｏｔｌ部位、ＢｇｌII部位又はＳｒｆＩ部位のいずれか、停止コードン及びＰＧＫターミネータを含むカセットを、プラスミドｐＧＢＴ９(Bartel et a l.，1993)、ｐＧＢＴ１０（Chardin et al.，1993）ｐＨＰ５、ｐＢＴＭ１１６（Vojtek et al.，1993）及びｐＶＪＬ１０（Julien-Flores et al.，1995）の単独ＰｖｕII部位に挿入し、それぞれプラスミドｐＧＢＴ９−３Ｈ、ｐＧＢＴ１０−３Ｈ、ｐＧＢＴ１１−３Ｈ、ｐＬｅｘ９−３Ｈ、及びｐＬｅｘ１０−３Ｈを得た。１mMのメチオニンの存在で、プロモータＭｅｔ２５の発現を抑制した。次の方法でｐＧＢＴ９−３Ｈから誘導したプラスミドを構築した：Ｈ−Ｒａｓ（Ｖ１２）の読み枠（ＯＲＦ）(ｐＢＴＭ１１６−ＲａｓのＥｃｏＲＩ−ＳａｌＩ断片（Vojtek et al.，1993))をＧＡＬ４のＤＮＡ結合ドメインと同相でクローン化し、得られたプラスミドは［ｐＧＢＴ−Ｒａｓ／Ｍｅｔ−０］であった。プラスミドｐＧＡＤ−Ｒａｆ（Van Aelst et al.，1993）から生じるｃＲａｆ− １のＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ断片のいずれかへ、ＮｏｔＩクローン化部位を含む結合配列を加えて、ついで［ｐＧＢＴ−Ｒａｓ／Ｍｅｔ−０］のＭｅｔ２５発現カセットのＮｏｔＩ部位へ得られた断片をクローン化して、プラスミド［ｐＧＢＴ−Ｒａｓ／Ｍｅｔ−Ｒａｆ］を得た。Ｂ）結果：［ｐＧＢＴ−Ｒａｓ／Ｍｅｔ−Ｒａｆ］及びｐＧＡＤ−Ｒａｆで共形質転換した細胞は、メチオニンの存在、すなわち、プロモータＭｅｔ２５の抑制条件下で、ＬａｃＺ＋（β−ガラクトシダーゼ遺伝子の転写）である。同じ細胞がメチオニンの欠如、すなわち、プロモータＭｅｔ２５の抑制解除の条件下でＬａｃＺ− である。この観察は、プロモータＭｅｔ２５を用いて発現した野性型Ｒａｆタンパク質が［ｐＧＢＴ９−Ｒａｓ／Ｍｅｔ−Ｒａｆ］を用いて発現したタンパク質との相互作用に対し競合に入るという事実で説明でき、このように融合タンパク質ＧＡＤ４ＤＢＤ−ＲａｓとＧＡＬ４ＡＤ−Ｒａｆ間の相互作用を阻害する。以前の制御は、誘導性プロモータＭｅｔ２５の存在が、このプロモータが活性化されているか、又は抑制されているかで、融合配列から生じる二つの生成物間の相互作用に影響しないことを示した。タンパク質間の相互作用を阻害するペプチドを同定するために、例えばプロモータＭｅｔ２５の制御下で、オリゴヌクレオチドの合成ライブラリーを発現することにより、上記のプラスミドを使用できる。プロモータＭｅｔ２５の抑制解除の条件下で、ＬａｃＺ試験によって、相互作用の阻害を検出でき；メチオニンの存在で表現型ＬａｃＺ＋を回復し、阻害がプロモータＭｅｔ２５の発現のためであり、変異のような他の事象のためではないことを示した。表１：表１の説明：ｐＧＢＴ９３５において、ＧＡＬ４ＤＮＡ結合ドメイン（ＧＡＬ−ＤＢＤ）をコードするドメインと同相でＲａｓタンパク質（ｃ−Ｈ−Ｒａｓ；Vojtek，1993 ）をコードするｃＤＮＡの挿入は、プラスミド［ｐＧＢＴ９３５、Ｍｅｔ２５− ０］に導き；プラスミド［ｐＧＢＴ９３５、Ｍｅｔ２５−０］へのＨＡエピトープ（ＨＡ−ＮＬＳ）に結合した核局在性部位をコードするドメインと同相でクローン化したＲａｆタンパク質（ｃ−Ｒａｆ−１；Van Aelst，1993 ）をコードするｃＤＮＡは、プラスミド［ｐＧＢＴ９３５、Ｍｅｔ２５−Ｒａｆ］に導く。プラスミドｐＧＡＤ−Ｒａｆは、ＧＡＬ４アクチベータードメイン（ＡＤ−Ｒａｆ）と融合したタンパク質ｃ−Ｒａｆ−１の発現を可能にする。図の説明：図１：ベクターｐＢＴＭ１１６から誘導したベクターｐＬｅｘ９−３Ｈ。部分ｐＢＴＭ１１６は、Ｅ．ｃｏｌｉにおけるその複製に必要な配列に加えて、ＴＲＰＩ選択標識及びプロモータの下流及びＡＤＨのターミネータ（Ｔ）の上流でクローン化したＬｅｘＡ転写アクチベーターを含む。ｐＬｅｘ９−３Ｈも調節性プロモータＭｅｔ２５、ｔａｇＨＡ、核局在性配列（ＮＬＳ）及びターミネータｔＰＧＫを含む発現カセットを有する。問題のｃＤＮＡ挿入部位を示す。図２：Ｃｄｋ７をコードするｃＤＮＡは、ＬｅｘＡとの融合でクローン化され、サイクリンＨのものは調節性プロモータＭｅｔ２５の下流でプラスミドｐＬｅｘ９− ３ＨへｔａｇＨＡで融合されるが、ｃＤＮＡ及びＭＡＴ１は、プラスミドｐＶＰ１６へＶＰ１６との融合でクローン化される。このプラスミドは、選択標識ＬＥＵ２及びＡＤＨ構成的プロモータの下流でＶＰ１６活性化ドメインを含む。図３：Ａ：メチオニンの無い培地（Ｍｅｔ−：メチオニン抑制解除）及びメチオニンに富んだ培地（Ｍｅｔ＋１mM：メチオニン抑制）上のプラスミドＣｄｋ７−ｐＬｅｘ９−３Ｈ−サイクリンＨ及びＭＡＴ１−ｐＶＰ１６で形質転換した酵母の三種のクローンの増殖試験。図の中心に異なる希釈が示される。Ｂ：一方で、ベクターＣｄｋ７−ｐＬｅｘ９−３Ｈ−サイクリンＨにより、他方で、ＸＰＢ、ＸＰＤ、ｐ６２、ｐ４４、ｐ３４、又はＭＡＴ１又はＶＰ１６単独（ＶＰ１６）と融合したタンパク質ＶＰ１６を発現するベクターにより形質転換した酵母の抽出物のβ−ガラクトシダーゼ活性で、それはメチオニンの存在（＋）又は欠如（−）で増殖した。β−ｇａｌ単位はml^-1・min^-1で示される。図４：プラスミドペアで共形質転換したＨＦ７ｃ酵母株細胞は、トリプトファン又はロイシン（Rose，1990）を含まない培地に選ばれる；コロニーは、トリプトファン又はロイシンを含まないが、メチオニンを含む又は含まない培地に分布する。３０℃で２４時間後、ヒスチジンに対する活力低下（結果は示されない）及びメチオニンの存在又は欠如で、ＬａｃＺ（Chardin，1993）の発現に対して試験するために皿は再接種された。参考文献：

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＧＷ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者カモニ，ジャックフランス国、エフ―75008 パリ、リュ・クラペイロン、18 (72)発明者ロメロ−ポルティーヨ，フランシスコスペイン国、エー―41018 セヴィリア、３デー、ポルタル１、アヴェニダ・デ・エデュアルド・ダデ、23 (72)発明者アタ，リカルドアメリカ合衆国、ニュージャージー 08648、ローレンスビル、サンティナ・コート 10 (72)発明者エグリ，ジャン−マルクフランス国、エフ―67000 ストラスブール、リュ・ヴォルテール、４ (72)発明者ティロード，フランクフランス国、エフ―67400 イルキルシュ、ルート・ドゥ・ストラスブール、100

Claims

【特許請求の範囲】１．少なくとも２種の与えられたタンパク質と直接又は間接に相互作用するタンパク質を検出するための方法であって、 −そのゲノムが、宿主細胞のゲノムが、・一方で、少なくとも２種の与えられたタンパク質と相互作用できる該試験タンパク質をコードするＤＮＡ配列(このＤＮＡ配列の転写は条件プロモータの制御下に置かれている)、及び・他方で、該与えられたタンパク質をコードするＤＮＡ配列、を含む、ようなベクターの１種以上と共に、レポーター遺伝子の１種以上を含む宿主細胞を形質転換する工程、及び −上述のレポーター遺伝子（類）の可能性のある転写においての、この条件プロモータの抑制の効果とこの条件プロモータの活性化の効果の比較（それはこの比較の結果を、相互作用の検出、又は逆に該試験タンパク質と該与えられたタンパク質間の相互作用の欠如に相関させることができる）を含むことを特徴とする方法。２．該宿主細胞の形質転換のために用いられるベクター（類）に含まれるＤＮＡ配列でコードされる２種のタンパク質、又は少なくとも２種の該与えられたタンパク質のうちで、一つはＤＮＡ結合ドメインと融合され、他は転写活性化ドメインと融合され、これらの２種の融合タンパク質をコードするＤＮＡ配列の転写が、構成的プロモータの制御下にあることをこ特徴とする、請求項１記載の方法。３．−それらの１種が、ＤＮＡ結合ドメインと融合した与えられたタンパク質の一つをコードするＤＮＡ配列を含み、そしてその転写が、構成的プロモータの制御下にあるが、別のベクターが、活性化ドメインと融合した別の与えられたタンパク質をコードするＤＮＡ配列を含み、そしてその転写も構成的プロモータの制御下にあり、 −２種の上述のベクターの一つ、又は別のベクターが、上記タンパク質類と相互作用できる試験タンパク質をコードするＤＮＡ配列を含み、そしてその転写が、条件プロモータの制御下にあり、 −適切ならば、上述のベクターの１種以上、又は他のベクターの１種以上が、上記タンパク質類と相互作用できる別の与えられたタンパク質をコードするＤＮＡ配列の１種以上を含み、そしてその転写が、上記条件プロモータと異なる条件プロモータの制御下又は構成的プロモータの制御下にあるような数種のベクターを用いて行われることを特徴とする、請求項１又は請求項２記載の方法。４．形質転換宿主細胞が、それらのゲノムが一つ又はそれ以上のレポーター遺伝子を含み、その転写のそれぞれが、上述のベクターの１種でコードされるＤＮＡ結合ドメインにより認識されるオペレーターの制御下に置かれ、これらのレポーター遺伝子の転写が、適切ならば、試験タンパク質の直接又は間接の影響下で、培養された形質転換宿主細胞中に産生された与えられたタンパク質の間のタンパク質複合体の形成のときに、起るようであることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか１項記載の方法。５．一条件プロモータが、形質転換された宿主細胞の培養培地中でメチオニンの濃度の関数として調節することができるプロモータＭｅｔ２５であり、該プロモータが、培養培地中のメチオニンの欠如で活性化され、メチオニンの存在で抑制され、そして −形質転換された宿主細胞のゲノムに含まれるレポーター遺伝子が：・形質転換された細胞が培養される培地中でのこの酵素反応の結果を、特に着色反応と関連して基質と反応する酵素を検出、又は測定さえすることを可能する条件下で、与えられた基質と反応できる酵素をコードするいかなる遺伝子、例えばβ−ガラクトシダーゼ活性を検出すること、又は測定さえすることを可能にするＬａｃＺ遺伝子；又は・特異的化合物、特にアミノ酸（それについて形質転換された細胞株が栄養素必要性である）アミノ酸の代謝の原因となる酵素をコードするいかなる遺伝子でもあることを特徴とする、請求項１〜４のいずれか１項記載の方法。６．−少なくとも２種の他の与えられたタンパク質を、後者と結合させ、少なくとも３種のタンパク質からなるタンパク質複合体を形成するいかなるタンパク質、又は −少なくとも二種の与えられたタンパク質間のタンパク質複合体の形成を、特にタンパク質複合体のパートナーの一つ以上のコンフォーメーション改変機構により、触媒するいかなるタンパク質の検出のための、請求項１〜５のいずれか１項記載の方法。７．該与えられたタンパク質をコードするＤＮＡ配列が、互にタンパク質複合体を生成しないか又はほとんど生成しないタンパク質をコードするそれらから選択され、 −試験タンパク質をコードするＤＮＡ配列の転写がその制御下に置かれ、該条件プロモータを活性化しながら培養された該宿主細胞のレポーター遺伝子（類）の転写、又は該条件プロモータを抑制しながら、これらの同じレポーター遺伝子の転写と比較して、これ又はこれらのレポーター遺伝子の転写の増加さえもが、タンパク質複合体の生成中に試験タンパク質と該与えられたタンパク質間の直接又は間接相互作用に相関することができることを特徴とする、請求項６記載の方法。８．−少なくとも２種の他のタンパク質からなるタンパク質複合体生成を、特にタンパク質複合体のパートナーの一つとの競合機構により阻害するいかなるタンパク質、又は −少なくとも２種の他の与えられたタンパク質からなるタンパク質複合体生成の阻害を、特に該タンパク質複合体一つ以上のコンフォーメーション改変機構により触媒するいかなるタンパク質をも検出のための、請求項１〜６のいずれか１項記載の方法。９．−互にタンパク質複合体を生成するタンパク質類をコードするものから選ばれる該与えられたタンパク質をコードするＤＮＡ配列、及び −試験タンパク質をコードするＤＮＡ配列の転写がその制御下に置かれる該条件プロモータを活性化しながら、培養された該宿主細胞のレポーター遺伝子（類）の転写の欠如、又は該条件プロモータを抑制しながら、これらの同じ遺伝子の転写と比較して、これ又はこれらのレポーター遺伝子のより少ない転写さえもが、そのときタンパク質複合体生成の阻害の間の試験タンパク質と該与えられたタンパク質間の直接又は間接相互作用の検出に相関することができることを特徴とする、請求項８記載の方法。