FR2791261A1 - Utilisation de la vitamine c ou analogue pour promouvoir la transformation de procollagenes inactifs en collagenes actifs - Google Patents
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Abstract
L'invention se rapporte à un procédé pour transformer les procollagènes de types I et III inactifs en collagènes de types I et III actifs en appliquant sur la peau une composition comprenant une quantité efficace d'acide ascorbique ou d'au moins un de ses analogues.
Description
L'invention se rapporte à un procédé pour transformer les procollagènes de
types I et 11I inactifs en collagènes de types I et III actifs en appliquant sur la peau une composition comprenant une quantité efficace d'acide ascorbique ou d'au moins
un de ses analogues.
La peau humaine est constituée de deux compartiments à savoir un compartiment
superficiel, l'épiderme, et un compartiment profond, le derme.
L'épiderme humain naturel est composé principalement de trois types de cellules qui sont les kératinocytes, très majoritaires, les mélanocytes et les cellules de Langerhans. Chacun de ces types cellulaires contribue par ses fonctions propres
au rôle essentiel joué dans l'organisme par la peau.
Le derme fournit à l'épiderme un support solide. C'est également son élément nourricier. Il est principalement constitué de fibroblastes et d'une matrice extracellulaire composée elle-même principalement de collagène, d'élastine et d'une substance, dite substance fondamentale, composants synthétisés par le fibroblaste. On y trouve aussi des leucocytes, des mastocytes ou encore des macrophages tissulaires. Il est également traversée par des vaisseaux sanguins et des fibres nerveuses. Dans une peau normale, c'est à dire non pathologique ni cicatricielle, le fibroblaste est à l'état quiescent, c'est à dire non prolifératif, peu
actif d'un point de vue métabolique et non mobile.
Ce sont les fibres de collagène qui assurent la solidité du derme. Les fibres de collagène sont constituées de fibrilles scellées les unes aux autres, formant ainsi plus de dix types de structures différentes, les collagènes de types I et 111 représentent 90% des collagènes matriciels. La solidité du derme est en grande partie due à l'enchevêtrement des fibres de collagène tassées les unes contre les autres en tous sens. Les fibres de collagène participent à l'élasticité et à la tonicité
de la peau et/ou des muqueuses.
La synthèse des fibres de collagènes, et plus particulièrement des collagènes de types I et 111, commence par la synthèse d'ARNm procollagènes de types I et 111, suivi de leur traduction en procollagènes de types I et 111, ces procollagènes subissent différentes étapes post-traductionnelles pour les rendre actifs (ou efficaces). Ces procollagènes sont tout d'abord hydroxylés sur leurs résidus proline et lysine par les lysine- et proline- hydroxylases. Les procollagènes inactifs et solubles ainsi obtenus portent des propeptides amino- et carboxy-terminaux
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permettant leur transport à distance de leur lieu de synthèse vers la matrice extracellulaire o ils deviennent insolubles et actifs par polymérisation spontanée après clivage de ces propeptides. Ce clivage est assuré par deux enzymes spécifiques, l'aminoprocollagène peptidase (N-PCP) et la carboxyprocollagène peptidase (C-PCP). Les polymères de collagène sont finalement stabilisés par la
formation de liaisons covalentes croisées sous l'activité de la lysyloxydase.
Les fibres de collagènes sont constamment renouvelées mais ce renouvellement diminue avec l'âge ce qui entraîne un amincissement du derme. Il est également admis que des facteurs extrinsèques comme les rayons ultraviolets, le tabac ou certains traitements (Glucocorticoïdes, vitamine D et dérivés par exemple) ont
également un effet sur la peau et sur son taux de collagène.
Par ailleurs à la ménopause, les principales modifications concernant le derme sont une diminution du taux de collagène et de l'épaisseur dermique. Cela entraîne chez la femme ménopausée un amincissement de la peau et/ou des muqueuses. La femme ressent alors une sensation de "peau sèche" ou de peau qui tire et l'on constate une accentuation des fines rides et ridules de surface. La peau présente un aspect rugueux à la palpation. Enfin la peau présente une
souplesse diminuée.
On comprend alors à la lecture de ce qui précède l'importance des collagènes dans la structure des tissus, particulièrement de la peau et/ou des muqueuses, et l'importance qu'il y a à augmenter leur efficacité dans les tissus pour ainsi lutter contre le vieillissement qu'il soit chronobiologique ou photo-induit et ses conséquences, I'amincissement du derme et/ou la dégradation des fibres de
collagène ce qui entraînent l'apparence de peau molle et ridée.
Un des buts de la présente invention est donc de promouvoir la transformation
des procollagènes de types I et 111 inactifs en collagènes de types I et III actifs.
Or, la demanderesse a maintenant découvert que l'acide ascorbique appliqué topiquement sur la peau favorise la transformation des procollagènes de types I
et 11i1 inactifs en collagènes de types I et Ilil actifs.
L'acide ascorbique (ou vitamine C) est connu pour stimuler la synthèse de collagène, en empêchant, en tant que co-facteur, I'auto-inactivation des enzymes lysine- et proline- hydroxylases et en augmentant la synthèse des ARNm de
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procollagènes. L'acide ascorbique (ou vitamine C) est également connu pour stimuler la synthèse de l'élastine de la peau. On peut citer à cet égard les brevets US 5801192, US 4983382 et EP 0717983. On peut également citer un article intitulé "Pola to incorporate vitamin C in new cosmetics line for skin care" du Japan Economic Journal du 5 juin 1984 (page 15). Ainsi, il a été décrit que l'acide ascorbique utilisé dans des compositions cosmétiques permet de traiter notamment les rides (Fragrance Joumrnal, Vol.8, N 6(45) (1980) pp38-43,
"Cosmetic and vitamin -action and safety to dermatology").
L'invention a donc pour objet l'utilisation d'une quantité efficace d'acide ascorbique ou d'un de ses analogues dans une composition ou dans la préparation d'une composition destinée à être appliquée sur la peau pour promouvoir la transformation des procollagènes de types I et III inactifs en
collagènes de types I et IlIl actifs.
L'invention a pour second objet l'utilisation d'une quantité efficace d'acide ascorbique ou d'un de ses analogues dans une composition ou dans la préparation d'une composition destinée à être appliquée sur la peau pour augmenter la transformation des procollagènes de types I et IlIl inactifs et solubles
en procollagènes de types I et Ill actifs et insolubles.
L'invention a pour troisième objet l'utilisation d'une quantité efficace d'acide ascorbique ou d'un de ses analogues dans une composition ou dans la préparation d'une composition destinée à être appliquée sur la peau pour augmenter la transformation des procollagènes de types I et IlIl actifs et insolubles
en collagènes de types I et III actifs, insolubles et stables.
En effet, la demanderesse a découvert que l'acide ascorbique appliqué topiquement sur la peau permet d'augmenter la synthèse d'ARNm des enzymes
aminoprocollagène peptidase (N-PCP) et carboxyprocollagène peptidase (C-
PCP) et par ce biais d'augmenter la transformation des procollagènes de types I et 111 inactifs et solubles en procollagènes de types I et IlIl actifs et insolubles. Elle a également découvert que l'acide ascorbique appliqué topiquement sur la peau permet d'augmenter la synthèse d'ARNm de la lysyloxydase et par ce biais d'augmenter la transformation des procollagènes de types I et lIl actifs et
insolubles en collagènes de types I et III actifs, insolubles et stables.
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Favoriser la transformation des procollagènes de types I et III inactifs en collagènes de types I et III actifs permet notamment d'améliorer l'aspect de la peau et plus particulièrement de diminuer les signes du vieillissement de la peau, notamment en améliorant l'élasticité, la tonicité ou la fermeté de la peau ou en diminuant les rides ou en retardant leur apparition. Les analogues de l'acide ascorbique sont, plus particulièrement, ses sels, tels que notamment l'ascorbate de sodium, I'ascorbylphosphate de magnésium ou de sodium, ses esters, tels que notamment ses esters acétique, propionique ou
palmitique, ou ses sucres, tels que notamment l'acide ascorbique glycosilé.
L'acide ascorbique est généralement sous forme L, car il est habituellement extrait
de produits naturels.
1 5 La quantité efficace d'acide ascorbique ou de ses analogues utilisable selon l'invention est bien entendu celle qui est nécessaire pour obtenir les effets attendus selon l'invention. Pour donner un ordre de grandeur, cette quantité représente préférentiellement de 0,001% à 20% du poids total de la composition, préférentiellement de 0,1% à 15% du poids total de la composition et
avantageusement de 3% à 10% du poids total de la composition.
En outre, la composition de l'invention est utilisée pendant un temps suffisant pour obtenir les effets attendus selon l'invention. Pour donner un ordre de grandeur, cette durée peut être au minimum de 3 semaines, mais peut être aussi de plus de
4 semaines, voire de plus de 8 semaines.
La composition de l'invention destinée à une application topique contient un milieu physiologiquement acceptable, c'est-à-dire compatible avec la peau y compris le cuir chevelu; les muqueuses et/ou les yeux et peut constituer
notamment une composition cosmétique ou dermatologique.
Cette composition peut se présenter sous toutes les formes galéniques normalement utilisées dans les domaines cosmétique et dermatologique, et elle peut être notamment sous forme d'une solution aqueuse éventuellement gélifiée, d'une dispersion du type lotion éventuellement biphasée, d'une émulsion obtenue par dispersion d'une phase grasse dans une phase aqueuse (H/E) ou inversement (E/H), ou d'une émulsion triple (E/H/E ou H/E/H) ou d'une dispersion
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vésiculaire de type ionique et/ou non ionique. Ces compositions sont préparées
selon les méthodes usuelles.
La composition de l'invention peut constituer par exemple une lotion, un gel, une crème ou un lait, et par exemple une lotion ou un lait de démaquillage ou de
nettoyage, un shampooing ou un gel douche.
L'exemple suivant illustre l'invention sans la limiter aucunement. Dans les compositions les proportions indiquées sont des pourcentages en poids, sauf
mention contraire.
Exemple:
1. Méthode On a appliqué sur le bas du cou de 10 femmes entre 55 et 60 ans pendant 3 mois, une fois par jour, d'un côté une émulsion eau dans huile (Véhicule ou Placébo) et d'un autre côté la même émulsion eau dans huile, mais comprenant
également 5 % de vitamine C (= Composition ou Actif).
Composition Acide L-ascorbique 5,00 % Hydroxyde de sodium 1, 83 % Acide citrique,1 H20 1, 24 % Disodium EDTA 0,05 % Huile d'amandes d'abricot 3,00 % Huile de silicone 4 % Cyclopentasiloxane et dimethicone copolyol 20 % Dimethicone et dimethiconol 3 % Glycerin 23 % Propylene glycol 4 % Charges 7 % Conservateurs 0,30 % Eau qsp 100,00 %
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On procède ensuite à des biopsies de ces surfaces traitées.
2. Extraction et purification des ARN totaux.
Les biopsies sont broyées sous azote liquide dans un Mikrodismembrator S (Braun). La poudre obtenue est récoltée dans la capsule de téflon par 2 ml de solution de lyse (isothiocyanate de guanidine 5M, mercaptoéthanol, 0,1M, laurylsucosyl de Na 0,017M, citrate Na 0,025M, pH7, antifoam 3 p. l/ml). La suspension est transférée dans un tube mis sous agitation à température ambiante durant 15 minutes. Le lysat est déposé à la surface d'un coussin de 1,4 ml de chlorure de Césium 5,7M, EDTA 0, 1M, pH 7 dans un tube de polyallomer de 3,8 ml pour le rotor SW60 (Ultracentrifugeuse Beckman L70M). Une ultracentrifugation à 35.000 RPM est réalisée durant 18 heures à 20 C. Le culot est rincé à l'éthanol absolu, centrifugé à 13.000 RPM, 4 C, 10 minutes et mis en
solution dans 100 Rl d'eau distillée.
3. Ouantification de la concentration en ARN total et en ARNm spécifiques.
La quantité d'ARN récolté à partir des biopsies est estimée par la densité optique de la solution à 260 nm puis mesurée en amplifiant par RT-PCR I'ARN ribosomial 28S. La mesure des ARNm spécifiques est réalisée par RT-PCR quantitative sur des aliquots de la même dilution d'ARN total, conservées à -80 C jusqu'à leur utilisation. Mesure de l'ARNm des enzymes de maturation, la N-PCP, la C-PCP et la lysyloxydase Les amorces oligonucléotidiques spécifiques des gènes étudiés comportent 24 bases, ont un % de A - T proche de 50 % et sont choisies sur deux exons différents afin d'éviter l'amplification d'éventuelles traces d'ADN présentes dans les échantillons. Les conditions optimales d'amplification (température et nombre de cycles) ont été déterminées pour chacun des gènes étudiés en tenant compte de leur niveau d'expression dans la peau. La RT-PCR est réalisée à l'aide du kit Gene Amp rTth de Perkin Elmer ou du kit Titam de
Boehringer.
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Chaque réaction de RT-PCR est réalisée en présence d'un nombre connu de copies d'un ARN synthétique créé en laboratoire contenant les séquences des amorces oligonucléotidiques spécifiques des ARNm d'intérêt et dont le produit d'amplification a une taille moléculaire permettant de le discriminer de I'ARNm endogène. Ce multistandard permet de contrôler et de calculer le rendement de la transcription réverse et de la réaction d'amplification Les produits d'amplification sont analysés par électrophorèse en gel de polyacrylamide suivie d'une coloration au CyberGreen. L'intensité des signaux fluorescents est mesurée à l'aide d'un Fluoro S Multilmager. Les résultats sont corrigés pour le rendement de la RT-PCR et exprimés en unités arbitraires par unité d'ARN 28 S ribosomial 4. Analyse statistique L'analyse statistique a été réalisée à l'aide du t-Test de Student unilatéral sur les
rapports des valeurs Actif (Vitamine C)/Placebo (= A/P).
t(n- 1) = (M A/P- 1) Vn M écarts - types Pour un degré de liberté n-1 = 9, le rapport A/P est significativement supérieur à 1 avec une probabilité supérieure à 95 % pour une valeur de t > 1,83 et une
probabilité supérieure à 99 % pour une valeur de t > 2,82.
5. Résultats Mesure de l'ARN total obtenu à partir des biopsies La quantité totale d'ARN purifié à partir des biopsies est évaluée dans un premier temps par mesure de la densité optique à 260 nm et leur qualité estimée par la
mesure du rapport des DO 260/290 nm.
Des quantités largement suffisantes d'ARN ont été obtenues à partir de chacune
des biopsies (entre 2,1 et 6,3 gg) avec un degré de pureté (rapport de D. O.
260/280) satisfaisant.
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La concentration en ARN total est amenée par dilution à une valeur calculée de 4 nanogrammes par pI. Ce procédé permet de réaliser les réactions de transcription reverse et d'amplification sur des quantités similaires d'ARN total pour tous les échantillons. La quantité d'ARN total présente dans la solution diluée est déterminée de façon quantitative par mesure de P'ARN ribosomial 28S, réalisée
en triplicate.
Cette même solution d'ARN sera utilisée pour toutes les mesures des ARNs
spécifiques dont les résultats sont exprimés par unité d'ARN 28S.
2. Mesure du taux à l'équilibre des ARNm des enzymes de maturation du procollagène: la carboxyprocollagène peptidase (C-PCP) et l'aminoprocollagène
peptidase (N-PCP).
Les résultats exprimés en unités arbitraires par unité d'ARN 28S sont détaillés
dans le tableau 1.
Tableau 1: mesure des ARNm de C-PCP et N-PCP
C-PCP N-PCP
sujet A P A/P A P A/P a 108 65 1,66 298 224 1,33 b 170 139 1,22 138 125 1,10 c 155 152 1,02 271 312 0,87 d 274 188 1,46 637 325 1,96 e 155 119 1,30 507 321 1,58 f 138 121 1, 14 254 213 1,19 g 206 178 1,16 349 350 1,00 h 225 192 1,17 327 380 0,85 i 370 334 1,11 409 517 0,79 j 212 159 1,33 246 174 1, 41 Moyenne 201 165 1,26** 344 294 1,21* Ecart-type 76 71 0,19 143 114 0,37 Test de Student unilatéral **t=4,56, p < 0,01 *t = 1,89, p < 0,05 Les 10 sujets de l'étude voient l'expression de la C-PCP accrue avec l'acide ascorbique et six sujets sur 10 présentent un rapport actif/placebo supérieur à 1
pour la N-PCP.
Lorsque ces mesures sont rapportées aux mesures équivalentes faites pour l'ARNm procollagènes I ou II1, la valeur moyenne de ces rapports calculée sur la série des échantillons traités et des échantillons placebo est très proche indiquant une modulation coordonnée de l'expression des procollagènes et de leurs
enzymes de maturation.
3. Mesure du taux à l'équilibre de l'ARNm de la lysyloxvdase Les résultats exprimés en unités arbitraires par unité d'ARN28S sont détaillées
dans le tableau 2.
Tableau 2: mesure de l'ARNm de la Lysyloxydase sujet A P A/P a 102 18 5,67 b 38 15 2,53 c 62 108 0,57 d 292 247 1,18 e 183 83 2,20 f 110 78 1,41 g 278 109 2,55 h 74 314 0,24 i 226 154 1,47 j 97 67 1,45 Moyenne 146 119 1,93* Ecart-type 92 96 1,52 Test de Student unilatéral: * t = 2,04, p < 0,05 Le taux à l'équilibre de l'ARNm de la lysyloxydabe est accru par l'acide ascorbique chez 8 sujets sur 10. La moyenne des rapports A/P est significativement supérieure à 1 selon le T-test de Student unilatéral malgré une
variabilité inter-individuelle plus importante que pour les autres enzymes.
Claims (6)
1. Utilisation d'une quantité efficace d'acide ascorbique ou d'un de ses analogues dans une composition ou dans la préparation d'une composition destinée à être appliquée sur la peau pour promouvoir la transformation des procollagènes de
types I et II1 inactifs en collagènes de types I et III actifs.
2. Utilisation d'une quantité efficace d'acide ascorbique ou d'un de ses analogues dans une composition ou dans la préparation d'une composition destinée à être appliquée sur la peau pour augmenter la transformation des procollagènes de types I et II1 inactifs et solubles en procollagènes de types I et 11I actifs et insolubles.
3. Utilisation d'une quantité efficace d'acide ascorbique ou d'un de ses analogues dans une composition ou dans la préparation d'une composition destinée à être appliquée sur la peau pour augmenter la transformation des procollagènes de types I et III actifs et insolubles en collagènes de types I et III actifs, insolubles et
stables.
4. Utilisation selon l'une des revendications précédentes, caractérisée par le fait
que les analogues de l'acide ascorbique sont choisis parmi ses sels, ses esters, et
ses sucres.
5. Utilisation selon la revendications précédente, caractérisée en ce que les
analogues de l'acide ascorbique sont choisis parmi l'ascorbate de sodium, I'ascorbylphosphate de magnésium, de sodium, ses esters acétique, propionique,
palmitique et l'acide ascorbique glycosilé.
6. Utilisation selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée
par le fait que la quantité d'acide ascorbique ou de ses analogues représente de 0,001% à 20%, préférentiellement de 0,1% à 15%, et avantageusement de 3% à
% du poids total de la composition.
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Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| AU3172700A (en) | 2000-10-09 |
| EP1165062A1 (fr) | 2002-01-02 |
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