JP2001501809A

JP2001501809A - カンディダアルビカンスからの新規ｔｆｉｉｂ転写ファクター、それをコード化する核酸配列、及びカンディダアルビカンス増殖の阻害のためのスクリーニング方法

Info

Publication number: JP2001501809A
Application number: JP09535632A
Authority: JP
Inventors: ブラトウスキー，ステファン; シー，リチャードウォッベ; ブラッドリー，ジョン
Original assignee: Harvard College
Current assignee: Harvard College
Priority date: 1996-04-01
Filing date: 1997-03-31
Publication date: 2001-02-13
Also published as: EP0894269A1; US6300067B1; CA2250121A1; US5863762A; WO1997037230A1; EP0894269A4

Abstract

(57)【要約】本発明はカンディダアルビカンスからの新規の転写ファクター、ＴＦＩＩＢ、ＴＦＩＩＢをコード化する核酸配列、及び標的ＴＦＩＩＢによるカンディダアルビカンスの成長の阻害のためのスクリーニング方法を包含する。

Description

【発明の詳細な説明】カンディダアルビカンスからの新規ＴＦＩＩＢ転写ファクター、それをコード化する核酸配列、及びカンディダアルビカンス増殖の阻害のためのスクリーニング方法開示の概要本発明は、カンディダアルビカンス(Candida albicans)からの新規の転写ファクター、ＴＦＩＩＢ、ＴＦＩＩＢをコード化する核酸配列、及び標的ＴＦＩＩＢによるカンディダアルビカンス増殖の阻害のためのスクリーニング方法を包含する。本発明は概ね転写ファクターと抗真菌剤のためのスクリーニング方法に関する。本発明は一つにはgovernment funds，NIH grant no.GM46498を用いて作成され、それ故米国政府は本発明において正当な権利を有する。発明の背景酵母カンディダアルビカンス(C．albicans)はヒトにおける悪質な真菌性病原体の一つである。それは傷付いた宿主の様々なスペクトルが日和見的感染すること、及びヒト身体中の多くの様々な組織に侵入する能力を有する。それは多くの場合において抗生物質治療及び免疫システムの攻撃を逃れる。カンディダアルビカンスは呼吸器、消化器及び女性生殖器官、そのような局所において、粘膜の通常フローラのメンバーであるにもかかわらず、それは優勢を獲得し、さらに病的な状態に結び付けることができる。時折、それは衰弱した又は免疫抑制された患者において、殊に細胞-調整免疫性が損なわれるならば、進行性全身的疾患を生じる。敗血症は、傷付いた細胞の免疫性、例えばガンの化学療法を行うそれら又はリンパ腫、エイズ(AIDS)を持った、又は別のコンディションのそれらの患者において発生し得る。カンディダは、例えばチューブ、針、麻薬乱用、などで静脈内に混入した場合、血流の侵入、血栓性静脈炎、心内膜炎、又は眼及び事実上何れかの器官又は組織の感染を引き起こす。カンディダアルビカンスは、バランスされた致命的な二重性を示しており、それ故にたぶん有性の相又は減数分裂のサイクルを介していない。この酵母は、少なくとも７つの全般的な表現型の間で高い頻度で突発的に及び可逆的に転換できることが見られる。スイッチングは標準の実験株だけでなく、健康人の口腔から分離した株においても生じることが示されている。ナイスタチン、ケトコナゾール、及びアンホテリシンＢは、口内及び全身的なカンディダ感染を治療するために使用されている。しかしながら経口投与されたナイスタチンは消化管内の治療に制限され、全身的治療には適用できない。幾つかの全身的感染はケトコナゾール又はアンホテリシンＢで治療する余地があるが、しかし、これらの薬剤は、そのような治療において補足的な薬剤と組み合わせない限り、有効ではないであろう。アンホテリシンＢは相対的に狭い治療インデックス及び非常にたくさんの望ましくない副作用及び治療的濃度で一様の毒性を有する。一方、ケトコナゾール及び他のアゾール抗真菌剤は、有意に低い毒性を示すが、ヒトにおいて見出される幾つかの、それの作用のメカニズム、ある種の酵素中でシトクロムＰ₄₅₀補欠分子団の不活性化は、身体のシトクロムＰ₄₅₀酵素によって代謝される他の薬剤を同時に受容する患者における使用を妨げる。加えて、これらの化合物の抵抗性があらわれ、そして将来において重大な問題を生起するだろう。カンディダアルビカンスによって引き起こされる日和見感染の有効な治療が当該分野では必要である。それ故に、本発明の一つの目的は、カンディダアルビカンス増殖の潜在的な阻害を確認するためのスクリーニングアッセイを提供することである。本発明の別の目的は、この生物における転写の阻害に基づいたカンディダアルビカンスのスクリーニング方法を提供すること及び潜在的な阻害を確認することである。真核細胞中のｍＲＮＡの合成には、ＲＮＡポリメラーゼＩＩと補助的な転写ファクター、全体的であり及び多くても作用する幾つかのもの、全てではないにしても、プロモーター、及び特異性と制御を与えるその他のものが要求される。５つの全般的なファクター、ａ，ｂ，ｄ，ｅ及びｇは酵母サッカロミセスセレビシエ(S．cerevisiae)から均質的に精製されており、ＴＦＩＩＥ，ＴＦＩＩＨ，ＴＦＩＴＤ，ＴＦＩＩＢ及びＴＦＩＩＦの各々がヒト又はラットファクターの相補対向物として同定されている。これらのファクターは開始した転写にＲＮＡポリメラーゼＩＩとの複合体においてプロモーターで集合する。結合スタディは、プロモーターＤＮＡ上の開始複合体の集合の順序は、ファクターｄ(ＴＦＩＩＤ)により始まり、ファクターｅ(ＴＦＩＩＢ)、そしてポリメラーゼと残るファクターによって続行されることが示されている。ファクターｂ(ＴＦＩＩＨ)、ｅ(ＴＦＩＩＢ)及びｇ(ＴＦＩＩＦ)は、しかしながらポリメラーゼＩＩに直接結合し、さらに５つのファクターの４つの主なものは、プロモーター結合の以前にホロ酵素のポリメラーゼと集合することができる。結合スタディによって明らかにされる相互反応の機能的な徴候は、転写を生じることができる開始複合体のいくらかのパーセントにおいてのみ明確にされていない。ＲＮＡポリメラーゼＩＩによる転写の多くの態様は、酵母と高等な真核生物の間で保存される。例えば、酵母、ドロソフィラ(Drosophila)及び哺乳動物ポリメラーゼの最も大きなサブユニットの中で類似した長いアミノ酸配列がある。ＴＡＴＡ-結合及びエンハンサー結合ファクターのような転写装置の別な成分は、例えば酵母と哺乳動物の間のインビボの結合又は転写システムを相互交換可能である。それにもかかわらず、それら２つのシステムの間には有意な差がある。ＴＡＴＡ成分は、サッカロミセスセレビシエプロモーターの開始サイトの上流に４０から１２０又はそれ以上の塩基対が配置され、そしてこれら成分が現れる場合、それらは遺伝子の発現を要求する。カンディダアルビカンス遺伝子がサッロミセスセレビシエ中で作用するという事実は、ＴＡＴＡ成分と開始サイトとの間に間隔をとる４０から１２０塩基対もまた使用することを示唆する。一方、哺乳動物(同じくサッカロミセスポンベ(S.pombe))ＴＡＴＡ成分と転写出発サイトは２５から３０ｂｐのみ離れ、ＴＡＴＡ成分の削除は、たとえそれが開始サイトを変更できたとしても、転写開始の頻度をいつも減ずることはない。酵母と哺乳動物源からの各転写ファクター配列間には相同性の度合いの変動もある。ＲＮＡポリメラーゼＩＩ、ＴＦＩＩＦ、及びＴＦＩＩＤのようなマルチサブユニットファクターの幾つかはヒトと酵母におけるサブユニットの異なる数を含有する。相当するポリペプチドの分子量は、それのヒトの対向物、及びその逆において存在しない与えられる酵母ファクター中に存在している配列を持つヒトと酵母において異なる。異なる酵母種の転写における同じ転写ファクターの有効な代用品は、予期することはできない。これは、異なる酵母種からの幾つかの転写ファクターの中でアミノ酸配列の相同性の高い度合いにもかかわらず真実である。例えば、非相同の酵母種において有効に且つ精密に転写を支持するために与えられる転写ファクターの能力は予期することはできない。Ｌｉら（1994，Science 263:805)は、インビボにおいて、サッカロミセスセレビシエとサッカロミセスポンベの転写ファクターの交互交換可能性を試験し、多くのサッカロミセスセレビシエ成分がサッカロミセスポンベ転写ファクターａ，ｅ又はポリメラーゼＩＩにそれぞれ置換することができず、しかしこれら成分の幾つかの組合せは有効であることを報告している。ある事実において、活性な転写は、サッカロミセスセレビシエ-誘導ＴＦＩＩＢがサッカロミセスポンベからのファクターのＴＦＩＩＢ-激減セット内でのみ置換される場合に再構成することができない。サッカロミセスセレビシエからのＴＦＩＩＢ-ＲＮＡポリメラーゼＩＩとの組合せは置換することができ、これら２つの成分の機能的な相互反応か重要であるばかりでなく、その活性が異なる生物から誘導される一方の成分によって補足することができない種- 特異的決定要素に依存するであろうことを示す。異なる酵母種の中の与えられたファクターの置換生成における非予測可能性は、そのような置換物が相当物ではないことにおいても明白であり；すなわち、サッカロミセスセレビシエ転写システム内へのサッカロミセスポンベフラクションの置換は、逆の置換よりも効果が劣る(Ｌｉら、上記)。酵母カンディダアルビカンスは、それが利用する哺乳動物又は酵母のいずれかの主要な生物の同じ遺伝的コードを使用していないことから主要な酵母種とは異なる。Santosら(1995，Nucleic Acids Research，23:1481)は、普遍コードがロイシンのように読めるコドンＣＵＧが、カンディダ中のセリンとして解読されることを報告した。従って何れかのＣＵＧコドン、すなわちセリンとしてカンディダアルビカンス中で解読されるものは、形質転換されたサッカロミセスセレビシエ中のロイシンとして解読されるだろう。ＣＵＧコドンを含む何れかの遺伝子は、それ故にカンディダアルビカンスとサッカロミセスセレビシエにおける異なるアミノ酸配列として翻訳されるであろう。そのような翻訳ミスは、アミノ酸セリンとロイシンが化学特性に顕著な相違を有し且つセリンは幾つかの酵素の活性サイト中の必須の残基として知られることから、不活性タンパク質を生成するであろう。ＣＵＧコード化残基でのセリンによるロイシンの置換は、カンディダアルビカンス中の多くのレポーターシステム(例えばβ-ガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、Flux)の使用において重大な問題である。以前の実験はロイシンに代えてセリンとしたＣＵＧのカンディダによる翻訳が不活性リポータータンパク質の生成という結果をしばしばもたらす。本発明の別な目的は、カンディダアルビカンス増殖及び／又は生存能力の選択的阻害のためのスクリーニングのためのアッセイを提供することである。本発明のさらに別な目的は、カンディダアルビカンス転写又は転写開始の阻害のための分子標的を提供することである。発明の概要本発明は、カンディダアルビカンスＴＦＩＩＢをコードする核酸配列を備える組換え核酸を包含する。また本発明は、カンディダアルビカンスＴＦＩＩＢをコードする核酸配列を備えるベクター、及びカンディダアルビカンスＴＦＩＩＢをコードする核酸配列を備える形質転換宿主細胞をも包含する。また本発明は、カンディダアルビカンスＴＦＩＩＢを備える組換えポリペプチド、及びカンディダアルビカンスＴＦＩＩＢのフラグメントをも包含し、該フラグメントは転写開始においてカンディダアルビカンスの生物学的活性を阻害し、又はカンディダアルビカンスの増殖を防止することを特徴とする。また本発明は、カンディダアルビカンスＴＦＩＩＢをコードする核酸の発現を許容するのに十分な条件の下でカンディダアルビカンスＴＦＩＩＢをコードする核酸で形質転換した宿主細胞を培養すること、及びカンディダアルビカンスＴＢＰを分離することを備える、組換えカンディダアルビカンスＴＦＩＩＢの製造方法をも包含する。また本発明は、ＤＮＡテンプレート、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ、組換えカンディダアルビカンスＴＦＩＩＢ、及びインヒビター候補、ここで該ＤＮＡテンプレートに相補的なｍＲＮＡ転写物の生成は該インヒビター候補が不在において生じる、を備えるインビボにおける転写アッセイにおいてｍＲＮＡ転写の阻害を検出することを備える、カンディダアルビカンス増殖の阻害を同定するためのスクリーニング方法をも包含する。好ましくは、該アッセイはカンディダアルビカンスＴＢＰをも含有する。また本発明は、ＤＮＡテンプレートと組換えカンディダアルビカンスＴＦＩＩＢ及びＴＢＰを備える複合体の形成の阻害を、インヒビター候補の存在中で検出すること、ここで該インヒビター候補の不在において該複合体の形成が起こる、を備えるカンディダアルビカンス増殖の阻害を同定するためのスクリーニング方法をも包含する。また本発明は、カンディダアルビカンスＴＦＩＩＢとカンディダアルビカンスＴＢＰを備える複合体の形成の阻害を、インヒビター候補の存在中で検出すること、ここでインヒビター候補の不在において、該複合体の形成が起こる、を備えるカンディダアルビカンス増殖の阻害を同定するためのスクリーニング方法をも包含する。好ましくは、該複合体はＤＮＡテンプレートを含むであろう。また本発明は、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ、カンディダアルビカンスＴＢＰ、及びカンディダアルビカンスＴＦＩＩＢを備える複合体の形成の阻害をインヒビター候補の存在中で検出すること、ここで該インヒビター候補の不在において該複合体の形成が起こる、を備えるカンディダアルビカンス増殖の阻害を同定するためのスクリーニング方法をも包含する。好ましくは該複合体はＤＮＡテンプレートとカンディダアルビカンスからのＲＮＡポリメラーゼＩＩを含むであろう。上述したスクリーニング方法において、検出は複数のインヒビター候補の存在において実行されて良い。複数のインヒビター候補のスクリーニングを含んだ本発明のスクリーニング方法において、複数のインヒビターは単一のアッセイにおいて一緒に、或いは複数同時に個別の検出工程を用いて個別にスクリーングされて良い。また本発明は、カンディダアルビカンスＴＦＩＩＢの生物学的活性を選択的に阻害するインヒビターとともに培養して接触させることを備える、培養におけるカンディダアルビカンス増殖を防止する方法をも包含する。また本発明は、カンディダアルビカンスＴＦＩＩＢの生物学的活性を阻害するインヒビターの治療学的有効量を哺乳動物に投与することを備える、哺乳動物中のカンディダアルビカンス増殖を防止する方法をも包含する。ここで用いられる「阻害」とは、それがカンディダアルビカンス増殖又は生存可能性、カンディダアルビカンスＴＦＩＩＢ-介在の転写、又はカンディダアルビカンス転写複合体の形成のいずれかで測定されるパラメーターにおける減少に関する。そのような減少の量は標準品(コントロール)に対して測定される。転写開始においてカンディダアルビカンスの複数の相互作用のために、検出のための標的製品が使用される特有のスクリーニングアッセイに関して変更する。この開示において存在する３つの好ましい検出製品は、ａ）新たに転写したｍＲＮＡ、ｂ）ＤＮＡ-ＴＦＩＩＢ複合体、及びｃ）ＴＢＰ-ＴＦＩＩＢ-ＲＮＡポリメラーゼＩＩ複合体である。「減少」とはコントロールに対して少なくとも２５％、好ましくは少なくとも５０％、最も好適には少なくとも７５％の減少として表される。ここで用いられる「増殖」とは、カンディダアルビカンスの通常の増殖パターン、すなわち６０−９０分の細胞倍化時間に関する。「生存可能性」とは４８時間の培養において生き残るカンディダアルビガンスの能力に関する。「生物学的活性」とは、ＤＮＡテンプレートと又は転移複合体の他のタンパク質との転移複合体を形成する、或いは転移の開始を許容するために他の転移成分との相互作用する、ＴＢＰの能力に関する。「ＤＮＡテンプレート」とは、二重鎖ＤＮＡに関し及び、単鎖ＤＮＡへの特異的な結合アッセイによって示される、少なくとも長さにおいて１０ヌクレオチドの、ネガティブに超コイル化されて良い、プロモーター部分を所有し、且つ酵母ＴＡＴＡ共通部分を含有する。ここで好適に用いられるＤＮＡテンプレートは、開始サイトの上流の４０から１２０まで又はそれ以上の塩基対に配置されたＴＡＴＡ配列を含有するであろう(間隔はＴＡＴＡ成分の最初のＴから５'-主要開始サイトまでで測定される)。転写を包含する本発明の方法において使用するための特に有効なＤＮＡは、グアノシン残基を持たないものであり、従って「Ｇマイナス」又は「Ｇ-レス」カセットが好適である(Sawdago and Roeder，1985，PNAS 82:43 94−4398)。「ｍＲＮＡ転写物(mRNA transcript)」は、完全-長転写物(full-length trans cript)、同じく先端切断転写物、オリゴヌクレオチド転写物及びジヌクレオチドＲＮＡｓに関する。「複合体の形成」とは、他の転写ファクターへのＴＦＩＩＢの結合(すなわちタンパク-タンパク結合)、同様にＤＮＡへのＴＦＩＩＢの結合に関し；そのような結合は勿論、非共有結合である。本発明の他の特徴及ひ効果は詳細な説明、その好ましい実施態様、図面及ひ請求の範囲から明らかになるであろう。図面の簡単な説明図１はカンディダアルビカンス転写ファクターＴＢＰの核酸及びアミノ酸配列を示す。図２はカンディダアルビカンス転写ファクターＴＦＩＩＢの核酸及びアミノ酸配列を示す。詳細な説明本発明は、新規なタンパク質、カンディダアルビカンスＴＦＩＩＢの発見と、カンデイダアルビカンス転写ファクターＴＦＩＩＢをコードする組換えＤＮＡの分離に基づくものである。ＴＦＩＩＢはその細胞の生存可能性のために必須であることから、そのタンパク質の生物学的活性を妨害する化合物は殺真菌特性を有することが予期される。それ故に、本発明はまた、ＴＦＩＩＢのインヒビターからスクリーニングのためのアッセイの発展に基づくものでもある。カンディダアルビカンスＴＢＰ及びＴＦＩＩＢ遺伝子の分離と特徴付け異なる酵母株の中で与えられる転写ファクターの置換の操作に関して与えられる予期できないことは、一つには、遺伝的相補のようなファクター作用に基づいた転写ファクターを与えるコード化遺伝子のクローニングのための取り組むであろう戦略を仮定することができない。核酸レベルでの相同関係に基づいたそれらのような機能的な相補が要求されない別のクローニングの戦略は、ファクター機能のための要求を避けるための試みにおいて用いることができる。例えば、大腸菌(E.coli)において実行されるライブラリーへのサザーンハイブリダイゼーション及び遺伝子の潜在的な高い相同関係部分のＰＲＣ増幅は、異なる生物からの相同関係の遺伝子のクローン化に首尾良く用いられている２つの戦略である。これらの又は類似した方法の成功の可能性を確かめるために、我々は、全体のサッカロミセスセレビシエコード化配列を含有する放射能標識したプローブが、各種の制限酵素で消化されるサッカロミセスセレビシエ及びカンディダアルビカンスからのゲノムＤＮＡ調製物のどこにハイブリダイズされるか、サザーンハイブリダイゼーション実験を実行した。低い緊縮(０．２ｘＳＳＣ，室温のハイブリダイゼーション)で該プローブはサッカロミセスセレビシエ消化物中の制限バンドを知るために予期された通り完全にハイブリッド形成されるが、しかしカンディダアルビカンス消化物のいずれかの制限バンドに検出可能にハイブリッド形成しなかった。サッカロミセス配列は１０分間よりも少ない曝露によってオートラジオグラフ上で検出される。これに対して、さらに一週間の曝露でも、カンディダアルビカンスへの同じプローブのハイブリッド形成は検出されない。これらの観測から、カンディダアルビカンス遺伝子のＤＮＡ配列は、サッカロミセスセレビシエ配列から完全に有意に分けられ、相補的核酸配列のハイブリッド形成に基づくサザーンハイブリダイゼーション、ＰＣＲ戦略又は他のクローニング法はＳＰＴ１５のカンディダアルビカンス相同体に至ることは成功の見込みがない。ＴＢＰのカンディダアルビカンス相同体をクローン化することに用いるアプローチは、サッカロミセスセレビシエ変異株の遺伝的相補が含まれる。カンディダアルビカンスの遺伝的配列のライブラリーは、変異したＴＦＩＩＢ遺伝子( ＳＵＡ７)を含んだサッカロミセスセレビシエの株内に導入される。この変異株は３０℃での増殖が可能であるが、しかしＴＦＩＩＢ遺伝子中の温度感受性変異のために、３７℃では生存できない。該株中へのライブラリーの以下の転写は、該細胞は３７℃で培養され、この非-容認温度で増殖したコロニーが遺伝子欠如の潜在的に搬送するカンディダアルビカンス相同体として、さらに研究される。プラスミドは、３７℃で生存可能である各種分離株から生成される。クローン候補が非容認温度での増殖によって分離された後、ライブラリープラスミドＤＮＡが細胞から採取され、且つプラスミド上のカンディダアルビカンス配列がサッカロミセスセレビシエ遺伝子との置換性を確証するために再試験される。カンディダアルビカンス配列のサブクローンは、標準的なクローニング方法によって構築され、且つ置換した最小のカンディダＤＮＡ配列は標準的な方法を用いて配列決定される。サッカロミセスセレビシエ複数の独立したＳＵＡ７株を相補するためにプローブ化されるｐＲＳ３１６中にサブクローン化する場合、これらプラスミドの消化物は、長さにおいてほぼ１．３５ｋｂの通例のＤＮＡフラグメントを現す。このＤＮＡフラグメントは配列決定され、且つサッカロミセスセレビシエＳＵＡ７に対するカンディダアルビカンスＳＵＡ７の相同性が確認される。カンディダアルビカンスＴＢＰコード化核酸配列と予期されるタンパク質コード化アミノ酸配列が図１に示される(配列ID NOS：１と２)。カンディダアルビカンスＴＦＩＩＢコード化核酸配列と予期されるタンパク質コード化アミノ酸配列が図２に示される(配列ID NOS：３と４)。カンディダアルビカンス増殖及び／又は生存可能性の潜在的な阻害のスクリーニング方法ＴＦＩＩＢが転写阻害のために必須であることから、組換えカンディダアルビカンスＴＦＩＩＢ遺伝子及びこの遺伝子によってコードされた組換えタンパク質は、カンディダアルビカンス増殖及び生存可能性のインヒビターのためのスクリーニングアッセイにおいて用いることができる。本発明のスクリーニングアッセイは、転写、転写開始、又は開始複合体形成の阻害の測定によって、或いはタンパク質／ＤＮＡ又はタンパク質／タンパク質複合体の形成の定量分析によってのいずれかで、転写開始のカンディダアルビカンスＴＦＩＩＢ-介在成分の開始を検出する。実施例１転写の阻害のためのスクリーニングａ）転写アッセイ成分ＤＮＡテンプレートからのｍＲＮＡ転写を合成するために必要な無機成分からなるインビボでの転写アッセイは、ｍＲＮＡ生成の阻害をスクリーンするのに使用することができる。そのようなアッセイの要素は；ａ）ＤＮＡテンプレート、ｂ）ＲＮＡポリメラーゼＩＩ、ｃ）組換えカンディダアルビカンスＴＦＩＩＢ、及びｄ）好適なカンディダアルビカンスＴＢＰであるＴＢＰからなる。転写の効果を増加するため、転写複合体の付加的な成分が要望により、例えばＴＦＩＩＥ、ＴＦＩＩＦ、ＴＦＩＩＨなどが含まれても良い。 ParvinとSharp(Cell 73，533-540，1993)は、ＤＮＡテンプレート、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ、ＴＦＩＩＢ、及びＴＢＰを含んだ最小の反応でインビボでの遺伝子転写を再構成している。最小限の条件の下での有効な転写のために、そのＤＮＡテンプレートａ）は超コイル化され、及び（ｂ）はＴＡＴＡ共通部分を含んだプロモーター部分を所有する。加えて、Lueら(Science 246，661-664，1989) は、転写がグアノシン残基を欠くＤＮＡテンプレート(Ｇ-マイナス又はＧ-レスカセット)で最も有効に検出できることを確認している。プロモーター依存性は、プロモーター配列を欠くプラスミドがテンプレートとして用いられる場合にシグナルの損失によって表される。正確な開始は、変成ポリアクリルアミド電気泳動ゲル上で予期される生成物のサイズと一致する移動性を持ったバンドの生成物によって示される。上述した通り、カンディダアルビカンスＴＦＩＩＢはＲＮＡポリメラーゼＩＩによって転写開始複合体を形成する。従って、本発明によるインビボでの転写アッセイはＲＮＡポリメラーゼＩＩを含有する。たとえそれがカンディダアルビカンス以外の酵母株、例えばサッカロミセスセレビシエからのＲＮＡポリメラーゼＩＩを用いてインヒビタースクリーニングアッセイを実行することが可能だとしても、転移複合体成分がカンディダアルビカンスからのものである相同関係のアッセイが最も望ましい。サッカロミセスセレビシエＲＮＡｐｏIII精製のための方法は、Edwardsら(Pr oc．Natl．Acad．Sci．USA 87：2122-2126(1990))中に記載される。代替的に、カンディダアルビカンスからの高度に精製されたＲＮＡポリメラーゼＩＩは、下記の通り提供される。ＲＮＡポリメラーゼＩＩ活性は、５０ｍＭＴｒｉｓ-Ｃｌ，ｐＨ７．９（４ ℃）、５０ｍＭ(ＮＨ₄)₂ＳＯ₄、２．５ｍＭＭｎＣｌ₂、０．１ｍＭＥＤＴＡ、５ｍＭＤＴＴ、１００μｇ／ｍｌＢＳＡ、０．６ｍＭＡＴＰ，ＣＴＰとＧＴＰ、２５μＭＵＴＰ(２．５μＣｉ)[α-³²Ｐ]ＵＴＰ及び１００μｇ／ｍｌ加熱-変成ウシ胸腺ＤＮＡを最終容量５０μｌ中に含む反応において測定される。反応物は３０℃で６０分間インキュベートされ、そして５０μｌの１５％(w /v)トリクロロ酢酸の添加によって終了させる。酸-不溶の放射能は、ガラス繊維フィルターを通す濾過によって捕集され、液体シンチレーション分光分析装置によって定量分析される。ＲＮＡポリメラーゼ活性の１単位は、上述した条件の下に６０分間、酸-不溶材料内に１pmolのＵＴＰの合併を触媒する。カンディダアルビカンスは、American Type Culture Collection(ATCC 10231 )から得て、活発な撹拌と通気と共に３０℃でＹＰＤ培地(Current Protocols in Molecular Biology，Vol．2，13，Suppl．19(1989))中で培養される。細胞は遠心分離(5000rpm，１０分間，Sorvall H6000ロータ−)によって収穫され、氷冷脱イオン水〜１１で入り℃洗浄し、上記の通り再ペレット化される。その細胞のペレット(湿重量で２００−３００ｇ)は、多量のバッファーＡ(５０ｍＭＴｒｉｓ-ＨＣｌ，ｐＨ７．９，４℃、１０％グリセリン、１ｍＭＥＤＴＡ、５ｍＭＭｎＣｌ₂、及びプロテアーゼインヒビター）、細胞の詰められた容積に等しい３００ｍＭの(ＮＨ₄)₂ＳＯ₄を含む、で完全に再懸濁される(１ｇ／ｍｌ細胞の濃度とする重量により決定される)。再懸濁した細胞は、直ぐに後述するように処理するか又は液体窒素中への滴下によって凍結しさらに−８０℃で保存される。凍結した細胞は処理の前に氷上で解凍される。０．１％の最終濃度にＮＰ−４０の添加の後、細胞は、１ｍｌの酸洗浄ガラスビーズ／ｍｌ細胞懸濁液(Sigma，４００−６２５μＭ)で、ビードビーター(Bead Beater;BioSpec)中で３０分間１２バーストを用いて砕くことによって破砕処理される。ガラスビーズは沈降分離され、その上層が４０分間、30,000ｘｇで遠心分離される。固体(ＮＨ₄)₂ＳＯ₄ が、０．４ｇ／ｍｌ上層液の最終濃度にゆっくりと添加され、且つ得られた沈殿は、100,000ｘｇで３０分間の遠心分離によってペレットにされる。そのペレットは、７５ｍＭの(ＮＨ₄)₂ＳＯ₄を含むバッファーＡに等しい伝導性を生じるために十分な量のバッファーＡによって再懸濁される。次に該再懸濁液を10,000ｘｇで１０分間遠心分離し、この上層(1-1.5mgタンパク質／ｍｌ）は、７５ｍＭの(ＮＨ₄)₂ＳＯ₄を含むバッファーＡで平衡化された３００ｍｌのＤＥＡＥ-カラム上に加えた。７５ｍＭの(ＮＨ₄)₂ＳＯ₄を含むバッファーＡのカラム５倍量で洗浄した後、ＲＮＡポリメラーゼＩＩが０．４Ｍ（ＮＨ₄)₂ＳＯ₄を含むバッファーＡのカラム５倍量で溶離される。フラクションは２８０ｎｍでの吸収によって測定されるタンパク質のピークを含む部分が捕集され且つプールされる。その貯液は２０％のグリセリンを含むバッファーＡに対して４℃で３時間透析される。ＤＥＡＥ-セルロースからの０．４Ｍ(ＮＨ₄)₂ＳＯ₄溶離液(２６１ｍｇのタンパク質、２９０ｍｌ)は０．１５Ｍ(ＮＨ₄)₂ＳＯ₄を含むバッファーＡに均しい導電率に低下させるために十分なバッファーＡで希釈され、10,000ｘｇで１０分間遠心分離され、さらに上層は、０．１５Ｍ(ＮＨ₄)₂ＳＯ₄を含むバッファーＡで平衡化したＤＥＡＥ-セルロース３０ｍｌ上に３０ｍｌ／時の流速で加えられる。０．１５Ｍ(ＮＨ₄)₂ＳＯ₄を含むバッファーＡのカラム３倍量で洗浄した後、そのカラムは、４５ｍｌ／時の流速で、バッファーＡ中に０．１５−０．４Ｍ( ＮＨ₄)₂ＳＯ₄の直線状濃度勾配液２００ｍｌで展開される。０．２２Ｍ(ＮＨ₄)₂ ＳＯ₄の辺りで溶離した、アミニチン-感受性ＲＮＡポリメラーゼ活性の単一ピークからのフラクションはプールされ(２１．１ｍｇタンパク質、４５ｍｌ)、そして０．２Ｍ(ＮＨ₄)₂ＳＯ₄を含むバッファーＡで平衡化された５ｍｌヘパリンアガロースカラム上に直ちに加えられる。該カラムは０．２Ｍ(ＮＨ₄)₂ＳＯ₄を含むバッファーＡのカラムの３倍量で洗浄され、バッファーＡ中に０．２−０．６Ｍ(ＮＨ₄）₂ＳＯ₄の直線状濃度勾配液８０ｍｌで展開される。ほぼ０．４２Ｍ( ＮＨ₄)₂ＳＯ₄で溶離したその活性なフラクションはプールされ(２．０ｍｇタンパク質、１５ｍｌ）、液体窒素中その一部分３００μｌを凍結し、活性が少なくとも６ヶ月間安定なように−８０℃で保存した。本アッセイにおいて使用するタンパク質開始ファクターの精製は、文献(Natur e 346，387-390(1990))中に開示されるような当該分野の標準的な周知の方法(例えば、ゲル濾過に続くホスホセルロースクロマトグラフィー)により達成される。カンディダアルビカンスＴＦＩＩＢ-介在転写阻害のためのスクリーンのため、転写アッセイは組換えカンディダアルビカンスＴＦＩＩＢを用いて再構成される。カンディダアルビカンスＴＦＩＩＢは、Buratowski,1993，Proc．Natl． Acad.Sci．90:5633中に記載されたように大腸菌(E．coli)中で発現され且つ精製される。Lueら(Science 246，661-664(1989))により記載されたＧ-レスカセットに結合したＣＹＣ１プロモーターを含む超コイル化プラスミドＤＮＡは、超コイル化円形ＤＮＡの精製のための標準的な方法によって精製される(Current Proto cols in Holecular Biology，Vol.2，13，Suppl．19(1989))。１０−１００ｎｇのカンディダアルビカンスＴＦＩＩＢ、１０−１００ｎｇのカンディダアルビカンスＴＢＰ、１０−１００ｎｇのカンディダアルビカンスＲＮＡポリメラーゼＩＩ及び１μｇのプラスミドＤＮが、５０ｍＭＨＥＰＥＳ,ｐＨ７．５、１０％グリセリン、９０ｍＭグルタミン酸カリウム、０．７５％ポリエチレングリコール(分子量３３５０)、１０ｍＭ酢酸マグネシウム、５ｍＭＥＧＴＡ、５ｍＭＤＴＴ、０．４ｍＭＡＴＰ、０．４ｍＭＣＴＰ、１０μＭ[α-³²Ｐ]ＵＴＰ、０．２ｍＭ３'-Ｏ-メチル-ＧＴＰ、及びインヒビター候補分子を含有する又は欠いている。反応物は３０℃で３０−６０分間インキュベートされ、そしてＲＮＡ合成が下記の通り検出される。ｂ）転写したＲＮＡの検出新たに転写したＲＮＡの検出は、標準の方法により達成される(Current Proto cols in Molecular Biology，Vol．1，4.10，Suppl 24(1989))。一つの実例として、ＲＮＡ合成は、高い分子量ＲＮＡ生成物内への放射能的又は蛍光的に標識されたヌクレオチドの合併として検出することができ、下記の方法の一つにより決定される：１）酸-不溶性標識材料を適当な方法によって定量する(例えば、放射性前駆体のためのシンチレーション計測、蛍光性前駆体のための蛍光測定)；２）標識した反応生成物を正確に開始される転写に相補的なオリゴヌクレオチドをハイブリダイズする(すなわちノーザンブロット分析)；３）変性ポリアクリルアミド電気泳動ゲル上で、適当な可動性を持った標識したバンドの存在をオートラジオグラフィーによって検出する：４）ポリヌクレオチドからモノヌクレオチドを分ける何れかの別の方法、ここでポリヌクレオチドは望ましいＲＮＡ生成物である。そのような方法は、分子生物学の周知の技法の１つ又はそれ以上を用いて良く(Current Protocols in Molecular Biology，Vol.2，13，Suppl．19(1989))、例えば；ＵＶ分析、アフィニティーシステム(例えば、アフィニティークロマトグラフィー、ニトロセルロース濾過、ビオチン／ストレプタビジン系、免疫アフィニティー)(Current Protocols in Holecular Biology，Vol.2，13，Suppl．19 (1989))；及び高性能液体クロマトグラフィー。カンディダアルビカンスＴＢＰ生物学的活性を妨げるインヒビター分子の含有は転写を阻害する。この分析において阻害ばインヒビターの不在中で生じたｍＲＮＡ転写の量に相対して生じたｍＲＮＡ転写物の量における減少として測定される(陽性コントロール)。ｍＲＮＡ転写物の量における減少はインヒビターの存在を示す。ｍＲＮＡ転写阻害の有効なレベルの測定を下記に示す。実施例２ＤＮＡ-タンパク質複合体形成の阻害のためのスクリーニングＤＮＡ-カンディダアルビカンスＴＦＩＩＢ複合体結合を生じさせるために必要な最小限の成分からなるＤＮＡ-タンパク質結合分析は、転写開始の間にＤＮＡ-カンディダアルビカンスＴＦＩＩＢの形成の阻害のためのスクリーニングに用いることができる。そのような分析の必須的な成分は；ａ）ＤＮＡテンプレート、ｂ）組換えカンディダアルビカンスＴＦＩＩＢ、ｃ）ＴＢＰ、好ましくはカンディダアルビカンスからの、及び任意にｄ）カンディダアルビカンスＴＦＩＩＢインヒビター候補よりなる。カンディダアルビカンスＴＦＩＩＢとＤＮＡテンプレートとの間の相互反応を妨げるインヒビター分子の含有は転写開始を阻害する。該インヒビターはカンディダアルビカンスＴＦＩＩＢタンパク質と直接相互作用して良く、及び／又はそれはＴＢＰ及び／又はＤＮＡテンプレートど、ＴＦＩＩＢ／ＴＢＰ結合のサイトで相互作用して良い。この分析において阻害は、インヒビターの不在中で生じたＤＮＡ-ＴＢＰ-ＴＦＩＩＢ複合体の量に相対して生じたＤＮＡ-ＴＢＰ-ＴＦＩＩＢ複合体の量における減少として測定される(陽性コントロール)。ＤＮＡ- ＴＢＰ -ＴＦＩＩＢ複合体の量の減少はインヒビターの存在を示す。ＤＮＡ-ＴＢＰ-ＴＦＩＩＢ複合体の有効なレベルの測定を下記に示す。ＤＮＡ結合分析の一つは下記の通り構成される。上述した通り大腸菌中で発現され且つそれから精製された、１０−１００ｎｇのカンディダアルビカンスＴＦＩＩＢは、Buratowskiらによって(Cell 56，549-561(1989))記載された一例のようなＴＡＴＡ成分を含有する０．５ｎｇ標識化(例えば放射能又は蛍光標識化) オリゴヌクレオチドと、１０−２０ｍＭＨＥＰＥＳ(又は均等物),pH7.5-8.0，５ｍＭＭｇＣｌ₂、１２％グリセリン、１０ｍＭジチオトレイトール(ＤＴＴ) 、１００μｇ／ｍｌＢＳＡ、５−２０μｇ／ｍｌポリ(ｄＧ-ｄＣ)：(ｄＧ- ｄＣ)及び複合体形成のインヒビター候補を含む反応物中、インキュベートされる。その反応物は３０℃で３０−６０分間インキュベートされる。ＤＮＡ-ＴＢＰ-ＴＦＩＩＢ複合体の形成は、タンパク質固定化のための周知のアフィニティー法(例えば、ビオチン／ストレプタビジン、ニトロセルロース濾過、アフィニティークロマトグラフィー、免疫アフィニティー)を用いる標識ＤＮＡの保持として検出して良い(該標識は放射能標識ＤＮＡ用のシンチレーション計数又は蛍光標識ＤＮＡ用の蛍光測定のような適当な方法論によって検出される)。カンディダアルビカンスＴＦＩＩＢ-ＴＢＰ-ＤＮＡ複合体形成の欠落による標識ＤＮＡの非保持性は有効なインヒビターの存在を示すものである。複合体形成は、ＤＮＡ固定化のための周知の方法を用いて標識されたカンディダアルビカンスＴＦＩＩＢ(例えば放射能的、蛍光的に)の保持として検出されても良い。標識されたカンディダアルビカンスＴＦＩＩＢの非保持はカンディダアルビカンスＴＦＩＩＢ-ＴＢＰ-ＤＮＡ複合体形成の欠乏による有効なインヒビターの存在を示す。これらの方法は、薬の発見においてそれらの通例的な使用のような高いスループットの化合物ライブラリーのスクリーニングのために好適である。ＤＮＡ／タンパク質複合体形成の検出するための第３の実施例は、５％(v/v) グリセリン、２５ｍＭＴｒｉｓ、１００ｍＭグリシン、１ｍＭＥＤＴＡ、５ｍＭＭｇＣｌ₂、カンディダアルビカンスＴＦＩＩＢとＴＢＰの存在中、ｐＨ８．３、を含む４％ポリアクリルアミドゲル上での標識ＤＮＡの電気泳動移動シフトの検出を含有する。標識されたオリゴヌクレオチドの位置は適当な方法(例えば放射性オリゴヌクレオチドのためのオートラジオグラフィー)によって検出される。ＤＮＡ-カンディダアルビカンスＴＦＩＩＢ複合体形成による予期される移動シフトの不在または偏差は、有効なインヒビターの存在を示す。最後に、ＤＮＡ-タンパク質複合体を検出する又は分離するための別の方法は、ＵＶ架橋分析、高性能液体クロマトグラフィー、ファージディスプレイ技法( 米国特許第5,403,484号、Viruses Expressing Chimeric Binding Proteins)、及び後述する表面プラスモン共鳴(Biacore，Pharmacia Biosensor，North America )を含めて使用して良い。実施例３タンパク質-タンパク質複合体形成の阻害のためのスクリーニング出現するべきカンディダアルビカンスＴＢＰ-カンディダアルビカンスＴＦＩＩＢ結合を許すために必要な最低限の成分からなるタンパク質-タンパク質結合アッセイは、転写開始の間に、カンディダアルビカンスＴＢＰ-カンディダアルビカンスＴＦＩＩＢ複合体の形成の阻害をスクリーンすることを用いることができる。そのような分析の成分は：ａ）組換えカンディダアルビカンスＴＦＩＩＢ、ｂ）ＴＢＰ、好ましくはカンディダアルビカンスからの、及び任意にｃ）結合のインヒビターの候補、を含有する。カンディダアルビカンスＴＢＰとカンディダアルビカンスＴＦＩＩＢの間の相互作用を妨げるインヒビター分子の含有は転写開始を阻害する。そのインヒビターはカンディダアルビカンスＴＢＰ又はＴＦＩＩＢタンパク質と相互作用して良く、及びかくして結合を防止する構造的な変更を誘導し、又はカンディダアルビカンスＴＦＩＩＢとＴＢＰタンパク質相互作用を直接阻害して良い。このアッセイにおいて阻害は、インヒビターの不在において生成するカンディダアルビカンスＴＢＰ-ＴＦＩＩＢ複合体の量に相対して生成したカンディダアルビカンスＴＢＰ-ＴＦＩＩＢ複合体の量における減少として測定される(陽性コントロール)。ＴＦＩＩＢ-ＴＢＰ複合体の量における減少はインヒビターの存在を示すものである。カンディダアルビカンスＴＢＰ-ＴＦＩＩＢ結合の有効なレベルの検出を後述する。カンディダアルビカンスＴＢＰ-ＴＦＩＩＢ複合体の形成のための１つのアッセイは以下の通り構成される。上述した通り大腸菌中で発現し且つ精製した１０ −１００ｎｇのカンディダアルビカンスＴＦＩＩＢ及び１０-１００ｎｇのカンディダアルビカンスＴＢＰは、１０−２０ｍＭＨＥＰＥＳ(又は均等物),pH7. 5-8.0、５ｍＭＭｇＣｌ₂、１２％グリセリン、１０ｍＭジチオトレイトール( ＤＴＴ)、１００μｇ／ｍｌＢＳＡ、及び複合体形成のインヒビター候補を含む反応液中に添加される。その反応液は３０℃で３０−６０分間インキュベートされる。カンディダアルビカンスＴＢＰとカンディダアルビカンスＴＦＩＩＢを含む複合体の形成は、５％(v/v)グリセリン、２５ｍＭＴｒｉｓ、１００ｍＭグリシン、１ｍＭＥＤＴＡ、５ｍＭＭｇＣｌ₂、非標識対の存在中、ｐＨ８．３、を含む４％ポリアクリルアミドゲル上での標識(例えば放射能又は蛍光)ＴＢＰ又はＴＦＩＩＢの電気泳動移動シフトによって検出して良い。標識された対の位置は適当な方法(例えば放射性オリゴヌクレオチドのためのオートラジオグラフィー)によって検出される。カンディダアルビカンスＴＦＩＩＢ-ＴＢＰ複合体形成による予期される移動シフトの不在または偏差は有効なインヒビターの存在を示す。カンディダアルビカンスＴＢＰとカンディダアルビカンスＴＦＩＩＢ複合体の形成は、タンパク質固定化のための周知のアフィニティー法(例えば、ビオチン／ストレプタビジン、ニトロセルロース濾過、アフィニティークロマトグラフィー、免疫アフィニティー)を用いて標識されたＴＢＰの保持として検出されて良い。カンディダアルビカンスＴＦＩＩＢ-ＴＢＰの形成の欠落は、阻害の存在を示し且つ標識ＴＢＰの非保持により示される。代替的に、固定化成分はカンディダアルビカンスＴＢＰ及び標識した対カンディダアルビカンスＴＦＩＩＢであって良い。上記実施例において、強いシグナルは、ＴＢＰとＴＦＩＩＢの両方、及び加えて、ＴＡＴＡ成分を含むＤＮＡテンプレートの存在において与えられる。その複合体は、次いでオートラジオグラフィー、リン光測定技法、又は放射能標識したファクターのためのシンチレーション計測、蛍光標識したファクターのための蛍光分析、化学発光又はリン光プローブ化方法論を用いて検出されるリガンドで標識したファクターのためのルミノメトリー、又は別の類似の検出方法又は当該分野において標準的である上述した通りの材料標識化によって定量分析される。タンパク質-タンパク質複合体を検出する又は分離するための別な方法は、ＵＶ架橋分析、高性能液体クロマトグラフィー、ファージディスプレイ技法、及び後述する表面プラスモン共鳴を含めて使用して良い。実施例４ＴＢＰ-ＴＦＩＩＢ-ＲＮＡポリメラーゼＩＩ-ＤＮＡ複合体の形成のためのアッセイＴＢＰ，ＴＦＩＩＢ，ＲＮＡポリメラーゼＩＩ、ＤＮＡ複合体の形成は、別のファクター、ＴＦＩＩＦの添加によって顕著に刺激されることが知られる。以前のデータは、サッカロミセスセレビシエからのＴＦＩＩＦが、シゾサッカロミセスポンベ及びヒトにかすかに関係した種において作用する、このファクターがそれのカンディダアルビカンス相同体に機能的に置換できることを強く示唆することが示される。従って、このファクターは公知の方法(Sayre,1992，J.Bio l．Chem．267:23383)によってサッカロミセスセレビシエから精製され、且つカンディダアルビカンスＴＢＰ，ＴＦＩＩＢ、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ及びＴＦＩＩＢ-ＴＢＰ-ＤＮＡ複合体の再構成のために記載されたようなＤＮＡを含有するプロモータを含有する複合体の形成を再構成するために使用される。複合体の形成は、例えば、１０−１００ｎｇカンディダアルビカンスＴＢＰ、１０−１００ｎｇカンディダアルビカンスＴＦＩＩＢ、１０−１００ｎｇカンデイダアルビカンスＲＮＡポリメラーゼＩＩ、１０−１００ｎｇサッカロミセスセレビシエＴＦＩＩＦ、０．５ｎｇ二重鎖ＴＡＴＡ成分含有-オリゴヌクレオチド(ＴＦＩＩＢ-ＴＢＰ-ＤＮＡ複合体分析用に用いるものと同じ)、１０−２０ｍＭＨＥＰＥＳ(又は均等物),pH7.5-8.0、５ｍＭＭｇＣｌ₂、１２％グリセリン、１０ｍＭジチオトレイトール(ＤＴＴ)、１００μｇ／ｍｌＢＳＡ、５ −２０μｇ／ｍｌポリ(ｄＧ-ｄＣ)：(ｄＧ−ｄＣ)及び阻害活性を試験するべき化合物を含有する反応液中で実行される。３０℃、３０−６０分間のインキュベーションに続き、複合体はＴＢＰ-ＴＦＩＩＢ-ＤＮＡ複合体のための上述した方法の一つによって検出される。ＴＢＰ-ＴＦＩＩＢ-ＲＮＡポリメラーゼＩＩ−ＤＮＡ複合体は、電気泳動法の使用によって同定されるＴＢＰ-ＴＦＩＩＢ-ＤＮＡ複合体よりもより遅い電気泳動移動性を有する。加えて、複合体形成は、ＤＮＡ含有ＴＡＴＡ-成分結合を持ったマトリックス上のＲＮＡポリメラーゼＩＩ活性(上記ＲＮＡポリメラーゼＩＩ精製化のプロトコールにおいて記載されたＲＮＡポリメラーゼ活性のための分析法を用いる酸-不溶性生成物中の標識化ヌクレオチド前駆体の合併によって測定される)のＴＢＰ、ＴＦＩＩＢ依存性保持として検出することができる。阻害性化合物のＩＣ₅₀は、上述した通り再構成される反応物中の滴定によって決定されるであろう。ヒトのＴＢＰ、ＴＦＩＩＢ及びＲＮＡポリメラーゼIIによって再構成された反応物に対するこれら化合物のＩＣ₅₀もまた、同じ方法によって決定されるであろう。ヒトのＲＮＡポリメラーゼＩＩとＴＦＩＩＦは、先の開示の通り精製される(Floresら，1990，J．Biol．Chem．265:5629-5634; Reinbergら，J.Biol．Chem 262:3310-3321)。カンディダアルビカンスのファクターを含む反応物に対するＩＣ₅₀がヒトのファクターで再構成された反応物に対するそれらのＩＣ₅₀の≦1/5であるそれらの化合物は、後述する通りカンディダアルビカンス増殖を阻害するそれらの能力のために試験されるであろう。実施例５ファージディスプレイインヒビタースクリーニング上述した当該技術における標準的な技法に加え、分子の同定化のための別の技法は、インヒビター分子の同定化において用いることができる。これらの技法の一つが、ファージディスプレイ技法(米国特許第5,403,484号、Viruses Expressi ng Chimeric Binding Proteins)である。ファージディスプレイは、選択した標的に対する結合タンパク質の同定化を許す。ファージディスプレイは組換えバクテリオファージを用いる分子スクリーニングのプロトコールである。該技法は重要な標的分子結合することができる適当なリガンド(この場合、インヒビター候補)をコード化する遺伝子を持った形質転換バクテリオファージを含む。この開示の目的のため、標的分子は、これまでに記載した通りのカンディダアルビカンスＴＢＰ、又はＴＢＰ及び／又はＴＦＩＩＢを用いて形成されたＤＮＡ-タンパク質又はタンパク質−タンパク質複合体で良い。形質転換されたバクテリオファージ (好ましくは固体支持体に固定された)は、インヒビター候補を発現し且つそれのファージ外層上にディスプレイされる。標的分子を認識するインヒビター候補を生じる細胞又はウイルスは分離され且つ増殖される。成功したインヒビターは特徴付けされる。ファージディスプレイ技法は、標準のアフィニティーリガンドスクリーニング技法を越えた効果を有する。そのファージ表面には３次元構造においてミクロタンパク質リガンドが、より密に類似したそれの本質で生起した構造がディスプレイされる。これはより特異的であり、スクリーニングの目的のために高度なアフィニティー結合を許す。実施例６生物特異的な相互作用分析本発明のインヒビタースクリーニング分析に適用して良い第２の関連のある新規スクリーニング技法は、生物特異的相互作用分析(BIAcore，Pharmacia Biosen sor AB，Uppsala，Sweden)。この技法は、Jonssonら(Biotechniques 11:5，620- 627(1991))によって詳細に記載される。生物特的相互作用分析は、センサーチップ上の生物分子複合体の吸収をモニターするための表面プラスモン共鳴(ＳＰＲ) を用いる。ＳＰＲはセンサーチップの表面で導かれた偏光の屈折率における偏光を測定する。関連の標的分子(すなわちカンディダアルビカンスＴＢ又ＦＩＩＢはタンパク質-タンパク質又はＴＦＩＩＢを含むタンパク質-ＤＮＡ複合体)に結合することができる特異的リガンド(インヒビター候補)は、センサーチップに固定化される。標的分子の存在において、固定化リガンドへの特異的な結合が生じる。初期の固定化リガンド-標的分子複合体は偏光の屈折率における変化の原因となり、且つダイオードアレイ上に検出される。生物特異的相互作用分析は次に効果を提供する：１）分子複合体形成の標識-フリーの実験を許すこと；２）そのアッセイがセンサーチップを通過するリアルタイムでの分子の相互作用を研究すること；３）１０ｐｇ／ｍｍ²以下の表面濃度で検出すること；２つ又はそれ以上の分子間の相互作用を検出すること；及び４）完全に自動化されること(Biotechniques 11;5 ，620-627(1991)). 実施例７潜在的なインヒビターの高スループットスクリーニングここに開示されるスクリーニング法が複数のサンプルのスクリーニングを包含し、また「高スループット」スクリーニングとしてここに関連するものは本発明に従って考察される。例えば、高スループットスクリーニングにおいて、数百から数千までのインヒビター候補が単一の分析においてスクリーンされて良い。本発明に従って用いられる高スループットスクリーニング分析の幾つかの実施例は下記の通りである。タンパク質Ａ(ｐＡ)-カンディダアルビカンスＴＦＩＩＢ融合タンパク質は、プラスミドｐＲＩＴ２Ｔ(Pharmacia Biotech)のｐＡコード化配列のフレーム下流中にＴＦＩＩＢのコード化配列の挿入化によって生成される。融合構造が誘導され、且つ組換えタンパク質が製造者の提示する条件に従って抽出され且つ精製される。この手順は、下流コード化配列がＴＢＰタンパク質のそれであることを予期するｐＡ-カンディダアルビカンスＴＢＰ融合タンパク質の作製のために実行することもでき；全ての他の工程は同様に保持されるであろう。 Dynatech Microlite 2ミクロタイタープレート又は均等な高タンパク質-結合容量プレートが、コーティング緩衝液(０．２Ｍ炭酸ナトリウム,ｐＨ９．４)中に３００μｌの３．３３μｇ／ｍｌのヒトＩｇＧ(シグマ社)を４℃で４−１２時間ウェル中でインキュベートすることによって、１μｇ／ウェルのヒトＩｇＧをコートした。該コーティング緩衝液はさらにデカンテーションされ、該ウェルは３００μｌのＰＢＳで５回洗浄される。３．３３μｇ／ｍｌのｐＡ−ＴＦＩＩＢ又はｐＡ-ＴＢＰを含有する３００μｌのブロック化緩衝液(SuperBlock^TMブロック化緩衝液；Pierce社)が加えられ、さらに該プレートは４℃で４時間又はそれ以上インキュベートされる。そのプレートは使用するまで４℃でこの形態において保存される。使用開始の場合、該プレートは３００μｌのＰＢＳで５回洗浄される。２０−２００μＭの最終濃度で試験化合物は、コーティング工程の間に加えられることがないとしても、ＴＦＩＩＢ又はＴＢＰを標識され(すなわち、非融合タンパク質)、且つ１０−１０００ｆモルのＴＡＴＡ配列含有ＤＮＡが２００μｇ／ｍｌのＢＳＡを含有するトータルの容量１５０μｌのＨＥＧ緩衝液中に懸濁され、さらに該反応物を６０分間緩やかに撹拌しつつ室温でインキュベートされる。該プレートは次いで、Dynatech plate waser又は均等物を用いたＰＢＳで５回洗浄される。結合した標識化タンパク質は、ウェル当たり２５０μｌのHicrosci nt(パッカード社)の添加によって定量分析され、且つミクロタイタープレート- 適合シンチレーション分光計において計数される。代替として、タンパク質Ａ融合及び第２の、非融合タンパク質は、上述と同じ緩衝液とインキュベーション条件の下でポリプロピレン製のマイクロタイタープレート中、試験化合物の存在中インキュベートされる。この反応混合物は次いで、ヒトＩｇＧ(上述したものが好適であり且つブロック化緩衝液中に保存され且つ使用前の中間で３００μｌのＰＢＳで５回洗浄される)でコートしたマイクロタイタープレートのウェルに移され、さらに緩やかに撹拌しつつ室温で６０分間インキュベートされる。プレート上の放射能の保持として測定されるＴＢＰとＴＦＩＩＢの相互作用は、プレートにコートされたヒトＩｇＧ及び野生型カンディダアルビカンスＴＢＰ又はＴＦＩＩＢ、ｐＡに融合されることが必要であるものの一つに起因する。３０％より大きい放射能の阻害保持が同定されるインヒビター候補又は抽出物及びその阻害活性はもし必要ならばさらに精製される。上述した通り同定されるインヒビターは、これまで記載したようなインビボでの転写システム中でのカンディダアルビカンスＴＦＩＩＢ-従属転写を阻害するためのそれらの能力について試験され、且つまたカンディダアルビカンス増殖を阻害するそれらの能力について試験しても良い。意図される、しかしそれに限定されないが、別な融合又は修正されたタンパク質システムは、グルタチオン-Ｓ-トランスフェラーゼ、マルトース結合タンパク質、インフルエンザウイルスヘマグルチニン、ＦＬＡＧ^TM及び公知の方法で作製され、発現され、且つ精製されたカンディダアルビカンスＴＢＰ又はカンディダアルビカンスＴＦＩＩＢに融合するヘキサヒスチジン又は商業的に役立て得る反応性ビオチン前駆体を用いて作製されるビオチン化されたカンディダアルビカンスＴＢＰ又はＴＦＩＩＢ、を含有する。精製された融合又は変性タンパク質は、それぞれの融合タンパク質のための適当なリガンド(例えば、グルタチオン、アミロース、ＣＡ１５７抗体、などのそれぞれ)を含んだミクロタイタープレート上に固定化され、且つその測定は上述したのと本質的に同じ手法において実行され且つ結果が評価される。実施例８インヒビター候補これまでに使用されたような「インヒビター候補」は、カンディダアルビカンスＴＦＩＩＢ-介在転写開始又は複合体形成を阻害することの能力を持った何れかの化合物である。インヒビター候補は、その分子の分子量及び測定のタイプに鑑みた濃度範囲において試験される。例えば、タンパク質／タンパク質又はタンパク質／ＤＮＡ複合体形成又は転写開始の阻害のため、小さい分子(下記の通り)は１ｐｇ−１００μｇ／ｍｌ、好ましくは１００ｐｇ−１０ｎｇ／ｍｌの濃度範囲において試験されて良く；大きな分子、例えばペプチドは、１０ｎｇ−１００μｇ／ｍｌ、好ましくは１００ｎｇ−１０μｇ／ｍｌの範囲において試験されて良い。カンディダアルビカンス増殖又は生存可能性のインヒビターは、これまでに記載の新規な転写ファクター、ＴＦＩＩＢを標的として良く、又はそれはインビボにおいて出現する且つカンディダにおいて転写開始に至る自然の生物学的相互作用を防止するための新規な転写ファクターと相互作用するタンパク質又は核酸を標的として良い。かくて、これまでに記載した通り同定されるインヒビターは、２つの特性を有するであろう：１）何れかの濃度で、それがカンディダアルビカンス増殖又は生存可能性を阻害するであろう；及び２）同じ濃度で、それは哺乳動物、特にヒト、細胞の増殖に有意の影響を与えないであろうこと。インヒビター候補は、これまでに記載の新規ＴＦＩＩＢ配列に基づいたアミノ酸配列を有するペプチド及びポリペプチドインヒビターを含有するであろう。例えば、ＴＦＩＩＢのフラグメントは、例えばＲＮＡポリメラーゼＩＩ、ＴＢＰのようなカンディダの転写において含有される他のタンパク質へのＴＦＩＩＢの結合に関して、又はＤＮＡテンプレートへの転写複合体の結合に関して、競合するインヒビターとして作用して良い。そのようなフラグメント候補の一つは、古典的亜鉛フィンガーモチーフを含有するＴＦＩＩＢのフラグメントである(配列)。このフラグメントスパン３５アミノ酸はＴＦＩＩＢ配列の残基２２−４６によって表される。合成の又は天然の化合物の大きなライブラリーからのインヒビター候補の化合物をスクリーンすることができる。多数の手段が、サッカリド、ペプチド及び核酸をベースとする化合物のランダム及び直接的合成のために現に用いられる。合成化合物ライブラリーは、Maybridge Chemical Co.(Trevillet，Cornwall，UK) 、Comgenex(Princeton，NJ)、Brandon Associates(Merrimack，NH)及びMicrosou rce(New Milford，CT)を含む多くの会社から商業的に役立て得る。まれな化学ライブラリーは、Aldrich(Milwaukee，WI)からのものが使用し得る。結合のライブラリーを使用し得るとともに作製することができる。代替的に、細菌、真菌、植物及び動物抽出物の形態においての天然化合物のライブラリーは、例えば、Pan Laboratories(Bothell，WA)又はHycoSearch(NC)からのものを使用でき、又は容易に作製可能である。補足的に、天然の及び合成で生成したライブラリーまたは化合物は、通常の化学的、物理的及び生化学的手段を経て容易に修正される。使用する化合物は、典型的にはそれらが有機化合物であり、且つ好ましくは小さい有機化合物であるにもかかわらず、多数の化学部門の中で見出すことができる。小さい有機化合物は、５０より大きい、さらに約２５００ダルトンより小さい、好ましくは約７５０より小さい、より好ましくは３５０ダルトンより小さい分子量を有する。典型的な分類は、複素環、ペプチド、サッカリド、ステロイド、及びその類似物を包含する。その化合物は、有効性、安定性、製薬上の適合性及びその類似の特性を増大するために修正されて良い。薬剤の構造的な同定化は、同一化すること、生成すること、又は添加薬剤のスクリーンすることを用いて良い。例えば、ペプチド剤が同定された場合、Ｄ-アミノ酸、特にＤ-アラニンのよな非天然アミノ酸を用いるような、それらの安定性を増加させるための各種の手法において、アミノ又はカルボキシ末端を機能化すること、例えばアミノ基のためのアクリル化又はアルキル化、及びカルボキシル基のためのエステル化又はアミド化、又は同様の手法、によって修正して良い。安定化の別な方法は、例えばリポソームなどのようなカプセル内包化を含めて良い。実施例９有効な阻害の測定インヒビター候補による阻害の量は、放射能標識部分によって再構成される反応を開示する下記の式を用いて定量される。式中、ＣＰＭ_{Positive control}(ＣＰＭ陽性コントロール)はインヒビター候補を欠いた反応において形成された複合体又はＲＮＡ分子中のｃｐｍの平均であり、またＣＰＭ_Sampleはインヒビター候補を含有する反応において形成された複合体中のｃｐｍである。阻害パーセントが５０％であるためのインヒビター候補は、カンディダアルビカンスＴＦＩＩＢ又はヒトＴＦＩＩＢ(存在する組換えクローンを用い大腸菌中で発現され且つ生成された(Petersonら，Science 248，1625-1 630，1990；Kaoら，Science 248，1646-1650，1990；Hoffmanら,Nature 346，38 7-390，1990，及び上述の通り測定される)のいずれかを含む反応物中で滴定され、且つヒトとカンディダアルビカンスＴＦＩＩＢに関するそれらのＩＣ₅₀は、化合物濃度対％阻害のグラフから決定される。そのＩＣ₅₀は、５０％阻害の結果が得られた濃度として表される。カンディダアルビカンスＴＦＩＩＢ-含有反応に対するＩＣ₅₀がヒトＴＦＴＩＢ-含有反応に対するＩＣ₅₀の１／５より低く又は等しくなるためのインヒビター候補は、後述する培養におけるカンディダアルビカンスの増殖を阻害する能力についてさらに試験される。実施例１０培養におけるカンディダアルビカンス増殖の阻害のための測定以前のインヒビターはここまでに記載された結合又は転写測定の１つ又はそれ以上において同定され、それは培養におけるカンディダアルビカンスの増殖及び／又は生存可能性についてインヒビターの作用を決定するために開示することができる。インヒビター候補は以下の通りの培養においてカンディダアルビカンス細胞の増殖を阻害する能力が試験される。培養における増殖阻害について実行する試験の方法は、当該技術において周知である。そのような以前の手順は、下記の通りのＮＣＣＬＳＭ２７Ｐ法(The National Committee for Clinical L aboratory Standards，Reference Method for Broth Dilution Antifungal Susc eptibility Testing of Yeasts;proposed standard，1992)に基づいている。インヒビター候補の連続希釈(１００−２００μｇ／ｍｌの最大濃度から出発する2 -又は3倍ステップ)は、希釈液としてRPHI-1640培地を用いて調製され且つ各希釈液の１００μｌの一部分は、９６-ウェルのポリスチレンミクロタイタープレートに加えられる。カンディダアルビカンス試験株(American Type Collection Y east Catalogからのカタログナンバー１０２３１)を前もって１４−２０時間接種培養したSabouraudデキストロース寒天培地から取り出した５つのカンディダアルビカンスのコロニーは、細胞濃度が10,000-30,000細胞／ｍｌとなるようにR PMI-1640培地中に再懸濁した。細胞懸濁液１００μｌが、希釈したインヒビター候補及び培地のみのコントロールを含む９６-ウェルのミクロタイタープレートの各ウェル内に加えられる。培養物は撹拌によって混合され、そして撹拌なしに３５℃で４８時間インキュベートし、細胞増殖の後、混濁及び／又は菌糸体コロニーの形成のための視覚検査によってモニターされる。この方法によって細胞の増殖が検出されないインヒビター候補の最小濃度が化合物の付いての最小阻害濃度(ＭＩＣ)として表される。この技法を用いて得られる周知の抗真菌化合物のＭＩＣの実例はフルコナゾールが０．１２５−０．５μｇ／ｍｌ、及びアンホテリシンＢ(The National Committee for Clinical Laboratory Standards，Referen ce Method for Broth Dilution Antifungal Susceptibility Testing of Yeasts ;proposed standard，1992)が０．２５−１．０μｇ／ｍｌである。これまでに記載した方法によって同定したインヒビターは、フルコナゾール又はアンホテリシンＢのＭＩＣと均等か若しくはより少ないＭＩＣを有する。実施例１１ヒトＴＦＩＩＢを用いる転写阻害カウンタースクリーンここに記載されたアッセイの１またはそれ以上に従うカンディダアルビカンスのインヒビターとして同定された化合物は、宿主生物におけるその有効性を決定するためにさらに試験して良い。ヒトの治療のための有効な抗真菌化合物の発展において、そのような化合物は、病原性真菌の生存可能性を阻害することにおいて有効な薬剤として作用し、同時にヒトの細胞システムを有意に阻害することがないので望ましいものである。特に、上述した測定のいずれか１つにおいて同定化したカンディダアルビカンスのインヒビターは、ヒトのＴＦＩＩＢの阻害のためのカウンタースクリーンされて良い。組換えヒトＴＦＩＩＢは、生存ソースから得ることができ、且つ公知の方法( 例えば、Petersonら、Kaoら、及びHoffmanら、上記を参照)によって精製され、上述したような、しかしヒトのシステムを用いるアッセイにおいてインヒビター候補と接触させる。ヒトの治療としてカンディダアルビカンスＴＦＩＩＢインヒビターの有効性は、カンディダアルビカンスＴＦＩＩＢに関する阻害のレベルに比したヒトＴＦＩＩＢに対する阻害の低いレベルを示す１つのものとして決定される。例えば、上述したアッセイの何れかにおいて試験する場合に、ヒトのシステムにおいてヒトＴＦＩＩＢの与えられるインヒビターによる阻害の量がカンディダのシステム中のカンディダアルビカンスＴＦＩＢの阻害の量に関して２０％しかないことが好適である。投薬及び製剤組成物治療的使用のため、これまでに記載した同定されたインヒビターは、例えばクリーム、軟膏、ローション又は局所適用のためのスプレーの形態において製剤的に許容され／生物学的に適合可能な組成物として、または内部投与のための、塩の溶液のような、生理学的溶液として、投与されて良い。投与されるインヒビターの量は、病原体の感染の度合い及び感染が全身的か又は局所的かのいずれかに従って決定されるであろうし、また典型的には、約１μｇ−１００ｍｇ／体重１ｋｇの範囲とされるであろう。該インヒビターがペプチド又はポリペプチドである場合には、約１００−５００μｇ／ｍｌ投薬当たりの範囲において投与されるであろう。インヒビターの単一投薬又は複数投薬、毎日、週毎の、又は断続的な投薬は本発明に従い意図される。投与のルートは医師により選択されるであろうし、局部、経口、経皮、点鼻、直腸中、静脈中、筋肉中、又は皮下注射であって良い。ブダペスト条約による寄託カンディダアルビカンスＴＢＰコード化遺伝子を含むプラスミドで形質転換した大腸菌(E．coli)は、１９９５年９月１５日付で取得ナンバー６９９００の下に、A.T.C.C，Rockville,MDに、国際寄託において寄託されている。カンディダアルビカンスＴＦＩＩＢコード化遺伝子を含むプラスミドで形質転換した大腸菌(E.coli)は、１９９５年９月１５日付で取得ナンバー６９８９９の下に、A. T.C.C,Rockville,MDに、国際寄託において寄託されている。A.T.C.C.Nos.６９９００と６９８９９は、ここに記載された本発明との関連においてその取得ナンバーを開示した特許の付与の公開上で役立て得るであろう。ブダペスト条約に従ってなされた該寄託は、該寄託がなされた特許の存続期間を越えて役立て得るであろうし、寄託の時点から少なくとも３０年の期間は維持されるであろうし且つ少なくとも５年後に寄託した試料の供与のための最も最近の要求がA.T.C.C.によって受領される。それはこれら寄託物の有用性が政府の指令によって主題発明のために付与される特許権の低下において主題発明を実施するためのライセンスを構成するものではない。他の実施態様前述の実施例は、本発明の作製及び実行において本発明によって実施され且つ考慮した実験を示す。これらの実施例は本発明の実施の技術とその有用性を示すことの両方を知らせるために役立つ技術の開示を含むものと確信する。それは、ここに一般的に記載された多くの技術と実施態様は、同じ結果を達成するために用いて良い一般の多くの均等な方法と技術において単に好適な実施態様に過ぎない。ここまでに関係した参考文献の全ては、それらの記載、説明、本発明の１又はそれ以上の実施態様を実行するのに重要視して良い基礎となる又は可能な組成物及び又は方法を提供する範囲との関係によってここに明白に併合される。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ１２Ｎ 1/19 Ｃ１２Ｎ 1/19 1/21 1/21 5/10 Ｃ１２Ｐ 21/02 ＣＣ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｑ 1/68 ＺＣ１２Ｑ 1/68 Ｇ０１Ｎ 33/15 ＺＧ０１Ｎ 33/15 33/50 Ｚ 33/50 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ａ //(Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡＣ１２Ｒ 1:725） (72)発明者ブラトウスキー，ステファンアメリカ合衆国マサチューセッツ 02912 ニードハムウェブスターストリート 706 (72)発明者ウォッベシー，リチャードアメリカ合衆国マサチューセッツ 02173 レキシントンスプリングストリート 57 (72)発明者ブラッドリー，ジョンアメリカ合衆国マサチューセッツ 02147 ブルックラインパークマンストリート＃１ 25

Claims

【特許請求の範囲】１．カンディダアルビカンスＴＦＩＩＢコード化核酸配列を備える組換え核酸。２．カンディダアルビカンスＴＦＩＩＢコード化核酸配列を備えるベクター。３．カンディダアルビカンスＴＦＩＩＢコード化核酸配列を備える形質転換宿主細胞。４．カンディダアルビカンスＴＦＩＩＢを備える組換えポリペプチド。５．カンディダアルビカンスＴＦＩＩＢのフラグメントであり、転移開始においてカンディダアルビカンスＴＦＩＩＢの生物学的活性を阻害することを特徴とするフラグメント。６．カンディダアルビカンスＴＦＩＩＢのフラグメントであり、転移開始においてカンディダアルビカンスの増殖を妨げることを特徴とするフラグメント。７．カンディダアルビカンスＴＦＩＩＢコード化核酸の発現を許容するに十分な条件の下で請求項３記載の宿主細胞を培養すること、及び上記カンディダアルビカンスＴＦＩＩＢを分離することを備える組換えカンディダアルビカンスＴＦＩＩＢの製造方法。８．ＤＮＡテンプレート、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ、組換えカンディダアルビカンスＴＦＩＩＢ、及びインヒビター候補を備え、インビボでの転写アッセイにおいてｍＲＮＡ転写の阻害を検出すること、ここで上記ＤＮＡテンプレートからのｍＲＮＡ転写の生成は上記インヒビター候補の不在において起こる、を備えるカンディダアルビカンス増殖のインヒビターを同定するためのスクリーニング方法。９．ＤＮＡテンプレート及び組換えカンディダアルビカンスＴＦＩＩＢを備える複合体の形成の阻害を、インヒビター候補の存在中で検出すること、ここで上記インヒビター候補の不在において上記複合体の形成が起こる、を備えるカンディダアルビカンス増殖のインヒビターを同定化するためのスクリーニング方法。１０．カンディダアルビカンスＴＦＩＩＢ及びカンディダアルビカンスＴＢＰを備える複合体の形成の阻害を、インヒビター候補の存在中で検出すること、ここで上記インヒビター候補の不在において上記複合体の形成が起こる、を備えるカンディダアルビカンス増殖のインヒビターを同定化するためのスクリーニング方法。１１．ＲＮＡポリメラーゼＩＩ、カンディダアルビカンスＴＢＰ、及びカンディダアルビカンスＴＦＩＩＢを備える複合体の形成の阻害を、インヒビター候補の存在中で検出すること、ここで上記インヒビター候補の不在において上記複合体の形成が起こる、を備えるカンディダアルビカンス増殖のインヒビターを同定化するためのスクリーニング方法。１２．上記阻害が複数のインヒビター候補による阻害を示すように複数のインヒビター候補の存在中で上記検出が実行される、請求項８，９，１０又は１１のいずれか１項記載のスクリーニング方法。１３．複数の検出工程が複数のインヒビター候補を用いて同時に実行される、ここでいずれか１つのインヒビター候補による阻害の検出が複数を独自に検出可能とされる、請求項８，９，１０又は１１のいずれか１項記載のスクリーニング方法。１４．カンディダアルビカンスＴＦＩＩＢの生物学的活性を選択的に阻害するインヒビターと培養基とを接触させることを備える、培養におけるカンディダアルビカンス増殖の防止方法。１５．カンディダアルビカンスＴＦＩＩＢの生物学的活性を阻害するインヒビターの治療的有効量を哺乳動物に投与することを備える、哺乳動物におけるカンディダアルビカンス増殖の防止方法。