FR2860237A1

FR2860237A1 - Polypeptide d'interaction comprenant un motif heptapeptidique et un domaine de penetration cellulaire

Info

Publication number: FR2860237A1
Application number: FR0311463A
Authority: FR
Inventors: Pierre Jalinot; Armelle Roisin; Jean Philippe Robin
Original assignee: Centre National de la Recherche Scientifique CNRS; Ecole Normale Superieure de Lyon; Ecole Normale Superierure de Lyon
Current assignee: Centre National de la Recherche Scientifique CNRS; Ecole Normale Superieure de Lyon; Ecole Normale Superierure de Lyon
Priority date: 2003-09-30
Filing date: 2003-09-30
Publication date: 2005-04-01
Anticipated expiration: 2023-09-30
Also published as: FR2860237B1; WO2005033147A1; US7709606B2; JP2008500267A; CA2540520A1; EP1668037A1; JP4927546B2; US20060240516A1

Abstract

La présente invention concerne un polypeptide d'interaction consistant en ou comprenant un motif heptapeptidique de séquence X1X2X3X4X5X6X7 et un domaine de transduction, caractérisé en ce qu'il s'agit d'un polypeptide chimère, que l'acide aminé X7 se trouve entre 5 et 35 acides aminés de l'extrémité C-terminale dudit polypeptide, et que le domaine (b) est situé en C-terminal par rapport au motif (a).Elle concerne également des procédés de criblage pour l'identification de polypeptides d'interaction capables de modifier le phénotype d'une cellule et des utilisations des polypeptides d'interaction tels que mentionnés dans des cribles phénotypiques ou pour des fins thérapeutiques. Enfin, la présente invention est dirigée vers des polypeptides d'interaction particuliers capables de modifier la fonction de la protéine virale Rev de HIV-1

Description

POLYPEPTIDE D'INTERACTION COMPRENANT UN MOTIF
HEPTAPEPTIDIQUE ET UN DOMAINE DE PENETRATION CELLULAIRE La présente invention concerne des polypeptides d'interaction comprenant un motif heptapeptidique et un domaine de pénétration cellulaire, et des procédés de criblage pour l'identification de polypeptides d'interaction capables de modifier le phénotype d'une cellule. La présente invention concerne également des utilisations des polypeptides d'interaction tels que mentionnés dans des cribles phénotypiques ou pour des fins thérapeutiques. Enfin, la présente invention est dirigée vers des polypeptides d'interaction particuliers capables de modifier la fonction de la protéine virale Rev de HIV-1 Les interactions peptidiques sont responsables d'une part importante de la communication intra et intercellulaire ; c'est par un jeu complexe d'interactions entre une protéine et son ligand que la cellule fonctionne et s'adapte à son environnement. Quand de nouvelles protéines sont identifiées, cette connaissance peut paraître, dans un premier temps, dépourvue d'intérêt tant que les partenaires de cette nouvelle protéine ne sont pas, à leur tour, identifiés, ce qui permet de déterminer la fonction cellulaire de la protéine.

De plus, une protéine est, dans la majorité des cas, capable d'interagir avec différents partenaires. De ces interactions peuvent naître ou bien la même fonction vis-à-vis de chacun des partenaires (par exemple une protéine phosphorylant différents ligands peptidiques), ou bien peuvent naître ainsi des fonctions parfaitement distinctes. Cela est notamment le cas des protéines membranaires, qui indépendamment de leur fonction naturelle au sein de la cellule, servent également de porte d'entrée pour des virus. La fonction de toute protéine donnée est donc en grande partie déterminée par les peptides ou protéines avec lesquels cette protéine interagit.

Les interactions protéiques sont en général la combinaison d'interactions locales entre des sites très spécifiques de la protéine (quelques acides aminés) grâce à différentes liaisons, telles que des liaisons électrostatiques, hydrogène, et d'interactions répulsives dues à l'encombrement spatial.

Une protéine donnée peut interagir spécifiquement avec un domaine protéique si bien que cette protéine peut interagir avec toute une classe d'autres protéines qui partagent ce même domaine.

Bien que pour une protéine donnée on ne connaisse en général qu'un nombre restreint de partenaires peptidiques naturels, sa capacité d'interaction est bien plus importante. En effet, une protéine donnée peut posséder de nombreux sites capables de générer des interactions et qui soient accessibles à d'autres peptides.

La détermination de nouveaux partenaires d'interaction peut donc permettre ou bien de modifier (perturber, empêcher, améliorer, changer la cinétique, la spécificité,...) des interactions, ou bien de mimer des interactions existantes, ou bien de mettre au jour de nouvelles interactions.

L'identification de nouveaux partenaires d'interaction est en général réalisée dans deux situations différentes.

Dans un premier cas, on recherche un partenaire pour une cible déterminée, intracellulaire ou extracellulaire. Dans un tel cas, il est possible d'élaborer un polypeptide particulier susceptible d'interagir avec la cible. La séquence de ce polypeptide est déterminée en tenant compte notamment de la structure de la protéine cible avec laquelle il doit interagir, de la répartition des charges, des forces attractives et répulsives. Cette étape est réalisée la plupart du temps par modélisation moléculaire. Cette approche nécessite une connaissance très approfondie de la protéine cible et en particulier de sa structure tri-dimensionnelle. Il est également possible d'effectuer un crible pour tester de très nombreux polypeptides potentiels contre la cible. Le crible doit permettre de mettre en évidence une interaction entre l'un des polypeptide testés et la cible déterminée. Un crible généralement utilisé dans ce cas est le crible deux-hybrides ( two-hybrid system ) en levure (brevet US5,580,736), où la cible déterminée et le polypeptide potentiel sont exprimés simultanément.

Dans un second cas, la protéine cible n'est pas déterminée, c'est-à-dire que de nouveaux partenaires d'interaction peuvent aussi être criblés pour leur capacité à modifier un phénotype donné de la cellule, sans que la protéine cible avec laquelle ils interagissent soit connue. Dans ce cas, on fait appel à des cribles phénotypiques qui consistent à faire exprimer par la cellule différents polypeptides et à identifier ceux capables de modifier le phénotype dans le sens attendu (brevet US 6, 153,380).

Une variante de cette situation consiste à cribler de nouveaux partenaires d'interaction capables d'empêcher, de détruire, de modifier ou de déstabiliser une interaction entre deux autres protéines. Dans ce cas, on fait également généralement appel à des cribles phénotypiques. Le mode par lequel le partenaire

agit sur l'interaction entre les deux autres protéines n'est pas nécessairement connu.

Pour l'élaboration de polypeptides à utiliser dans des cribles tels que mentionnés, il a été proposé de nombreuses constructions caractérisées notamment par la présence simultanée d'une séquence protéique fixe (parfois appelée plate-forme) au sein de laquelle est insérée un motif dont la séquence est aléatoire (demande de brevet W096/02561). En faisant varier cette séquence, il est donc possible d'engendrer toute une famille de polypeptides et de les tester successivement pour leur capacité à interagir au sein de la cellule.

Quand cette approche est utilisée pour déterminer de nouveaux partenaires d'interaction de protéines intracellulaires, il est généralement fait recours à des clonages et des transformations qui permettent d'exprimer la construction à tester dans la cellule où est exprimée la protéine dont on cherche un nouveau partenaire d'interaction.

Dans le domaine thérapeutique, cela signifie que, si un partenaire potentiel est détecté, il faut ensuite pouvoir en faire un médicament qui agira à l'intérieur de la cellule, c'est-à-dire trouver un moyen pour le faire pénétrer dans la cellule. La thérapie génique ne permet pas normalement de réaliser cette étape aisément. L'autre solution consistant à greffer sur le partenaire d'interaction un motif favorisant la pénétration cellulaire présente quant à elle l'inconvénient de modifier le partenaire d'interaction d'une façon non prévisible. Après cette modification, il n'est pas assuré qu'il soit encore capable d'interagir avec la protéine dont il a été choisi pour être un ligand.

Une autre approche consiste à élaborer des mimes protéiques par modélisation, mais cette méthode n'est pas encore au point. De plus, on aboutit souvent sur des molécules qui ne sont pas ou difficilement en mesure de traverser la membrane de la cellule, et qui donc n'engendrent pas l'interaction pour laquelle elles ont été élaborées. S'il faut greffer sur ces molécules un motif assurant la pénétration cellulaire, alors, comme dans le précédent cas, il n'est pas assuré qu'elles soient encore capables d'interagir avec la protéine dont elles ont été choisies pour être un ligand.

La présente invention a pour objet de proposer de nouveaux peptides d'interaction ayant une construction particulière telle qu'un domaine de pénétration cellulaire est associé au partenaire d'interaction. Si un tel partenaire se révèle, après un premier

crible, susceptible d'interagir avec le partenaire d'intérêt, le passage du crible à la génération d'un médicament n'ajoute pas de nouveau motif qui risquerait de perturber l'interaction mise en évidence lors de l'étape de criblage.

Les peptides d'interaction selon l'invention possèdent la propriété duale de pénétration cellulaire, par exemple dans les lymphocytes et/ou dans les macrophages, et d'interaction avec un partenaire.

Les inventeurs ont développé un procédé permettant de réaliser des protéines de petite taille possédant un motif heptapeptidique et capables de se fixer sur une cible protéique, d'origine virale ou cellulaire, et par là d'inhiber son activité. Ces protéines de petite taille ont été conçues pour pouvoir pénétrer dans les cellules.

Le polypeptide d'interaction de l'invention peut également posséder un domaine de stabilisation, des linkers ou d'autres composantes.

La présente invention propose également différents procédés de criblage permettant d'obtenir de nouveaux polypeptides capables de modifier un phénotype donné ou d'interagir avec une cible donnée.

Un domaine où la détermination de tels partenaires est importante est la réplication des virus. En effet, la réplication de certains virus dans les cellules humaines ou animales est permise par l'expression d'un nombre limité de protéines virales, dont certaines ont une activité essentielle pour la réalisation de ce processus. En bloquant ces protéines par un polypeptide d'interaction défini selon les cribles de la présente invention, donc capable de pénétrer dans les cellules et d'empêcher les contacts nécessaires avec d'autres protéines virales ou cellulaires, il est possible d'empêcher la réplication du virus.

La mise en oeuvre de l'invention a permis d'identifier des partenaires capables d'interagir avec la protéine Rev de HIV-1 et d'empêcher ainsi la réplication du virus.

Ces polypeptides font également partie de la présente invention.

Dans le contexte de la présente invention, les termes ci-dessous sont définis de la manière suivante : Heptapeptide ou motif heptapeptidique : enchaînement linéaire de 7 acides aminés consécutifs liés de façon covalente.

Domaine (peptidique) :séquence peptidique comprenant au moins 5 acides aminés, et qui, au sein d'une séquence le comprenant, peut être délimité par une analyse de délétion-mutation. Un tel domaine est généralement responsable d'une fonction ou d'un rôle et se caractérise par la présence d'acides aminés essentiels

dont la mutation entraîne la perte de fonction. Comme exemples, on peut citer le domaine NLS (Nuclear Localization Signal) présent dans de nombreuses protéines du noyau, le domaine de pénétration cellulaire, le domaine NES (Nuclear Export Signal), les domaines d'interaction protéine-protéine, les domaines catalytiques.

Domaine ou motif de pénétration cellulaire ou de transduction : séquence peptidique, comprenant de 5 à 35 acides aminés, capable d'assurer, in vivo, ex vivo ou in vitro, la pénétration à l'intérieur de la cellule d'une protéine contenant ce domaine.

Afin d'assurer la pénétration cellulaire, le domaine peut nécessiter d'être placé à une extrémité de la protéine, par exemple à l'extrémité C-terminale ; la fonction de pénétration cellulaire peut également être indifférente au positionnement du motif au sein de la protéine. La fonction de pénétration cellulaire est éventuellement limitée à une certaine taille de la protéine, taille au-delà de laquelle la pénétration n'est plus assurée.

Le motif de pénétration cellulaire est soit général à tous les types cellulaires, soit spécifique à certaines membranes, par exemple aux membranes de cellules procaryotes ou aux membranes de bactéries Gram + ou - ou aux membranes de certains types cellulaires humains, tels que les lymphocytes, par exemple les lymphocytes primaires, et/ou les macrophages.

Le motif de pénétration peut également assurer la pénétration à l'intérieur du noyau pour les cellules eucaryotes.

Domaine ou motif de stabilisation : séquence d'acides aminés, comprenant au moins 30 acides aminés, dont la structure secondaire est stable dans le temps et sous certaines conditions de stress, et qui a la capacité de stabiliser toute protéine chimérique qui la comprend. Notamment, la structure doit être peu sensible à la dénaturation et à la dégradation par les protéases et aux conditions de stress en général ; cette structure doit également n'être que faiblement perturbée en cas d'insertion au sein ou aux extrémités de ce domaine. Le domaine de stabilisation se caractérise également par un faible caractère immunogène. De préférence, un domaine de stabilisation est de taille relativement modérée, donc possède moins de 300 acides aminés, de préférence moins de 200 acides aminés.

De manière générale, un domaine de stabilisation est dans la plupart des cas un fragment d'une protéine naturellement présente au sein de la cellule, protéine qui doit être choisie parmi les protéines abondantes dans la cellule, ubiquitaires, et non impliquées dans des processus de dégradation.

Séquence aléatoire : séquence qui est définie ou construite par un processus aléatoire.

Dans le cas d'une séquence d'ADN, le processus aléatoire consiste à choisir, un à un, des désoxyribonucléotides, parmi les quatre possibles, chacun ayant (équiprobabilité) ou non (choix biaisé), la même probabilité d'être choisi. Du fait de la dégénérescence du code génétique, une séquence d'ADN aléatoire, avec équiprobabilité des 4 bases, engendrera une séquence peptidique aléatoire, mais avec un biais, car les acides aminés codés par plusieurs codons seront surreprésentés par rapport aux autres.

La probabilité qu'une séquence d'ADN aléatoire de 21 bases (soit 7 acides aminés) ne contienne pas de codon stop en phase est de 71,5%.

Il peut également s'agir d'une séquence peptidique définie de manière aléatoire, c'est-à-dire que les acides aminés sont déterminées successivement, par choix parmi tous les acides aminés possibles, avec équiprobabilité ou non.

Appât : dans un crible ayant pour objectif de déterminer de nouvelles molécules capables d'interagir entre elles, l'appât est la molécule définie, déterminée, dont on cherche un ligand au moyen du crible.

L'appât peut être fusionné ou non à une molécule jouant le rôle de rapporteur.

Proie : dans ce même crible, la proie est la molécule qui est testée pour sa capacité à interagir avec un appât déterminé.

La proie peut être fusionnée ou non à une molécule jouant le rôle de rapporteur.

Crible deux-hybrides ( two-hybrid system ): il s'agit d'un crible particulier, qui a été mis au point dans un premier temps en levure mais dont le principe peut être adapté à d'autres types cellulaires.

Dans un crible deux-hybrides, la séquence d'ADN codant pour l'appât est fusionnée en phase à une séquence d1 codant pour un premier domaine D1 . La séquence codant pour la proie est quant à elle fusionnée en phase à une séquence d2 codant pour un second domaine D2 . Les domaines D1 et D2 sont caractérisés par le fait que leur réunion D1+D2 a une propriété ou fonction particulière que n'ont pas les éléments D1 et D2 pris séparément. La réunion de D1 et D2 nécessite une intervention extérieure pour les mettre et les maintenir en contact. Après traduction, l'éventuelle interaction de l'appât (fusionné à D1 ), et de la proie (fusionnée à D2 ), entraînera la réunion de D1 et D2 . La propriété ou la fonction particulière qui découle de cette réunion D1+D2 permet de mettre en évidence l'interaction entre l'appât et la proie.

Polypeptide chimère : polypeptide comprenant une fusion covalente d'au moins deux séquences d'acides aminés qui ne sont pas, naturellement, contiguës au sein d'une même protéine. La fusion covalente peut être réalisée par une liaison covalente directe ou indirecte (par l'intermédiaire d'un linker).

Il peut s'agir de deux séquences provenant de deux protéines de la même cellule, ou bien de deux protéines provenant de cellules d'un genre proche ou éloigné, par exemple d'espèces animales différentes, ou bien une séquence d'une protéine de cellule eucaryote et l'autre de cellule procaryote. Il peut également s'agir de la fusion covalente d'une séquence d'une protéine avec une séquence synthétique, qui n'est pas naturellement présente au sein de ladite protéine.

Linker ou espaceur : d'acides aminés, très courte, en général comprenant 1 à 10 acides aminés, de préférence 1 à 5, présente entre deux domaines d'un polypeptide qu'elle sépare. Les linkers sont choisis pour ne pas interférer fonctionnellement avec les deux domaines qu'ils séparent. L'utilisation de linkers est aussi particulièrement recommandée pour permettre à chaque domaine d'adopter un repliement tridimensionnel indépendamment l'un de l'autre.

Les linkers sont généralement riches en acide aminé glycine car ceux-ci présentent un très faible encombrement au niveau de la chaîne latérale et sont peu réactifs. Des prolines sont également très souvent insérés dans les linkers pour leurs propriétés favorisant la formation de coudes et donc une plus grande indépendance des deux domaines que le linker sépare.

Pourcentage d'identité entre deux séquences de protéines : Ce pourcentage indique le degré d'identité entre deux séquences d'acides aminés le long des séquences dans leur entier. Si les séquences considérées sont de taille différente, le % d'identité est exprimé en fonction de la longueur totale de la plus longue séquence. Pour calculer le % d'identité, les deux séquences sont superposées de façon à maximiser le nombre d'acides aminés identiques en autorisant des discontinuités de longueur finie, puis le nombre d'acides aminés identiques est divisé par le nombre total d'acides aminés de la plus longue séquence. Cette définition est celle adoptée dans le cadre de la présente invention.

Selon un premier aspect, l'invention concerne un polypeptide d'interaction comprenant un motif heptapeptidique de séquence N X1X2X3X4X5X6X7 c et un domaine de pénétration cellulaire. Le polypeptide d'interaction selon l'invention est un polypeptide chimère ; son caractère chimère provient de la fusion du motif

heptapeptidique et du domaine de pénétration cellulaire, c'est-à-dire que cet enchaînement n'est pas naturellement présent dans aucune protéine.

De plus, un polypeptide selon l'invention est caractérisé par une disposition particulière du motif heptapeptidique par rapport au domaine de pénétration cellulaire. En effet, l'acide aminé X7 se trouve entre 5 et 35 acides aminés de l'extrémité C-terminale dudit polypeptide, de préférence entre 7 et 25, de préférence entre 9 et 20, par exemple 12 à 15, et le domaine de pénétration cellulaire est situé en C-terminal par rapport au motif heptapeptidique. Le domaine de transduction peut être placé à l'extrémité C-terminale du polypeptide d'interaction ; il peut également être disposé en C-terminal par rapport au motif heptapeptidique, sans pour autant être à l'extrémité C-terminale, par exemple il est suivi par un His-Tag ou un autre motif permettant la purification du polypeptide d'interaction ou bien sa détection.

Le motif heptapeptidique présent dans le polypeptide d'interaction selon l'invention est un enchaînement de 7 acides aminés. De préférence, les acides aminés sont choisis parmi les 20 acides aminés existant naturellement. Cependant, il peut également, dans le cadre de l'invention, être incorporés des acides aminés modifiés.

Le motif heptapeptidique est, par exemple, généré par un processus aléatoire. Il peut également être codé par une séquence d'ADN qui a été elle-même générée par un processus aléatoire. Inversement, le motif heptapeptidique peut être parfaitement choisi et déterminé, éventuellement après une étape de modélisation moléculaire quand le polypeptide d'interaction est criblé pour sa capacité à interagir avec une protéine déterminée.

La longueur de 7 acides aminés pour le motif est particulièrement avantageuse, notamment quand le motif est codé par une séquence d'ADN générée par un processus aléatoire. En effet, quand la séquence d'ADN est générée de manière aléatoire, cela peut conduire à l'obtention de codons stop (TAA, TAG et TGA).

Une longueur de 7 acides aminés, soit 21 nucléotides, permet d'obtenir une occurrence de codons stop et de séquences inutiles relativement faible tout en étant suffisamment long pour l'obtention d'un domaine capable d'interaction. Le chiffre 7 pour la longueur du motif heptapeptidique apparaît donc comme un compromis avantageux.

Un autre avantage du chiffre 7 tient au fait qu'une séquence de cette longueur a peu de probabilité d'être immunogène. En effet, il est connu que les antigènes présentés

par le complexe majeur d'histocompatibilité de classe I (MHC-class 1) ont une longueur minimale de 8 à 9 acides aminés, donc supérieure à la longueur de l'heptapeptide.

Un polypeptide d'interaction d'après la présente invention comprend donc au moins 12 à 42 acides aminés. Il est généralement admis que des polypeptides de cette taille peuvent parfois être peu stables à l'intérieur de la cellule et qu'ils sont des cibles privilégiées pour les protéases, à l'exception toutefois de quelques peptides tels que les peptides antimicrobiens. De ce fait, un polypeptide d'interaction selon la présente invention est, de préférence, couplé à une molécule qui va stabiliser l'ensemble. De préférence, une telle stabilisation est opérée en intégrant un domaine de stabilisation à la séquence du polypeptide d'interaction.

Le domaine de stabilisation est caractérisé par une stabilité dans le temps du polypeptide le comprenant supérieure à celle du même polypeptide sans domaine de stabilisation. Il est également caractérisé par sa stabilité vis-à-vis des conditions de stress, par exemple des conditions de dénaturation et de clivage qui peuvent survenir in vitro ou in vivo. Un domaine de stabilisation donné peut aussi être choisi pour sa stabilité dans certains milieux biologiques particuliers tels que le milieu intestinal ou le milieu sérique, par exemple pour que les partenaires d'interaction contenant un tel domaine soient stables en cas d'ingestion, de passage dans le flux sanguin. Indépendamment de son rôle stabilisant, un domaine de stabilisation peut également posséder des caractéristiques permettant sa détection.

Un autre avantage du domaine de stabilisation est sa capacité à être produit en bactérie, ou dans un autre organisme permettant la production de protéines recombinantes, en quantité importante et sous forme stable.

Parmi les domaines de stabilisation préférés se trouvent les fragments de protéines naturelles. En effet, certaines protéines sont particulièrement abondantes dans la cellule, ubiquitaires, non immunogènes et stables. Des fragments de telles protéines sont alors particulièrement préférés pour une utilisation comme domaine de stabilisation. C'est le cas en particulier des protéines de la famille des ubiquitines (ubiquitin-like).

Quand le polypeptide d'interaction a vocation à être introduit dans une cellule donnée, il s'avère particulièrement avantageux de choisir comme domaine de stabilisation un fragment d'une protéine présente dans ladite cellule, ou bien une protéine appartenant à l'espèce dont fait partie la cellule. Dans le cadre de la présente invention, il est donc avantageux de choisir le domaine de stabilisation

parmi les fragments de protéines présentes dans les cellules humaines ou bien animales.

Les inventeurs ont notamment montré les propriétés très intéressantes, comme domaine de stabilisation, d'un membre de la famille des ubiquitines, tronqué dans sa partie C-terminale afin de supprimer le motif diglycine ainsi que toutes les séquences qui se trouvent en aval de ce motif.

Une protéine particulièrement préférée dans le cadre de la présente invention est la protéine homologue à l'Ubiquitine, nommée SUMO-1. Un fragment de la protéine SUMO-1 particulièrement adapté à la mise en oeuvre de la présente invention est le fragment illustré à la figure 6 (SEQ ID N 1), où le motif diglycine et toutes les séquences en aval ont également été tronquées. Pour l'utilisation comme domaine de stabilisation dans le cadre de la présente invention, toute séquence présentant au moins 80% d'identité, de préférence au moins 90%, ou au moins 95% d'identité avec la séquence précédemment mentionnée est particulièrement avantageuse.

D'autres protéines ou fragments de protéines sont également adaptées à cette fonction de domaine de stabilisation , notamment les protéines chaperones, telles que les 'Heat shock proteins' (HSP).

Une alternative à l'utilisation d'un domaine de stabilisation consiste à cycliser les partenaires d'interaction, pour obtenir le même effet de stabilisation. Par cyclisation, on entend la fusion peptidique de la partie N-terminale, en amont du domaine heptapeptidique, avec l'extrémité C-terminale du polypeptide d'interaction.

Selon la présente invention, il est envisagé que des séquences d'acides aminés, très courtes, appelées linker ou espaceur , soient présentes ou bien entre le domaine de stabilisation s'il y en a un et le motif heptapeptidique, ou bien entre le motif heptapeptidique et le domaine de transduction. Ces linkers ont pour principal rôle de relier les différents domaines du polypeptides.

Ce rôle est donc par exemple d'isoler les domaines de telle manière qu'il n'y ait pas d'interaction entre les domaines, par exemple simplement en les séparant par un nombre suffisant d'acides aminés n'interagissant ni avec un domaine, ni avec l'autre. Les deux domaines peuvent alors adopter un repliement qui n'est que peu influencé par la présence de l'autre domaine.

Le rôle du linker peut également être d'imposer un positionnement particulier d'un domaine par rapport à l'autre, notamment en formant un coude, ce qui a aussi en général pour conséquence d'isoler un domaine par rapport à l'autre.

Enfin, le domaine peut également comporter des acides aminés qui sont connus pour être des sites de clivage par certaines protéases de préférence intracellulaires.

Cette approche permet, après pénétration cellulaire, de séparer les deux domaines en clivant à l'endroit du linker.

Inversement, un linker peut être choisi tel qu'il soit particulièrement résistant aux protéases, afin d'éviter par exemple le clivage potentiel du domaine de pénétration cellulaire avant l'étape de pénétration.

De préférence, un linker selon l'invention comprend majoritairement des acides aminés peu réactifs et peu encombrants, c'est-à-dire des acides aminés dont la chaîne latérale ne comporte que quelques atomes, c'est notamment le cas des acides aminés glycine et proline. De plus, la proline forme généralement un coude au sein de la chaîne dans laquelle elle est insérée, cette propriété peut être exploitée pour isoler un domaine par rapport à l'autre.

D'une manière préférée, un linker selon la présente invention comprend 5 acides aminés ou moins de 5 acides aminés.

Un linker selon l'invention permet d'introduire un degré de flexibilité entre les différentes parties fonctionnelles de la protéine.

Un linker particulièrement adapté à la mise en oeuvre de la présente invention comprend moins de 5 acides aminés et au moins environ 20% d'acides aminés Glycine ou Proline, de préférence au moins 50%. Selon une situation particulière, un linker selon la présente invention comporte uniquement des acides aminés choisis parmi la glycine et la proline. Par exemple, un linker selon l'invention peut avoir la séquence GGGG ou PG, où G signifie Glycine, P signifie Proline, et les séquences sont écrites selon la convention classique de l'extrémité N-terminale vers l'extrémité C-terminale.

Un polypeptide d'interaction selon l'invention comprend un domaine de pénétration cellulaire de 5 à 35 acides aminés qui se trouve dans sa partie C-terminale ; ce domaine de pénétration cellulaire permet la pénétration du polypeptide à l'intérieur de la cellule.

Différents domaines identifiés dans la littérature peuvent être utilisés à cette fin.

Parmi les domaines particulièrement préférés dans le cadre de la présente invention, se trouve le domaine de pénétration de la protéine HIV-Tat, ou bien des domaines d'autres souches virales ayant la même activité.

Le domaine de pénétration cellulaire de la protéine HIV-Tat se caractérise par la séquence suivante : N RKKRRQRRRc (SEQ ID N 9).

où le code à une lettre pour représenter les acides aminés a été utilisé. Il est également envisagé, dans le cadre de la présente invention, d'utiliser un domaine de pénétration cellulaire correspondant essentiellement à la séquence précédente où quelques acides aminés ont été mutés, afin notamment d'améliorer les propriétés de pénétration ou bien d'augmenter la résistance aux protéases.

Le domaine de pénétration intracellulaire du polypeptide d'interaction selon l'invention peut également comprendre un motif polyarginine de séquence RRRRRRR, RRRRRRRR ou RRRRRRRRR (7 à 9 acides aminés arginine) dont le rôle de pénétration a été montré notamment pour les lymphocytes (Wender et al, 2000).

Un autre domaine de transduction également envisagé dans la présente invention a une séquence correspondant partiellement à celle du domaine de transduction de Tat mais incorporant certaines modifications : RRKARRQRRR.

Une construction particulière pour un polypeptide d'interaction selon l'invention consiste à placer l'acide aminé X7 du motif heptapeptidique entre 10 et 30 acides aminés de l'extrémité C-terminale du polypeptide, de préférence entre 12 et 28, de préférence entre 15 et 25 acides aminés de l'extrémité C-terminale.

Pour le choix du domaine de stabilisation d'un polypeptide d'interaction selon la présente invention, un domaine particulièrement adapté est la protéine SUMO-1. De préférence, on utilise comme domaine de stabilisation le fragment de la protéine SUMO-1 dont la séquence est illustrée dans la figure 6 (SEQ ID N 1), ou tout domaine partageant au moins 80% d'identité, de préférence 90% d'identité avec cette séquence.

Un autre domaine qui peut être utilisé dans le cadre de l'invention est le fragment de l'ubiquitine défini par la séquence illustrée dans la figure 6.

D'autres domaines ou éléments font avantageusement partie d'un polypeptide d'interaction ou sont greffés sur un tel polypeptide. En particulier, il est particulièrement avantageux d'incorporer dans la séquence du polypeptide une séquence d'adressage, ou bien une séquence facilitant sa détection et le suivi, par exemple de sa localisation ou de sa dégradation. Comme séquence facilitant la détection, on peut envisager des séquences ayant une propriété enzymatique facilement détectable, ou bien une réactivité avec un anticorps déterminé, ou bien des propriétés fluorescentes. Il est également envisageable de greffer ou d'incorporer dans la séquence d'un polypeptide une séquence facilitant sa purification, par exemple en prévoyant une queue poly-histidine ou His-Tag.

Parmi les séquences particulièrement préférées pour le motif heptapeptidique, on peut citer les séquence possédant au moins l'une des caractéristiques suivantes : X2 est un acide aminé Tryptophane, X4 est un acide aminé Cystéine et X6 est un acide aminé Leucine. De préférence, la séquence du motif heptapeptidique comporte au moins deux des caractéristiques énoncées. Un motif heptapeptidique comporte de préférence les 3 caractéristiques énumérées.

Des séquences de motifs heptapeptidiques tout particulièrement préférées dans le cadre de la présente invention comme interagissant avec la protéine Rev de HIV-1 sont les séquences suivantes : N FWFCGLK c (SEQ ID N 2), N NWLCCLN c (SEQ ID N 3), N KLGCFWF c (SEQ ID N 10), N NLCCLWNC (SEQ ID N 11), N FWFCGLA (SEQ ID N 27), N AWLCCLNC (SEQ ID N 25) et N NWLCCLA c (SEQ ID N 26).

Sont également préférées les séquences de 7 acides aminés obtenues à partir des séquences précédentes par substitution d'un seul acide aminé.

Parmi les séquences particulièrement préférées pour un polypeptide d'interaction selon l'invention, on peut citer les séquences suivantes : FWFCGLKPGRKKRRQRRRG (SEQ ID N 4) NWLCCLNPGRKKRRQRRRG (SEQ ID N 5).

Un polypeptide de l'invention possède donc la capacité de pénétrer à l'intérieur d'une cellule sans intervention extérieure quand il est mis au contact de la cellule, il possède également la capacité à interagir avec une protéine ou un domaine protéique qui peut être intracellulaire ou extracellulaire.

De plus, la structure même d'un polypeptide de l'invention lui assure une grande flexibilité, notamment au niveau de la partie variable qui est le motif heptapeptidique. En effet, ce motif est placé à moins de 35 acides aminés de la partie C-terminale du polypeptide, de préférence moins de 25 acides aminés. Cette position privilégiée, dans une partie du polypeptide subissant moins de contraintes conformationnelles que dans la partie plus centrale du polypeptide, assure à l'heptapeptide un plus grande liberté de repliement. Cette liberté accrûe se traduit vraisemblablement par une capacité accrûe à s'adapter à sa cible. En effet, lorsque les contraintes sont faibles à chaque extrémité de l'heptapeptide, il peut adopter un nombre de conformations plus important car la barrière énergétique pour passer d'une conformation à une autre est plus faible. Cette souplesse engendre, pour un même heptapeptide, différentes conformations possibles, et donc une probabilité d'interaction plus importante avec la cible.

Selon un autre aspect, la présente invention concerne plus particulièrement des peptides capables d'interagir avec la protéine Rev de HIV-1 pour en inhiber la réplication, caractérisés en ce qu'ils consistent en ou comprennent la séquence heptapeptidique N X1WX3CX5LX7 C, où X1, X3, X5, X7, sont des acides aminés choisis indépendamment parmi les acides aminés naturels ou modifiés.

De tels peptides comprennent ou consistent en une séquence capable d'interagir avec la protéine Rev dans un test double-hybride en levure ; de plus, ces peptides sont également capables d'inhiber in vivo la réplication virale. Des séquences heptapeptidiques préférées sont les séquences suivantes : N FWFCGLK (SEQ ID N 2), N NWLCCLN c (SEQ ID N 3), N FWFCGLA c (SEQ ID N 27), N AWLCCLN (SEQ ID N 25) et N NWLCCLA c (SEQ ID N 26).

Afin de tester la capacité d'un peptide à interagir avec la protéine Rev dans un test double-hybride en levure, le test suivant, mis en oeuvre dans la partie expérimentale, peut être réalisé : Appât : plasmide pLexRev (voir exemple 1 ) Proie : plasmide contenant le domaine d'activation de GAL4 en fusion avec la séquence codant pour le peptide à tester, par exemple un plasmide dérivé de pGAD424.

Levure : souche HF7c de S. cerevisiae.

L'exemple 1 fournit plus amples renseignements sur des conditions opératoires envisageables pour la mise en oeuvre de ce test.

Afin de tester la capacité du peptide à inhiber in vivo la réplication virale, le test suivant, mis en oeuvre dans la partie expérimentale, peut être réalisé : Cellules : cellules humaines, mononucléaires de sang périphérique Virus : souche lymphotropique de référence HIV-1-LAI (Barré-Sinoussi et al ; 1983).

Protocole : les cellules sont pré-traitées pendant 30 minutes avec 5 concentrations du peptide à tester puis infectées avec la souche HIV-1-LAI. Le peptide est maintenu dans le milieu pendant tout le temps de la culture ; le surnageant cellulaire est collecté 7 jours après l'infection et l'activité de transcription inverse est mesurée.

La partie expérimentale fournit plus amples renseignements sur les conditions opératoires, les concentrations et les tampons qui peuvent être utilisés pour mettre en oeuvre ce test.

Les polypeptides comprenant les séquences N FWFCGLKPGRKKRRQRRRG (SEQ ID N 4) et N NWLCCLNPGRKKRRQRRRGC (SEQ ID N 5) sont particulièrement préférés en vue d'une utilisation comme inhibiteurs ou modulateurs de la protéine Rev de HIV.

De tels peptides sont capables d'interagir ou bien globalement avec la protéine Rev, ou bien éventuellement avec l'un de ses domaines. En effet, les protéines sont généralement caractérisées par la présence de différents domaines possédant des fonctions parfois différentes au sein de leur séquence. Selon la structure tridimensionnelle et le repliement adopté par la protéine, ces domaines ont parfois la particularité d'être accessibles à des partenaires indépendamment les uns des autres.

Cette même situation se retrouve pour les différents épitopes d'une même protéine permettant de générer des anticorps monoclonaux distincts, les différents épitopes étant des domaines de la protéine distincts les uns des autres, et étant chacun accessibles.

Au sein de la protéine Rev a notamment été identifié un signal appelé NES pour Nuclear Export Signal, qui assure l'adressage de la protéine à l'extérieur du noyau.

Ce signal répond à la définition de domaine telle qu'elle est donnée dans la présente demande. De ce fait, un peptide interagit soit avec la protéine Rev globalement, soit spécifiquement avec le domaine NES de la protéine Rev. Le domaine NES est défini par la séquence :N LQLPPLERLTLD c (SEQ ID N 8) où le code à une lettre pour représenter les acides aminés est utilisé.

Selon encore un autre aspect, la présente invention concerne également une famille de polypeptides d'interaction selon l'invention, les membres de la famille étant des polypeptides d'interaction ne se différenciant les uns des autres que par la séquence du motif heptapeptidique.

Différents membres d'une même famille sont donc identiques pour leur domaine de pénétration, leur domaine de stabilisation s'ils en possèdent un, leurs éventuels linkers. Une famille est définie par la présence d'au moins deux membres dont seule la séquence du motif heptapeptidique diffère. Cependant une famille comprend généralement plus de deux membres, en général au moins 10 et de préférence au moins 50. Des familles particulièrement préférées dans le cadre de la présente

invention sont des familles comprenant au moins 100 membres distincts, de préférence 1000.

Dans le cas où le motif heptapeptidique est constitué de 7 acides aminés choisis parmi les 20 naturels, une famille telle que définie selon l'invention comprend jusqu'à 207 membres distincts.

L'avantage d'une telle famille est que seul le motif heptapeptidique est responsable des propriétés différentes possédées par chacun des membres de la famille, étant donné que c'est la seule variable entre les membres.

De préférence, une famille de polypeptides d'interaction selon la présente invention comprend la séquence NX1X2X3X4X5X6X7PGKKRRQRRRGC (SEQ ID N 6), où la séquence N X1X2X3X4X5X6X7 correspond à la séquence du motif heptapeptidique tel que défini dans l'invention et la séquence PGKKRRQRRRG (SEQ ID N 12) correspond la séquence d'un linker et d'un domaine de pénétration cellulaire, où le code à une lettre pour représenter les acides aminés est utilisé. Le domaine heptapeptidique est la seule région variable d'un polypeptide membre de la famille par rapport à un autre polypeptide également membre de la famille.

D'une manière encore préférée, une famille de polypeptides d'interaction comprend des membres dont la séquence comprend ou consiste en la séquence suivante : MSDQEAKPSTEDLGDKKEGEYIKLKVIGQDSSEIHFKVKMTTHLKKLKESYCQRQG VPMNSLRFLFEGQRIADNHTPKELGMEEEDVIEVYQEQTARPPNPKKEIELGGGGS X1X2X3X4X5X6X7PGKKRRQRRRG (SEQ ID N 7). Le motif heptapeptidique, correspondant à la séquence N X1X2X3X4X5X6X7C est la seule région différente d'un membre de la famille à un autre.

Les polypeptides d'interaction de cette famille sont dénommés SUMO-1 Heptapeptide Protein Transduction Domain ou SHP.

La séquence PGKKRRQRRRG (SEQ ID N 12) comprend le domaine de pénétration cellulaire requis pour les polypeptides de l'invention. Une séquence présentant moins de 3 modifications par rapport à cette séquence est également une séquence préférée dans la cadre de l'invention. Par modification, on entend ajout ou suppression d'un acide aminé, ou bien substitution d'un acide aminé de cette séquence par un autre acide aminé.

La séquence :
MSDQEAKPSTEDLGDKKEGEYIKLKVIGQDSSEIHFKVKMTTHLKKLKESYCQRQG VPMNSLRFLFEGQRIADNHTPKELGMEEEDVIEVYQEQTARPPNPKKEIELGGGGS (SEQ ID N 16) comprend un domaine de stabilisation pour le polypeptide

d'interaction. Des séquences partageant au moins 80%, de préférence au moins 90% d'identité avec cette séquence sont également des séquences qui peuvent être utilisées afin de constituer le domaine de stabilisation d'une famille de polypeptides selon l'invention.

L'invention concerne également toutes les séquences d'ADN codant pour un polypeptide de l'invention, unique ou faisant partie d'une famille, ou pour tout autre fragment ou domaine mentionné dans la présente invention. Il peut s'agir d'un ADN double brin ou bien d'un ADN simple brin. On considère dans le cadre de la présente invention qu'un ADN simple brin code pour un polypeptide lorsque cette séquence ou bien la séquence complémentaire contient en effet la partie codante. La séquence d'ADN est sous forme linéaire ou sous forme circulaire, par exemple dans un plasmide.

Les différents ARN qui pourraient être issus de la transcription d'une séquence d'ADN codant pour un polypeptide de l'invention sont également compris dans l'invention.

Un polypeptide d'interaction tel que défini dans la présente invention a la capacité potentielle d'interagir avec un partenaire protéique, déterminé ou non, afin de modifier le comportement de la cellule. A l'intérieur de la cellule, la présence d'un tel polypeptide peut donc permettre de bloquer certaines fonctions cellulaires, notamment en jouant le rôle d'inhibiteurs compétitifs. Cette action a des effets thérapeutiques dans de nombreuses affections si la modification cellulaire consiste à atténuer ou empêcher une fonction cellulaire néfaste à la cellule. Il est également envisagé que la présence du polypeptide à l'extérieur de la cellule modifie la propriété de la cellule en interagissant avec un messager ou bien avec une protéine à la surface de la cellule.

De ce fait, les polypeptides de l'invention tels que définis ont une application privilégiée dans le domaine de la thérapie où ils peuvent être utilisés comme principe actif dans des médicaments. Ils sont alors bien souvent accompagnés de différents excipients pharmaceutiquement acceptables.

Etant donné qu'ils ont été spécialement conçus pour posséder un moyen de pénétrer les cellules, à savoir leur domaine de pénétration, ils peuvent être administrés sous des formes très variées, sans aucune limitation. Ils peuvent notamment être ingérés sous forme de tablette, capsule, sirop, ou bien être injectés

musculairement ou par intraveineuse, par pénétration d'une lotion, d'un gel ou d'une pommade. Toute autre forme d'administration peut également être envisagée. Ils peuvent également être conditionnés sous forme de liposomes puis administrés sous cette forme.

Il n'est pas exclu que le médicament consiste également en la molécule d'ADN codant pour un polypeptide d'interaction de l'invention. C'est notamment le cas quand il est fait recours à la thérapie génique.

L'invention concerne également des cellules contenant un polypeptide de l'invention, unique ou faisant partie d'une famille, ou tout autre fragment ou domaine mentionné dans la présente invention, et également des cellules contenant des séquences d'ADN codant pour de tels polypeptides.

Des cellules telles que présentées peuvent être obtenues par transformation, thérapie génique, ou par mise en contact de la cellule et d'un polypeptide d'interaction de l'invention. De telles cellules ont des applications particulièrement intéressantes en thérapie. Des cellules, notamment bactériennes, transformées avec un ADN codant pour un polypeptide d'interaction selon l'invention, sont particulièrement avantageuses pour produire ledit polypeptide. Le polypeptide produit en bactérie est ensuite éventuellement purifié et peut être utilisé comme principe actif dans un médicament.

Selon un autre aspect, la présente invention concerne également des procédés de criblage faisant intervenir des polypeptides d'interaction tels que décrits. En effet, ces polypeptides sont spécialement conçus pour agir contre des cibles protéiques contre lesquelles ils ont été testés.

Un premier procédé de criblage envisagé par l'invention vise à identifier des polypeptides qui soient capables de modifier le phénotype d'une cellule.

Le procédé comprend une étape de mise en présence d'un polypeptide de l'invention avec la cellule dont on cherche à modifier le phénotype. Cette étape est suivie de la détection du changement de phénotype de la cellule. Ces étapes sont ensuite éventuellement complétées par une étape de détermination de la séquence du motif heptapeptidique compris dans la séquence du polypeptide qui a été testé.

Le terme phénotype doit s'entendre au sens large comme englobant toutes les caractéristiques morphologiques ou fonctionnelles de la cellule. Une modification du phénotype peut notamment se caractériser par un changement de forme de la cellule, une modification de la composition de la membrane, une sécrétion d'une

protéine donnée, un changement de couleur ou un changement de réactivité dans des conditions données.

Le procédé vise à identifier des polypeptides qui soient capables de modifier, d'une manière générale, le phénotype d'une cellule, il peut s'agir d'une modification attendue ou recherchée, il peut également s'agir d'une modification surprenante ou qui n'était pas recherchée.

En effet, selon une utilisation du procédé, il peut être utilisé afin d'identifier des polypeptides capables d'interagir avec une protéine donnée. Dans une telle situation, l'interaction du polypeptide avec sa cible conduira à une modification du phénotype qui était attendue, par exemple la mort de la cellule, ou bien une résistance ou sensibilité à un antibiotique, ou à un virus, ou à la chaleur.

Eventuellement, l'interaction peut être mise en évidence par l'intermédiaire d'un rapporteur, notamment un gène rapporteur. Cet élément rapporteur est responsable de la modification du phénotype, cette modification étant attendue.

Le procédé peut également être utilisé pour identifier un polypeptide capable d'interagir avec un groupement de protéines donné ou par exemple avec une voie métabolique ou une cascade immunitaire donnée. Dans une telle situation, la modification du phénotype attendu est la modification de la fonction du groupement ou bien la modification de la voie ou de la cascade immunitaire. L'effet d'une telle modification n'est pas toujours déterminé à l'avance.

Il est également possible d'utiliser le procédé de l'invention pour cribler des polypeptides à la recherche par exemple d'une modification bénéfique à la cellule, sans que la nature exacte de la modification soit fixée au commencement du procédé de crible.

La première étape du procédé se caractérise par la mise en présence d'un polypeptide de l'invention avec la cellule. On entend par mise en présence aussi bien l'action consistant à amener le polypeptide à proximité de la cellule, la mise en contact ainsi que l'action consistant à introduire le polypeptide dans la cellule. Par l'expression mise en présence , il est également inclus le cas où l'ADN codant pour le polypeptide est introduit dans la cellule et que cet ADN est ensuite traduit pour donner naissance au polypeptide. Dans cette situation, c'est la cellule ellemême qui contribue à générer le polypeptide.

La première étape du procédé est donc par exemple mise en oeuvre par l'addition extracellulaire du polypeptide dans un milieu contenant la cellule dont le phénotype doit être modifié, par exemple l'addition du polypeptide dans un fluide contenant la

cellule. Comme le polypeptide selon l'invention possède un domaine de pénétration, il peut le cas échéant traverser la membrane de la cellule.

Le procédé décrit est soit un procédé de criblage extracellulaire soit un procédé de criblage intracellulaire. Le criblage est considéré comme intracellulaire si l'interaction entre le polypeptide et sa cible a lieu dans la cellule, indépendamment du fait que le polypeptide ait été ajouté de manière extracellulaire ou introduit de manière intracellulaire. Le criblage est considéré comme extracellulaire si au contraire l'interaction entre le polypeptide et sa cible a lieu à l'extérieur de la cellule, par exemple à sa surface.

Le procédé de criblage de l'invention peut être mis en #uvre in vivo, ou bien in vitro. Quand il est mis en oeuvre in vivo, la mise en présence du polypeptide et de la cellule peut consister en la mise en présence du polypeptide avec un fluide comprenant la cellule ou bien un tissu contenant une telle cellule.

Une application particulièrement préférée du procédé de l'invention consiste à faire usage d'un crible deux-hybrides. Cette application est recommandée quand la protéine cible, dont on cherche un partenaire sous forme de polypeptide d'interaction, est connue et quand on dispose de sa séquence. Il est alors possible de détecter une interaction entre la protéine cible et un polypeptide d'interaction selon l'invention. Une telle interaction se manifeste en général par l'induction d'un gène rapporteur dont l'expression modifie le phénotype de manière aisément détectable, par exemple par un changement de couleur de la cellule.

Une application particulièrement préférée du procédé est dans le domaine du criblage de nouveaux partenaires d'interaction contre des protéines virales, dont la protéine Rev de HIV. Dans cette application, le gène codant pour la protéine Rev est par exemple cloné dans un système deux-hybrides pour servir d'appât. Un tel crible permet d'identifier des polypeptides capables de rendre une cellule résistante à une infection par HIV, en empêchant ou limitant la réplication virale dans la cellule-hôte.

Une autre application du procédé consiste à faire usage d'un crible triple-hybride.

Dans un tel crible, deux partenaires peptidiques, dont l'interaction est connue, sont clonés dans un système deux-hybrides et un troisième plasmide comprend le partenaire d'interaction selon l'invention. Ce dernier est testé pour sa capacité à modifier l'interaction entre les deux premiers partenaires. Grâce au système rapporteur du crible deux-hybrides, il est possible d'observer et de mesurer l'action du partenaire d'interaction sur l'interaction entre les deux partenaires peptidiques.

Un second procédé couvert par la présente invention est un procédé de criblage de molécules pour l'identification de l'une d'elles qui interagisse avec une cible intracellulaire déterminée.

Un tel procédé comprend une première étape de génération de polypeptides de l'invention. Les polypeptides ainsi générés sont mis en présence de la cible intracellulaire, une détection des interactions entre polypeptide et cible est opérée, éventuellement suivie de la détermination de la séquence du motif heptapeptidique du polypeptide.

Le polypeptide peut être mis en présence de la cible directement par introduction du polypeptide dans la cellule, ou bien indirectement par mise en présence du polypeptide et de la cellule, le polypeptide pénétrant ensuite dans la cellule.

L'étape de détection peut être réalisée par toute technique connue de l'homme du métier. Une détection envisageable est notamment l'observation d'un changement phénotypique ; le crible peut être adapté pour que la modification du phénotype soit le résultat de l'expression d'un gène rapporteur. La détection peut également impliquer le dosage d'une entité, par exemple le dosage d'une protéine, ou d'un métabolite.

Les différentes caractéristiques ou utilisations préférées mentionnées dans le cadre du premier procédé selon l'invention sont également applicables pour ce second procédé. Notamment, le procédé peut être mis en oeuvre in vivo ou in vitro. Il est préférentiellement mis en #uvre en faisant usage d'un système deux-hybrides.

Enfin, une application préférée d'un tel procédé de criblage vise à identifier des molécules d'interaction capables d'interagir avec les protéines virales essentielles à la réplication des virus, et tout particulièrement la protéine Rev de HIV.

Un troisième procédé couvert par l'invention est un procédé pour moduler les propriétés d'une molécule-cible intracellulaire. Un tel procédé comprend une étape de mise en présence d'une cellule qui contient la molécule-cible et d'un polypeptide d'interaction de l'invention.

La molécule-cible est de préférence une protéine ou un fragment de protéine comprenant au moins 5 acides aminés, de préférence au moins 10. Le polypeptide de l'invention est spécifiquement conçu avec un motif heptapeptidique qui soit capable d'interagir avec la molécule-cible. Un tel motif heptapeptidique est avantageusement déterminé par la mise en #uvre du premier procédé de criblage de l'invention.

Par moduler les propriétés il faut entendre toutes les modifications de la cible qui sont susceptibles d'affecter sa fonction ou ses propriétés, notamment les modifications qui vont modifier sa capacité d'interaction avec ses partenaires ; mais également les modifications qui vont entraîner une stabilité plus grande ou plus faible dans certaines conditions, les modifications de cinétique enzymatique, de spécificité ou de sélectivité.

Comme déjà mentionné, les différentes caractéristiques ou utilisations préférées mentionnées dans le cadre du premier procédé selon l'invention sont également applicables pour ce troisième procédé. Notamment, le procédé peut être mis en #uvre in vivo ou in vitro. Il est préférentiellement mis en oeuvre en faisant usage d'un système deux-hybrides. Enfin, une application préférée d'un tel procédé vise à modifier les propriétés de protéines virales essentielles à la réplication des virus, et tout particulièrement la protéine Rev de HIV.

Selon un autre aspect, l'invention concerne différentes utilisations. En particulier, l'invention comprend l'utilisation d'une séquence d'ADN codant pour un polypeptide de l'invention afin que le polypeptide ensuite traduit serve de proie dans un crible phénotypique ; de préférence la séquence d'ADN est clonée dans un système deuxhybrides.

En effet, un système deux-hybrides se caractérise par la recherche d'une interaction entre une molécule (protéine) donnée, généralement dénommée appât , et un partenaire potentiel à tester, généralement dénommé proie . Un système deuxhybrides comprend généralement l'introduction dans une cellule des séquences codant pour l'appât, la proie et un gène rapporteur, liées d'une manière spécifique à d'autres éléments. C'est dans ce cadre, en tant que proie, qu'il peut être fait usage de la séquence d'ADN codant pour un polypeptide de l'invention.

Une situation particulièrement préférée dans le cadre de l'invention consiste à utiliser la séquence d'ADN codant pour un polypeptide de l'invention comme proie dans un système deux-hybrides. Dans cette situation, un appât potentiel est la protéine Rev du virus de l'immunodéficience humaine (HIV). En effet, cette protéine virale est une cible particulièrement intéressante pour l'identification de nouveaux inhibiteurs. La présente invention envisage donc tout particulièrement l'utilisation de la séquence d'ADN codant pour un polypeptide de l'invention dans un système deux-hybrides avec la protéine Rev de HIV.

Comme indiqué précédemment, l'interaction recherchée entre le polypeptide de l'invention et une protéine donnée, par exemple HIV-Rev, peut intervenir de manière globale, ou bien avec un domaine particulier de la protéine. Dans le cadre de la présente invention, il est donc envisagé de ne cloner, pour servir d'appât, qu'une séquence codant pour un domaine de la protéine cible. Cette stratégie permet d'identifier des polypeptides d'interaction spécifiques à ce domaine.

En effet, il a été découvert par les inventeurs que les potentialités d'interaction entre deux polypeptides donnés sont augmentées lorsque les deux polypeptides ont des tailles comparables. Le polypeptide d'interaction de l'invention possède une séquence assez courte responsable de l'interaction, il s'agit des 7 acides aminés de l'heptapeptide, avec éventuellement la combinaison de l'interaction générée par le motif de pénétration. De ce fait, des polypeptides d'interaction sont particulièrement recommandés pour leur capacité à interagir avec des polypeptides de taille comparable, d'une manière préférée, avec des domaines de taille comparable.

Des utilisations particulièrement intéressantes de polypeptides d'interaction dans un crible deux-hybrides font donc appel, pour l'appât, à des séquences codant pour des domaines de 5 à 30 acides aminés, de préférence de 6 à 20, de manière encore préférée de 7 à 15 acides aminés. De tels domaines sont par exemple des domaines de fixation, des signaux d'adressage, des domaines catalytiques.

Un autre exemple de domaine particulièrement préféré dans le cadre de ces utilisations, est le NLS (Nuclear Localisation Signal). Un autre domaine également préféré est le NES (Nuclear Export Signal). Un tel domaine NES est notamment celui de la protéine Rev de HIV. D'autres signaux NES sont connus ayant des séquences plus ou moins similaires et des tailles dans le même ordre de grandeur.

Les deux domaines NLS et NES ont des tailles parfaitement compatibles avec les tailles optimales pour l'interaction avec un polypeptide de l'invention.

Une séquence pour un domaine NES est en particulier celle de la protéine Rev de HIV-1, LQLPPLERLTLD (SEQ ID N 8).

Quand la protéine Rev de HIV est la protéine cible dont on cherche un partenaire d'interaction, alors il est particulièrement avantageux de cloner dans un crible deuxhybrides un domaine de la protéine Rev, et de préférence le domaine NES de REV, pour jouer le rôle d'appât.

La présente invention concerne également une méthode pour l'identification de molécules capables de moduler les propriétés d'une molécule-cible intracellulaire.

Cette méthode se caractérise notamment par les différentes étapes suivantes.

Dans un premier temps, il est généré des molécules d'acides nucléiques comprenant des séquences codant pour différents membres d'une famille de polypeptides d'interaction selon l'invention. Ces différents membres ne diffèrent les uns des autres que par la séquence du motif heptapeptidique.

La méthode comprend également le criblage des molécules ainsi générées à l'aide d'un système deux-hybrides en levure. Dans ce criblage, il est fait usage de la molécule-cible, dont on cherche des partenaires d'interaction, comme appât. Les molécules générées jouent quant à elle le rôle de proie.

La méthode comprend de plus une étape de détection d'une interaction. Cette interaction peut se manifester notamment par l'expression d'un gène rapporteur compris dans le système deux-hybrides. Un changement phénotypique de la cellule ou le dosage d'une entité peuvent aussi permettre la détection d'une interaction.

De manière facultative, la méthode comprend également la vérification de cette interaction en cellule humaine. Cette étape est réalisable de différentes façons. Une façon consiste à créer l'équivalent du système deux-hybrides mais adapté aux cellules humaines. Le système est avantageusement mis en oeuvre avec une lignée cellulaire. Il est également envisageable de vérifier l'interaction par coimmunoprécipitation ou en vérifiant les effets engendrés par cette interaction. Selon cette façon, le polypeptide criblé est mis en présence de la cellule contenant la cible intracellulaire. On observe si ce polypeptide induit un effet sur la cellule du fait de son interaction avec la cible.

Une étape ultérieure également envisagée consiste à produire en quantité le polypeptide d'interaction identifié dans le cadre de la présente invention. Une telle production est avantageusement réalisée en bactérie, par exemple sous l'action d'un promoteur inductible capable de sur-exprimer le polypeptide. Le polypeptide peut être produit sous forme soluble ou sous forme de corps d'inclusion. La production en quantité est également envisageable en cellules de mammifères, par exemple en cellules Sf9.

Cette méthode est particulièrement appropriée pour détecter les polypeptides d'interaction capables de modifier la fonction de protéines virales, telles que celles de HIV : Tat, Rev.

Dans un tel cas, la méthode pour l'obtention et la caractérisation de polypeptides d'interaction selon l'invention se fait en plusieurs étapes et peut être réalisée selon la méthodologie suivante, employée par les inventeurs : Criblage d'une banque d'heptapeptides aléatoires en levure contre la protéine ciblée: Une banque d'heptapeptides aléatoires en fusion avec le domaine activateur d'un facteur de transcription, dans ce cas GAL4, à son extrémité N-terminale, et les neuf acides aminés du domaine basique de Tat à son extrémité C-terminale a été construite dans un vecteur d'expression en levure. La séquence codant pour la protéine d'intérêt, virale ou cellulaire est clonée en aval de celle codant pour un domaine de liaison à l'ADN, dans le cas présent LexA, dans un vecteur permettant l'expression de la protéine dans la levure. Le domaine basique de Tat associé au motif heptapeptidique est utilisé comme motif assurant la pénétration intracellulaire.

La conception de la séquence finale de la protéine est telle que les différents domaines soient espacés par des acides aminés glycine ou proline qui assurent leur séparation. La souche de levure L40 qui possède les gènes rapporteurs His et LacZ sous dépendance de motifs de liaison LexA est transformée par le vecteur exprimant la fusion LexA protéine cible, ce qui a été fait avec les protéines LexATat, LexA-Rev et LexA-NES Rev, puis par la banque de vecteurs possédant les heptapetides aléatoires. Les protéines Tat et Rev de HIV-1 sont des protéines régulatrices essentielles à la réplication virale. Une première sélection des clones est faite sur milieu sans histidine. Les clones positifs sont ensuite soumis à un test (3-galactosidase sur filtre.

Les colonies nettement positives sont récupérées et le vecteur contenant le motif heptapeptidique isolé par transformation dans E. coli. Le séquençage du vecteur permet l'identification du motif heptapeptidique.

Vérification de l'existence de l'interaction dans le contexte de cellules de mammifères: Pour s'assurer que les motifs sélectionnés dans l'environnement levure fonctionne aussi dans le contexte biochimique de cellules humaines, un essai similaire au précédent est mené dans des cellules HeLa. Le motif heptapeptidique est re-cloné du vecteur de levure dans un plasmide permettant l'expression en cellules humaines en aval de séquences codant pour l'épitope Flag, un signal de localisation nucléaire et le domaine activateur de la protéine Vp16.

Cette construction est co-transfectée dans des cellules HeLa avec un vecteur exprimant la fusion LexA-protéine cible et un vecteur possédant le gène rapporteur SEAP (Secreted Alkaline Phosphatase) sous contrôle de séquences de fixation de LexA. La mesure de l'activité SEAP permet d'évaluer la capacité du motif heptapeptidique à interagir avec la protéine cible dans le noyau de cellules humaines. Le vecteur exprimant le motif heptapeptidique permet aussi d'évaluer par des expériences d'immunoblot, faites avec des extraits de cellules transfectées par cette construction, le niveau d'expression de la protéine fusion avec ce motif, et donc de vérifier sa stabilité dans les cellules. Ces expériences ont permis de confirmer la capacité de plusieurs motifs heptapeptidiques à interagir avec Tat et Rev.

Association de la séquence heptapeptide/acides aminés basiques de Tat avec une protéine de stabilisation: Les peptides linéaires courts présentent parfois une mauvaise stabilité dans les milieux extra- et intra-cellulaires. Pour contourner ce problème les inventeurs ont décidé d'associer la séquence heptapeptide/ acides aminés basiques de Tat avec une protéine de petite taille, stable et abondante dans les cellules humaines. Leur choix s'est porté dans un premier temps sur des membres de la famille de l'Ubiquitine. Les constructions ont été faites avec l'Ubiquitine (Ub) elle même et une protéine homologue, SUMO-1. Les séquences codant pour ces protéines ont été introduites dans un vecteur d'expression pour cellules de mammifères. La séquence heptapeptide/acides aminés basiques de Tat est introduite en aval de SUMO-1 ou de l'Ubiquitine au niveau du motif diglycine qui est perdu. Ce motif diglycine est normalement lié aux chaînes latérales des lysines des protéines modifiées par ces polypeptides. La bonne expression des protéines fusion SUMO-1-heptapetides spécifiques de Tat (dénommées SHPT) et Rev (dénommées SHPR) a pu être vérifiée. Pour les constructions Ub ces essais n'ont pas encore été faits en l'absence d'un bon anticorps dirigé contre l'Ubiquitine.

A l'aide de ces constructions les inventeurs ont mené des essais fonctionnels pour évaluer si les SHPRs et SHPTs dirigés respectivement contre Rev et Tat étaient capables d'empêcher la fonction de ces protéines. Pour Tat, les vecteurs d'expression SHPTs ont été co-transfectés avec un vecteur exprimant Tat et une construction indicatrice possédant le promoteur HIV-1 devant la séquence CAT.

Deux SHPRs anti-Rev sur six montrent une inhibition complète de l'effet de Rev sur une construction possédant la séquence CAT en association avec le Rev Response

Element (RRE) dans un intron. La séquence ARN RRE permet la fixation de la protéine Rev. Ce type de construction indicatrice permet d'évaluer l'effet de Rev, qui en provoquant le transport vers le cytoplasme de l'ARN non épissé permet l'expression de l'enzyme CAT.

Production en quantité des peptides d'interaction SHPTs et SHPRs: Suite à ces résultats, les inventeurs ont développé un système de production des peptides d'interaction en grande quantité pour pouvoir évaluer leur capacité à pénétrer dans les cellules et à inhiber la fonction de leur protéine cible à partir du milieu extracellulaire. La séquence SUMO-1/heptapeptide anti-Rev/domaine basique de Tat a été clonée dans un vecteur permettant la production en bactéries. Un protocole de purification sur colonne d'héparine, puis par gel filtration, a été défini. Les premiers résultats montrent que les SHPRs sont bien produits et peuvent être purifiés par ce procédé.

La réalisation d'un lot important de ces deux molécules permet d'évaluer l'éventuel intérêt pharmacologique de ces protéines.

L'ensemble du processus décrit ici a permis d'établir la faisabilité de la méthode d'identification de ligands antagonistes de la fonction de protéines-cibles. Les peptides d'interaction obtenus peuvent être utilisés directement comme molécules thérapeutiques, ou servir de modèles pour développer de petites molécules organiques mimant leur structure.

Le schéma illustré à la figure 1 récapitule les différentes étapes et les constructions employées. Les étapes et les constructions sont données à titre d'exemple de mise en oeuvre et peuvent sans difficulté majeure être adaptées ou remplacées par des équivalents par l'homme du métier.

Légende des figures : Figure 1 : Elle illustre les différentes étapes et les constructions employées pour la génération de polypeptides d'interaction capables d'interagir avec une protéine cible donnée. Les doubles flèches symbolisent une interaction entre deux molécules.

Les différents types de cellules sont indiqués pour chaque étape. L'étape 3 (essais fonctionnels) a été réalisée avec la protéine virale REV pour cible.

Figure 2 : la figure 2 illustre les cartes des différents plasmides utilisés pour l'étape de deux-hybrides en levure.

Figure 2A : plasmide pGAD-CR qui dérive de pGAD424.

plasmide pGAD-CR-P qui dérive de pGAD-CR et inclut la séquence codant pour le motif heptapeptidique insérée entre les sites de restriction BamHl et Xmal.

Figure 2B : plasmide pLex-Tat qui contient l'ADNc de Tat inséré entre les sites de restriction EcoRI et BamHl du plasmide pLex9. plasmide pLexNES qui contient la séquence codant pour le motif NES de Rev insérée entre les sites de restriction BamHl et Xhol du plasmide pLex9.

Figure 2C : plasmide pLexRev qui contient l'ADNc de Rev inséré entre les sites de restriction BamHl et Sali du plasmide pLex9.

Figure 3 : la figure 3 illustre les cartes des différents plasmides utilisés pour l'étape de deux-hybrides en cellules de mammifères.

Figure 3A : plamside pSG-FNV-P. Le motif X7 PTD a été amplifié à partir de pGAD-CR-P, digéré par les enzymes de restriction Sali et BgIII puis inséré entre les sites de restriction Xhol et Bglll du plasmide pSG-FNV.

Plasmide pSG5LexA-Tat, dérive de pSG5LexA et inclut l'ADNc de Tat.

Figure 3B : Plasmide pSG5LexA-Rev, dérive de pSG5LexA et inclut l'ADNc de Rev.

Figure 4 : la figure 4 illustre les cartes des vecteurs d'expression SUMO-1-P pour les tests fonctionnels. pTL1-SUMO-1-CP : la séquence codante de SUMO-1 incluant les sites de restriction Xhol et Bglll a été insérée dans pTL1. pTL1-SUMO-1-P : la séquence du motif X7 PTD a été insérée entre les sites de restriction Xhol et Bglll de pTL1-SUMO-1-CP.

Figure 5 : la figure 5 illustre la carte du plasmide pFLAG-SUMO-1-P utilisé comme vecteurs d'expression en bactérie. Ce plasmide a été construit par insertion de la séquence codant pour le motif de SUMO-1-P entre les sites de restriction Hindlll et Bglll du plasmide pFLAG- MAC.

Figure 6 : la figure 6 illustre les séquences sauvages de 'SUMO-1' (numérotée 1) et de l'ubiquitine (numérotée 3) ainsi que les séquences des peptides d'interaction selon l'invention comprenant comme domaine de stabilisation un fragment de SUMO-1 (peptides d'interaction SUMO numérotée 2) ou d'ubiquitine (peptides d'interaction UB numérotée 4).

Les séquences de SUMO-1 sauvage et d'un peptide d'interaction comprenant un fragment de SUMO-1 ont été alignées. L'étoile symbolise la présence d'un acide aminé identique dans les deux séquences.

Un alignement similaire a été réalisé entre la séquence de l'ubiquitine et du peptide d'interaction comprenant un fragment d'ubiquitine.

Le motif XXXXXXX dans les peptides d'interaction représente la séquence de 7 acides aminés qui peut être définie de manière aléatoire.

Figure 7: la figure 7 est une représentation schématique des protéines servant d'appât (A) et de proies (B, C) dans les tests deux-hybrides en levure (A) ou en cellules mammifères (C).

A. Les appâts consistent en la protéine LexA en fusion avec Tat (acides aminés aa 1 à 86), Rev (aa 1 à 116) ou le domaine d'exportation nucléaire de Rev (aa 70 à 96).

B. Les proies en levure comprennent le domaine d'activation GAL4, une série de 7 acides aminés de séquence aléatoire et le domaine de transduction (Protein Transduction Domain PTD) de Tat.

C. Les proies en cellules mammifères incluent l'épitope FLAG, le NLS (signal de localisation nucléaire) de SV40 (large T), le domaine d'activation Vp16 de
HSV et le module heptapeptide + PTD de Tat.

Figure 8 : la figure 8 illustre l'analyse des modules heptapeptide + PTD de Tat, sélectionnés contre Tat et Rev, par le criblage deux-hybrides mammifère.

A. Des cellules HeLa sont transfectées avec le construit rapporteur pSEAP
LEX5X et pSG5LexA-Tat, seul ou avec pSG-FNV-P-T8,-T9, -T10, ou-T24.

La quantité de SEAP est mesuré et la moyenne des valeurs obtenues pour deux points indépendants de transfection est représentée. La barre d'erreur correspond à la moitié de la différence entre les deux valeurs.

B. Le même test a été réalisé avec pSEAP LEX5X et pSG5LexA-Rev ensemble avec pSG-FNV-P-T24, R15, -R115, -R190, -N142, -N31 et-N7. Les résultats sont présentés comme pour la figure 8A.

Figure 9: la figure 9 illustre l'inhibition des activités de Tat et Rev pour les construits SHPT et SHPR.

A. représentation schématique du construit SHP qui inclut la séquence entière de SUMO-1, dans laquelle le motif diglycine (GG) a été muté en AR, associé à son extrémité C-terminale au module Heptapeptide - PTD de Tat.

B. Des cellules HeLa sont transfectées avec le construit LTR HIV-CAT avec pSG-Tat et ou bien pTL1-SUMO-1, pTL1-SHPT-8, -9,-10, ou-24. La quantité de ces derniers plasmides était soit 0,5pg (barres gris clair), soit
2 g (barres gris foncé). L'activité CAT est mesurée et la moyenne des valeurs obtenues pour deux points indépendants de transfection est représentée. La barre d'erreur correspond à la moitié de la différence entre les deux valeurs.

C. Afin d'évaluer l'activité de Rev, des cellules HeLa sont transfectées avec les plasmides pDM128 et pSG-Rev ensemble avec soit pTL1-SUMO-1, pTL1-
SHPR-15,-115, -190,-R7, -R31 et -R142. Les activités CAT sont représentées comme pour la figure 9B.

Figure 10 : la figure 10 représente l'interaction directe protéine-protéine entre SHPR et Rev. GST-Rev a été produit en bactérie et chargé sur une colonne agaroseglutathion. SHPR-142,-190 ainsi que SHPT-8 sont chargés dans la colonne. Après un lavage, les protéines sont éluées avec du glutathion. Un aliquote des fractions de charge (ligne 1), de lavage (ligne 2) et d'élution (lignes 3,4, 5) a été analysé par immunoblot pour GST-Rev (graphe du dessus) et pour SHP à l'aide d'anticorps contre GST ou contre FLAG, respectivement. Ceci montre qu'il y a co-élution de SHPR-142 et SHPR-190 avec GST-Rev, alros que SHPT-8 ne se lie pas à la protéine sur la colonne.

Figure 11 : la figure 11 illustre l'entrée intracellulaire de SHP.

Des cellules mononucléaires sont préparées à partir de sang périphérique, soit directement (A), soit après activation avec PHA (phytohémagglutinine)et IL-2 (interleukine 2) (B), puis incubées avec 2 M de SHPR-190. Aux temps indiqués après l'addition du peptide d'interaction, un aliquote du surnageant est analysé par immunoblot à l'aide d'anticorps contre FLAG (A, lignes 1 à 4 ; B,lignes 1 à 3). Les cellules sont collectées et lysées dans du tampon RIPA. L'extrait ainsi obtenu est analysé par immunoblot comme décrit pour le surnageant (A, lignes 5 et 6 ; ligne 4). Dans la partie A, les temps d'exposition sont différents entre les lignes 5 et 6 (30s) et les lignes 1 à 4 (5s).

Ces analyses montrent que la protéine est stable dans le surnageant et aussi qu'elle est présente à l'intérieur des cellules.

Dans la partie C, des cellules Jurkat ont été incubées avec 2 M de SHPT-8, SHPR- 15, SHPR-142 ou SHPR-190 pendant une heure et 24h plus tard les cellules ont été collectées et analysées par immunofluorescence à l'aide d'un anticorps contre

FLAG. Des images de transmission de lumière et fluorescence pour des cellules représentatives sont montrées. Les cellules présentent une fluorescence diffuse qui n'est pas observée pour les contrôles.

Figure 12 : la figure 12 représente l'inhibition de la réplication de HIV-1 dans les lymphocytes et les macrophages.

A. des cellules mononucléaires sont préparées à partir de sang périphérique et sont activées. Les cellules sont traitées par différentes quantités d'AZT, d'Indinavir, de SHPR-15, -142, -190 ou SHPT-8 et infectées avec HIV-1-LAI.

La réplication virale est mesurée par dosage de l'activité de transcription inverse dans les surnageants et les pourcentages d'inhibition sont représentés en fonction de la quantité du composé.

B. Des macrophages sont préparés à partir de monocytes, traités avec différentes concentrations des drogues et SHPs et infectés par HIV-1/Ba-L.

La réplication virale est mesurée par dosage de l'activité de transcription inverse. Les pourcentages d'inhibition à 7 jours post-infection sont représentés comme dans la figure 12A.

EXEMPLES Exemple 1 : Description des constructions et des conditions opératoires utilisées pour identifier des peptides interagissant avec les protéines Tat et Rev de HIV-1.

HIV-1 exprime plusieurs protéines de régulation dont l'action sur les facteurs cellulaires essentiels assure une production rapide et efficace des particules virales.

Après deux décennies de recherches intenses, des progrès significatifs ont été réalisés dans la compréhension des mécanismes moléculaires induisant les diversions actions de ces protéines de régulation. Un intérêt tout particulier a été porté à deux d'entre elles, à savoir les protéines Tat et Rev.

Tat active la transcription du provirus intégré en établissant des contacts avec les facteurs de transcription et le motif TAR situé à l'extrémité 5' de l'ARN viral.

Rev possède également la capacité duale d'interagir avec l'ARN, dans ce cas le motif RRE présent en position intronique dans la partie 3' de l'ARN viral, et avec des facteurs nucléaires de la cellule. Cette protéine virale inclut à la fois un signal de localisation nucléaire (NLS, nuclear localization signal) et un signal d'exportation cellulaire (NES, nuclear export séquence), et en faisant la navette entre le noyau et

le cytoplasme, cette protéine permet l'export et donc la traduction des ARNs viraux non épissés et partiellement épissés.

Du fait que les protéines Tat et Rev sont de petites protéines qui agissent par l'intermédiaire d'interaction protéine-protéine, les inventeurs ont donc estimé qu'il devait être possible d'inhiber leur fonction, qui est absolument nécessaire à la réplication virale, grâce à des ligands peptidiques (peptides d'interaction) capables d'interférer de manière compétitive avec les associations dans lesquelles ces protéines d'intérêt sont engagées.

Comme il permet de mettre en évidence des interactions en milieu intracellulaire, et tout particulièrement dans le noyau, le test double hybride (ou deux-hybride) représente une méthode de choix pour une première étape dans la sélection de tels peptides d'interaction.

Un problème important lié à l'utilisation de peptides est leur pénétration intracellulaire. Afin d'éviter l'utilisation de procédures complexes dans le cadre de la thérapie génique, les inventeurs ont ajouté la propriété de pénétration cellulaire à l'étape même de criblage, grâce à l'adjonction d'un domaine de transduction protéique, plus particulièrement dans ce cas le domaine basique de Tat. Cette méthode a permis aux inventeurs d'identifier de courtes séquences peptidiques qui se lient à Tat ou Rev. L'association de ces séquences peptidiques avec SUMO-1 afin de les stabiliser, a conduit à des petites protéines, nommée SUMO-1 Heptapeptide Protein Transduction Domain ou SHP, qui sont capables de pénétrer efficacement dans les lymphoytes, et d'inhiber, pour certaines d'entre elles ; les fonctions de Rev. Ces protéines, dont il a également été observé qu'elles inhibaient la réplication virale, tant dans les lymphocytes que dans les macrophages, représentent de nouveaux agents thérapeutiques potentiels utiles pour lutter contre la génération de nouvelles particules virales.

Les SHP développés contre la protéine Tat sont dénommés SHPT et ceux développés contre la protéine Rev sont dénommés SHPR.

I. Deux hybrides en levure: A. Banque de peptide aléatoire:
1- Construction pGAD-CR: Ce plasmide est un dérivé de pGAD424 (Clontech). Ce vecteur a été digéré par EcoRI et Bglll.

Le fragment contenant les régions linkers, les sites de clonage du fragment de séquence aléatoire et le domaine basique de Tat a été obtenu par hybridation des oligonucléotides suivants : 5'pAATTGGGTGGTGGCGGATCCGGTTTGCCCGGGAGAAAGAAGCGTAGACAAAGAAGACGTGGTTA CCCACCACCGCCTAGGCCAAACGGGCCCTCTTTCTTCGCATCTGTTTCTTCTGCACCAATTCTAGp5' (p signifie phosphate). Ce fragment a été inséré entre les sites Ecorl et Bglll de pGAD424 2- Construction de la banque de peptides d'interaction (pGAD-CR-P): Le fragment de séquence aléatoire a été généré par hybridation des deux oligonucléotides suivants : 5'-bACTCGGATCCNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNCCCGGGGTCGCAGTG
GGCCCCAGCGTCACb - 5', (b signifie biotine) réparation par une DNA polymérase et digestion par les enzymes BamHI et Xmal.

Le produit de digestion a été mélangé avec des billes de streptavidine paramagnétiques afin de retirer les extrémités biotinylées.

Le fragment BamHI-Xmal contenu dans le surnageant a été inséré entre les sites BamHl et Xmal du vecteur pGAD-CR, pour donner les plasmides pGAD-CR-Ps.

Les produits de ligation ont été transformés dans la souche E.coli XL1-blue et striés sur des plaques d'agar LB contenant de l'ampicilline. 2.106 colonies indépendantes ont été récupérées et mises en culture 1 h dans du milieu LB contenant de l'ampicilline. Les plasmides sont ensuite extraits et purifiés selon la procédure standard PEG.

B. Appâts: 1. Vecteur pLex9: Ce vecteur est un dérivé de pGBT9 (Clontech). Le domaine de fixation à l'ADN de GAL4 a été remplacé par celui de LexA (Farjot et al., 1999).

2- Construction pLex-Tat: Le fragment Ncol réparé/ BamHl obtenu du vecteur pSG-Tat (Veschambre et al., 1995) a été cloné entre les sites Smal et BamHl de pLex9.

3- Construction pLexrev et pLex-NES: Ces constructions contiennent toute la séquence Rev (pLexRev) ou seulement celle du NES (pLex-NES) en fusion avec celle de LexA (Farjot et al., 1999).

Les criblages double hybride avec soit pLexTat, pLexRev ou pLex-NES comme appât et pGAD-CR-P comme proie ont été réalisés dans la souche HF7c de S.

cerevisiae tel que déjà décrit (Rousset el al, Oncogene, 1998,16, 643-654). Les colonies ont été cultivées sur un milieu minimal, dépourvu d'histidine, et ont été analysées pour l'expression de la ss-galactosidase, par le dosage sur filtre précédemment décrit (Rousset el al, Oncogene, 1998, 16, 643-654). Les plasmides pGAD-CR-P des colonies positives sont récupérés et le motif heptapeptidique séquence.

Il. Deux hybrides en cellules de mammifères: A. Constructions pSG-FNV-P: Ces constructions sont des dérivés du plasmide pSG-FNV (Desbois et al., 1996). La région contenant l'heptapeptide a été amplifiée à partir des constructions pGAD-CRP à l'aide des oligonucléotides suivants : 5'- TGAAGGTCGACCACCAAACCCAAAAAAAGAG -3' (Oligo 5') 5'- CCTGAGAAAGCAACCTGACC -3' (Oligo 3') Le fragment PCR a été digéré par Sali et Bglll et inséré entre les sites Xhol et Bglll du vecteur pSG- FNV, donnant ainsi le plasmide pSG-FNV-P.

B. Appâts : 1. Construction du vecteur pSG-LexA-Rev: Ce vecteur est un dérivé de pSG5 (Green et al., 1988) exprimant en cellules de mammifères la fusion LexA-Rev (Farjot et al., 1999).

2. Construction du vecteur pSG-LexA-Tat.

La séquence codant pour Tat a été introduite en aval de celle de LexA dans pSGLexA.

C. Construction indicatrice (construit rapporteur): Ce plasmide possède la séquence SEAP sous contrôle de cinq sites de fixation pour LexA (Farjot et al., 1999).

III. Vecteurs d'expression SUMO-1 et SUMO-1-peptides pour cellules de mammifères : A. Construction pTL1-SUMO-1 sauvage: La séquence SUMO-1 a été amplifiée à partir d'un cDNA (clone IMAGE obtenu du HGMP - UK) par les oligos suivants : 5'- GGGTCGACGTCCATATGTCTGACCAGGAGG-3' 5'- AAAAGATCTCTAAACTGTTGAATGACC -3'

Le fragment amplifié a été digéré par Sali et Bglll et inséré entre les sites Xhol et Bglll du vecteur d'expression pTL1 qui est un dérivé de pSG5.

B. Construction du vecteur pTL1-SUMO-CP: Cette construction permet l'insertion des heptapeptides en fusion avec SUMO-1 en supprimant le motif diglycine. La séquence SUMO-1 a été amplifiée avec les oligonucléotides suivants : 5'- GGGTCGACGTCCATATGTCTGACCAGGAGG -3' 5'- ATCAGATCTGAATCTCGAGCCGTTTGTTCCTGATAAAC -3' Le fragment amplifié a été digéré par Sali et Bglll et inséré entre les sites Xhol et Bglll du vecteur pTL1.

C. Construction des vecteurs pTL1-SUMO-P La séquence contenant l'heptapeptide et le domaine basique de Tat a été amplifiée comme décrit en Il. A. , digéré par Sali et Bglll et inséré entre les sites Xhol et Bglll du vecteur pTL1-SUMO-CP.

IV. Vecteurs d'expression Ubiquitine et Ubiquitine peptides pour cellules de mammifère: A. Construction pTL1-Ub-CP: La séquence de l'ubiquitine a été amplifiée à partir d'un cDNA (clone IMAGE obtenu du HGMP - UK) avec les oligonucléotides suivants : 5'- CTAAGAATTCAAAATGCAAATCTTCGTGAAAACC -3' 5'- CACGAAGATCTACACTCGAGCTCTCAGACGCAGGACC - 3' Le fragment amplifié a été digéré par EcoRI et Bglll et inséré entre les sites EcoRI et Bglll de pTL1.

B. Construction des vecteurs pTL1-Ub-P La séquence contenant l'heptapeptide et le domaine basique de Tat a été amplifiée comme décrit en II. A. , digéré par Sali et Bglll et inséré entre les sites Xhol et Bglll de pTL1-Ub-CP V. Construction des vecteurs d'expression en bactéries pFLAG-SUMO-P: Les plasmides pTL1-SUMO-P ont été digérés par Hindlll et Bglll. Le fragment contenant la séquence SUMO-1 en fusion avec la partie heptapeptide/domaine basique de Tat a été insérée entre les sites Hindlll et Bglll du vecteur pFLAGMac (IBI FLAG Biosystems).

VI. Construction des vecteurs d'expression en bactéries pFLAG-Ub-P: Les plasmides pTL1-Ub-P ont été digérés par EcoRI et Bglll. Le fragment contenant la séquence Ub en fusion avec la partie peptide/domaine basique de Tat a été insérée entre les sites EcoRI et Bglll du vecteur pFLAG-2 (IBI FLAG Biosystems).

VII. Culture cellulaire et transfection: Les cellules HeLa et COS7 sont cultivées dans du milieu DMEM supplémenté avec 5% de sérum de veau foetal dans une atmosphère humidifiée à 5% de CO2. Les transfections ont été réalisées par la méthode de co-précipitation calcium/phosphate.

Pour les tests double-hybride en cellules mammifères, la transfection est réalisée dans des plaques 6 puits ensemencés avec 80'000 cellules HeLa. Le mélange d'ADN contient 125ng de la construction rapporteur SEAP, 25ng des vecteurs d'expression Tat ou Rev en fusion avec LexA, avec une quantité définie comme optimale de plasmide exprimant la proie, à savoir 250ng pour les motifs sélectionnés contre Tat et 25ng pour les motifs sélectionnés contre Rev, à l'exception des clones 142 et 190 (50ng). L'activité SEAP est mesurée à l'aide du kit SEAP Reporter Gene Assay Chemiluminescent (Roche) selon les instructions du fabricant. Le test fonctionnel Tat est réalisé par transfection de 300 000 cellules HeLa dans des boîtes de Pétri 60mm avec le construit rapporteur LTR HIV-CAT (50ng), pSG-Tat (2ng) et le vecteur d'expression de SUMO-1 ou d'un peptide d'interaction (0,5 et 2 g). Le test fonctionnel Rev est réalisé de façon similaire en transfectant le plasmide rapporteur pDM128 (50ng), pSG-Rev (5ng) et le vecteur d'expression de SUMO-1 ou d'un peptide d'interaction (0,5 et 2 g). L'activité CAT est mesurée en utilisant le kit CAT ELISA (Roche). Des cellules Jurkat sont cultivées dans du RPMI 1640 supplémenté avec 10% de sérum de veau foetal, à 37 C, dans une atmosphère humidifiée, à 5% de C02. Les cellules humaines sanguines mononucléaires (PBMC) et les monocytes sont isolés à partir du sang de donneurs en bonne santé séronégatifs par centrifugation selon un gradient de densité, à l'aide de Ficoll-Hypaque (Eurobio). Les cellules humaines sanguines mononucléaires (PBMC) sont activées durant 3jours avec 1 g de phytohemagglutinine-P (PHA-P, Difco Laboratories) et 5 lU/mL d'lnterleukine-2 recombinante humaine (rhlL-2 ; Roche products). Ensuite, les cellules humaines sanguines mononucléaires (PBMC) sont disposées sur une microplaque 96 puits

(100 000 cellules par puits) dans 200pL de milieu A (milieu de culture cellulaire RPMI 1640 ; Invitrogen, 10% de sérum de veau foetal (FCS, Bio West) inactivé par la chaleur (+56 C pendant 45 minutes), et 1% de mélange tri-antibiotique (pénicilline, streptomycine et néomycine ; PSN, Invitrogen)) supplémenté avec 20 IU/mL rhlL-2. Les cellules sont maintenues à 37 C dans une atmosphère humidifiée, avec 5% de CO2.

*Les macrophages dérivant de monocytes ( monocyte-derived macrophages MDM) sont différenciés des monocytes à 7 jours par adhérence. Au jour 3,300 000 cellules sont dispersées par puits dans des plaques 48 puits dans 1 mL de milieu de culture. La différenciation des monocytes et la culture des MDM sont réalisées dans du milieu de culture cellulaire A' : DMEM glutamaxTM supplémenté avec 10% de FCS inactivé par la chaleur et le mélange tri-antibiotique PSN 1X à 37 C dans une atmosphère à 5% de C02, humidifiée.

VIII. Production en bactéries et purification des SHP Les vecteurs décrits à la section VI sont utilisés pour transformer des cellules E.coli BL21-CodonPlusTM-RP (Stratagene) qui ont été cultivées dans 2L de milieu LB jusqu'à atteindre une densité optique de 0,9. Après 30 minutes à 18 C, 0,1mM d'IPTG est ajouté aux cultures qui sont poursuivies une nuit à 18 C. Les bactéries sont soniquées dans un tampon de lyse : 200mM de NaCI, 0,1M de Tris-HCI, pH7. 4, 10mM de MgCI2 qui est complété avec l'antiprotease complete de Roche (Complete antiprotease, Roche), 0,5mg/mL de lysosyme et 20u/mL de Benzonase (Sigma). Après centrifugation à 4 000 tours par minutes pendant 30 minutes, le surnageant est chargé sur une colonne 5mL d'Héparine HyperD (Biosepra).

L'élution est réalisée avec le tampon DE 600 (600mM de KCI, 20mM d'Hepes, pH7.9, 10 M de ZnCl2, 1,5mM de MgCI2, 1 mM d'EDTA et 1 mM de DTT). Le produit de l'élution est fractionné par une colonne de gel filtration Hiload 16/60 Superdex 200 (Amersham Pharmacia Biotech). Les fractions contenant les SHP sont regroupées et, après dialyse contre un tampon DE 50 (même composition que le tampon DE 600, à l'exception de la concentration de KCI qui est de 20mM), sont chargées sur une colonne 5mL mono Q HyperD (Biosepra). Le flow-through est dialysé contre du tamppon PBS 1X , concentré 10 fois par lyophilisation et filtré stérilement.

IX- Immunoblot et immunofluorescence: Les techniques utilisées sont celles classiquement utilisées dans le domaine (gels de polyacrylamide, membranes de Polyvinylidène difluoré, PVDF, anticorps

monoclonal dirigé contre FLAG de Sigma, dilué au 1 :1000 et révélation avec le kit ECL d'AMersham Biosciences).

Les tests d'immunofluorescence sont réalisés avec un anticorps primaire anti-FLAG à une dilution 1 :500 incubé pendant 2 heures et un anticorps secondaire couplé au fluorophore Alexa Fluor 488 (Molecular Probes) dilué au 1 : 1000, incubé pendant une heure.

X. Virus et test antiviral: Les cellules PBMC sont infectées avec la souche lymphotropique de référence HIV- 1-LAI (Barre-Sinoussi et al, Science, 1983,220, 868-871), et les cellules MDM avec la souche de référence ayant un tropisme pour les macrophages HIV-1/Ba-L (Gartner et al, Science, 1086,233, 215-219). Ces virus sont amplifiés in vitro avec des cellules mononucléaires ombilicales sanguines (umbilical blood mononuclear cells UBMC) activées avec de la PHA-P. Le surnageant dépourvu de cellules est centrifugé à 360 000g pendant 10 minutes afin d'éliminer les facteurs solubles, et le culot est re-suspendu dans du milieu de culture cellulaire. Des stocks de virus sont titrés à l'aide de cellules PBMC activées à la PHA-P et les doses à 50% d'infection de tissus en culture (50% Tissue Culture Infectious Doses TCID50) sont calculées à l'aide de la formule de Karber.

Les cellules PBMC sont prétraitées pendant 30 minutes par 5 concentrations de chaque molécule et infectées avec 75 TCID50 de la souche HIV-1-LAI. L'AZT (1.6, 8,40, 200 et 1 OOOnM) et l'indinavir (1. 6, 8,40, 200 et 1 OOOnM) sont utilisés comme contrôle. Les peptides d'interaction SHPR-8, -15, -190 et SHPT-142 sont testés à des concentrations de 31, 62.5, 125, 250, 500, 1000 et 2000 nM. Les molécules dont maintenues tout au long de la culture, et le surnageant cellulaire est récolté 7 jours après l'infection et stocké à -20 C afin de mesurer la réplication virale par le dosage de l'activité de transcription inverse ( reverse transcriptase RT). Les cellules PBMC sont observées au niveau microscopique au septième jour afin de déceler une possible cytotoxicité induite par la drogue.

Les cellules MDM sont prétraitées pendant 30 minutes dans 5 concentrations des différentes molécules et infectées avec 30 000 TCID50 de la souche HIV-1/Ba-L.

L'AZT (0. 8, 4,20, 100 et 500 nM) et l'indinavir (0. 8, 4,20, 100 et 500 nM) sont utilisés comme contrôle. Les peptides d'interaction SHPR-8, -15, -190 et SHPT-142 sont testés à des concentrations de 62.5, 125, 250, 500, 1000 et 2000 nM. Les molécules sont maintenues durant 7 jours après l'infection, et le surnageant cellulaire est récolté 7,14 et 21 jours après l'infection et stocké à -20 C afin de

mesurer la réplication virale par le dosage de l'activité de transcription inverse ( reverse transcriptase RT). Les cellules MDM sont observées au niveau microscopique aux jours 7,14 et 21 afin de déceler une possible cytotoxicité induite par la drogue.

La réplication de HIV est analysée par un dosage de l'activité RT dans les surnageants des cultures cellulaires à l'aide du kit RetroSys RT (Innovagen). Les expériences sont réalisées 3 fois et les résultats sont exprimés comme la moyenne de l'activité RT +/- la déviation standard (SD). 50, 70 et 90% des doses effectives (ED50, ED70 et ED90) sont calculées à l'aide des pourcentages des contrôles nontraités et d'un logiciel informatique (J. et T. C. Chou, Biosoft, Cambridge).

Exemple 2 : Résultats Identification de séquences peptidiques se liant à Tat et Rev La recherche de peptides d'interaction contre les protéines de régulation Tat et Rev a été réalisée dans un premier temps par un criblage deux-hybrides en levure. Les appâts contiennent la séquence de LexA en fusion avec la séquence entière de Tat, de Rev ou du NES de rev (Figure 7A). La proie comprend 3 parties différentes : le domaine d'activation GAL4, une séquence aléatoire de 7 acides aminés et le domaine de transduction de Tat (Figure 7B). La banque des vecteurs d'expression des proies a été construite en clonant des fragments d'ADN préparés à partir d'oligonucléotides synthétiques incluant une série de 21 positions dégénérées.

Cette banque a été utilisée dans 3 cribles différents avec soit LexTat, LexRev ou LexNES comme appât (Voir Tableau 1a ). Tous les vecteurs des clones poussant sur un milieu dépourvu d'histidine et positifs au test de la ss-galactosidase ont été isolés et re-testés. Aucun de ces vecteurs ne déclenche l'expression de la ssgalactosidase lorsque LexA seul est utilisé comme appât (Voir Tableau 1 b, c, d).

Quatre vecteurs sélectionnés contre Tat, 3 contre Rev et 19 contre NES ont été ainsi obtenus (Voir Tableau 1 b, c et d). Ces clones positifs ont ensuite été analysés à l'aide d'un test double-hybride en cellules mammifères. Les constructions réalisées ont été décrites précédemment et sont illustrées à la figure 7C. Lorsque LexA, seul ou avec les protéines Proie, est exprimé de manière transitoire, aucune expression de la phosphatase alcaline secrétée ( Secreted alkaline phosphatase SEAP) n'est observée à partir du construit rapporteur. LexTat et LexRev tous les deux, sont capables, en eux-mêmes, de déclencher l'expression de SEAP, mais cette production est augmentée par la cotransfection avec les vecteurs des proies.

Les résultats sont présentés dans la figure 8. Ils montrent que les séquences sélectionnées en levure sont également capables de se lier aux protéines Tat et Rev dans le noyau de cellules humaines.

Tableau 1a : nombre de clones obtenus par criblage double hybride de la banque de peptides aléatoires :

<tb>
<tb> Appât <SEP> LexTat <SEP> LexRev <SEP> LexNES
<tb> Nombre <SEP> de <SEP> transformants <SEP> 15,5.106 <SEP> 9,3.106 <SEP> 2,5. <SEP> 105
<tb> Nombre <SEP> de <SEP> colonies <SEP> poussant <SEP> sur <SEP> 94 <SEP> 161 <SEP> 40
<tb> des <SEP> plaques <SEP> sans <SEP> Histidine
<tb> Nombre <SEP> de <SEP> colonies <SEP> positives <SEP> pour <SEP> 24 <SEP> 12 <SEP> 19
<tb> l'expression <SEP> de <SEP> la <SEP> ss-gal
<tb>
Tableau 1b : test de la ss-galactosidase pour les clones obtenus à partir du criblage effectué avec Lex-Tat comme appât :

<tb>
<tb> Coloration <SEP> des <SEP> colonies
<tb> W= <SEP> blanc <SEP> après <SEP> 6h <SEP> ; <SEP> bleu <SEP> après <SEP> 6h
<tb> BB= <SEP> bleu <SEP> après <SEP> 3h <SEP> ; <SEP> BBB= <SEP> bleu <SEP> après <SEP> 1 <SEP> h <SEP>
<tb> N <SEP> du <SEP> clone <SEP> pLex9 <SEP> pLex-Tat
<tb> 8 <SEP> W <SEP> BB
<tb> 9 <SEP> W <SEP> BB
<tb> 10 <SEP> W <SEP> BB
<tb> 24 <SEP> W <SEP> BBB
<tb> autres <SEP> w <SEP> W
<tb>
Tableau 1c : test de la ss-galactosidase pour les clones obtenus à partir du criblage effectué avec Lex-Rev comme appât :

<tb>
<tb> Coloration <SEP> des <SEP> colonies
<tb> W= <SEP> blanc <SEP> après <SEP> 6h <SEP> ; <SEP> bleu <SEP> après <SEP> 6h
<tb> BB= <SEP> bleu <SEP> après <SEP> 3h <SEP> ; <SEP> bleu <SEP> après <SEP> 1 <SEP> h <SEP>
<tb> N <SEP> du <SEP> clone <SEP> pLex9 <SEP> pLexRev
<tb> 15 <SEP> W <SEP> B
<tb> 115 <SEP> W <SEP> B
<tb> 190 <SEP> W <SEP> BB
<tb> autres <SEP> w <SEP> W
<tb>

Tableau 1d : test de la ss-galactosidase pour les clones obtenus à partir du criblage effectué avec Lex-NES comme appât :

<tb>
<tb> Coloration <SEP> des <SEP> colonies
<tb> W= <SEP> blanc <SEP> après <SEP> 6h <SEP> ; <SEP> B= <SEP> bleu <SEP> après <SEP> 6h
<tb> BB= <SEP> bleu <SEP> après <SEP> 3h <SEP> ; <SEP> BBB= <SEP> bleu <SEP> après <SEP> 1h
<tb> N <SEP> du <SEP> clone <SEP> pLex9 <SEP> pLexNES
<tb> 1 <SEP> W <SEP> B
<tb> 7 <SEP> W <SEP> BB
<tb> 9 <SEP> W <SEP> BB
<tb> 17 <SEP> W <SEP> B
<tb> 21 <SEP> W <SEP> BB
<tb> 25 <SEP> W <SEP> BB
<tb> 31 <SEP> W <SEP> BB
<tb> 123 <SEP> W <SEP> BB
<tb> 124 <SEP> W <SEP> B
<tb> 127 <SEP> W <SEP> BB
<tb> 130 <SEP> W <SEP> BB
<tb> 131 <SEP> W <SEP> B
<tb> 136 <SEP> W <SEP> BB
<tb> 137 <SEP> W <SEP> BBB
<tb> 138 <SEP> W <SEP> BB
<tb> 141 <SEP> W <SEP> BB
<tb> 142 <SEP> W <SEP> BBB
<tb> 147 <SEP> W <SEP> BB
<tb> 151 <SEP> W <SEP> BBB
<tb> Autres <SEP> w <SEP> W
<tb>
Inhibition des fonctions de Tat et Rev Etant donné la capacité des peptides d'interaction isolés aux étapes précédentes, l'étape suivante est de vérifier leur capacité d'agir comme antagoniste de l'activité de Tat et Rev, en troublant leur association avec des effecteurs cellulaires. Des tests fonctionnels ont donc été réalisés. Afin de stabiliser les peptides d'interaction identifiés, des constructions ont été réalisées avec la protéine SUMO-1. La séquence codante entière, incluant une mutation du motif C-terminal di-glycine a été insérée en amont de la séquence codant pour le module heptapeptide-domaine de transduction. Les protéines artificielles ou chimères ainsi réalisées ont été dénommées Sumo-1- heptapetide - protein Transuction domain Tat ou Rev, soit SHPT ou SHPR selon leur capacité à se lier à Tat ou Rev respectivement.

L'effet des 4 SHPT sur la transactivation du promoteur de HIV-1 par Tat est évalué par des expériences d'expression transitoire dans des cellules HeLA. A basses

concentrations, les différents SHPT ne réduisent pas la transactivation de Tat ; à plus fortes concentrations, une légère réduction de la trans-activation est observée, notamment avec SHPT-8 ( voir figure 9A). Ces données montrent que les SHPT sélectionnés ne sont pas de très bons inhibiteurs de la fonction de Tat.

L'activité des SHPR a été évaluée à l'aide du construit rapporteur pDM128 qui inclut la séquence codante CAT ainsi qu'un motif RRE dans un intron. L'expression de Rev stimule l'expression de CAT en permettant l'export du messager non-épissé vers le cytoplasme. En utilisant ce test, il a été observé que les différents SHPR montrent des activités différentes, les résultats sont illustrés à la figure 9B. Les données montrent clairement que 2 SHPR, SHPR-142 et SHPR-190 sont a priori d'efficaces inhibiteurs de la fonction de Rev. Il a été vérifié si cette inhibition est en effet corrélée directement avec une interaction protéine-protéine comme prévu. A cette fin, à la fois Rev et les SHPR ont été produits en bactérie. Un protocole a été développé afin de purifier les SHPs ( voir exemple 1). Rev est exprimé en fusion avec la GST et couplé à des billes de glutathion-agarose. SHPR-142 et SHPR-190 sont chargés dans la colonne, ainsi que SHPT-8 comme contrôle. Lorsque la fusion GST-Rev est déchargée avec le glutathion, on observe une co-élution de SHPR-142 et SHPR-190 alors qu'aucun SHPT n'est présent dans les fractions contenant GSTRev ( voir figure 10). Ceci montre que l'interaction entre SHPR-142 et SHPR-190 d'une part et Rev d'autre part est directe et n'implique aucun intermédiaire.

Pénétration des SHPs à l'intérieur des cellules à partir du milieu extracellulaire L'activité des SHPs identifiés à partir du milieu extracellulaire a ensuite été testée.

Dans un premier temps, la cytotoxicité a été examinée. A des concentrations allant jusqu'à 1 M, ces molécules ne semblent pas modifier le pourcentage de cellules mourantes dans une population de cellules mononucléaires sanguines périphériques ( peripheral blood mononuclear cell PBMC) cultivées in vitro, activées avec PHA et IL-2.

Afin d'évaluer la capacité des SHP à pénétrer dans les cellules, des PBMCs sont cultivés dans un milieu supplémenté avec 2 M de SHPR-190. A différents instants, un aliquote du surnageant est retiré et les cellules sont collectées. Après plusieurs lavages, les cellules sont lysées dans du tampon RIPA et le surnageant ainsi que ce qui est extrait sont analysés par immunoblot à l'aide d'un anticorps dirigé contre l'épitope FLAG, épitope présent à l'extrémité N-terminale des SHP produits en bactérie. A la fois pour les lymphocytes au repos (figure 11A) et ceux activés

(figure 11 B), il est observé que SHPR-190 est stable dans le milieu de culture et qu'une fraction de la protéine est présente à l'intérieur de la cellule (figure 11). En considérant qu'un lymphocyte est une sphère de 12 de diamètre, les expériences de quantification qui ont été réalisées avec des anticorps marqués par un fluorophore, ont montré qu'une concentration externe de 2 M conduit à une concentration intracellulaire de 15 M. Ceci indique que les SHPs sont susceptibles d'être concentrés à l'intérieur de la cellule.

Afin de confirmer que les SHP entrent bien à l'intérieur de la cellule, des analyses par immunofluorescence ont également été effectuées. Des cellules Jurkat ont été incubées avec 1 M de SHP pendant 4 heures et après deux lavages, les cellules ont été mises en culture pendant 24 heures. L'analyse par immunofluorescence à l'aide d'un anticorps contre FLAG montre une nette fluorescence présente de manière diffuse dans tout l'intérieur cellulaire pour les 4 SHPs testés (figure 11 C), alors que tel n'est pas le cas pour les cellules contrôles.

L'ensemble de ces expériences apporte donc la preuve que des lymphocytes peuvent être cultivés avec des SHPs purifiés et que ces dernières molécules peuvent effectivement entrer dans les cellules.

Inhibition de la réplication de HIV-1 9 parles SHPs Dans une dernière étape, il a été examiné si les SHPs étaient en effet capables d'inhiber la réplication de HIV-1. Ceci a été réalisé dans des PBMC activés par PHA-P et dans des MDM. Dans le modèle de PBMC activés par PHA-P, la réplication de HIV-1-LAI est optimale au 7ème jour. Les effets des différents SHPs ont donc été testés à cette date. L'AZT et l'indinavir ont été utilisés comme contrôles. Comme prévu, la réplication de HIV-1-LAI est inhibée de manière effective par l'AZT et l'indinavir (figure 12A et tableau 2a). SHPT-8 ne présente aucune activité anti-HIV et SHPR-15 une faible activité. Au contraire, SHPR-142 et SHPR-190 diminuent la réplication dans les cellules PBMCs activées avec de la PHA-P. La réplication de HIV-1 est diminuée par SHPR-142 à 2 M (73 6%, voir tableau 2a), et par SHPR-190 à 1 et 2 M (80 7% et 100% respectivement, voir tableau 2a), La comparaison des doses effectives à 50% confirment que SHPR-190 est plus actif que SHPR-142 (voir tableau 2b).

Tableau 2a : effets anti-HIV de l'AZT, l'indinavir IDV et de SHPR-15, SHPT-8, SHPR-142 et SHPR-190 dans les PBMC infectés par HIV-1 LAI. Pourcentage d'inhibition.

Dose <SEP> Moyenne <SEP> Ecart-type
<tb> AZT <SEP> 1,6 <SEP> 0
<tb> 8 <SEP> 81 <SEP> 17
<tb> 40 <SEP> 98 <SEP> 1
<tb> 200 <SEP> 98 <SEP> 1
<tb> 1 <SEP> 000 <SEP> 100 <SEP> 0
<tb> IDV <SEP> 1,6 <SEP> 0-
<tb> 8 <SEP> 67 <SEP> 7
<tb> 40 <SEP> 92 <SEP> 6
<tb> 200 <SEP> 100 <SEP> 0
<tb> 1 <SEP> 000 <SEP> 100 <SEP> 0
<tb> #8 <SEP> 31 <SEP> 0-
<tb> 62. <SEP> 5 <SEP> 0-
<tb> 125 <SEP> 0-
<tb> 250 <SEP> 0-
<tb> 500 <SEP> 0-
<tb> 1000 <SEP> 0-
<tb> 2 <SEP> 000 <SEP> 0-
<tb> #15 <SEP> 31 <SEP> 0-
<tb> 62. <SEP> 5 <SEP> 0-
<tb> 125 <SEP> 0-
<tb> 250 <SEP> 0-
<tb> 500 <SEP> 0-
<tb> 1000 <SEP> 0-
<tb> 2 <SEP> 000 <SEP> 31 <SEP> 13
<tb> #142 <SEP> 31 <SEP> 0
<tb> 62. <SEP> 5 <SEP> 0
<tb> 1250
<tb> 2500
<tb> 500 <SEP> 19 <SEP> 10
<tb> 1 <SEP> 000 <SEP> 26 <SEP> 19
<tb> 2 <SEP> 000 <SEP> 73 <SEP> 6
<tb> #190 <SEP> 31 <SEP> 0
<tb> 62. <SEP> 5 <SEP> 0
<tb> 1250
<tb> 2500
<tb> 500 <SEP> 38 <SEP> 17
<tb> 1000 <SEP> 80 <SEP> 7
<tb> 2 <SEP> 000 <SEP> 100 <SEP> 0
<tb>

Tableau 2b : effets anti-HIV de l'AZT, l'indinavir IDV et de SHPR-142 et SHPR-190 dans les PBMC infectés par HIV-1 LAI: 50, 70 et 90% des doses effectives. Les résultats sont exprimés en nM.

7ème <SEP> jour
<tb> AZT <SEP> ED50 <SEP> 11
<tb> ED70 <SEP> 13.5
<tb> ED90 <SEP> 19
<tb> IDV <SEP> ED50 <SEP> 14
<tb> ED70 <SEP> 18
<tb> ED90 <SEP> 25.5
<tb> SHPR-142 <SEP> ED50 <SEP> 1 <SEP> 400
<tb> ED70 <SEP> 2100
<tb> ED90 <SEP> 4 <SEP> 600 <SEP>
<tb> SHPR-190 <SEP> ED50 <SEP> 615
<tb> ED70 <SEP> 720
<tb> ED90 <SEP> 927
<tb>
La souche de référence HIV-1/Ba-L se réplique de manière efficace dans les MDM (Monocytes derived macrophages). L'activité de transcription inverse dans le surnageant des cultures est détectée dès le 7ème jour post-infection (p.i.) et est maximal entre 14 et 21 jours p.i.. Comme prévu, la réplication de HIV-1/Ba-L est diminuée de manière dose-dépendante par l'AZT et l'indinavir (figure 12B et tableau 3a). Dans ces cellules, comme dans les PBMCs, SHPR-15 montre une très faible activité. Contrairement aux résultats obtenus pour les PBMCs activés, SHPT-142 présente également une faible inhibition de la réplication de HIV (44 10% pour 2 M au jour 14, et aucun effet à 1 M, tableau 3a). Au contraire, la réplication virale est inhibée à la fois par SHPT-8 et SHPR-190 à 2 M (69 6% et 92 2% au jour 14, respectivement, tableau 3a). Contrairement à SHPT-8, les effets de SHPR-190 sur la réplication de HIV sont dose dépendants (figure 12B). De plus, comme illustré par les valeurs ED90 (tableau 3b), le peptide d'interaction SHPR-190 montre une activité anti-HIV plus importante. Ces effets déclinent après 14 jours, probablement du fait de la dégradation du peptide d'interaction.

Tableau 3a : effets anti-HIV de l'AZT, l'indinavir IDV et de SHPT-8 et SHPR-190 dans les MDM infectés par HIV-1/Ba-L . Pourcentage d'inhibition.

Day <SEP> 7 <SEP> Day <SEP> 14 <SEP> Day <SEP> 21 <SEP>
<tb> Moy <SEP> EType <SEP> Moy <SEP> E-type <SEP> Moy <SEP> Etype
<tb> AZT <SEP> 0.8 <SEP> 76 <SEP> 5 <SEP> 0 <SEP> - <SEP> 0 <SEP> - <SEP>
<tb> 4 <SEP> 72 <SEP> 18 <SEP> 55 <SEP> 24 <SEP> 0-
<tb> 20 <SEP> 87 <SEP> 2 <SEP> 82 <SEP> 7 <SEP> 68 <SEP> 9
<tb> 100 <SEP> 88 <SEP> 4 <SEP> 92 <SEP> 4 <SEP> 81 <SEP> 12
<tb> 500 <SEP> 93 <SEP> 2 <SEP> 100 <SEP> 0 <SEP> 100 <SEP> 0
<tb> IDV <SEP> 0. <SEP> 8 <SEP> 59 <SEP> 25 <SEP> 0- <SEP> 0-
<tb> 4 <SEP> 69 <SEP> 10 <SEP> 0- <SEP> 0-
<tb> 20 <SEP> 90 <SEP> 3 <SEP> 68 <SEP> 7 <SEP> 47 <SEP> 16
<tb> 100 <SEP> 93 <SEP> 3 <SEP> 100 <SEP> 0 <SEP> 96 <SEP> 1
<tb> 500 <SEP> 97 <SEP> 0 <SEP> 100 <SEP> 0 <SEP> 100 <SEP> 0
<tb> #15 <SEP> 62. <SEP> 5 <SEP> 0- <SEP> 0- <SEP> 0-
<tb> 125 <SEP> 0- <SEP> 0- <SEP> 0-
<tb> 250 <SEP> 0- <SEP> 0- <SEP> 0-
<tb> 500 <SEP> 0- <SEP> 0- <SEP> 0-
<tb> 1000 <SEP> 0- <SEP> 0- <SEP> 0-
<tb> 2000 <SEP> 37 <SEP> 31 <SEP> 3 <SEP> 15 <SEP> 0 <SEP> - <SEP>
<tb> #8 <SEP> 62.5 <SEP> 5 <SEP> 17 <SEP> 0- <SEP> 0-
<tb> 125 <SEP> 39 <SEP> 16 <SEP> 2 <SEP> 5 <SEP> 5 <SEP> 6
<tb> 250 <SEP> 78 <SEP> 6 <SEP> 55 <SEP> 9 <SEP> 37 <SEP> 8
<tb> 500 <SEP> 78 <SEP> 6 <SEP> 50 <SEP> 8 <SEP> 21 <SEP> 8
<tb> 1000 <SEP> 70 <SEP> 10 <SEP> 46 <SEP> 1 <SEP> 20 <SEP> 9
<tb> 2000 <SEP> 84 <SEP> 1 <SEP> 69 <SEP> 6 <SEP> 59 <SEP> 0
<tb> #142 <SEP> 62. <SEP> 5 <SEP> 0- <SEP> 0- <SEP> 0-
<tb> 125 <SEP> 0- <SEP> 0- <SEP> 0-
<tb> 250 <SEP> 0- <SEP> 0- <SEP> 0-
<tb> 500 <SEP> 0- <SEP> 0- <SEP> 0-
<tb> 1000 <SEP> 3 <SEP> 14 <SEP> 0- <SEP> 0-
<tb> 2000 <SEP> 35 <SEP> 9 <SEP> 44 <SEP> 10 <SEP> 18 <SEP> 11
<tb> #190 <SEP> 62. <SEP> 5 <SEP> 0- <SEP> 0- <SEP> 0-
<tb> 125 <SEP> 34 <SEP> 7 <SEP> 0- <SEP> 0-
<tb> 250 <SEP> 50 <SEP> 4 <SEP> 0- <SEP> 0-
<tb> 500 <SEP> 89 <SEP> 8 <SEP> 66 <SEP> 4 <SEP> 28 <SEP> 16
<tb> 1000 <SEP> 94 <SEP> 3 <SEP> 70 <SEP> 9 <SEP> 50 <SEP> 5
<tb> 2000 <SEP> 99 <SEP> 92 <SEP> 60 <SEP> 3 <SEP>
<tb>
Les résultats montrent donc que le peptide d'interaction SHPR-190 présente de réels effets anti-HIV dans les deux principales cibles cellulaires du VIH, à savoir les lymphocytes T CD4+ et les macrophages.

De plus, étant donné que le peptide SHPR-142 a été sélectionné contre le NES de Rev et que le peptide SHPR-190 s'avère également interagir avec le signal NES de

Rev, ces deux molécules potentiellement interfèrent avec les propriétés d'exportation de la protéine Rev.

Tableau 3b : effets anti-HIV de l'AZT, l'indinavir IDV et de SHPT-8 et SHPR-190 dans les MDM infectés par HIV-1/Ba-L : 50, 70 et 90% des doses effectives. Les résultats sont exprimés en nM. NC signifie non-calculé.

14ème <SEP> jour <SEP> 21ème <SEP> jour
<tb> AZT <SEP> ED50 <SEP> 3 <SEP> NC
<tb> ED70 <SEP> 9 <SEP> NC
<tb> ED90 <SEP> 64 <SEP> NC
<tb> IDV <SEP> ED50 <SEP> 22 <SEP> 22
<tb> ED70 <SEP> 26.5 <SEP> 32
<tb> ED90 <SEP> 34.5 <SEP> 62
<tb> SHPT-8 <SEP> ED50 <SEP> 1 <SEP> 100 <SEP> NC
<tb> ED70 <SEP> 2 <SEP> 050 <SEP> NC
<tb> ED90 <SEP> 5 <SEP> 500 <SEP> NC
<tb> SHPR-190 <SEP> ED50 <SEP> 850 <SEP> 1200
<tb> ED70 <SEP> 1 <SEP> 040 <SEP> > <SEP> 2 <SEP> 000
<tb> ED90 <SEP> 1450 <SEP> > <SEP> 2 <SEP> 000 <SEP>
<tb>
Exemple 3 : Séquences des SHP identifiés SHPT : SHPT-8 Phe Thr Met Arg Gly Val Asp SHPT-9# Ile Thr Arg Arg Ile Glu Met Pro Gly Arg Asp Ile Pro Gly Val Asp Gly Ser Ile Leu Arg Gly Cys Trp Asp SHPT-10- Gly Ala Val Asp Lys Ser His SHPT-24 Ser Arg Val Asp Arg Lys Asp # Ce clone résulte de l'insertion de plusieurs séquences heptapeptidiques.

SHPR : SHPR-15 Met Cys Val Asp Leu Leu Leu SHPR-31 Arg Gln Val Gly Met Leu Tyr SHPR-115 Leu Ala Pro Arg Asn Leu Leu SHPR-142* Phe Trp Phe Cys Gly Leu Lys

SHPR-190* Asn Trp Leu Cys Cys Leu Asn *: ces deux heptapeptides sont ceux ayant un pouvoir inhibiteur sur la fonction de la protéine Rev.

Exemple 4 : Mutations dans SHPR-142 et SHPR-190 Des analyses de mutations ont été réalisées pour permettre de mieux déterminer l'importance des résidus à chaque position dans les SHPR-142 et-190. Chacune des sept positions a été mutée en alanine et ces mutants testés par l'essai fonctionnel en cellules HeLa (co-transfection des vecteurs d'expression Rev et SHPR avec le rapporteur pDM128), à la recherche de mutants ayant une activité anti-virale augmentée.

Les résultats indiquent que la mutation des positions 1 et 7 de SHPR-190 (soient les heptapeptides N AWLCCLN c et N NWLCCLA C ) augmente l'activité, ainsi que la mutation de la position 7 de SHPR-142 (N FWFCGLA C).

Références : - Desbois, C., Rousset, R., Bantignies, F., and Jalinot, P. (1996). Exclusion of Int-6 from PML nuclear bodies by binding to the HTLV-I Tax oncoprotein. Science 273, 951-3.

- Farjot, G., Sergeant, A., and Mikaelian, I. (1999). A new nucleoporin-like protein interacts with both HIV-1 Rev nuclear export signal and CRM-1. J Biol Chem 274, 17309-17.

- Green, S., Issemann, I., and Sheer, E. (1988). A versatile in vivo and in vitro eukaryotic expression vector for protein engineering. Nucleic Acids Res 16, 369.

- Veschambre, P., Simard, P., and Jalinot, P. (1995). Evidence for functional interaction between the HIV-1 Tat transactivator and the TATA box binding protein in vivo. J Mol Biol 250,169-80.

- Wender PA, Mitchell DJ, Pattabiraman K, Pelkey ET, Steinman L, Rothbard JB. (2000). The design, synthesis, and evaluation of molecules that enable or enhance cellular uptake : peptoid molecular transporters. Proc Natl Acad Sci USA; 97(24):13003-8.

- Kràber, G. Beitag Zur Kollektiven Behandlung Pharmakologisher Reihenversuche.

(1931) Arch. Exp. Path. Pharmak. 162, 956-959.

Claims

Revendications 1. Polypeptide d'interaction consistant en ou comprenant les éléments suivants : (a) Un motif heptapeptidique de séquence X1X2X3X4X5X6X7 , (b) Un domaine de transduction, caractérisé en ce qu'il s'agit d'un polypeptide chimère, que l'acide aminé X7 se trouve entre 5 et 35 acides aminés de l'extrémité C-terminale dudit polypeptide, et que le domaine (b) est situé en C-terminal par rapport au motif (a).
2. Polypeptide d'interaction selon la revendication 1 caractérisé en ce que ledit motif a une séquence définie par un processus aléatoire.
3. Polypeptide d'interaction selon la revendication 1 comprenant de plus : (c) Un domaine de stabilisation, caractérisé en ce que le domaine de stabilisation est situé en N-terminal par rapport au motif heptapeptidique dudit polypeptide.
4. Polypeptide d'interaction selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que des espaceurs (linkers) sont insérés entre lesdits éléments a et b, et/ou a et c.
5. Polypeptide selon la revendication 4, caractérisé en ce que lesdits espaceurs sont des séquences de moins de 5 acides aminés et comportant au moins 20% d'acides aminés Glycine ou Proline.
6. Polypeptide selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que le domaine de transduction est celui de la protéine HIV-Tat.
7. Polypeptide selon la revendication 6, caractérisé en ce que ledit domaine de transduction comprend la séquence RKKRRQRRR.
8. Polypeptide selon l'une des revendications 3 à 7, caractérisé en ce que ledit domaine de stabilisation comprend la séquence :

<Desc/Clms Page number 50>

RQGVPMNSLRFLFEGQRIADNHTPKELGMEEEDVIEVYQEQT (SEQ ID N 1), ou comprend une séquence ayant au moins 90% d'identité avec SEQ ID N 1.

MSDQEAKPSTEDLGDKKEGEYIKLKVIGQDSSEIHFKVKMTTHLKKLKESYCQ
9. Polypeptide selon l'une des revendications 1 à 8, caractérisé en ce que l'acide aminé X7 se trouve entre 10 et 30 acides aminés de l'extrémité C-terminale dudit polypeptide.
10. Polypeptide selon la revendication 9, caractérisé en ce que l'acide aminé X7 se trouve entre 15 et 25 acides aminés de l'extrémité C-terminale dudit polypeptide.
11. Polypeptide selon l'une des revendications 1 à 10, comprenant un motif (a) ayant la séquence suivante :

N X1WX3CX5LX7C, où X1, X3, X5, X7, sont des acides aminés choisis indépendamment les uns des autres, parmi les acides aminés naturels ou modifiés, où W est le tryptophane,

C la cystéine et L la leucine.
12. Polypeptide selon la revendication 11, comprenant comme motif (a) une séquence choisie parmi les séquences suivantes : i. FWFCGLK (SEQ ID N 2) ii. NWLCCLN (SEQ ID N 3),
13. Polypeptide selon la revendication 12, comprenant une séquence choisie parmi les séquences suivantes : i. FWFCGLKPGRKKRRQRRRG (SEQ ID N 4) ii. NWLCCLNPGRKKRRQRRRG (SEQ ID N 5),
14. Polypeptide comprenant un heptapeptide de séquence :

N X1WX3CX5LX7C, où X1, X3, X5, X7, sont des acides aminés choisis indépendamment les uns des autres, parmi les acides aminés naturels ou modifiés, où W est le tryptophane,

C la cystéine et L la leucine, et interagissant avec la protéine Rev ou l'un de ses domaines.

<Desc/Clms Page number 51>
15. Polypeptide selon la revendication 14 où ledit heptapeptide est capable d'interagir avec la protéine Rev de HIV-1 dans un test double-hybride en levure, et où ledit polypeptide est capable d'inhiber in vivo la réplication du virus HIV-1.
16. Polypeptide selon la revendication 14 ou 15, où la séquence de l'heptapeptide est choisie parmi les séquences suivantes : (a) FWFCGLK (SEQ ID N 2) (b) NWLCCLN (SEQ ID N 3).
17. Population de molécules d'interaction, chaque membre de la population étant constitué par ou comprenant un polypeptide selon la revendication 1, 2 ou 3 et ne se distinguant des autres membres que par la séquence de l'heptapeptide.
18. Population de molécules d'interaction selon la revendication 17, caractérisée en ce que cette population comprend au moins 100 molécules distinctes, de préférence au moins 1000.
19. Population de molécules d'interaction selon la revendication 17, caractérisée en ce que chaque membre comprend la séquence suivante : X1X2X3X4X5X6X7PGKKRRQRRRG (SEQ ID N 6).
20. Population de molécules d'interaction selon l'une des revendications 17 à 19 caractérisée en ce que chaque membre comprend la séquence suivante

MSDQEAKPSTEDLGDKKEGEYIKLKVIGQDSSEIHFKVKMTTHLKKLKESYCQRQGVPMNSLRF

LFEGQRIADNHTPKELGMEEEDVIEVYQEQTARPPNPKKEIELGGGGSX1X2X3X4X5X6X7PG

KKRRQRRRG (SEQ ID N 7).
21. Molécule d'acide nucléiques comprenant une séquence codant pour l'un quelconque des polypeptides selon les revendications 1 à 20.
22. Polypeptide selon l'une quelconque des revendications 1 à 16 pour une utilisation comme médicament.

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23. Procédé de criblage pour l'identification de polypeptides capables de modifier le phénotype d'une cellule comprenant : i. la mise en présence d'un polypeptide d'interaction selon l'une quelconque des revendications 1 à 13 et 17 à 20 avec la cellule ; ii. la détection d'une modification du phénotype de la cellule ; iii. éventuellement la détermination de la séquence du motif heptapeptidique dudit polypeptide.
24. Procédé de criblage selon la revendication 23 caractérisé en ce que la mise en présence consiste en la synthèse du polypeptide d'interaction par la cellule.
25. Procédé de criblage selon la revendication 23 caractérisé en ce que la mise en présence consiste en l'addition extracellulaire du polypeptide.
26. Procédé de criblage selon la revendication 23 caractérisé en ce qu'il s'agit d'un criblage intracellulaire.
27. Procédé de criblage selon la revendication 23 caractérisé en ce qu'il s'agit d'un criblage extracellulaire.
28. Procédé de criblage selon la revendication 23 caractérisé en ce qu'il s'agit d'un procédé de criblage in vivo.
29. Procédé de criblage selon la revendication 23 caractérisé en ce qu'il s'agit d'un procédé mis en #uvre in vitro.
30. Procédé de criblage selon la revendication 23 caractérisé en ce que le changement phénotypique observé est induit par un gène rapporteur.
31. Procédé de criblage selon la revendication 30 caractérisé en ce que ledit gène rapporteur est celui d'un système deux-hybrides .
32. Procédé de criblage de molécules pour l'identification d'une molécule interagissant avec une cible intracellulaire déterminée comprenant :

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i. la génération de polypeptides selon l'une des revendications 1 à 13 ou 17 à 20, ii. la mise en présence de la cible avec les polypeptides générés ; iii. la détection de l'interaction d'un polypeptide avec la cible et iv. éventuellement la détermination de la séquence du motif heptapeptidique.
33. Procédé de criblage selon la revendication 32, où la détection de l'interaction est réalisée par l'observation d'un changement phénotypique, par exemple grâce à un système deux-hybrides, ou par le dosage d'une entité.
34. Procédé pour moduler les propriétés d'une molécule-cible intracellulaire comprenant la mise en contact in vitro d'une cellule contenant la molécule- cible et d'un polypeptide d'interaction selon l'une quelconque des revendications 1 à 13, ledit polypeptide comprenant un motif heptapeptidique interagissant avec la molécule cible.
35. Utilisation d'une molécule selon la revendication 21 comme proie dans un crible phénotypique.
36. Utilisation selon la revendication 35, caractérisée en ce que ledit crible phénotypique est un crible deux-hybrides.
37. Utilisation selon la revendication 36 caractérisée en ce que l'appât dans ledit crible comprend une séquence codant pour la protéine HIV-Rev ou l'un de ses domaines.
38. Utilisation selon la revendication 36 caractérisée en ce que l'appât dans ledit crible comprend une séquence codant pour un domaine de 7 à 15 acides aminés.
39. Utilisation selon la revendication 38 caractérisée en ce que ledit domaine est un NLS (Nuclear Localisation Signal).

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40. Utilisation selon la revendication 37 caractérisée en ce que ledit domaine est un NES (Nuclear Export Signal).
41. Utilisation selon la revendication 40 caractérisée en ce que ledit NES est celui de la protéine HIV-REV.
42. Utilisation selon la revendication 40 caractérisée en ce que ledit NES a la séquence peptidique suivante : LQLPPLERLTL (SEQ ID N 8).
43. Méthode d'identification de molécules capables de moduler les propriétés d'une molécule-cible intracellulaire comprenant : i. La génération de molécules d'acides nucléiques comprenant des séquences codant pour différents membres d'une population de polypeptides selon l'une des revendications 17 à 20, ii. Le criblage de ces molécules à l'aide d'un système deux-hybrides en levure, comprenant la molécule-cible comme appât, iii. La détection d'une interaction ; iv. Eventuellement, la vérification de cette interaction en cellule humaine.