FR2821672A1 - Moyens pour l'extraction de produits a analyser et leurs applications en diagnostic et analyse - Google Patents
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Abstract
L'invention vise des moyens pour l'extraction de produits à analyser. Ces moyens comprennent un dispositif d'extraction d'une ou plusieurs bandes renfermant les produits ou constituants recherchés à partir d'un tube d'analyse (1) comportant une pluralité de bandes distinctes, contigües ou chevauchantes, en milieu liquide, formant un gradient continu ou discontinu de densité (2), caractérisé en ce qu'il comprend : - un tube d'analyse (1) standard,- un tube ou capillaire d'extraction (3), pré-positionnable en fonction de la couche à extraire, et- des moyens pour obtenir un écoulement laminaire d'une ou plusieurs bandes du tube sans aspiration, soit par surpression appliquée sur le dessus du milieu liquide avec un fluide, gaz ou liquide de faible densité, soit en exerçant une force centrifuge.Applications à l'extraction d'une ou plusieurs couches de constituants par exemple d'un mélange sanguin.
Description
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MOYENS POUR L'EXTRACTION DE PRODUITS A ANALYSER ET LEURS
APPLICATIONS EN DIAGNOSTIC ET ANALYSE.
APPLICATIONS EN DIAGNOSTIC ET ANALYSE.
L'invention se rapporte à des moyens, dispositifs, procédés et kits, pour l'extraction de produits à analyser contenus dans une couche située dans un gradient, continu ou discontinu, de différents produits en milieu liquide. Le terme"produits" couvre des produits en solution et des liquides.
Elle est également relative aux applications en analyse et en diagnostic de ces moyens, notamment au dépistage précoce des maladies génétiques foetales.
L'établissement d'un diagnostic impose souvent l'isolement par extraction des constituants recherchés, présents dans une couche séparée par gradient de densité. Dans la description et les revendications, les termes"couche","bande"ou"fraction" seront utilisés indifféremment pour désigner les produits séparés suivant leur densité réelle ou apparente.
Dans la pratique courante du laboratoire, cette couche est extraite par le technicien, à partir d'un tube d'analyse, par aspiration, par perçage ou par coupure de tube, ce qui pose au moins deux difficultés majeures : la bande désirée est isolée partiellement et elle est contaminée par les régions en amont et en aval à la suite d'un écoulement turbulent, source de remélange annihilant l'efficacité de la technique de séparation par densité. En effet, la dépression nécessaire à l'aspiration du produit provoque un vortex qui mélange les couches voisines.
On notera que l'expression"tube d'analyse"est utilisée dans son sens le plus général pour désigner tout récipient.
Pour remédier aux inconvénients ci-dessus, les inventeurs ont développé des moyens d'extraction, dispositifs, procédés et kits, de n'importe quelle fraction positionnée n'importe où dans un gradient continu ou discontinu de différents produits.
A partir d'une séparation basée sur la différence de
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densité, réelle ou apparente, ces moyens permettent d'isoler totalement n'importe quelle fraction, sans phénomène de mélange.
Les inventeurs ont également mis au point des moyens d'injection, dispositifs, procédés et kits, permettant de déposer les couches dans un tube d'analyse sans mélange au niveau des interfaces, l'extraction spécifique d'une ou plusieurs couches étant ensuite réalisée selon une technique donnée, en particulier telle que visée selon l'invention.
L'invention a donc pour but de fournir de tels moyens d'extraction sélective de produits à analyser contenus dans une couche d'un gradient de densité.
Elle vise également à fournir des moyens d'injection de telles couches.
L'invention vise en outre les applications des moyens d'injection et/ou d'extraction pour l'analyse et le diagnostic, en mettant à profit leurs avantages de sélectivité, de fiabilité et de simplicité.
Le dispositif d'extraction d'une ou plusieurs bandes renfermant les produits ou constituants recherchés à partir d'un tube d'analyse (1) comportant une pluralité de bandes distinctes, contiguës ou chevauchantes, en milieu liquide, formant un gradient continu ou discontinu de densité (2), est caractérisé en ce qu'il comprend - un tube d'analyse (1) standard, un tube d'extraction (3), appelé ci-après capillaire d'extraction, pré-positionnable en fonction de la couche à extraire, et des moyens pour obtenir un écoulement laminaire sans aspiration d'une ou plusieurs bandes du tube, soit par surpression appliquée sur le dessus du milieu liquide, avec un fluide, gaz ou liquide de faible densité, soit en exerçant une force centrifuge.
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Grâce à ces dispositions, il est possible d'extraire sans mélange avec cette technique, successivement et laminairement, toutes les couches.
L'invention vise également un procédé d'extraction spécifique d'une ou plusieurs bandes renfermant les produits ou constituants recherchés à partir d'un tube d'analyse comme indiqué plus haut.
Ce procédé est caractérisé par les étapes suivantes : - on introduit dans un tube d'analyse standard un capillaire d'extraction au moyen d'un guide assurant son positionnement dans l'espace à la hauteur voulue par rapport à la bande à extraire ou, en variante, on utilise un tube d'analyse avec un capillaire pré-positionné à la hauteur voulue, situé à l'intérieur ou en partie à l'extérieur du tube, et on applique des moyens pour obtenir un écoulement laminaire sans aspiration, soit par surpression avec un fluide, gaz ou liquide de faible densité, soit en exerçant une force centrifuge.
L'invention fournit également des kits permettant de réaliser lesdites extractions. Ces kits sont caractérisés en ce qu'ils comprennent tout ou partie du dispositif d'extraction tel que défini ci-dessus, et les produits pour la mise en oeuvre du procédé d'extraction de l'invention, tels que le milieu séparateur et/ou des réactifs permettant une séparation sélective de constituants recherchés.
Le procédé d'extraction défini ci-dessus est avantageusement appliqué à des couches déposées, selon l'invention, à des hauteurs déterminées et selon une technique originale permettant d'éviter le mélange des produits au niveau des interfaces.
Ainsi, conformément à l'invention, l'injection dans un tube d'analyse de produits, sous forme de couches successives, par introduction de quantités pré-déterminées de produits ou de liquides avec des densités différentes est réalisée à l'aide
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d'un dispositif caractérisé en ce que le tube d'analyse (1) comprend des moyens d'injection permettant l'arrivée tangentielle des produits en quantités pré-déterminées.
On observera avec intérêt qu'un tel dispositif facilite les manipulations, standardise le dépôt des couches à des hauteurs de produits pré-déterminées et permet d'éviter le mélange des produits au niveau des interfaces, résolvant ainsi la difficulté fondamentale du mélange des produits au niveau des interfaces entre les différentes couches.
Le procédé d'injection à l'aide d'un tel dispositif entre également dans le champ de l'invention. Ce procédé est caractérisé en ce qu'on procède à l'injection dans le tube d'analyse, à l'aide d'une pipette ou d'un distributeur calibrateur, des quantités requises de produits ou de liquides pour une couche donnée, de manière à amener le produit tangentiellement à la surface de la couche précédente ou, en variante, on introduit lesdits produits ou liquides dans le tube d'analyse à l'aide d'une aiguille avec un embout d'injection tangentielle, la hauteur de pénétration étant pré-déterminée selon la hauteur des couches préalablement formées.
Selon encore un autre aspect, l'invention vise des kits pour l'injection de couches successives de produits dans un tube d'analyse, ces kits comprenant tout ou partie d'un dispositif d'injection tel que défini plus haut et des doses individuelles de produits ou de liquides pré-calibrées en fonction de l'empilement des couches à réaliser.
Avec les dispositifs, procédés et kits décrits ci-dessus pour la préparation des couches de produits et l'extraction des constituants recherchés, l'invention fournit des moyens de séparation de grande spécificité de produits recherchés pour une analyse et présente en particulier un grand intérêt pour la séparation des différents constituants d'un mélange.
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L'invention vise en particulier l'application de ces dispositifs et/ou procédés et/ou kits pour séparer les constituants d'un mélange sanguin dans un milieu séparateur contenant le cas échéant un anti-agrégant, et pour les récupérer de manière sélective.
L'invention vise tout spécialement une telle application pour extraire les érythroblastes foetaux du sang maternel, ce qui permet un dépistage précoce des maladies génétiques foetales au cours de la gestation.
On sait que, dans la séparation des cellules foetales nucléées, par rapport aux cellules maternelles, il est habituel d'utiliser les variations de densité cellulaire, pour des raisons évidentes de simplicité.
Les deux techniques les plus connues sont basées sur l'utilisation de Ficoll@ ou de Percoll@. La technique au Percoll permet de réaliser un gradient continu de densité.
Compte tenu de sa précision, cette méthode est souvent employée pour séparer les cellules foetales des cellules adultes. Le prélèvement d'une partie du gradient Percoll@ permet de récupérer des cellules foetales très pures, mais en très faible quantité. La technique au Ficoll@ permet de réaliser des gradients discontinus et de récupérer davantage d'érythroblastes
foetaux. Le problème posé par cette méthode réside dans l'élimination des cellules adultes contaminantes prélevées en même temps que les cellules foetales.
foetaux. Le problème posé par cette méthode réside dans l'élimination des cellules adultes contaminantes prélevées en même temps que les cellules foetales.
En se basant sur cette technique du Ficoll simple, les inventeurs ont développé un procédé permettant d'obtenir les différents constituants d'un mélange sanguin et plus spécialement les constituants du sang maternel durant la gestation avec une concentration significative et une pureté élevée.
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L'invention vise donc un procédé pour séparer les constituants du sang maternel pendant la gestation, dans un tube d'analyse renfermant un milieu séparateur permettant d'obtenir un gradient de densité, et du sang maternel avantageusement dilué, caractérisé en ce qu'on incorpore dans le tube une couche de milieu séparateur dilué entre la couche de sang et celle de milieu séparateur et qu'on soumet le contenu du tube à une centrifugation de manière à séparer les constituants du sang en couches distinctes.
Ce procédé permet de récupérer, séparément, des érythroblastes, des lymphocytes, des polynucléaires et des globules rouges. Les érythroblastes sont le cas échéant en mélange avec des globules rouges. On notera avec intérêt que ces différents produits présentent un degré de pureté jamais atteint à ce jour et que l'absence de contaminants leur confère des structures originales. Il s'agit donc de produits qui, en tant que tels, sont nouveaux. A ce titre, ces produits sont également visés par l'invention.
D'autres caractéristiques et avantages de l'invention sont donnés dans les exemples qui suivent avec référence aux figures, qui représentent, respectivement, - les figures 1A à 1E des dispositifs d'extraction par surpression, - la figure 2, un dispositif d'extraction par force centrifuge, - les figures 3A et 3B, des dispositifs d'injection, - les figures 4A et 4B, une séparation des éléments du sang
au Ficoll selon la technique classique, et les figures 5A et 5B, une séparation respectivement d'érythroblastes et de lymphocytes à partir de sang maternel en opérant selon l'invention.
au Ficoll selon la technique classique, et les figures 5A et 5B, une séparation respectivement d'érythroblastes et de lymphocytes à partir de sang maternel en opérant selon l'invention.
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1-Exemples de dispositifs d'extraction Selon un mode de réalisation de l'invention, les moyens capables d'exercer une surpression dans le tube d'analyse (1) forment un système hermétiquement clos, au moment de l'extraction, avec le gradient de densité (2) et le capillaire d'extraction (3).
Ces moyens comprennent, dans une variante représentée sur la figure 1A, un bouchon (4) destiné à fermer le tube d'analyse (1) de manière étanche et un tube de surpression (5) d'entrée dudit fluide.
Dans une autre variante, lesdits moyens comprennent un élément dont le déplacement permet de faire varier le volume de la phase gazeuse dans la partie de tête du tube d'analyse, tel qu'un piston, une membrane ou un bouchon.
Sur la figure 1B, on a représenté un dispositif d'extraction comportant un capillaire d'extraction (3) solidaire d'un piston (8).
Le piston (8) actionnable par un poussoir (9) est muni d'un échappement (10) occultable. Lors de la mise en place du piston jusqu'en appui sur une butée (11), cet échappement évite la mise en pression du tube.
Dans une autre variante représentée sur la figure 1C, le capillaire d'extraction (3) est souple. Son extrémité est lestée par une masse (12) de manière à constituer un ludion.
L'extrémité du capillaire d'extraction se positionne dans le milieu liquide selon la densité apparente du ludion. La densité apparente du ludion est déterminée en fonction de celle de la fraction à extraire.
Dans encore une autre variante, lesdits moyens comprennent un bouchon (4) destiné à fermer de manière hermétique le tube d'analyse (1) et un élément chauffant (non représenté) placé dans la partie supérieure du tube ou dans le bouchon, provoquant
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la dilatation de la phase gazeuse de manière à obtenir la surpression.
Selon un autre mode de réalisation de l'invention représenté sur la figure 2, lesdits moyens autorisant un écoulement laminaire sont des moyens capables d'exercer une force centrifuge et comprennent un tube support (8) apte à être placé avec le tube d'analyse (1) dans une centrifugeuse (non représentée), le tube support (8) contenant un capillaire de récupération (9) avec une branche de retour (10) droite ou spiralée. Le capillaire de récupération (9) est raccordé au capillaire d'extraction (3) et forme un siphon par rapport à ce capillaire. Une partie ou la totalité des bandes présentes dans le tube d'analyse, situées au-dessus de l'embouchure du capillaire d'extraction, peuvent être contenues dans le système de récupération (9). Ce système est par exemple un serpentin.
Dans une variante de ce mode de réalisation, pour augmenter la poussée centrifuge, on ajoute dans le tube d'analyse une masse formant piston (non représentée).
Le capillaire d'extraction (3) est apte à être positionné à hauteur variable dans le milieu d'analyse, verticalement ou non, ou en variante est fixé à l'intérieur ou à l'extérieur du tube.
Il peut être regroupé avec le tube de surpression (5), formant un seul tube à 2 voies.
Selon une disposition de l'invention, le capillaire d'extraction forme un siphon. Dans une autre disposition représentée sur la figure 1D, le capillaire d'extraction est muni d'un robinet (6). Selon encore une autre disposition représentée sur la figure lE, le capillaire d'extraction (3) est associé à un capillaire de récupération (7). Ce capillaire de récupération est par exemple spiralé ou droit. Le capillaire d'extraction (3) ou de récupération (7) peut être marqué ou gravé par des repères à des positions déterminées en fonction du positionnement attendu de la ou des fractions, et est
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éventuellement sécable au niveau des repères. L'intérieur du capillaire d'extraction (3) ou de récupération (7) peut être garni totalement ou partiellement d'un ou de plusieurs réactifs biologiques et/ou physiques et/ou chimiques. Il s'agit par exemple d'antigènes, de récepteurs, d'anticorps, de protéines, de sondes de biologie moléculaire, de lectines. Il est ainsi possible de retenir spécifiquement dans le capillaire une partie ou un constituant de la fraction, ou de retenir spécifiquement un contaminant. Le capillaire s'assimile alors à une colonne chromatographique en phase liquide. Les couches inférieures servent de pousseur aux fractions contenues dans le capillaire.
Le diamètre du capillaire influence les propriétés rhéologiques de certains produits. Ainsi, en fonction du diamètre et de la longueur du capillaire, certains produits sont plus ou moins freinés, permettant ainsi d'affiner la qualité de la séparation.
On observera que la sortie supérieure du capillaire d'extraction (3), ou le cas échéant du capillaire de récupération (7) qui lui est associé, peut être reliée à un collecteur de fractions ou directement à l'entrée d'un analyseur, par exemple d'un spectromètre UV, de masse, RMN, d'un HPLC ou d'un CPG (non représentés).
Pour augmenter la sélectivité de la séparation, lesdits moyens autorisant un écoulement laminaire définis ci-dessus comprennent un tube d'analyse (1) avec au moins deux bandes conductrices soumises à une différence de potentiel ou, en variante, le tube d'analyse est placé dans un champ magnétique.
On observera que le système d'extraction est indépendant du tube d'analyse et peut s'aj outer extemporanément sur n'importe quel tube d'analyse.
Ce système peut être en place, partiellement ou totalement, avant la séparation des couches.
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Il permet d'extraire en continu l'ensemble ou une partie des constituants séparés préalablement par densité.
Les différentes formes de réalisation des dispositifs selon l'invention sont avantageusement mises en oeuvre pour extraire spécifiquement une ou plusieurs bandes renfermant les produits ou constituants recherchés à partir d'un tube d'analyse comprenant une pluralité de bandes telles que définies plus haut.
Conformément à un mode de réalisation de l'invention, on assure à cet effet l'écoulement laminaire de la bande à récupérer vers un capillaire d'extraction, en exerçant une surpression dans le tube d'analyse hermétiquement fermé, on récupère la bande désirée à partir du capillaire d'extraction, l'opération étant continuée pour obtenir d'autres bandes si souhaité, en allant successivement de la bande la plus dense à la bande la moins dense, sans re-mélange de bas en haut.
La surpression est obtenue par variation de pression, de température ou de volume.
La variation de pression est exercée en injectant dans le tube d'analyse un fluide par l'intermédiaire d'un tube dit de surpression. Comme fluide, on utilise un gaz inerte, de l'air, ou encore un liquide de faible densité.
En variante, on exerce une variation de volume dans la partie de tête du tube d'analyse à l'aide d'un élément tel que piston, membrane ou bouchon mobile.
Le piston (8) actionnable par un poussoir (9) est muni d'un échappement (10) occultable. Lors de la mise en place du piston jusqu'en appui sur une butée (11), cet échappement évite la mise en pression du tube. L'extrémité du capillaire d'extraction est alors positionnée juste au-dessus de la fraction à extraire.
Puis l'échappement est obturé afin de rendre le système"tube- piston"étanche.
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La pression exercée sur le poussoir se transmet au piston et à toutes les couches du liquide situées dans le tube au-dessus de l'extrémité du capillaire d'extraction.
Ainsi, les fractions situées en dessous de l'extrémité du capillaire d'extraction remontent successivement à l'intérieur du capillaire d'extraction puis dans le capillaire de récupération.
L'extrémité du capillaire d'extraction, solidairement au piston, s'enfonce dans le liquide au fur et à mesure de l'extraction des fractions.
Les fractions comprises entre l'extrémité du tube d'extraction et le piston ne sont pas extraites du tube.
On peut aussi utiliser un capillaire d'extraction simple terminé, à son extrémité, par une masse formant ludion, qui se positionne dans le milieu liquide selon la densité apparente du ludion, celle-ci étant déterminée en fonction de celle de la fraction à extraire.
Une autre variante consiste à exercer une variation de température en chauffant la partie de tête. Après avoir positionné le capillaire d'extraction, on chauffe alors le contenu du tube d'analyse à l'aide d'un dispositif chauffant qui provoque la dilatation de la partie de tête du tube d'analyse et engendre la surpression recherchée pour l'extraction de la bande à récupérer.
L'ensemble du gradient de densité est alors poussé vers le bas, les couches supérieures s'appuyant uniformément sur les couches inférieures.
On récupère la bande désirée à partir du capillaire d'extraction, l'opération étant continuée pour obtenir d'autres bandes si souhaité, en allant successivement de bas en haut, de la bande la plus dense à la bande la moins dense, sans remélange.
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La surpression pousse toutes les fractions situées au dessus de l'embouchure basse du capillaire d'extraction. Elles remontent successivement à l'intérieur du capillaire. Elles ressortent du capillaire par siphon dans l'ordre croissant des densités, réelles ou apparentes. (La plus dense ressort en premier).
Ainsi, la fraction à extraire remonte dans le capillaire d'extraction, sans perturbation ni de la couche basse, ni des couches supérieures, ce qui permet d'extraire totalement, successivement et en continu, les différentes couches supérieures par ordre inverse (les plus denses en premier) sans contamination, ni mélange et sans extraire les couches en aval de densité supérieures.
Dans une variante, on utilise un capillaire d'extraction comportant un robinet, ce qui permet en ouvrant le robinet de recevoir la couche à extraire. En fermant ensuite le robinet, on isole de l'atmosphère, en sortie du capillaire d'extraction, la fraction extraite. On sort alors le capillaire délicatement du tube d'analyse et on récupère la couche en l'expulsant par sa mise à l'atmosphère, puis on la dépose sur un support prévu à cet effet.
Cette variante permet de protéger la fraction isolée de l'air, de la maintenir dans son environnement, et d'assurer ainsi un transport entre le dispositif d'extraction et le lieu d'analyse.
Dans encore une autre variante, on raccorde un capillaire récupérateur au capillaire d'extraction, ce qui permet de retenir spécifiquement une partie ou un constituant de la fraction ou de retenir spécifiquement un contaminant.
Selon un autre mode de réalisation de l'invention, on assure l'écoulement laminaire de la bande à récupérer en exerçant une force centrifuge. On place à cet effet un tube support comportant un système de récupération de fraction dans une
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centrifugeuse à côté du tube d'analyse, le système de récupération étant raccordé au capillaire d'extraction, et on soumet les deux tubes à une force centrifuge assurant le passage des bandes situées au-dessus de l'embouchure du capillaire d'extraction dans le système récupérateur, l'opération étant appliquée avec des durées différentes à d'autres bandes si souhaité.
On enlève le système de récupération de son tube support et on coupe la ou les sections renfermant la ou les bandes recherchées. Ces sections peuvent correspondre à des repères préalablement établis.
On utilise par exemple un serpentin comme système de récupération.
Selon encore un autre mode de réalisation de l'invention, on réalise l'extraction en présence d'un champ électrique ou d'un champ magnétique.
Le procédé de l'invention est avantageusement appliqué à des couches séparées à l'aide, par exemple, de Ficoll@, de Percoll@, d'albumine, de chlorure de césium, de polyvinylpyrrolidone (PVP), de glucose, glycérol ou silice colloïdale.
2-Exemples de dispositifs d'iniection selon l'invention (non représentés).
Dans un mode de réalisation de l'invention représenté sur la figure 3A, les moyens d'injection sont constitués par un capillaire (11) solidaire de la paroi interne du tube d'analyse, comportant des encoches perpendiculaires (12) au tube d'analyse (1), à des hauteurs pré-établies en fonction des quantités de produits à injecter dans le tube d'analyse, ce qui permet une arrivée tangentielle de produit à la surface de la couche précédente.
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Le capillaire est par exemple collé à l'intérieur du tube, ou en variante, est formé par extrusion lors de la fabrication du tube.
Dans un autre mode de réalisation de l'invention représenté sur la figure 3B, les moyens d'injection sont constitués par une aiguille d'injection (13) dont la hauteur de pénétration dans le tube est prédéterminée et/ou comportant un embout d'injection tangentielle (14).
L'invention vise également un procédé d'injection de produits dans un tube d'analyse, sous forme de couches successives. Ce procédé est caractérisé par l'introduction successive de quantités pré-déterminées desdits produits de manière à assurer une arrivée tangentielle de ces produits sur la couche précédente.
Cette introduction est avantageusement réalisée en procédant à l'injection dans le capillaire, à l'aide d'une pipette ou d'un distributeur calibrateur, des quantités requises de produits ou de liquides pour une couche donnée, de manière à amener le produit tangentiellement à la surface de la couche précédente.
Les produits ou liquides sont introduits par ordre de densité croissante, en dessous de la surface inférieure de la couche précédente, ou en variante par ordre de densité décroissante au-dessus de la surface supérieure de la couche précédente.
En variante, on introduit dans le tube d'analyse une aiguille avec embout d'injection tangentielle, la hauteur de pénétration étant pré-déterminée selon la hauteur des couches préalablement formées.
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3 - Séparation des constituants d'un mélange sanquin : applications à partir d'un prélèvement de sang maternel pendant la qestation.
Le Ficoll Histo-paque est constitué de polysucrose et de diatrizotate de sodium, en quantités variables de manière à obtenir trois liquides isotoniques de densités différentes : 1,077 ; 1,083 ; 1,119. Ce réactif permet de séparer les éléments mononucléés à partir de sang total. On a représenté sur la figure 4A, un tube d'analyse contenant une couche inférieure (15) de 2 ml de Ficoll pur de densité 1,077 et une couche supérieure (16) de 1 ml de sang dilué avec 1 ml de PBS. Après centrifugation pendant 20 min. à 600 g, comme représenté sur la figure 4B, on obtient de bas en haut des couches de globules rouges (17) et de polynucléaires (18), une couche de Ficoll (19), puis une bande de lymphocytes (20) surmontée d'une bande ou fraction de plasma (21).
Une séparation complexe au Ficoll, pour obtenir des érythroblastes purs exempts de toute contamination lymphocytaires a été rapportée par Bhat et al. 1983 J. Immunol.
Methods 158 : 277-280. Cette technique repose sur l'emploi de trois couches de Ficoll de densités différentes (1,119 ; 1,107 ; 1,077). Elle permet de récupérer des érythroblastes purs, mais les rendements sont tellement faibles que cette technique ne fonctionne qu'avec des prélèvements importants contenant de grandes quantités d'érythroblastes.
Avec des prélèvements maternels adéquats de 5 ml, on ne réussit pas à isoler d'érythroblastes foetaux par cette technique.
Ce résultat est confirmé par Huber K. et al., 1996, Prenat.
Diag. 16 : 1011-1019, qui obtiennent 1 % de récupération après triple Ficoll selon cette méthode.
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L'étude réalisée par les inventeurs sur une séparation des éléments mononucléés à partir de sang total a amené à dégager les observations suivantes : - les globules rouges se rassemblent en"piles d'assiettes", constituant une"rouleau formation", ce qui implique une modification profonde des charges des globules rouges, - les lymphocytes ne rentrent pas dans le Ficoll@, mais sont posés dessus, à l'interface avec le sérum, - les polynucléaires sédimentent à la surface du culot de globules rouges : avant centrifugation, l'addition dans le fond du tube d'une petite quantité de Ficoll 1,119 permet d'avoir une interface entre les globules rouges et les polynucléaires, facilitant ainsi la récupération d'un culot érythrocytaire théoriquement exempt de polynucléaires.
On note par ailleurs, qu'en présence de Ficoll@, lors de l'agrégation des globules rouges en"rouleau formation", des érythroblastes foetaux et des polynucléaires sont aléatoirement emprisonnés.
- les érythroblastes ne sont pas discernables de visu dans la bande lymphocytaire. En revanche, l'adjonction de 200 pl de sang pur de foetus au sang maternel prélevé entre la 14ème et la 17ème semaine de gestation montre une fine bande d'érythroblastes visible en lumière rasante sur fond noir. Ces érythroblastes apparaissent individualisés en une bande située entre la bande lymphocytaire et le Ficoll@.
Des observations du même type sont dégagées avec d'autres milieux séparateurs tels que mentionnés plus haut.
Ces études ont amené les inventeurs à développer un procédé pour séparer les constituants du sang maternel pendant la gestation, dans un tube d'analyse renfermant un milieu séparateur permettant d'obtenir un gradient de densité, et du sang maternel avantageusement dilué, caractérisé en ce qu'on
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incorpore dans le tube une couche de milieu séparateur dilué entre la couche de sang et celle de milieu séparateur et qu'on soumet le contenu du tube à une centrifugation de manière à séparer les constituants du sang en couches distinctes.
La dilution du milieu séparateur est choisie pour obtenir une augmentation de l'espace séparant le doublet lymphocytes- érythroblastes.
Comme milieu séparateur approprié, on citera le Ficoll, le Percoll@, le glucose, l'albumine, le chlorure de césium, la polyvinylpyrrolidone (PVD), le glycérol ou la silice colloïdale.
Des résultats satisfaisants sont obtenus en utilisant comme milieu séparateur du Ficoll@ pur et pour la séparation du doublet lymphocytes-érythroblastes du Ficoll@ dilué à 15-25% notamment à 20%. Le Ficoll@ pur présente avantageusement une densité de 1,083 et le Ficoll dilué de 1,069.
L'échantillon de sang est avantageusement dilué avec du PBS ou du sérum physiologique.
La figure 5A illustre un tube renfermant, de bas en haut, les couches de Ficoll pur (22), de Ficoll dilué (23) et de sang dilué (16). La figure 5B montre la séparation en différentes couches après centrifugation, à savoir de bas en haut, les couches de globules rouges (24), de Ficoll@ pur (22), d'érythroblastes (25), de Ficoll dilué (23), de lymphocytes (26) et de plasma (21).
Cette succession de couches constitue une caractéristique de l'invention et entre donc dans son champ de protection.
Le dépôt des couches successives est avantageusement réalisé selon les techniques de l'invention en procédant d'abord à l'introduction du milieu séparateur pur, puis du milieu séparateur dilué, et enfin du mélange de sang dilué, contenant le cas échéant un anti-agrégant.
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A l'aide des techniques d'extraction définies ci-dessus, le prélèvement de la bande recherchée est effectué de manière remarquablement simple.
Dans le cas par exemple d'une extraction opérée à partir de sang maternel prélevé entre la 14ième et la 17ième semaine de grossesse, l'examen microscopique de chaque bande montre les données suivantes : - un tapis de globules rouges en"rouleau formation"au fond, teintés en rouge, les lymphocytes représentent 10 à 30% des cellules nucléées ; leurs noyaux sont teintés en bleu par coloration MGG, - les érythroblastes foetaux et adultes représentent 60 à 80% des cellules nucléées dans la couche extraite. L'intensité optique de la couche avec les érythroblastes est proportionnelle à la concentration en érythroblastes et en globules rouges qui sont en nombre important, ce qui suggère la formation d'un complexe érythroblastes-globules rouges.
La technique de l'invention permet d'augmenter considérablement la concentration en érythroblastes dans cette couche, qui passe ainsi de 10-5 à 10-1 érythroblastes/globules rouges.
On peut encore améliorer la technique en activant le capillaire d'extraction ou de récupération soit pour fixer les cellules foetales en utilisant par exemple des (anticorps anti CD71, anti-hémoglobine foetale, anti-i...), soit en fixant les cellules maternelles contaminantes (anticorps anti-hémoglobine adulte, anti-I, et lectines par exemple Aplysia lectin gonad).
Compte tenu de similitudes entre les cellules cancéreuses et les cellules foetales, on peut étendre cette technique à l'isolement de cellules cancéreuses.
Ce procédé, permettant de fixer les cellules foetales ou d'éliminer les cellules adultes contaminantes par fixation, peut être généralisé à l'isolement par fixation des cellules
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cancéreuses (à l'aide d'anti-i) ou l'élimination des cellules saines contaminantes (à l'aide d'anti-I ou Aplysia Gonad Lectin) anti-I.
L'examen microscopique de ces cellules isolées a montré que ce complexe érythroblastes-globules rouges n'est pas une structure en"rouleau formation", ce qui explique la relative légèreté de cet ensemble par rapport à la très haute densité des globules rouges en"rouleau formation"déposés en fond de tube après séparation par gradient de densité.
La répétition de cette expérience sur 1 ml de sang de femme enceinte donne une très fine bande rouge au niveau de la localisation érythroblastique. Cette coloration rouge est due à quelques globules rouges co-migrants qui servent alors de traceurs et favorisent la localisation de cette couche.
Il est possible d'augmenter les rendements au niveau de la bande érythroblastique, en enrichissant le sang maternel prélevé par des érythroblastes exogènes servant de traceurs, par exemple du sang de reptile, d'oiseau, de batracien ou de chameau.
Les globules rouges piégés dans la"formation en rouleau" sont normaux, c'est-à-dire en forme de disque aplati. Cette forme particulière permet leur empilement. L'observation au microscope de,"globules rouges traceurs" (GRT) dans la couche érythroblatique montre qu'ils ont échappé au processus de "rouleau formation". Leurs formes sont caractéristiques, et sont pour la plupart sphériques ou en"poire". Les morphologies de tels GRT obtenus à partir de sang de patients ayant certaines anomalies des globules rouges permettent de caractériser les cellules vieillies ou malades, telles qu'observées par exemple dans les pathologies de Minkowsky, ou dans le cas de thalassémie, les cellules immatures ou celles présentant des anomalies de forme.
On notera que l'addition d'un anti-agrégant à l'échantillon sanguin permet d'obtenir une couche de globules rouges ayant
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réagi avec l'anti-agrégant, ce qui fournit des moyens d'étude de l'efficacité et du dosage des anti-agrégants sanguins pour le traitement des pathologies sanguines.
L'invention fournit ainsi les moyens de disposer des différents constituants du sang selon des quantités et des degrés de pureté permettant de réaliser des analyses et diagnostics dans des conditions particulièrement favorables.
L'invention vise ainsi notamment l'application des couches d'érythroblastes récupérées pour l'établissement de diagnostics pré-nataux de pathologies génétiques. Elle vise également l'utilisation des couches lymphocytaires récupérées par exemple dans des applications en cytaphérèse.
On donne ci-après à titre illustratif un exemple de séparation de sang au Ficoll@.
Préparation :
On utilise 4 ml de sang dilué à 50/50 dans 4 ml de PBS et du Ficoll pur de densité 1,083, et du Ficoll dilué à 20% pour obtenir une densité de 1,069.
On utilise 4 ml de sang dilué à 50/50 dans 4 ml de PBS et du Ficoll pur de densité 1,083, et du Ficoll dilué à 20% pour obtenir une densité de 1,069.
Dépôt des couches :
Dans un tube de 4 ml, on dépose - 4 ml de Ficoll@ de densité 1,083, - 2 ml de Ficoll de densité 1,069, et - 8 ml du sang dilué.
Dans un tube de 4 ml, on dépose - 4 ml de Ficoll@ de densité 1,083, - 2 ml de Ficoll de densité 1,069, et - 8 ml du sang dilué.
Séparation des couches :
On effectue une centrifugation à 600 g pendant 20 minutes.
On effectue une centrifugation à 600 g pendant 20 minutes.
On obtient de bas en haut : - des globules rouges séparés dans le culot du tube, - la couche de Ficoll de densité 1,083, - une couche d'érythroblastes en mélange avec des globules rouges situés dans la bande intermédiaire, d'environ 150 à 200 Ill, - la couche de Ficoll dilué de densité 1,069,
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- une couche de lymphocytes situés au-dessus de la couche de Ficoll dilué, surmontée, - d'une couche de plasma.
Extraction :
La couche contenant les constituants recherchés est extraite dans un maximum de 500 gl de Ficoll en utilisant les techniques d'extraction décrites ci-dessus et récupérée dans un tube conique.
La couche contenant les constituants recherchés est extraite dans un maximum de 500 gl de Ficoll en utilisant les techniques d'extraction décrites ci-dessus et récupérée dans un tube conique.
Lavage comprenant : - la dilution de la couche de produit, dans 2 ml de PBS + Albumine (FV) 0, 5 g/100 ml, - le mélange sous faible agitation, et - le culottage en centrifugeuse à 500 g pendant environ 7 minutes, suivi de la décantation du culot.
Ces étapes sont répétées si nécessaire.
Préparation du Produit aux fins d'analyse :
Le produit récupéré est remis en suspension dans PBS pur ou PBS-A, QSP 0,5 ml. On dépose 250 gl sur 2 lames de microscope, selon la technique habituelle de cytospin. Pour les besoins d'observation au microscope, on procède à une coloration selon la technique habituelle M. G. G.
Le produit récupéré est remis en suspension dans PBS pur ou PBS-A, QSP 0,5 ml. On dépose 250 gl sur 2 lames de microscope, selon la technique habituelle de cytospin. Pour les besoins d'observation au microscope, on procède à une coloration selon la technique habituelle M. G. G.
4-Exemples de séparations de constituants présents dans des mêlantes. Taux de purete des érythroblastes 10--a 10-
Les dispositifs et les procédés d'extraction définis cidessus sont avantageusement appliqués dans les domaines de la recherche, pour établir un diagnostic biologique, ou pour effectuer une analyse, ou d'une manière générale dans le domaine de la production industrielle, du médicament. On citera, à titre d'exemples, - les séparations d'ADN/ARN, en biochimie des protéines, la séparation des immunoglobulines sur gradient de sucrose selon Ito T. et al dans
Les dispositifs et les procédés d'extraction définis cidessus sont avantageusement appliqués dans les domaines de la recherche, pour établir un diagnostic biologique, ou pour effectuer une analyse, ou d'une manière générale dans le domaine de la production industrielle, du médicament. On citera, à titre d'exemples, - les séparations d'ADN/ARN, en biochimie des protéines, la séparation des immunoglobulines sur gradient de sucrose selon Ito T. et al dans
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Pediatr. Nephrol. 15 Nov. 2000 (1-2) : 90-5, de macromolécules complexes selon Hutchinson W. L. et al dans Mol. Med. 6 juin 2000 (6) : 482-483, des enzymes de haut poids moléculaire sur gradient de glycérol selon Mo J. et al dans Biochemistry 20 juin 2000 ; 39 (24) : 7245-54, de protéines membranaires sur gradient de sucrose selon Geng L. et al dans Biochim. Biophys. Acta 15 Dec. 2000 ; 1535 (1) : 21-35, - les séparations d'organites ou fractions (cellulaires, bactériennes, parasitaires dont oocytes, mycosiques ou virales) sur gradient de Percoll@ (Pertoft H., J Biochem Biophys Methods 10 juillet 2000 ; 44 (1-2) : 1-30), de cellules, d'immuns complexes, de lipoprotéines selon Bakalova R. A. et al, Gen.
Physio. Biophys. 2000 March 19 (1) : 103-13, de différents mucus sur gradient de chlorure de césium selon Montagné L. et al, J. Dairy Sci 2000 Mars ; 83 (3) : 507-17, de drogues naturelles, de produits de synthèse partielle ou totale, - en cytologie et cancérologie, l'isolement de cellules cancéreuses de la prostate à partir de sang total (Wang Z. P. et al, Cancer 2000,15 juin ; 88 (12) : 2787-95), en biologie de la reproduction, la séparation de spermatozoïdes (Zini A. et al, Urology 20 décembre 2000 ; 56 (6) : 1081-4), en galénique, la séparation de liposomes, émulsions, micelles, lipocores, nanocapsules (Perkins W. R. et al, Int. J. Pharm. 25 avril 2000 ; 200 (1) : 27-39 ou Mosqueira V. C., J. Pharm. Sci., Mai 2000 ; 89 (5) : 614-26), - en zoologie, l'isolement des ovocytes de Xénope (Richter H. P. et al, Biol. Cell. 1995 ; 84 (3) : 129-38), - en parasitologie, l'isolement des oeufs de Opisthorchis viverrini (J. Helminthol. Décembre 1998 ; 72 (4) : 359-61, l'isolement de Dirofilaria immitis (Exp. Parasitol, Août
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1995 ; 81 (1) : 63-71 ; la séparation du mucus de porc infecté par Ascaris suum (Vet. Parasitol. Sept. 1988 ; 29 (2-3) : 143-58).
A titre indicatif, on rapporte ci-après des exemples de gradients tels que donnés dans Centrifuge (a) 2nd édition, A practical approach, D. Rickwood (Ed. ) Kontron (1987) selon les produits à séparer.
(Dans les tableaux suivants, l'indication (ex.) signifie par exemple , et (pdt) pendant ) Tableau 1. Applications de différents types de gradient isopycnique
<tb>
<tb> Gradient <SEP> ADN <SEP> ARN <SEP> Nucléo- <SEP> Membranes <SEP> Organites <SEP> Cellules <SEP> Virus
<tb> proteines <SEP> subcellulaires
<tb> Sucre <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> +
<tb> (ex., <SEP> sucrose)
<tb> Polysaccharides <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> +
<tb> (ex.,Ficoll#)
<tb> Sels <SEP> de <SEP> métaux <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP> + <SEP> +
<tb> alcalins <SEP> +
<tb> (ex., <SEP> CsCl)
<tb> Silice <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> +
<tb> Colloidale
<tb> (ex., <SEP> Percoll)
<tb> Composés <SEP> non-+ <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> +
<tb> ioniques <SEP> iodés
<tb> (ex., <SEP> Nycodenz#)
<tb>
<tb> Gradient <SEP> ADN <SEP> ARN <SEP> Nucléo- <SEP> Membranes <SEP> Organites <SEP> Cellules <SEP> Virus
<tb> proteines <SEP> subcellulaires
<tb> Sucre <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> +
<tb> (ex., <SEP> sucrose)
<tb> Polysaccharides <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> +
<tb> (ex.,Ficoll#)
<tb> Sels <SEP> de <SEP> métaux <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP> + <SEP> +
<tb> alcalins <SEP> +
<tb> (ex., <SEP> CsCl)
<tb> Silice <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> +
<tb> Colloidale
<tb> (ex., <SEP> Percoll)
<tb> Composés <SEP> non-+ <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> +
<tb> ioniques <SEP> iodés
<tb> (ex., <SEP> Nycodenz#)
<tb>
La classification est comme suit : + + + bon ; + + satisfaisant ; + application limitée; - inapplicable Tableau 2. Densités apparentes de particules biologiques dans des solutions de sucrose
<tb>
<tb> Particules <SEP> Gradient <SEP> Conditions <SEP> de <SEP> Densité <SEP> apparente
<tb> Centrifugation <SEP> (g/cm")
<tb> Membranes <SEP> plasma-sucrose <SEP> 100 <SEP> 000 <SEP> g <SEP> pdt <SEP> 1,5 <SEP> h <SEP> 1. <SEP> 13-1. <SEP> 18
<tb> tiques <SEP> du <SEP> foie
<tb> Lysosomes <SEP> sucrose) <SEP> 1. <SEP> 21-1. <SEP> 22
<tb> Mitochondries <SEP> sucrose) <SEP> 59 <SEP> 000 <SEP> g <SEP> pdt <SEP> 4 <SEP> h <SEP> 1.19
<tb> Peroxisomes <SEP> sucrose) <SEP> 1.23
<tb> Plantes <SEP> peroxisomes <SEP> sucrose) <SEP> 1. <SEP> 25
<tb> Thylacoides <SEP> sucrose) <SEP> 65 <SEP> 000 <SEP> g <SEP> pdt <SEP> 4 <SEP> h <SEP> 1.17
<tb> Chloroplastes <SEP> sucrose) <SEP> 1.22
<tb> Chromatine <SEP> sucrose/glucose <SEP> 50 <SEP> 000 <SEP> g <SEP> pdt <SEP> 40 <SEP> h <SEP> 1.36
<tb> Informosomes <SEP> sucrose/D2O <SEP> 180 <SEP> 000 <SEP> g <SEP> pdt <SEP> 20 <SEP> h <SEP> 1.29
<tb> Virus <SEP> sarcome <SEP> murin <SEP> sucrose <SEP> 65 <SEP> 000 <SEP> g <SEP> pdt <SEP> 1 <SEP> h <SEP> 1.16
<tb> Virus <SEP> tumeurs <SEP> sucrose <SEP> 240 <SEP> 000 <SEP> g <SEP> pdt <SEP> 1 <SEP> h <SEP> 1.17
<tb> mammaire <SEP> murin
<tb> Virus <SEP> canin <SEP> sucrose <SEP> 88 <SEP> 000 <SEP> g <SEP> pdt <SEP> 16 <SEP> h <SEP> 1.20
<tb>
<tb> Particules <SEP> Gradient <SEP> Conditions <SEP> de <SEP> Densité <SEP> apparente
<tb> Centrifugation <SEP> (g/cm")
<tb> Membranes <SEP> plasma-sucrose <SEP> 100 <SEP> 000 <SEP> g <SEP> pdt <SEP> 1,5 <SEP> h <SEP> 1. <SEP> 13-1. <SEP> 18
<tb> tiques <SEP> du <SEP> foie
<tb> Lysosomes <SEP> sucrose) <SEP> 1. <SEP> 21-1. <SEP> 22
<tb> Mitochondries <SEP> sucrose) <SEP> 59 <SEP> 000 <SEP> g <SEP> pdt <SEP> 4 <SEP> h <SEP> 1.19
<tb> Peroxisomes <SEP> sucrose) <SEP> 1.23
<tb> Plantes <SEP> peroxisomes <SEP> sucrose) <SEP> 1. <SEP> 25
<tb> Thylacoides <SEP> sucrose) <SEP> 65 <SEP> 000 <SEP> g <SEP> pdt <SEP> 4 <SEP> h <SEP> 1.17
<tb> Chloroplastes <SEP> sucrose) <SEP> 1.22
<tb> Chromatine <SEP> sucrose/glucose <SEP> 50 <SEP> 000 <SEP> g <SEP> pdt <SEP> 40 <SEP> h <SEP> 1.36
<tb> Informosomes <SEP> sucrose/D2O <SEP> 180 <SEP> 000 <SEP> g <SEP> pdt <SEP> 20 <SEP> h <SEP> 1.29
<tb> Virus <SEP> sarcome <SEP> murin <SEP> sucrose <SEP> 65 <SEP> 000 <SEP> g <SEP> pdt <SEP> 1 <SEP> h <SEP> 1.16
<tb> Virus <SEP> tumeurs <SEP> sucrose <SEP> 240 <SEP> 000 <SEP> g <SEP> pdt <SEP> 1 <SEP> h <SEP> 1.17
<tb> mammaire <SEP> murin
<tb> Virus <SEP> canin <SEP> sucrose <SEP> 88 <SEP> 000 <SEP> g <SEP> pdt <SEP> 16 <SEP> h <SEP> 1.20
<tb>
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Tableau 3. Densités apparentes de cellules et virus dans des crradients de Ficoll@
<tb>
<tb> Particules <SEP> Conditions <SEP> de <SEP> Densité <SEP> apparente
<tb> Centrifugation <SEP> (g/cm3)
<tb> Membranes <SEP> 100 <SEP> 000 <SEP> g <SEP> pdt <SEP> 16 <SEP> h <SEP> 1. <SEP> 05
<tb> Chromatophores <SEP> 195 <SEP> 000 <SEP> g <SEP> pdt <SEP> 36 <SEP> h <SEP> 1.07
<tb> Vésicules <SEP> de <SEP> cerveau <SEP> 21 <SEP> 000 <SEP> g <SEP> pdt <SEP> 15 <SEP> min <SEP> Mitochondrie <SEP> 80 <SEP> 000 <SEP> g <SEP> pdt <SEP> 2 <SEP> h <SEP> 1. <SEP> 136
<tb> Cellules <SEP> hépatiques6 <SEP> 000 <SEP> g <SEP> pdt <SEP> 2 <SEP> h1. <SEP> 10-1. <SEP> 15
<tb> Cellules <SEP> fibroblastes <SEP> 8 <SEP> 000 <SEP> g <SEP> pdt <SEP> 60 <SEP> min <SEP> 1. <SEP> 05
<tb> Cellules <SEP> d'ascites <SEP> d'Ehrlich1 <SEP> 400 <SEP> g <SEP> pdt <SEP> 45 <SEP> min <SEP> 1. <SEP> 07
<tb> Virus <SEP> de <SEP> tumeurs <SEP> mammaires <SEP> 59 <SEP> 000 <SEP> g <SEP> pdt <SEP> 60 <SEP> min <SEP> 1.14
<tb>
<tb> Particules <SEP> Conditions <SEP> de <SEP> Densité <SEP> apparente
<tb> Centrifugation <SEP> (g/cm3)
<tb> Membranes <SEP> 100 <SEP> 000 <SEP> g <SEP> pdt <SEP> 16 <SEP> h <SEP> 1. <SEP> 05
<tb> Chromatophores <SEP> 195 <SEP> 000 <SEP> g <SEP> pdt <SEP> 36 <SEP> h <SEP> 1.07
<tb> Vésicules <SEP> de <SEP> cerveau <SEP> 21 <SEP> 000 <SEP> g <SEP> pdt <SEP> 15 <SEP> min <SEP> Mitochondrie <SEP> 80 <SEP> 000 <SEP> g <SEP> pdt <SEP> 2 <SEP> h <SEP> 1. <SEP> 136
<tb> Cellules <SEP> hépatiques6 <SEP> 000 <SEP> g <SEP> pdt <SEP> 2 <SEP> h1. <SEP> 10-1. <SEP> 15
<tb> Cellules <SEP> fibroblastes <SEP> 8 <SEP> 000 <SEP> g <SEP> pdt <SEP> 60 <SEP> min <SEP> 1. <SEP> 05
<tb> Cellules <SEP> d'ascites <SEP> d'Ehrlich1 <SEP> 400 <SEP> g <SEP> pdt <SEP> 45 <SEP> min <SEP> 1. <SEP> 07
<tb> Virus <SEP> de <SEP> tumeurs <SEP> mammaires <SEP> 59 <SEP> 000 <SEP> g <SEP> pdt <SEP> 60 <SEP> min <SEP> 1.14
<tb>
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Tableau 4. Densités apparentes de particules biologiques dans des crradients iodés (Hinton R. H. et Mullock B. M. (1976), Rickwood D. (ed. ), iIRL press, Oxford et
Washington et Rickwood D., ed. (1983), IRL press
Oxford et Washington
Washington et Rickwood D., ed. (1983), IRL press
Oxford et Washington
<tb>
<tb> Particules <SEP> Conditions <SEP> de <SEP> Densité <SEP> apparente
<tb> Centrifugation <SEP> (g/cm3)
<tb> metri-zoate <SEP> metri-zamide <SEP> Nycodenz <SEP> (S)
<tb> ADN <SEP> Natif <SEP> 65 <SEP> 000 <SEP> g <SEP> pdt <SEP> 44 <SEP> h <SEP> 1. <SEP> 13 <SEP> 1.11 <SEP> 1.13
<tb> ADN <SEP> dénaturé <SEP> 65 <SEP> 000 <SEP> g <SEP> pdt <SEP> 44 <SEP> h <SEP> 1.14 <SEP> 1. <SEP> 14 <SEP> 1. <SEP> 17
<tb> ARN <SEP> 000 <SEP> g <SEP> pdt <SEP> 44 <SEP> h <SEP> 1. <SEP> 23 <SEP> 1.17 <SEP> 1.18
<tb> Proteines <SEP> 163 <SEP> h
<tb> hémoglobine <SEP> 1.27
<tb> catalase <SEP> 1.29
<tb> b-alactosidase <SEP> 1. <SEP> 25
<tb> albumine <SEP> sérique <SEP> 1.22
<tb> Polysaccharides <SEP> 80 <SEP> 000 <SEP> g <SEP> pdt <SEP> 48 <SEP> h
<tb> glycogene <SEP> 1. <SEP> 48 <SEP> 1.28 <SEP> 1.29
<tb> dextrane <SEP> bleu <SEP> 1.19 <SEP> 1.19
<tb> acide <SEP> 1. <SEP> 10
<tb> hyaluronique
<tb> chondroi <SEP> tine <SEP> 1.08
<tb> sulphate
<tb> Nucléoprotéines <SEP> 150 <SEP> 000 <SEP> g <SEP> pdt <SEP> 68 <SEP> h
<tb> polysomes <SEP> 1.34 <SEP> 1.33
<tb> ARN <SEP> messager <SEP> 1.21
<tb> ribosomes <SEP> 80S <SEP> 1. <SEP> 33 <SEP> 1. <SEP> 30
<tb> chromatine <SEP> 1. <SEP> 20 <SEP> 1. <SEP> 16-1. <SEP> 20 <SEP> 1. <SEP> 17-1.19
<tb> chromosomes <SEP> 1.19 <SEP> 1.24 <SEP> 1.29
<tb> métaphase
<tb> Organites <SEP> tes <SEP> 100 <SEP> 000 <SEP> g <SEP> pdt <SEP> 16 <SEP> h
<tb> membranes <SEP> 1. <SEP> 14-1. <SEP> 26 <SEP> 1. <SEP> 11-1.19
<tb> lysosomes <SEP> 1.15 <SEP> 1.13 <SEP> 1.15
<tb> mitochondries <SEP> 1.16 <SEP> 1.17
<tb> peroxisomes <SEP> 1.22 <SEP> 1.22
<tb> noyaux <SEP> 1.23
<tb> nucléole <SEP> 1.24
<tb> Cellules <SEP> 10 <SEP> 000 <SEP> g <SEP> pdt <SEP> 30 <SEP> mi
<tb> lymphocytes <SEP> 1.07 <SEP> 1.07
<tb> erythrocytes <SEP> 1. <SEP> 15 <SEP> 1. <SEP> 11
<tb> parenchyme <SEP> 1.12 <SEP> 1.14
<tb> hépatique
<tb> Vi <SEP> 200 <SEP> 000 <SEP> g <SEP> pdt <SEP> 18 <SEP> h
<tb> poliovirus <SEP> 1. <SEP> 29 <SEP> 1. <SEP> 31 <SEP> 1. <SEP> 30
<tb> virus <SEP> coxsackie <SEP> 1.18 <SEP> 1.18
<tb> virus <SEP> Semliki <SEP> 1.20 <SEP> 1. <SEP> 18
<tb> Forest
<tb> virus <SEP> de <SEP> la <SEP> 1.14
<tb> maladie <SEP> de
<tb> Newcastle <SEP> disease
<tb> bactériophage <SEP> T7 <SEP> 1. <SEP> 27
<tb>
<tb> Particules <SEP> Conditions <SEP> de <SEP> Densité <SEP> apparente
<tb> Centrifugation <SEP> (g/cm3)
<tb> metri-zoate <SEP> metri-zamide <SEP> Nycodenz <SEP> (S)
<tb> ADN <SEP> Natif <SEP> 65 <SEP> 000 <SEP> g <SEP> pdt <SEP> 44 <SEP> h <SEP> 1. <SEP> 13 <SEP> 1.11 <SEP> 1.13
<tb> ADN <SEP> dénaturé <SEP> 65 <SEP> 000 <SEP> g <SEP> pdt <SEP> 44 <SEP> h <SEP> 1.14 <SEP> 1. <SEP> 14 <SEP> 1. <SEP> 17
<tb> ARN <SEP> 000 <SEP> g <SEP> pdt <SEP> 44 <SEP> h <SEP> 1. <SEP> 23 <SEP> 1.17 <SEP> 1.18
<tb> Proteines <SEP> 163 <SEP> h
<tb> hémoglobine <SEP> 1.27
<tb> catalase <SEP> 1.29
<tb> b-alactosidase <SEP> 1. <SEP> 25
<tb> albumine <SEP> sérique <SEP> 1.22
<tb> Polysaccharides <SEP> 80 <SEP> 000 <SEP> g <SEP> pdt <SEP> 48 <SEP> h
<tb> glycogene <SEP> 1. <SEP> 48 <SEP> 1.28 <SEP> 1.29
<tb> dextrane <SEP> bleu <SEP> 1.19 <SEP> 1.19
<tb> acide <SEP> 1. <SEP> 10
<tb> hyaluronique
<tb> chondroi <SEP> tine <SEP> 1.08
<tb> sulphate
<tb> Nucléoprotéines <SEP> 150 <SEP> 000 <SEP> g <SEP> pdt <SEP> 68 <SEP> h
<tb> polysomes <SEP> 1.34 <SEP> 1.33
<tb> ARN <SEP> messager <SEP> 1.21
<tb> ribosomes <SEP> 80S <SEP> 1. <SEP> 33 <SEP> 1. <SEP> 30
<tb> chromatine <SEP> 1. <SEP> 20 <SEP> 1. <SEP> 16-1. <SEP> 20 <SEP> 1. <SEP> 17-1.19
<tb> chromosomes <SEP> 1.19 <SEP> 1.24 <SEP> 1.29
<tb> métaphase
<tb> Organites <SEP> tes <SEP> 100 <SEP> 000 <SEP> g <SEP> pdt <SEP> 16 <SEP> h
<tb> membranes <SEP> 1. <SEP> 14-1. <SEP> 26 <SEP> 1. <SEP> 11-1.19
<tb> lysosomes <SEP> 1.15 <SEP> 1.13 <SEP> 1.15
<tb> mitochondries <SEP> 1.16 <SEP> 1.17
<tb> peroxisomes <SEP> 1.22 <SEP> 1.22
<tb> noyaux <SEP> 1.23
<tb> nucléole <SEP> 1.24
<tb> Cellules <SEP> 10 <SEP> 000 <SEP> g <SEP> pdt <SEP> 30 <SEP> mi
<tb> lymphocytes <SEP> 1.07 <SEP> 1.07
<tb> erythrocytes <SEP> 1. <SEP> 15 <SEP> 1. <SEP> 11
<tb> parenchyme <SEP> 1.12 <SEP> 1.14
<tb> hépatique
<tb> Vi <SEP> 200 <SEP> 000 <SEP> g <SEP> pdt <SEP> 18 <SEP> h
<tb> poliovirus <SEP> 1. <SEP> 29 <SEP> 1. <SEP> 31 <SEP> 1. <SEP> 30
<tb> virus <SEP> coxsackie <SEP> 1.18 <SEP> 1.18
<tb> virus <SEP> Semliki <SEP> 1.20 <SEP> 1. <SEP> 18
<tb> Forest
<tb> virus <SEP> de <SEP> la <SEP> 1.14
<tb> maladie <SEP> de
<tb> Newcastle <SEP> disease
<tb> bactériophage <SEP> T7 <SEP> 1. <SEP> 27
<tb>
<Desc/Clms Page number 26>
Tableau 5. Densité et conditions de séparation pour l'isolement de cellules, Virus et particules subcellulaires dans un gradient de Percoll@ (Wakefield J. S. J. et al (1982) Biochem. J., 202, 795 ; Pertfot H. et al, (1979)
Pergamon press, Londres et New York, p 67 ; et Pertoft
H. et al (1979) Biochem. Vol. 9, Reid E. (ed.), Ellis
Horwood, Chichester, p. 67.
Pergamon press, Londres et New York, p 67 ; et Pertoft
H. et al (1979) Biochem. Vol. 9, Reid E. (ed.), Ellis
Horwood, Chichester, p. 67.
<tb>
<tb>
<tb>
Particules <SEP> Densité <SEP> de <SEP> Solution <SEP> Densité <SEP> Mode <SEP> opératoire
<tb> départ <SEP> obtenue
<tb> (g/cm3) <SEP> (g/cm3)
<tb> Oranites
<tb> membranes <SEP> 1. <SEP> 04 <SEP> sucrose <SEP> 1.02 <SEP> plasmiques <SEP> 1.03
<tb> microsomes <SEP> 1.05 <SEP> sucrose <SEP> 1. <SEP> 03-
<tb> 1.05
<tb> peroxisomes <SEP> min
<tb> 1.07
<tb> mitochondries <SEP> min
<tb> 1.11
<tb> lysosomes <SEP> 1.05 <SEP> sucrose <SEP> 1. <SEP> 04 <SEP> - <SEP> 50 <SEP> 000 <SEP> g <SEP> pdt <SEP> 45 <SEP> min
<tb> 1.07
<tb> 1. <SEP> 08-
<tb> 1.11
<tb> synaptosomes <SEP> 1.04 <SEP> sucrose <SEP> 1. <SEP> 04-50 <SEP> 000 <SEP> g <SEP> pdt <SEP> 45 <SEP> min
<tb> 1.06
<tb> noyaux <SEP> 10 <SEP> sucrose <SEP> 1.08 <SEP> - <SEP> 100 <SEP> 000 <SEP> g <SEP> pdt <SEP> 60 <SEP> min
<tb> 1.12
<tb> granules <SEP> Préformé <SEP> sucrose <SEP> 1. <SEP> 06-10 <SEP> 000 <SEP> g <SEP> pdt <SEP> 30 <SEP> min
<tb> chromaffines <SEP> 1.07
<tb> Cellules <SEP> hépatiques <SEP> de
<tb> rat
<tb> hépatocytes <SEP> min
<tb> Eagle
<tb> Cellules <SEP> de <SEP> 1. <SEP> 06 <SEP> Gradient <SEP> 1.05-1.06 <SEP> min
<tb> Kupffer <SEP> Eagle
<tb> Cellules <SEP> de <SEP> sang
<tb> humain
<tb> thrombocytes <SEP> 1.04-1. <SEP> 06
<tb> lymphocytes) <SEP> 1.090 <SEP> Tampon <SEP> 1.06-1. <SEP> 08
<tb> Hepes-NaOH
<tb> granulocytes <SEP> 1.08-1. <SEP> 09
<tb> erythrocytes <SEP> ) <SEP> 1.09-1. <SEP> 10
<tb> Cellules <SEP> testiculaires
<tb> cellules <SEP> de <SEP> Leydig <SEP> Préformé <SEP> sucrose <SEP> 1. <SEP> 06)
<tb> spermatides <SEP> Préformé <SEP> sucrose <SEP> 1. <SEP> 04) <SEP> 800 <SEP> g <SEP> pdt <SEP> 20 <SEP> min
<tb> Bactéries
<tb> E. <SEP> Coli <SEP> 1. <SEP> 10 <SEP> PBS <SEP> 1. <SEP> 13 <SEP> 30 <SEP> 000 <SEP> g <SEP> pdt <SEP> 20 <SEP> min
<tb> Virus
<tb> virus <SEP> de <SEP> la <SEP> 1.06 <SEP> sucrose <SEP> 1.06 <SEP> 100 <SEP> 000 <SEP> g <SEP> pdt <SEP> 45 <SEP> min
<tb> mosaïque <SEP> du <SEP> tabac
<tb> virus <SEP> avortif <SEP> 1.10 <SEP> 0. <SEP> 01 <SEP> M <SEP> 1.08 <SEP> 40 <SEP> 000 <SEP> g <SEP> pdt <SEP> 45 <SEP> min
<tb> équin <SEP> tris-HCL
<tb> virus <SEP> influenza <SEP> 1.05 <SEP> 0.01 <SEP> M <SEP> 1.06 <SEP> 25 <SEP> 000 <SEP> g <SEP> pdt <SEP> 25 <SEP> min
<tb> tris-HCL
<tb> rotavirus <SEP> 1.10 <SEP> sucrose <SEP> 1.08 <SEP> 50 <SEP> 000 <SEP> g <SEP> pdt <SEP> 45 <SEP> min
<tb>
<tb> départ <SEP> obtenue
<tb> (g/cm3) <SEP> (g/cm3)
<tb> Oranites
<tb> membranes <SEP> 1. <SEP> 04 <SEP> sucrose <SEP> 1.02 <SEP> plasmiques <SEP> 1.03
<tb> microsomes <SEP> 1.05 <SEP> sucrose <SEP> 1. <SEP> 03-
<tb> 1.05
<tb> peroxisomes <SEP> min
<tb> 1.07
<tb> mitochondries <SEP> min
<tb> 1.11
<tb> lysosomes <SEP> 1.05 <SEP> sucrose <SEP> 1. <SEP> 04 <SEP> - <SEP> 50 <SEP> 000 <SEP> g <SEP> pdt <SEP> 45 <SEP> min
<tb> 1.07
<tb> 1. <SEP> 08-
<tb> 1.11
<tb> synaptosomes <SEP> 1.04 <SEP> sucrose <SEP> 1. <SEP> 04-50 <SEP> 000 <SEP> g <SEP> pdt <SEP> 45 <SEP> min
<tb> 1.06
<tb> noyaux <SEP> 10 <SEP> sucrose <SEP> 1.08 <SEP> - <SEP> 100 <SEP> 000 <SEP> g <SEP> pdt <SEP> 60 <SEP> min
<tb> 1.12
<tb> granules <SEP> Préformé <SEP> sucrose <SEP> 1. <SEP> 06-10 <SEP> 000 <SEP> g <SEP> pdt <SEP> 30 <SEP> min
<tb> chromaffines <SEP> 1.07
<tb> Cellules <SEP> hépatiques <SEP> de
<tb> rat
<tb> hépatocytes <SEP> min
<tb> Eagle
<tb> Cellules <SEP> de <SEP> 1. <SEP> 06 <SEP> Gradient <SEP> 1.05-1.06 <SEP> min
<tb> Kupffer <SEP> Eagle
<tb> Cellules <SEP> de <SEP> sang
<tb> humain
<tb> thrombocytes <SEP> 1.04-1. <SEP> 06
<tb> lymphocytes) <SEP> 1.090 <SEP> Tampon <SEP> 1.06-1. <SEP> 08
<tb> Hepes-NaOH
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<tb> Cellules <SEP> testiculaires
<tb> cellules <SEP> de <SEP> Leydig <SEP> Préformé <SEP> sucrose <SEP> 1. <SEP> 06)
<tb> spermatides <SEP> Préformé <SEP> sucrose <SEP> 1. <SEP> 04) <SEP> 800 <SEP> g <SEP> pdt <SEP> 20 <SEP> min
<tb> Bactéries
<tb> E. <SEP> Coli <SEP> 1. <SEP> 10 <SEP> PBS <SEP> 1. <SEP> 13 <SEP> 30 <SEP> 000 <SEP> g <SEP> pdt <SEP> 20 <SEP> min
<tb> Virus
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<tb> tris-HCL
<tb> rotavirus <SEP> 1.10 <SEP> sucrose <SEP> 1.08 <SEP> 50 <SEP> 000 <SEP> g <SEP> pdt <SEP> 45 <SEP> min
<tb>
Claims (27)
1/Dispositif d'extraction d'une ou plusieurs bandes renfermant les produits ou constituants recherchés à partir d'un tube d'analyse (1) comportant une pluralité de bandes distinctes, contigües ou chevauchantes, en milieu liquide, formant un gradient continu ou discontinu de densité (2), caractérisé en ce qu'il comprend : - un tube d'analyse (1) standard, - un tube ou capillaire d'extraction (3), pré-positionnable en fonction de la couche à extraire, et - des moyens pour obtenir un écoulement laminaire d'une ou plusieurs bandes du tube sans aspiration, soit par surpression appliquée sur le dessus du milieu liquide avec un fluide, gaz ou liquide de faible densité, soit en exerçant une force centrifuge.
2/Dispositif selon la revendication 1, caractérisé en ce que les moyens capables d'exercer une surpression comprennent un bouchon (4) destiné à fermer de manière hermétique le tube d'analyse et un tube de surpression (5) d'entrée dudit fluide, l'ensemble formant avec le capillaire d'extraction (3) et le gradient de densité (2) un système hermétiquement clos au moment de l'extraction.
3/Dispositif selon la revendication 2, caractérisé en ce que lesdits moyens de surpression comprennent un élément dont le déplacement assure une variation de volume de la phase gazeuse dans la partie de tête du tube d'analyse (1), tel qu'un piston, une membrane ou un bouchon.
4/Dispositif selon la revendication 1, caractérisé en ce que les moyens capables d'exercer une surpression comprennent un bouchon (4) destiné à fermer de manière hermétique le tube d'analyse (1) et un élément chauffant placé dans la partie
<Desc/Clms Page number 28>
supérieure du tube ou dans le bouchon, provoquant la dilatation de la phase gazeuse de manière à obtenir la surpression.
5/Dispositif selon le revendication 1, caractérisé en ce que lesdits moyens capables d'exercer une force centrifuge comprennent un tube support (8) pouvant être placé avec le tube d'analyse (1) dans une centrifugeuse, et logé dans le tube support (8), un capillaire de récupération (9) avec une branche de retour (10), spiralée ou droite, ce système étant raccordé au capillaire d'extraction (3), comportant le cas échéant un robinet (6), et capable de constituer un siphon par rapport à ce capillaire, et de contenir la totalité des bandes présentes dans le tube d'analyse situées au-dessus de l'embouchure du capillaire d'extraction, ledit tube d'analyse comportant le cas échéant une masse formant piston.
6/Dispositif selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que le capillaire d'extraction (3) est apte à être positionné à hauteur variable dans le milieu d'analyse, verticalement ou non, ou en variante est fixé à l'intérieur ou à l'extérieur du tube.
7/Dispositif selon la revendication 6, caractérisé en ce que le capillaire d'extraction (3) est muni d'un robinet (6) ou est associé à un capillaire de récupération (7), spiralé ou droit.
8/Dispositif selon la revendication 6 ou 7, caractérisé en ce que le capillaire d'extraction (3) ou de récupération (7) est marqué ou gravé par des repères à des positions déterminées en fonction du positionnement attendu de la ou des fractions, et est éventuellement sécable au niveau des repères.
9/Dispositif selon l'une quelconque des revendication 6 à 8, caractérisé en ce que l'intérieur du capillaire d'extraction (3) ou de récupération (7) est garni totalement ou partiellement d'un ou de plusieurs réactifs physiques, chimiques ou biologiques.
<Desc/Clms Page number 29>
10/Dispositif selon l'une quelconque de revendications 1 à 9, caractérisé en ce que le tube d'analyse (1) comprend au moins deux bandes conductrices soumises à une différence de potentiel, ou en variante est placé dans un champ magnétique.
11/Procédé d'extraction spécifique d'une ou plusieurs bandes renfermant les produits ou constituants recherchés dans un tube d'analyse comportant une pluralité de bandes distinctes, contigües ou chevauchantes, en milieu liquide, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : - on introduit dans un tube d'analyse standard un capillaire d'extraction au moyen d'un guide assurant son positionnement dans l'espace à la hauteur voulue par rapport à la bande à extraire, ou en variante on utilise un tube d'analyse avec un capillaire pré-positionné à la hauteur voulue, situé à l'intérieur ou en partie à l'extérieur du tube, on applique des moyens pour obtenir un écoulement laminaire sans aspiration, soit par surpression par le dessus du milieu liquide avec un gaz ou un fluide de faible densité, soit en exerçant une force centrifuge.
12/Procédé selon la revendication 11, caractérisé en ce qu'on assure l'écoulement laminaire de la bande à récupérer vers un capillaire d'extraction, en exerçant une surpression dans le tube d'analyse hermétiquement fermé, et on récupère la bande désirée à partir du capillaire d'extraction, l'opération étant continuée pour obtenir d'autres bandes si souhaité, en allant successivement de bas en haut de la bande la plus dense à la bande la moins dense, sans re-mélange.
13/Procédé selon la revendication 11, caractérisé en ce que la surpression est obtenue par variation de pression, en injectant un fluide dans le tube d'analyse par l'intermédiaire d'un tube, par variation de volume, en déplaçant un élément tel que piston, membrane ou bouchon mobile dans la partie de tête du tube d'analyse, ou par variation de température, en chauffant le
<Desc/Clms Page number 30>
contenu du tube d'analyse pour provoquer la dilatation de sa partie de tête.
14/Procédé selon l'une quelconque des revendications 11 à 13, caractérisé en ce qu'on raccorde un capillaire récupérateur au capillaire d'extraction pour retenir spécifiquement une partie ou un constituant de la fraction, ou un contaminant.
15/Procédé selon l'une quelconque des revendications 11 à 14, caractérisé en ce qu'on introduit dans le capillaire d'extraction ou dans le capillaire de récupération des réactifs chimiques, physiques ou biologiques.
16/Procédé selon la revendication 11, caractérisé en ce qu'on assure l'écoulement laminaire de la bande à récupérer en exerçant une force centrifuge, en plaçant un tube support comportant un capillaire de récupération de fraction dans une centrifugeuse à côté du tube d'analyse, le capillaire de récupération étant raccordé au capillaire d'extraction, et en soumettant les deux tubes à une force centrifuge assurant le passage des bandes situées au-dessus de l'embouchure du capillaire d'extraction dans le capillaire de récupération, l'opération étant appliquée avec des durées différentes à d'autres bandes, si souhaité.
17/Procédé selon l'une quelconque des revendications 11 à 16, caractérisé en ce qu'on réalise l'extraction en présence d'un champ électrique ou d'un champ magnétique.
18/Procédé selon l'une quelconque des revendications 11 à 17, caractérisé en ce qu'il est appliqué à des couches séparées dans du Ficoll@, Percoll@, glucose, chlorure de césium, albumine, polyvinylpyrrolidone, glycérol ou silice colloïdale.
19/Dispositif selon l'une quelconque des revendications 1 à 10, caractérisé en ce qu'il est associé à un dispositif pour l'injection dans un tube d'analyse (1) de produits, sous forme de couches successives, par introduction de quantités pré-
<Desc/Clms Page number 31>
déterminées de produits ou de liquides avec des densités différentes, caractérisé en ce que le tube d'analyse (1) comprend des moyens d'injection permettant l'arrivée tangentielle des produits en quantités pré-déterminées.
20/Dispositif selon la revendication 19, caractérisé en ce que les moyens d'injection sont constitués par un capillaire (11) solidaire de la paroi interne du tube d'analyse, comportant des encoches perpendiculaires (12) au tube d'analyse (1), à des hauteurs pré-établies en fonction des quantités de produits à injecter dans le tube d'analyse, ce qui permet une arrivée tangentielle de produit à la surface de la couche précédente.
21/Dispositif selon la revendication 19, caractérisé en ce que les moyens d'injection sont constitués par une aiguille d'injection (13) dont la hauteur de pénétration dans le tube est prédéterminée et/ou comportant un embout d'injection tangentielle (14).
22/Procédé selon l'une quelconque des revendications 11 à 18, caractérisé en ce qu'il comporte en outre une étape d'injection dans un tube d'analyse de produits sous forme de couches successives, caractérisé par l'introduction de quantités pré-déterminées desdits produits de manière à assurer une arrivée tangentielle de ces produits sur la couche précédente, en procédant à l'injection dans le tube, à l'aide d'une pipette ou d'un distributeur calibrateur, des quantités requises de produits ou de liquides pour une couche donnée, de manière à amener le produit tangentiellement à la surface de la couche précédente ou, en variante, on introduit dans le tube d'analyse une aiguille avec un embout d'injection tangentielle, la hauteur de pénétration étant pré-déterminée selon la hauteur des couches préalablement formées.
23/Application de dispositif selon l'une quelconque des revendications 1 à 10 et/ou du procédé selon l'une quelconque des revendications 11 à 18 à l'extraction d'une couche ou de
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plusieurs couches de constituants d'un mélange sanguin dans un milieu séparateur contenant le cas échéant un anti-agrégant.
24/Application selon la revendication 23, caractérisée par l'incorporation dans un tube d'analyse renfermant un milieu séparateur permettant d'obtenir un gradient de densité et du sang maternel dilué, prélevé pendant la gestation, d'une couche de milieu séparateur dilué entre la couche de sang et celle de milieu séparateur et qu'on soumet le contenu du tube à une centrifugation de manière à séparer les constituants du sang en couches distinctes.
25/Application selon la revendication 24, à l'extraction d'érythroblastes foetaux du sang maternel et/ou de la couche lymphocytaire et/ou des polynucléaires et/ou du culot de globules rouges.
26/Application selon la revendication 24, à l'établissement d'un diagnostic prénatal de maladies génétiques foetales.
27/Application selon la revendication 23, à l'extraction de cellules cancéreuses dans le sang d'origine sanguine ou tissulaire, comme la prostate, le sein, le poumon, l'ovaire.
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