FR2773563A1 - Procede de controle de la division et/ou de l'elongation de cellules eucaryotes - Google Patents

Abstract

L'invention concerne un procédé pour contrôler la division et/ ou l'élongation de cellules eucaryotes, et en particulier de cellules végétales, en modifiant l'expression et/ ou l'activité d'une protéine de type TONNEAU1 dans lesdites cellules. Ce procédé permet en particulier d'agir sur la taille des plantes, ou de leurs organes.La modification de l'expression et/ ou de l'activité d'une protéine TONNEAU1 peut par exemple, être effectuée par l'intermédiaire du gène codant pour cette protéine, ou des séquences contrôlant son expression, ou par utilisation d'inhibiteurs ou d'activateurs de ladite protéine.

Description

PROCEDE DE CONTROLE DE LA DIVISION ET/OU DE L'ELONGATION
DE CELLULES EUCARYOTES.

La présente invention concerne le clonage et l'expression de gènes permettant d'agir sur l'architecture, la croissance ou la fertilité des plantes.

L'architecture d'une plante supérieure est déterminée essentiellement par le contrôle des divisions et de l'élongation cellulaires. Les cellules des racines, des feuilles, des tiges, et des fleurs de la plante se forment initialement dans les méristèmes. La conversion des ébauches d'organes en organes matures nécessite un contrôle précis de l'allongement de ces cellules.

Des mutations affectant le contrôle de l'élongation aboutissent à des modifications importantes de l'aspect des plantes. Ainsi, chez Arabidopsis thaliana, on a observé des mutants dénommés tonneau , qui présentent un phénotype très affecté par rapport au type sauvage. Ces plantes sont capables de générer les primordia racinaires, foliaires et floraux, sans pouvoir les faire grandir et leur donner une forme mature appropriée. Elles présentent un fort raccourcissement des racines, des tiges et des pétioles de feuille, ainsi que des organes floraux et reproducteurs.

Tous les organes sont présents, mais ont une taille et une forme modifiée. Les cotylédons, de taille plus réduite que ceux du type sauvage, ont une épaisseur accrue. L'hypocotyle et la racine, très courts et de fort diamètre, s'allongent peu au cours du développement. De nombreux poils racinaires, des racines secondaires et de petites feuilles en forme d'écailles et charnues apparaissent. Après 8 à 10 semaines de culture in vitro, se développe une hampe florale portant des fleurs stériles fortement modifiées, ainsi que des ramifications secondaires.

Des études de développement de l'embryon effectuées par l'équipe des Inventeurs sur des mutants tonneaul (tonl) d'Arabidopsis thaliana, ont montré que le zygote était affecté dès la première mitose par une modification de l'orientation du plan de division [TRAAS et al., Nature, 375, 676-677, (1995)]. Cette altération se poursuit aux stades ultérieurs par une perturbation des divisions cellulaires entraînant une modification de la forme et de la taille des cellules par rapport au type sauvage.
il est généralement admis que le cytosquelette intervient dans l'élongation cellulaire et la mise en place du plan de division. Lors de la division cellulaire, les microtubules s'organisent pour former une structure dénommée : anneau de préprophase , qui déterminera précisément l'emplacement du plan de division, où le phragmoplaste sera constitué et la future paroi construite. Les inhibiteurs de polymérisation des microtubules bloquent aussi les processus d'allongement cellulaire, ce qui révèle leur rôle dans ce processus.

Les Inventeurs ont étudié l'organisation du cytosquelette chez des plantules sauvages d'Arabidopsis thaliana et chez des plantules du mutant tonl. Grâce à des immunomarquages effectués à l'aide d'anticorps spécifiques des tubulines, ils ont ainsi montré qu'à l'interphase, les microtubules corticaux des cellules de plantes sauvages sont disposés perpendiculairement à l'axe d'élongation de la cellule, alors qu'ils se répartissent aléatoirement dans les cellules mutantes.

Dans les cellules mutantes, le fuseau achromatique se met correctement en place mais l'anneau de préprophase n'est jamais présent, ce qui se traduit par une orientation aléatoire du plan de division [TRAAS et al., publication précitée]
Les Inventeurs ont maintenant isolé chez
Arabidopsis thaliana, le gène TONNEAU1 (TON1) dont la mutation est responsable du phénotype TONNEAU décrit ci-dessus. Ils ont en outre identifié des homologues de ce gène chez d'autres plantes, en particulier le riz, et ont constaté qu'il était très conservé chez les plantes supérieures (on observe par exemple 77% d'identité entre le gène TONNEAU1 d'Arabidopsis et celui du riz, et 36 acides aminés contigus identiques chez les deux protéines).

La présente invention a pour objet un procédé pour contrôler le processus de division et/ou d'élongation de cellules eucaryotes, et en particulier de cellules végétales, caractérisé en ce que l'on modifie l'expression et/ou l'activité d'une protéine de type
TONNEAU1 dans lesdites cellules.

La présente invention a également pour objet l'utilisation d'une séquence d'acide nucléique dérivée de tout ou partie de la séquence d'un gène de type TONNEAU1 pour l'obtention d'un produit permettant de modifier l'expression et/ou l'activité d'une protéine de type
TONNEAU1 dans des cellules eucaryotes, et en particulier des cellules végétales.

Au sens de la présente invention, on entend par : protéine de type TONNEAU1 , non seulement une protéine codée par un quelconque des gènes TONNEAU d'Arabidopsis ou du riz représentés sur la figure 3, mais également toutes les protéines homologues, ce qui inclut en particulier les protéines TONNEAU1 codées par des gènes orthologues d'autres plantes. De même, on entend par : séquence d'un gène de type TONNEAU1 , non seulement la séquence de l'un quelconque des gènes
TONNEAU1 d'Arabidopsis ou du riz représentés sur la figure 3, mais également les séquences de gènes homologues, et en particulier celles des gènes orthologues d'autres organismes, et en particulier d'autres plantes supérieures. Ces gènes peuvent être aisément identifiés et clonés sur la base de leur homologie avec le gène TONNEAU1 d'Arabidopsis ou son orthologue du riz. Des séquences d'acide nucléique dérivées de tout ou partie de la séquence du gène
TONNEAU1 , comprennent en particulier
- les séquences d'ADNc de protéines de type
TONNEAU1 ou des portions de ces séquences d'ADNc, ainsi que leurs produits de transcription ; il peut s'agir par exemple de la totalité d'une séquence codant pour une protéine de type TONNEAU1, ou d'une portion de cette séquence codante, et/ou de tout ou partie des régions 5' et 3' non-traduites. Ces séquences peuvent être utilisées en orientation sens ou antisens
- des séquences d'acide nucléique susceptibles d'être obtenues par mutagénèse à partir de la séquence d'un gène de type TONNEAU1 tel que défini cidessus.

La modification de l'expression et/ou l'activité de protéines de type TONNEAU1 dans des cellules de plantes permet, en agissant sur le développement de celles-ci, de contrôler la morphologie et l'architecture desdites plantes, et en particulier de modifier la taille de la plante ou celle de certains de ces organes.

Par exemple, en inhibant, totalement ou partiellement l'expression ou l'activité d'une protéine
TONNEAU1 dans une plante ou dans certains organes de celles-ci, on induira une réduction de la taille de ladite plante, ou desdits organes; au contraire, si l'on surexprime ou si l'on active la protéine TONNEAU1, on induira une augmentation de la taille de la plante ou des organes concernés.

Selon un mode de mise en oeuvre préféré de la présente invention, on modifie l'expression et/ou l'activité de la protéine de type TONNEAU1 en effectuant la mutagénèse du gène codant pour ladite protéine.

Cette mutagénèse peut être effectuée par tout moyen approprié, connu en lui même ; on peut par exemple procéder à la délétion de tout ou partie du gène
TONNEAU1, et/ou à l'insertion d'une séquence exogène ; on peut également introduire une ou plusieurs mutations ponctuelles, pour interrompre ou décaler le cadre de lecture, ou bien pour obtenir une protéine TONNEAU1 mutante, plus ou moins active que la protéine sauvage on peut également produire des homologues nonfonctionnels de TONNEAU1 à effet antagoniste dominant.

La présente Invention englobe également des séquences d'acide nucléique susceptibles d'être obtenues par mutagénèse à partir de la séquence d'un gène de type
TONNEAU1 tel que défini ci-dessus, et en particulier des séquences d'acide nucléique susceptibles d'être obtenues par introduction d'une mutation propre à modifier l'expression et/ou l'activité de la protéine TONNEAU1.

Selon un autre mode de mise en oeuvre de la présente invention, on modifie l'expression de la protéine TONNEAU1 en associant une séquence dérivée de la séquence d'un gène TONNEAU avec des séquences appropriées de contrôle de la transcription.

Par exemple, pour réguler le niveau d'expression d'une protéine de type TONNEAU1, on pourra remplacer le promoteur naturel de cette protéine par un promoteur fort, ou au contraire l'associer à des séquences de type silenceur.

On peut également inhiber l'expression de la protéine TONNEAU1 au niveau post-transcriptionnel, par co-suppression ou suppression antisens, en introduisant dans les cellules des constructions d'ADN recombinant produisant dans ces cellules des transcrits sens ou antisens dérivés de l'ADNc de cette protéine.

La présente invention englobe également les constructions d'ADN recombinant permettant de réguler le niveau d'expression d'une protéine de type TONNEAU1, et contenant au moins une séquence dérivée de tout ou partie de la séquence d'un gène de type TONNEAU1, sous contrôle transcriptionnel d'un promoteur approprié.

Avantageusement, on pourra, si on le souhaite, utiliser un promoteur inductible, et/ou tissu-spécifique.

L'invention englobe également des vecteurs recombinants portant les constructions d'ADN recombinant définies ci-dessus, ainsi que des cellules et des organismes pluricellulaires transformés par ces constructions ; la présente invention englobe en particulier des cellules végétales ou des végétaux transformés par des constructions d'ADN recombinant définies ci-dessus.

Selon encore un autre mode de mise en oeuvre de la présente invention, on utilise au moins un produit inhibiteur ou activateur de la protéine TONNEAU1.

On peut par exemple, pour inhiber l'activité de TONNEAU1, utiliser des anticorps dirigés contre cette protéine ; il peut s'agir en particulier d'anticorps recombinants produits dans la plante concernée, ou dans certains tissus de celle-ci.

On peut également sélectionner des produits inhibiteurs ou activateurs de TONNEAU1 sur la base de leur affinité sélective pour cette protéine. Ces produits peuvent par exemple être criblés sur des cellules végétales cultivées in vitro, chez lesquelles TONNEAU1 est nécessaire à l'élongation, ou sur des systèmes hétérologues (bactérie, levure) dans lesquels on exprime la protéine TONNEAU1, ou sur des systèmes acellulaires, par recherche d'interactions de TONNEAU1 avec divers ligands.

Du fait du rôle essentiel joué par la protéine TONNEAU1 dans le processus d'élongation, la modification de son expression et/ou de son activité trouve de nombreuses applications dans le domaine des productions végétales.

Par exemple, pour obtenir une réduction de la taille d'une plante, on peut comme indiqué ci-dessus, inhiber dans celle-ci la production de la protéine
TONNEAU1, en mettant en oeuvre des techniques classiques telles que la suppression antisens, ou la co-suppression, ou bien inhiber l'activité de TONNEAU1 par la production d'homologues non-fonctionnels de cette protéine à effet antagoniste dominant, ou par la production d'anticorps dirigés contre TONNEAU1.

Avantageusement, l'expression ou l'activité de TONNEAU1 pourront être bloquées grâce à l'emploi d'un promoteur inductible, afin d'induire un phénomène de nanisme contrôlé dans le temps, ou bien cette inhibition pourra être sélectivement obtenue dans les tissus-cibles souhaités (ex : tige, pétiole de la feuille, organes floraux) grâce à l'emploi de promoteurs tissuspécifiques.

Ceci permet de modifier sélectivement l'architecture de la plante et d'obtenir par exemple une réduction de taille de la tige chez les céréales, de l'encombrement latéral, et la hauteur chez les hybrides, en particulier les hybrides de mais, de colza et de tournesol. Cette réduction de taille permet par exemple d'augmenter l'indice de récolte, et/ou d'obtenir une meilleure résistance aux aléas climatiques (verse).

La modification de l'expression et/ou de l'activité de TONNEAU1 peut également permettre de modifier l'architecture florale pour induire une stérilité mâle (par réduction de la taille et blocage de la déhiscence des anthères), supprimer les pétales (par exemple pour produire des colzas apétales permettant une meilleure résistance aux maladies cryptogamiques, et une meilleure photosynthèse), ou induire la stérilité femelle d'espèces ornementales afin d'accroître la période de floraison.

L'inhibition tissu-spécifique de l'expression et/ou de l'activité du gène TONNEAU1 peut également porter sur le système racinaire, par exemple dans le cas de plantes ornementales, pour contrôler son développement en pot.

Chez les ligneux on peut aussi obtenir une amélioration de la qualité des fibres et de la qualité mécanique du bois en réduisant l'élongation des cellules, ou au contraire en l'augmentant, par surexpression de TONNEAUX.

On peut également modifier par des moyens similaires à ceux mentionnés ci-dessus pour TONNEAU1, l'activité de protéines homologues, présentes dans des cellules eucaryotes animales ou végétales. En agissant sur ces protéines on peut ainsi, par exemple, envisager de contrôler la multiplication des cellules, leur dispersion dans l'organisme, et d'inhiber ainsi, par exemple, le développement de tumeurs.

La présente invention sera mieux comprise à l'aide du complément de description qui va suivre, qui se réfère à des exemples non-limitatifs illustrant l'identification, le clonage, et l'expression de gènes
TONNEAU1.

EXEMPLE 1 : IDENTIFICATION DU (DES) GENE(S) TONNEAU1
Un mutant de phénotype tonneau a été identifié au cours du criblage de la collection de mutants d'insertion de l'INRA-Versailles. Ce mutant (ACL4) porte une insertion d'un fragment d'ADN porteur d'un marqueur de résistance à la kanamycine. Sur 2256 graines récoltées à partir d'une plante hétérozygote pour le marqueur de résistance à la kanamycine, 1710 descendants étaient normaux, et 546 avaient le phénotype tonneau. Tous les mutants se sont révélés résistants à la kanamycine, indiquant une étroite liaison entre la mutation tonneaul, nucléaire récessive et le fragment d'ADN-T inséré. Par la suite une seconde insertion ADN-T, dépourvue de marqueur de résistance à la kanamycine fonctionnel, a été identifiée.

Afin d'analyser plus précisément les sites d'insertions de l'ADN-T, les Inventeurs ont réalisé une banque génomique du mutant ACL4, car les séquences flanquant l'ADN-T n'avaient pu être isolées par des méthodes basées sur la PCR. La cartographie des séquences flanquant les deux insertions met en évidence la présence de réarrangements chromosomiques : une translocation réciproque impliquant le bas des chromosomes 2 et 3 (portant environ sur 20 centiMorgans) et une inversion portant sur 40 centiMorgans correspondant à la partie centrale du chromosome 2. Par ailleurs, les résultats de cartographie de la mutation vont dans le même sens puisque des marqueurs du chromosome 2 et du chromosome 3 sont étroitement liés à la mutation et les recombinaisons sont bloquées sur une grande partie du chromosome 2.

Des analyses moléculaires réalisées sur des plantules mutantes individuelles ont mis en évidence que 30% des mutants possédaient un chromosome 2 transloqué et un chromosome 2 de type sauvage et 708 2 chromosomes 2 transloqués. Par ailleurs tous les mutants testés présentent 2 copies transloquées pour le chromosome 3.

Ces éléments ont conduit les Inventeurs à analyser la région du bas du chromosome 3, proche des marqueurs cdc2B et BGL1 [LISTER et DEAN Weeds World, 4(i), 1-10 (1997)] impliquée dans l'insertion d'ADN-T afin d'identifier le gène causant le phénotype ton. Deux banques de chromosomes bactériens artificiels (BAC =
Bacterian Artificial Chromosome), la banque TAMU accessible à l'adresse : http://aims.cps.msu.edu/aims/ et la banque IGF accessible à l'adresse http://www.rzpd.de/ ont été criblées sur la base des séquences flanquant les insertions d'ADN-T du mutant
ACL4.

Cinq clones BAC ont été isolés et une carte de restriction a permis de les positionner les uns par rapport aux autres. Ces clones et la carte de restriction correspondante sont représentés sur la Figure 1. Le clone
BAC 2F19 issu de la banque TAMU, et recouvrant largement la région du site d'insertion de l'ADN-T a été utilisé pour les diverses analyses ; et des fragments SalI/XhoI et SalI/PvuII ont été sous-clonés, partiellement séquencés et utilisés pour les analyses de complémentation fonctionnelles.

Légende de la figure 1
Les séquences flanquant les insertions d'ADN
T isolées qui ont été utilisées comme sondes pour cribler les deux banques génomiques de type BAC sont représentées par une bande noire. Les cinq clones BACs isolés sont représentés par des bandes hachurées. La position des fragments SalI/XhoI et SalI/PvuII du clone BAC 2F19 qui ont été isolés et utilisés pour les analyses de complémentation fonctionnelle des mutants est indiquée au bas de la figure. Une portion de 7,1 kpb du fragment
SalI/XhoI qui a été sous-clonée et séquencée est représentée par une double flèche hachurée. Les hybridations moléculaires de type Southern et les analyses par PCR ont mis en évidence une duplication des gènes TONNEAU1 (cf. exemple 2 ci-dessous) . Ces 2 gènes sont représentés par les flèches noires.

EXEMPLE 2 :IDENTIFICATION DE DEUX GENES HOMOLOGUES
PRESENTS AU LOCUS TONNEAU1
Afin de détecter d'éventuels remaniements ou délétions dans le fragment cloné, la séquence de 7,1 kpb isolée à partir du BAC 2F19 (cf. Figure 1) a été comparée aux séquences flanquant les insertions d'ADN-T chez les mutants tonl ACL4.

Cette comparaison a mis en évidence, chez ces derniers, une délétion de 1,4 kpb au point d'insertion de 1 'ADN-T.

Des amplifications par PCR ont ensuite été réalisées à partir de l'ADN génomique du mutant tonl
ACL4, et du l'ADN du BAC 2F19, en utilisant différentes amorces. La position de ces amorces est indiquée sur la
Figure 2 et sur la Figure 3.

La première amplification a été effectuée avec les amorces P5 (localisée dans la délétion chez les mutants tonl) et P6. Aucune amplification n'était attendue chez les plantes de type mutant alors que la taille attendue du fragment amplifié était de 430 pb dans les séquences génomiques de type sauvage. Or, de façon surprenante, un produit d'amplification de 330 pb a été obtenu chez les plantes de type mutant, et deux produits d'amplification de 330 et 430 pb pour les séquences de type sauvage. Le séquencage de ces fragments de 330 et 430 pb montre qu'ils présentent une identité de 95,1% et 93,5 au niveau de leur régions terminales, alors que cette identité diminue fortement dans la partie centrale.

L'analyse d'autres séquences obtenues à partir de cette région (fragment amplifié par les amorces TlAf et T2Br) a montré que les deux régions conservées correspondent à deux fragments d'exons encadrant un intron. Ces résultats indiquent la présence d'un second gène présentant une homologie avec la séquence affectée chez les mutants tonl.

EXEMPLE 3 : ISOLEMENT ET SEQUENÇAGE DES GENES TON1
Afin d'analyser les régions affectées par la délétion chez les mutants tonl, et d'établir le degré d'identité entre les deux gènes homologues affectés par cette mutation, la région génomique de type sauvage a été clonée et séquencée.

Des analyses préliminaires d'hybridation et d'amplification n'ayant pas mis en évidence de différence notable entre 1'ADN génomique végétal (de type WS) et l'ADN extrait des BACs sélectionnés (ColO), le fragment de 7,1 kb de 1'ADN isolé à partir du BAC 2F19 a été utilisé pour le clonage et ce séquencage. Ce fragment a été sous-cloné dans le plasmide pBSIISK (STRATAGENE) et séquence. Les brins d'ADN synthétisés à partir d'amorces
PCR marquées PRISM Ready Reaction Dye Primer Cycle
Sequencing Kit (APPLIED BIOSYSTEMS) sont ensuite séparés sur gel dénaturant de polyacrylamide et analysés grâce à un séquenceur automatique (APPLIED BIOSYSTEMS
Model 373A DNA Sequencing System).

La séquence obtenue a été comparée avec des banques d' "EST" (Expressed Sequence Tag), Cette comparaison a permis d'identifier différentes EST présentant des similitudes de séquence avec les protéines
TON1 , et en particulier une EST isolée chez le riz (numéro d'identification : D39592) homologue de ces séquences Le clone correspondant (S1091) fourni par MAFF
DNA Bank (1-2,2-chome, Kannondai, Tsukuba, Ibaraki 305,
JAPON), s'est avéré correspondre après séquençage, à un
ADNc complet de 1083 pb, codant pour une protéine de 261 acides aminés.

La position des introns et des exons a été définie d'une part grâce au logiciel NETPLANTGENE [HEBSGAARD et ai., Nucleic Acids Res., 24, 3439-3452 (1996)] et d'autre part grâce à des comparaisons avec les séquences d'ADNc isolés à partir d'une banque d'Arabidopsis [QUAEDVLIEG et ai., Plant Ceil, 7, (1), 117-129 (1995)] et les séquences de produits de 3'RACE
PCR isolés (cf exmple 4 ci-dessous) à partir des amorces P5 et P8 (Marathon cDNA amplification Kit ; CLONTECH).

La structure et la séquence des gènes
TONNEAU1 d'Arabidopsis sont représentés sur les figures 2 et 3. La Figure 2 schématise la structure des 2 gènes
TONNEAU1 ; la délétion de 1,4 kpb au point d'insertion de l'ADN-T chez le mutant tonl est représentée par une double flèche noire. Les deux gènes TONla et TONlb sont représentés par des flèches noires. Ces 2 gènes sont séparés de 220 pb.

Les exons sont représentés par des boîtes noires. Les zones hachurées correspondent aux séquences transcrites non traduites. La localisation et la taille des introns et des exons est très conservée, excepté pour le sixième intron du gène TONla qui est absent dans le gène TONlb.

Les positions des sites donneurs et accepteurs d'épissage sont représentés par des crochets.

Les chiffres associés correspondent à la probabilité que la séquence détectée soit un site d'épissage.

Les pointes de flèches indiquent la position des différentes amorces utilisées au cours de la caractérisation des mutants tonl. Les pointes de flèches noires correspondent aux amorces définies et les pointes de flèches grises correspondent aux séquences homologues aux amorces définies. Les tailles des fragments d'amplification correspondants sont également indiquées.

La séquence du fragment de 7,1 kpb isolé à partir du BAC 2F19 est représentée sur la Figure 3 (3a à 3k).

Les acides aminés correspondant aux exons sont figurés en capitales.

Les séquences d'ADNc isolés à partir de la banque d'Arabidopsis (Quaedvlieg et al., 1995), l'ADNc de riz (S1091), et les séquences de produits de 3'RACE PCR isolés à partir des amorces P5 et P8 sont respectivement indiquées en caractères gras, en caractères surlignés en grisé, et en caractères italiques.

Les séquences soulignées correspondent aux différentes amorces PCR. Les amorces dont le nom est représenté en italique correspondent aux séquences homologues aux amorces définies à partir de la séquence.

Les boites hachurées correspondent respectivement au début et à la fin de la délétion induite par l'insertion d'ADN-T. Les boites grisées correspondent aux sites de polyadénylation des ADNc.

Les résultats présentés sur les Figures 2 et 3, montrent que les deux gènes TONla et TONlb sont positionnés en tandem direct et séparés par 220 pb. Le gène TONla se compose de 8 exons d'une taille moyenne de 98 nucléotides ; la taille moyenne des introns est de 168 pb. Le gène TONlb se compose de 7 exons d'une taille moyenne de 110 nucléotides ; la taille moyenne des introns est de 214 pb.

La comparaison des séquences de type sauvage et de type mutant montre que la délétion induite par l'insertion d'ADN-T affecte les deux gènes TONla et
TONlb. Elle a induit la disparition de la partie Cterminale de la protéine TONla (correspondant aux 97 derniers acides aminés) et de la partie N-terminale de la protéine TONlb (correspondant aux 29 premiers acides aminés). De plus, la comparaison entre les séquences flanquant les insertions d'ADN-T et la région contenant les gènes TONNEAU1 confirme que l'insertion (et les remaniements chromosomiques associés) n'ont pas induit d'autres modifications de la séquence nucléotidique.

EXEMPLE 4 : EXPRESSION DES GENES TON1A ET TON1B
L'organisation génomique de la région affectée par l'insertion d'ADN-T chez les mutants tonneaul est singulière puisqu'elle contient un gène dupliqué en tandem direct. La question de la fonctionnalité et de l'expression simultanée (ou non) de ces gènes se pose. Le criblage d'une banque d'ADNc (environ 500 000 clones) a permis d'isoler quatre clones indépendants. Après analyse et séquençage, tous les quatre se sont avérés correspondre au gène TONlb.

Parallèlement au criblage de cette banque, des réactions de RACE PCR ont été effectuées. Cette méthode permet d'isoler par amplification par PCR les parties 3' ou 5' d'un transcrit (même faiblement exprimé) à partir d'une amorce interne au gène d'intérêt et d'une amorce positionnée sur un adaptateur ligué aux extrémités de l'ADNc synthétisé. Les amplifications ont été réalisées sur des ADNc produits à partir d'ARN messagers isolés à partir de plantules de l'écotype WS âgées de 5 jours. Les réactions de 3' RACE ont été effectuées à partir des amorces P5 et P8. La partie 3' des deux gènes a ainsi pu être obtenue. La partie 3' du gène TON la a été isolée par amplification à partir de l'amorce P8 alors que celle du gène TONlb a été obtenue à partir de l'amorce P5. Les amplifications ainsi obtenues démontrent que les deux gènes TONla et TONlb sont exprimés chez les plantules âgées de 5 jours.

Les différentes séquences correspondant aux produits de RACE PCR, aux ADNc de riz et d'Arabidopsis, et les séquences déduites à partir de la séquence génomique ont été comparées. Les résultats de ces alignements sont reportés sur la Figure 4.

Les analyses d'alignement de séquence ont été réalisées grâce à la fonction Pileup du logiciel GCG (Wisconsin Package Version 9.0, Genetics Computer Group,
Inc. (GCG) Madison Wisc, USA). Les recherches d'homologie ont été établies par le logiciel SeqVu 1.1 (The Garvan
Institute of Medical Research, Sydney, Australia) à partir de la méthode GES. Les cases grisées représentent les acides aminés identiques Les cases blanches à l'intérieur des blocs représentent les acides aminés homologues.

Les séquences traduites correspondent respectivement à l'ADNc isolé chez le riz (tonlriz.p), aux séquences déduites à partir de la séquence gènomique d'Arabidopsis (tonla.p et tonlbg.p) et de l'ADNc isolé dans la banque d'Arabidopsis (tonlbc.p).

Ces résultats montrent que les séquences isolées par RACE PCR (écotype WS) sont parfaitement identiques à celles déduites de la séquence nucléotidique isolée à partir du BAC (écotype ColO) . Les séquences protéiques correspondant aux gènes TONla et TONlb présentent un fort taux d'identité (80%). Le niveau d'identité atteint 96% sur les trois premiers exons. Un fort niveau d'identité (67%) et d'homologie (79%) est également obtenu entre les séquences protéiques correspondant au gène TONla et à l'ADNc isolé chez le riz. Ces niveaux d'identité et d'homologie sont légèrement inférieurs dans le cas de la protéine TONlb.

La figure 5 représente la comparaison des séquences protéiques déduites des gènes TONNEAU1, du gène orthologue chez le riz, et de plusieurs EST homologues de mammifères ou de parasites (identifiées comme décrit à l'exemple 3).

EXEMPLE 5 : COMPLEMENTATION DES MUTANTS TON1
Pour confirmer la relation directe entre l'insertion d'ADN-T et le phénotype mutant toni on a procédé à la complémentation des mutants par introduction d'une copie de type sauvage du gène TONNEAU1. Pour ce faire, plusieurs constructions ont été réalisées en utilisant comme vecteur le plasmide binaire pZPHYG. Ce plasmide dérive du vecteur PZP200 [HAJDUKIEWICZ et al.,
Plant Mol. Biol., 25, 989-994 (1994)] dans lequel a été introduit le gène codant pour l'hygromycine B phosphotransférase (HPT). Ce gène, sous contrôle des promoteurs et terminateurs de la nopaline synthase issu du plasmide pGDW32 [WING et al ., Mol. Gen. Genet., 219, 9-16, (1992)] confère aux plantes la résistance à l'hygromycine.

Ces constructions sont représentées sur la
Figure 6.

Les constructions 1 et 2 contiennent les fragments génomiques de 12 kpb (SailIXhol) et de 7,2 kpb (SalI/PvuII) isolés à partir du BAC 2F19 et correspondant respectivement aux deux gènes TONla et TONlb ou au gène TONIa. Ces gènes TONNEAU1 sont représentés sur la Figure 6 par des flèches noires.

La construction 1 contient les deux gènes
TONla et TONIE (fragment SalI-XhoI) alors que la construction 2, ne contient que le gène TONla (fragment
Sal I-Pvu II).

La construction 3 a été réalisée à partir de l'ADNc du gène TONlb pleine longueur issu de la banque d'Arabidopsis. Cet ADNc a été cloné entre le promoteur doublé du virus de la mosaïque du chou-fleur (Prom7O CAMV) et le terminateur du virus de la mosaïque du choufleur (Term CAMV) issus du plasmide pJIT60 [GUERINEAU et al., Plant Mol. Biol. 18(4), 815-818 (1992)].

Un témoin négatif de complémentation (vecteur binaire seul), a également été utilisé afin d'évaluer l'effet de l'infiltration sur les fréquences de ségrégation de la mutation TONNEAU1 et ainsi obtenir des mutants portant le gène de résistance à l'hygromycine.

Ces constructions ont été introduites dans la souche d'Agrobacterium tumefaciens C58C1, pMP90 [KONCZ et
SCHELL, Moi. Cen. Genet, 204, 383-396 (1986)] par électroporation. Les souches recombinantes ont été utilisées pour transformer des plantes d'Arabidopsis hétérozygotes pour la mutation tonî.

Deux séries d'infiltrations (transformation in planta) [BECHTOLD et al.., C. R. Acad. Sci. Paris, 316, 1194-1200, (1993)] portant sur 75 plantes hétérozygotes pour la mutation tonneaul et 50 plantes de type sauvage ont été réalisées pour chacune des constructions. Les plantes (TO) ont été récoltées et les transformants primaires (T1) semés in vitro. Les graines issues de plantes hétérozygotes pour la mutation TONNEAUl ont subi une double sélection. Ainsi, les semis ont été effectués sur hygromycine (75 pg/ml), et après une semaine de culture, les plantules résistantes ont été repiquées sur milieu contenant de la kanamycine (100 Ag/ml). Les plantules présentant une résistance aux deux agents de sélection ont été repiquées en serre. La descendance de ces plantes (T2) a été utilisée pour les analyses génétiques de complémentation. Parallèlement, des plantes de type sauvage (WS) ont été traitées suivant ce même protocole (excepté pour la sélection des transformants qui ne se fait que sur hygromycine).

Les plantules T1 sélectionnées dans une fraction (1/8) de la descendance de plantes infiltrées (plantes hétérozygotes pour la mutation tonl) se répartissent ainsi : 22 et 31 pour les constructions 1 et 2, 43 pour la construction 3 et 15 pour la construction 4. Les différentes plantules transférees en serre présentaient un phénotype sauvage lors du repiquage excepté pour l'une d'entre elles (obtenue à partir de la construction 3).

Après quelques semaines de culture en serre, deux plantes présentant un défaut de développement ont été isolées parmi les plantes ayant un phénotype sauvage lors du repiquage. Ces transformants obtenus à partir de la construction 3, présentaient un accroissement du diamètre et une forte réduction de l'élongation des hampes florales ainsi qu'un "gaufrage" des feuilles.

Lors de la floraison, les premières fleurs et les premières siliques mises en place semblaient peu affectées , cependant, les fleurs produites ultérieurement présentaient un phénotype de plus en plus affecté aboutissant à des fleurs quasiment identiques aux fleurs de type tonneau (réduction de la taille des organes floraux, déformation et raccourcissement de plus en plus important des siliques). A la différence des fleurs, les pédoncules floraux n'étaient que très peu affectés. Après deux mois de culture, les hampes florales présentaient des blessures (éclatement des tiges) et un accroissement du diamètre dans la partie apicale.

Ces plantes présentant une altération du développement ont été isolées dans la descendance des plantes hétérozygotes pour la mutation tonl et transformées avec la construction 3. Aucune plante présentant un phénotype semblable n'a été observée parmi les transformants obtenus avec les autres constructions ou dans la descendance des plantes de type sauvage (même transformées avec la construction 3).

La structure allélique pour la mutation tonla été testée par des amplifications par PCR chez ces plantes. Les amplifications réalisées à partir d'une amorce spécifique localisée à l'intérieur de la délétion et une amorce à l'extérieur de la délétion montrent que les plantules sont de génotype mutant.

La présence d'insertions d'ADN-T portant l'ADNc TONlb a également été testée par amplification par
PCR. Les amorces P5 et P10 amplifient chez ces plantes un fragment de 950 pb correspondant à la taille attendue pour une amplification à partir d'un ADNc TON1. Un fragment de taille identique a également été amplifié à partir de l'ADN des différents transformants obtenus par infiltration avec la souche bactérienne contenant la construction 3. Ces plantes à phénotype intermédiaire correspondent donc à une restauration partielle du phénotype ton. Certaines plantes de phénotype sauvage ont une descendance homogène kanamycine-résistante, elles sont porteuses d'une insertion ADN-T au locus TON à l'état homozygote, cependant dans leur descendance des plantes de phénotype ton sont observées. Ces plantes sont des mutants restaurés par la présence d'un gène TON fonctionnel ce qui confirme la nature des deux gènes candidats identifiés, cibles de la mutation.

Claims (1)

REVENDICATIONS
1. l)Procédé pour contrôler la division et/ou l'élongation de cellules eucaryotes, et en particulier de cellules végétales, caractérisé en ce que l'on modifie l'expression et/ou l'activité d'une protéine de type

   TONNEAU1 dans lesdites cellules.

   2)Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'on modifie l'expression et/ou l'activité de ladite protéine par mutagénèse d'un gène de type TONNEAU1.

   3)Séquence d'acide nucléique susceptible d'être obtenue par mutagénèse de la séquence d'un gène de type TONNEAU1.

   4)Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'on modifie l'expression de ladite protéine de type TONNEAU1 en exprimant au moins une séquence dérivée de tout ou partie de la séquence d'un gène de type TONNEAU1 sous contrôle transcriptionnel de séquences appropriées.

   5) Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce que ladite séquence dérivée est une séquence codant pour une protéine de type TONNEAU1.

   6) Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce que ladite séquence dérivée est une séquence antisens.

   7) Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce que ladite séquence dérivée est une séquence mutante selon la revendication 3.

   8)Utilisation d'une séquence d'acide nucléique dérivée de tout ou partie de la séquence d'un gène de type TONNEAU1 pour l'obtention d'un produit permettant de modifier l'expression et/ou l'activité d'une protéine de type TONNEAU1 dans des cellules eucaryotes.

   9)Construction d'ADN recombinant contenant au moins une séquence d'acide nucléique dérivée de tout ou partie de la séquence d'un gène de type TONNEAU1 sous contrôle transcriptionnel d'un promoteur approprié.

   10)Construction d'ADN recombinant selon la revendication 9, caractérisé en ce que ledit promoteur est un promoteur inductible, et/ou tissu-spécifique.

   1l)Cellule transformée par une séquence d'acide nucléique dérivée de tout ou partie de la séquence d'un gène de type TONNEAU1.

   12)Cellule selon la revendication 11, caractérisée en ce qu'il s'agit d'une cellule de plante.

   13)Plante transgénique, transformée par une séquence d'acide nucléique dérivée de tout ou partie de la séquence d'un gène de type TONNEAU1.

   14)Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'on modifie l'expression de la protéine de type TONNEAU1 en utilisant au moins un produit inhibiteur ou activateur de ladite protéine.

   15)Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il est mis en oeuvre pour contrôler la taille d'une plante, ou d'au moins un organe de celleci.