MX2013005485A

MX2013005485A - Plantas tolerantes a la marchitez.

Info

Publication number: MX2013005485A
Application number: MX2013005485A
Authority: MX
Inventors: Andrew Kenneth Borrell; David Robert Jordan; John Mullet; Patricia Klein
Original assignee: Grains Res & Dev Corp
Priority date: 2010-11-15
Filing date: 2011-11-15
Publication date: 2013-09-26
Also published as: US20130333066A1; EP2640182A4; EA201390724A1; ZA201303689B; CA2817758A1; EP3434099A1; CA2817758C; WO2012065219A1; ES2692857T3; HUE040165T2; MX352184B; CN108624618A; EP2640182B1; TR201815884T4; CN103429072A; AU2011331908B2; EP2640182A1; UA113503C2; BR112013012025A2; EA034044B1

Abstract

La presente especificación enseña la generación de plantas tolerantes a la marchitez. La presente descripción permite la manipulación de una característica fenotípica denominada aquí como "siempre verde" para generar plantas tolerantes a la marchitez a través de métodos recombinantes, mutagénicos y/o de sembrado y selección. También se enseñan sistemas para practicar el manejo de plantas para incrementar la producción de cultivo y eficiencia de cosecha en ambientes con limitación de agua.

Description

PLANTAS TOLERANTES A LA MARCHITEZ Datos de Presentación La presente solicitud está asociada con la Solicitud Provisional Norteamericana No. 61/413,902, presentada el 15 de noviembre de 2010, la cual está incorporada en su totalidad a la presente invención como referencia.

Campo de la Invención La presente especificación enseña la generación de plantas tolerantes a la marchitez. La presente descripción permite la manipulación de una característica fenotípica aquí referida como "siempre verde" para generar plantas tolerantes a la marchitez a través de métodos recombinantes, mutagénicos y/o de sembrado y selección. También se enseñan sistemas para practicar el manejo de plantas para incrementar la producción de cultivo y la eficiencia de cosecha en ambientes con limitación de agua.

Antecedentes de la Invención Los detalles bibliográficos de las publicaciones referidas por el autor en la presente especificación, son presentados en forma alfabética al final de la descripción.

La referencia a cualquier técnica anterior en la presente especificación, no deberá ser tomada como un reconocimiento o cualquier forma de sugerencia de que dicha técnica anterior, forme parte del reconocimiento común general en cualquier país.

Una población humana cada vez mayor necesita incrementos en la productividad de cultivos. Esto ha sido una meta importante para los criadores de plantas y genetistas de plantas. Un método para mejorar la productividad de cultivo implica la selección de rasgos de la planta que facilita un mayor rendimiento y estabilidad del grano (Springer, Nature Genetics 42: 475-476, 2010). Este método ha sido referido como la "Revolución Verde". Otros métodos incluyen el desarrollo de arquitecturas ideales de la planta que han conducido, por ejemplo, a la identificación de un locus de rasgo cuantitativo (QTL) que codifica una proteína de enlace promotora escamosa-tipo 14 (OsSPL14) en arroz, y que facilita la producción de arroz mejorada (Jiao et al., Nature Genetics 42:541-544, 2010; Miura et al., Nature Genetics 42:545-549, 2010).

La marchitez es la restricción más importante en la producción de cereales a nivel mundial. El sorgo es un almacén de mecanismos de resistencia a la marchitez, que incluye fotosíntesis C4, raíces profundas y cera gruesa en la hoja, que permiten el crecimiento en ambientes calientes y secos. La tolerancia a la marchitez hace al sorgo especialmente importante en regiones secas, tales como África del SubSahara, India del occidente central, Australia del noreste y las planicies del sur de los Estados Unidos de América. Con una presión cada vez más mayor en la disponibilidad de recursos de agua escasos, se vuelve cada vez más importante la identificación de rasgos asociados con la producción de granos bajo condiciones de marchitez.

El mecanismo de adaptación de marchitez identificado en sorgo, que da como resultado la retención de hojas verdes durante períodos más largos durante la formación del grano, es conocido como "siempre verde". El mecanismo "siempre verde" ha estado asociado con una alta producción de granos bajo una marchitez posterior a la floración en sorgo (Borrell et al., Crop Sci. 40:1037-1048, 2000b; Kassahun et al., Euphytica 72:351-362, 2010), trigo (Triticum aestivum L.) [Spano et al, J. Exp. Bot. 54:1415-1420, 2003; Christopher et al, Aust. J. Agrie. Res. 59:354-364, 2008], arroz (Oryza sativa L.) [ ashiwagi et al, Plant Physiology y Biochemistry 44:152-157, 2006] y maíz (Zea mays L.) [Zheng et al, Plant Breed 725:54-62, 2009]. Además, se puede afectar indirectamente la producción del grano bajo marchitez, mejorando la resistencia a la putrefacción corchosa (Macrophomina phaseolina [Tassi] Goid.) (Tenkouano et al, Theor. Appl. Genet. 85:644-648, 1993; Garud et al, Int. Sorghum y Millets Newsl. 43:63-65, 2002). Esto reduce la fijación (Reddy et al, Euphytica 759:191-198, 2008), permitiendo a los criadores de plantas explotar la asociación positiva entre la altura de la planta y la producción del grano (Jordán et al, Theor. Appl. Genet. 70(5:559-567, 2003). El mecanismo "siempre verde" ha sido un criterio de selección importante para los programas de cultivo de sorgo que se dirigen a la adaptación a la marchitez tanto en los Estados Unidos de América (Rosenow et al, Agrie. Water Manag. 7:207-222, 1983) como en Australia (Henzell et al, Australia Int. Sorghum y Millets News. 38: 1-9, 1997).

Se está montando un cuerpo de evidencia fisiológica considerable, como soporte de este mecanismo (Borrell et al, Crop Sci. 40:1026-1037, 2000a; Borrell y Hammer, Crop Sci. 40:1295-1307, 2000; Harris et al, J. Exp. Bot. 58:327-338, 2007; Christopher et al, 2008 supra; Van Oosterom et al, Field Crops Res. 175:19-28, 2010a y Van Oosterom et al, Field Crops Res. 115:29-38, 2010b). Aunque este mecanismo de resistencia a la marchitez ha sido utilizado por los creadores de sorgo en los Estados Unidos de América y Australia durante 25 años, y se han entendido de mejor manera las amplias bases fisiológicas del mecanismo, hasta ahora permanecen desconocidos los mecanismos de origen y el lugar genético implicados.

Bajo condiciones de limitación de agua, la producción de grano es una función de transpiración (T), eficiencia de transpiración (TE), e índice de cosecha (Hl) [Passioura, J. Aust. Inst. Agrie. Sci. 43:117-120, 1977]. Dentro de este marco, la producción de grano está ligada al afloramiento posterior T (Turner, J. Exp. Bot. 55:2413-2425, 2004; Manschadi et al, Fund Plant. Biol 53:823-837, 2006), debido a que Hl incrementa con la fracción del cultivo total T utilizado después de la floración (Passioura, 1977 supra; Sadrás y Connor, Field Crops Res. 26:227-239, 1991; Hammer, Agrie. Sci. J 9:16-22, 2006). La floración posterior T incrementada, está asociada con una tensión de marchitez reducida alrededor de la floración, lo cual puede afectar positivamente el rango de crecimiento del cultivo en la floración de cereales, y por lo tanto el número de granos (Andrade et al, Crop Sci. 42:1173-1179, 2002; Van Oosterom y Hammer, Field Crops Res. 108:259-268, 2008). Si la cantidad total de agua disponible está limitada, se puede incrementar la floración posterior T restringiendo la floración previa T. Esto se puede lograr restringiendo el tamaño de la cubierta, ya sea genéticamente o a través del manejo del cultivo. Sin embargo, una cubierta menor únicamente reducirá el T total si su TE no está comprometida. Se han reportado para el sorgo diferencias genotípicas significativas en TE (Hammer et al, Aust. J. Agrie. Res. 48:649-655, 1997; Henderson et al, Aust. J. Plant Physiol. 25:111-123, 1998; Mortlock y Hammer, J. Crop Prod. 2:265-286, 1999; Xin et al, Field Crops Res. 111:74-80, 2009). Como alternativa, se puede incrementar el agua posterior a la floración incrementando la cantidad de agua total a la que tiene acceso el cultivo, ya sea a través de un enraizamiento más profundo, o un límite inferior reducido de extracción de agua (Manschadi et al, 2006 supra).

El mecanismo 'siempre verde' afecta una cantidad de los procesos anteriores en sorgo. Primero, el mecanismo 'siempre verde' reduce el tiempo de agua durante el período previo a la floración, restringiendo el tamaño de la cubierta (mediante vastagos reducidos y hojas más pequeñas).

Segundo, el mecanismo 'siempre verde' mejora la accesibilidad del agua, incrementando la proporción de raíz:brote. Existe cierta evidencia experimental para una mejor extracción de agua en líneas siempre verdes, aunque se requiere más investigación. Estas respuestas de la raíz, también pueden ser explicadas mediante el transporte incrementado de auxina (Wang et al, Molecular Plant 2(4):823-831, 2009). Tercero, el mecanismo 'siempre verde' incrementa el verdor de las hojas en la floración, incrementando de manera efectiva la capacidad fotosintética , y por consiguiente, TE (siempre que la fotosíntesis incremente en forma proporcional que la conductancia). El incremento en el verdor de la hoja, es un efecto indirecto de la masa reducida de la hoja, por ejemplo, nitrógeno que está concentrado en la hoja.

La producción de más alimentos con menos agua, es uno de los principales desafíos que actualmente enfrenta la humanidad. Existe una necesidad real y urgente en países tanto en desarrollo como desarrollados, para identificar los genes y redes genéticas que controlan la adaptación a la marchitez en plantas de cultivo. Esto permite una adaptación a la marchitez incrementada en un amplio rango de especies de cultivo crecidas en ambientes con limitación de agua a nivel mundial.

Breve Descripción de la Invención La presente descripción enseña loci de rasgos cuantitativos (QTLs) asociados con y/o que facilitan de otra forma el fenotipo 'siempre verde'. Los QTLs son referidos en la presente invención como "siempre verde (Stg) X" en donde X es un número de incremento a partir de 1, que representa la región en un cromosoma asociada con el fenotipo siempre verde.

Tal como aquí se enseña, los QTLs identifican regiones genéticas en sorgo, que llevan loci que codifican una a una cantidad de proteínas o agentes reguladores tales como microARNs, que facilitan el fenotipo 'siempre verde'. La modulación de expresión de uno o más de estos loci en una planta de cultivo, genera una arquitectura de cubierta que facilita un cambio en el uso de agua a través de la planta en el período posterior a la floración, o una capacidad de acceso de agua incrementada durante el crecimiento de cultivo o eficiencia de transpiración incrementada, incrementando de esta forma el índice de cosecha (Hl) y la producción del grano bajo condiciones con limitación de agua.

En una modalidad, el loci codifica una proteína PIN que está asociada con una auxina. Las proteínas PIN son transportadoras de eflujo de auxina que contienen dominios de transmembrana y se localizan principalmente en las membranas de plasma. El término "PIN" se deriva de "inflorescencia tipo alfiler".

El término "SbPINn" se utiliza para describir dicho gen en sorgo, en donde n es un número que define el componente transportador del eflujo de auxina, y n es de 1 y 11. La referencia a "SbPINn" incluye sus homólogos y ortólogos en otras plantas. Los ejemplos de loci SbPINn en sorgo, incluyen los descritos en la tabla 1A, tal como pero sin limitarse a SbPIN4 y SbPIN2 o sus equivalentes en otras plantas. La modulación de expresión de un PIN o la expresión de un PIN con una variación polimórfica particular, se enseña en la presente invención para facilitar la exhibición del fenotipo 'siempre verde'. La presente descripción enseña PINs se otras plantas, tales como arroz. El subíndice con letra que tiene un PIN, especifica su fuente (por ejemplo, Sb, sorgo; Os, arroz; etc). La ubicación de un SbPIN en sorgo es determinada por el número de ID del gen (Ver la tabla 1A). Como ejemplos, SbPIN4 corresponde a OsPIN5 y SbPIN2 corresponde a OsPIN3a.

SbPIN4 y SbPIN2 son ejemplos de SbPINs aquí enseñados, como responsables del rasgo 'siempre verde' en sorgo, asociado con Stg1, y Stg2, respectivamente, que da como resultado un rango de fenotipos que confieren adaptación a la marchitez mediante el uso disminuido de agua hasta la floración (debido a los vástagos reducidos y hojas más pequeñas), capacidad de acceso al agua incrementada (debido a la proporción incrementada de raíz:brote), eficiencia de transpiración incrementada bajo un déficit de agua moderado (debido a una mayor concentración de nitrógeno en la hoja), biomasa incrementada por área de hoja bajo el déficit de agua terminal (debido a la transpiración incrementada por área de hoja) y producción de grano, tamaño del grano y resistencia a la fijación incrementadas. En la tabla 1A se describen otros ejemplos, e incluyen sus equivalentes en otras plantas.

La presente descripción enseña un método para generar una planta genéticamente modificada que utiliza agua de manera más eficiente que una planta no modificada genéticamente de la misma especie, en donde el método comprende modular el nivel de expresión de un locus de inflorescencia existente o tipo alfiler introducido (PIN) en todo el tejido o tejido seleccionado en la planta para facilitar un fenotipo 'siempre verde', en donde el fenotipo incluye un cambio en el uso de agua en el período posterior a la floración, o una capacidad de agua incrementada durante el crecimiento del cultivo o eficiencia de transpiración incrementada que da como resultado un índice de cosecha y producción de grano incrementado bajo condiciones con limitación de agua.

En la presente invención se habilita un método para generar una planta genéticamente modificada que utiliza agua de manera más eficiente que una planta no modificada genéticamente de la misma especie, en donde el método comprende introducir en una planta o progenitor de la planta, un agente genético que codifica una proteína PIN seleccionada de SbPINI a 11, o un equivalente de la misma de otra planta u homólogo ortólogo funcional del mismo; o que modula la expresión de una proteína PIN nativa; en donde el nivel y ubicación de la expresión PIN facilita un fenotipo 'siempre verde', en donde el fenotipo incluye, entre otras cosas, una arquitectura de cubierta que facilita un cambio en el uso de agua en el período posterior a la floración, o una capacidad de acceso de agua incrementada durante el crecimiento del cultivo, dando como resultado un índice de cosecha y producción de grano incrementado bajo condiciones con limitación de agua.

La presente descripción enseña además un método para generar una planta genéticamente modificada que utiliza agua de manera más eficiente que una planta no modificada genéticamente de la misma especie, en donde el método comprende introducir en una planta o progenitor de la planta, un agente genético que codifica una proteína PIN de sorgo seleccionada de SbPIN4 y SbPIN2 o un equivalente en otra planta, o que modula la expresión de una PIN nativa. La referencia a la modulación, incluye incrementar o disminuir el nivel de expresión. Además, se puede seleccionar un PIN que tiene un perfil de expresión deseado en todo el tejido o en tejidos seleccionados en una planta.

En la presente invención se habilita un método para generar una planta genéticamente modificada que utiliza agua de manera más eficiente que una planta no modificada genéticamente de la misma especie, en donde el método comprende introducir en la planta o progenitor de la planta, un agente genético que codifica un producto que está asociado con, o facilita el fenotipo 'siempre verde', en donde el fenotipo incluye un cambio en el uso de agua en el período posterior a la floración, o una capacidad de acceso de agua mejorada durante el crecimiento del cultivo o eficiencia de transpiración incrementada que da como resultado un índice de cosecha y producción de grano incrementados bajo condiciones con limitación de agua, y en donde el producto es seleccionado de la lista que consiste en SbPINI a 11 o un equivalente de las mismas en otra planta, o en donde el agente modula la expresión de una PIN nativa en la planta.

También se enseña en la presente invención un método para generar una planta genéticamente modificada que utiliza agua de manera más eficiente que una planta no modificada genéticamente de la misma especie, en donde el método comprende introducir en una planta o progenitor de la planta, un agente genético que codifica una proteína seleccionada de la lista que consiste en SbPIN4 y SbPIN2 o un equivalente de la misma en otra planta, o en donde el agente modula la expresión de una PIN nativa en la planta. El término "introducir" incluye mediante intervención recombinante, así como mediante protocolo de mutagénesis o crianza, seguido de selección.

La presente descripción instruye con respecto a un método para generar una planta genéticamente modificada, que utiliza agua de manera más eficiente que una planta no modificada genéticamente de la misma especie, en donde el método comprende introducir en una planta y/o progenitor de la planta, un agente genético que codifica dos o más proteínas PIN, o que modula una expresión de dos o más proteínas PIN nativas en una planta. Los ejemplos de PINs en sorgo incluyen SbPINI a 11, tal como SbPIN4 y SbPIN2 o un equivalente de las mismas de otra planta. Por ejemplo, SbPIN4 corresponde a OsPIN5 y SbPIN2 corresponde a OsPIN3a. SbPINs y OsPINS se definen en la tabla 1 A.

Las plantas genéticamente modificadas y su progenie, que exhiben el mecanismo 'siempre verde', también están habilitadas en la presente invención, así como las semillas, frutos y flores y otro material reproductor o de propagación.

El material genético que codifica una proteína PIN u homólogo u ortólogo funcional de la misma, que está asociado con, o que facilita un fenotipo 'siempre verde', en donde el fenotipo incluye una arquitectura de cubierta que facilita un cambio en el uso de agua en el período posterior a la floración, o una capacidad de acceso de agua incrementada durante el crecimiento del cultivo o eficiencia de transpiración incrementada, da como resultado un índice de cosecha y producción de grano incrementados bajo condiciones con limitación de agua, y un agente que modula la expresión del PIN; ambos habilitados en la presente descripción.

En un ejemplo, el material genético se selecciona de (i) un agente que codifica SbPIN4; y (ii) un agente que modula los niveles de expresión de SbPIN4 o su equivalente en otra planta. En otro ejemplo, el material genético seleccionado de (i) un agente que codifica SbPIN2; y (ii) un agente que modula la expresión de SbPIN2 o su equivalente en otra planta.

El material genético incluye un agente que codifica una proteína SbPIN4 o SbPIN2 o un homólogo u ortólogo funcional de la misma o un equivalente de la misma en otra planta que está asociada con, o que facilita un fenotipo 'siempre verde', en donde el fenotipo incluye una arquitectura de cubierta que facilita un cambio en el uso de agua en el período posterior a la floración o una capacidad de acceso de agua incrementada durante el crecimiento del cultivo o eficiencia de transpiración incrementada que da como resultado un índice de cosecha o producción de grano incrementados bajo condiciones con limitación de agua; y un agente que modula la expresión de SbPIN4 o SbPIN2, o un equivalente del mismo en otra planta.

En la presente invención se enseña un sistema de manejo de plantas para reducir la dependencia de agua de la cosecha, o para mejorar de otra forma la eficiencia del uso del agua y para aumentar la producción del grano o del producto. El sistema del manejo de la planta incluye la generación de un cultivo adaptado a la marchitez, que incluye plantas de cereal, utilizando la selección y modulación de expresión de un locus PIN o su equivalente funcional, tal como se define en la presente invención solo o en combinación con la introducción de otros rasgos útiles, tal como el tamaño del grano, tamaño de la raíz, tolerancia a la sal, resistencia a herbicidas, resistencia a pestes y similares. Como alternativa o en forma adicional, el sistema del manejo de plantas comprende la generación de plantas adaptadas a la marchitez y procedimientos agrícolas tales como irrigación, requerimiento de nutrientes, densidad y geometría de cultivo, control de maleza, control de insectos, aireado de tierra, vástagos reducidos, lechos elevados y similares. Los ejemplos de un locus PIN incluyen SbPINl a 11 (tabla 1A), tal como SbPIN4 y SbPIN2 y un equivalente de las mismas, en otra planta.

En la presente invención también se enseña un modelo de negocios para una producción de cultivos con rendimientos económicos, en donde el modelo comprende generar plantas de cultivo que tienen una arquitectura de cubierta que facilita un cambio en el uso de agua a través de la planta en el período posterior a la floración, o una capacidad de acceso de agua incrementada durante el crecimiento del cultivo, o eficiencia de transpiración incrementada, para incrementar de esta forma Hl, y la producción de grano bajo condiciones con limitación de agua, para obtener semillas de la planta de cultivo generada, y distribuir las semillas a los productores de granos para incrementar la producción y las ganancias.

En la presente especificación se utilizan las abreviaturas que se encuentran a continuación: Cl, intervalo de contabilidad cwu, uso de agua de cultivo DW, peso seco GLA, área de hoja verde HD, alta densidad Hl, índice de cosecha HT, vástago de alto nivel HW, agua de alto nivel HWHD, agua de alto nivel, alta densidad (tensión de agua intermedia) HWLD, agua de alto nivel, baja densidad (menos agua en tensión) LA, área de la hoja LD, baja densidad LT, vástagos de bajo nivel LW, bajo nivel de agua LWHD, bajo nivel de agua, alta densidad (la mayor parte del agua tensionada) LWLD, bajo nivel de agua, baja densidad (tensión de agua intermedia) NIL, línea casi isogénica OsPIN, PIN de arroz PAB, biomasa posterior a la floración PASM, masa de tallo posterior a la floración PIN, inflorescencia tipo alfiler PPBR, proporción de biomasa pre: post-floración QTL, locus de rasgo cuantitativo ROS, resguardo contra la lluvia RWC, contenido de agua relativo SbPIN, PIN de sorgo SLW, peso de hoja específico SML, aprendizaje en máquina estadística Stg, 'siempre verde' T, Transpiración T2, vastago en la axila de la hoja 2 T3, vástago en la axila de la hoja 3 T4, vastago en la axila de la hoja 4 T5, vástago en la axila de la hoja 5 T6, vástago en la axila de la hoja 6 TE, eficiencia de transpiración TS tensión terminal VPD, déficit de presión de vapor WW, bien mojada Tabla 1A proporciona información con respecto a PIN de sorgo y arroz.

OI o oí OI Tabla 1A Detalles QTL Stg de Sorgo en o en en Breve Descripción de las Figuras Algunas de las figuras contienen representaciones o entidades a color. Las fotografías a color están disponibles en Patente mediante solicitud, o en una Oficina de Patentes adecuada. Se puede requerir un pago de honorarios si se obtiene de una Oficina de Patentes.

La figura 1, es una representación gráfica que muestra la relación entre raicillas por m2 y área de hojas verdes en la floración, en un rango de líneas casi isogénicas que contienen diversas introgresiones de Stg.

La figura 2, es una representación gráfica que muestra la relación entre raicillas por m2 y área de hoja verde en floración, en un rango de introgresiones Stg en un trasfondo RTx7000 crecido bajo dos densidades de cultivo (LD = 10 plantas/m2; HD = 20 plantas/m2).

La figura 3, es una representación gráfica que muestra el histograma de valores anticipados de raicillas por planta en la población de mapeo fino Stg1 promediada en tres estaciones.

La figura 4, es una representación tabulada que muestra un histograma de raicillas por planta en 44 DAE para cinco genotipos crecidos bajo dos regímenes de agua. Los genotipos comprenden RTx7000 (origen recurrente), 6078-1 (origen donador), y tres selecciones de la población de mapeo fino Stg1. HWLD = alto contenido de agua, baja densidad (10 plantas/m2). LWLD = bajo contenido de agua, baja densidad (10 plantas/m2).

La figura 5, es una representación gráfica que muestra la variación fenotípica en la población de mapeo fino Stg1 para la presencia de T2.

La figura 6, es una representación gráfica que muestra la variación fenotípica en la población de mapeo fino Stg1 para la presencia de T3.

La figura 7, es una representación que muestra un histograma de la presencia de T2 para ocho recombinantes de vástagos de alto nivel y ocho recombinantes de vástagos de bajo nivel de la población de mapeo fino Stg1.

La figura 8, es una representación que muestra un histograma del número de vástagos totales por planta para cinco recombinantes de vástagos de alto nivel y tres recombinantes de vástagos de bajo nivel de la población de mapeo fino Stg1. Se eligió un valor de 2.5 como el corte arbitrario entre los vástagos de alto y bajo nivel.

Las figuras 9A a 9D son representaciones gráficas que muestran la distribución de tamaño de la hoja principal de RTX7000 y 6078-1 (Stg7 NIL), VPD.

La figura 10, es una representación gráfica que muestra la distribución de la hoja principal de RTx7000, 6078-1 (Stg1 NIL) y tres recombinantes de la población de mapeo fino Stg1 crecida bajo condiciones de limitación de agua y alta densidad en el campo (HD = 20 plantas/m2).

La figura 11, es una representación gráfica que muestra la distribución de tamaño de la hoja (L1-6) para los progenitores de la población de mapeo fino Stg 1 mostrada en un iglú.

La figura 12, es una representación gráfica que muestra la distribución de longitud de la hoja (L1-6) de los progenitores de la población de mapeo fino Stg1 crecido en un iglú.

La figura 13, es una representación gráfica que muestra la distribución de ancho de la hoja (L1-6) de los progenitores de la población de mapeo fino Stg1 crecido en un iglú.

La figura 14, es una representación gráfica que muestra la distribución de tamaño de la hoja (11-11) de los progenitores de la población de mapeo fino Stg1 crecida en un iglú.

La figura 15, es una representación gráfica que muestra la distribución de longitud de la hoja (L1-10) de los orígenes de la población de mapeo fino Stg1 crecida en un iglú.

La figura 16, es una representación que muestra un histograma de variación fenotípica de la longitud L10 en un subconjunto de la población de mapeo fino Stg1 crecida en un iglú.

La figura 17, es una representación en diagrama que muestra la disponibilidad incrementada de agua en la floración que se logra mediante el uso de agua reducida debido a dos mecanismos (vástagos reducidos y hojas más pequeñas) en plantas que contienen la región Stg1.

La figura 18, es una representación que muestra que el tamaño de cubierta se modula tanto mediante respuestas constitutivas como de adaptación controladas por un gen(s) en la región Stg 1.

La figura 19, es una representación gráfica que muestra las distribuciones de tamaño de la hoja principal de RTx7000, 6078-1 (Stg1 NIL) y tres recombina ntes de la población de mapeo fino Stg1 crecida bajo condiciones con limitación de agua y alta densidad en el campo (HD = 20 plantas/m2).

La figura 20, es una representación gráfica que muestra la relación entre la relación entre el área de la hoja 12 y el área total de la hoja verde en la floración para los dos progenitores (6078-1 y RTx7000), y tres recombinantes de la población de mapeo fino Stg1.

La figura 21, es una representación gráfica que muestra la relación entre el área total de la hoja verde (cm2/m2) y el uso de agua para cultivo (mm) en la floración para los dos progenitores (6078-1 y RTx7000) y tres recombinantes de la población de mapeo fino Stg1.

La figura 22, es una representación gráfica que muestra la relación entre el área de la hoja verde y el uso de agua (T) en cuatro QTL Stg, y el progenitor recurrente (RTx7000) en estudios de lisimetría bajo dos niveles de VPD.

La figura 23, es una representación gráfica que muestra un histograma de variación fenotípica para la "proporción de raíz:brote" L6 en la población de mapeo fino Stg1 crecida en un iglú.

La figura 24, es una representación gráfica que muestra el patrón temporal de uso de agua de cultivo acumulativo para RTx7000 y Stg1 crecidos bajo condiciones de agua de bajo nivel y baja densidad (20 plantas/m2). La línea vertical indica la floración .

La figura 25, es una representación gráfica que muestra la relación entre la longitud (mm) ya el verdor (SPAD) de la hoja 10 en la población de mapeo fino Stg1 crecida en un iglú.

La figura 26, es una representación gráfica que muestra la relación entre el verdor de la hoja (SPAD) y la fotosíntesis de la hoja en un subconjunto de líneas de la población de mapeo fino Stg1, incluyendo los progenitores.

La figura 27, es una representación gráfica que muestra la relación entre el verdor de la hoja (SPAD) y WUE (Licor) en un subconjunto de líneas de la población de mapeo fino Stg1, incluyendo los progenitores.

La figura 28, es una representación gráfica que muestra la relación entre el verdor de la hoja (SPAD) y WUE (Licor) en cuatro Nils Stg (Stg1, Stg2, Stg3 y Stg4) y el progenitor recurrente (RTx7000).

La figura 29, es una representación gráfica que muestra la relación entre la transpiración por área de la hoja y la eficiencia de transpiración en cuatro QTL Stg y el progenitor recurrente (RTx7000) en estudios de lisimetría bajo dos niveles de VPD.

La figura 30, es una representación gráfica que muestra la relación entre CWU (mm) antes y después de la floración, en un subconjunto de líneas de la población de mapeo fino Stg1, incluyendo los progenitores, crecidos bajo condiciones de alta densidad (HD) y baja densidad (HD).

Las figuras 31A y 31B, son representaciones gráficas que muestran los progenitores de uso de agua acumulativo para Stg 1 y RTx7000 crecido bajo LWHD y condiciones.

La figura 32, es una representación gráfica que muestra la relación entre CWU (mm) antes y después de la floración en cuatro QTL Stg y el progenitor recurrente (RTx7000) crecido bajo condiciones de agua de bajo nivel (LW) y baja densidad (LD).

La figura 33, es una representación gráfica que muestra la relación entre PPBR y PAB en cuatro QTL Stg y el progenitor recurrente (RTx7000) crecido bajo condiciones con limitación de agua en dos densidades de cultivo (LD = 10 plantas/m2; HD = 20 plantas/m2).

La figura 34, es una representación gráfica que muestra la relación entre GLAA y PPBR en cuatro QTL Stg y el progenitor recurrente (RTx7000) crecido bajo condiciones con limitación de agua en dos densidades de cultivo (LD = 10 plantas/m2; HD = 20 plantas/m2).

La figura 35, es una representación gráfica que muestra la relación entre GLAA y PASB en cuatro QTL Stg y el progenitor recurrente (RTx7000) crecido bajo condiciones con limitación de agua en dos densidades de cultivo (LD = 10 plantas/m2; HD = 20 plantas/m2).

La figura 36, es una representación gráfica que muestra la relación entre PPBR y PAB en cuatro QTL Stg y el progenitor recurrente (RTx7000) crecido bajo condiciones con limitación de agua en dos densidades de cultivo (LD = 10 plantas/m2; HD = 20 plantas/m2).

La figura 37, es una representación gráfica que muestra la relación entre PPBR y PASM en cuatro QTL Stg y el progenitor recurrente (RTx7000) crecido bajo condiciones con limitación de agua en dos densidades de cultivo (LD - 10 plantas/m2; HD = 20 plantas/m2).

La figura 38, es una representación gráfica que muestra la relación entre PPBR y la producción de grano en cuatro QTL Stg y el progenitor recurrente (RTx7000) crecido bajo condiciones con limitación de agua en dos densidades de cultivo (LD = 10 plantas/m2; HD = 20 plantas/m2).

La figura 39, es una representación gráfica que muestra la relación entre RWC en el llenado de grano medio (FL-2) y el rango relativo de senectud eñ cuatro QTL Stg y el progenitor recurrente (RTx7000) crecido bajo condiciones con limitación de agua en dos densidades de cultivo (LD = 10 plantas/m2; HD = 20 plantas/m2).

La figura 40, es una representación gráfica que muestra la relación entre el rango relativo de la senectud de la hoja y el área de hoja verde en la madurez en cuatro QTL Stg y el progenitor recurrente (RTx7000) crecido bajo condiciones con limitación de agua en dos densidades de cultivo (LD = 10 plantas/m2; HD = 20 plantas/m2).

La figura 41, es una representación gráfica que muestra la relación entre el contenido relativo de agua (RWC) en un llenado de grano medio (FL-2), y la masa del tallo en la madurez en cuatro QTL Stg y el progenitor recurrente (RTx7000) crecido bajo condiciones con limitación de agua y dos densidades de cultivo (LD = 10 plantas/m2; HD = 20 plantas/m2).

La figura 42, es una representación gráfica que muestra la relación entre la masa del tallo posterior a la floración (PASM) y la biomasa posterior a la floración (PAB) en cuatro QTL Stg y el progenitor recurrente (RTx7000) crecido bajo condiciones con limitación de agua en dos densidades de cultivo (LD = 10 plantas/m2; HD = 20 plantas/m2).

La figura 43, es una representación gráfica que muestra la relación entre la biomasa del tallo posterior a la floración y la producción de grano en cuatro QTL Stg y el progenitor de origen (RTx7000) crecido bajo condiciones con limitación de agua en dos densidades de cultivo (LD = 10 plantas/m2; HD = 20 plantas/m2).

La figura 44, es una representación gráfica que muestra la relación entre la masa del tallo posterior en la floración (PASM) y la biomasa posterior en la floración (PAB) en cuatro QTL Stg1 y el progenitor recurrente (RTx7000) crecidos bajo condiciones con limitación de agua y dos densidades de cultivo crecidas en un experimento en 2005 (LD = 10 plantas/m2; HD = 20 plantas/m2).

La figura 45, es una representación gráfica que muestra la relación entre la masa del tallo posterior a la floración (PASM) y la producción de grano en cuatro QTL Stg y el progenitor recurrente (RTx7000) crecido bajo condiciones con limitación de agua en dos densidades de cultivo (LD = 10 plantas/m2; HD = 20 plantas/m2) crecidas en un experimento en el año 2005.

La figura 46, es una representación gráfica que muestra la relación entre la masa del tallo posterior a la floración (PASM) y la biomasa posterior a la floración (PAB) en diversas líneas de mapeo fino Stg 1 y el progenitor recurrente (RTx7000) crecido bajo condiciones con limitación de agua en dos densidades de cultivo (LD = 10 plantas/m2; HD = 20 plantas/m2).

La figura 47, es una representación gráfica que muestra la relación entre el contenido de agua relativo (RWC) en un llenado de grano medio (FL-2) y la producción de grano en varias combinaciones de QTL Stg y el progenitor recurrente (RTx7000) crecido bajo condiciones con limitación de agua en dos densidades de cultivo (LD = 10 plantas/m2; HD = 20 plantas/m2) en un experimento crecido en el año 2004.

La figura 48, es una representación gráfica que muestra la relación entre el potencial de agua de la hoja (LWP) de FL-2 en un llenado de grano medio (barras) y producción de grano (g/m2) en el QTL Stg1 (6078-1) y el progenitor recurrente (RTx7000) crecido bajo condiciones con limitación de agua en dos densidades de cultivo (LD = 10 plantas/m2; HD - 20 plantas/m2).

La figura 49, es una representación gráfica que muestra la relación entre PPBR y CWU durante el llenado de grano en cuatro QTL Stg y el progenitor recurrente (RTx7000) crecido bajo condiciones con limitación de agua en dos densidades de cultivo (LD = 10 plantas/m2; HD = 20 plantas/m2).

La figura 50, es una representación gráfica que muestra la relación entre CWU durante el llenado de grano (mm) y la producción de grano (g/m2) en cuatro QTL Stg y el progenitor recurrente (RTx7000) crecido bajo condiciones con limitación de agua en dos densidades de cultivo (LD = 10 plantas/m2; HD = 20 plantas/m2).

La figura 51 es una representación gráfica que muestra la relación entre PPBR y la producción de grano en cuatro QTL Stg y el progenitor recurrente (RTx7000) crecido bajo condiciones con limitación de agua en dos densidades de cultivo (LD = 10 plantas/m2; HD = 20 plantas/m2).

La figura 52, es una representación gráfica que muestra la relación entre CWU durante el llenado de grano (mm) y el tamaño de grano (mg) en cuatro QTL Stg y el progenitor recurrente (RTx7000) crecido bajo condiciones de limitación de agua en dos densidades de cultivo (LD = 10 plantas/m2; HD = 20. plantas/m2).

La figura 53, es una representación gráfica que muestra la relación entre PPBR y el tamaño del grano en cuatro QTL Stg y el progenitor recurrente (RTx7000) crecidos bajo condiciones con limitación de agua en dos densidades de cultivo (LD = 10 plantas/m2; HD = 20 plantas/m2).

La figura 54, es una representación gráfica que muestra la relación entre PPBR y CWU durante el llenado de grano en varias líneas de mapeo fino Stg1 y el progenitor recurrente (RTx7000) crecido bajo condiciones con limitación de agua en dos densidades de cultivo (LD = 10 plantas/m2; HD = 20 plantas/m2).

La figura 55, es una representación gráfica que muestra la relación entre CWU durante el llenado de grano (mm) y la producción de grano (g/m2) en varias líneas de mapeo fino Stg1 y el progenitor recurrente (RTx7000) crecido bajo condiciones con limitación de agua en dos densidades de cultivo (LD = 10 plantas/m2; HD = 20 plantas/m2).

Las figuras 56A a 56C, son representaciones gráficas que muestran los resultados de correr un modelo de simulación de cultivo de sorgo utilizando la variedad genética Buster con los 2 vástagos/planta (HT) usuales versus una variedad Buster únicamente con 1 vástago/plantas (LT) en un ambiente virtual bien mojado (WW) y terminalmente tensionado (TS). Para ambos ambientes virtuales, se eligieron los siguientes parámetros: densidad de plantado 5 plantas/m2 con un espaciamiento de fila de 1 m; profundidad de tierra = 1800 mm; tierra PA WC = 324 mm; N no limitante.

La figura 57A, es una representación gráfica del diferencial de expresión de SbPIN4 (candidato Stg1) bajo condiciones de riego. Bajo condiciones de riego, este gen es inhibido en puntas de raíz jóvenes NIL Tx642 y Stg1 en comparación con Tx7000.

La figura 57B, es una representación gráfica de la expresión diferencial de SbPIN4 (candidato Stg1) bajo condiciones con deficiencia de agua. Bajo condiciones con deficiencia de agua, este gen es aumentado en la mayor parte de los tejidos, aunque especialmente en hojas de expansión de NIL Tx642 y Stg1, en comparación con Tx7000.

La figura 57C, es una representación gráfica de la expresión diferencial de SbPTN2 (candidato Stg2) bajo condiciones de riego. Bajo condiciones de riego, este gen es ligeramente aumentado en los tejidos del tallo y la raíz de NIL Tx642 y Stg1 en comparación con Tx7000.

La figura 57D, es una representación gráfica de una expresión diferencial de SbPIN2 (candidato Stg2) bajo condiciones con deficiencia de agua. Bajo condiciones con deficiencia de agua, este gen es aumentado en la mayor parte de los tejidos de NIL Tx642 y Stg1 en comparación con Tx7000.

Descripción Detallada de la Invención A lo largo de la presente especificación, a menos que el contexto requiera lo contrario, la palabra "comprende", o variaciones tales como "que comprende" o "comprendiendo", será comprendida para implicar la inclusión de un elemento o entero o paso de método o grupo de elementos o entero o pasos de métodos manifestados, pero no implica la exclusión de cualquier otro elemento o entero o paso de método o grupo de elementos o enteros o pasos de métodos.

Tal como se utiliza en la presente especificación, las formas singulares "un", "uno, una", y "el, la" incluyen aspectos plurales a menos que el contexto indique claramente lo contrario. Por lo tanto, por ejemplo, la referencia a "un locus" incluye un solo locus, así como dos o más loci; con referencia a "una auxina" se incluye una sola auxina, así como dos o más auxinas; la referencia a "la descripción" incluye un solo aspecto o múltiples aspectos enseñados por la descripción. Los aspectos aquí enseñados están comprendidos por el término "invención". Todos los aspectos enseñados, descritos o reivindicados en la presente invención están permitidos dentro de la amplitud de la presente descripción.

La presente descripción enseña QTLs asociados con, y los cuales facilitan el fenotipo siempre verde en cultivos que incluyen plantas de cereal. Los QTLs son referidos en forma genérica como StgX en donde X es un número de 1 y mayor, que corresponde a un locus genético o región de loci genética en un cromosoma particular en una planta de cultivo. Una sub-región es referida como StgXm, en donde m es una designación alfabética de una región dentro de StgX. La modulación de la expresión de un StgX en todo el tejido o tejido seleccionado en una planta, se enseña en la presente invención para facilitar una red fisiológica y genética que induce o promueve un cambio de agua mediante la planta de cultivo en el período posterior a la floración o la capacidad de acceso de agua incrementada durante el crecimiento de cultivo o eficiencia de transpiración incrementada, para incrementar de esta forma el índice de cosecha (Hl) y la producción de grano bajo condiciones con limitación de agua. La "expresión" de un StgX incluye el aumento o inhibición de los niveles de expresión (por ejemplo, modulación de expresión) de un locus, así como la selección de una variante polimórfica que se expresa en un mayor o menor nivel, o que codifica un producto más o menos activo en todo el tejido o en tejido seleccionado en una planta. El locus, por si mismo puede conferir este fenotipo o un equivalente funcional del mismo, tal como un cADN que codifica la misma proteína codificada por el locus.

Los QTL's identifican loci que codifican proteínas PIN. Las proteínas PIN son transportadoras de eflujo de auxina que contienen dominios de transmembrana, y se localizan principalmente en las membranas de plasma. El término "PIN" se deriva de "inflorescencia tipo alfiler". Un alfiler para sorgo es "SbPIN". La presente descripción enseña un PIN de cualquier planta (por ejemplo, OsPIN de arroz). La ubicación genómica de una SbPIN de sorgo, se describe en la tabla 1A.

En la presente invención se habilita un método para generar una planta genéticamente modificada que utiliza agua de manera más eficiente que una planta no modificada genéticamente de la misma especie, en donde el método comprende introducir en una planta o progenitor de la planta un agente genético que codifica una proteína PIN o un homólogo u ortólogo funcional de la misma; o que modula la expresión de una proteína PIN nativa; en donde el nivel y ubicación de la expresión PIN facilitan un fenotipo 'siempre verde', en donde el fenotipo incluye, entre otras cosas, una arquitectura de cubierta que facilita un cambio en el uso de agua en el período posterior a la floración o capacidad incrementada de acceso al agua durante el crecimiento del cultivo, dando como resultado un índice de cosecha y producción de grano incrementados bajo condiciones con limitación de agua.

La presente descripción enseña además un método para generar una planta genéticamente modificada que utiliza agua de manera más eficiente que una planta no modificada genéticamente de la misma especie, en donde el método comprende introducir en una planta o progenitor de la planta, un agente genético que codifica una proteína SbPIN de sorgo seleccionada de SbPIN 1 a SbPIN 11 o un equivalente en otra planta o que modulan la expresión de una PIN nativa. Los ejemplos de PINs incluyen SbPIN4 y SbPIN2 y otras SbPINs descritas en la tabla 1A y sus equivalentes en otra planta, así como una PIN que tiene una variación polimórfica particularmente deseada, la cual, por ejemplo, permite un perfil de expresión alterado de los niveles elevados de la proteína PIN. Los ejemplos de PINs en otras plantas OsPIN5, que corresponden a SbPIN4 y OsPIN3a que corresponden a SbPIN2.

El agente genético puede ser un locus o región genómica o su equivalente funcional, tal como cADN o fragmento de ADN genómico. Como alternativa, el agente puede modular la expresión como un locus PIN nativo en una planta particular. Por el término "introducción" se entiende mediante intervención recombinante, mediante mutagénesis o sembrado después de la selección .

Sin pretender limitar la tecnología a la presente especificación, en su teoría o modo de acción, la expresión de modulación de una PIN sola o en combinación con una red genética o fisiológica, altera la arquitectura de la planta para incrementar o promover de otra forma el uso de agua eficiente. En un aspecto, la arquitectura modificada, es la arquitectura de la cubierta de la planta modificada.

El término "progenie" incluye una progenie inmediata, así como relativos distantes de la planta, siempre que exprese en forma estable el rasgo 'siempre verde' introducido primero en un progenitor anterior.

La referencia a una "planta de cultivo" incluye una planta de cereal. Las plantas de cereal de cultivo aquí habilitadas, incluyen sorgo, trigo, avena, maíz, cebada, centeno, arroz, abacá, alfalfa, almendra, manzana, esparrago, plátano, alubia, zarzamora, haba, cañóla, anacardo, mandioca, garbanzo, cítricos, coco, café, maíz, algodón, higo, linaza, uvas, maní, cáñamo, kenaf, lavanda, mano, hongo, olivo, cebolla, chícharo, cacahuate, pera, mijo, papa, ramio, semilla de colza, ryegras, frijol de soya, fresa, betabel, azúcar de caña, girasol, camote, taro, té, tabaco, tomate, triticale, trufa y ñame. En un ejemplo, los mecanismos de tolerancia a la marchitez del sorgo se utilizan para promover tolerancia a la marchitez en sorgo, así como otras plantas de cultivo. En un ejemplo, las plantas genéticamente modificadas utilizan de manera más eficiente agua que una planta no modificada genéticamente de la misma especie. Los loci PIN existentes en cada una de las plantas anteriores son referidos como PINs "nativos". La presente descripción enseña como aumentar e inhibir una PIN nativa o seleccionar una PIN que tiene un perfil de expresión particular. Una PIN "nativa" es un locus de PIN en una planta progenitora antes de cualquier manipulación (recombinante, mutagénesis o de sembrado).

Por el término "tolerancia a la marchitez", se incluye la evasión de la marchitez, adaptación a la marchitez, resistencia a la marchitez, sensibilidad reducida a las condiciones de marchitez, eficiencia de uso de agua incrementada, así como la capacidad de cambiar el uso de agua en el período posterior a la floración o la capacidad de acceso de agua incrementada durante el crecimiento de cultivo, para incrementar de esta forma Hl y la producción de grano bajo condiciones con limitación de agua. Las plantas que exhiben tolerancia a la marchitez, se describen como "plantas adaptadas a la marchitez" o "plantas que exhiben sensibilidad reducida a las condiciones con limitación de agua". En la presente invención se enseña que la tolerancia a la marchitez es inducida, facilitada, o de otra manera está asociada con el fenotipo 'siempre verde' .

Por el término "genéticamente modificada", en relación con una planta, se incluye una planta genéticamente modificada derivada originalmente, así como cualquier progenie, inmediata o distante que expresa en forma estable el rasgo 'siempre verde'. Por lo tanto, la presente descripción enseña tanto técnicas de siembra clásicas para introducir el agente genético, es decir, la QTL 'siempre verde' o un equivalente funcional de las mismas, tal como cADN o un fragmento genómico o un agente que aumente o inhiba (es decir, module) la expresión de QTL o la proteína codificada de la misma, así como tecnología de ingeniería genética. Esta última está comprendida por los términos "medios de ingeniería genética" y "medios recombinantes". Los marcadores que definen el mecanismo 'siempre verde', también pueden ser clasificados durante protocolos de siembra para monitorear la transferencia de regiones genéticas particulares. Además, una región 'siempre verde' específica se inserta genéticamente a través de medios recombinantes sin una célula de planta o callo de planta y una plántula regenerada. Una planta "genéticamente modificada" incluye un progenitor o cualquier progenie, así como cualquiera productos de la planta, tal como grano, semillas material de propagación, polen, y óvulos. Además, se puede expresar un locus PIN en un tejido de planta en particular, pero no expresarse, o su expresión ser reducida en otro tejido. Además, una planta puede ser sujeto de mutagénesis, tal como mutagénesis genética radioactiva o química, y plantas mutadas seleccionadas con una PIN que tiene un fenotipo deseado.

Haciendo referencia al "fenotipo siempre verde", se incluyen características seleccionadas de la plasticidad de arquitectura de la cubierta incrementada, tamaño de la cubierta reducida, biomasa incrementada por área de hoja de unidad en la floración, eficiencia de transpiración superior, uso de agua incrementado durante el llenado del grano, estado de agua en la planta incrementado durante el llenado del grano, proporción reducida de la biomasa pre:post floración, senectud retardada, producción de granos incrementada, tamaño más grande del grano y fijación reducida.

En la presente invención se habilita una método para generar una planta genéticamente modificada que utiliza agua de manera más eficiente que una planta no modificada genéticamente de la misma especie, en donde el método comprende introducir en la planta o un progenitor de la planta, un agente genético que codifica un producto que está asociado con, o que facilita un fenotipo siempre verde, en donde el fenotipo incluye un cambio en el uso de agua en el período postfloración, o una capacidad de acceso de agua incrementada durante el crecimiento del cultivo o una eficiencia de transpiración incrementada que da como resultado un índice de cosecha y producción de grano incrementados bajo condiciones con limitación de agua, y en donde el producto se selecciona de la línea que consiste en SbPINI a 11 incluyendo SbPIN4 y SbPIN2, y otras SbPINs descritas en la tabla 1 A o un equivalente de las mismas en otra planta, o el agente que modula la expresión de una PIN nativa en la planta.

Por lo tanto, en la presente invención se enseña el uso de material genético que codifica un material genético que modula los niveles de una PIN nativa para facilitar el fenotipo PIN 'siempre verde'.

En la presente invención se proporcionan plantas genéticamente modificadas que exhiben el fenotipo 'siempre verde' como resultado de la modificación genética, así como semillas, frutos, flores y otro material reproductivo o de propagación. También se habilitan existencias de la raíz y existencias de propagación. Esto se basa en la premisa de que las semillas, frutos, flores, material reproductor y de propagación, exhiben o pueden pasar en el 'siempre verde' introducido en el progenitor(s) final.

Haciendo referencia a un "agente que modula los niveles de expresión de una PIN", se incluyen promotores, microARNs, genes y compuestos químicos que facilitan la expresión incrementada o disminuida del gen del tejido o tejidos seleccionados o una actividad incrementada o disminuida de un producto de gen, así como cADN y fragmentos genómicos. Un agente también puede ser un intrón de un gen genómico que es parte de una red genética natural para facilitar la modulación de expresión .

Una proteína PIN produce un gradiente de auxina en células que contienen un dominio de transmembrana y se localiza principalmente en la membrana de plasma. Las proteínas PIN son los factores de limitación de rango del transporta de auxina y proporciona dirección vectorial para que fluya la auxina. En la presente invención se enseña que al menos uno de Stg1 o Stg2 codifica una proteína PIN. Se enseña la introducción de Stg1 o Stg2 de novo en una planta o la elevación de su modulación o expresión de una Stg1 o Stg2 nativa, para facilitar la exhibición de una o más características o subcaracterísticas asociadas con el fenotipo siempre verde'.

Tal como se indicó anteriormente, las proteínas PIN son transportadores de eflujo de auxina que transmiten el transporte de auxina polar (PAT) de célula a célula, en forma opuesta al transporte de auxina a través de la xilema (Rashotte et al. Plant Cell 13:1683-1697, 2000; Friml et al, Current Opinión in Plant Biology 6:7-12, 2003). El término 'PIN' se deriva de la inflorescencia tipo alfiler que se desarrolla en Arabidopsis, cuando es defectuoso el transporte. En la presente invención se habilita una SbPINn de sorgo, en donde n es un número de 1 a 11, así como una PIN de cualquier otra planta.

También se enseña en la presente invención, un método para generar una planta genéticamente modificada que utiliza agua en forma más eficiente que una planta no modificada genéticamente de la misma especie, en donde el método comprende introducir en una planta o progenitor de la planta, un agente genético que codifica una proteína seleccionada de la lista que consiste en SbPINI a 11 tal como SbPIN4 y SbPIN2 u otras SbPINs descritas en la tabla 1 A, o un equivalente de las mismas en otra planta o un agente que modula la expresión de una PIN nativa en la planta.

En la presente descripción se enseña que SbPIN4 y SbPIN2 de sorgo, son genes de adaptación a la marchitez importante junto con otras SbPINs, así como sus equivalentes en otras plantas. Las diferencias en la señalización de auxina explican todos los múltiples fenotipos observados en las plantas con un perfil de expresión PIN. Los fenotipos exhibidos por plantas SbPIN4 o SbPIN2, se explican por ejemplo a través de los cambios en el eflujo de auxina e incluyen generación de vástagos reducida, hojas más pequeñas (tanto en longitud como en ancho), masa reducida de la hoja y una proporción incrementada de raíz: brote. Los fenotipos exhibidos por plantas SbPIN4 o SbPIN2, también pueden ser explicados, por ejemplo de manera indirecta (como consecuencias emergentes de estos efectos directos) e incluyen la disponibilidad incrementada del agua en la floración, mayor concentración N en la hoja en la floración, transpiración incrementada y biomasa por área de hoja unitaria, mayor eficiencia de transpiración, retención del área verde de la hoja durante el llenado del grano, índice de cosecha incrementado, mayor producción de grano, mayor tamaño del grano y resistencia a la fijación incrementada. En la presente invención se proporcionan equivalentes de SbPIN4 y SbPIN2 y otras SbPINs son operativas a través de otras especies de cultivo y cereal importantes, para incrementar la adaptación a la marchitez en regiones a nivel mundial, en donde el agua limita el crecimiento del cultivo posterior a la floración.

De acuerdo con las enseñanzas de la presente especificación, la modulación de la expresión de una PIN seleccionada de SbPINI a 11, tal como SbPIN4 (Stg1) y SbPIN2 (Stg2) o sus equivalentes en otras plantas en todo el tejido, o en tejidos seleccionados, confiere adaptación a la marchitez tanto directamente, como indirectamente, conduciendo finalmente a una mayor producción de grano, mayor tamaño de grano y resistencia a la fijación bajo condiciones limitación de agua .

En un ejemplo, el fenotipo 'siempre verde' implica la presencia de múltiples proteínas tales como dos o más de SbPINa a 11, tal como SbPIN4 y SbPIN2.

En la presente invención se enseña un método para generar una planta genéticamente modificada que utiliza agua en forma más eficiente que una planta no modificada genéticamente de la misma especie, en donde el método comprende introducir en una planta o progenitor de la planta un agente genético que codifica dos o más PINs o un homólogo u ortólogo funcional de la misma, que están asociados con o facilitan un fenotipo 'siempre verde', en donde el fenotipo incluye un cambio en el uso de agua en el período posterior a la floración, o una accesibilidad de agua incrementada durante el crecimiento del cultivo o eficiencia de transpiración incrementada que da como resultado un índice de cosecha y producción de grano incrementados bajo condiciones con limitación de agua; o un agente que modula los niveles de expresión de dos o más PINs.

Por el término "dos o más", significa 2 o 3 o 4 o 5 o 6 o 7 o 8 o 9 o 10 o 11. También se puede expresar o inhibir un loci PIN simple o múltiple.

Se logra la disponibilidad de agua incrementada en la floración, mediante uso de agua reducido debido a dos mecanismos (generación de vástagos reducida y hojas más pequeñas) en plantas que contienen la región Stg1. Ambos mecanismos, en forma individual, parecen reducir el tamaño de la cubierta en aproximadamente el 9%, en promedio. El mecanismo de "baja generación de vástago" domina en ambientes de baja densidad, cuando es alto el potencial de generación de vástagos. El mecanismo de "hoja pequeña" domina en ambientes de alta densidad, en donde es bajo el potencial de generación de vástago. En combinación, estos dos mecanismos proporcionan plantas de cultivo con plasticidad considerable para modificar la arquitectura de cubierta en respuesta a la severidad de la limitación de agua.

El fenotipo 'siempre verde' incrementa la plasticidad de arquitectura de cubierta mediante respuestas constitutivas ya de adaptación. El tamaño de cubierta en Stg1 o Stg2 se reduce en aproximadamente 5%, incluso cuando no hay limitación de agua (respuesta constitutiva). El tamaño de la cubierta se reduce en forma adicional (respuesta de adaptación) en una marchitez moderada (-10%) y marchitez más severa (~15%). La baja generación de vástagos, es principalmente una respuesta constitutiva. El tamaño de hoja pequeño es tanto una respuesta constitutiva como una de adaptación.

Además, en la presente invención se enseña que la región Stg1 o Stg2 confiere adaptación a la marchitez, reduciendo el tamaño de cubierta (mediante generación de vastago reducida y hojas más pequeñas) y reduciendo el uso de agua en el cultivo en la floración. Esto se muestra a través de una alta correlación (r 2 = 0.9) entre el tamaño de la cubierta y uso de agua del cultivo en estudios de marchitez artificial (resguardo contra la lluvia [ROS]) y medidor de lisis.

También se logró una disponibilidad de agua incrementada en la floración, mediante capacidad de acceso al agua incrementada (mejor extracción de agua) y dispersión lateral más profunda o más grande).

El genotipo 'siempre verde' incrementa la biomasa por área de hoja unitaria en la floración. Asumiendo que la masa de la raíz es equivalente (o al menos no significativamente menor), estas diferencias pueden ser explicadas por las diferencias en transpiración (T) por área de hoja unitaria [LA] (T/LA) y/o eficiencia de transpiración (TE). Los estudios de medición de lisis indican que el incremento en T/LA, en lugar de TE, conducen a incrementos observados en biomasa por área de hoja. Se debe observar que la T/LA incrementada únicamente ocurrió cuando el déficit de agua fue suficiente para reducir el área de la hoja. Cuando el déficit del agua fue menos severo (es decir no suficiente para reducir el área de la hoja) entonces disminuyó T/LA, dando como resultado una TE superior.

La TE superior en líneas StgX, tal como líneas Stg1 o Stg2, también se observó cuando el déficit de agua es menos severo. La TE incrementada mediante introgresión de Stg1 o Stg2, se propone como debido a a) capacidad fotosintética proporcionalmente mayor en comparación con la conductancia estomatal, debido a hojas más pequeñas, más delgadas y más verdes, y/o b) una disminución en la transpiración manteniendo al mismo tiempo la biomasa. Los estudios de lisimetría indican que ambos de estos mecanismos contribuyen a una TE superior en líneas Stg1, con la reducción en transpiración del mecanismo primario.

Los cambios en transpiración por área de hoja unitaria se muestran en la presente invención, como debido a a) número de estomas, b) tamaño de apertura de estomas, c) cambios en la sincronización de abertura y cierre de estomas relativo a VPD, y/o d) el número de células de base ciliada (que afectan la capa del límite y por lo tanto T/LA). Por ejemplo, la introgresión de Stg 1 , por ejemplo, en RTx7000, modificó la anatomía de la hoja incrementando el número de células de envoltorio de paquete que rodean el paquete vascular.

Las diferencias en la morfología de las hojas, se pueden apreciar entre RTx7000 y Stg1 o Stg2. En este caso, hubieron más envolturas de paquete, y más pequeñas que rodean el paquete vascular en Stg1 o Stg2. Asimismo, hubieron menos estomas, y menos células a base ciliada por área de hoja unitaria (hojas 7 y 10) en Stg1 en comparación con RTx7000.

El uso de agua incrementado durante el llenado de grano, se logra mediante (i) disponibilidad de agua incrementada en la floración y (ii) capacidad de acceso de agua incrementada (mejor extracción de agua y dispersión lateral más profunda o mayor) durante el llenado del grano.

El uso de agua de cultivo (CWU) antes de la floración, estuvo correlacionada en forma negativa con CWU después de la floración en un experimento de marchitez artificial (resguardo contra la lluvia [ROS]). Por ejemplo, en un experimento, un incremento del 25% en el uso de agua después de la floración (80 vs 60 mm) dio como resultado un incremento del 25% en la producción de granos (400 vs 300 g/m2). Esto se tradujo en 50 kg/ha de grano por cada mm adicional de agua disponible.

El uso de agua incrementado durante el período de llenado de grano fue exhibido por Stg1 o Stg2 bajo tratamientos tanto de baja como alta densidad en un experimento de resguardo contra la lluvia (ROS). Esto se debió principalmente a (i) uso de agua reducido en la floración bajo alta densidad, y (ii) capacidad de acceso de agua incrementado durante el llenado de grano bajo baja densidad.

En la presente invención se enseña que StgX, tal como Stg1 o Stg2 confieren adaptación a la marchitez mediante la asociación con la producción de biomasa pre y post floración. La región Stg1 o Stg2, por ejemplo, reduce la proporción de biomasa pre:post floración debajo de un nivel crítico, incrementando la producción de grano y la resistencia a la fijación.

De acuerdo con las enseñanzas de la presente descripción, la expresión de StgX, tal como Stg1, Stg2, Stg3 y/o Stg4, facilita uno o más de los siguientes fenotipos: (i) senectud de la hoja retardada (siempre verde), mayor producción del grano y resistencia a la fijación son consecuencias de un mayor estado de agua en la planta durante el llenado del grano (debido al uso de agua incrementado durante el llenado del grano); (ii) la introgresión de StgX, por ejemplo, en el trasfondo RTx7000 incrementa el estado de agua en la planta en el llenado de grano moderado, tal como se indica mediante a) mayor contenido de agua relativo (RWC), y b) menor potencial de agua en la hoja (LWP): (Mi) mayor producción de grano y mayor tamaño del grano son consecuencias de la disponibilidad incrementada de agua durante el llenado del grano; (iv) mayor producción de grano, mayor tamaño del grano y resistencia a la fijación incrementada no son mutuamente exclusivas (es decir, los tres rasgos son exhibidos por StgX); (v) las ventajas de producción y tamaño de grano son relativamente mayores bajo una marchitez terminal severa que bajo marchitez terminal moderada; (vi) el beneficio de los genes "siempre verde", por ejemplo en el trasfondo RTx7000 (innatos) ocurre en el rango de producción de 1-3 t/ha (12 a 22%), seguido por un beneficio menor aún significativo en el rango de rendimiento 3-4 t/ha (8 a 10%). Sin embargo, hubo una pequeña penalidad asociada con estas regiones (2 a 4%) en mayores niveles de producción (5 a 8 t/ha) debido a condiciones de mayor humedad. Se debe observar que estos rangos de producción pueden ser considerablemente mayores en híbridos. Ya que la producción de grano de sorgo promedio para híbridos en la banda de granos del norte es de aproximadamente 2.5 t/ha, el beneficio de los genes "siempre verde" debe ser significativo. No se ha observado en híbridos la reducción en la producción de granos bajo condiciones de mayor humedad (sin limitación de agua) debido al mecanismo "siempre verde". (vií) la ¡ntrogresión de StgX, por ejemplo, en RTx7000 también incrementa el tamaño del grano en un 11%, en promedio, bajo una marchitez terminal severa. No hubo impacto del StgX QTL en el tamaño del grano bajo una marchitez terminal moderada o sin marchitez; y (viii) cada uno de los mecanismos StgX clave, se mapea hacia una región definida, lo que sugiere que la acción de un gen simple tiene múltiples efectos pleyotróficos.

La presente descripción enseña además un modelo de negocios para incrementar las ganancias económicas en la producción de grano. De acuerdo con estas enseñanzas, se proporciona un modelo de negocio para ganancias económicas incrementadas en la producción de cultivos, en donde el modelo comprende generar plantas de cultivo que tengan un perfil de expresión PIN que dé como resultado que la planta de cultivo tenga un cambio en el uso de agua a través de la planta en el período posterior a la floración, o una capacidad de acceso de agua incrementada durante el crecimiento del cultivo, para incrementar de esta forma el Hl y la producción de grano bajo condiciones con limitación de agua, obteniendo semillas de la planta de cultivo generada, y distribuyendo las semillas a los productores de grano para obtener una producción y ganancias incrementadas. Con referencia a PIN, se incluye SbPINI a 11 tal como SbPIN4 y SbPIN2, así como sus equivalentes en otras plantas.

En la presente invención se enseña un sistema de manejo de plantas para reducir la dependencia que tienen los cultivos del agua, o para mejorar de otra forma la eficiencia del uso de agua y para incrementar la producción de granos o productos. El sistema de manejo de plantas incluye la generación de un cultivo adaptado a la marchitez, incluyendo plantas de cereal, utilizando la selección y expresión modulada del locus PIN o su equivalente funcional, tal como se define en la presente invención solo o en combinación con la introducción de otros rasgos útiles tales como tamaño de grano, tamaño de raíz, tolerancia a la sal, resistencia a herbicidas, resistencia a pestes y similares. Alternativamente o en forma adicional, el sistema de manejo de plantas comprende la generación de plantas adaptadas a la marchitez y procedimientos agrícolas tales como irrigación, requerimiento de nutrientes, densidad y geometría de cultivo, control de maleza, control de insectos, aereado de tierra, generación de vástagos reducida, lechos elevados y similares.

La presente especificación es una instrucción como un medio para inducir o incrementar la capacidad de adaptación a la marchitez en una planta, introduciendo do novo una o más características del fenotipo "siempre verde", o elevando o reduciendo la expresión de uno o más loci PIN existentes en una planta y/o seleccionando una variante polimórfica PIN con expresión o actividad del producto incrementada o mejorada. La manipulación del fenotipo "siempre verde", se puede llevar a cabo sola o como comparte de un sistema de manejo de plantas integrado, que puede incluir una selección de rasgo y/o técnicas agrónomas mejoradas adicionales. Los cultivos resultantes utilizan agua de manera más eficiente, y tienen una mayor producción de granos y un tamaño de grano incrementado.

Las enseñanzas de la presente invención incluyen modelos de negocio para recolectar semillas de las plantas de cultivo incrementadas o adaptadas a la marchitez para distribución a productores para incrementar finalmente la producción de granos.

La presente descripción es habilitante con respecto al uso de un agente genético que codifica una proteína PIN, o que modula los niveles de expresión de una proteína PIN nativa en la fabricación de una planta adaptada a la marchitez.

Los QTLs son identificados en la presente invención como llevando uno o más loci PIN, en donde cuyo nivel de expresión es seleccionado en protocolos de siembra o mediante ingeniería genética, para promover el fenotipo "siempre verde".

Las plantas genéticamente modificadas y su progenie, que exhiben el rasgo "siempre verde", también son mostradas en la presente invención, así como las semillas, frutos y flores y otros materiales reproductores o de propagación.

El material genético que codifica una proteína PIN o un homólogo u ortólogo funcional de la misma, que está asociada con, o facilita un fenotipo siempre verde, en donde el fenotipo incluye una arquitectura de cubierta que facilita un cambio en el uso de agua en el período de floración o una capacidad de acceso al agua incrementada durante el crecimiento de cultivo o eficiencia de transpiración incrementada, da como resultado un índice de cosecha y producción de grano incrementados bajo condiciones con limitación de agua; y un agente que modula el nivel de PIN; siendo mostrados ambos en la presente especificación .

En un ejemplo, el material genético se selecciona de (i) un agente que codifica una SbPIN descrita en la tabla 1A; y (ii) un agente que modula los niveles de expresión de una SbPIN descrita en la tabla 1A o su equivalente en otra planta.

En un ejemplo, el material genético es seleccionado de (i) un agente que codifica SbPIN4; y (ii) un agente que modula los niveles de expresión de SbPIN4 o su equivalente en otra planta. En otro ejemplo, el material genético seleccionado de (i) un agente que codifica SbPIN2; y (ii) un agente que modula la expresión de SbPIN2 o su equivalente en otra planta.

El material genético incluye un agente que codifica una PIN u homólogo u ortólogo funcional de la misma, que está asociada con, o facilita un fenotipo "siempre verde", en donde el fenotipo incluye una arquitectura de cubierta que facilita un cambio en el uso de agua en el período posterior a la floración, o una capacidad de acceso al agua incrementado durante el crecimiento de cultivo o eficiencia de transpiración incrementada dando como resultado un índice de cosecha y producción de grano incrementada bajo condiciones con limitación de agua. El agente activo incluye un agente que aumenta o inhibe los niveles de PIN. Los genes en cuestión también pueden ser utilizados como marcadores para transferir regiones de genomas que comprenden uno o más de los genes, o sus equivalentes en otras plantas, a una planta en particular, con el objeto de incluir el fenotipo "siempre verde".

EJEMPLOS Los aspectos mostrados y habilitados en la presente invención, se describen en forma adicional a través de los siguientes ejemplos no limitantes.

EJEMPLO 1 Identificación de un gen StgX Se ha identificado un locus de rasgo cuantitativo (QTL), el cual es referido en la presente invención como Stg1, el cual es un ejemplo de un StgX, que incrementa o mejora la eficiencia del uso de agua en las plantas de sorgo. Stg1 codifica un miembro bicolor de sorgo de la familia del componente 4 transportador de eflujo de auxina, PIN4 (o SbPIN4).

Este gen de adaptación a la marchitez importante ha sido mapeado en forma fina en el genoma de sorgo. Los cambios en el eflujo de auxina podrían explicar todos los múltiples fenotipos observados en plantas que contienen SbPIN4. El gen candidato (y región promotora) es secuenciado en los dos progenitores de la población de mapeo fino (RTx7000 y Tx642) para identificar un polimorfismo de nucleótido simple. El perfilado de la expresión de ARN de la población de mapeo fino Stg1, también se lleva a cabo en un subconjunto de líneas, tiempos y órganos. Los fenotipos exhibidos por plantas SbPIN4 que pueden ser explicados directamente por los cambios en el eflujo de auxina, incluyen generación de vástagos reducida, hojas más pequeñas (tanto longitud como ancho), masa de la hoja reducida y proporción de raíz/brote incrementada. Los fenotipos exhibidos por plantas SbPIN4 que pueden ser explicados en forma indirecta (o como consecuencias que surgen de estos efectos directos), incluyen una disponibilidad de agua incrementada en la floración, mayor concentración N en la hoja en la floración, transpiración y biomasa por área de hoja unitaria incrementadas, proporción reducida de biomasa pre:post floración, mayor eficiencia de transpiración, retención de área de hoja verde durante el llenado del grano, índice de cosecha incrementado, mayor producción de grano, mayor tamaño del grano y resistencia a la fijación incrementada. Se propone que SbPIN4 opera a través de otras especies de cereal y cultivo importantes para aumentar la adaptación a la marchitez en regiones a nivel mundial, en donde el agua limita el crecimiento del cultivo posterior a la floración.

Stg1 (SbPIN4) confiere adaptación a la marchitez tanto directamente, como indirectamente, conduciendo finalmente a una mayor producción de granos, mayor tamaño del grano y resistencia a la fijación bajo condiciones con limitación de agua .

Se logra la disponibilidad de agua incrementada en la floración, mediante el uso reducido de agua debido a dos mecanismos (generación de vastagos reducida y hojas más pequeñas) en plantas que contienen la región Stg1. Ambos mecanismos, en forma individual, parecen reducir el tamaño de la cubierta en aproximadamente el 91%, en promedio. El mecanismo de "baja generación de vástago" domina en ambientes de baja densidad, cuando es alto el potencial de generación de vástagos. El mecanismo de "hoja pequeña" domina en ambientes de alta densidad en donde es bajo el potencial de generación de vástagos. Combinados, estos dos mecanismos proporcionan plantas de cultivo con considerable plasticidad para modificar la arquitectura de la cubierta, en respuesta a la severidad de la limitación de agua.

El rasgo "siempre verde", incrementa la plasticidad de la arquitectura de la cubierta mediante respuestas constitutivas y de adaptación. El tamaño de la cubierta en Stg1 se reduce en aproximadamente 5%, incluso cuando el agua no está limitada (respuesta constitutiva). El tamaño de la cubierta se reduce en forma adicional (respuesta de adaptación) en una marchitez moderada (-10%) y marchitez más severa (-15%). La baja generación de vástagos es principalmente una respuesta constitutiva. El tamaño de hoja pequeño es tanto una respuesta constitutiva como de adaptación.

Existe un enlace entre el tamaño de cubierta reducido (mediante la generación de vástagos reducida y hojas más pequeñas) y el uso de agua en cultivo reducido en la floración. La alta correlación (r2 = 0.9) entre el tamaño de la cubierta y el uso de agua del cultivo en estudios ROS y de medición de lisis.

También se logra una disponibilidad de agua incrementa en la floración, mediante la capacidad de acceso al agua incrementada (mejor extracción de agua y dispersión lateral más profunda o más grande).

El rasgo siempre verde incrementa la biomasa por área de hoja unitaria en la floración. Asumiendo que la masa de la raíz es equivalente (o al menos no significativamente menor), estas diferencias pueden ser explicadas mediante las diferencias en transpiración por área de hoja unitaria (T/LA) y/o eficiencia de transpiración (TE). Los estudios de medición de lisis indican que los incrementos en T/LA, en lugar de TE, conducen a los incrementos observados en biomasa por área de hoja. Se debe observar que la T/LA incrementada, ocurrió únicamente bajo condiciones VPD bajas; T/LA se redujo realmente bajo condiciones VPD altas, presumiblemente como un mecanismo de conservación de agua.

También se observó una mayor TE en líneas Stg1, bajo condiciones de VPD superiores. La TE incrementada mediante introgresión de Stg1, puede ser debido a a) capacidad fotosintética proporcionalmente mayor en comparación con la conductancia estomatal, debido a hojas más pequeñas, más delgadas y más verdes y/o b) una disminución en la transpiración, manteniendo al mismo tiempo la biomasa. Los estudios de medición de lisis indican que ambos de estos mecanismos contribuyen a una TE superior en líneas Stg1, con la reducción en la transpiración del mecanismo primario.

Los cambios en transpiración por área de hoja unitaria pueden ser debido a a) número de estomas, b) tamaño de apertura de estomas, c) cambio en la sincronización de la abertura y cierre estomatal relativa a VPD, y/o d) el número de células de base ciliada (que afectan la capa de límite y por lo tanto T/LA). La introgresión de Stg1 en RTx7000, reduce el número de estomas e incrementa el número de células de base ciliada por área de hoja unitaria en hojas 7 y 10; ambos mecanismos pueden conservar el agua reduciendo T/LA.

La introgresión de Stg1 en RTx7000, modificó la anatomía de la hoja incrementando el número de células de envoltorio de paquete que rodean el paquete vascular. El número incrementado de células en el envoltorio de paquete, también puede contribuir a una asimilación fotosintética incrementada y por lo tanto TE.

Las diferencias en la morfología de las hojas (por ejemplo, hojas 7 y 10) se pueden apreciar entre Tx7000 y Stg1. En este caso, hubo más envoltorios de paquete y más pequeños rodeando el paquete vascular en Stg1. El número incrementado de células en el envoltorio de paquete, también debe contribuir a la asimilación fotosintética incrementada y por lo tanto TE.

El uso de agua incrementado durante el llenado del grano se logra mediante (i) disponibilidad de agua incrementada en la floración, y (ii) capacidad de acceso de agua incrementada (mejor extracción de agua y dispersión lateral más profunda o mayor) durante el llenado del grano. a) Disponibilidad de agua incrementada en floración El uso de agua de cultivo (CWU) antes de la floración, estuvo correlacionado en forma negativa con CWU después de la floración en un experimento ROS. Por ejemplo, en un experimento, un incremento del 25% en el uso de agua después de la floración (80 vs 60 mm) dio como resultado un incremento del 25% en la producción de grano (400 vs 300 g/m2). Esto se tradujo en 50 kg/ha de grano por cada mm adicional de agua disponible. b) Capacidad de acceso de agua incrementado durante llenado de grano El uso de agua incrementado durante el período de llenado de grano fue exhibido por Stg1 bajo tratamientos tanto con baja como alta densidad en un experimento ROS. Esto se debió principalmente a (i) uso de agua reducido en la floración bajo alta densidad, y (ii) capacidad de acceso de agua incrementada durante llenado de grano bajo baja densidad.

La región Stg1 confiere adaptación a la marchitez a través de una unión entre la producción de biomasa pre y post floración. La región Stg 1 reduce la proporción de biomasa pre: post floración debajo de un nivel crítico, incrementando la producción de grano y la resistencia a la fijación.

La senectud de la hoja retardada ("siempre verde"), mayor rendimiento de grano y resistencia a la fijación, son consecuencias de un estado de agua en la planta superior durante el llenado del grano (debido al uso de agua incrementado durante el llenado del grano).

La introgresión de Stg1 en un trasfondo RTx7000, incrementó el estado de agua de la planta en el llenado de grano moderado, tal como se indica mediante a) contenido de agua relativamente mayor (RWC), y b) potencial de agua de la hoja menor (LWP).

Un mayor rendimiento de grano y mayor tamaño del grano son consecuencias de la disponibilidad de agua incrementada durante el llenado del grano.

Un mayor rendimiento del grano, mayor tamaño del grano y resistencia a la fijación incrementada no son mutuamente exclusivos (es decir, los tres rasgos son exhibidos por Stg1).

Las ventajas de la producción y tamaño de grano son relativamente mayores bajo una marchitez terminal severa que bajo marchitez terminal moderada.

Los estudios indican que ocurre el mayor beneficio de los genes siempre verde en un trasfondo RTx7000 (innato) dentro del rango de producción 1 a 3 t/ha (12-22%), seguido por un beneficio menor, aunque aún significativo en el rango de producción 3 a 4 t/ha (8 a 10%). Sin embargo, ésta fue una pequeña penalidad asociada con estas regiones (2 a 4%) en mayores niveles de producción (5 a 8 t/ha), debido a las condiciones de agua. Se debe observar que estos rangos de producción pueden ser considerablemente mayores en híbridos. Ya que la producción de grano de sorgo promedio para híbridos en la banda de granos del norte es de aproximadamente 2.5 t/ha, debe ser significativo el beneficio de los genes "siempre verde". En general, no se ha observado reducción en la producción de granos bajo condiciones de mayor humedad (sin límite de agua) debido al rasgo siempre verde.

La introgresión de Stg1 en RTx7000, también incrementó el tamaño de grano en un 11% en promedio, bajo una marchitez terminal severa. No hubo impacto de esta QTL en el tamaño del grano bajo una marchitez terminal moderada o sin marchitez.

Cada uno de los mecanismos Stg1 clave, mapea hacia la misma región, lo que indica la acción de un solo gen con múltiples efectos pleyotrópicos.

EJEMPLO 2 Generación de vástagos reducida (estudios fisiológicos de NlLs en el campo) Los datos muestran el impacto de Stg1 en la generación de vástagos bajo condiciones tanto de agua de alto nivel (HW) como agua de bajo nivel (LW). Las diferencias en el desarrollo de cubierta antes de la floración, fueron en gran parte una consecuencia de la variación en la generación de vástagos entre las líneas. El número de raicillas por m2 en la floración, fue la mejor medida general del efecto de la generación de vástagos en dinámicas de cubierta. Los números de raicillas por m2 fueron equivalentes bajo ambos regímenes de agua (12.89), lo que indica que la generación de vástago reducida es un rasgo constitutivo. Los genotipos variaron significativamente (P<0.001) en este parámetro, fluctuando de 8.59 a 16.67. Sin embargo, el genotipo y el tratamiento no interactuaron en forma significativa en este parámetro.

Los números de raicillas por m2 fueron analizados en términos de sus estados Stg, y los promedios de categoría se presentan en la tabla 1. RTx7000 produjo 41% más (P<0.05) raicillas /m2 que B35 (14.07 vs. 10.00). La introgresión de la región Stg1 sola en RTx7000 (6078-1) redujo las raicillas /m2 significativamente (P<0.05) en comparación con RTx7000 (9.40 vs. 14.07). En comparación únicamente con Stg1, las introgresiones adicionales ya sea de Stg2 o Stg4 incrementaron los números de raicillas a 10.49 (combinación 1,2) y 10.74 (combinación 1,4). Se debe observar que las tres cuasi isolíneas que no contienen regiones Stg (2212-3, 2235-11 y 6120-16), también exhibieron una alta generación de vástagos equivalente a Tx7000. Por lo tanto, la fluctuación general de generación de vástagos en estas líneas es de Stg1 < B35 < Stg4 < Stg2 < Stg3 < ninguna < RTx7000.

En la floración, los números de raicillas estuvieron altamente correlacionados (r2 = 0.71) con el área de hoja verde total (GLAA; figura 1).

Tabla 1 Las raicillas por m2 en las líneas de progenitor recurrentes (RTx7000) y en diversas líneas que contienen introgresiones de QTL Stg1, tanto solos como en combinación con otros QTL Stg.

Las diferencias en el área de hoja verde en floración (GLAA), fueron debidas principalmente a las diferencias en el área de hoja verde de vástago en la floración (GLAAt), ya que GLAAt estuvo altamente correlacionado con GLAA (r = 0.78), aunque no lo estuvo el área de hoja principal.

El área de hoja verde de vástago en la floración, fue analizada en término de estado Stg y se presentan los promedios de la categoría en la tabla 2. RTx7000 produjo GLAAt casi ocho veces más (P<0.05) que B35 (15460 vs. 1980). La introgresión de la región Stg1 sola en RTx7000 (6078-1) redujo significativamente GLAAt (P<0.05) en comparación con RTx7000 (3121 vs 15460). En comparación únicamente con Stg1, las introgresiones adicionales ya sea de Stg2 o Stg4 incrementaron GLAAt a 4187 (combinación 1,2) y 4797 (combinación 1,4). Todas las líneas que contienen Stg1 (en cualquier combinación) no fueron significativamente diferentes (P<0.05) en GLAAt a partir de Stg1 solo. Se debe observar que GLAAt en las tres cuasi isolíneas que no contienen regiones Stg (2212-3, 2235-11 y 6120-16) no fueron significativamente diferentes a RTx7000. Por lo tanto, las clasificaciones significativamente diferentes (P<0.05) de GLAAt en estas líneas son B35 = Stg1 = Stg4 < Stg2 = Stg3 < ninguno = RTx7000.

Tabla 2 El área de hoja verde en vástago en la floración en las líneas de progenitor recurrentes (RTx7000) y en diversas líneas contienen introgresiones de QTL Stg1, tanto solas como en combinación con otros QTL Stg.

El área de hoja verde en raicillas por m2 en la floración, estuvo altamente correlacionada bajo tratamientos de alta (HD) y baja (LD) densidad en el experimento de resguardo contra lluvia (figura 2). La introgresión en las regiones Stg1 o Stgla en RTx7000, redujo lasm raicillas por m2 y GLAA bajo ambas densidades.

EJEMPLO 3 Generación de vastagos reducida (estudios de mapeo fino) Se creció una población de mapeo fino Stg1 en el campo bajo condiciones de alta y baja densidad en tres años consecutivos. El número de raicillas por planta se midió en la floración en cada año, y se llevó a cabo un análisis combinado a lo largo de los años. En general, RTx7000 produjo 47% más raicillas por planta que 6078-1 (1.85 vs. 1.26; figura 3).

En estos estudios en campo, se mapeó el rasgo (número de raicillas por planta). Un valor arbitrario de 1.54 raicillas por planta, produjo la separación óptima entre la generación de vástago de alto y bajo nivel con propósitos de mapeo (por ejemplo recombinantes con menos de 1.54 raicillas fueron genotipos BB, aunque los que tienen más de 1.54 raicillas fueron genotipos TT). La disminución a través de los marcadores revela que se logró la ganancia de función (generación de vástagos de bajo nivel) en tres genotipos (10564-2, 10704-1 y 10620-4). Uno recombinante (10568-2) exhibió un fenotipo de alta generación de vástagos, aunque otros tres (10620-4, 10704-1 y 10564-2) exhibieron fenotipos de baja generación de vástagos. Se propuso como el gen candidato un gen de componente transportador de eflujo de auxina 5.

EJEMPLO 4 Generación de vástagos reducido (estudios de mapeo fino Stg1 en ROS) Se creció un subconjunto de la población de mapeo fino Stg 1 en el campo en el estudio de resguardo contra la lluvia (ROS) bajo condiciones de agua de alto y bajo nivel, con cada tratamiento de agua dividido para alta y baja densidad. Esto creó cuatro regímenes de agua con niveles en incremento de déficit de agua: HWLD (menos tensión) <HWHD<LWLD<LWHD (más tensión). El número de raicillas por planta se midió a los 44 días después del surgimiento de cada trazo. Las diferencias fueron las más obvias en el tratamiento de baja densidad (LD), ya que la expresión de la generación de vástago se maximiza en ese tratamiento. En promedio, RTx7000, 10568-2 y 10709-5 produjeron 27% más raicillas por planta que 6078-1 y 10604-5 bajo condiciones LWLD (2.05 vs. 1.62; figura 4), y 23% más raicillas por planta bajo condiciones HWLD (1.49 vs. 1.22).

EJEMPLO 5 Generación de vástagos reducida (estudios de mapeo fino Stg1 en iglú) Se llevaron a cabo tres estudios de mapeo fino adicionales en la población Stg1 bajo condiciones controladas en un iglú. En estos estudios, se analizó con más detalle la generación de vástagos en comparación con los estudios de campo más tempranos. Se contó el número total de generadores de vástagos y más específicamente se contó el número de generadores de vástagos que surgieron de la axila de las hojas 2 (T2), 3 (T3) y 4 (T4). La presencia o ausencia de T2 fue el mejor indicador del potencial de generación de vástagos general de un recombinante determinado. T2 también fue el mejor rasgo para utilizarse para el mapeo fino del gen.

En este experimento, el número total de generadores de vástagos fue la suma de T2, T3 y T4, en donde T2 fue el generador de vástago que emerge de la axila de la hoja 2 (y así sucesivamente para T3 y T4), incluyendo generadores de vástagos secundarios. Se observó una variación genotípica significativa en todos los rasgos que se relacionan con la generación de vástagos en este estudio (tabla 34), con capacidades de herencia generalmente superiores a 30.

Tabla 3 de Vástagos tillerno_max presence_T2 presence_T3 presence_T4 gleaf_T stem_T bio_T b¡o.GLA_T_ratio La Tabla 3, proporciona un resumen de los promedios anticipados, el valor P y la capacidad de herencia de los rasgos de generación de vástagos medidos en la cosecha L11. Se sombrearon con amarillo las diferencias significativas (P<0.05), mientras que las capacidades de herencia >20 se sombrearon con color verde.

El análisis por separado de los datos T2, T3 y T4, encontró que 6078-1 no produjo generadores de vástagos T2 en cualquiera de las cuatro réplicas, en tanto que RTx7000 produjo generadores de vástagos T2 en 2 de 4 réplicas (figura 5).

También se pudieron apreciar diferencias en los números T3. 6078-1 produjo un generador de vástago T3 en 1 de 4 réplicas, en tanto que RTx7000 produjo un generador de vástago T3 en las 4 réplicas (figura 6).

También variaron entre los genotipos los números de generadores de vástago T4. 6078-1 produjo un generador de vástago T4 en 3 de 4 réplicas, en tanto que RTx7000 produjo un T4 en las 4 réplicas. Por lo tanto, la introgresión de Stg1 evitó esencialmente el crecimiento de los tituladores T2 y T3 en un trasfondo RTx7000.

Se separaron las líneas que produjeron un generador de vástago T2 en 0 a 2 réplicas (grupo de baja generación de vástago; 8 recombinantes) de los que produjeron un generador de vástago T2 en 3 a 4 réplicas (grupo alta generación de vástago; 8 recombinantes) [Tabla 4, figura 7].

Tabla 4 La Tabla 4 muestra la presencia de generadores de vástago (T1-T3) y el número total de generadores de vástago de ocho recombinantes con generación de vástago de alto nivel (sombreado color café) y ocho recombinantes de generación de vástago de bajo nivel (sombreado color verde) de la población de mapeo fino Stg1.

Se logra la ganancia de función (generación de vástago de bajo nivel) en 10604-1-157-5 recombinante. También se logra la ganancia de función (baja generación de vástago) en tres recombinantes (10604-1-195-5, 10604-1-56-7, 10604-1-477-4).

Se utilizó un subconjunto de líneas en este experimento para validar la región de generación de vástago. Se utilizaron más réplicas por recombinante (20) para reducir en forma adicional la varianza de error e incrementar la potencia de discriminación entre las líneas. Los resultados indicaron la presencia de un gen de esquina de eflujo de auxina.

Se llevó a cabo un análisis de punto de ruptura de estas líneas, las cuales, de acuerdo con su genotipo (BB o TT), "incrementaron" o "disminuyeron" a través de la región de interés, para identificar el gen de generación de vástago de bajo nivel. Se pudo apreciar un claro rompimiento, que separa las líneas que produjeron un número de generador de vástago total de >2.5 (grupo de generación de vástago de alto nivel; 5 recombinantes) de los que produjeron un número de generador de vástago total de <2.5 (grupo de generador de vástago de bajo nivel; 3 recombinantes) [Tabla 5, figura 8].

Tabla 5 La Tabla 5 muestra la presencia de generadores de vástago (T1-T4), incluyendo generadores de vástago secundarios, y un número de generador de vástagos total para cinco recombinantes de generación de vástago de alto nivel (sombreado color café) y tres recombinantes de generación de vástago de bajo nivel (sombreado verde) de la población de mapeo fino Stg1.

Se logra la ganancia de función (generación de vástago de bajo nivel) en 10604-1-157-5 recombinante. El gen PIN4 en Sorgo bicolor (aquí designado como "SbPIN4"), por consiguiente es un fuerte candidato para el gen de baja generación de vástago Stg1.

EJEMPLO 6 Hojas más pequeñas En general, la introgresión de la región Stg1 en RTx7000, redujo el tamaño de la hoja (longitud y ancho) bajo condiciones de alto riego y con limitación de agua, indicando una acción de gen constitutivo. Sin embargo, la reducción en el tamaño de la hoja fue generalmente mayor bajo condiciones con limitación de agua, lo que indica, hasta cierto punto, una respuesta de adaptación (inducible) además de la respuesta constitutiva. Por lo tanto, Stg1 confiere dos mecanismos para reducir el tamaño de cubierta: a) generación de vástago reducida, y b) tamaño de hoja reducida. Combinados, estos dos mecanismos proporcionan un alto grado de plasticidad para que la planta modifique la arquitectura de la cubierta en respuesta a factores ambientales y/o de manejo.

Una serie de estudios de medición de lisis instruye particularmente en la evaluación de los patrones de tamaño de la hoja bajo diversos niveles de déficit de presión de vapor (VPD) (figuras 9A a D). Aunque las macetas fueron regadas regularmente en ambos experimentos, el tamaño de la cubierta difirió entre las estaciones, presumiblemente debido a diferencias de la estación en temperatura y VPD, creando condiciones de alta (1.8 kPa) y baja (1.3 kPa) VPD. Para el generador de vástagos principal y el más grande (T3), la reducción en el tamaño de la hoja fue significativa bajo condiciones tanto de alta como baja VPD (figuras 9A a D), aunque la reducción comenzó más tarde bajo una VPD de bajo nivel en comparación con una VPD de alto nivel en el tallo principal (L12 vs L9) y T3 (L7 vs L5).

Sin embargo, para los generadores de vástagos restantes (T4-T6), las distribuciones de tamaño de la hoja difirieron marcadamente entre experimentos. Aunque no hubo diferencia en el tamaño de la hoja entre RTx7000 y 6078-1 bajo VPD de alto nivel, las hojas de 6078-1 fueron significativamente más pequeñas bajo VPD de bajo nivel. Esto indica una respuesta de adaptación (inducible) a la reducción del tamaño de la hoja bajo ciertas condiciones ambientales para los generadores de vástagos T4-T6.

Por lo tanto, bajo tensión de agua de bajo nivel, la introgresion de Stg1 en RTx7000 dio como resultado hojas más pequeñas en el tallo principal y generador de vástago más grande (T3), pero no en T4-T6. Esta respuesta puede habilitar a la planta a maximizar la intercepción de luz en los generadores de vástago posteriores, cuando son favorables las condiciones. Bajo alta tensión de agua, la introgresión de Stg1 en RTx7000 dio como resultado niveles más pequeños de todas las raicillas. Esta respuesta puede permitir que la planta reduzca en forma dramática su tamaño de cubierta bajo condiciones con limitación de agua.

EJEMPLO 7 Hojas más pequeñas (estudios de Resguardo Contra la Lluvia) Se llevaron a cabo experimentos de Resguardo Contra la Lluvia (ROS) para evaluar el impacto de la región Stg1 bajo dos densidades de cultivo, creando de esta forma dos niveles de déficit de agua (alta densidad = alta tensión; baja densidad = baja tensión). En general, la generación de vástago fue baja o estuvo ausente bajo HD (20 plantas/m2) y normal bajo LD (10 plantas/m2).

El tamaño de la cubierta fue más pequeño durante ambos años bajo el tratamiento de alta densidad (HD), lo que refleja el mayor déficit de agua generado a través de este tratamiento. En ambos años bajo los déficits de agua más moderados (LD) y más severos (HD), los tamaños de la hoja fueron generalmente menores en 6078-1 (Stg1) en comparación con RTx7000. La excepción fue cuando el patrón de distribución de tamaño de la hoja fue similar para 6078-1 y RTx7000 en el déficit de agua más moderado (LD), aunque las hojas fueron significativamente más pequeñas en 6078-1 (hasta el 18% más pequeña) bajo el mayor déficit de agua (HD), lo que sugiere una respuesta de adaptación mediante las plantas Stg1 para incrementar el déficit de agua. De hecho, la introgresión de la región Stg1 en RTx7000 redujo el tamaño de las cuatro hojas más grandes (L10-L13) en un promedio de 16.5% en el déficit de agua más severo (HD). Ya que hubo poca generación de vástagos en cualquiera genotipo en este tratamiento. El tamaño de hoja reducido en 6078-1 debe haber disminuido marcadamente el tamaño de la cubierta, y por lo tanto el uso de agua del cultivo (asumiendo una transpiración similar por área de hoja unitaria).

Se debe observar que el mecanismo de reducción de tamaño de la hoja asociado con Stg1, pareció operar tanto en la presencia (LD) como en la usencia de generación de vástagos (HD), aunque parece ser mejor expresado bajo HD, en donde generalmente ocurren condiciones de uniraicilla y déficit de agua de alto nivel.

EJEMPLO 8 Hojas más pequeñas (estudio de mapeo fino Stg1 en Resguardo Contra la Lluvia) Se creció un subconjunto de población de mapeo fino Stg1 en el campo en el estudio de Resguardo Contra Agua (ROS) bajo condiciones de agua de alto y bajo nivel, con cada tratamiento de agua dividiéndose en alta y baja densidad. Esto creó cuatro regímenes de agua con niveles en incremento de déficit de agua: HWLD (menos tensión) <HWHD<LWLD<LWHD (más tensión). El área de cada hoja del tallo principal expandida completamente, fue medida para todos los genotipos en todos los tratamientos.

La introgresión de la región Stg1 completa (6078-1), y más específicamente, la región más pequeña, designada 10604-5, dio como resultado una reducción en el tamaño de las hojas 9 a 13 bajo condiciones de agua de bajo nivel y baja densidad (figura 10). Por ejemplo en comparación con RTx7000, L11 fue el 9% y 16% más pequeño en 10604-5 y 6078-1, respectivamente. Ya que la generación de vástago fue insignificante en este tratamiento, las diferencias en el tamaño de cubierta fueron esencialmente debido a las diferencias en el tamaño de la hoja.

Bajo condiciones de baja densidad, las distribuciones del tamaño de la hoja fueron afectadas por la generación de vástago, dando como resultado algunos cruces en comparación con el tratamiento de alta densidad (ver figura 10). Sin embargo, se debe observar que 10604-5 produjo hojas 9 a 13 más pequeñas relativas a 10709-5, 10568-2 y RTx7000 en tratamientos tanto HD como LD.

El gen de "tamaño de hoja pequeño" mapeó para el gen candidato, el componente transportador de eflujo de auxina 5.

EJEMPLO 9 Hojas más pequeñas (estudio de mapeo fino en iglú) El área de la hoja varió significativamente (P<0.001) entre los genotipos con una capacidad de herencia que alcanza 60 para las hojas 4 y 5. La introgresión de la región Sth1 en RTx7000, redujo el área de las hojas 1 a 6 (figura 16). Por ejemplo, el área L6 fue el 22% mayor en RTx7000 (67.4 cm2) que 6078-1 (55.3 cm2), aunque esta diferencia no fue significativa en el nivel. El área de L6 fluctuó de 47.8 cm2 a 93.9 cm2 (LSD [0.05] = 21), con una capacidad de herencia de 42.

Las diferencias en el área de la hoja fueron debido a más diferencias en la longitud de la hoja (figura 17) que en el ancho de la hoja (figura 13). Aunque el área de la hoja incrementó en forma exponencial con el número de hojas (figura 16), la longitud de la hoja incrementó en forma lineal (figura 12). La relación entre el ancho y número de hojas fue parabólica (figura 13). Por lo tanto, la divergencia en el área de la hoja entre 6078-1 y RTx7000 con un número de hojas en incremento, se debió principalmente a la divergencia en la longitud de hoja entre estos genotipos. Esto sugiere que la función de los genes que reducen el tamaño de la hoja, está asociada en forma más probable con la expansión (longitud de la hoja) que con la división (ancho de la hoja) celular.

La relación alométrica en la población de mapeo fino Stg1 enasgo rtre el área de la hoja (n) y el área de la hoja (n + 1), indica un cambio significativo aproximadamente en la Hoja 8 (en forma concurrente con el inicio de floración). Por consiguiente, los incrementos en el tamaño de la hoja ocurrieron en un menor rango. diomoaso -e rgi La introgresión de la región Stg1 en RTx7000 redujo el área de las hojas 9 a 11 [G)i VlPt |aenopoor- (figura 14), así como de las hojas 1 a 6 (descrito anteriormente). El área de L9 varió significativamente (P = 0.06) entre los genotipos, fluctuando de 234 a 300 cm2, con d E Virerroaranaz una capacidad de herencia de 21 (tabla 6). El área L9 fue el 8% mayor en RTx7000 (263 cm2) que 6078SDE av-1 (244 cm2) [figura 14]. Se pueden apreciar tendencias similares para las hojas 10 y 11.

Tabla 6 Tamaño de la hoja L6_GLA 54.122 88.256 10.871 17.358 23.256 L7 GLA 103.157 0.317 213.237 14.083 14.156 16.947 L8_GLA 178.469 0.179 535.126 19.269 12.962 7.623 5.391 L9J3LA 266.844 673.230 18.676 9.724 45.684 L10 GLA 342.756 0.506 1029.389 9.361 1.177 0.455 L11_GLA 383.560 0.374 848.058 7.592 3.098 1.440 L11 DW 1.955 0.522 0.058 12.372 0.000 0.000 SLW L9 L11 50.083 L0.Q3O 17.372 3.073 8.322 0.956 18.041 La Tabla 6, muestra un resumen de los promedios anticipados, valor P y capacidad de herencia de los rasgos del tamaño de la hoja medidos en la cosecha L 11. Se sombrearon con amarillo diferencias significativas (P<0.05), en tanto que las capacidades de herencia >20 se sombrearon con color verde. GLA = área verde de la hoja. DW = peso seco. SLW_L9_L11 = peso de la hoja específico.

La mayor parte de la variación en el área de hoja verde en la cosecha de la Hoja 11, fue debido a diferencias en la generación de vástagos. Sin embargo, las hojas 9 a 11 fueron menores en 6078-1 en comparación con RTx7000. Estas diferencias fueron significativas (P<0.05). Se debe observar que la "generación de vástagos de bajo nivel" y "hojas pequeñas" ambas estuvieron asociadas con la misma región, lo que indica la posibilidad de un solo gen que controla ambos rasgos de la arquitectura de la cubierta.

EJEMPLO 10 Hojas más pequeñas (estudios de mapeo fino en iglú) El número y la longitud de las hojas se correlacionaron en forma lineal con los progenitores de la población de mapeo fino Stg 1 (figura 15). La introgresión de Stg1 en RTx 7000 dio como resultado una reducción en la longitud de las hojas 8 a 10, con L10 siendo el 7% más corta en 6078-1 que RTx7000 (550 vs. 592 mm).

Con propósitos de mapeo, se seleccionaron las "colas" de la población de mapeo fino Stg1 (figura 15). Dos genotipos exhibieron hojas particularmente largas (10604-1-157-5 y 10604-1-318-1) y tres genotipos exhibieron hojas particularmente cortas (10604-1-222-1, 10604-1-501-327-3 y 6078-1).

Se logró la ganancia de función (hoja corta) en 10604-1-222-1 recombinante. Se propone el gen de "hoja pequeña" para mapear la misma región que el gen de "generación de vastago de bajo nivel".

Para propósitos de mapeo, se seleccionaron las "colas" de la población de mapeo fino Stg1 (figura 16). Tres genotipos exhibieron hojas particularmente largas (10604-1-157-5, 10604-1-318-1 y RTx7000) y dos genotipos exhibieron hojas particularmente cortas (10604-1-222-1 y 6078-1).

Incrementando los marcadores, se logró la ganancia de función (hoja corta) en 10604-1-222-1 recombinante. Por lo tanto, una vez más, el gen de "hoja pequeña" mapea la misma región que el gen de "generación de vástagos de bajo nivel". Se debe observar que la longitud de hoja en L9 y L10, mapea la misma región.

Una explicación es un gen simple con múltiples efectos pleyotrópicos. La disponibilidad incrementada de auxina, puede explicar tanto la generación de vástagos de bajo nivel como los fenotipos de tamaño de hoja pequeños observados en plantas que contienen esta región. Se localiza un gen de componente transportador de eflujo de auxina 5 en la región objetivo, y por consiguiente se identifica como candidato.

EJEMPLO 11 El rasgo "siempre verde" incrementa la plasticidad de la arquitectura de la cubierta mediante respuestas constitutivas y de adaptación Se logra la disponibilidad de agua incrementada en la floración mediante el uso de agua reducido debido a dos mecanismos (generación de vástagos reducida y hojas más pequeñas) en plantas que contienen la región Stg1 (figura 17). Ambos mecanismos, en forma individual, parecen reducir el tamaño de la cubierta en aproximadamente 9% en promedio. El mecanismo de "generación de vástagos de bajo nivel" domina en ambientes de baja densidad cuando es alto el potencial de generación de vástagos. El mecanismo de "hoja pequeña", domina en ambientes de alta densidad, cuando es bajo el potencial de generación de vástago. Combinados, estos dos mecanismos proporcionan plantas de cultivo con plasticidad considerable para modificar la arquitectura de la cubierta en respuesta a la severidad de la limitación de agua.

El rasgo siempre verde exhibe respuestas tanto constitutivas como de adaptación (figura 18). El tamaño de la cubierta en Stg1 se reduce en aproximadamente 5%, incluso cuando el agua no está limitada (respuesta constitutiva). El tamaño de la cubierta se reduce en forma adicional (respuesta de adaptación) en una marchitez moderada (-10%) y en marchitez más severa (-15%). La generación de vástago de bajo nivel es una respuesta principalmente constitutiva, aunque el tamaño de hoja más pequeño en generadores de vástago en respuesta al déficit de agua en incremento, es una respuesta de adaptación. El tamaño de hoja más pequeño es una respuesta tanto constitutiva como de adaptación.

EJEMPLO 12 Unión entre el tamaño de cubierta reducido (mediante generación de vástago reducida y hojas más pequeñas) y uso de agua de cultivo reducido en floración. El uso de agua de cultivo reducido en la floración puede utilizarse a través de a) un tamaño de cubierta más pequeño con transpiración equivalente por área de hoja unitaria, b) un tamaño de cubierta equivalente con menor transpiración por área de hoja unitaria, o c) un tamaño de cubierta más pequeño y menor transpiración por área de hoja unitaria. Los estudios ROS y de medición de lisis indican que bajo condiciones de alta tensión de agua, la región Stg1, y en particular el recombinante que contiene el gen candidato Stg1 (10604-5), exhibió menor uso de agua de cultivo debido a un menor tamaño de la cubierta, en lugar de menor transpiración por área de hoja unitaria. Se observaron altas correlaciones (r2 = 0.9) entre el tamaño de la cubierta y el uso de agua de cultivo, en estudios ROS y de medición de lisis. (a) Ahorros de agua debido a tamaño de hoja más pequeño La generación de vástago fue insignificante en este experimento debido a la alta densidad de cultivo. Por lo tanto las diferencias en el tamaño de la cubierta fueron debido a diferencias en el tamaño de la hoja (figura 20), tal como queda claro mediante la alta correlación entre el tamaño de la hoja 12 y el área de hoja verde total en la floración (figura 21).

A su vez, el área de hoja verde en la floración estuvo altamente correlacionado con el uso de agua en el cultivo en la floración (figura 22). En forma relativa a RTx7000, las dos líneas que contienen el gen candidato Stg1 (6078-1 y 10604-5), ambas exhibieron hojas más pequeñas (L10-L13), menor área de hoja verde en la floración (GLAA) y menor uso de agua de cultivo en la floración. (b) Ahorros de agua debido a transpiración reducida por área de hoja unitaria (estudios de asimetría) La transpiración (T) es el producto del área de la hoja (LA) y la transpiración por área de la hoja (T/LA). Bajo condiciones de alta VPD, LA fue similar entre Stg1 y RTx7000 (11795 vs 11628 cm2), aunque T/LA fue menor en Stg1 que Tx7000 (2.60 vs 2.85), dando como resultado un menor uso de agua por planta (T) en Stg1 que en RTx7000 (30.7 vs 32.8 1). Por lo tanto los ahorros de agua en Stg1 (en un ambiente de alta VPD) se lograron completamente a través de una reducción en T/LA, lo que sugiere que ésta es un estrategia de conservación de agua constitutiva conferida por Stg1. En este caso, la eficiencia de transpiración mayor (TE) en Stg1, fue una consecuencia de la biomasa equivalente y la transpiración de bajo nivel.

Un análisis más amplio en comparación con las cuatro QTL Stg (Stg1, Stg2, Stg3 y Stg4) con RTx7000 ayuda a poner en perspectiva la respuesta Stg1. Bajo condiciones de alta VPD, T/LA estuvo correlacionada en forma positiva con T. Sin embargo, bajo condiciones de baja VPD, T/LA estuvo correlacionada en forma negativa con T (r2 = 0.52). El área de hoja verde y la transpiración estuvieron correlacionadas en forma positiva tanto bajo condiciones de baja como alta VPD (figura 22). En ambos experimentos, las QTLs redujeron el área de hoja verde y la transpiración en comparación con RTx700G. (c) Ahorros de agua debido al área de la hoja reducida La transpiración (T) es el producto de LA y T/LA. Bajo condiciones de baja VPD, LA fue el 31% menor en Stg1 que RTx7000 (4898 vs 7082 cm2). Esto se compensó ligeramente mediante un incremento del 9% en T/LA en Stg 1 en comparación con RTx7000 (5.15 vs 4.70). El resultado neto fue una reducción del 22% en el uso de agua por planta (T) en Stg1, en comparación con RTx7000 (25.6 vs 32.71), principalmente debido al tamaño de cubierta reducido. El incremento en T/LA exhibido por Stg1, puede ser por sí mismo un mecanismo de adaptación a la marchitez, mediante el enfriamiento de la hoja y permitiendo que continúe la fotosíntesis.

La plasticidad en T/LA parece ser particularmente importante en la regulación del estado de agua de la planta.

Bajo condiciones de alta VPD, la T/LA reducida en Stg1, fue el mecanismo clave para reducir T e incrementar TE. Bajo condiciones de baja VPD, T/LA incrementada en Stg1, pudo haber contribuido al mantenimiento de la función de la hoja mediante enfriamiento.

Los estudios de medición de lisis en un subconjunto de mapeo fino Stg1 proporcionan una visión adicional en esta región. Bajo condiciones de alta VPD, LA por planta fue menor en 10604-5 (ubicación del gen candidato Stg1) que RTx7000 (10283 vs 1.1628 cm.2), aunque T/LA fue equivalente en 10604-5 y RTx7000 (~2.86), dando como resultado un menor uso de agua por planta en 10604-5 que RTx7000 (28.0 vs 32.8 1). Por lo tanto, los ahorros de agua en 10604-5 se lograron completamente a través de una reducción en el tamaño de la cubierta.

Bajo condiciones de baja VPD, LA por planta fue menor en todas las líneas Stg1 en comparación con RTx7000, dando como resultado ahorros de agua en todas las líneas Stg1. Por consiguiente, fue difícil mapear en forma fina esta región, ya que todos los recombinantes respondieron en forma similar a 6078-1. (d) Simulación de Agronomía Macho plantado en 5 plantas/m2 con un espaciamiento de fila de 1 m. Profundidad de tierra = 1800 mm; PAWC de tierra = 324mm; N no limitante. Los resultados se muestran en las figuras 56A a C.

Tratamientos HT Generación de vástagos de alto nivel (2 generadores de vástago/planta) LT Generador de vástago de bajo nivel (1 generador de vástago/planta) WW Bien regado (Iniciando con perfil al 100% y alimentación de lluvia) TS Tensión Terminal (Comenzando con perfil a la mitad [162mm] y sin lluvia después del establecimiento).

EJEMPLO 13 También se puede lograr la disponibilidad de agua incrementada en la floración mediante la capacidad de acceso de agua incrementada debido a una mejor extracción de agua y/o dispersión lateral más profunda o mayor de las raíces en plantas que contienen la región Stg1 La masa de la raíz y la proporción de raíz/brote (figura 23) fueron mayores en Stg1 que RTx7000 en la etapa de Hoja 6. Hubo una segregación de transgresión considerable para estos rasgos en la población de mapeo fino Stg1. La relación entre la masa de raíz y la proporción de raíz: brote indica la oportunidad de adelanto genético adicional en estos rasgos.

Se puede utilizar la proporción de masa de raíz por área de hoja como un índice de adaptación de marchitez en la etapa de siembra, ya que integra la capacidad de la planta para accesar al agua (masa de raíz) con la capacidad de la planta para utilizar el agua (área de la hoja). Un índice superior indica una mayor capacidad de accesar agua por área de hoja unitaria. Stg1 exhibió una mayor proporción de masa de raíz por área de hoja relativa a RTx7000, debido tanto a una mayor masa de raíz como a una menor área de la hoja.

La mayor proporción de masa de raíz por área de hoja exhibida por Stg1 en la etapa L6, puede explicar porque utiliza más agua en el crecimiento temprano del cultivo (20 a 50 DAE) en comparación con RTx7000 bajo el tratamiento LWLD (figura 24). No está claro aún si la capacidad de acceso de agua incrementada durante el llenado de grano exhibido por Stg1 en comparación con RTx7000 (figura 24) fue debido a una mejor extracción de agua y/o mayor dispersión de raíz.

En un experimento de cámara de raíz en Gatton, Queensland, Australia (Van Oosterom et al., 2010 supra), el límite interior gravimétríco de la extracción de agua fue 0.26% menor para híbridos A35 (rasgos siempre verde) que AQL39 (senectud). A35 contiene la región Stg1, mientras que AQL39 no. Asumiendo una necesidad de volumen de 1.3 g cm-3 y una profundidad de tierra de 150 cm, esto podría incrementar potencialmente el agua disponible en el campo en >5 mm a lo largo del ciclo de vida del cultivo.

EJEMPLO 14 El rasgo 'siempre verde' incrementa la biomasa por área de hoja unitaria en la floración. Asumiendo que la masa de raíz es equivalente (o al menos no significativamente menor), estas dif rencias pueden ser explicadas mediante las diferencias en transpiración por área de hoja unitaria y/o eficiencia de transpiración La biomasa del tallo principal por área de hoja unitaria (B/LA) en la floración, fue del -24% mayor en Stg1 que RTx7000 bajo condiciones de baja tensión de agua (35.2 vs 26.2 g/m2/cm2) y alta tensión de agua (40.6 vs 31.4 g/m2/cm2) (Tabla 7). La B/LA del tallo principal en la floración fue del ~14% mayor bajo condiciones de alta tensión de agua que bajo condiciones de baja tensión de agua tanto para Stg1 como para RTx7000, es decir, B/LA incrementó con un déficit de agua. Se debe observar que el B/LA del generador de vástago fue equivalente en Stg1 y RTx7000 en condiciones de baja tensión y alta tensión de agua.

Tabla 7 La Tabla 7 muestra la biomasa del tallo principal, generador de vástagos y total por área de hoja de RTx7000 (progenitor recurrente) y un número de líneas casi isogénicas que contienen varias introgresiones Stg1 crecidas en alta y baja tensión de agua en Biloela, Queensland, Australia.

Las medidas detalladas del uso de agua sugieren que la mayor biomasa por área de hoja unitaria observada en las líneas Stg1 en Biloela se debió probablemente a una mayor transpiración por área de hoja unitaria en lugar de en TE.

Baja tensión de agua Stg1 y RTx7000 mostraron B/LA equivalente en baja tensión de agua. Sin embargo, T fue el ~7% menor en Stg1, debido al ~10% menor de T/LA, lo cual, a su vez, incrementó TE en un ~9% (figura 45). Por consiguiente, Stg1 mantuvo la biomasa, pero utilizó menos agua en comparación con RTx7000. Alta tensión de agua En alta tensión de agua, B/LA fue el ~6% mayor en Stg1 en comparación con RTx7000. B/LA se correlacionó en forma positiva con T/LA pero no con TE. Por lo tanto, la B/LA mayor mostrada por Stg1, se debió a la T/LA mayor. En general, B/LA se correlacionó en forma positiva con T/LA y se correlacionó en forma negativa con TE en alta tensión de agua.

En este caso, Stg1 utilizó el ~22% menos de agua que RTx7000 durante el período previo a la floración. Por consiguiente, Stg1 puede tener significativamente más agua disponible para el llenado del grano, a pesar de la biomasa inferior en la floración.

EJEMPLO 15 La TE incrementada por la introgresión de Stg1, puede ser debido a, a) capacidad fotosintética proporciona/mente mayor en comparación con conductancia estomatal, debido a hojas más pequeñas, más delgadas y más verdes, o b) una disminución en la transpiración por área de hoja, manteniendo al mismo tiempo la biomasa por área de hoja En la población de mapeo fino Stg1, la longitud y verdor (SPAD) de la hoja 10, estuvieron correlacionados en forma negativa (r2 = 0.72, figura 25). Por lo tanto, la disminución en el tamaño de la hoja en esta población incrementó la concentración de nitrógeno en la hoja. La introgresión de Stg1 en un trasfondo RTx7000 disminuyó la longitud L10 en un ~7% (de 592 a 550 mm) e incrementó L10 SPAD en un -4% (de 47.1 a 48.9).

Las hojas más verdes pueden incrementar la capacidad fotosintética, y por consiguiente, la eficiencia del uso de agua. En un subconjunto de la población de mapeo fino Stg1, la fotosíntesis incrementó con el valor SPAD hasta que alcanzó una meseta en un SPAD de ~48.5 (figura 26). Sin embargo, la línea (6078-1) con el valor SPAD más alto (51.6) exhibió un rango de fotosíntesis relativamente bajo (32.1 MJ/m /d). Este resultado es ya sea a) anómalo, o b) indica una disminución real en la fotosíntesis en altos valores SPAD.

El verdor (SPAD) y WUE de la hoja (con base en un índice calculado por el software Licor) estuvieron correlacionados en forma positiva en un subconjunto de la población de mapeo fino Stg1 (figura 27). Ninguna de las introgresiones Stg1 alcanzó el valor de 6078-1 (0.8), a pesar del SPAD relativamente alto en las líneas isogénicas 10604-5 y 10709-5 (NlLs).

En comparación con RTx7000 y otras QTLs Stg, Stg1 exhibió una hoja más verde (valor SPAD superior) y una WUE superior (con base en un índice calculado por el software Licor) [figura 28].

EJEMPLO 16 La TE incrementada por la introgresión de Stg1, puede ser debido a a) capacidad fotosintética proporcionalmente mayor en comparación con conductancia estomatal , debido a hojas más pequeñas, más delgadas y más verdes, o b) una disminución en la transpiración por área de hoja, manteniendo al mismo tiempo la biomasa por área de hoja La eficiencia de transpiración (TE) estuvo correlacionada en forma negativa con la transpiración por área de hoja (T/LA) en condiciones de baja y alta VPD (figura 29) en un conjunto de NlLs Stg, incluyendo el progenitor recurrente (RTx7000). Sin embargo, la clasificación de las NlLs Stg relativa a RTx7000 interactúo con las condiciones VPD. Por ejemplo, T/LA en Stg 1 fue menor en forma relativa a RTx7000 en condiciones de alta VPD, aún mayor que RTx7000 en condiciones de baja VPD.

En condiciones de alta VPD, la pendiente de la correlación negativa entre T/LA y TE fue pronunciada, de modo que una ligera disminución en T/LA de 2.9 mm/cm2 (Stg4) a 2.6 mm/cm2 (Stg1) dio como resultado un incremento significativo en TE de 4.2 g/m2/mm (Stg4) a 5.1 g/m2/mm (Stg1) [figura 29]. El gradiente fue menos pronunciado en condiciones de baja VPD, de modo que se requirió una disminución de seis veces más en T/LA por incremento unitario en TE, en comparación con condiciones de alta VPD (1.2 vs 0.2 unidades). Se debe observar que para una TE equivalente, Stg1 exhibió una T/LA mayor que RTx7000 (5.1 vs 4.6 mm/cm2) en una baja VPD. Esto puede proporcionar un mecanismo para qüe las hojas Stg 1 permanezcan más frías bajo ciertas condiciones ambientales.

EJEMPLO 17 Los cambios en transpiración por área de hoja unitaria pueden ser debido a, a) número de estomas, b) apertura de estomas, c) cambios en la sincronización de la abertura y cierre estomatal en forma relativa a VPD, y/o d) número de células de base ciliada (lo cual afecta la capa de límite y por lo tanto TLA).

La introgresión de Stg 1 en RTx7000 afectó en forma diversa a T/LA, dependiendo de las condiciones VPD. En forma relativa a RTx7000, Stg1 incrementó T/LA en un ~9% en baja VPD, y disminuyó T/LA en un ~10% en alta VPD. Entre otras cosas, T/LA, puede regularse mediante a) el número de estomas por área de hoja unitaria, b) el tamaño de apertura estomatal, c) la sincronización de la abertura y cierre estomatal, y/o d) el número de células de base ciliada (que afecta la capa de límite y por lo tanto T/LA). Se han realizado las medidas de dos de estos cuatro componentes (a y d). En un experimento de resguardo contra la lluvia, se recolectaron hojas individuales del tratamiento de alta densidad dentro del control irrigado, se eliminaron las cutículas, y se tomaron las imágenes de la superficie de la cutícula. Estas imágenes se utilizaron para determinar a) el número de estomas por área de hoja unitaria, b) el número de células epidérmicas por área de hoja unitaria, y c) el número de células de base ciliada por área de hoja unitaria.

Al mismo tiempo, se tomaron secciones de la hoja transversales. Los análisis preliminares de estos datos indican que la introgresión de Stg1 en RTx7000, modificó la anatomía de la hoja. Las diferencias en la morfología de las hojas (por ejemplo, Hojas 7 y 10) se pueden apreciar entre RTx7000 y Stg1. En este caso, hubo más envolturas de paquete y más pequeñas rodeando el paquete vascular en Stg1. El número de células incrementado en la envoltura de paquete, también debe contribuir a la asimilación fotosintética incrementada (PNAS 2007), y por lo tanto TE.

EJEMPLO 18 El uso de agua incrementado durante el llenado del grano se logra mediante (i) disponibilidad de agua incrementada en la floración y (ii) disponibilidad de agua incrementada (mejor extracción de agua y dispersión lateral más profunda o mayor) durante el llenado del grano a) Disponibilidad de agua incrementada en floración El uso de agua de cultivo (CWU) antes de la floración, estuvo correlacionado en forma negativa con CWU después de la floración en el experimento ROS (figura 30). Por ejemplo, el ahorrar 20 mm de agua antes de la floración (165 vs 185 mm), habilitó la utilización de 20 mm adicionales después de la floración (80 mm vs 60 mm). Por lo tanto, toda el agua conservada antes de la floración, fue utilizada por el cultivo después de la floración. En general, un incremento del 25% en el uso de agua después de la floración en este experimento, dio como resultado un incremento del 25% en la producción de grano (400 vs 300 g/m2). Esto se tradujo en 50 kg/ha de grano por cada mm adicional de agua disponible. Aunque estos datos soportan el concepto de que se logra el uso de agua incrementada durante el llenado del grano mediante una disponibilidad de agua incrementada en la floración, no explica con respecto a la capacidad de acceso de agua incrementada durante el llenado del grano. b) Accesibilidad al agua incrementada durante el llenado del grano Stg1 exhibió un uso de agua incrementado durante el período de llenado del grano en tratamientos tanto de baja como de alta densidad en el experimento ROS. Esto se debió principalmente a (i) disponibilidad de agua incrementada en floración en alta densidad, y (ii) capacidad de acceso de agua incrementada durante el llenado del grano en baja densidad (figuras 31A y B).

En un estudio de RTx7000 y cuatro NlLs Stg (Stg1, Stg2, Stg3 y Stg4), CWU antes y después de la floración, estuvo correlacionada en forma negativa en un experimento ROS en condiciones de baja densidad (figura 32). En este caso, el ahorro de ~25 mm de agua antes de la floración (168 vs 191 mm), contribuyó a la utilización de -50 mm después de la floración (135 mm vs 86 mm), indicando que tanto la disponibilidad (~25 mm) como la capacidad de acceso (~25 mm) de agua incrementada fueron igualmente importantes. Sin embargo, Stg1 fue anómalo en este ejemplo, ya que un uso de agua de alto nivel después de la floración, estuvo asociado con un uso de agua de alto nivel antes de la floración. Las explicaciones para esta anomalía en Stg1, son a) un error en los datos de agua pre-floración, b) un error en los datos de agua post-floración, o c) sin errores en la medida de agua (Stg1 simplemente respondió en forma diferente a otras NlLs). Una revisión de los datos de biomasa revela que, por alguna razón, Stg1 produjo mayor biomasa antes de la floración en LWLD en comparación con las otras NlLs, lo que sugiere que los patrones de uso de agua previos a la floración simplemente reflejaron una producción de biomasa en este experimento. Sin embargo, este ejemplo no proporciona evidencia de la capacidad de acceso de agua incrementada por Stg1 durante el período de llenado del grano.

EJEMPLO 19 Unión entre la producción de biomasa pre y postfloración En baja densidad (LD), la reducción de la biomasa prefloración en un 23% (de 700 a 640 g/m2) incrementó la biomasa postfloración en más del doble (de ~200 a 425 g/m2).

En LD, Stg1 produjo una biomasa pre-f loración similar a RTx7000 (~610 g/m2), produciendo aún menos biomasa postfloración (265 vs 327 g/m2). Sin embargo, en HD, Stg 1 y RTx7000 produjeron una biomasa pre-floración similar (~840 g/m2), produciendo Stg 1 aún más biomasa postfloración (195 vs 17 g/m2).

La relación entre GLAA y la proporción de biomasa pre:post floración es importante en la historia de Stg1. GLAA debe cortarse nuevamente a <3 para asegurar una adecuada disponibilidad de agua para el llenado del grano, y este es un desempeño importante del gen Stg1. En este experimento, Stg1 redujo GLAA en forma adecuada para lograr una proporción de biomasa pre:post floración de <3 en LD, pero no en HD. En HD, se debe observar que la introgresión de Stg1 en RTx7000 redujo GLAA de 31200 a 29300 cm2/m2, reduciendo la proporción de biomasa pre:post floración de 8.2 a 6.5 (pero aún no a <3). Esto indica la importancia de las estrategias de manejo adecuadas tal como densidad de cultivo en la maximización de los recursos de agua limitados.

La relación negativa entre GLAA y la masa del tallo posterior a la floración, también es importante para la historia de Stg1. La GLAA más baja, y por lo tanto el uso de agua reducido en la floración, estuvo asociado con una mayor masa del tallo posterior a la floración (un componente de resistencia a la fijación). La introgresión de Stg1 en RTx7000 incrementó la masa del tallo posterior a la floración, en condiciones tanto LD (incremento marginal) como HD (incremento significativo).

La relación entre la proporción de biomasa pre:post floración (PPBR) y la biomasa post-floración es instructiva. Los dos tratamientos de densidad proporcionan una continuidad en el rango de PPBR de <2 a >8. Al reducir PPBR de >8 a -3, se obtiene como resultado un incremento gradual en la biomasa post-floración. Sin embargo, la reducción en forma adicional de PPBR debajo de 3, dio como resultado un incremento relativamente pronunciado en la biomasa postfloración, presumiblemente debido a que estuvo disponible más agua durante el llenado del grano cuando la proporción PPBR cayó debajo de 3. La introgresión de Stg 1 en RTx7000 incrementó la biomasa posterior a la floración bajo HD pero no LD.

La relación entre la proporción de biomasa pre:post floración (PPBR) y la masa del tallo postfloración, es igualmente instructiva. La masa del tallo postfloración es un componente de la resistencia a la fijación. El análisis de este componente proporciona cierta comprensión de como las introgresiones Stg afectan la resistencia a la fijación. Al reducir PPBR de >8 a ~4, se obtiene como resultado un incremento gradual en la masa del tallo postfloración. Sin embargo, al reducir en forma adicional PPBR debajo de 4, proporciona como resultado un incremento relativamente pronunciado en la masa del tallo postfloración. La introgresión de Stg1 en RTx7000 incrementó la masa del tallo postfloración, en condiciones tanto LD (incremento marginal) como HD (incremento significativo).

La relación entre PPBR y la producción del grano fue menos clara en este experimento. Aunque la producción de grano fue mayor en Stg1 que RTx7000 bajo ambas densidades, una mayor producción se puede explicar únicamente por la PPBR inferior en Stg1 en condiciones HD.

Se revisaron dos introgresiones Stg1 en este experimento. a) 6078-1 (toda la región Stg1), y b) 10946-5 (una cubierta recombinante de aproximadamente 1/3 de la región Stg1 entre los marcadores Sb03QGM116 y Sb03QGM106).

La reducción de la biomasa prefloración en un 20% (de 920 a 735 g/m2) incrementó la biomasa postfloración en aproximadamente 100% (de 200 a 400 g/m2) [figura 40]. En general, la biomasa prefloración en RTx7000 = Stg2>Stg3 = Stg4>Stg1 y la biomasa postfloración en Stg1 >Stg3 = Stg4>Stg2 RTx7000.

El tamaño de la cubierta, tal como queda claro mediante GLAA, determinó en gran medida la proporción de la biomasa pre:post floración (figura 34). En tratamientos tanto de alta como baja densidad, la introgresión de Stg1 en un trasfondo RTx7000 redujo GLAA, lo cual a su vez, redujo la proporción de la biomasa pre:post floración a <3, asegurando una adecuada disponibilidad de agua para el llenado de grano en estas condiciones con limitación de agua.

El tamaño de la cubierta, tal como queda claro mediante GLAA, fue un determinante de la masa del tallo postfloración (PASM) [figura 35]. Bajo tratamientos tanto de baja como de alta densidad, la introgresión de Stg1 o Stgla en un trasfondo RTx7000 redujo GLAA, lo cual a su vez, incrementó PASM. Aproximadamente 40 g/m2 más reservas de tallo, fueron utilizadas en HD en comparación con LD, lo que refleja una mayor tensión impuesta por este tratamiento.

La relación entre la proporción de biomasa pre:post floración (PPBR) y la biomasa postfloración (PAB) fue fuerte (figura 36). Los dos tratamientos de densidad proporcionan una continuidad dentro del rango de PPBR de <1.5 a >4. Al reducir PPBR de ~4.5 a ~3.5, no se tuvo impacto en PAB. Sin embargo, la reducción adicional de PPBR debajo de ~3.5 dio como resultado un incremento relativamente pronunciado en PAB, presumiblemente debido a que no está disponible más agua durante el llenado del grano cuando la proporción PPBR cae debajo de 3.5. La introgresión de Stg1 en RTx7000 disminuyó PPBR debajo de 3 en HD y LD, incrementando de esta forma PAB en ambos tratamientos de densidad.

La proporción de biomasa pre:post floración (PPBR) también afectó la resistencia a la fijación (figura 37). En este caso, se utilizó la masa de tallo postfloración (PASM) como un sustituto de la resistencia a la fijación. En altas y bajas densidades, PPBR estuvo correlacionado en forma negativa con la biomasa de tallo postfloración. Esto es, una alta proporción de biomasa pre:post floración incrementó la cantidad de reservas de tallos removilizadas durante el llenado del grano, reduciendo de esta forma la biomasa del tallo e incrementando la probabilidad de fijación. En comparación con RTx7000, Stg1 redujo en forma significativa la cantidad de reservas de tallo movilizadas en LD (~5 vs 65 g/m2) y HD (-80 vs 140 g/m2). En comparación con RTx7000, Stg 1 redujo en forma significativa la cantidad de reservas de tallo movilizadas en HD (~80 vs 140 g/m2), pero no LD. El grado de las reservas de tallo movilizadas fue mayor en HD que en LD, reflejando un mayor déficit de agua en HD. Por ejemplo, la diferencia en la movilización de reserva del tallo entre HD y LD fue del doble en RTx7000 (aproximadamente 140 vs 70 g/m2).

La producción de grano permaneció baja (en una medida comparativa de ~4.2 t/ha) hasta que la proporción de biomasa pre:post floración cayó debajo de ~3 (HD) o ~2.5 (LD) [figura 38]. Debajo de estos valores críticos, la producción de grano incrementó significativamente en cada reducción en incremento en estas proporciones, con el rango de incremento en la producción de grano siendo ligeramente mayor en LD que en HD. Esto sugiere que la disponibilidad de agua posterior a la floración estuvo relacionada cercanamente con la GLAA y biomasa prefloración, y que se requirió una cierta reducción en GLAA para asegurar una disponibilidad de agua adecuada para el llenado del grano. Bajo ambas densidades, Stg1 redujo la proporción de biomasa pre:post floración debajo de los niveles críticos, dando como resultado incrementos en la producción de 28% (LD) y 22% (HD), en forma relativa a RTx7000. Estos datos proporcionan una unión crítica entre la acción del gen Stg1 (tamaño de cubierta reducida en la floración) y la producción de grano bajo una marchitez terminal. Se debe observar que la introgresión de Stgla tuvo cierto impacto en la reducción de PPBR (HD y LD) y una producción de grano en incremento (LD únicamente) en forma relativa a RTx7000, pero no en el mismo grado que Stg1. Por lo tanto, no existe una fuerte evidencia a partir de este experimento, de que el gen Stg1 clave reside adentro de la región Stgla. Esto soporta la evidencia presentada anteriormente, ya que el candidato más fuerte para Stg1 (SbPIN4), se localiza arriba de la introgresión Stgla.

Se revisaron cuatro introgresiones Stg1 en este experimento: a) 6078-1 (la región Stg1 total); b) 10709-5 (una cubierta recombinante de aproximadamente 1/3 de la región Stg1); c) 10604-5 (una cubierta recombinante de aproximadamente 3/4 de la región Stg1); y d) 10568-2 (una cubierta recombinante casi del 1/2 de la región Stg1).

En una baja densidad (LD), la biomasa prefloración varió únicamente en -5% (de 522 a 552 g/m2) entre los genotipos, aún la biomasa posterior a la floración varió casi dos veces (de 173 a 313 g/m2). Esto sugiere que las diferencias considerables en la biomasa postfloración fueron afectadas por algo además de la biomasa prefloración, por ejemplo, las diferencias en capacidad de acceso de agua. Por ejemplo, 10709-5 y RTx7000 produjeron ambos -550 g/m2 de biomasa prefloración, en donde Stg 1 recombinante (10709-5) produjo el ~60% más de biomasa postfloración .

En alta densidad (HD), la biomasa pre y postfloración estuvieron altamente correlacionadas en forma negativa. La introgresión de Stg1 en RTx7000 redujo la biomasa prefloración en un 9% e incrementó la biomasa postfloración en un 23%.

El uso de agua para cosecha (CWU) en la floración, se diferenció de mejor manera entre los genotipos que en la biomasa prefloración. Al combinar los datos HD y LD, la biomasa postfloración (PAB) permaneció baja (en una medición comparativa de ~150 g/m2) hasta que el CWU en la floración cayó debajo de ~180 mm. Debajo de este valor crítico, PAB incrementó en cada reducción en incremento en CWU debajo de un nivel de 175 mm, con una meseta de PAB en aproximadamente 310 g/m2. Las reducciones adicionales en CWU en la floración debajo de 175 mm, no dieron como resultado un PAB adicional.

El tamaño de la cubierta, tal como se evidencia mediante GLAA, determinó en gran medida la proporción de la biomasa pre:post floración (PPBR). Bajo los tratamientos tanto de alta como de baja densidad, la introgresión de Stg1 (o recombinantes particulares tales como 10709-5) en un trasfondo RTx7000, redujo GLAA, lo cual a su vez, redujo la proporción de la biomasa pre:post floración, incrementando de esta forma la disponibilidad de agua para el llenado del grano bajo estas condiciones con limitación de agua. El valor PPBR para 6078-1 parece ser anómalo (demasiado alto) ya que este genotipo se coloca bien arriba de la línea de regresión GLAA/PPBR.

El tamaño de la cubierta, tal como se evidencia mediante GLAA, fue un determinante de la masa de tallo postfloración (PASM). Bajo el tratamiento de alta densidad, la introgresión de Stg1 (o recombinantes Stg1, tales como 10604-5 y 10709-5) en un trasfondo RTx7000, redujo GLAA, lo cual a su vez, incrementó PASM. Aproximadamente, 60 g/m2 más de reservas de tallo fueron utilizadas en HD, en comparación con LD, lo que refleja una mayor tensión impuesta por este tratamiento.

Fue fuerte la relación entre la proporción de biomasa pre:post floración (PPBR) y la biomasa postfloración (PAB). Los dos tratamientos de densidad proporcionan una continuidad en el rango de PPBR de <2 a >5, aunque fue mayor la pendiente de regresión para LD que para HD. En HD, la reducción PPBR de ~6 a -3.5, dio como resultado un incremento gradual en PAB de -130 g/m2 (RTx7000) a -180 g/m2 (10604-5). Al reducir en forma adicional PPBR debajo de -3 en LD, se obtuvo como resultado un incremento más pronunciado en PAB, presumiblemente debido a que estuvo disponible más agua durante el llenado del grano cuando la proporción PPBR cayó debajo de 3.

La proporción de biomasa pre:post floración (PPBR) también afectó la resistencia a la fijación. En este caso, se utilizó la masa del tallo postfloración (PASM) como un substituto de la resistencia a la fijación. En densidades tanto altas como bajas, PPBR se correlacionó en forma negativa con la biomasa de tallo postfloración. Esto es, una alta proporción de biomasa pre:post floración, incrementó la cantidad de reservas del tallo removilizadas durante el llenado del grano, reduciendo de esta forma una biomasa del tallo e incrementando la probabilidad de fijación. En comparación con RTx7000, Stg 1 redujo en forma significativa la cantidad de reservas de tallo movilizadas en HD (-100 vs 160 g/m2). El grado de reservas de tallo movilizadas, fue mayor en HD que en LD, lo que refleja un mayor déficit de agua en HD. Por ejemplo, la diferencia en la movilización de reserva de tallo entre HD y LD, fue más del doble en RTx7000 (aproximadamente 160 vs 60 g/m2). En forma interesante, PASM incrementó con la disminución de PPBR en un rango total de PPBR (1.5 a 6), en tanto que la producción del grano, y en un menor grado PAB, únicamente incrementó cuando PPBR cayó debajo de -3. Esto sugiere que los ahorros de agua relativamente pequeños antes de la floración, aún tuvieron la capacidad de mejorar la resistencia a la fijación, aunque se requirieron mayores ahorros de agua antes de que respondiera la producción de granos.

La producción de grano permaneció baja (en una medición comparativa de -3.1 t/ha) hasta que la proporción de biomasa pre:post floración cayó debajo de ~3. Debajo de este valor crítico, la producción de grano incrementó significativamente en cada reducción en incremento en esta proporción. Ya que ninguna de las introgresiones Stg1 redujo el PPBR a <3 en HD, no se consideraron beneficios de producción por Stg1 en este tratamiento. En LD, alguna de las introgresiones Stg1 redujeron PPBR debajo del nivel crítico, dando como resultado incrementos en la producción de 12% (10568-2) y 5% (10709-5), en forma relativa a RTx7000. Estos datos proporcionan una unión crítica entre la acción del gen Stg1 (tamaño de cubierta reducido en la floración) y una producción de grano bajo marchitez terminal.

CWU durante el llenado del grano permaneció bajo (en una medición comparativa de ~60 mm) hasta que la proporción de biomasa pre:post floración cayó debajo de -3.5 (figura 39). Debajo de este valor crítico, CWU durante el llenado del grano incrementó significativamente para cada reducción en esta proporción. Ya que ninguna de las introgresiones Stg1 redujo la PPBR a <3.5 en HD, no se consideraron incrementos en CWU durante el llenado del grano a partir de los recombinantes Stg1 en este tratamiento. En LD, algunas de las introgresiones Stg1 (y RTx7000) redujeron PPBR debajo de este nivel crítico, incrementando CWU durante el llenado del grano hasta ~80 mm, en comparación con la línea de base HD (-60 mm).

La relación entre CWU durante el llenado del grano y la producción de grano, fue positiva (figura 40). Sin embargo, la correlación entre estos parámetros fue relativamente baja (r2 = 0.23), probablemente debido a la naturaleza altamente variable de las medidas en el campo de agua en la tierra.

EJEMPLO 20 La senectud de hoja retardada (siempre verde) es una consecuencia del estado de agua en la planta superior durante el llenado del grano (debido al uso de agua incrementado) El estado de agua de la planta se determinó en FL-2 (dos hojas debajo de la etiqueta) en el llenado de grano medio utilizando dos metodologías: potencial de agua en la hoja (LWP) y contenido de agua relativo (RWC). LWP se midió en el campo con una bomba de presión. Después de la determinación de LWP en el campo, se colocó en hielo una muestra de la misma hoja, y en algunos minutos, se llevó a un laboratorio externo a unos 300 m para la determinación de RWC a través de métodos estándar.

El RWC de FL-2 estuvo correlacionado en forma negativa con el rango relativo de senectud de la hoja en el llenado del grano medio en densidades tanto altas como bajas en un conjunto de NlLs Stg incluyendo el progenitor recurrente. Las correlaciones para HD y LD fueron paralelas, aunque la compensación en aproximadamente 0.35 unidades de la senectud de la hoja, es decir, para un nivel determinado de RWC, es decir, 70, los rangos relativos de senectud de la hoja fueron de 2.1 y 2.45 para LD y HD, respectivamente. La introgresión de la región Stg1 en RTx7000 incrementó RWC en un llenado de grano medio (FL-2) y disminuyó el rango relativo de senectud de la hoja tanto en HD como en LD, aunque el impacto fue mayor en HD.

A su vez, el rango relativo de senectud de la hoja estuvo correlacionado en forma negativa con el área de hoja verde en la madurez (GLAM) en HD y LD (figura 49), con mayores rangos de senectud de la hoja exhibidos en HD. Stg1 produjo más de dos veces tanto GLAM como RTx7000 en HD (2106 vs 859 cm2/m2) y 19% más de GLAM en LD (2145 vs. 1725 cm2/m2), ver también figura 42.

EJEMPLO 21 La resistencia a la fijación incrementada es una consecuencia del estado de agua en la planta superior durante el llenado de grano (debido al uso de agua incrementado) La masa del tallo superior en la madurez, es un componente de la resistencia a la fijación. RWC en el llenado de grano medio (FL-2) estuvo correlacionado en forma altamente negativa con la masa del tallo en la madurez, en un conjunto de NlLs Stg crecido bajo condiciones con limitación de agua en dos densidades de cultivo (figura 43). La introgresión de Stg 1 en RTx7000, incrementó RWC en el llenado de grano medio (FL-2) y la masa del tallo en la madurez en HD y LD, con un impacto mayor en HD. En forma relativa a RTx7000, Stg 1 incrementó la masa del tallo en la madurez en un 9% en LD (224 vs. 203 g/m2) y 29% en HD (286 vs. 204 g/m2). Por lo tanto, el beneficio de Stg1, en términos de resistencia a la fijación, incrementó con el nivel de déficit de agua.

La biomasa posterior a la floración está comprendida principalmente de, a) masa de tallo postfloración (PASM), una medida de la movilización de reserva del tallo y un componente de la resistencia a la fijación, y b) producción de grano. Los productores de granos requieren que se maximice tanto la producción del grano como la resistencia a la fijación, es decir, no desean que suceda una cosa a expensas de la otra. La masa de tallo posterior a la floración estuvo correlacionada en forma altamente lineal con PAB bajo condiciones HD y LD (figura 44). Aunque Stg1 tuvo poco impacto en PASM bajo una marchitez moderada (LD), la cantidad de masa seca translocada del tallo durante el llenado del grano, fue mucho menor en Stg1, en comparación con RTx7000 (85 vs. 139 g/m2) en la marchitez más severa (HD). Esto dio como resultado una mayor masa del tallo en la madurez en Stg1 en forma relativa a RTx7000 (286 vs. 204 g/m2), lo cual a su vez, debe tener resistencia a la fijación incrementada.

Aunque las correlaciones entre PASM y PAB fueron altas en HD y LD (figura 43), las correlaciones entre la producción de grano y PAB, fueron bajas en ambas densidades (figura 44). Las introgresiones de Stg1 en RTx7000, incrementaron la producción de grano en HD y LD, aunque PAB únicamente fue mayor en HD. Se debe observar que se logró una mayor producción de grano en Stg1 en comparación con RTx7000 (290 vs. 184 g/m2) en HD, con reservas de tallo significativamente menores en Stg1 que en RTx7000 (85 vs. 139 g/m2), lo que indica que la demanda de carbono durante el llenado del grano, fue cumplida en gran parte mediante la fotoasimilación actual y las reservas del tallo en Stg1 y RTx7000, respectivamente.

La negociación potencial entre PASM y la producción de granos se señala en la figura 45. En HD, Stg1 logró la mayor producción de grano de cualquier introgresión (290 g/m2), mientras se mantienen las pérdidas del tallo en 85 g/m2. En forma relativa a RTx7000, Stg1 optimizó la negociación entre PASM y la producción de grano. Las reducciones adicionales en la utilización de reserva de tallo mediante Stg24 (38 g/m2), dieron como resultado una menor producción de grano (263 g/m2). En LD, Stg1 también logró una alta producción de grano en forma relativa a RTx7000 (282 vs. 214 g/m2), utilizando al mismo tiempo reservas de tallo ligeramente menores (46 vs. 50 g/m2). Por consiguiente, en ambas densidades, Stg1 logró una mayor producción de grano y resistencia a la fijación que RTx7000.

La relación entre PASM y la masa del tallo en la madurez, fue relativamente plana en las diversas introgresiones Stg en condiciones HD y LD, aunque RTx7000 cayó debajo de la línea de regresión en ambos casos. Para un nivel determinado de utilización de reserva del tallo (por ejemplo, -140 g/m2 en HD o 50 g/m2 en LD), la introgresión de una región Stg en RTx7000, incrementó en forma significativa la masa del tallo en la madurez, lo que sugiere que fue importante algún otro factor (por ejemplo, resistencia del tallo) además de la cantidad de reservas de tallo utilizadas.

La masa de tallo posterior a la floración (PASM), estuvo correlacionada en forma altamente lineal con PAB en condiciones HD y LD (figura 46). Las correlaciones HD y LD fueron casi paralelas, aunque la compensación en aproximadamente 50 g/m2, es decir, para un nivel determinado de PAB, es decir, 300 g/m2, PASM fue -50 g/m2 menor en HD que en LD (-100 vs. -50 g/m2). Esto refleja el mayor nivel de tensión en el tratamiento HD. En HD, tanto Stg1 como Stgla utilizaron -80 g/m2 de reservas de tallo en comparación con casi 140 g/m2 en RTx7000, produciendo Stg1 aún el -28% más PAB que Stgla para la utilización de reserva de tallo equivalente. En LD, Stgla, y un menor grado Stg1, ambos incrementaron PAB en forma relativa a RTx7000. Sin embargo, aunque Stgla utilizó ~60 g/m2 menos reservas de tallo que RTx7000, Stg1 utilizó ~20 g/m2 más reservas de tallo que RTx7000.

La producción de grano se correlacionó en forma positiva con PAB en condiciones HD y LD. En condiciones HD, Stg1 superó RTx7000 en un 24%, aunque Stgla fue equivalente a RTx7000 en la producción de grano. En LD, Stg1 y Stgla superó RTx7000 en un 42% y 20%, respectivamente.

En este experimento, no hubo negociación entre PASM y la producción de grano, ya que la correlación entre estos parámetros fue positiva y lineal para ambas densidades de cultivo (figura 47). En HD, Stg1 exhibió la más alta masa de tallo y producción de grano de todas las introgresiones Stg, indicando que la producción de grano y la resistencia a la fijación no son mutuamente exclusivas.

La relación entre PASM y la masa del tallo en la madurez, estuvo correlacionada en forma positiva en HD y en forma negativa en LD. En HD, PASM y la masa del tallo en la madurez, fueron significativamente mayores en Stg1 que en RTx7000. En LD, la masa del tallo en la madurez fue mayor en Stg1 que en RTx7000 (314 vs. 271 g/m2), aunque Stg1 utilizó más reservas de tallo en comparación con RTx7000 (87 vs 66 g/m2). En general, Stg1 incrementó la masa del tallo en la madurez en un 22% (HD) y 16% (LD) en forma relativa a RTx7000. Así mismo, Stgla utilizó significativamente menos reservas de tallo que RTx7000, en ambas densidades de cosecha .

La masa de tallo postfloración (PASM) estuvo correlacionada en forma altamente lineal con PAB en condiciones HD y LD (figura 48). La variación genética en la utilización de reservas de tallo postfloración fluctuó de -30-110 g/m2 en LD, y de ~100-160 g/m2 en HD, reflejando el mayor nivel de tensión en el tratamiento de HD. En HD, el progenitor Stg1 (6078-1) y dos de los recombinantes (10604-5 y 10709-5), utilizaron significativamente menos reservas de tallo en comparación con RTx7000 (-100 vs. 160 g/m2), y aún produjeron más PAB que RTx7000 (-170 vs. 130 g/m2). En LD, únicamente uno de los recombinantes Stg1 (10568-2) utilizó significativamente menos reservas de tallo que RTx7000 (-30 vs. 60 g/m2), y produjo más PAB que RTx7000 (-310 vs. 230 g/m2).

La producción de grano estuvo correlacionada en forma positiva con PAB en LD y en forma negativa en HD, aunque en general (combinando HD y LD), la relación fue positiva, con RTx7000 (HD) como una anormalidad.

En este experimento, no hubo negociación entre PASM y la producción de grano, ya que la correlación entre estos parámetros fue positiva y lineal para ambas densidades de cultivo. En HD, el progenitor Stg1 (6078-1 ) .exhibió una masa de tallo y producción de grano de alto nivel en comparación con otras ¡ntrogresiones Stg1. RTx7000 fue una anomalía en HD, exhibiendo una baja masa de tallo y una alta producción de grano. En LD, 10709-5 y 10558-2 exhibieron una masa del tallo y producción de grano de alto nivel en forma relativa a RTx7000.

La relación entre PASM y la masa del tallo en la madurez, estuvo correlacionada en forma positiva en ambas densidades. En HD, PASM y la masa del tallo en la madurez, fueron ambas significativamente mayores en 6078-1 y 10709-5 que RTx7000. En LD, únicamente un recombinante Stg1 (10568-2) excedió RTx7000 en PASM y la masa de tallo en la madurez.

EJEMPLO 22 La mayor producción de grano es una consecuencia de un estado de agua en la planta mayor durante el llenado de grano La introgresión de Stg1 en un trasfondo RTx7000, incrementó el estado de agua de la planta en el llenado de grano medio, tal como se indica mediante a) mayor contenido de agua relativo (RWC) en FL-2 en LD y HD, menor potencial de agua en la hoja (LWP) en FL-2 en LD y HD. En general, las plantas tuvieron más tensión en LD que en HD en este experimento, evidenciado mediante RWC en LD. Sin embargo, el impacto benéfico de Stg1 en el estado de agua de la planta fue más dramático en HD, en donde RWC fue el 26% mayor en Stg1 que RTx7000.

RWC en un llenado de grano medio en FL-2, estuvo correlacionado en forma positiva con la producción del grano en HD y LD. En mayores niveles de tensión de agua en la planta (RWC<73), la producción de grano fue mayor en LD que en HD, para un nivel determinado de RWC. RWC y la producción de grano fue mayor en Stg1 que en RTx7000 en ambas densidades de cultivo. Por ejemplo, en Stg1, bajo HD, un incremento del 26% en RWC estuvo asociado con un incremento del 58% en la producción de grano, en forma relativa a RTx7000.

El potencial de agua de la hoja (LWP) de FL-2 en el llenado de grano medio, estuvo correlacionado en forma negativa con la producción de grano en condiciones HD y LD (figura 49), Bajo ambas densidades, Stg1 exhibió un LWP inferior (menos tensión) y una producción de grano superior en forma relativa a RTx7000. Estos datos, junto con los datos RWC, proporcionan una fuerte evidencia de una unión entre el estado de agua de la planta superior durante el llenado de grano, y la producción de grano incrementada debido a la región Stg 1.

EJEMPLO 23 Una mayor producción de grano y mayor tamaño de grano son consecuencias de la disponibilidad de agua incrementada durante el llenado del grano Importante para la hipótesis de la función de Stg1, es la relación entre el uso de agua pre y postfloración, y subsecuentemente, la relación entre el uso de agua profloracion y la producción de grano. El gen Stg1 es de poco valor a nivel de campo, en donde no hay relación entre la disponibilidad de agua incrementada durante el llenado del grano y ya sea, la producción o el tamaño del grano.

Primero, es importante establecer la unión entre la proporción de biomasa pre:post floración (PPBR) y el uso de agua de cultivo (CWU) durante el llenado del grano. CWU durante el llenado del grano permaneció bajo (en una medición comparativa de ~85 y 95 mm para LD y HD, respectivamente) hasta que la proporción de biomasa pre:post floración cayó debajo de ~3 y 2.5 en LD y HD, respectivamente (figura 50). Debajo de este valor crítico, CWU durante el llenado del grano incrementó significativamente para cada reducción incrementada en esta proporción. Bajo ambas densidades, las introgresiones de Stg1 redujeron la PPBR lo suficiente para incrementar en forma significativa CWU en forma relativa a RTX7000.

Segundo, es importante mostrar la unión entre CWU durante el llenado de grano y la producción de grano. En general, estos parámetros estuvieron asociados en forma positive en un experimento ROS, además de dos anormalidades distintas en LD (Stg2 y Stg3) [figura 51]. La introgresión de Stg1 en RTx7000 incrementó tanto CWU durante el llenado de grano como la producción de grano bajo ambas densidades de cultivo.

Finalmente, la unión entre PPBR y la producción de grano en condiciones con limitación de agua completa la ilustración (figura 51). La producción de grano permaneció baja (en una medición comparativa de ~410 g/m2) hasta que la proporción de biomasa pre:post floración cayó debajo de -2.7 (figura 52). Debajo de este valor crítico, la producción de grano incrementó en forma significativa para cada reducción incremental en esta proporción. Bajo ambas densidades, las introgresiones de Stg1 redujeron PPBR lo suficiente para incrementar en forma significativa la producción de grano en forma relativa a RTx7000. Estos datos proporcionan una unión crítica entre la acción del gen Stg1 (tamaño de cubierta reducido en la floración) y la producción de grano bajo marchitez terminal.

CWU durante el llenado del grano estuvo correlacionado en forma positiva con el tamaño de grano tanto en tratamientos HD como LD (figura 53). La introgresión de Stg1 en RTx7000 incrementó en forma significativa el tamaño de grano en HD, pero no en LD.

La relación entre PPBR y el tamaño de grano bajo condiciones con limitación de agua, indica la importancia de la conserva de agua antes de la floración, como un determinante del tamaño del grano (figura 54). El tamaño del grano permaneció bajo (en una medición comparativa de ~17 y 17.5 mg para HD y LD, respectivamente) hasta que la proporción de biomasa pre:post floración cayó debajo de ~2.7 (figura 54). Debajo de este valor crítico, el tamaño de grano incrementó significativamente para cada reducción en incremento en esta proporción. En HD pero no en LD, las introgresiones de Stg1 redujeron lo suficiente PPBR para incrementar en forma significativa el tamaño del grano en forma relativa a RTx7000. Estos datos proporcionan una unión crítica entre la acción del gen Stg1 (tamaño de cubierta reducido en la floración) y tamaño de grano en marchitez terminal.

CWU durante el llenado del grano permaneció bajo (en una medición comparativa de ~58 mm para HD) hasta que la proporción de biomasa pre:post floración cayó debajo de ~3.5. Se debe observar que PPBR no cayó debajo del valor de umbral crítico en cualquier genotipo en HD, ya que CWU durante el llenado del grano permaneció relativamente bajo para todos los genotipos en este tratamiento. Sin embargo, conforme los genotipos cayeron debajo de este valor crítico en el tratamiento LD, CWU durante el llenado del grano incrementó significativamente para cada reducción ¡ncremental en esta proporción. Únicamente un Stg1 recombinante (10709-5) incrementó CWU durante el llenado del grano en forma relativa a RTX7000.

En general, CWU durante el llenado de grano y la producción de grano estuvo correlacionado en forma positiva utilizando un conjunto de datos combinado de los tratamientos HD y LD, con genotipos que utilizan más agua y producen más grano en LD. Sin embargo, la relación entre estos parámetros no fue muy fuerte. Ni los recombinantes Stg1 particulares superaron en forma consistente RTx7000 en tratamientos HD y LD. Ver figura 55.

EJEMPLO 24 Análisis de gen QTL y PIN Análisis QTL Se recolectaron datos QTL siempre verde de 7 estudios (Crasta y asociados, 1999; Hausmann y asociados, 2002; Kebede y asociados, Theoretical and Applied Genetics 103: 266 a 276, 2001; Srininvas y asociados, Theor Appl Genet 118: 703 a 717, 2009; Subudhi y asociados, Theor App Genet 101: 733 a 741, 2000; Tao y asociados, Theor Appl Genet 100: 1225 a 1232, 2000; Xu y asociados, Genome 43: 461 a 469, 2000). De los 7 estudios, se identificaron 47 QTL individuales y se proyectaron en el mapa de consenso de sorgo (Mace y asociados, BMC Plant Biol. 9: 13, 2009). Cuando se estimaron Intervalos de Confiabilidad (Cl) de QTL para el mismo rasgo traslapado, los QTL se agruparon en un meta QTL. Nueve meta-QTL para el rasgo siempre verde fueron identificados en esta forma. QTL para el mismo rasgo fue clasificado como un QTL separado, si Cl no tenía una región en común y la ubicación de QTL promedio fuera menor o igual a 15cM fuera una de la otra.

El análisis QTL de Aprendizaje de Máquina Estadístico (SML) (Bedo y asociados, BMC Genetics 9: 35, 2008), se llevó a cabo en un conjunto de aproximadamente 500 entradas en el rasgo de machos pyt de sorgo DEEDI. 23 QTL identificados con una probabilidad de <0.05, también fueron trazados en el mapa de consenso.

Análisis de gen PIN Todos los genes PIN disponibles en arroz y Arabidopsis se buscaron a través de NCBI (www.ncbi.org). En total, la secuencia de 9 genes PIN de arroz (OsPINI, OsPINIb, OsPINIc, OsPIN2, OsPIN3a, OsPIN3b, OsPIN4, OsPIN5, OsPIN6) y 3 genes PIN Arabidopsis (AtPIN , AtPIN2, AtPIN4), fueron identificados. Todos los genes (secuencia de proteína) fueron BLASTed contra WGS de sorgo (www.gramene.org) y se identificaron los 100 aciertos mayores. Se compararon la calificación (valor S: una medida de similitud de la consulta en la secuencia mostrada), el valor E (la probabilidad debido a la oportunidad, que es otra alineación con una similitud mayor a la calificación S determinada), %ID y la longitud de homología de secuencia para cada uno de los 1200 aciertos. La relación entre 4 medidas fue analizada, y la calificación S fue seleccionada como la medida principal para evaluar la probabilidad de similitud de secuencia. Después de un análisis de la distribución de los valores de calificación S, se identificaron 3 categorías de calificación S, (>1000; >499 y <1000; <499) y se produjo (Tabla 8) una lista de 11 genes de sorgo con calificaciones >499 (por ejemplo, en las primeras 2 categorías).

Tabla 8 Comparaciones De los 11 ortólogos PIN identificados, 10 (90.9%) se alinearon con QTL conocidos para el rasgo siempre verde. Únicamente uno de los 11 genes PIN de sorgo (Sb03g043960 en SBI-03, no se alinearon con cualquier QTL reportado. De los 79 QTL trazados (23 SML-QTL y 56 de la literatura/meta-QTL), 30 (38%) se alinearon con los ortólogos PIN.

EJEMPLO 25 Análisis de PIN2, PIN3, PIN4 y PIN5 La fuente siempre verde BTx642 (B35), y las líneas casi isogénicas (NlLs) que contienen las QTLs Stg1, Stg2, Stg4, así como la línea de senectud contrastante de Tx7000, se crecieron en líneas de raíz en un invernadero.

El objeto del experimento fue medir los niveles de expresión de los genes que son identificados en la presente invención como candidatos del gen siempre verde bajo condiciones de riego, y después de que se ha impuesto una tensión de marchitez en las plantas, para ver si hubieron algunas diferencias en la expresión en el rasgo siempre verde en comparación con las plantas senescientes.

El experimento se dividió en dos partes: una tensión de marchitez temprana (Exp1) y una tensión de marchitez tardía (Exp2).

Los resultados del experimento de tensión de marchitez temprano se muestran en la Tabla 9.

Tabla 9 Las principales diferencias en la expresión de estos genes PIN se resume más adelante (Tabla 10 y en las figuras 67A a D).

Tabla 10 Se identificaron patrones emergentes para SbPIN4 y SbPIN2, Stg1 y Stg2, respectivamente.

En ambos casos la expresión de estos genes fue mayor en las líneas siempre verdes en comparación con la línea de senectud en respuesta al déficit de agua.

Estos dos genes PIN mostraron diferencias en especificidad de tejido. SbPIN4 generalmente (en todas las condiciones) estuvo más altamente expresado en raíces y tallos, y menos en hojas, en tanto que SbPIN2 generalmente mostró una mayor expresión en hojas y tallos, y menor expresión en raíces).

Los expertos en la técnica apreciarán que los aspectos aquí descritos son susceptibles a variaciones y modificaciones además de las descritas en forma específica. Quedará entendido que dichos aspectos incluyen todas las variaciones y modificaciones. Los aspectos aquí descritos también incluyen todos los pasos, características, composiciones y compuestos referidos o indicados en la presente invención, en forma individual o colectiva, y cualquiera y todas las combinaciones de cualquiera de dos o más de los pasos o características.

BIBLIOGRAFÍA Andrade y asociados, Crop Sci. 42: 1173 a 1179, 2002 Bedo y asociados, BMC Genetics 9: 35, 2008 Benkova y asociados, Cell 115: 591 a 602, 2003 Borrell y asociados, Crop Sci. 40: 1026 a 1037, 2000a Borrell y asociados, Crop Sci. 40: 1037 a 1048, 2000b Borrell and Hammer, Crop Sci. 40: 1295 a 1307, 2000 Carraro y asociados, Plant Physiology 142: 254 a 264, 2006 Christopher y asociados, Aust. J. Agrie. Res. 59: 354 a 364, 2008 Crasta y asociados, Molecular and General Genetics 262: 579 a 588,1999 Forestan and Varotto, Plant Physiology, 2009 Friml y asociados, Current Opinión in Plant Biology 6: 7 a 12, 2003 Garud y asociados, Int. Sorghum and Millets Newsl. 43: 63 a 65, 2002 Hammer y asociados, Aust. J. Agrie. Res. 48: 649 a 655, 1997 Hammer, Agrie. Sci. 19: 16 a 22, 2006 Harris y asociados, J. Exp. Bot. 58: 327 a 338, 2007 Hausmann y asociados, Theoretical and Applied Genetics 106: 133 a 142, 2002 Henderson y asociados, Aust. J. Plant Physiol. 25: 111 a 123, 1998 Henzell y asociados, Australia Int. Sorghum and Millets Newsl. 55: 1 a 9, 1997 Jiao y asociados, Nature Genetics 42: 541 a 544, 2010 Jordán y asociados, Theor. Appl. Genet. 706: 559 a 567, 2003 Kashiwagi y asociados, Plant Physiology and Biochem istry 44: 152 a 157, 2006 Kassa un y asociados, Euphytica 72: 351 a 362, 2010 Kebede y asociados, Theoretical and Applied Genetics 103: 266 a 276, 2001 Leyser, Current Biology 76: R4242 a R433, 2001 Mace y asociados, BMC Plant Biol 9: 13, 2009 Manschadi y asociados, Funct. Plant. Biol. 33: 823 a 837, 2006 Miura y asociados, Nature Genetics 42: 545 a 549, 2010 Mortlock and Hammer, J. Crop Prod. 2: 265 a 286, 1999 Papanov y asociados, Trends in Plant Science 10(4): 170 a 177, 2005 Passioura, J. Aust. Inst. Agrie. Sci. 43: 117 a 120, 1977 Rashotte y asociados, Plant Cell 13: 1683 a 1697, 2000 Reddy y asociados, Euphytica 159: 191 a 198, 2008 Reinhardt y asociados, Plant Cell 12: 507 a 518, 2000 Rosenow y asociados, Agrie. Water Manag. 7: 207 a 222, 1983 Sadrás and Connor, Field Crops Res. 26: 227 a 239, 1991 Spano y asociados, J. Exp. Bot. 54: 1415 a 1420, 2003 Springer, Nature Genetics 42: 475 a 476, 2010 Srininvas y asociados, Theor Appl Genet 118: 703 a 717, 2009 Subudhi y asociados, Theor Appl Genet 101: 733 a 741, 2000 Tao y asociados, Theor Appl Genet 100: 1225 a 1232, 2000 Tenkouano y asociados, Theor. Appl. Genet. 85: 644 a 648, 1993 Turner, J. Exp. Bot. 55: 2413 a 2425, 2004 Van Oosterom y asociados, Field Crops Res. 115: 19 a 28, 2010a Van Oosterom y asociados, Field Crops Res. 115: 29 a 38, 2010b Van Oosterom and Hammer, Field Crops Res. 108: 259 a 268, 2008 Wang y asociados. Molecular Plant 2(4): 823 a 831, 2009 Xin y asociados, Field Crops Res. 111: 74 a 80, 2009 Xu y asociados, Genome 43: 461 a 469, 2000 Zheng y asociados, Plant Breed 128: 54 a 62, 2009.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un método para generar una planta genéticamente modificada que utiliza agua en forma más eficiente que una planta no modificada genéticamente de la misma especie, en donde el método comprende modular el nivel de expresión de un locus de inflorescencia tipo alfiler (PIN) existente o introducido en todo el tejido, o en tejidos seleccionados en la planta, para facilitar un fenotipo siempre verde, en donde el fenotipo incluye un cambio en el uso de agua en el período posterior a la floración o una capacidad de acceso de agua incrementada durante el crecimiento del cultivo, y una eficiencia de transpiración incrementada que da como resultado un índice de cosecha y producción de grano incrementados bajo condiciones con limitación de agua.

2. El método tal como se describe en la reivindicación 1, caracterizado porque el locus PIN codifica una proteína PIN seleccionada de la lista que consiste en SbPINI a SbPIN11 de sorgo, o un equivalente de los mismos en otra planta.

3. El método tal como se describe en la reivindicación 1, caracterizado porque el PIN es SbPIN4 o un equivalente del mismo en otra planta.

4. El método tal como se describe en la reivindicación 1, caracterizado porque el PIN es SbPIN2 o un equivalente del mismo en otra planta.

5. El método tal como se describe en la reivindicación 1, caracterizado porque el PIN es OsPIN5 o OsPIN3a o un equivalente de los mismos en otra planta.

6. El método tal como se describe en la reivindicación 1, caracterizado porque comprende introducir un agente genético que codifica una proteína PIN o que incrementa o disminuye los niveles de una proteína PIN nativa.

7. El método tal como se describe en la reivindicación 1, caracterizado porque el agente genético es una región o genoma de planta seleccionado de un perfil de expresión PIN en particular.

8. El método tal como se describe en la reivindicación 7, caracterizado porque el agente genético se introduce a través de medios de ingeniería genética o a través de un protocolo de siembra.

9. El método tal como se describe en la reivindicación 1, caracterizado porque la planta genéticamente modificada es una planta de sorgo.

10. El método tal como se describe en la reivindicación 1, caracterizado porque la planta genéticamente modificada se selecciona de trigo, avena, maíz, cebada, centeno y arroz.

11. El método tal como se describe en la reivindicación 1, caracterizado porque la planta genéticamente modificada se selecciona de abacá, alfalfa, almendra, manzana, esparrago, plátano, alubia, zarzamora, haba, cañóla, anacardo, mandioca, garbanzo, cítricos, coco, café, maíz, algodón, higo, linaza, uvas, maní, cáñamo, kenaf, lavanda, mano, hongo, olivo, cebolla, chícharo, cacahuate, pera, mijo, papa, ramio, semilla de colza, ryegras, frijol de soya, fresa, betabel, azúcar de caña, girasol, camote, taro, té, tabaco, tomate, triticale, trufa y ñame.

12. El método tal como se describe en la reivindicación 1, caracterizado porque el fenotipo siempre verde incluye además un fenotipo seleccionado de plasticidad de arquitectura de cubierta incrementada, tamaño de cubierta reducida, biomasa incrementada por área de hoja unitaria en la floración, mayor eficiencia de transpiración, uso de agua incrementado durante el llenado de grano, producción reducida de biomasa pre- y postfloración y senectud retardada.

13. El método tal como se describe en la reivindicación 1, caracterizado porque el fenotipo siempre verde incluye además un tamaño de grano más grande.

14. Una planta genéticamente modificada generada a través del método tal como se describe en cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 13.

15. La progenie de la planta tal como se describe en la reivindicación 14, caracterizada porque está genéticamente modificada para exhibir el fenotipo siempre verde.

16. Semillas o frutos u otras partes reproductoras de propagación de la planta tal como se describe en la reivindicación 14 o 15.

17. Un método para generar una planta genéticamente modificada que utiliza en forma más eficiente agua que una planta no modificada genéticamente de la misma especie, en donde el método comprende introducir en una planta o progenitor de la planta, un agente genético que codifica una proteína PIN seleccionada de SbPINI a 11 de sorgo, o un equivalente funcional de la misma de otra planta que está asociada con un fenotipo siempre verde, en donde el fenotipo incluye un cambio en el uso de agua en el período postfloración, o una capacidad de acceso de agua incrementada durante el crecimiento del cultivo o eficiencia de transpiración incrementada que da como resultado un índice de recolección y producción de grano incrementados bajo condiciones con limitación de agua, o un agente que modula la expresión de un locus PIN nativo.

18. El método tal como se describe en la reivindicación 17, caracterizado porque la proteína SbPIN se selecciona del grupo que consiste en SbPIN4, SbPIN2, OsPIN5 y OsPIN3a o un equivalente de la misma en otra planta.

19. Un material genético aislado, el cual, cuando se expresa en una célula de planta, confiere un fenotipo en la planta, en donde el fenotipo incluye un cambio en el uso de agua en el período postfloración o capacidad de acceso de agua incrementada durante el crecimiento del cultivo o eficiencia de transpiración incrementada que da como resultado un índice de cosecha y producción de grano incrementados bajo condiciones con limitación de agua, y en donde el material genético codifica una proteína seleccionada de SbPINI a 11 o un equivalente de la misma de otra planta.

20. El material genético aislado tal como se describe en la reivindicación 19, caracterizado porque la proteína SbPIN se selecciona de SbPIN4 y SbPIN2 o un equivalente de la misma en otra planta.

21. El material genético aislado tal como se describe en la reivindicación 19 o 20, caracterizado porque el material genético se expresa en una planta de sorgo genéticamente modificada .

22. El material genético aislado tal como se describe en la reivindicación 19, caracterizado porque el material genético se expresa en una planta genéticamente modificada seleccionada de trigo, avena, maíz, cebada, centeno y arroz.

23. El material genético aislado tal como se describe en la reivindicación 19, caracterizado porque el material genético se expresa en una planta genéticamente modificada seleccionada de abacá, alfalfa, almendra, manzana, esparrago, plátano, alubia, zarzamora, haba, cañóla, anacardo, mandioca, garbanzo, cítricos, coco, café, maíz, algodón, higo, linaza, uvas, maní, cáñamo, kenaf, lavanda, mano, hongo, olivo, cebolla, chícharo, cacahuate, pera, mijo, papa, ramio, semilla de colza, ryegras, frijol de soya, fresa, betabel, azúcar de caña, girasol, camote, taro, té, tabaco, tomate, triticale, trufa y ñame.

24. Un modelo de ganancias económicas mejoradas en la producción de cultivos, en donde el modelo comprende generar plantas de cultivo que comprenden una arquitectura de cubierta que facilita un cambio en el uso de agua por parte de la planta en el período postfloración, o una capacidad de acceso de agua incrementada durante el crecimiento del cultivo o eficiencia de transpiración incrementada, para incrementar de esta forma el Hl y la producción de granos bajo condiciones con limitación de agua, obteniendo una semilla de la planta de cultivo generada y distribuyendo la semilla a los productores de granos para producir ganancias y rendimientos incrementados, en donde la planta de cultivo se genera a través del método tal como se describe en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13 o 17 o 18.