WO2000056326A1 - Utilisation de la vitamine c ou analogues pour promouvoir la transformation de procollagenes inactifs en collagenes actifs - Google Patents

Utilisation de la vitamine c ou analogues pour promouvoir la transformation de procollagenes inactifs en collagenes actifs Download PDF

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WO2000056326A1
WO2000056326A1 PCT/FR2000/000562 FR0000562W WO0056326A1 WO 2000056326 A1 WO2000056326 A1 WO 2000056326A1 FR 0000562 W FR0000562 W FR 0000562W WO 0056326 A1 WO0056326 A1 WO 0056326A1
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active
iii
skin
insoluble
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André Rougier
Alain Richard
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La Roche Posay Laboratoire Pharmaceutique
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Definitions

  • the invention relates to a method for transforming inactive types I and III procollagens into active types I and III collagen by applying to the skin a composition comprising an effective amount of ascorbic acid or of at least one of its analogs. .
  • Human skin is made up of two compartments, namely a surface compartment, the epidermis, and a deep compartment, the dermis.
  • the natural human epidermis is mainly composed of three types of cells which are the keratinocytes, very majority, the melanocytes and the Langerhans cells. Each of these cell types contributes by its own functions to the essential role played in the body by the skin.
  • the dermis provides the epidermis with solid support. It is also its nourishing element. It mainly consists of fibroblasts and an extracellular matrix itself composed mainly of collagen, elastin and a substance, known as the fundamental substance, components synthesized by the fibroblast. There are also leukocytes, mast cells or tissue macrophages. It is also crossed by blood vessels and nerve fibers. In normal skin, that is to say non-pathological or scarring, the fibroblast is in a quiescent state, that is to say non-proliferative, not very active from a metabolic point of view and not mobile.
  • Collagen fibers which ensure the solidity of the dermis.
  • Collagen fibers are made up of fibrils sealed to each other, thus forming more than ten different types of structures, collagen types I and III represent 90% of matrix collagen.
  • the solidity of the dermis is largely due to the entanglement of collagen fibers packed against each other. others in every way. Collagen fibers participate in the elasticity and tone of the skin and / or mucous membranes.
  • the synthesis of collagen fibers begins with the synthesis of mRNA procollagens of types I and III, followed by their translation into procollagens of types I and III, these procollagens undergo different stages post -translational to make them active (or effective). These procollagens are first hydroxylated on their praline and lysine residues by the lysine- and praline-hydroxylases. The inactive and soluble procollagens thus obtained carry amino- and carboxy-terminal propeptides allowing their transport at a distance from their place of synthesis towards the extraceliular matrix where they become insoluble and active by spontaneous polymerization after cleavage of these propeptides.
  • N-PCP raminoprocollagen peptidase
  • C-PCP carboxyprocollagen peptidase
  • the collagen fibers are constantly renewed, but this renewal decreases with age, which leads to thinning of the dermis. It is also recognized that extrinsic factors such as ultraviolet rays, tobacco or certain treatments (glucocorticoids, vitamin D and derivatives for example) also have an effect on the skin and its collagen level.
  • extrinsic factors such as ultraviolet rays, tobacco or certain treatments (glucocorticoids, vitamin D and derivatives for example) also have an effect on the skin and its collagen level.
  • the main modifications concerning the dermis are a reduction in the collagen level and the dermal thickness. This leads in menopausal women to thinning of the skin and / or mucous membranes. The woman then feels a feeling of "dry skin” or of skin that pulls and there is an accentuation of fine wrinkles and fine lines on the surface. The skin has a rough appearance on palpation. Finally, the skin has reduced flexibility.
  • One of the aims of the present invention is therefore to promote the transformation of inactive types I and III procollagens into active types I and III collagen.
  • the Applicant has now discovered that the ascorbic acid applied topically to the skin promotes the transformation (a) of inactive and soluble types I and III procollagens into active and insoluble types I and III procollagens, and (b) of these the latter in active type I and III collagen, insoluble and stable.
  • Ascorbic acid is known to stimulate the synthesis of collagen, by preventing, as a co-factor, the auto-inactivation of the enzymes lysine- and praline- hydroxylases and by increasing the synthesis of mRNA of procolla fauxs .
  • Ascorbic acid (or vitamin C) is also known to stimulate the synthesis of elastin in the skin.
  • US patents 5801192, US 4983382 and EP 0717983 We can also cite an article entitled "Pola to incorporate vitamin C in new cosmetics line for skin care" of the Japan economy Journal of June 5, 1984 (page 15) .
  • ascorbic acid applied topically to the skin makes it possible to increase the synthesis of mRNA of enzymes aminoprocollagen peptidase (N-PCP) and carboxyprocollagen peptidase (C-PCP) and thereby increase the transformation of inactive and soluble type I and III procollagens into active and insoluble type I and III procollagens.
  • N-PCP aminoprocollagen peptidase
  • C-PCP carboxyprocollagen peptidase
  • ascorbic acid applied topically to the skin increases the synthesis of lysyloxidase mRNA and thereby increases the transformation of active and insoluble types I and III procollagens into type I collagens and III active, insoluble and stable.
  • Promoting the transformation of inactive types I and III procollagens into active types I and III collagens notably improves the appearance of the skin and more particularly reduces the signs of aging of the skin, in particular by improving elasticity, the tone or firmness of the skin or by reducing wrinkles or delaying their appearance.
  • a subject of the invention is therefore the use of an effective amount of ascorbic acid or one of its analogs in a composition or in the preparation of a composition intended to be applied to the skin to increase the transformation of procollagens of types I and III inactive and soluble in procollagens of types I and III active and insoluble.
  • a second object of the invention is the use of an effective amount of ascorbic acid or one of its analogs in a composition or in the preparation of a composition intended to be applied to the skin to increase the transformation of procollagens types I and III active and insoluble in collagen types I and III active, insoluble and stable.
  • the analogues of ascorbic acid are, more particularly, its salts, such as in particular sodium ascorbate, magnesium or sodium ascorbylphosphate, its esters, such as in particular its acetic, propionic or palmitic esters, or its sugars , such as in particular glycosylated ascorbic acid.
  • Ascorbic acid is usually in L-form because it is usually extracted from natural products.
  • the effective amount of ascorbic acid or its analogs which can be used according to the invention is of course that which is necessary to obtain the expected effects according to the invention.
  • this quantity preferably represents from 0.001% to 20% of the total weight of the composition, preferably from 0.1% to 15% of the total weight of the composition and advantageously from 3% to 10% of the total weight of composition.
  • composition of the invention is used for a time sufficient to obtain the expected effects according to the invention.
  • this duration can be at least 3 weeks, but can also be more than 4 weeks, or even more than 8 weeks.
  • composition of the invention intended for topical application contains a physiologically acceptable medium, that is to say compatible with the skin including the scalp, mucous membranes and / or the eyes and may in particular constitute a cosmetic or dermatological composition. .
  • This composition can be in all the galenical forms normally used in the cosmetic and dermatological fields, and it can in particular be in the form of an aqueous solution possibly gelled, of a dispersion of the lotion type possibly biphasic, of an emulsion obtained by dispersion of a fatty phase in an aqueous phase (O / W) or vice versa (W / O), or of a triple emulsion (W / O / W or O / W / O) or of a vesicular type dispersion ionic and / or non-ionic.
  • These compositions are prepared according to the usual methods.
  • composition of the invention can constitute for example a lotion, a gel, a cream or a milk, and for example a lotion or a cleansing or cleansing milk, a shampoo or a shower gel.
  • the following example illustrates the invention without limiting it in any way. In the compositions the proportions indicated are percentages by weight, unless otherwise stated.
  • Citric acid 1 H2O 1, 24%
  • Biopsies of these treated surfaces are then carried out. 2. Extraction and purification of total RNA.
  • Biopsies are ground under liquid nitrogen in a Mikrodismembrator S (Braun).
  • the powder obtained is collected in the teflon capsule with 2 ml of lysis solution (guanidine isothiocyanate 5M, mercaptoethanol, 0.1 M, laurylsucosyl of Na 0.017M, citrate Na 0.025M, pH7, antifoam 3 ⁇ l / ml).
  • the suspension is transferred to a tube, stirred at room temperature for 15 minutes.
  • the lysate is deposited on the surface of a 1.4 ml cushion of 5.7M cesium chloride, 0.1 M EDTA, pH 7 in a 3.8 ml polyallomer tube for the rotor SW60 (Beckman L70M ultracentrifuge ). A 35,000 RPM uitracentrifugation is carried out for 18 hours at 20 ° C. The pellet is rinsed with absolute ethanol, centrifuged at 13,000 RPM, 4 ° C, 10 minutes and dissolved in 100 ⁇ l of distilled water.
  • RNA harvested from biopsies is estimated by the optical density of the solution at 260 nm and then measured by amplifying the 28S ribosomal RNA by RT-PCR.
  • the measurement of specific mRNAs is carried out by quantitative RT-PCR on aliquots of the same dilution of total RNA, stored at -80 ° C. until their use.
  • the specific oligonucleotide primers of the genes studied have 24 bases, have an A - T% close to 50% and are chosen from two different exons in order to avoid amplification of possible traces of DNA present in the samples.
  • the optimal amplification conditions (temperature and number of cycles) were determined for each of the genes studied, taking into account their level of expression in the skin.
  • RT-PCR is made using the Gen amp Amp rTth kit from Perkin Elmer or the Titam kit from Boehringer.
  • Each RT-PCR reaction is carried out in the presence of a known number of copies of a synthetic RNA created in the laboratory containing the sequences of the oligonucleotide primers specific for the mRNAs of interest and the amplification product of which has a molecular size allowing discriminate it from endogenous mRNA.
  • This multistandard makes it possible to control and calculate the yield of the reverse transcription and of the amplification reaction.
  • the amplification products are analyzed by electrophoresis in polyacrylamide gel followed by staining with CyberGreen.
  • the intensity of the fluorescent signals is measured using a Fluoro S Multilmager.
  • the results are corrected for the yield of RT-PCR and expressed in arbitrary units per unit of 28 S ribosomal RNA.
  • the total quantity of RNA purified from biopsies is first evaluated by measuring the optical density at 260 nm and their quality estimated by measuring the OD ratio 260/290 nm.
  • RNA was obtained from each of the biopsies (between 2.1 and 6.3 ⁇ g) with a satisfactory degree of purity (D.O. report 260/280).
  • the concentration of total RNA is brought by dilution to a calculated value of 4 nanograms per ⁇ l. This process makes it possible to carry out the reverse transcription and amplification reactions on similar quantities of total RNA for all the samples.
  • the amount of total RNA present in the diluted solution is quantitatively determined by measurement of the 28S ribosomal RNA, carried out in triplicate.
  • RNA solution will be used for all measurements of specific RNAs, the results of which are expressed per unit of 28S RNA.
  • C-PCP carboxyprocollagen peptidase
  • N-PCP aminoprocollagen peptidase
  • C-PCP N-PCP subject APA / PAPA / P a 108 65 1.66 298 224 1.33 b 170 139 1, 22 138 125 1, 10 c 155 152 1.02 271 312 0.87 d 274 188 1, 46 637 325 1.96 e 155 119 1.30 507 321 1.58 f 138 121 1, 14 254 213 1, 19 g 206 178 1, 16 349 350 1, 00 h 225 192 1.17 327 380 0.85 i 370 334 1, 11 409 517 0.79 j 212 159 1, 33 246 174 1, 41
  • the 10 subjects of the study see the expression of increased C-PCP with ascorbic acid and six subjects out of 10 have an active / placebo ratio greater than 1 for N-PCP.
  • the equilibrium rate of lysyloxidase mRNA is increased by ascorbic acid in 8 out of 10 subjects.
  • the mean of the A / P ratios is significantly greater than 1 according to the unilateral Student T-test despite inter variability -individual more important than for the other enzymes.

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Abstract

L'invention se rapporte à un procédé pour transformer les procollagènes de types I et II inactifs en collagènes de types I et III actifs en appliquant sur la peau une composition comprenant une quantité d'acide ascorbique ou d'au moins un de ses analogues.

Description

Utilisation de la vitamine C ou analogues pour promouvoir la transformation de procollagènes inactifs en collagenes actifs
L'invention se rapporte à un procédé pour transformer les procollagènes de types I et III inactifs en collagenes de types I et III actifs en appliquant sur la peau une composition comprenant une quantité efficace d'acide ascorbique ou d'au moins un de ses analogues.
La peau humaine est constituée de deux compartiments à savoir un compartiment superficiel, l'épiderme, et un compartiment profond, le derme.
L'épiderme humain naturel est composé principalement de trois types de cellules qui sont les kératinocytes, très majoritaires, les mélanocytes et les cellules de Langerhans. Chacun de ces types cellulaires contribue par ses fonctions propres au rôle essentiel joué dans l'organisme par la peau.
Le derme fournit à l'épiderme un support solide. C'est également son élément nourricier. Il est principalement constitué de fibroblastes et d'une matrice extracellulaire composée elle-même principalement de collagène, d'élastine et d'une substance, dite substance fondamentale, composants synthétisés par le fibroblaste. On y trouve aussi des leucocytes, des mastocytes ou encore des macrophages tissulaires. Il est également traversée par des vaisseaux sanguins et des fibres nerveuses. Dans une peau normale, c'est à dire non pathologique ni cicatricielle, le fibroblaste est à l'état quiescent, c'est à dire non prolifératif, peu actif d'un point de vue métabolique et non mobile.
Ce sont les fibres de collagène qui assurent la solidité du derme. Les fibres de collagène sont constituées de fibrilles scellées les unes aux autres, formant ainsi plus de dix types de structures différentes, les collagenes de types I et III représentent 90% des collagenes matriciels. La solidité du derme est en grande partie due à l'enchevêtrement des fibres de collagène tassées les unes contre les autres en tous sens. Les fibres de collagène participent à l'élasticité et à la tonicité de la peau et/ou des muqueuses.
La synthèse des fibres de collagenes, et plus particulièrement des collagenes de types I et III, commence par la synthèse d'ARNm procollagènes de types I et III, suivi de leur traduction en procollagènes de types I et III, ces procollagènes subissent différentes étapes post-traductionnelles pour les rendre actifs (ou efficaces). Ces procollagènes sont tout d'abord hydroxylés sur leurs résidus praline et lysine par les lysine- et praline- hydroxylases. Les procollagènes inactifs et solubles ainsi obtenus portent des propeptides amino- et carboxy-terminaux permettant leur transport à distance de leur lieu de synthèse vers la matrice extraceliulaire où ils deviennent insolubles et actifs par polymérisation spontanée après clivage de ces propeptides. Ce clivage est assuré par deux enzymes spécifiques, raminoprocollagène peptidase (N-PCP) et la carboxyprocollagène peptidase (C-PCP). Les polymères de collagène sont finalement stabilisés par la formation de liaisons covalentes croisées sous l'activité de la lysyloxydase.
Les fibres de collagenes sont constamment renouvelées mais ce renouvellement diminue avec l'âge ce qui entraîne un amincissement du derme. Il est également admis que des facteurs extrinsèques comme les rayons ultraviolets, le tabac ou certains traitements (Glucocorticoïdes, vitamine D et dérivés par exemple) ont également un effet sur la peau et sur son taux de collagène.
Par ailleurs à la ménopause, les principales modifications concernant le derme sont une diminution du taux de collagène et de l'épaisseur dermique. Cela entraîne chez la femme ménopausée un amincissement de la peau et/ou des muqueuses. La femme ressent alors une sensation de "peau sèche" ou de peau qui tire et l'on constate une accentuation des fines rides et ridules de surface. La peau présente un aspect rugueux à la palpation. Enfin la peau présente une souplesse diminuée. On comprend alors à la lecture de ce qui précède l'importance des collagenes dans la structure des tissus, particulièrement de la peau et/ou des muqueuses, et l'importance qu'il y a à augmenter leur efficacité dans les tissus pour ainsi lutter contre le vieillissement qu'il soit chronobiologique ou photo-induit et ses conséquences, l'amincissement du derme et/ou la dégradation des fibres de collagène ce qui entraînent l'apparence de peau molle et ridée.
Un des buts de la présente invention est donc de promouvoir la transformation des procollagènes de types I et III inactifs en collagenes de types I et III actifs.
Or, la demanderesse a maintenant découvert que l'acide ascorbique appliqué topiquement sur la peau favorise la transformation (a) des procollagènes de types I et III inactifs et solubles en procollagènes de types I et III actifs et insolubles, et (b) de ces derniers en collagène de types I et III actifs, insolubles et stables.
L'acide ascorbique (ou vitamine C) est connu pour stimuler la synthèse de collagène, en empêchant, en tant que co-facteur, l'auto-inactivation des enzymes lysine- et praline- hydroxylases et en augmentant la synthèse des ARNm de procollagènes. L'acide ascorbique (ou vitamine C) est également connu pour stimuler la synthèse de l'élastine de la peau. On peut citer à cet égard les brevets US 5801192, US 4983382 et EP 0717983. On peut également citer un article intitulé "Pola to incorporate vitamin C in new cosmetics line for skin care" du Japan Economie Journal du 5 juin 1984 (page 15). Ainsi, il a été décrit que l'acide ascorbique utilisé dans des compositions cosmétiques permet de traiter notamment les rides (Fragrance Journal, Vol.8, N°6(45) (1980) pp38-43, "Cosmetic and vitamin -action and safety to dermatology").
Toutefois, à la connaissance de la Demanderesse, il n'a jamais été suggéré que l'acide ascorbique puisse avoir un effet sur les réactions (a) et (b) ci-dessus.
Or, la demanderesse a découvert que l'acide ascorbique appliqué topiquement sur la peau permet d'augmenter la synthèse d'ARNm des enzymes aminoprocollagène peptidase (N-PCP) et carboxyprocollagène peptidase (C- PCP) et par ce biais d'augmenter la transformation des procollagènes de types I et III inactifs et solubles en procollagènes de types I et III actifs et insolubles. Elle a également découvert que l'acide ascorbique appliqué topiquement sur la peau permet d'augmenter la synthèse d'ARNm de la lysyloxydase et par ce biais d'augmenter la transformation des procollagènes de types I et III actifs et insolubles en collagenes de types I et III actifs, insolubles et stables.
Favoriser la transformation des procollagènes de types I et III inactifs en collagenes de types I et III actifs permet notamment d'améliorer l'aspect de la peau et plus particulièrement de diminuer les signes du vieillissement de la peau, notamment en améliorant l'élasticité, la tonicité ou la fermeté de la peau ou en diminuant les rides ou en retardant leur apparition.
L'invention a donc pour objet l'utilisation d'une quantité efficace d'acide ascorbique ou d'un de ses analogues dans une composition ou dans la préparation d'une composition destinée à être appliquée sur la peau pour augmenter la transformation des procollagènes de types I et III inactifs et solubles en procollagènes de types I et III actifs et insolubles.
L'invention a pour second objet l'utilisation d'une quantité efficace d'acide ascorbique ou d'un de ses analogues dans une composition ou dans la préparation d'une composition destinée à être appliquée sur la peau pour augmenter la transformation des procollagènes de types I et III actifs et insolubles en collagenes de types I et III actifs, insolubles et stables.
Les analogues de l'acide ascorbique sont, plus particulièrement, ses sels, tels que notamment l'ascorbate de sodium, l'ascorbylphosphate de magnésium ou de sodium, ses esters, tels que notamment ses esters acétique, propionique ou palmitique, ou ses sucres, tels que notamment l'acide ascorbique glycosylé. L'acide ascorbique est généralement sous forme L, car il est habituellement extrait de produits naturels.
La quantité efficace d'acide ascorbique ou de ses analogues utilisable selon l'invention est bien entendu celle qui est nécessaire pour obtenir les effets attendus selon l'invention. Pour donner un ordre de grandeur, cette quantité représente préférentiellement de 0,001 % à 20% du poids total de la composition, préférentiellement de 0,1% à 15% du poids total de la composition et avantageusement de 3% à 10% du poids total de la composition.
En outre, la composition de l'invention est utilisée pendant un temps suffisant pour obtenir les effets attendus selon l'invention. Pour donner un ordre de grandeur, cette durée peut être au minimum de 3 semaines, mais peut être aussi de plus de 4 semaines, voire de plus de 8 semaines.
La composition de l'invention destinée à une application topique contient un milieu physiologiquement acceptable, c'est-à-dire compatible avec la peau y compris le cuir chevelu, les muqueuses et/ou les yeux et peut constituer notamment une composition cosmétique ou dermatologique.
Cette composition peut se présenter sous toutes les formes galéniques normalement utilisées dans les domaines cosmétique et dermatologique, et elle peut être notamment sous forme d'une solution aqueuse éventuellement gélifiée, d'une dispersion du type lotion éventuellement biphasée, d'une émuision obtenue par dispersion d'une phase grasse dans une phase aqueuse (H/E) ou inversement (E/H), ou d'une émuision triple (E/H/E ou H/E/H) ou d'une dispersion vésiculaire de type ionique et/ou non ionique. Ces compositions sont préparées selon les méthodes usuelles.
La composition de l'invention peut constituer par exemple une lotion, un gel, une crème ou un lait, et par exemple une lotion ou un lait de démaquillage ou de nettoyage, un shampooing ou un gel douche. L'exemple suivant illustre l'invention sans la limiter aucunement. Dans les compositions les proportions indiquées sont des pourcentages en poids, sauf mention contraire.
Exemple : 1. Méthode
On a appliqué sur le bas du cou de 10 femmes entre 55 et 60 ans pendant 3 mois, une fois par jour, d'un côté une émuision eau dans huile (Véhicule ou Placebo) et d'un autre côté la même émuision eau dans huile, mais comprenant également 5 % de vitamine C (= Composition ou Actif). Composition :
Acide L-ascorbique 5,00 % Hydroxyde de sodium 1 >83 %
Acide citrique, 1 H2O 1 ,24 %
Disodium EDTA 0,05 %
Huile d'amandes d'abricot 3,00 %
Huile de silicone 4 % Cyclopentasiloxane et dimethicone copolyol 20 %
Dimethicone et dimethiconol 3 %
Glycerin 23 %
Propylene glycol 4 % Charges 7 %
Conservateurs 0,30 %
Eau qsp 100,00 %
On procède ensuite à des biopsies de ces surfaces traitées. 2. Extraction et purification des ARN totaux.
Les biopsies sont broyées sous azote liquide dans un Mikrodismembrator S (Braun). La poudre obtenue est récoltée dans la capsule de téflon par 2 ml de solution de lyse (isothiocyanate de guanidine 5M, mercaptoethanol, 0,1 M, laurylsucosyl de Na 0,017M, citrate Na 0,025M, pH7, antifoam 3 μl/ml). La suspension est transférée dans un tube mis sous agitation à température ambiante durant 15 minutes. Le lysat est déposé à la surface d'un coussin de 1 ,4 ml de chlorure de Césium 5,7M, EDTA 0, 1 M, pH 7 dans un tube de polyallomer de 3,8 ml pour le rotor SW60 (Ultracentrifugeuse Beckman L70M). Une uitracentrifugation à 35.000 RPM est réalisée durant 18 heures à 20°C. Le culot est rincé à l'éthanol absolu, centrifugé à 13.000 RPM, 4°C, 10 minutes et mis en solution dans 100 μl d'eau distillée.
3. Quantification de la concentration en ARN total et en ARNm spécifiques.
La quantité d'ARN récolté à partir des biopsies est estimée par la densité optique de la solution à 260 nm puis mesurée en amplifiant par RT-PCR l'ARN ribosomial 28S. La mesure des ARNm spécifiques est réalisée par RT-PCR quantitative sur des aiiquots de la même dilution d'ARN total, conservées à -80°C jusqu'à leur utilisation.
Mesure de l'ARNm des enzymes de maturation, la N-PCP, la C-PCP et la lysyioxydase
Les amorces oligonucléotidiques spécifiques des gènes étudiés comportent 24 bases, ont un % de A - T proche de 50 % et sont choisies sur deux exons différents afin d'éviter l'amplification d'éventuelles traces d'ADN présentes dans les échantillons. Les conditions optimales d'amplification (température et nombre de cycles) ont été déterminées pour chacun des gènes étudiés en tenant compte de leur niveau d'expression dans la peau. La RT-PCR est réalisée à l'aide du kit Gène Amp rTth de Perkin Elmer ou du kit Titam de Boehringer.
Chaque réaction de RT-PCR est réalisée en présence d'un nombre connu de copies d'un ARN synthétique créé en laboratoire contenant les séquences des amorces oligonucléotidiques spécifiques des ARNm d'intérêt et dont le produit d'amplification a une taille moléculaire permettant de le discriminer de l'ARNm endogène. Ce multistandard permet de contrôler et de calculer le rendement de la transcription réverse et de la réaction d'amplification.
Les produits d'amplification sont analysés par électrophorèse en gel de polyacrylamide suivie d'une coloration au CyberGreen. L'intensité des signaux fluorescents est mesurée à l'aide d'un Fluoro S Multilmager. Les résultats sont corrigés pour le rendement de la RT-PCR et exprimés en unités arbitraires par unité d'ARN 28 S ribosomial.
4. Analyse statistique
L'analyse statistique a été réalisée à l'aide du t-Test de Student unilatéral sur les rapports des valeurs Actif (Vitamine C)/Placebo (= A/P).
t(n- 1 ) = (M A/P - 1 ) Vn M écarts - types
Pour un degré de liberté n-1 = 9, le rapport A/P est significativement supérieur à 1 avec une probabilité supérieure à 95 % pour une valeur de t > 1 ,83 et une probabilité supérieure à 99 % pour une valeur de t > 2,82. 5. Résultats
Mesure de l'ARN total obtenu à partir des biopsies
La quantité totale d'ARN purifié à partir des biopsies est évaluée dans un premier temps par mesure de la densité optique à 260 nm et leur qualité estimée par la mesure du rapport des DO 260/290 nm.
Des quantités largement suffisantes d'ARN ont été obtenues à partir de chacune des biopsies (entre 2,1 et 6,3 μg) avec un degré de pureté (rapport de D.O. 260/280) satisfaisant.
La concentration en ARN total est amenée par dilution à une valeur calculée de 4 nanogrammes par μl. Ce procédé permet de réaliser les réactions de transcription reverse et d'amplification sur des quantités similaires d'ARN total pour tous les échantillons. La quantité d'ARN total présente dans la solution diluée est déterminée de façon quantitative par mesure de l'ARN ribosomial 28S, réalisée en triplicate.
Cette même solution d'ARN sera utilisée pour toutes les mesures des ARNs spécifiques dont les résultats sont exprimés par unité d'ARN 28S.
2. Mesure du taux à l'équilibre des ARNm des enzymes de maturation du procollagène : la carboxyprocollagène peptidase (C-PCP) et l'aminoprocollagène peptidase (N-PCP).
Les résultats exprimés en unités arbitraires par unité d'ARN 28S sont détaillés dans le tableau 1. Tableau 1: mesure des ARNm de C-PCP et N-PCP
C-PCP N-PCP sujet A P A/P A P A/P a 108 65 1,66 298 224 1,33 b 170 139 1 ,22 138 125 1 ,10 c 155 152 1,02 271 312 0,87 d 274 188 1,46 637 325 1,96 e 155 119 1,30 507 321 1,58 f 138 121 1 ,14 254 213 1 ,19 g 206 178 1 ,16 349 350 1 ,00 h 225 192 1,17 327 380 0,85 i 370 334 1 ,11 409 517 0,79 j 212 159 1 ,33 246 174 1 ,41
Moyenne 201 165 1 ,26** 344 294 1 ,21*
Ecart-type 76 71 0,19 143 114 0,37
Test de Student unilatéral : **t=4,56, p < 0,01
*t = 1 ,89, p < 0,05
Les 10 sujets de l'étude voient l'expression de la C-PCP accrue avec l'acide ascorbique et six sujets sur 10 présentent un rapport actif/placebo supérieur à 1 pour la N-PCP.
Lorsque ces mesures sont rapportées aux mesures équivalentes faites pour l'ARNm procollagènes I ou III, la valeur moyenne de ces rapports calculée sur la série des échantillons traités et des échantillons placebo est très proche indiquant une modulation coordonnée de l'expression des procollagènes et de leurs enzymes de maturation. 3. Mesure du taux à l'équilibre de l'ARNm de la lysyloxydase
Les résultats exprimés en unités arbitraires par unité d'ARN28S sont détaillées dans le tableau 2.
Tableau 2 : mesure de l'ARNm de la Lysyloxydase
Figure imgf000013_0001
Test de Student unilatéral : * t = 2,04, p < 0,05
Le taux à l'équilibre de l'ARNm de la lysyloxydase est accru par l'acide ascorbique chez 8 sujets sur 10. La moyenne des rapports A/P est significativement supérieure à 1 selon le T-test de Student unilatéral malgré une variabilité inter-individuelle plus importante que pour les autres enzymes.

Claims

REVENDICATIONS
1. Utilisation d'une quantité efficace d'acide ascorbique ou d'un de ses analogues dans une composition ou dans la préparation d'une composition destinée à être appliquée sur la peau pour augmenter la transformation des procollagènes de types I et III inactifs et solubles en procollagènes de types I et III actifs et insolubles.
2. Utilisation d'une quantité efficace d'acide ascorbique ou d'un de ses analogues dans une composition ou dans la préparation d'une composition destinée à être appliquée sur la peau pour augmenter la transformation des procollagènes de types I et III actifs et insolubles en collagenes de types I et III actifs, insolubles et stables.
3. Utilisation selon l'une des revendications précédentes, caractérisée par le fait que les analogues de l'acide ascorbique sont choisis parmi ses sels, ses esters, et ses sucres.
4. Utilisation selon la revendications précédente, caractérisée en ce que les analogues de l'acide ascorbique sont choisis parmi l'ascorbate de sodium, l'ascorbylphosphate de magnésium, de sodium, ses esters acétique, propionique, palmitique et l'acide ascorbique glycosilé.
5. Utilisation selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée par le fait que la quantité d'acide ascorbique ou de ses analogues représente de 0,001 % à 20%, préférentiellement de 0,1 % à 15%, et avantageusement de 3% à 10% du poids total de la composition.
6. Utilisation d'une quantité efficace d'acide ascorbique ou d'un de ses analogues dans une composition ou dans la préparation d'une composition destinée à être appliquée sur la peau pour augmenter la synthèse d'ARNm des enzymes aminoprocollagène peptidase (N-PCP) et/ou carboxyprocollagène peptidase (C- PCP) et/ou lysyloxydase
7. Procédé pour augmenter la transformation des procollagènes de types I et III inactifs et solubles en procollagènes de types I et III actifs et insolubles chez une personne déficiente en procollagènes de types I et III actifs et insolubles comprenant l'application topique sur la peau d'une quantité efficace d'acide ascorbique ou d'un de ses analogues.
8. Procédé pour augmenter la transformation des procollagènes de types I et III actifs et insolubles en collagenes de types I et III actifs, insolubles et stables chez une personne déficiente en collagenes de types I et III actifs, insolubles et stables, comprenant l'application topique sur la peau d'une quantité efficace d'acide ascorbique ou d'un de ses analogues.
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