BRPI0721895A2 - Seqüência promotora de sp3d, constructo genético, método para provisão de plantas da família solanaceae possuindo um índice simpodial reduzido, método para aumento de rendimento de safra em uma planta da família solanaceae, planta, sementes e/ou outras partes de plantas, e planta da família solanaceae - Google Patents

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I SEQÜÊNCIA PROMOTORA DE SP3D, CONSTRUCTO GENÉTICO, MÉTODO PARA PROVISÃO DE PLANTAS DA FAMÍLIA SOLANACEAE POSSUINDO UM ÍNDICE SIMPODIAL REDUZIDO, MÉTODO PARA AUMENTO DE RENDIMENTO DE SAFRA EM UMA PLANTA DA FAMÍLIA SOLANACEAE, 5 PLANTA, SEMENTES E/OU OUTRAS PARTES DE PLANTAS, E PLANTA DA FAMÍLIA SOLANACEAE

A presente invenção refere-se a uma seqüência promotora que, quando ligada operacionalmente a um gene vegetal de jusante em uma planta, é capaz de aumentar o 10 rendimento de uma safra da referida planta, particularmente no tomate. A invenção refere-se adicionalmente a plantas da família Solanaceae, particularmente a plantas de tomate (Solanum lycopersicum), compreendendo a referida seqüência promotora ligada operacionalmente ao referido gene vegetal 15 de jusante, a métodos para obtenção das referidas plantas e a plantas passíveis de serem obtidas mediante utilização dos referidos métodos.

O tomate (Solanum lycopersicum, também designado como Lycopersicum esculentum) é uma planta perene de tempo 20 curto de vida, cultivada como planta anual, e é um parente próximo da batata. O fruto (isto é, o tomate) é uma baga comestível, de cor viva (normalmente vermelha, devido à presença do pigmento licopeno), com 1-2 cm de diâmetro em plantas de tipo selvagem, e normalmente muito maior em 25 formas cultivadas. A planta é atualmente cultivada no mundo inteiro devido a seus frutos comestíveis, que constituem um vegetal de comercialização em estado fresco. O hábito de crescimento das plantas de tomate é normalmente classificado como determinado ou indeterminado. Esta classificação depende da capacidade do sistema de brotos para crescimento simpodial contínuo. As cultivares 5 indeterminadas (em que o meristema apical cresce indefinidamente e as flores surgem do meristema axilar) produzem sistemas ramificados que crescem indefinidamente, ao passo que as cultivares determinadas (em que o meristema apical é convertido em flor terminal) produzem sistemas 10 ramificados com um número progressivamente menor de nós até o broto terminar com duas inflorescências e desenvolver a forma de um arbusto. Esta alteração de arquitetura da planta é devida a uma mutação no gene SELF-PRUNING (SP) (Pnueli e outros, Developement 125: 1979-1989, 1998) e tem 15 constituído um importante desenvolvimento para esta safra, na medida em que os tipos determinados podem ser colhidos mecanicamente e são portanto principalmente utilizados para a indústria de processamento, ao passo que os tipos indeterminados são geralmente cultivados em estufas ou 20 casas de vegetação e são utilizados para o mercado de produtos frescos.

Fridman e outros (Mol. Genet. Genomics 266: 821- 826, 2002) demonstraram anteriormente que a introgressão de um alelo de S. pennellii de um QTL designado como PW9-2-5 25 em um ambiente sp/sp de S. Esculentum produz como resultado um crescimento semi-determinado com 2 folhas entre as inflorescências (designado como spi=2). os autores sugeriram que o gene SP9D de S. pennellii, SP9Dpen, é o gene candidato para a alteração da arquitetura da planta e também o assim designado Conteúdo Sólido Sólido ("Solid Solid Content" - SSC) ou o índice de refração (que é 5 indiretamente relacionado com o sabor) . O gene SP9D pertence à família de genes CETS (CENTRORADIALIS, Terminal Flower), e acredita-se que esta família de genes desempenha um papel primordial na determinação da arquitetura da planta (Carmel-Goren, Plant Mol. Biol. 52; 1215-1222, 10 2003).

0 S. lycopersicum possui seis membros da família de genes CETS, designados como SP, distribuídos através de cinco diferentes cromossomos: SP2I, SP3D, SP5G, SP6A, e SP9D, em que os nomes são dados de acordo com a posição de 15 intercalação ("bin position") (Pan e outros, Genetics 155: 309-322, 2000). 0 sexto elemento, SP, é localizado no cromossomo 6, posição intercalar ("bin") E, e é conhecido como sendo o gene que altera o tomate em um fenótipo determinado (sp/sp)/indeterminado (SP/-). As relações 20 filogenéticas agruparam os cromossomos SP3D, SP5G, e SP6A com o gene FT de Arabidopsis. Os cromossomos SP9D e SP são agrupados com TFL-I de Arabidopsis, e o cromossomo SP2I encontra-se na mesma ramificação com a Mãe de Tempo de Floração ("Mother of Flowering Time" - MFT) de Arabidopsis 25 (Carmel-Goren e outros, supra). Apesar das relações filogenéticas entre os genes, os perfis de expressão diferem. Desta forma, a expressão do cromossomo SP5G tem sido encontrada predominantemente em cotilédones, ao passo que o cromossomo SP3D é principalmente expressado em órgãos florais com baixa expressão em folhas de órgãos vegetativos. Para o cromossomo SP6A não foi até agora 5 encontrado qualquer tipo de expressão. 0 SP9D é principalmente expressado no ápice do broto e apresenta uma elevada expressão nas raízes, ao passo que o SP2I se encontra expressado em todos os órgãos testados. Apesar destes perfis de expressão, pouco se conhece sobre sua 10 função com SP constituindo uma exceção.

Durante as últimas décadas, o cultivo de tomate indeterminado focalizou principalmente o rendimento, a resistência a doenças, e os aspectos de qualidade dos frutos tais como sabor e amadurecimento uniformes. Os 15 aperfeiçoamentos de rendimento foram obtidos graças a novos métodos de produção, aperfeiçoamentos de gerenciamento de pragas e variedades mais adequadas a novos métodos de produção, porém os ganhos em termos de rendimento tornam-se menores. Novas variedades com 5 ou 15 frutos a mais por 20 planta proporcionaram um aumento de rendimento de 2-4%.

O desenvolvimento de variedades com rendimento mais elevado foi prejudicado pela falta de conhecimento relativo aos aspectos que determinam o rendimento do tomate. Xiao (2004; ISHS Acta Horticulturae 654 ("workshop" 25 internacional sobre modelos de cultivo/crescimento de plantas e controle de qualidade de produto em produção hortícola) e Heuvelink (2005; ISHS Acta Horticulturae 691 (Conferência Internacional sobre sistemas sustentáveis de casa de vegetação/estufa - greensys2004; 43-50) simularam que uma variedade de tomate com duas folhas entre inflorescências ao invés das convencionais três folhas 5 desviaria a assimilação para os frutos, resultando em rendimentos mais elevados quando fosse mantido o índice de Área Foliar ("Leaf Area Index" - LAI) . Os dados simulados foram validados mediante remoção de uma a cada duas folhas e manutenção do índice LAI acima de 3. Conforme simulado, o 10 rendimento aumentou em aproximadamente 10%.

As variedades cultivadas com duas folhas entre as inflorescências não são conhecidas, entretanto existem parentes de tomate selvagem com duas folhas entre as inflorescências, isto é, possuindo um índice simpodial = 2 15 (spi=2), tal como as espécies Solanum neorickii, Solanum chmielewskii, Solanum chilense, Solanum peruvianum, e Solanum pennellii. A propriedade de um índice simpodial de 2 é recessiva para o índice simpodial de 3 em tomates cultivados de híbridos Fl do cruzamento inter-espécies com 20 S. pennellii (Pnueli e outros, 1998, supra). A base genética de spi=2, entretanto, não é até agora conhecida.

À medida que a população mundial continua a crescer, a demanda por vegetais frescos, tais como tomates, é objeto de um crescimento constante no mundo inteiro. 25 Desta forma existe uma necessidade contínua de meios e métodos para aperfeiçoamento do rendimento de plantas tais como o tomate. O objeto da presente invenção consiste na provisão de novos meios e métodos para aumento do rendimento de safras de plantas da família Solanaceae.

0 objeto da presente invenção consiste particularmente na provisão de novos meios e métodos para aumento de rendimento de safras de tomate, S. lycopersicum.

Este objetivo é alcançado mediante provisão de uma seqüência promotora do cromossomo SP3D, que é capaz de realizar diretamente a transcrição de um gene SP3D de 10 jusante que é operacionalmente interligado à referida seqüência promotora, em que a seqüência promotora é derivada de uma espécie da família Solanaceae, possuindo um índice simpodial de 2, para redução do índice simpodial em plantas que possuem um índice simpodial de 3 ou mais.

Em uma configuração preferencial, a seqüência

promotora compreende um motivo ("motif") CA em uma posição 62-61 nucleotídeos a jusante (isto é, em posições -62 e -61 nt) do códon de início do referido gene SP3D.

Na pesquisa que conduziu à presente invenção, foi 20 identificado um novo gene da família de genes CETS que proporciona um aumento do índice spi=2. Desta forma, a linhagem de introgressão 49015-2 contendo uma inserção La716 de S. pennellii do cromossomo 3 demonstrou proporcionar um índice simpodial de 2. Com base em 25 localização de mapeamento e fenótipo foi concluído que a propriedade de spi=2 da linhagem 49015-2 é causada pelo gene SP3D de S. pennellii, que foi designado como "SP3Dpen".

De acordo com a invenção, foi subseqüentemente descoberto que a propriedade de índice spi=2 não foi causada pelo gene propriamente dito e sim devida à 5 regulação do gene pelo referido promotor. Em particular, foi demonstrado que o índice simpodial de 2 se encontrava interligado com um motivo CA na seqüência promotora 62-61 nt a montante do início do gene SP3D, isto é, o nucleotídeo na posição -62 é C e o nucleotídeo na posição -061 é A.

Conforme foi descrito acima, nos brotos simpodiais

de tomate (S. lycopersicum) as fases vegetativas e reprodutiva alternam-se regularmente. O ramo primário ocorre normalmente após a produção de 8-10 folhas e o crescimento prossegue então a partir do broto lateral 15 (axilar) mais superior imediatamente abaixo das inflorescências. Este broto gera então geralmente três folhas mais antes de terminar por sua vez em uma outra inflorescência, e assim por diante. Desta forma, o broto é predominantemente composto de um número de unidades 20 simpodiais reiteradas, cada uma consistindo em três nós vegetativos e uma inflorescência terminal, que é referida como tendo um índice simpodial de 3 (spi=3).

λ

De acordo com a presente invenção, foi agora descoberto que mediante introdução de uma das seqüências 25 promotoras descritas acima em interligação operacional com um gene SP3D em uma planta da família Solanaceae possuindo um índice simpodial de 3 ou mais, é obtida como resultado uma planta possuindo um indice simpodial reduzido em comparação com plantas desprovidas do referido promotor.

Em uma configuração preferencial o índice simpodial é reduzido para um índice simpodial de 2. Desta forma, é 5 preferencialmente obtida como resultado uma planta possuindo um índice simpodial de 2, isto é, uma planta em que o broto é predominantemente composto de unidades simpodiais consistindo em dois nós vegetativos e uma inflorescência terminal. De acordo com a presente invenção, 10 um "índice simpodial de 2" refere-se a um índice simpodial médio entre, e incluindo, 1,6 e 2,5, preferencialmente entre 1,6 e 2,5, mais preferencialmente entre 1,7 e 2,4, ainda mais preferencialmente entre 1,8 e 2,3, e absolutamente mais preferencialmente entre 1,9 e 2,2.

De acordo com a invenção, foi descoberto que a

seqüência promotora, quando interligada operacionalmente com um gene SP3D, causa um aumento de rendimento de safra em plantas. Desta forma, por exemplo, uma planta possuindo um índice simpodial reduzido de 3 para 2 irá apresentar 20 predominantemente duas folhas entre as inflorescências ao invés de três, de tal forma que os simpódios são aproximadamente 1/3 mais curtos que a contrapartida de índice spi=3, o que produzirá como resultado um aumento de número de inflorescências por unidade de comprimento da 25 planta. Adicionalmente, as sucessivas inflorescências irão surgir mais cedo no tempo, de tal forma que é igualmente obtido um número maior de inflorescências por unidade de tempo. Adicionalmente, foi descoberto que a seqüência promotora produz como resultado um aumento de rendimento de safra sem o hábito de crescimento semi-determinado da SP9Dpen.

Adicionalmente, o promotor, quando operacionalmente

interligado ao gene SP3D, produz como conseqüência vários outros traços benéficos tais como a ocorrência de uma primeira inflorescência após o surgimento de 6-8 folhas ao invés de aproximadamente 10 folhas. Adicionalmente, é 10 possível manter nessas plantas uma maior quantidade de frutos por inflorescência (aproximadamente um fruto a mais por inflorescência) . Essas características produzem como resultado um aumento do número de agrupamentos de frutos por metro ou unidade de tempo e/ou um aumento do número de 15 frutos por agrupamento e portanto um rendimento mais elevado da safra.

Deverá ser observado que de acordo com a presente invenção, a expressão "rendimento de safra" é definida como a quantidade (por exemplo, expressada em kg) de produto 20 (por exemplo, frutos, por exemplo, tomates) por metro de broto e ramos da planta, ou por unidade de tempo (desde a lavra inicial de plantio até o final da safra ou o término da estação de cultivo, por exemplo expressada em meses). Um aumento de rendimento de safra de plantas compreendendo a 25 seqüência promotora de acordo com a invenção refere-se ao aumento de rendimento da safra em comparação com o rendimento de safra das mesmas planta quando não compreendem a seqüência promotora de acordo com a invenção.

Em uma configuração particularmente preferencial da invenção, a seqüência promotora é derivada de uma espécie da família Solanaceae selecionada do grupo que consiste em 5 Solanum pennellii, Solanum neorickii, Solanum chmielewskii, Solanum chilense, e Solanum peruvianum.

Em uma outra configuração preferencial da invenção, a referida seqüência promotora compreende uma seqüência de nucleotídeos possuindo uma identidade de pelo menos 7 5% com os nucleotídeos 1 até 624 da SEQ ID NO: 1 (Fig. 2).

De acordo com uma configuração preferencial adicional da invenção, a seqüência promotora compreende uma seqüência de nucleotídeos possuindo uma identidade de pelo menos 85%, mais preferencialmente pelo menos 90%, mais 15 preferencialmente pelo menos 95%, e mais preferencialmente pelo menos 99% com os nucleotídeos 1 até 624 da SEQ ID NO: 1.

De acordo com a presente invenção, a expressão "uma seqüência de nucleotídeos possuindo uma identificação de 20 X%" refere-se a uma seqüência de nucleotídeos possuindo uma seqüência de nucleotídeos na qual X% dos nucleotídeos são idênticos à seqüência de nucleotídeos específica (isto é, dos nucleotídeos 1 até 624) da SEQ ID NO: I. Isto pode portanto abranger seqüências de nucleotídeos possuindo o 25 mesmo número de 624 nucleotídeos, porém em que X% dos nucleotídeos são diferentes em comparação com os nucleotídeos 1-624 da referida SEQ ID NO: 1, e/ou fragmentos da referida parte da SEQ ID NO: 1, compreendendo X% dos nucleotídeos originais (uma forma mista é igualmente possível). Deverá ser entendido que em todos os casos o motivo CA deverá encontrar-se presente e o promotor deverá 5 ter atividade promotora.

Em uma configuração particularmente preferencial, a seqüência promotora é derivada de S. pennellii e consiste na seqüência de nucleotídeos dos nucleotídeos 1 até 624 da SEQ ID NO: 1.

Foi portanto descoberto de acordo com a presente

invenção que plantas da família Solanaceae, particularmente S. lycopersicum, compreendendo a seqüência promotora de acordo com a presente invenção, conforme definida acima, em interligação operacional com um gene SP3D, rendem uma maior 15 quantidade de kg de frutos, por metro de broto e ramos e/ou por unidade de tempo, em comparação com as mesmas plantas quando não compreendem a seqüência promotora de acordo com a presente invenção.

Foi anteriormente relatado por Lifschitz e outros 20 (PNAS 103, 6398-6403, 2006, que o gene SP3D é o gene causai da mutação de tomate de inflorescência de flor única sft ("Single-Flower Truss"). As plantas mutantes sft apresentam florescimento tardio com um número reduzido de flores por inflorescência (1 ou 2 flores por inflorescência) e 25 apresentam uma inflorescência de tipo indeterminado. Foi demonstrado que a mutação de inflorescência de flor única (sft) é devida a mutações no gene SP3D. Foi demonstrado que plantas que apresentam uma elevada expressão de sft sob controle do promotor 35S constitutivo mantêm o padrão de crescimento simpodial porém apresentam um índice simpodial de 2 ao invés de 3. 0 enxerto de um rebento mutante sft em 5 um porta-enxerto SFT:35S recuperou o fenótipo do tipo natural (incluindo o índice spi=3), demonstrando que o SP3D/SFT media sua função através de um sinal sistêmico. A seqüência promotora de acordo com a presente invenção e sua influência no índice simpodial, e conseqüentemente no 10 rendimento de safras de plantas da família Solanaceae, particularmente de S. lycopersicum, não foram divulgados por Lifschitz e outros.

A seqüência promotora de acordo com a presente invenção pode ser introduzida em interligação operacional com qualquer gene SP3D ativo.

Em uma configuração preferencial, o gene SP3D compreende uma seqüência genômica de nucleotídeos possuindo uma identidade de pelo menos 75% com os nucleotídeos 625 até 7307 da SEQ ID NO: 1. Preferencialmente, a identidade 20 de seqüência é de 85%, mais preferencialmente, 90%, ainda mais preferencialmente 95% e mais preferencialmente ainda, 99%. A invenção também se refere a estes genes SP3D em si mesmos.

Em uma configuração particularmente preferencial, o gene SP3D é o gene SP3D de S. pennellii, SP3Dpen, possuindo uma seqüência genômica de nucleotídeos consistindo nos nucleotídeos 625 até 7307 da SEQ ID NO: 1. A presente invenção também se refere a um constructo genético, compreendendo uma seqüência promotora conforme descrita acima e uma seqüência de cDNA derivada de um gene SP3D conforme descrito acima. Esse constructo 5 genético pode ser, por exemplo, introduzido em plantas mediante utilização de técnicas conhecidas de biologia molecular, para produção de plantas geneticamente modificadas da família Solanaceae, preferencialmente S. lycopersicum, possuindo um índice simpodial reduzido.

Em uma configuração preferencial, a seqüência de

cDNA compreende uma seqüência de nucleotídeos possuindo uma identidade de pelo menos 7 5% com a seqüência de cDNA de SP3Dpen conforme se encontra ilustrado na Figura 3. Preferencialmente, a identidade de seqüência é de 85%, mais 15 preferencialmente, 90%, ainda mais preferencialmente 95% e mais preferencialmente ainda, 99%.

Em uma configuração particularmente preferencial, a seqüência de cDNA consiste na seqüência de nucleotídeos conforme ilustrada na Figura 3.

A invenção refere-se adicionalmente a um método

para provisão de plantas da família Solanaceae possuindo um índice simpodial reduzido, compreendendo a introdução, no genoma de uma planta da família Solanaceae, possuindo um índice simpodial de 3 ou mais, de uma seqüência promotora 25 conforme descrita acima em interligação operacional com um gene SP3D de jusante, ou introdução na referida planta de um constructo genético conforme descrito acima, de tal forma que é obtida como resultado uma planta possuindo um índice simpodial reduzido em comparação com a referida planta na ausência da referida seqüência promotora.

Em uma configuração preferencial, o índice simpodial é reduzido para um índice simpodial de 2.

A invenção refere-se adicionalmente a um método para aumento de rendimento de safra de uma planta da família Solanaceae possuindo um índice simpodial de 3 ou mais, compreendendo a introdução, no genoma da referida 10 planta, de uma seqüência promotora conforme descrita acima, em interligação operacional com um gene SP3D de jusante, ou introdução na referida planta de um constructo genético conforme descrito acima.

Em configurações preferenciais dos métodos 15 identificados acima a planta é preferencialmente selecionada do grupo que consiste em S. habrochaites, S. cheesmaniae, S. pimpinellifolium e S. lycopersicum, e/ou plantas derivadas das mesmas. Em uma configuração particularmente preferencial, a planta consiste em S. 20 lycopersicum. A expressão "plantas derivadas das mesmas" refere-se por exemplo a plantas derivadas do cruzamento de duas espécies selecionadas tais como, por exemplo, plantas derivadas de um cruzamento entre as espécies S. habrochaites e S. lycopersicum.

A seqüência promotora, e/ou o constructo genético

podem ser introduzidos nestas plantas por introgressão através de técnicas de melhoramento convencionais, tais como descritas abaixo, ou alternativamente, mediante utilização de técnicas aSequadas de biologia molecular, que são bem conhecidas das pessoas versadas na técnica. A introdução da seqüência promotora, ou a introdução de um 5 constructo genético adequado, compreendendo a seqüência promotora e uma seqüência de cDNA de um gene SP3D de acordo com a invenção, para o interior de células de plantas, pode ser efetuado, por exemplo, por transfecção, micro-injeção, eletroporação, etc. É igualmente possivel utilizar-se 10 transformação medida por Agrobacterium. As células podem ser então subseqüentemente regeneradas para obtenção de plantas completas.

De acordo com a invenção, foi demonstrado que mediante a introdução da seqüência promotora de acordo com 15 a invenção em interligação operacional com um gene SP3D, ou mediante introdução do constructo genético de acordo com a invenção em espécies da família Solanaceae, que teriam normalmente (isto é, sem a seqüência promotora) um índice simpodial de 3 ou mais, por exemplo um índice simpodial de 20 3, podem ser agora obtidas plantas com um índice simpodial reduzido, preferencialmente um índice simpodial de 2, proporcionando como benefício um aumento de rendimento da safra.

Adicionalmente, foi descoberto que no caso do tomate, S. lycopersicum, a primeira inflorescência ocorre após 6-8 folhas ao invés de aproximadamente 10 folhas. Adicionalmente, é possível manter nestas plantas uma maior quantidade de frutos por inflorescência (aproximadamente um fruto adicional por inflorescência). Desta forma, são obtidas plantas que proporcionam um aumento de rendimento da safra em comparação com as mesmas plantas quando estas 5 últimas não compreendem a seqüência promotora.

A seqüência promotora de acordo com a invenção pode ser introduzida em interligação operacional com um gene SP3D que é endógeno na planta, isto é, com o gene SP3D que existe normalmente na referida planta. Neste caso, somente 10 é introduzida a seqüência promotora, isto é, a seqüência promotora endógena é substituída por um produto recombinante selecionado da seqüência promotora de acordo com a invenção, que se encontra em interligação operacional com o gene SP3D endógeno da referida planta. Entretanto, é 15 igualmente possível introduzir tanto o promotor quanto o gene SP3D, ou um constructo genético de acordo com a presente invenção conforme definido acima. No caso em que tanto o promotor quanto o gene SP3D são introduzidos na planta, ambos são portanto exógenos relativamente à 20 referida planta.

A invenção refere-se adicionalmente a plantas da família Solanaceae, passíveis de obtenção através do

«

referido método, e possuindo um índice simpodial reduzido, preferencialmente possuindo um índice simpodial de 2, bem 25 como a sementes e outras partes de plantas derivadas das mesmas, tais como células de plantas, órgãos, e tecidos, tais como, por exemplo, porta-enxertos. A prática normal no cultivo do tomate por melhoristas envolve o enxerto de uma variedade de tomate em um porta-enxertos resistente a doenças para propósitos de controle de doenças oriundas do solo. Os porta-enxertos são geralmente mais vigorosos que 5 os tomates não-exertados. 0 enxerto pode, por exemplo, ser executado nos epicótilos, antes das primeiras folhas, em um híbrido de S. lycopersicum x parente natural.

A planta de acordo com a invenção é preferencialmente selecionada do grupo que consiste em S. 10 habrochaites, S. cheesmaniae, S. pimpinellifolium e S. lycopersicum, e/ou plantas derivadas das mesmas. Em uma configuração particularmente preferencial, a planta consiste em S. lycopersicum.

A invenção refere-se adicionalmente a plantas da 15 família Solanaceae, particularmente a plantas possuindo normalmente um índice simpodial de 3 ou mais, compreendendo em seu genoma uma seqüência promotora conforme descrita acima, em interligação operacional com um gene SP3D, e possuindo portanto um índice simpodial reduzido, 20 preferencialmente possuindo um índice simpodial de 2. Uma vez mais, o gene SP3D pode ser endógeno ou exógeno relativamente à planta. A invenção também se refere a sementes de plantas e/ou outras partes de plantas conforme descritas acima, derivadas da referida planta.

A planta é preferencialmente selecionada do grupo

que consiste em S. habrochaites, S. cheesmaniae, S. pimpinellifolium e S. lycopersicum, e/ou plantas derivadas das mesmas.

Preferencialmente, a planta consiste em S. lycopersicum.

A invenção é adicionalmente ilustrada pelos Exemplos e Figuras que se encontram a seguir.

A Figura 1 ilustra as seqüências de "primers" utilizadas para triagem de uma biblioteca BAC de S. pennellii e seleção de plantas.

A Figura 2 ilustra a seqüência de nucleotídeos da 10 SEQ ID NO: 1, isto é, a seqüência genômica de nucleotídeos do gene SP3Dpen incluindo a seqüência promotora (nucleotídeos 1-624). O motivo ("motif") CA foi indicado em negrito e sublinhado; as caixas de cor cinza e a região com sublinhado duplo indicam o códon de SP3D, as expressões em 15 letras minúsculas indicam um SNP na CDS em comparação com S. lycopersicum.

A Figura 3 ilustra o alinhamento de cDNA de SP3Desc com sua tradução em aminoácidos (isto é, derivado de S. lycopersicum) (também conhecido como L. esculentum) com 2 0 cDNA de SP3Dpen e sua tradução em aminoácidos, indicando que as 4 alterações de nucleotídeos (caixas de cor cinza) nas regiões de codificação são sinônimas.

A Figura 4 ilustra o alinhamento da região promotora de SP3Dpen dos nucleotídeos 544-580 com outros parentes naturais da família Solanaceae indicando que os motivos CT ou TA indicados com uma seta são interligados com spi=3 e um motivo CA encontra-se associado com spi=2. A Figura 5 ilustra o alinhamento de seqüência de DNA da região 1-624 promotora de SP3Dpen com outros parentes naturais da família Solanaceae, indicando que polimorfismos a montante e a jusante do motivo CA não são 5 interligados com mas propriedades de spi=2 ou spi=3. As barras de cor cinza indicam uma equiparação de < 49%.

A Figura 6 é um esquema de cultivo de um híbrido Fl com e sem SP3Dgene. Os nomes nas caixas negras são SP3Dpen, nas caixas brancas são SP3Desc, e nas caixas de cor cinza são heterozigóticos.

A Figura 7 é uma tabela de comparação dos fenóticpos para híbridos Fl homozigóticos e heterozigóticos. Os resultados fornecidos consistem na média dos resultados de 4 plantas. A designação 15751 15 indica uma planta de S. lycopersicum de acordo com a invenção, que compreende o promotor de acordo com a presente invenção em interligação operacional com o gene SP3D em forma homozigótica, 15753 é uma planta de S. lycopersicum de acordo com a invenção, que compreende o 20 promotor/SP3D gene em forma heterozigótica. É claro que tanto as plantas homozigóticas quanto as plantas heterozigóticas possuem um índice simpodial reduzido em comparação com a planta 157 69, que é uma planta normal de

S. lycopersicum que não compreende a constituição genética de promotor/gene SP3D de acordo com a invenção. SPI é um índice simpodial. A designação # frutos é o número total de frutos passíveis de colheita, a designação # inflorescências é o número total de inflorescências formadas durante o período de exame (isto é, um total de 4 meses, e "# folhas 1 inflorescência" é o número total de folhas até a primeira inflorescência.

5 EXEMPLOS

EXEMPLO 1

Clonagem e isolação de SP3Dpen

O gene SP3D de Solanum esculentum (número de acesso AY186735) foi utilizado para clonagem do gene la716 de 10 Solanum pennellii. A biblioteca BAC de S. pennellii foi submetida a triagem com "primers" SP3D-f2/SP3D-r: 40 ciclos a 92° C 30", 60° C 30" e 72° C 60" resultando em BAC52,lc06ell contendo SP3Dpen (FIG. 1).

BAC51,lc06ell foi subseqüentemente duplamente digerido com BamHI/Spel e ligado em pUC18 Xbal/BamHI duplamente digerido para criação de sub-clones. Subseqüentemente, os sub-clones foram triados com marcador SP3D-f2/SP3D-r para identificação do clone individual que abrigava SP3Dpen. 0 clone KEZ504 foi seqüenciado e continha o locus/gene SP3D completo de S. pennellii, designado como SP3Dpen, SEQ ID NO: 1 (Fig. 2) . A comparação de cDNA de » SP3D de S. lycopersicum, número de acesso AY186735, com o

cDNA de SP3D de S. pennellii revelou que o SP3Dpen apresentava 4 mudanças de nucleotídeos. Dois polimorfismos 25 de nucleotídeos simples ("Single Nucleotide Polymorphisms"

- SNP) encontram-se localizados no primeiro éxon na posição 15 (T=>C) e 120 (C=>T) , o terceiro SNP encontra-se no segundo éxon na posição 270 (C=>T), e o quarto SNP encontra-se posicionado no quarto éxon, na posição 387 (G=>A), vide a Fig. 3. Todos estes SNP's eram sinônimos. Foi portanto concluído que a propriedade de spi=2 não era 5 causada pelo gene propriamente dito e sim devida à regulação do gene.

EXEMPLO 2

SNP causai em promotor, parentes naturais

Uma das chaves da determinação da espécie Solanum é 10 o índice simpodial. As espécies com duas folhas entre inflorescências (spi=2) são Solanum neorickii, Solanum chmielewskii, Solanum chilense, Solanum peruvianum, e Solanum pennellii. As espécies com três folhas entre inflorescências (spi=3) são S. habrochaites, S. 15 cheesmaniae, S. pimpinellifolium e S. lycopersicum.

Para confirmação da hipótese de que o índice spi=2 seja causado por uma alteração a montante do gene, foram estudados diversos parentes de origem natural. Cinqüenta e três parentes selvagens das espécies mencionadas foram re- 20 seqüenciadas com utilização de "primers" SP3D-10fa e dSP3D- rl. Do grupo de 53 parentes selvagens, 11 representaram S. cheesmaniae, 2 representaram S. chilense, 7 representaram

S. habrochaites, 10 representaram S. neorickii, 1 representou S. pennellii, 7 representaram S. peruvianum, 11 representaram S. chmielewskii, 1 representou S. lycopersicum, e 3 representaram S. pimpinellifolium.

As comparações de seqüências revelaram um motivo CA 62-61 nucleotídeos a montante do início genético em todos os parentes spi=2 ao passo que as espécies com índice spi=3 apresentaram um motivo de nucleotídeo CT ou TA, vide a Fig. 4. Adicionalmente, os polimorfismos a montante e a jusante 5 do motivo CA não se encontravam interligados ao índice simpodial (vide a Fig. 5).

EXEMPLO 3

Fenótipos de Híbridos Fl com e sem SP3Dpen

A linhagem de introgressão 49015-2 que contém o gene SP3Dpen de la716 de S. pennellii foi cruzada com as linhagens OT1464 E OT1690 de S. lycopersicum da empresa Enza Zaden. Os híbridos Fl resultantes foram retro-cruzados com OT1464 ou auto-cruzados ("selfed") no caso do cruzamento com OT1690. As plantas com SP3Dpen foram selecionadas com marcador dCAPS dSP3D-lfr; "primers" dSP3D- f/dSP3D-r, condições de PCR de 40 ciclos a 92° C 30", 55° C 60"e 72° C 60", digeridas por HpyCH4V, separadas em 3% de ms-8 agarose (Hispanagar). Além do marcador dSP3D-lfr, foi utilizado cruzamento reverso assistido por marcação para identificação do parente mais recorrente, conforme é conhecido daqueles que são versados na técnica, resultando na planta NT05-96cll para o ambiente de OT1464 e nas plantas NT05-108hl0 e NT05-108el2 para o ambiente de OT1690. Estas plantas individuais foram auto-cruzadas ("selfed") 2 vezes, foram novamente selecionadas com marcador dSP3D e por cruzamento reverso assistido por marcação, resultando em plantas 111B6 para o ambiente de ΟΤ1464 e plantas 117F1 e 117G1 para o ambiente de OT1690. Subseqüentemente, foram obtidos híbridos Fl mediante cruzamento 111B6 x IllFl produzindo como resultado 15751 (SP3Dpen homozigótico) , 111B6 x 117G1 produzindo como 5 resultado 15753 (heterozigótico) e OT1690 x OT1464 produzindo como resultado 15769 como controle de SP3Desc homozigótico, vide a Fig. 6.

Quatro plantas por híbrido foram cultivadas na estufa/casa de vegetação durante o período de junho de 2006 10 até o final de outubro de 2006 com práticas de cultivo normais e foram avaliadas relativamente a índice simpodial mediante contagem do número de folhas entre sucessivas inflorescências, número de folhas até a primeira inflorescência, peso médio dos frutos, rendimento, número 15 de frutos e inflorescências. O índice simpodial médio foi de 2,4 para SP3Dpen, 2,5 para plantas heterozigóticas e 2,7 para SP3Desc (Fig. 7). Conforme previsto, o número de folhas até a primeira inflorescência foi alterado e decresceu de 7,5 para Sp3Desc para 5,8 para Sp3Dpen e 20 híbridos heterozigóticos. 0 peso médio dos frutos foi similar entre híbridos em uma faixa de 57 até 59 g/fruto. Conforme previsto, o número de inflorescências aumentou, 9

«

para SP3Desc para 14 para SP3Dpen. O número de frutos por inf lorescência aumentou de 6,7 para SP3Desc para 7,6 para 25 SP3Dpen. Isto adiciona aproximadamente 0,7 kg ao rendimento total de híbridos Fl SP3Dpen homozigóticos durante este período de crescimento. Estes dados revelam que o aperfeiçoamento total de rendimento observado após 5 meses nas plantas compreendendo a seqüência promotora de acordo com a invenção em comparação com plantas que não compreendiam a referida 5 seqüência promotora foi devido a um aumento do número de inflorescências, e no caso de SP3Dpen homozigótico, foi igualmente devido a um acréscimo do número de frutos por inflorescência. Como resultado, o rendimento total de 4 plantas por híbrido foi aperfeiçoado de 3,5 kg para 5,0 kg 10 e 6,0 kg para SP3Desc, SP3Desc/pen e SP3Dpen respectivamente.

O aperfeiçoamento de rendimento causado por SP3Dpen é devido à seqüência promotora de SP3Dpen, compreendendo o motivo CA 62-61 nucleotídeos a montante do início do gene.

Claims (28)

1. SEQÜÊNCIA PROMOTORA DE SP3D, capaz de dirigir a transcrição de um gene SP3D de jusante que se encontra operacionalmente interligado à referida seqüência promotora, caracterizada por a seqüência promotora ser derivada de uma espécie da família Solanaceae possuindo um índice simpodial de 2, para redução do índice simpodial em plantas possuindo um índice simpodial de 3 ou mais.

2. Seqüência promotora, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por a referida seqüência promotora compreender um motivo CA em uma posição localizada 62-61 nucleotídeos a montante do códon de início do referido gene SP3D.

3. Seqüência promotora, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 e 2, caracterizada por a seqüência promotora ser derivada de uma espécie da família Solanaceae, selecionada do grupo que consiste em Solanum pennellii, Solanum neorickii, Solanum chmielewskii, Solanum chilense, Solanum peruvianum.

4. Seqüência promotora, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizada por a referida seqüência promotora compreender uma seqüência de nucleotídeos possuindo uma identidade de pelo menos 7 5% com os nucleotídeos 1 até 624 da SEQ ID NO: 1 (Fig. 2).

5. Seqüência promotora, de acordo com a reivindicação 4, caracterizada por compreender uma seqüência de nucleotídeos possuindo uma identidade de pelo menos 85% com os nucleotídeos 1 até 624 da SEQ ID NO: 1.

6. Seqüência promotora, de acordo com a reivindicação 5, caracterizada por compreender uma seqüência de nucleotídeos possuindo uma identidade de pelo menos 90% com os nucleotídeos 1 até 624 da SEQ ID NO: 1.

7. Seqüência promotora, de acordo com a reivindicação 6, caracterizada por compreender uma seqüência de nucleotídeos possuindo uma identidade de pelo menos 95% com os nucleotídeos 1 até 624 da SEQ ID NO: 1.

8. Seqüência promotora, de acordo com a reivindicação 7, caracterizada por compreender uma seqüência de nucleotídeos possuindo uma identidade de pelo menos 99% com os nucleotídeos 1 até 624 da SEQ ID NO: 1.

9. Seqüência promotora, de acordo com qualquer uma das reivindicações Ia 8, caracterizada por a seqüência promotora ser derivada de S. pennellii e consistir na seqüência de nucleotídeos dos nucleotídeos 1 até 624 da SEQ ID NO: 1.

10. CONSTRUCTO GENÉTICO, caracterizado por compreender uma seqüência promotora de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-9 e uma seqüência de cDNA derivada de um gene SP3D de planta.

11. Constructo genético, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado por a seqüência de cDNA compreender uma seqüência de nucleotídeos possuindo uma identidade de pelo menos 7 5% com a seqüência de cDNA de SP3Dpen conforme ilustrada na Figura 3.

12. Constructo genético, de acordo cora a reivindicação 11, caracterizado por a seqüência de cDNA compreender uma seqüência de nucleotídeos possuindo uma identidade de pelo menos 85% com a seqüência de cDNA de SP3Dpen conforme ilustrada na Figura 3.

13. Constructo genético, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado por a seqüência de cDNA compreender uma seqüência de nucleotídeos possuindo uma identidade de pelo menos 90% com a seqüência de cDNA de SP3Dpen conforme ilustrada na Figura 3.

14. Constructo genético, de acordo com a reivindicação 13, caracterizado por a seqüência de cDNA compreender uma seqüência de nucleotídeos possuindo uma identidade de pelo menos 95% com a seqüência de cDNA de SP3Dpen conforme ilustrada na Figura 3.

15. Constructo genético, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado por a seqüência de cDNA compreender uma seqüência de nucleotídeos possuindo uma identidade de pelo menos 99% com a seqüência de cDNA de SP3Dpen conforme ilustrada na Figura 3.

16. Constructo genético, de acordo com qualquer uma das reivindicações 10 a 15, caracterizado por a seqüência de cDNA consistir na seqüência de nucleotídeos conforme ilustrada na Figura 3.

17. MÉTODO PARA PROVISÃO DE PLANTAS DA FAMÍLIA SOLANACEAE POSSUINDO UM ÍNDICE SIMPODIAL REDUZIDO, o método sendo caracterizado por compreender a introdução, no genoma das referidas plantas, de uma seqüência promotora de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-8 em interligação operacional com um gene SP3D de jusante, ou introdução nas referidas plantas de um constructo genético de acordo com qualquer uma das reivindicações 9 até 15, de tal forma que o índice simpodial da planta com a seqüência promotora ou o constructo genético é reduzido em comparação com o da planta na qual a referida seqüência promotora ou constructo genético se encontra ausente.

18. Método, de acordo com a reivindicação 17, caracterizado por o índice simpodial ser reduzido para um índice simpodial de 2.

19. MÉTODO PARA AUMENTO DE RENDIMENTO DE SAFRA EM UMA PLANTA DA FAMÍLIA SOLANACEAE, possuindo um índice simpodial de 3 ou mais, caracterizado por compreender a introdução, no genoma da referida planta, de uma seqüência promotora conforme descrita acima, em interligação operacional com um gene SP3D de jusante, ou introdução na referida planta de um constructo genético conforme reivindicado em qualquer uma das reivindicações 9 a 15.

20. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 17 a 19, caracterizado por a planta ser selecionada do grupo que consiste em S. habrochaites, S. cheesmaniae, S. pimpinellifolium e S. lycopersicum, e/ou plantas derivadas dessas espécies.

21. Método, de acordo com a reivindicação 20, caracterizado por a planta consistir em S. lycopersicum.

22. PLANTA, caracterizada por ser passível de obtenção mediante utilização do método de acordo com qualquer uma das reivindicações 17-21.

23. SEMENTES E/OU OUTRAS PARTES DE PLANTAS, caracterizadas por serem derivadas de uma planta de acordo com a reivindicação 22.

24. PLANTA DA FAMÍLIA SOLANACEAE, caracterizada por compreender em seu genoma uma seqüência promotora de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-9 em interligação operacional com um gene SP3D, em que a referida planta possui um índice simpodial reduzido, em comparação com a mesma planta quando esta última não possui a referida seqüência promotora.

25. Planta, de acordo com a reivindicação 24, caracterizada por a planta ser selecionada do grupo que consiste nas espécies S. habrochaites, S. cheesmaniae, S. pimpinellifolium e S. lycopersicum, e/ou uma planta derivada dessas espécies.

26. Planta, de acordo com a reivindicação 25, caracterizada por a planta consistir em S. lycopersicum.

27. Planta, de acordo com qualquer uma das reivindicações 24 a 26, caracterizada por apresentar um índice simpodial de 2.

28. SEMENTES E/OU OUTRAS PARTES DE PLANTAS, caracterizadas por serem derivadas de uma planta de acordo com qualquer uma das reivindicações 24 a 27.