FR2782093A1 - Procede de preparation de cultures de bacteries lactiques - Google Patents
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Abstract
La présente invention concerne un procédé de préparation de cultures de bactéries lactiques comprenant une étape d'addition, dans le milieu de culture desdites bactéries, d'un composé contenant du fer en association avec une étape d'aération du milieu de culture.L'invention a également pour objet l'application de ce procédés à la préparation de levains utilisables pour la transformation de produits à usage alimentaire, ou en tant que bactéries probiotiques.
Description
PROCEDE DE PREPARATION DE CULTURES DE BACTERIES
LACTIQUES
La présente invention concerne un nouveau procédé de préparation de cultures de bactéries lactiques, permettant un meilleur rendement, une meilleure survie et une meilleure conservation par rapport aux procédés classiquement
utilisés.
Les procédés de fermentation dans l'industrie en vue de la préparation de levain nécessitent une reproductibilité de toutes les étapes. Une des étapes clef est le bon redémarrage des bactéries composant le levain. Ce redémarrage dépend de l'état des bactéries lactiques (BL) composant le levain et donc de sa préparation. La préparation des levains fait intervenir des étapes lors desquelles les bactéries se trouvent en conditions de stress, par exemple par acidification du milieu (conséquence naturelle de la croissance des bactéries lactiques qui produisent de l'acide lactique), variation de température (froid pendant le stockage), présence ou absence d'oxygène. Ces différents facteurs altèrent la survie des différentes bactéries composant le levain. Ainsi, les différences entre les lots de levain se révèlent être importantes et conduisent souvent à des productions de qualité variable. L'importance de ce problème met en lumière la
nécessité de maîtriser certains paramètres de la production de levain.
Il existe un grand nombre d'information sur la capacité des bactéries lactiques à utiliser les sucres présents dans le milieu. Les sucres sont majoritairement convertis en acide lactique (produit majoritaire), acide acétique,
et pour une faible part en acétoïne, diacétyl, éthanol, acide formique, ou CO2.
Une partie des sucres peut être stockée sous forme de glycogène par exemple ou utilisée pour fabriquer des polymères telles que les exopolysaccharides. Les
bactéries lactiques sont considérées comme des bactéries fermentaires strictes.
Par contre, peu d'études ont été effectuées sur la capacité des bactéries lactiques à utiliser le fer présent dans le milieu. Le besoin en fer pour la croissance et la survie des bactéries lactiques est cependant une donnée controversée. Ainsi,
des études montrent (Sijpesteijn A.K., 1970, Antonie van Leeuwenhoek, 36: 335-
348) que du fer associé à un noyau protoporphyrique (hémine ou hématine par exemple) pouvait être incorporé par certaines bactéries lactiques, alors que dans au
moins une autre étude (Pandey A., et al., 1994, Appl. Microbiol. Biotech. 40: 735-
739) il a été montré que les bactéries lactiques ne peuvent pas internaliser le f;er
présent dans le milieu.
Lors de la préparation des levains, la croissance des bactéries est couplée à une diminution du pH du milieu qui, lorsque le pH atteint une valeur voisine de 4,5 induit l'arrêt des divisions cellulaires. Un bas pH diminue également la survie lors de la conservation des préparations bactériennes. Pour résoudre les problèmes liés à cette diminution de pH, les méthodes actuelles utilisent des milieux de culture tamponnés autour de pH 6 avec des cations associés à des carbonates, des hydroxydes, des phosphates ou des oxydes. La neutralisation du pH peut être faite soit en fin de croissance soit en continue. Cependant, ces apports dans le milieu de culture peuvent entraîner des problèmes pour les productions ultérieures. Par exemple, l'apport d'ions calcium lors de la neutralisation peut favoriser le développement de phages, et l'utilisation de levains contenant des ions phosphates ou des citrates peut conduire à un rendement de production fromagère plus faible car ces molécules augmentent la solubilité des caséines. Les bactéries ainsi préparées sont ensuite généralement conditionnées pour être soit congelées à une température d'environ -50 C soit lyophilisées puis stockées à -20 C ou à 4 C. Bien que les conditions soient parfaitement définies et contrôlées, il existe dans ces processus des conditions conduisant à la mort des cellules telles que des stress oxydants, osmotiques ou
thermiques (froid).
La présente invention permet de résoudre ces problèmes grâce à un nouveau procédé de préparation permettant un meilleur rendement et une survie
accrue des bactéries lactiques dans les levains.
L'invention a pour objet un procédé de préparation de cultures de bactéries lactiques comprenant une étape d'addition, dans le milieu de culture desdites bactéries, d'un composé contenant du fer sous forme incorporable dans les cytochromes bactériens, en association avec une étape d'aération du milieu de culture, - ledit procédé ayant un rendement supérieur à celui d'un procédé ne comprenant ni la susdite addition dudit composé contenant du fer, ni la susdite aération, et - ledit procédé permettant d'obtenir des cultures de bactéries lactiques dans lesquelles lesdites bactéries ont un taux de survie supérieur à celui résultant de la mise en oeuvre d'un procédé ne comprenant ni la susdite addition dudit
composé contenant du fer, ni la susdite aération.
Ce procédé de cultures de bactéries lactiques permet une augmentation du nombre de bactéries produites en fin de croissance, un maintien du pH final au environ de pH 6 sans avoir à tamponner le milieu, une survie prolongée à la
température de croissance ou dans diverses conditions de conservation.
Par aération, on désigne l'augmentation ou le maintien de la teneur en
oxygène présent dans le milieu de croissance.
L'aération peut être effectuée soit en agitant ou en brassant le milieu de croissance, soit en faisant passer de l'air ou un mélange gazeux contenant de
l'oxygène dans le milieu de croissance.
Selon un mode de réalisation avantageux du procédé de l'invention, le composé contenant du fer est choisi parmi: - des sels de fer, notamment chlorure ferreux, citrate ferrique, sulfate ferreux, - des noyaux porphyriques, notamment hème, hémine, hématine ou cytohémine, notamment dihydrochlorure de coproporphyrine I, tétraéthyl ester de coproporphyrine III, sel disodique de protoporphyrine IX, dichlorure d'hématoporphyrine IX, tétraisopropyl ester ou tétraméthyl ester de coproporphyrine, tétraisopropyl ester ou tétraméthyl ester de coproporphyrine III, hématoporphyrine IX, hémoglobine, protoporphyrine IX, diméthyl ester de protoporphyrine IX, protoporphyrine IX zinc, et le composé contenant du fer étant éventuellement en association avec de la
chlorophylle ou ses dérivés.
De façon avantageuse, le composé contenant du fer est choisi parmi
l'hémine ou l'hème.
Par chlorophylle, on désigne la chlorophylle a, la chlorophylle b. Un
exemple de dérivé de la chlorophylle est la chlorophylline.
Selon un mode de réalisation avantageux du procédé de l'invention, le fer est présent à raison d'environ 1 à environ 200 milligrammes par litre de culture
de bactéries.
Dans le procédé de l'invention, l'étape d'aération est une étape d'oxygénation du milieu de culture, l'oxygène étant présent à raison d'environ
au moins 5 millimoles par litre de milieu de culture de bactéries.
De façon avantageuse dans le procédé de l'invention en fin de culture, le pH se maintient à environ 6, sans qu'il soit nécessaire de neutraliser les acides
formés, notamment l'acide lactique.
Le fait que le pH se maintienne à environ 6 à la fin de la culture est un avantage car l'acidité est un facteur conduisant à la mortalité des cellules. La diminution du pH a également pour conséquence de limiter le développement des bactéries (par arrêt du métabolisme) sans que le milieu soit forcément limité
en nutriments.
On désigne par "fin de culture" l'arrêt des divisions cellulaires. Cet arrêt peut survenir à la suite de l'épuisement du milieu en un au moins de ces constituants, suite à l'acidification du milieu ou à un changement de température
(refroidissement par exemple).
De façon avantageuse dans le procédé de l'invention, la quantité de glucose contenue dans le milieu de culture et convertie en acide lactique est inférieure à environ 40 % en poids de la quantité totale de glucose présente, et est avantageusement d'environ 5 % à environ 30 % de la quantité totale de glucose présente, le pH étant d'environ 5 à environ 7, sans ajuster régulièrement
le pH ou tamponner le milieu.
Au cours de la culture, il y a principalement formation d'acides lactiques ou acétiques résultant de la transformation du glucose. Outre leur capacité
acidifiante, ces acides organiques sont des composés toxiques pour les cellules.
Le procédé de l'invention, ayant pour conséquence une production plus faible d'acides organiques (à savoir une production environ 2 à environ 10 inférieure à celle des procédés classiques), permet ainsi aux cellules d'avoir une meilleure survie, cette meilleure survie étant également observée lorsque le milieu est maintenu à un pH voisin de 7. L'acidification plus faible du milieu de culture a également pour conséquence de permettre une meilleure utilisation des composants du milieu de croissance. En effet, le maintien du pH à une valeur voisine de 6 et la faible concentration en acide organique sont des facteurs favorisant la croissance des cellules. Un autre avantage de ce procédé de préparation est que l'agitation associée à l'ajout d ' hème entraîne une modification des voies de métabolisme des sucres permettant ainsi une production d'énergie par molécule de glucose (ou un autre sucre) plus importante, une partie de ces sucres peuvent ainsi être utilisés pour produire de
la biomasse supplémentaire ou des métabolites secondaires.
Par bactéries lactiques, on désigne un groupe de bactéries appartenant à divers genres et utilisées dans des processus de fermentations de produits alimentaires. Ce groupe est principalement composé de bactéries dont le produit
principal du métabolisme des hydrates de carbone est l'acide lactique.
Cependant, des bactéries produisant de faibles quantités d'acide lactique (Leuconostoc et bactéries propioniques) sont incluses dans cette liste du fait de leur utilisation dans les processus de fermentation. Il s'agit généralement de bactéries lactiques des genres Lactococcus, Lactobacillus, Leuconostoc,
Propionibacterium, et Bifidobacterium, ou de Streptococcus salivarius.
Selon un mode de réalisation de l'invention, à l'issue de la phase de culture des bactéries lactiques, la quantité de bactéries lactiques obtenue est environ au moins 2 fois, notamment environ 2 à environ 5 fois, supérieure à celle obtenue par un procédé de préparation de cultures de bactéries lactiques ne faisant intervenir ni composé contenant du fer, ni étape d'aération. L'issue de la phase de culture des bactéries correspond à la fin de culture
telle que définie ci-dessus.
Le procédé de l'invention est tel que les bactéries lactiques possèdent la propriété, lorsque la température est maintenue d'environ 20 C à environ 50 C, selon la température de croissance optimale des bactéries lactiques concernées, de présenter un taux de survie d'environ 80% à environ 100%, 2 à 4 jours après l'arrêt de la phase de culture, et que 7 jours après l'arrêt de la phase de culture des bactéries lactiques, à la température d'environ 20 C à environ 50 C, selon la température de croissance optimale des bactéries lactiques concernées, les bactéries lactiques présentent un taux de survie d'environ au moins 2 fois, notamment environ au moins 10 fois, et notamment d'environ 10 à environ 105 fois, supérieur au taux de survie de cultures de bactéries lactiques obtenues par un procédé de préparation ne faisant intervenir ni composé contenant du fer, ni étape
d'aération.
Dans le procédé de l'invention, les bactéries lactiques sont conservées, à la température d'environ 4 C, et possèdent la propriété de présenter un taux de survie d'environ 100%, jusqu'à au moins 7 jours après l'arrêt de la phase de culture. L'invention concerne également un procédé de conservation de culture de bactéries lactiques obtenues par mise en oeuvre du procédé défini ci-dessus, comprenant une étape de congélation, notamment à une température d'environ
-195 C à environ -20 C.
Au cours de la congélation, il peut être avantageux d'utiliser un cryoprotecteur choisi parmi les composés suivants: glucose, lactose, raffinose, saccharose, tréhalose; adonitol, glycérol, mannitol, méthanol, polyéthylène glycol, propylène glycol, ribitol; alginate, bovine sérum albumine, carnitine, citrate, cystéine, dextran, diméthyl sulfoxyde, glutamate de sodium, glycine bétaïne, glycogène, hypotaurine, lait
écrémé, peptone, polyvinyle pyrolidine, taurine.
De façon avantageuse, on utilise l'alginate, le glycérol, la glycine bétaïne,
le lait écrémé, le tréhalose et le saccharose, comme cryoprotecteur.
Le procédé de conservation des cultures de bactéries lactiques obtenues par mise en oeuvre du procédé de l'invention peut comprendre ou non une étape de congélation, suivie d'une étape de lyophilisation, l'étape de congélation ou de lyophilisation pouvant avantageusement être précédée d'une étape de mise sous vide. Le procédé de conservation de culture de bactéries lactiques obtenues par mise en oeuvre du procédé de l'invention peut comprendre une étape de pulvérisation, ou d'atomisation sous vide, ou en atmosphère contrôlée, des
cultures de bactéries lactiques.
L'invention concerne également les cultures de bactéries lactiques telles
qu'obtenues selon le procédé de l'invention défini ci-dessus.
L'invention concerne également une culture de bactéries lactiques, caractérisée en ce que la quantité de glucose contenue dans le milieu de culture et convertie en acide lactique est inférieure à environ 40 % en poids de la quantité totale de glucose présente et est avantageusement d'environ 10 % à environ 30 % de la quantité totale de glucose présente, le pH étant d'environ 5 à
environ 7, et le milieu de culture ne contenant pas de tampon.
L'invention concerne également une culture de bactéries lactiques telle que définie ci-dessus, possédant la propriété, lorsque la température est maintenue d'environ 20 C à environ 50 C, selon la température de croissance optimale des bactéries lactiques concernées, de présenter un taux de survie d'environ 80% à environ 100%, 2 à 4 jours après l'arrêt de la phase de culture et, 7 jours après l'arrêt de la phase de culture des bactéries lactiques, à la température d'environ C à environ 50 C, les bactéries lactiques présentent un taux de survie d'environ au moins 2 fois, notamment environ au moins 10 fois, et notamment d'environ 10 à environ 105 fois supérieur au taux de survie de cultures de bactéries lactiques obtenues par un procédé de préparation ne faisant intervenir
ni composé contenant du fer, ni étape d'aération.
L'invention concerne également une culture de bactéries lactiques telle que définie ci-dessus, conservées à la température d'environ 4 C, possédant la propriété de présenter un taux de survie d'environ 100%, 7 jours après l'arrêt
de la phase de culture.
L'invention concerne également l'utilisation des cultures de bactéries lactiques obtenues par mise en oeuvre d'un procédé selon l'invention, notamment des cultures telles que définies ci-dessus, pour des transformations de produits à
usage alimentaire, ou pour une utilisation en tant que bactéries probiotiques.
Les cultures de bactéries lactiques peuvent être utilisées pour préparer des levains. Les levains obtenus par mise en oeuvre du procédé de l'invention peuvent par exemple être utilisés pour la fermentation des végétaux, la fabrication des pâtes à pain, de vins, de bière, et aussi des produits laitiers. Par levains, on désigne toutes préparations de bactéries utilisables pour l'ensemencement d'un milieu à transformer ou pour l'ensemencement d'un milieu en vue de production de molécules d'intérêt. L'invention concerne également l'utilisation des cultures de bactéries lactiques obtenues par mise en oeuvre d'un procédé selon l'invention, notamment des cultures définies ci-dessus, pour la préparation de molécules d'intérêt biotechnologique, telles que polymères de sucre, de texturants, de gélifiants, de polysaccharides, de probiotiques, de produits susceptibles de corriger la flore bactérienne, de protéines recombinantes, ou autres molécules biologiques
(nucléotides, cofacteurs, acides aminés, etc.).
L'invention sera davantage illustrée à l'aide des figures et des exemples
qui suivent.
1) Légende des figures - Figure 1: Croissance et survie de Lactococcus lactis cultivée et
conservée à 30 C.
Cette figure représente la comparaison de la croissance, du nombre de bactérie obtenu en fin de croissance et de la survie lorsque les souches de bactéries lactiques (ici Lactococcus lactis) sont cultivées à 30 C, avec ou sans hémine et aération selon le procédé de l'invention. Le nombre de cellules viables (ordonnées) est exprimé en fonction du temps (nombre de jours après ensemencement, correspondant au temps zéro), la température de conservation des bactéries étant de 30 C. La courbe avec des cercles correspond au procédé de l'art antérieur (sans hémine), alors que celle avec des carrés correspond à la
présence d'hémine dans le milieu de culture et à l'aération de ce dernier.
- Figure 2: Croissance et survie de Lactococcus lactis cultivée à 30 C
pendant 24h puis stockée à 4 C.
Cette figure représente la comparaison de la croissance, du nombre de bactérie obtenu en fin de croissance lorsque les souches de bactéries lactiques (ici Lactococcus lactis) sont cultivées à 30 C, et de la survie après transfert à 4 C 24h après l'ensemencement. La phase de culture à 30 C est effectuée dans un milieu avec ou sans hémine et aération selon le procédé de l'invention. Le nombre de cellules viables (ordonnées) est exprimé en fonction du temps (nombre de jours après ensemencement), la température de conservation des bactéries étant de 4 C. La courbe avec des cercles correspond au procédé de l'art antérieur (sans hémine ni aération), alors que celle avec des carrés correspond à la présence d'hémine dans le milieu de culture et à l'aération de ce dernier.
II) Exemples
Lactococcus lactis est une bactérie qui, lorsqu'elle est cultivée en milieu riche, en lait ou selon l'art antérieur à cette invention, présente les caractéristiques suivantes - production d'acide lactique comme produit majoritaire du métabolisme
des sucres (glucose ou lactose par exemple).
- Acidification du milieu jusqu'à une valeur de pH d'environ 4,5 dans un
milieu contenant 1% de glucose.
Cependant lorsque les bactéries sont cultivées dans les conditions décrites dans la présente invention, on peut observer que ces caractéristiques sont
modifiées. Les expériences suivantes en apportent la démonstration.
1) Mise en évidence d'un meilleur rendement et du maintien du pH à une valeur voisine de 6 lorsque les bactéries lactiques sont cultivées selon le
procédé de l' invention.
Les bactéries sont ensemencées dans un milieu de laboratoire (M17 supplémenté en glucose ou en lactose par exemple) au dilution de 1/100 ou de 1/1000 à partir d'une culture saturée cultivée pendant 24h à 30 C. De l'hémine à la concentration finale de 10/g/ml [solution stock à 0,5 mg/ml (100 mg d'hémine dans 2 ml de NaOH 5N, puis ajouter 198 ml d'eau puis autoclaver à C pendant 20 minutes)] est ensuite ajouté avant de mettre les cultures à C sous agitation pour oxygéner les cultures (200 rotations par minute au minimum) (remarque, l'oxygénation pourrait être effectuée en faisant passer de l'air dans le milieu). Après 24h00 de croissance, des aliquotes sont prélevés pour mesurer la densité optique à 600 nm (DO6oonn,), le nombre de bactéries
viables, le pH final et la concentration en acide lactique du milieu (Tableau 1).
Tableau 1: Effet de l'hémine et de l'aération du milieu en fonction de la concentration en glucose sur la DO (600 nm), le nombre de cellules viables, le pH, la production d'acide lactique après 24h de croissance A: Culture sans hemin ni agitation Concentration en 5 6 7 8 9 10 glucose (g/l) Facteurdedilution 100 1000 100 1000 100 1000 100 1000 100 1000 100 1000 DO6oo00nm 2,8 2,4 2,22 2,37 2,4 2, 78 2,82 2,8 3,05 2,95 3,1 2,8 Compte de bactéries viables (x109) 3,25 3,44 3,43 3,6 3,2 3,2 3,5 3,5 3,5 3,7 3, 9 2,4 viables (xI109) pH 5,77 5,74 5,51 5,52 5,13 5,19 4,96 4,92 4,71 4,65 4,56 4,55 Concentration en non non 4,81011 11lo, Ill 69 non 8 acide lactique (q/il) mesuré- 33 su ' - mesure iusi J mesur mesure1 B: Culture avec hémine et aérarion Concentration en 6 7 8 9 1 glucose (g/I) Facteur de dilution100 1000 100 1000 100 1000 100 1000 100 1000 100 1000 DO600o nm 4,6 4,5 5,1 5,5 5,6 5,7 5,9 5,4 5,9 5,8 6,1 6,2 Compte de bactéries mviables (x109) 5,7 5,7 6 7,6 9,1 8,6 8,9 9,3 9,2 9,4 10,1 9,6 viables (x109) pH 6,2 6,19 6,25 6,13 6,09 6,07 6, 04 6,03 6,02 6,01 6,01 5,99 Concentration en non 0,12 non 0, 14 non 0,19 non 0,35 non non 098 acide lactique (qA)/ mesuré mesuré mesuré mesuré mesuré mesuré On peut observer dans le tableau 1 que la biomasse est toujours plus importante lorsque les cellules sont cultivées en présence d'hémine et d'oxygène. Cette augmentation est mise en évidence par les valeurs de Densité optique plus importante et par un nombre de cellules viables plus élevé lorsque les cellules sont cultivées en présence d'hémine et d'oxygène. On peut également noter que, lorsque les cellules sont cultivées en présence d'hémine et d'oxygène, le pH varie peu et reste stable autour d'une valeur d'environ 6,1 quelque soit la concentration en glucose testé alors que le pH diminue fortement (passage de 5,7 à 4,5 pour une concentration de glucose variant de 0,5 % à 1%) pour les cellules cultivées dans les conditions classiques. On remarque également que la production d'acide lactique par les cellules cultivées en présence d'hémine et d'oxygène est faible et représente toujours une valeur inférieure à 10% de la quantité de sucre ajouté alors que dans le cas des cellules cultivées dans les conditions classiques, environ 80% du glucose ajouté est retrouvé sous la forme d'acide lactique. 2) Mise en évidence d'une survie plus importante lors d'un stockage à oC. Les bactéries sont ensemencées à la dilution de 1/1000 à partir d'une culture saturée dans un milieu de laboratoire, M17 supplémenté avec 1% de glucose. Les cultures sont ensuite divisées en deux parts égales et de l'hémine à la concentration finale de 10túg/ml est ajouté dans une de ces deux cultures. La culture ne contenant pas d'hémine est incubée à 30 C sans agitation alors que celle contenant de l'hémine est incubée à 30 C avec agitation pour oxygéner les cultures (200 rotations par minute au minimum). Des aliquotes de ces deux cultures sont prélevés régulièrement pendant la phase de croissance exponentielle pour suivre la viabilité, la vitesse de croissance, et le pH. Après 24h de croissance, les cultures sont incubées (stockées) dans une étuve à 30 C sans agitation et des aliquotes sont prélevés toutes les 24h pour suivre la
viabilité des cellules (Tableau 2 et Figure 1).
Tableau 2: Evolution de la survie lors du stockage à 30 C de cultures cutivées dans les conditions classiques ou en présence d'liémine et d'aération Nombre de jours après l'ensemencement 2 3 5 6 M17 1% glucose 9, 5 x 105 2,45 x 109 4,5 x 108 3,8 x 106 2,2 x 104 2,2 x 102 M17 1% glucose + hémine I 7%et luaération + i 1 x 106 1,76 x 10' 1,71 x 10' 5,32 x 10 4,3 x 108 8,5 x107 et aération On peut observer sur la courbe de la figure 1 une survie beaucoup plus importante des cellules cultivées en présence d'hémine et d'oxygène par rapport à celle cultivées dans les conditions classiques. Cette amélioration de la survie est visible après un jour de stockage. On observe qu'il n'y a pas de perte de viabilité pour les cellules cultivées en présence d'hémine et d'oxygène alors qu'on peut observer une mortalité de pratiquement 10 fois pour la souche cultivée dans les conditions classiques par rapport à la souche cultivée avec ll aération en présence d'hémine. Cette mortalité est d'environ 107 fois pour la souche cultivée dans les conditions classiques après 6 jours de stockage à 30 C alors qu'elle n'est que d'environ 100 fois pour la souche cultivée avec aération
en présence d'hémine.
3) Mise en évidence d'une survie plus importante lors d'un stockage à 4 C.L Les bactéries ont été cultivées comme dans l'expérience précédente mais le stockage, effectué 24h après l'ensemencement, est fait à 4 C au lieu de 30 C
(Tableau 3 et Figure 2).
Tableau 3: Evolution de la survie lors du stockage à 40C de cultures cultivées dans les conditions classiques ou en présence d'hémine et d'aération Nombre de jour après 1 2 3 5 l'ensemencement M17 1% glucose 9,4 x 105 2,4 x 109 2,3 x 109 2,1 x 109 1,9 X 108 M17 1% glucose + 1, 2 x 106 1,56 x 10 10 1,41 x 10' 1,35 x 101 1,38 x 101 hémine et aération Il est significatif sur cette courbe que les cellules cultivées en présence d'hémine et d'oxygène présente une survie plus importante lors d'une conservation au froid (4 C) que des cellules cultivées dans les conditions classiques. Nous pensons que cette augmentation d'un facteur 10 est
représentative d'un meilleur état physiologique des cellules en fin de croissance.
Claims (18)
1. Procédé de préparation de cultures de bactéries lactiques comprenant une étape d'addition, dans le milieu de culture desdites bactéries, d'un composé contenant du fer sous forme incorporable dans les cytochromes bactériens, en association avec une étape d'aération du milieu de culture, - ledit procédé ayant un rendement supérieur à celui d'un procédé ne comprenant ni la susdite addition dudit composé contenant du fer, ni la susdite aération, et - ledit procédé permettant d'obtenir des cultures de bactéries lactiques dans lesquelles lesdites bactéries ont un taux de survie supérieur à celui résultant de la mise en oeuvre d'un procédé ne comprenant ni la susdite addition dudit
composé contenant du fer, ni la susdite aération.
2. Procédé selon la revendication 1, dans lequel le composé contenant du fer est choisi parmi: - des sels de fer, notamment chlorure ferreux, citrate ferrique, sulfate ferreux, - des noyaux porphyriques, notamment hème, hémine, hématine ou cytohémine, notamment dihydrochlorure de coproporphyrine I, tétraéthyl ester de coproporphyrine III, sel disodique de protoporphyrine IX, dichlorure d'hématoporphyrine IX, tétraisopropyl ester ou tétraméthyl ester de coproporphyrine, tétraisopropyl ester ou tétraméthyl ester de coproporphyrine III, hématoporphyrine IX, hémoglobine, protoporphyrine IX, diméthyl ester de protoporphyrine IX, protoporphyrine IX zinc, et le composé contenant du fer étant éventuellement en association avec de la
chlorophylle ou ses dérivés.
3. Procédé selon l'une des revendications 1 ou 2, dans lequel le fer est
présent à raison d'environ 1 à environ 200 milligrammes par litre de culture de bactéries.
4. Procédé selon l'une des revendications 1 à 3, dans lequel l'étape
d'aération est une étape d'oxygénation du milieu de culture, l'oxygène étant présent à raison d'environ au moins 5 millimoles par litre de milieu de culture
de bactéries.
5. Procédé selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisé en ce qu'en fin
de culture, le pH se maintient à environ 6, sans qu'il soit nécessaire de
neutraliser les acides formés, notamment l'acide lactique.
6. Procédé selon l'une des revendications 1 à 5, dans lequel la quantité de
glucose contenue dans le milieu de culture et convertie en acide lactique est inférieure à environ 40 % en poids de la quantité totale de glucose présente, et est avantageusement d'environ 5 % à environ 30 % de la quantité totale de glucose présente, le pH étant d'environ 5 à environ 7, sans ajuster régulièrement
le pH ou tamponner le milieu.
7. Procédé selon l'une des revendications 1 à 6, dans lequel les bactéries
lactiques sont choisies parmi Lactococcus, Lactobacillus, Leuconostoc,
Propionibacterium, Bifidobacterium, ou Streptococcus salivarius.
8. Procédé selon l'une des revendications 1 à 7, dans lequel à l'issue de la
phase de culture des bactéries lactiques, la quantité de bactéries lactiques obtenue est environ au moins 2 fois, notamment environ 2 à environ 5 fois, supérieure à celle obtenue par un procédé de préparation de cultures de bactéries
lactiques ne faisant intervenir ni composé contenant du fer, ni étape d'aération.
9. Procédé selon l'une des revendications 1 à 8,
dans lequel les bactéries lactiques possèdent la propriété, lorsque la température est maintenue d'environ 20 C à environ 50 C, selon la température de croissance optimale des bactéries lactiques concernées, de présenter un taux de survie d'environ 80% à environ 100%, 2 à 4 jours après l'arrêt de la phase de culture, et dans lequel 7 jours après l'arrêt de la phase de culture des bactéries lactiques, à la température d'environ 20 C à environ 50 C, selon la température de croissance optimale des bactéries lactiques concernées, les bactéries lactiques présentent un taux de survie d'environ au moins 2 fois, notamment environ au moins 10 fois, et notamment d'environ 10 à environ 105 fois, supérieur au taux de survie de cultures de bactéries lactiques obtenues par un procédé de préparation ne faisant intervenir ni composé contenant du fer, ni étape
d'aération.
10. Procédé selon l'une des revendications 1 à 8 dans lequel les bactéries
lactiques conservées, à la température d'environ 4 C, possèdent la propriété de présenter un taux de survie d'environ 100%, jusqu'à au moins 7 jours après
l'arrêt de la phase de culture.
11. Procédé de conservation de culture de bactéries lactiques obtenues par
mise en oeuvre du procédé selon l'une des revendications 1 à 8, comprenant une
étape de congélation, notamment à une température d'environ -195 C à environ
-20 C.
12. Procédé de conservation de culture de bactéries lactiques obtenues par
mise en oeuvre du procédé selon l'une des revendications I à 8, comprenant ou
non une étape de congélation, suivie d'une étape de lyophilisation, l'étape de congélation ou de lyophilisation pouvant avantageusement être précédée d'une
étape de mise sous vide.
13. Procédé de conservation de culture de bactéries lactiques obtenues par
mise en oeuvre du procédé selon l'une des revendications 1 à 9, comprenant une
étape de pulvérisation, ou d'atomisation sous vide, ou en atmosphère contrôlée,
des cultures de bactéries lactiques.
14. Culture de bactéries lactiques, caractérisée en ce que la quantité de glucose contenue dans le milieu de culture et convertie en acide lactique est inférieure à environ 40 % en poids de la quantité totale de glucose présente et est avantageusement d'environ 5 % à environ 30 % de la quantité totale de glucose présente, le pH étant d'environ 5 à environ 7, et le milieu de culture ne
contenant pas de tampon.
15. Culture de bactéries lactiques selon la revendication 14, possédant la propriété, lorsque la température est maintenue d'environ 20 C à environ 50 C, selon la température de croissance optimale des bactéries lactiques concernées, de présenter un taux de survie d'environ 80% à environ 100%, 2 à 4 jours après l'arrêt de la phase de culture et, 7 jours après l'arrêt de la phase de culture des bactéries lactiques, à la température d'environ 20 C à environ 50 C, les bactéries lactiques présentent un taux de survie d'environ au moins 2 fois, notamment environ au moins 10 fois, et notamment d'environ 10 à environ 105 fois supérieur au taux de survie de cultures de bactéries lactiques obtenues par un procédé de préparation ne faisant intervenir ni composé contenant du fer, ni
étape d'aération.
16. Culture de bactéries lactiques selon la revendication 14, conservées à la température d'environ 4 C, possédant la propriété de présenter un taux de
survie d'environ 100%, 7 jours après l'arrêt de la phase de culture.
17. Utilisation des cultures de bactéries lactiques obtenues par mise en
oeuvre d'un procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 13,
notamment des cultures selon l'une des revendications 14 à 16, pour des
transformations de produits à usage alimentaire, ou pour une utilisation en tant
que bactéries probiotiques.
18. Utilisation des cultures de bactéries lactiques obtenues par mise en
oeuvre d'un procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 13,
notamment des cultures selon l'une des revendications 14 à 16 pour la
préparation de molécules d'intérêt biotechnologique, telles que polymères de sucre, de texturants, de gélifiants, de polysaccharides, de probiotiques, de produits susceptibles de corriger la flore bactérienne, de protéines recombinantes, ou autres molécules biologiques telles que nucléotides,
cofacteurs, et acides aminés.
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