JP2010535514A - トマトの収穫量を増加させるためのプロモーター配列および遺伝子構築物 - Google Patents

Abstract

本発明は、ＳＰ３Ｄプロモーター配列であって、前記プロモーター配列に作動可能に連結している下流ＳＰ３Ｄ遺伝子の転写を指示することができ、仮軸指数３以上を有する植物における仮軸指数を低下させるために、前記プロモーター配列が、仮軸指数２を有するナス科の１種に由来するＳＰ３Ｄプロモーター配列に関する。本発明は、さらに減少した仮軸指数を有するナス科の植物、特にＳ．ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍの植物を提供するための方法であって、上記植物のゲノムに、下流ＳＰ３Ｄ遺伝子と作動可能に連結している請求項１〜８のいずれかに記載のプロモーター配列を導入する工程、または上記植物に請求項９〜１５のいずれかに記載の遺伝子構築物を導入する工程を含み、上記プロモーター配列もしくは上記遺伝子構築物を備える上記植物の上記仮軸指数が上記プロモーター配列もしくは上記遺伝子構築物を含まない植物と比較して減少する方法、および上記方法によって入手可能な植物に関する。

Description

本発明は、植物における下流植物遺伝子に作動可能に連結されると、前記植物、特にトマトの収穫量を増加させることができるプロモーター配列に関する。本発明はさらに、ナス科（Ｓｏｌａｎａｃｅａｅ ｆａｍｉｌｙ）の植物、特にトマト植物（Ｓｏｌａｎｕｍ ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ）であって、前記下流植物遺伝子に作動可能に連結した前記プロモーター配列を含む植物、前記植物を入手するための方法および当該方法によって入手できる植物に関する。

トマト（Ｓｏｌａｎｕｍ ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ、またはＬｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍとも呼ばれる）は、ナス科（Ｓｏｌａｎａｃｅａｅまたはｎｉｇｈｔｓｈａｄｅ ｆａｍｉｌｙ）の植物である。トマトは、一年生植物のように成長する寿命の短い多年生植物であり、ジャガイモの近縁種である。果実（すなわちトマト）は食用の鮮やかな色（色素のリコピンから、通常は赤色）の液果であり、野生植物は直径が１〜２ｃｍであるが、一般に栽培品種でははるかに大きい。この植物は、現在は食用果実のために世界中で育てられており、世界中で主要な生鮮市場野菜である。

トマト植物の生育習性は、一般には有限花序もしくは無限花序として分類される。この分類は、シュート系が持続的に仮軸成長する能力に左右される。無限花序栽培品種（頂端分裂組織が無制限に成長し、花が腋生分裂組織から発生する）は無制限に成長する分枝系を生じさせるが、有限花序栽培品種（頂端分裂組織が頂花に転換される）はシュートが２つの花序で終了して低木の形態に発達するまで節が次第に少なくなる分枝系を生じさせる。植物構造におけるこの変化は、ＳＥＬＦ−ＰＲＵＮＩＮＧ（ＳＰ）遺伝子における突然変異に起因し（Ｐｎｕｅｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １２５：１９７９−１９８９，１９９８）、この作物にとって重要な発達となってきた。これは、有限花序タイプは機械を使用して収穫することができるために主として加工産業用に用いられ、他方無限花序タイプは一般に温室で栽培されて生鮮市場用に用いられるためである。

Ｆｒｉｄｍａｎ ｅｔ ａｌ．（Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ２６６：８２１−８２６，２００２）は以前に、ＰＷ９−２−５という名称のＱＴＬ（量的形質遺伝子座）のＳ．Ｐｅｎｎｅｌｌｉｉ対立遺伝子の、ｓｐ／ｓｐ Ｓ．Ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍバックグラウンドへの遺伝子移入が、果房間に２枚の葉を備える（ｓｐｉ＝２と表わす）半有限花序成長をもたらすことを証明した。彼らは、Ｓ．Ｐｅｎｅｌｌｉｉ由来のＳＰ９Ｄ遺伝子であるＳＰ９Ｄｐｅｎが、植物構造、およびいわゆる固形固形含量（ＳＳＣ）もしくは屈折率（味覚と間接的に関連する）を変化させるための候補遺伝子であると示唆する。ＳＰ９Ｄ遺伝子はＣＥＴＳ遺伝子ファミリー（ＣＥＮＴＲＯＲＡＤＩＡＬＩＳ、頂花）に属し、この遺伝子ファミリーは植物構造の決定において重要な役割を果たすと考えられている（Ｃａｒｍｅｌ−Ｇｏｒｅｎ，Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．５２；１２１５−１２２２，２００３）。

Ｓ．ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍは、５種の異なる染色体にわたって分散したＳＰと称する６つのＣＥＴＳ遺伝子ファミリーメンバー、すなわちＳＰ２Ｉ、ＳＰ３Ｄ、ＳＰ５Ｇ、ＳＰ６Ａ、およびＳＰ９Ｄを有し、これらの名称はｂｉｎの位置にしたがって与えられている（Ｐａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １５５：３０９−３２２，２０００）。第６のメンバーであるＳＰは、６番染色体、ｂｉｎ Ｅ上に位置し、有限花序（ｓｐ／ｓｐ）／無限花序（ＳＰ／−）表現型においてトマトを変化させる遺伝子であることが知られている。系統発生的関係では、ＳＰ３Ｄ、ＳＰ５Ｇ、およびＳＰ６Ａがシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）のＦＴ遺伝子とともに分類されている。ＳＰ９ＤおよびＳＰはシロイヌナズナのＴＦＬ−１とともに分類され、ＳＰ２ＩはシロイヌナズナのＭＦＴ（Ｍｏｔｈｅｒ ｏｆ Ｆｌｏｗｅｒｉｎｇ Ｔｉｍｅ）と同一の部門に含まれている（Ｃａｒｍｅｌ−Ｇｏｒｅｎ ｅｔ ａｌ．，上記参照）。遺伝子間には系統発生的関係があるにもかかわらず、発現プロファイルは相違する。よって、ＳＰ５Ｇの発現は主として子葉内で見いだされているが、他方、ＳＰ３Ｄは主として花器官において発現し、栄養器官である葉においては低発現を示す。ＳＰ６Ａについては、これまでのところ発現は見いだされていない。ＳＰ９Ｄは主として茎頂において発現し、根で高い発現率を有するが、ＳＰ２Ｉは試験した全器官内で発現する。これらの発現プロファイルにもかかわらず、例外としてのＳＰに関するそれらの機能に関してはほとんど知られていない。

最近の数十年間に、無限花序トマトの育種は、主として生産量、病害抵抗性、ならびに均一な熟成および味などの果実品質の側面に焦点が当てられてきた。収量の向上は、新しい生産方法、新しい生産方法のためにより適合する改良された害虫管理、および品種のおかげで達成されてきたが、収量の増加率はより小さくなっている。１つの植物当たり５個もしくは１５個以上の果実が得られる新品種がもたらした収量の増加は、２〜４％であった。

より高い収量を生じさせる新種の開発は、トマトの収量を決定する側面に関する知識の欠如によって阻まれた。Ｘｉａｏ（２００４；ＩＳＨＳ Ａｃｔａ Ｈｏｒｔｉｃｕｌｔｕｒａｅ ６５４（園芸生産における植物成長についてのモデルおよび生産物品質の制御に関する国際ワークショップ）およびＨｅｕｖｅｌｉｎｋ（２００５；ＩＳＨＳ Ａｃｔａ Ｈｏｒｔｉｃｕｌｔｕｒａｅ ６９１（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ ｏｎ ｓｕｓｔａｉｎａｂｌｅ ｇｒｅｅｎｈｏｕｓｅ ｓｙｓｔｅｍｓ−ｇｒｅｅｎｓｙｓ２００４；４３−５０）は、果房間に従来型の３枚の葉の代わりに２枚の葉を備えるトマト品種が果実に向けての同化を変化させ、葉面積指数（ＬＡＩ）が維持される場合はより高い収量を生じさせることを模擬実験した。彼らは、葉を１枚おきに取り除き、３を超えるＬＡＩを維持することによって、模擬実験したデータの妥当性を確認した。模擬実験したように、収量はおよそ１０％増加した。

果房間に２枚の葉を備える栽培品種は知られていないが、果房間に２枚の葉を備える、すなわち仮軸指数２（ｓｐｉ＝２）を有する野生型トマト近縁種、例えば、Ｓｏｌａｎｕｍ ｎｅｏｒｉｃｋｉｉ、Ｓｏｌａｎｕｍ ｃｈｍｉｅｌｅｗｓｋｉｉ、Ｓｏｌａｎｕｍ ｃｈｉｌｅｎｓｅ、Ｓｏｌａｎｕｍ ｐｅｒｕｖｉａｎｕｍ、およびＳｏｌａｎｕｍ ｐｅｎｎｅｌｌｉｉがある。Ｓ．ｐｅｎｅｌｌｉｉとの種間交雑のＦ１雑種である栽培トマトにおいて、仮軸指数２の特性は、仮軸指数３に対して劣性である（Ｐｎｕｅｌｉ ｅｔ ａｌ．，１９９８、上記参照）。しかしｓｐｉ＝２の遺伝的根拠は、これまで知られていない。

世界の人口が増加し続けるにつれて、トマトなどの生鮮野菜に対する需要は世界的に増え続けている。そこで、トマトなどの野菜植物の収量を改善するための手段および方法に対する継続的な必要性が存在する。

本発明の目的は、ナス科の植物の収穫量を増加させるための新規な手段および方法を提供することである。

本発明の目的は、具体的には、トマト、Ｓ．ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍの収穫量を増加させるための新規な手段および方法を提供することである。

この目的は、ＳＰ３Ｄプロモーター配列であって、前記プロモーター配列に作動可能に連結している下流ＳＰ３Ｄ遺伝子の転写を指示することのできるＳＰ３Ｄプロモーター配列を提供することによって達成されるが、前記プロモーター配列は、仮軸指数３以上を有する植物における仮軸指数を低下させるために、仮軸指数２を有するナス科の１種に由来する。

好ましい実施形態では、前記プロモーター配列は、前記ＳＰ３Ｄ遺伝子の開始コドンの６２−６１ヌクレオチド上流の位置（すなわち、−６２および−６１ヌクレオチドの位置）においてＣＡモチーフを含む。

本発明をもたらした研究では、ｓｐｉ＝２を生じさせるＣＥＴＳ遺伝子ファミリーの新規遺伝子が同定された。こうして、３番染色体由来のＳ．ｐｅｎｎｅｌｌｉｉ Ｌａ７１６挿入を含む遺伝子移入系統４９０１５−２は、仮軸指数２を生じさせることが証明された。マップの位置および表現型に基づいて、系統４９０１５−２由来のｓｐｉ＝２の特性は、「ＳＰ３Ｄｐｅｎ」と表わされるＳ．ｐｅｎｎｅｌｌｉｉ由来のＳＰ３Ｄ遺伝子によって引き起こされると結論付けられている。

本発明によると、ｓｐｉ＝２の特性は遺伝子自体によって引き起こされたのではなく、上記プロモーターによる遺伝子の調節に起因することが、引き続き見いだされた。具体的には、仮軸指数２はＳＰ３Ｄ遺伝子の開始点から６２−６１ヌクレオチド上流の、プロモーター配列におけるＣＡモチーフに連結していること、すなわち−６２位にあるヌクレオチドはＣであり、−６１位上のヌクレオチドはＡであることが証明された。

上述したように、トマト（Ｓ．ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ）の仮軸シュートでは、栄養相および生殖相が規則的に交互に並んでいる。一次シュートは、通常は８〜１０枚の葉が産生した後に発生し、成長はその後、花序の直下の最上の側芽（腋芽）から続く。このシュートは、次に、通常、３枚以上の葉を生成し、もう一つの花序などに伴って終了する。よって、シュートは主として、各々が３つの栄養節および１つの末端花序からなる多数の反復仮軸単位から構成され、仮軸指数３（ｓｐｉ＝３）を有するといわれる。

本発明によると、現在では、仮軸指数３以上を有するナス科の植物においてＳＰ３Ｄ遺伝子と作動可能に連結している上述したプロモーター配列の１つを導入することによって、上記プロモーターを有していない植物と比較して減少した仮軸指数を有する植物が生じることが見いだされている。

１つの好ましい実施形態では、仮軸指数は、仮軸指数２に減少する。よって、好ましくは仮軸指数２を有する植物、すなわちシュートが主として２つの栄養節および１つの末端花序からなる仮軸単位から構成される植物が生じる。本発明によると、「仮軸指数２」は、１．６〜２．５、好ましくは１．６〜２．５、より好ましくは１．７〜２．４、より一層好ましくは１．８〜２．３、最も好ましくは１．９〜２．２の範囲内の平均仮軸指数に関する。

本発明によると、上記プロモーター配列は、ＳＰ３Ｄ遺伝子に作動可能に連結している場合は、植物の増加した収穫量をもたらすことが見いだされている。よって、例えば、３から２に減少した仮軸指数を有する植物は、主として果房間で３枚の代わりに２枚の葉を有しているので、結果として仮軸はｓｐｉ＝３の対応物より大まかには１／３短くなり、このことは植物の単位長さ当たりの果房の数の増加をもたらす。さらに代々の果房がより早期に出現するので、単位時間当たりの増加した数の果房が得られる。さらにその上、上記プロモーター配列は、ＳＰ９Ｄｐｅｎの半有限花序成長の習性を伴わずに、増加した収穫量をもたらすことが見いだされた。

さらに、上記プロモーターは、ＳＰ３Ｄ遺伝子に作動可能に連結している場合は、およそ１０枚の葉の代わりに６〜８枚の葉の後に第１果房が発生するなどの他の幾つかの有益な形質を生じさせる。さらに、これらの植物では、１果房当たりより多くの果実（大まかには１果房当たり１つより多い果実）を維持し得る。これらの特性は、１メートル当たりもしくは単位時間当たりの増加した数の果房および／または１房当たりの増加した果実数を生じさせ、従ってより多い収穫量を生じさせる。

本発明によると、用語「収穫量」は、植物のシュートおよび枝の１メートル当たり、または（例えば月数で表される、初期植え付けから収穫末期または栽培期終了までの）単位時間当たりの作物（例、果実、例えばトマト）の量（例えば、ｋｇで表す）であると定義される。本発明のプロモーター配列を含む植物の収穫量の増加は、本発明のプロモーター配列を含んでいない同種の植物の収穫量と比較した収穫量の増加を意味する。

本発明の特に好ましい実施形態では、上記プロモーター配列は、Ｓｏｌａｎｕｍ ｐｅｎｎｅｌｌｉｉ、Ｓｏｌａｎｕｍ ｎｅｏｒｉｃｋｉｉ、Ｓｏｌａｎｕｍ ｃｈｍｉｅｌｅｗｓｋｉｉ、Ｓｏｌａｎｕｍ ｃｈｉｌｅｎｓｅ、およびＳｏｌａｎｕｍ ｐｅｒｕｖｉａｎｕｍからなる群から選択されるナス科の１種に由来する。

本発明のまた別の好ましい実施形態では、上記プロモーター配列は、配列番号１（図２）のヌクレオチド１〜６２４と少なくとも７５％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。

本発明のまた別の好ましい実施形態によると、上記プロモーター配列は、配列番号１のヌクレオチド１〜６２４と少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、および最も好ましくは少なくとも９９％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。

本発明によると、「Ｘ％の同一性を有するヌクレオチド配列」という表現は、ヌクレオチドのＸ％が配列番号１の特定ヌクレオチド配列（すなわち、ヌクレオチド１〜６２４）と同一であるヌクレオチド配列を有するヌクレオチド配列に関する。よって、これは、同一数の６２４ヌクレオチドを有するが、ヌクレオチドのＸ％は、上記配列番号１のヌクレオチド１〜６２４と比較して相違するヌクレオチド配列、および／または配列番号１の上記部分のフラグメントを含む可能性がある（混合形態もまた可能である）。あらゆる場合に、ＣＡモチーフが存在していなければならず、上記プロモーターがプロモーター活性を有していなければならないことを理解されたい。

特に好ましい実施形態では、上記プロモーター配列は、Ｓ．Ｐｅｎｎｅｌｌｉｉに由来し、上記配列番号１のヌクレオチド１〜６２４のヌクレオチド配列からなる。

そこで本発明によると、ナス科の植物、特に上記に規定した、ＳＰ３Ｄ遺伝子と作動可能に連結している本発明のプロモーター配列を含むＳ．ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍは、シュートおよび枝１メートル当たり、および／または単位時間当たり、本発明のプロモーター配列を含んでいない同種の植物と比較してより多いｋｇ数の果実を産生する。

以前に、ＳＰ３Ｄ遺伝子がｓｆｔ（ｓｉｎｇｌｅ−ｆｌｏｗｅｒ ｔｒｕｓｓ）トマト突然変異体についての原因遺伝子であることは、Ｌｉｆｓｃｈｉｔｚ ｅｔ ａｌ．，（ＰＮＡＳ １０３，６３９８−６４０３，２００６）によって報告された。ｓｆｔ突然変異体植物は、花序当たり減少した数の花（１房当たり１つもしくは２つの花）を伴って遅く開花し、無限花序を有する。ｓｆｔ突然変異は、ＳＰ３Ｄ遺伝子における突然変異に起因することが証明された。構成的３５Ｓプロモーターの制御下でＳＦＴを高度に発現する植物は仮軸成長パターンを維持するが、仮軸指数３ではなく仮軸指数２を有することが証明された。３５Ｓ：ＳＦＴの台木上へのｓｆｔ突然変異体の接穂の接ぎ木は、野生型表現型（ｓｐｉ＝３を含む）を回復させたが、このことはＳＰ３Ｄ／ＳＦＴが全身性シグナルによってその機能を媒介することを証明した。本発明によるプロモーター配列、およびそれが仮軸指数に及ぼす影響、および結果としてナス科の植物、特にＳ．ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍの植物の収穫量に及ぼす影響は、Ｌｉｆｓｃｈｉｔｚ ｅｔ ａｌ．によっては開示されていない。

本発明のプロモーター配列は、任意の活性なＳＰ３Ｄ遺伝子と作動可能に連結させて導入することができる。

好ましい実施形態では、ＳＰ３Ｄ遺伝子は、配列番号１のヌクレオチド６２５〜７３０７と少なくとも７５％の同一性を有するゲノムヌクレオチド配列を含む。好ましくは、配列同一性は、８５％、より好ましくは９０％、より一層好ましくは９５％、および最も好ましくは９９％である。本発明は、さらにこれらのＳＰ３Ｄ遺伝子自体に関する。

特に好ましい実施形態では、ＳＰ３Ｄ遺伝子は、Ｓ．ＰｅｎｎｅｌｌｉｉのＳＰ３Ｄ遺伝子であるＳＰ３Ｄｐｅｎであり、配列番号１のヌクレオチド６２５〜７３０７からなるゲノムヌクレオチド配列を有する。

本発明はさらに、上述したプロモーター配列および上述したＳＰ３Ｄ遺伝子由来のｃＤＮＡ配列を含む遺伝子構築物に関する。そのような遺伝子構築物は、減少した仮軸指数を有するナス科の、好ましくはＳ．ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍの遺伝子組み換えされた植物を提供するために、例えば、公知の分子生物学的技術を用いて、植物に導入することができる。

好ましい実施形態では、上記ｃＤＮＡ配列は、図３に示されるＳＰ３ＤｐｅｎのｃＤＮＡ配列と少なくとも７５％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。好ましくは、配列同一性は、８５％、より好ましくは９０％、より一層好ましくは９５％、および最も好ましくは９９％である。

特に好ましい実施形態では、上記ｃＤＮＡ配列は、図３に示されるヌクレオチド配列からなる。

本発明は、さらに、減少した仮軸指数を有するナス科の植物を提供するための方法であって、仮軸指数３以上を有するナス科の植物のゲノムに、下流ＳＰ３Ｄ遺伝子と作動可能に連結している上述したプロモーター配列を導入する工程、または植物が結果として上記プロモーター配列を含まない上記植物と比較して減少した仮軸指数を有するように上記植物に上述した遺伝子構築物を導入する工程を含む方法に関する。

１つの好ましい実施形態では、上記仮軸指数は、仮軸指数２に減少する。

本発明は、さらに、仮軸指数３以上を有するナス科の植物の収穫量を増加させるための方法であって、上記植物のゲノムに、下流ＳＰ３Ｄ遺伝子と作動可能に連結している上述したプロモーター配列を導入する工程、または上記植物に上述した遺伝子構築物を導入する工程を含む方法に関する。

上記に示した方法の好ましい実施形態では、上記植物は、好ましくは、Ｓ．ｈａｂｒｏｃｈａｉｔｅｓ、Ｓ．ｃｈｅｅｓｍａｎｉａｅ、Ｓ．ｐｉｍｐｉｎｅｌｌｉｆｏｌｉｕｍおよびＳ．ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ、および／またはそれらに由来する植物からなる群から選択される。特に好ましい実施形態では、植物は、Ｓ．ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍである。用語「それらに由来する植物」は、２つの選択された種を異種交雑させることに由来する植物、例えばＳ．ｈａｂｒｏｃｈａｉｔｅｓとＳ．ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍとの異種交雑に由来する植物などに関する。

プロモーター配列、および／または遺伝子構築物は、下記に記載する技術などの従来型育種技術による遺伝子移入、または当業者に周知の適切な分子生物学技術を使用することによる遺伝子移入によって、これらの植物に導入することができる。プロモーター配列の導入、またはプロモーター配列および本発明のＳＰ３Ｄ遺伝子のｃＤＮＡ配列を含む適切な遺伝子構築物の植物細胞への導入は、例えば、トランスフェクション法、マイクロインジェクション法、エレクトロポレーション法などによって実行できる。さらにまたアグロバクテリウムを介した形質転換法を使用することも可能である。細胞は、次に引き続いて全植物体内へ再生させることができる。

本発明によると、ＳＰ３Ｄ遺伝子と作動可能に連結している本発明のプロモーター配列を導入することによって、または本来は（すなわち、プロモーター配列を含まない場合は）仮軸指数３以上、例えば仮軸指数３を有するナス科の種に、本発明の遺伝子構築物を導入することによって、減少した仮軸指数、好ましくは仮軸指数２を有する、収穫量の増加をもたらす新規植物を入手できることが証明されている。

さらに、トマト、Ｓ．ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍの場合には、第１果房は、およそ１０枚の葉の代わりに６〜８枚の葉の後に発生することが見いだされている。さらに、これらの植物では、１つの果房当たりより多くの果実（大まかには１つの果房当たり１つより多い果実）を維持し得る。よって、プロモーター配列を含んでいない同種の植物と比較して、増加した収穫量をもたらす植物が得られる。

本発明のプロモーター配列は、上記植物にとって内因性であるＳＰ３Ｄ遺伝子、すなわち上記植物中に本来存在するＳＰ３Ｄ遺伝子と作動可能に連結させて導入することができる。この場合には、プロモーター配列だけが導入される、すなわち内因性プロモーター配列は上記植物の内因性ＳＰ３Ｄ遺伝子と作動可能に連結している本発明のプロモーター配列の選択された組換体によって置換される。しかし、さらにまたプロモーターおよびＳＰ３Ｄ遺伝子、または上記に規定した本発明による遺伝子構築物の両方を導入することもまた可能である。このように、プロモーターおよびＳＰ３Ｄ遺伝子の両方が上記植物に導入される場合には、どちらも上記植物にとって外因性である。

本発明は、さらにまた上記方法によって入手できる、減少した仮軸指数を有する、好ましくは仮軸指数２を有するナス科の植物、ならびにそれらに由来する種子およびその他の植物部分、例えば植物細胞、器官、および組織、例えば台木に関する。トマト育種における通常の方法は、土壌伝染性病害を制御するために病害耐性の台木にトマト品種を接ぎ木する工程を含む。台木は、一般に、接ぎ木されていないトマトよりはるかに元気である。接ぎ木は、例えば、Ｓ．ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ×野生型近縁種の雑種の、第１葉の前の上胚軸において実行することができる。

本発明の植物は、好ましくは、Ｓ．ｈａｂｒｏｃｈａｉｔｅｓ、Ｓ．ｃｈｅｅｓｍａｎｉａｅ、Ｓ．ｐｉｍｐｉｎｅｌｌｉｆｏｌｉｕｍおよびＳ．ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ、および／またはそれらに由来する植物からなる群から選択される。特に好ましい実施形態では、植物は、Ｓ．ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍである。

本発明はさらに、ナス科の植物、特に、本来は仮軸指数３以上を有し、そのゲノムに、ＳＰ３Ｄ遺伝子と作動可能に連結している上述したプロモーター配列を含み、それにより減少した仮軸指数を有する植物、好ましくは仮軸指数２を有する植物に関する。さらに、ＳＰ３Ｄ遺伝子は、その植物にとって内因性または外因性であってよい。本発明はさらに、上記植物に由来する植物種子および／または上述した他の植物部分に関する。

上記植物は、好ましくはＳ．ｈａｂｒｏｃｈａｉｔｅｓ、Ｓ．ｃｈｅｅｓｍａｎｉａｅ、Ｓ．ｐｉｍｐｉｎｅｌｌｉｆｏｌｉｕｍおよびＳ．ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ、および／またはそれらに由来する植物からなる群から選択される。

好ましくは、上記植物は、Ｓ．ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍである。

以下の実施例および図面によって本発明をさらに説明する。

Ｓ．ｐｅｎｎｅｌｌｉｉのＢＡＣライブラリーのスクリーニングおよび植物の選択のために使用されるプライマー配列を示す図である。 配列番号１のヌクレオチド配列、すなわちプロモーター配列（ヌクレオチド１〜６２４）を含むＳＰ３Ｄｐｅｎ遺伝子のゲノムヌクレオチド配列を示す図である。ＣＡモチーフは、ボールド体および下線を付して示されている。グレーの四角および二重下線の領域はＳＰ３Ｄコドンを示し、小文字はＳ．ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍと比較したＣＤＳ内のＳＮＰを示している。 ＳＰ３ＤｅｓｃのｃＤＮＡおよびそのアミノ酸翻訳（すなわちＳ．ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ（Ｌ．ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍとしても知られている）に由来する）と、ＳＰ３ＤｐｅｎのｃＤＮＡおよびそのアミノ酸翻訳とのアラインメントを示す図であり、コーディング領域内の４つのヌクレオチドの変異（グレーの四角）が同義であることを示している。 ヌクレオチド５４４〜５８０のＳＰ３Ｄｐｅｎプロモーター領域とナス科の他の野生型近縁種とのアラインメントを示す図であり、矢印で示されたＣＴモチーフまたはＴＡモチーフがｓｐｉ＝３と関連し、ＣＡモチーフがｓｐｉ＝２と関連していることを示している。 ＳＰ３Ｄｐｅｎプロモーター領域１〜６２４とナス科の他の野生型近縁種とのＤＮＡ配列アラインメントを示す図であり、ＣＡモチーフの上流および下流の多型がｓｐｉ＝２もしくはｓｐｉ＝３の特性と関連していないことを示している。グレーのバーは、４９％未満の一致を示している。 ＳＰ３Ｄ遺伝子を含むＦ１雑種、およびＳＰ３Ｄ遺伝子を含まないＦ１雑種の育種スキームを示す図である。黒い四角内の名称はＳＰ３Ｄｐｅｎであり、白い四角はＳＰ３Ｄｅｓｃであり、グレーの四角はヘテロ接合型である。 ホモ接合型Ｆ１雑種およびヘテロ接合型Ｆ１雑種についての表現型が比較されている表である。図示された結果は、４つの植物の平均の結果である。１５７５１は、ホモ接合型形態にあるＳＰ３Ｄ遺伝子と作動可能に連結している本発明のプロモーターを含む本発明のＳ．ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ植物であり、１５７５３は、ヘテロ接合型形態にあるプロモーター／ＳＰ３Ｄ遺伝子を含む本発明のＳ．ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ植物である。ホモ接合型およびヘテロ接合型の両方の植物は、本発明のプロモーター／ＳＰ３Ｄ遺伝子の遺伝子構成を含んでいない本来のＳ．ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ植物である植物１５７６９と比較して減少した仮軸指数を有することは明白である。ＳＰＩは、仮軸指数である。＃果実は、収穫可能な果実の総数であり、＃果房は試験期間（すなわち、計４カ月間）中に形成される果房の総数であり、「＃葉１果房」は、第１果房までの葉の総数である。

［ＳＰ３Ｄｐｅｎのクローニングおよび単離］
ＳＰ３Ｄ Ｓｏｌａｎｕｍ ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ遺伝子（アクセッション番号ＡＹ１８６７３５）は、Ｓｏｌａｎｕｍ ｐｅｎｎｅｌｉｉ ｌａ７１６の遺伝子をクローニングするために使用されてきた。Ｓ．ｐｅｎｎｅｌｌｉｉのＢＡＣライブラリーは、プライマーＳＰ３Ｄ−ｆ２／ＳＰ３Ｄ−ｒを用いて、すなわち９２℃で３０秒、６０℃で３０秒および７２℃で６０秒での４０サイクルによりスクリーニングされ、ＳＰ３Ｄｐｅｎを有するＢＡＣ５２、１ｃ０６ｅｌｌが得られた（図１）。

ＢＡＣ５１、１ｃ０６ｅｌｌは引き続いて、サブクローンを作製するために、ＢａｍＨＩ／ＳｐｅＩを用いて二重消化され、ｐＵＣ１８のＸｂａＩ／ＢａｍＨＩ二重消化物中にライゲートされた。引き続いて、サブクローンは、ＳＰ３Ｄｐｅｎを有する個々のクローンを同定するためにＳＰ３Ｄ−ｆ２／ＳＰ３Ｄ−ｒマーカーを用いてスクリーニングされた。クローンＫＥＺ５０４はシーケンシングされ、完全ＳＰ３Ｄ遺伝子／配列番号１のＳＰ３Ｄｐｅｎと表わされるＳ．ｐｅｎｎｅｌｌｉｉ由来の遺伝子座を含有していた（図２）。Ｓ．ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍのＳＰ３ＤのｃＤＮＡ（アクセッション番号ＡＹ１８６７３５）とＳ．ｐｅｎｎｅｌｌｉｉのＳＰ３ＤのｃＤＮＡとの比較は、ＳＰ３Ｄｐｅｎが４つのヌクレオチド変異を有することを明らかにした。２つの一塩基多型（ＳＮＰ）は第１エクソン内に１５位（Ｔ＝＞Ｃ）および１２０位（Ｃ＝＞Ｔ）上に位置し、第３のＳＮＰは第２エクソン内に２７０位（Ｃ＝＞Ｔ）上にあり、第４のＳＮＰは第４エクソン内に３８７位（Ｇ＝＞Ａ）上にある。図３を参照されたい。これら全てのＳＮＰは同義である。このため、ｓｐｉ＝２の特性は、遺伝子自体によって引き起こされたのではなく、上記遺伝子の調節に起因すると結論付けられた。

［プロモーターにおける原因ＳＮＰ、野生型近縁種］
ナス種の決定的重要点の１つは、仮軸指数である。果房間に２枚の葉を備える（ｓｐｉ＝２）種は、Ｓｏｌａｎｕｍ ｎｅｏｒｉｃｋｉｉ、Ｓｏｌａｎｕｍ ｃｈｍｉｅｌｅｗｓｋｉｉ、Ｓｏｌａｎｕｍ ｃｈｉｌｅｎｓｅ、Ｓｏｌａｎｕｍ ｐｅｒｕｖｉａｎｕｍ、およびＳｏｌａｎｕｍ ｐｅｎｎｅｌｌｉｉである。果房間に３枚の葉を備える（ｓｐｉ＝３）種は、Ｓ．ｈａｂｒｏｃｈａｉｔｅｓ、Ｓ．ｃｈｅｅｓｍａｎｉａｅ、Ｓ．ｐｉｍｐｉｎｅｌｌｉｆｏｌｉｕｍ、およびＳ．ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍである。

ｓｐｉ＝２は遺伝子の上流の変化によって引き起こされるという仮説を検証するために、数種の野生型近縁種が試験されている。上述した種の５３種の野生型近縁種は、プライマーのＳＰ３Ｄ−１０ｆａおよびｄＳＰ３Ｄ−ｒ１を用いて再シーケンシングされた。５３種の野生型近縁種の群中で、１１種はＳ．ｃｈｅｅｓｍａｎｉａｅを表し、２種はＳ．ｃｈｉｌｅｎｓｅを表し、７種はＳ．ｈａｂｒｏｃｈａｉｔｅｓを表し、１０種はＳ．ｎｅｏｒｉｃｋｉｉを表し、１種はＳ．ｐｅｎｎｅｌｌｉｉを表し、７種はＳ．ｐｅｒｕｖｉａｎｕｍを表し、１１種はＳ．ｃｈｍｉｅｌｅｗｓｋｉｉを表し、１種はＳ．ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍを表し、３種はＳ．ｐｉｍｐｉｎｅｌｌｉｆｏｌｉｕｍを表した。

配列比較は、全ｓｐｉ＝２近縁種における遺伝子開始点の６２−６１ヌクレオチド上流でＣＡモチーフを明らかにしたが、他方ｓｐｉ＝３種はＣＴヌクレオチドモチーフまたはＴＡヌクレオチドモチーフを示している。図４を参照されたい。さらに、ＣＡモチーフの上流および下流の多型は、仮軸指数と関連していなかった（図５を参照されたい）。

［ＳＰ３Ｄｐｅｎを含むＦ１雑種およびＳＰ３Ｄｐｅｎを含まないＦ１雑種の表現型］
Ｓ．ｐｅｎｎｅｌｌｉｉ ｌａ７１６由来のＳＰ３Ｄｐｅｎを有する遺伝子移入系４９０１５−２は、Ｅｎｚａ Ｚａｄｅｎ社のＳ．ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ系のＯＴ１４６４およびＯＴ１６９０と異種交雑させられている。結果として生じたＦ１雑種は、ＯＴ１４６４と戻し交雑されているか、ＯＴ１６９０交雑の場合には自家交雑されている。ＳＰ３Ｄｐｅｎを備える植物は、ｄＣＡＰＳマーカーであるｄＳＰ３Ｄ−１ｆｒ、プライマーのｄＳＰ３Ｄ−ｆ／ｄＳＰ３Ｄ−ｒを用いて、９２℃で３０秒、５５℃で６０秒および７２℃で６０秒での４０サイクルのＰＣＲ条件で、ＨｐｙＣＨ４Ｖによる消化、３％ｍｓ−８アガロース（Ｈｉｓｐａｎａｇａｒ社）での分離を用いて選択された。ｄＳＰ３Ｄ−１ｆｒマーカーの他に、当業者には公知であるように、最高の反復親を同定するためにマーカーアシスト戻し交雑が使用され、ＯＴ１４６４バックグラウンドについては植物ＮＴ０５−９６ｃ１１が得られ、ＯＴ１６９０バックグラウンドについてはＮＴ０５−１０８ｈ１０およびＮＴ０５−１０８ｅ１２が得られた。これらの個々の植物を２回自家交雑させ、ｄＳＰ３Ｄマーカーを用いて、およびマーカーアシスト戻し交雑によって再び選択し、ＯＴ１４６４バックグラウンドについては植物１１１Ｂ６が得られ、ＯＴ１６９０バックグラウンドについては植物１１７Ｆ１および１１７Ｇ１が得られた。その後、１１１Ｂ６×１１１Ｆ１を交雑させると１５７５１（ホモ接合型ＳＰ３Ｄｐｅｎ）が得られ、１１１Ｂ６×１１７Ｇ１を交雑させると１５７５３（ヘテロ接合型）が得られ、ＯＴ１６９０×ＯＴ１４６４を交雑させるとＳＰ３Ｄｅｓｃホモ接合型コントロールとしての１５７６９がＦ１雑種として得られた。図６を参照されたい。

１雑種当たり４つの植物を２００６年６月〜２００６年１０月の間に温室内で通常の生育方法で成長させ、連続する果房間の葉の数、第１果房までの葉の数、平均果実重量、収量、果実および果房の数を計数することによって仮軸指数について評価した。平均仮軸指数はＳＰ３Ｄｐｅｎについては２．４であり、ヘテロ接合型植物については２．５であり、ＳＰ３Ｄｅｓｃについては２．７であった（図７）。予想されたように、第１果房までの葉の数は変化し、ＳＰ３Ｄｅｓｃについての７．５からＳＰ３Ｄｐｅｎおよびヘテロ接合型雑種についての５．８へ減少した。平均果実重量は、５７〜５９ｇ／果実の範囲で、雑種間で類似していた。予想されたように、果房の数は、ＳＰ３Ｄｅｓｃについての９からＳＰ３Ｄｐｅｎについての１４へ増加した。果房当たりの果実の数は、ＳＰ３Ｄｅｓｃについての６．７からＳＰ３Ｄｐｅｎについての７．６へ増加した。これは、この成長期間中のホモ接合型ＳＰ３ＤｐｅｎＦ１雑種の総収量を、大まかには０．７ｋｇ増加させる。

これらのデータは、上記プロモーター配列を含んでいない植物と比較して、本発明のプロモーター配列を含む植物において５カ月後に観察された総収量の改善が、果房の増加した数に起因し、ホモ接合性ＳＰ３Ｄｐｅｎの場合にはさらに１果房当たりの増加した果実数にも起因することを明らかにしている。結果として、１雑種当たり４つの植物の総収量は、ＳＰ３Ｄｅｓｃ、ＳＰ３Ｄｅｓｃ／ｐｅｎおよびＳＰ３Ｄｐｅｎについてそれぞれ３．５ｋｇから５．０ｋｇおよび６．０ｋｇに向上する。

ＳＰ３Ｄｐｅｎによる収量の改良は、遺伝子の開始点から６２−６１ヌクレオチド上流のＣＡモチーフを含むＳＰ３Ｄｐｅｎのプロモーター配列に起因する。

Claims (28)

1. ＳＰ３Ｄプロモーター配列であって、前記プロモーター配列に作動可能に連結している下流ＳＰ３Ｄ遺伝子の転写を指示することができ、仮軸指数３以上を有する植物における仮軸指数を低下させるために、仮軸指数２を有するナス科の１種に由来するＳＰ３Ｄプロモーター配列。
2. 前記プロモーター配列が、前記ＳＰ３Ｄ遺伝子の開始コドンの６２−６１ヌクレオチド上流の位置にＣＡモチーフを含む、請求項１に記載のプロモーター配列。
3. 前記プロモーター配列が、Ｓｏｌａｎｕｍ ｐｅｎｎｅｌｌｉｉ、Ｓｏｌａｎｕｍ ｎｅｏｒｉｃｋｉｉ、Ｓｏｌａｎｕｍ ｃｈｍｉｅｌｅｗｓｋｉｉ、Ｓｏｌａｎｕｍ ｃｈｉｌｅｎｓｅ、およびＳｏｌａｎｕｍ ｐｅｒｕｖｉａｎｕｍからなる群から選択されるナス科の１種に由来する、請求項１または２に記載のプロモーター配列。
4. 前記プロモーター配列が、配列番号１（図２）のヌクレオチド１〜６２４と少なくとも７５％同一性を有するヌクレオチド配列を含む、請求項１、２または３に記載のプロモーター配列。
5. 配列番号１のヌクレオチド１〜６２４と少なくとも８５％同一性を有するヌクレオチド配列を含む、請求項４に記載のプロモーター配列。
6. 配列番号１のヌクレオチド１〜６２４と少なくとも９０％同一性を有するヌクレオチド配列を含む、請求項５に記載のプロモーター配列。
7. 配列番号１のヌクレオチド１〜６２４と少なくとも９５％同一性を有するヌクレオチド配列を含む、請求項６に記載のプロモーター配列。
8. 配列番号１のヌクレオチド１〜６２４と少なくとも９９％同一性を有するヌクレオチド配列を含む、請求項７に記載のプロモーター配列。
9. 前記プロモーター配列が、Ｓ．Ｐｅｎｎｅｌｌｉｉに由来し、配列番号１のヌクレオチド１〜６２４のヌクレオチド配列からなる、請求項１〜８のいずれかに記載のプロモーター配列。
10. 請求項１〜９のいずれかに記載のプロモーター配列および植物ＳＰ３Ｄ遺伝子由来のｃＤＮＡ配列を含む遺伝子構築物。
11. 前記ｃＤＮＡ配列が、図３に示される前記ＳＰ３ＤｐｅｎのｃＤＮＡ配列と少なくとも７５％同一性を有するヌクレオチド配列を含む、請求項１０に記載の遺伝子構築物。
12. 前記ｃＤＮＡ配列が、図３に示される前記ＳＰ３ＤｐｅｎのｃＤＮＡ配列と少なくとも８５％同一性を有するヌクレオチド配列を含む、請求項１１に記載の遺伝子構築物。
13. 前記ｃＤＮＡ配列が、図３に示される前記ＳＰ３ＤｐｅｎのｃＤＮＡ配列と少なくとも９０％同一性を有するヌクレオチド配列を含む、請求項１２に記載の遺伝子構築物。
14. 前記ｃＤＮＡ配列が、図３に示される前記ＳＰ３ＤｐｅｎのｃＤＮＡ配列と少なくとも９５％同一性を有するヌクレオチド配列を含む、請求項１３に記載の遺伝子構築物。
15. 前記ｃＤＮＡ配列が、図３に示される前記ＳＰ３ＤｐｅｎのｃＤＮＡ配列と少なくとも９９％同一性を有するヌクレオチド配列を含む、請求項１４に記載の遺伝子構築物。
16. 前記ｃＤＮＡ配列が、図３に示される前記ヌクレオチド配列からなる、請求項１０〜１５のいずれかに記載の遺伝子構築物。
17. 減少した仮軸指数を有するナス科の植物を提供するための方法であって、前記植物のゲノムに、下流ＳＰ３Ｄ遺伝子と作動可能に連結している請求項１〜８のいずれかに記載のプロモーター配列を導入する工程、または前記植物に請求項９〜１５のいずれかに記載の遺伝子構築物を導入する工程を含み、前記プロモーター配列もしくは前記遺伝子構築物を備える前記植物の前記仮軸指数が、前記プロモーター配列もしくは前記遺伝子構築物を含まない植物と比較して減少する方法。
18. 前記仮軸指数が、仮軸指数２に減少する、請求項１７に記載の方法。
19. 仮軸指数３以上を有するナス科の植物の収穫量を増加させるための方法であって、前記植物のゲノムに、下流ＳＰ３Ｄ遺伝子と作動可能に連結している上述したプロモーター配列を導入する工程、または前記植物に請求項９〜１５のいずれかに記載の遺伝子構築物を導入する工程を含む方法。
20. 前記植物が、Ｓ．ｈａｂｒｏｃｈａｉｔｅｓ、Ｓ．ｃｈｅｅｓｍａｎｉａｅ、Ｓ．ｐｉｍｐｉｎｅｌｌｉｆｏｌｉｕｍおよびＳ．ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ、ならびに／またはそれらに由来する植物からなる群から選択される、請求項１７、１８または１９に記載の方法。
21. 前記植物が、Ｓ．ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍである、請求項２１に記載の方法。
22. 請求項１７〜２１のいずれかに記載の方法によって得られる植物。
23. 請求項２２に記載の植物に由来する種子および／または他の植物部分。
24. ナス科の植物であって、そのゲノム内に、ＳＰ３Ｄ遺伝子と作動可能に連結している請求項１〜９のいずれかに記載のプロモーター配列を含み、前記植物が、前記プロモーターを含まない同種の植物と比較して、減少した仮軸指数を有する植物。
25. 前記植物が、Ｓ．ｈａｂｒｏｃｈａｉｔｅｓ、Ｓ．ｃｈｅｅｓｍａｎｉａｅ、Ｓ．ｐｉｍｐｉｎｅｌｌｉｆｏｌｉｕｍおよびＳ．ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ、および／またはそれらに由来する植物からなる群から選択される、請求項２４に記載の植物。
26. 前記植物が、Ｓ．ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍである、請求項２５に記載の植物。
27. 仮軸指数２を有する、請求項２４、２５または２６に記載の植物。
28. 請求項２４〜２７のいずれかに記載の植物由来の種子および／または他の植物部分。

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