CN108624618A - 耐干旱植物 - Google Patents

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Abstract

本说明书教导了耐干旱植物的生成。本公开使得能够对本文称为“持绿”的表型特征进行操作以通过重组、诱变和/或杂交和筛选方法生成耐干旱植物。本文还教导了植物管理实践系统，以增加水分有限环境中的作物产率和收获效率。

Description

耐干旱植物
本申请是申请日为2011年11月15日、申请号为201180062760.X 的同名申请的分案申请。
编档数据
本申请与提交于2010年11月15日的美国临时申请号61/413,902 相关，其全部内容通过引用并入本文。
发明领域
本说明书教导了耐干旱植物的生成。本公开使得能够对本文称作“持绿”的表型特征进行操作以通过重组、诱变和/或杂交和选择方法生成耐干旱植物。本文还教导了一种植物管理实践系统以增加水分有限的环境中的作物产率和收获效率。
发明背景
本说明书中作者参考的出版物的书目详情在说明书后以字母顺序进行汇总。
本说明书中对任何在先技术的参考不被视为承认或任何形式的暗示所述在先技术形成任何国家的通用一般知识的一部分。
人的日益增长需要作物产率得到提高。这成为植物培育者和遗传学者的主要目标。一种提高作物产率的方法包括对促进更高谷物产率和稳定性的植物性状进行选择(Springer,Nature Genetics 42:475-476, 2010)。这种方法被称为“绿色革命”。其他方法包括，开发理想的植物株型，例如，所述株型可鉴定出数量性状基因座(QTL)，所述QTL 编码水稻的鳞部启动子结合蛋白质样14(OsSPL14)，并促进水稻产率的提高(Jiao等人，NatureGenetics 42:541-544,2010；Miura等人，Nature Genetics 42:545-549,2010)。
干旱是世界范围内谷物生产的一个最重要的限制。高粱是一种耐干旱机制的系统，其包括C4光合作用、深根系统、厚的叶蜡，这使得其能在干热环境中生长。耐干旱的特性使得高粱在干燥区域尤其重要，如撒哈拉以南的非洲、印度中西部、澳大利亚东北部、以及美国的南部平原。因为水分缺乏，水分获得的压力日益增加，对干旱条件下谷物产率相关的形状的鉴定变得更加重要。
在高粱中鉴定出的干旱适应机制使得绿叶在干旱条件下的灌浆过程中能保持更长时间，这称为“持绿”。已经将持绿现象与高粱 (Borrell等人，Crop Sci.40:1037-1048,2000b；Kassahun等人， Euphytica 72:351-362,2010)，小麦(普通小麦(Triticumaestivum L.)) [Spano等人，J.Exp.Bot.54:1415-1420,2003；Christopher等人，Aust.J.Agric.Res.59:354-364,2008]，水稻(亚洲栽培稻(Oryza sativa L.)) [Kashiwagi等人，Plant Physiology and Biochemistry 44:152-157,2006] 以及玉米(玉蜀黍(Zeamays L.))[Zheng等人，Plant Breed 128:54-62, 2009]在开花期后干旱条件下还能有高的谷物产率相联系。此外，其可通过提高木炭腐病(菜豆壳球孢(Macrophomina phaseolina[Tassi] Goid.))抗性间接影响干旱条件下的谷物产率(Tenkouano等人，Theor.Appl.Genet.85:644-648,1993；Garud等人，Int.Sorghum and Millets Newsl.43:63-65,2002)。这会减少倒伏现象(Reddy等人，Euphytica 159:191-198,2008)，使植物培育者发现植物高度和谷物产率之间的正相关性(Jordan等人，Theor.Appl.Genet.106:559-567,2003)。持绿在美国(Rosenow等人，Agric.Water Manag.7:207-222,1983)和澳大利亚(Henzell等人，Australia Int.Sorghum and Millets Newsl.38:1-9,1997) 的干旱适应性高粱育种项目中都是重要的选择标准。
大量支持此项形状的生理学证据正在不断积累中(Borrell等人，Crop Sci.40:1026-1037,2000a；Borrell and Hammer,Crop Sci. 40:1295-1307,2000；Harris等人，J.Exp.Bot.58:327-338,2007； Christopher等人，2008见上文；Van Oosterom等人，FieldCrops Res. 115:19-28,2010a及Van Oosterom等人，Field Crops Res.115:29-38,2010b)。尽管美国和澳大利亚的高粱育种者已经研究此项干旱耐受机制超过25年，而且此项性状的大量生理学基础也越来越好地得到理解，然而相关的原因机制及遗传位点都还是未知的。
在水分有限的条件下，谷物产率是蒸腾作用(T),蒸腾作用效率 (TE)及收获指数(HI)的函数[Passioura,J.Aust.Inst.Agric.Sci. 43:117-120,1977]。在此框架内，谷物产率与开花期后的T有关(Turner, J.Exp.Bot.55:2413-2425,2004；Manschadi等人，Funct.Plant.Biol. 33:823-837,2006),因为HI随着开花期后使用的作物总的T部分的增加而增加(Passioura,1977，见上文；Sadras and Connor,Field Crops Res.26:227-239,1991；Hammer,Agric.Sci.19:16-22,2006)。开花期后 T的增加与开花期附近干旱压力的减少相关，这对作物在稻谷开花期的作物生长速率有正面影响，因此影响所得的谷物数量(Andrade等人，Crop Sci.42:1173-1179,2002；Van Oosterom and Hammer,Field CropsRes.108:259-268,2008)。如果可得的水的总量是有限的，则开花期后的T可通过限制开花期前的T而增加。这可通过限制冠层大小而完成，可以在遗传学上或通过作物管理而达到。然而，更小的冠层仅仅在TE不足的情况下减少总的T。已有报道，高粱的TE存在显著的基因型的差异(Hammer等人，Aust.J.Agric.Res.48:649-655,1997； Henderson等人，Aust.J.Plant Physiol.25:111-123,1998；Mortlock and Hammer,J.Crop Prod.2:265-286,1999；Xin等人，Field Crops Res. 111:74-80,2009)。备选地，开花期后的水分利用可通过增加作物可得到的水分总量而增加，这可通过扎根加深或减少水浸提的下限而达到(Manschadi等人，2006，见上文)。
持绿这一性状影响高粱中上述大量过程。首先，持绿在开花期前阶段通过限制冠层大小(通过减少分蘖和更小的叶片)减少水分利用。
第二，持绿通过增加生根：发芽比率提高水分利用度。有一些实验证据证明持绿品系中水提取会更好，但是还需要更多研究加以证明，这些生根的应答也可通过生长素传输增强得到解释(Wang等人，Molecular Plant 2(4):823-831,2009)。第三，持绿增加叶子在开花期的绿度，有效地增加了光合能力，因此，增加了TE(如果光合作用比导气性的增加是成比例的)。叶片绿度的增加是叶片质量减少间接影响的，即为氮在叶片中浓缩。
使用更少的水分生产更多的食物是人类目前面临的主要挑战。在发展中和发达国家，都有对鉴定出控制作物植物中干旱适应性的基因和基因网络的现实和迫切的需要。这能够增加大范围的作物种属在全世界的水分有限的环境中的干旱适应性。
发明概述
本公开教导了与持绿表型相关和/或促进持绿表型的数量性状基因座(QTL)。这些QTL在本文被称为"持绿(Stg)X"，其中X是由1增加的数字，代表染色体上与持绿表型相关的区域。
如本文所说明的，这些QTL鉴定出高粱中的遗传区域，其携带基因座，编码一个以至多个的促进持绿表型的蛋白质或调控试剂(如微小RNA)。对作物植物中一个或多个这些基因座的表达的调制生成了一种冠层结构，其促进植物中的水分利用转移至开花后阶段，或促进作物生长过程中水分的利用度的增加，或促进蒸腾作用效率的增加，并由此增加水分有限的条件下的收获指数(HI)和谷物产率。
在一个实施方式中，所述基因座编码与生长素相关的PIN蛋白质。 PIN蛋白质为生长素输出载体，其含有跨膜结构域，主要位于细胞质膜中。术语“PIN”来源于“针样花序”。
术语"SbPINn"被用于描述高粱中这样的基因，其中n为限定生长素输出载体组分的数字，并且n为1-11。指代"SbPINn"时包括在其他植物中的其同源物和直系同源物。高粱中SbPINn基因座的实例包括表1A中列出的那些，例如但不限于SbPIN4和SbPIN2或其他植物中其的等价物。对PIN的表达或具有具体的多形性变化的PIN的表达的调制在本文有所说明，这可促进持绿表型显现出来。本公开教导了来自其他植物如水稻的PIN。PIN的字母前缀说明其来源(例如，Sb，高粱；Os，水稻；等等)。高粱中SbPIN的定位是通过基因ID 号确定的(见表1A)。例如，SbPIN4对应OsPIN5，而SbPIN2对应OsPIN3a。
SbPIN4和SbPIN2是本文教导的SbPIN的实例，其负责高粱中的持绿性状，分别与Stg1和Stg2相关，其产生大量赋予干旱适应性的表型，这是通过降低开花前的水分利用(降低分蘖及减小叶片而致)、增加水分利用度(增加生根：发芽比率而致)、增加轻度水分不足情况下蒸腾作用效率(叶片氮浓度增高而致)、增加终极水分不足情况下每叶片面积的生物质(每叶片面积蒸腾作用增加而致)以及增加谷物产率、谷物大小和抗倒伏性。其他实例列于表1A，还包括其他植物中其的等价物。
本公开教导了用于生成遗传修饰植物的方法，其中所述植物比相同种属的非遗传修饰植物更能有效地利用水分，所述方法包括调制所述植物中所有或选定组织中的存在的或引入的针样花序(PIN)基因座的表达水平，以促进持绿表型，所述表型包括水分利用转移至开花后阶段或作物生长过程中水分的利用度的增加或蒸腾作用效率的增加，由此使得水分有限的条件下的收获指数和谷物产率增加。
本文描述了用于生成遗传修饰植物的方法，其中所述植物比相同种属的非遗传修饰植物更有效地利用水分，所述方法包括向植物或亲本植物中引入编码选自SbPIN1-11的PIN蛋白质或来自其他植物的其的等价物或其功能同源物或直向同源物的遗传试剂；或调制内源PIN 蛋白质的表达的遗传试剂；其中PIN表达的水平和定位促进持绿表型的形成，所述表型尤其包括这样的冠层结构，其促进水分利用转移至开花后阶段，或促进作物生长过程中水分的利用度的增加，由此使得水分有限的条件下的收获指数和谷物产率增加。
本公开进一步教导了用于生成遗传修饰植物的方法，所述植物比相同种属的非遗传修饰植物更有效地利用水分，所述方法包括向植物或亲本植物中引入编码选自SbPIN4和SbPIN2的高粱PIN蛋白质或其他植物中其的等价物的遗传试剂或调制内源PIN的表达的遗传试剂。提到调制，包括增加或降低表达水平。进一步地，可选择具有在植物中所有或选定组织中有所需的表达谱的PIN。
本文还教导了生成遗传修饰植物的方法，所述植物比相同种属的非遗传修饰植物更有效地利用水分，所述方法包括向植物或亲本植物中引入编码与持绿表型相关或促进持绿表型的产物的遗传试剂，所述持绿表型包括水分利用转移至开花后阶段或作物生长中水的利用度的增加，或蒸腾作用效率的增加，其导致水分有限条件下收获指数和谷物产率的增加，其中所述产物选自SbPIN1-11或其他植物中其的等价物，或调制植物内源PIN的表达的试剂。
本文还教导了生成遗传修饰植物的方法，所述所述植物比相同种属的非遗传修饰植物更有效地利用水分，所述方法包括向植物或亲本植物中引入编码选自SbPIN4和SbPIN2或其他植物中其的等价物的遗传试剂或调制植物中内源PIN的表达的试剂。通过“引入”，包括经由重组干预以及通过诱变或杂交操作流程并随后进行选择的方法。
本公开对于生成比相同种属的非遗传修饰植物更能有效利用水分的遗传修饰植物的方法进行说明，所述方法包括向植物/亲本植物中引入编码两种或更多种PIN蛋白质或调制植物中两种或更多种内源 PIN蛋白质表达的遗传试剂。高粱中PIN的实例包括SbPIN1-11如 SbPIN4和SbPIN2或其他植物中其的等价物。例如SbPIN4对应 OsPIN5，而SbPIN2对应OsPIN3a。表1A中说明了SbPIN和OsPIN。
本文还教导了显现出持绿性状的遗传修饰的植物及其子代，以及其种子、果实、花以及其他生殖或繁殖材料。
编码与持绿表型相关或促进持绿表型的PIN蛋白质或其功能同源物或直向同源物的遗传材料以及调制PIN表达的试剂也在本文进行说明，所述持绿表型包括冠层结构，其促进水分利用转移至开花后阶段或作物生长中水的利用度的增加或蒸腾作用效率的增加，其导致水分有限条件下收获指数和谷物产率的增加。
一个实施例中，所述遗传材料选自(i)编码SbPIN4的试剂；以及(ii) 调制SbPIN4或其他植物中其等价物的表达水平的试剂。在另一个实施例中，所述遗传材料选自(i)编码SbPIN2的试剂；以及(ii)调制 SbPIN2或其他植物中其等价物的表达水平的试剂。
遗传材料包括编码与持绿表型相关或促进持绿表型的SbPIN4或 SbPIN2蛋白质或其他植物中其的功能同源物或直向同源物或其等价物的试剂，其中持绿表型包括冠层结构，其促进水分利用转移至开花后阶段或作物生长中水的利用度的增加或蒸腾作用效率的增加，其使得水分有限条件下收获指数和谷物产率得到增加；还包括调制SbPIN4 或SbPIN2或其他植物中其等价物的表达水平的试剂。
本文教导了植物管理系统，可减少作物对水分的依赖，或提高水分利用效率并增加谷物或产品产率。所述植物管理系统包括生产干旱适应作物(包括稻谷植物)，这是通过仅仅根据本文限定的方法或结合其他有用性状如谷物大小、根大小、盐耐受性、除草剂耐受性、害虫耐受性等等的导入，对PIN基因座或其功能等价物表达的选择和调制进行的。备选地或此外地，所述植物管理系统包含生成干旱适应性植物以及农业步骤，如灌溉、营养要求、控制作物密度和几何形状、杂草控制、虫害控制、翻土、减少耕耘、高位栽培等等。PIN基因座的实例包括SbPIN1-11(表1A)，如SbPIN4和SbPIN2，及其他植物中其的等价物。
本文还说明了用于提高作物产率的经济回报的商业模型，所述模型包含生成具有冠层结构的作物植物，所述冠层结构促进植物对水的利用转移至开花后阶段或作物生长中水分利用度的增加或蒸腾作用增加，或由此促进水分有限条件下HI及谷物产率的增加，由所生成的作物植物获得种子并将这些种子分配至谷物生产商，以增强的产率和收益。
以下缩写使用于说明书主体部分：
CI, 置信区间
CWU, 作物水分利用
DW, 干重
GLA, 绿叶面积
HD, 高密度
HI, 收获指数
HT, 高度分蘖
HW, 高水分
HWHD, 高水分、高密度(轻度水分压力)
HWLD, 高水分,低密度(最低水分压力)
LA, 叶片面积
LD, 低密度
LT, 低分蘖
LW, 低水分
LWHD, 低水分、高密度(最高水分压力)
LWLD, 低水分、低密度(轻度水分压力)
NIL, 近等基因系
OsPIN， 来自水稻的PIN
PAB, 开花期后生物质
PASM, 开花期后茎质量
PIN, 针样花序
PPBR, 开花期前生物质:开花期后生物质
QTL, 数量性状基因座
ROS, 防雨棚
RWC, 相对水含量
SbPIN, 来自高粱的PIN
SLW, 比叶重量
SML, 统计机器学习
Stg, 持绿
T, 蒸腾作用
T2, 叶片2叶腋的分蘖
T3, 叶片3叶腋的分蘖
T4, 叶片4叶腋的分蘖
T5, 叶片5叶腋的分蘖
T6, 叶片6叶腋的分蘖
TE, 蒸腾作用效率
TS, 终极压力
VPD, 蒸汽压差
WW, 灌溉良好
表1A提供了来自高粱和水稻的PIN的信息
附图简述
一些图中有彩色表示或部分。可通过请求从专利所有人处获得彩色照片或从适当的专利当局获得。如果从专利当局获得这些照片，可能需要缴纳一定费用。
图1是图示，显示了大量含有多种Stg基因渗透的近等基因系在开花期时每m2的茎杆和绿叶面积之间的关联。
图2是图示，显示了生长在两种作物密度下生长的RTx7000背景下对于多种Stg基因渗透，其在开花期时每m2的茎杆和绿叶面积之间的关联。(LD＝10植物/m2；HD＝20植物/m2)。
图3是图示，显示了Stg1精细定位群体中每株植物三季内平均的茎杆预测值的直方图。
图4是列表图示，显示了生长于两种灌溉方案下的五种基因型在 44DAE的每株植物的茎杆数的直方图。所述基因型包括，RTx7000(回归亲本)、6078-1(供体亲本)、以及三个选自Stg1精细定位群体的基因型。HWLD＝高水分，低密度(10株植物/m2)。LWLD＝低水分，低密度(10株植物/m2)。
图5是图示，显示了Stg1精细定位群体中关于T2存在情况的表型变化。
图6是图示，显示了Stg1精细定位群体中关于T3存在情况的表型变化。
图7是图示，显示了Stg1精细定位群体中八株高分蘖及八株低分蘖重组子中关于T2存在情况的直方图。
图8为示意图，显示了Stg1精细定位群体中五株高分蘖及三株低分蘖重组子每株植物的总分蘖数的直方图。人为地选择2.5的值作为高分蘖和低分蘖之间的界点。
图9A-D为图示，显示了生长于蒸渗计测量的低VPD及高VPD 条件下的RTx7000和6078-1(Stg1 NIL)的主茎和分蘖的叶片大小分布情况。
图10为图示，显示了生长于水分有限及高密度条件下的田地中RTx7000、6078-1(Stg1 NIL)及来自Stg1精细定位群体的三个重组子的主茎叶片大小分布情况(HD＝20株植物/m2)。
图11为图示，显示了生长于igloo中的Stg1精细定位群体的亲本的叶片大小分布情况(L1-6)。
图12为图示，显示了生长于igloo中的Stg1精细定位群体的亲本的叶片长度分布情况(L1-6)。
图13为图示，显示了生长于igloo中的Stg1精细定位群体的亲本的叶片宽度分布情况(L1-6)。
图14为图示，显示了生长于igloo中的Stg1精细定位群体的亲本的叶片大小分布情况(l1-11)。
图15为图示，显示了生长于igloo中的Stg1精细定位群体的亲本的叶片长度分布情况(L1-10)。
图16为图示，显示了生长于igloo中的Stg1精细定位群体的亚群中L10长度上的表型变化情况的直方图。
图17为图解示意，显示了开花期水分利用度的增加是通过减少水分利用而实现的，所述水分利用的减少是由含有Stg1区域的植物中的两种机制造成的(分蘖减少及叶片更小)。
图18为图示，显示了冠层大小是通过Stg1区域的(多种)基因控制的组成性及适应性应答进行调制的。
图19为图示，显示了生长于水分有限及高密度条件下的田地中 RTx7000、6078-1(Stg1 NIL)及来自Stg1精细定位群体的三个重组子的主茎叶片大小的分布情况(HD＝20株植物/m2)。
图20为图示，显示了两个亲本(6078-1和RTx7000)及Stg1精细定位群体的三个重组子在开花期的叶片12及总绿叶面积之间的相关性。
图21为图示，显示了两个亲本(6078-1和RTx7000)及Stg1精细定位群体的三个重组子在开花期的总绿叶面积(cm2/m2)和作物水分利用(mm)之间的相关性。
图22为图示，显示了蒸渗计研究中两种水平的VPD下四个Stg QTL和回交亲本(RTx7000)中绿叶面积和水分利用(T)之间的相关性。
图23为图示，显示了生长于igloo中Stg1精细定位群体的L6 的“生根：发芽比率”这一表型的变化情况的直方图。
图24为图示，显示了生长于低水分和低密度(20株植物/m2)条件下的RTx7000和Stg1的累积作物水分利用情况的时间格局。垂直线表示开花期。
图25为图示，显示了生长于igloo中的Stg1精细定位群体中叶片10的长度(mm)和绿度(SPAD)之间的相关性。
图26为图示，显示了来自Stg1精细定位群体的亚群品系(包括其亲本)中叶片绿度(SPAD)和叶片光合作用之间的相关性。
图27为图示，显示了来自Stg1精细定位群体的亚群品系(包括其亲本)中叶片绿度(SPAD)和WUE(Licor)之间的相关性。
图28为图示，显示了四种Stg近等基因系(Stg1、Stg2、Stg3和 Stg4)及回交亲本(RTx7000)的叶片绿度(SPAD)和WUE(Licor) 之间的相关性。
图29为图示，显示了蒸渗计研究中两种水平的VPD下四个Stg QTL和回交亲本(RTx7000)中每叶片面积的蒸腾作用和蒸腾作用效率之间的相关性。
图30为图示，显示了生长于高密度(HD)和低密度(LD)条件下的来自Stg1精细定位群体的亚群品系(包括其亲本)的开花期前和开花期后的CWU(mm)之间的相关性。
图31A和B为图示，显示了生长于LWHD条件下Stg1和RTx7000的累积水分利用情况的格局。
图32为图示，显示生长于低水分(LW)和低密度(LD)条件下的四种Stg QTL和回交亲本(RTx7000)在开花期前和开花期后的CWU (mm)之间的相关性。
图33为图示，显示了生长于水分有限条件下的四种Stg QTL和回交亲本(RTx7000)在两种作物密度(LD＝10株植物/m2；HD＝20株植物/m2)下，PPBR和PAB之间的相关性。
图34为图示，显示了生长于水分有限条件下的四种Stg QTL和回交亲本(RTx7000)在两种作物密度(LD＝10株植物/m2；HD＝20株植物/m2)下，GLAA和PPBR之间的相关性。
图35为图示，显示了生长于水分有限条件下的四种Stg QTL和回交亲本(RTx7000)在两种作物密度(LD＝10株植物/m2；HD＝20株植物/m2)下，GLAA和PASB之间的相关性。
图36为图示，显示了生长于水分有限条件下的四种Stg QTL和回交亲本(RTx7000)在两种作物密度(LD＝10株植物/m2；HD＝20株植物/m2)下，PPBR和PAB之间的相关性。
图37为图示，显示了生长于水分有限条件下的四种Stg QTL和回交亲本(RTx7000)在两种作物密度(LD＝10株植物/m2；HD＝20株植物/m2)下，PPBR和PASM之间的相关性。
图38为图示，显示了生长于水分有限条件下的四种Stg QTL和回交亲本(RTx7000)在两种作物密度(LD＝10株植物/m2；HD＝20株植物/m2)下，PPBR和谷物产率之间的相关性。
图39为图示，显示了生长于水分有限条件下的四种Stg QTL和回交亲本(RTx7000)在两种作物密度(LD＝10株植物/m2；HD＝20株植物/m2)下，在中等谷物灌浆(FL-2)下的RWC和叶片衰老相对速率之间的相关性。
图40为图示，显示了生长于水分有限条件下的四种Stg QTL和回交亲本(RTx7000)在两种作物密度(LD＝10株植物/m2；HD＝20株植物/m2)下，叶片衰老相对速率和成熟期绿叶面积之间的相关性。
图41为图示，显示了生长于水分有限条件下的四种Stg QTL和回交亲本(RTx7000)在两种作物密度(LD＝10株植物/m2；HD＝20株植物/m2)下，在谷物灌浆期间期(FL-2)下的相对水含量(RWC)和成熟期茎质量之间的相关性。
图42为图示，显示了生长于水分有限条件下的四种Stg QTL和回交亲本(RTx7000)在两种作物密度(LD＝10株植物/m2；HD＝20株植物/m2)下，开花后茎质量(PASM)和开花后生物质(PAB)之间的相关性。
图43为图示，显示了生长于水分有限条件下的四种Stg QTL和回交亲本(RTx7000)在两种作物密度(LD＝10株植物/m2；HD＝20株植物/m2)下，开花后茎质量和谷物产率之间的相关性。
图44为图示，显示了2005年的一项实验中，生长于水分有限条件下的四种Stg1QTL和回交亲本(RTx7000)在两种作物密度(LD＝ 10株植物/m2；HD＝20株植物/m2)下，开花后茎质量(PASM)和开花后生物质(PAB)之间的相关性。
图45为图示，显示了2005年的一项实验中，生长于水分有限条件下的四种Stg QTL和回交亲本(RTx7000)在两种作物密度(LD＝10 株植物/m2；HD＝20株植物/m2)下，开花后茎质量(PASM)和谷物产率之间的相关性。
图46为图示，显示了生长于水分有限条件下的多种Stg1精细定位品系和回交亲本(RTx7000)在两种作物密度(LD＝10株植物/m2；HD ＝20株植物/m2)下，开花期后茎质量(PASM)和开花期后生物质(PAB) 之间的相关性。
图47为图示，显示了2004年的一项实验中，生长于水分有限条件下的Stg QTL和回交亲本(RTx7000)的多种组合在两种作物密度 (LD＝10株植物/m2；HD＝20株植物/m2)下，在中等谷物灌浆(FL-2) 下的相对水含量(RWC)和谷物产率之间的相关性。
图48为图示，显示了生长于水分有限条件下的Stg1 QTL(6078-1) 和回交亲本(RTx7000)的多种组合在两种作物密度(LD＝10株植物 /m2；HD＝20株植物/m2)下，FL-2在中等谷物灌浆下的叶片水势能 (LWP)(bar)与谷物产率(g/m2)之间的相关性。
图49为图示，显示了生长于水分有限条件下的四种Stg QTL和回交亲本(RTx7000)在两种作物密度(LD＝10株植物/m2；HD＝20 株植物/m2)下，在谷物灌浆期间PPBR和CWU之间的相关性。
图50为图示，显示了生长于水分有限条件下的四种Stg QTL和回交亲本(RTx7000)在两种作物密度(LD＝10株植物/m2；HD＝20株植物/m2)下，在谷物灌浆期间的CWU(mm)和谷物产率(g/m2)之间的相关性。
图51为图示，显示了生长于水分有限条件下的四种Stg QTL和回交亲本(RTx7000)在两种作物密度(LD＝10株植物/m2；HD＝20株植物/m2)下，PPBR和谷物产率之间的相关性。
图52为图示，显示了生长于水分有限条件下的四种Stg QTL和回交亲本(RTx7000)在两种作物密度(LD＝10株植物/m2；HD＝20株植物/m2)下，在谷物灌浆期间的CWU(mm)和谷物大小(mg)之间的相关性。
图53为图示，显示了生长于水分有限条件下的四种Stg QTL和回交亲本(RTx7000)在两种作物密度(LD＝10株植物/m2；HD＝20株植物/m2)下，PPBR和谷物大小之间的相关性。
图54为图示，显示了生长于水分有限条件下的多种Stg1精细定位品系和回交亲本(RTx7000)在两种作物密度(LD＝10株植物/m2；HD ＝20株植物/m2)下，在其谷物灌浆期间的PPBR和CWU之间的相关性。
图55为图示，显示了生长于水分有限条件下的多种Stg1精细定位品系和回交亲本(RTx7000)在两种作物密度(LD＝10株植物/m2； HD＝20株植物/m2)下，在谷物灌浆期间的CWU(mm)和谷物产率 (g/m2)之间的相关性。
图56A-C为图示，显示了使用种属变种Buster运行高粱作物仿真模型的结果，其中在灌溉良好(WW)和终极压力(TS)虚拟环境中使用了通常的2分蘖/植物(HT)对只有1分蘖/植物(LT)的Buster 而进行。对两种虚拟环境，都选择了以下参数：种植密度为5株植物 /m2，列间距为1m；土壤深度＝1800mm；土壤PAWC＝324mm；N无限制。
图57A为灌溉良好条件下SbPIN4(Stg1候选基因)的差异表达图示。在灌溉良好的条件下，该基因在Tx642及Stg1 NIL的幼根尖中相比Tx7000有所下调。
图57B为水分缺乏条件下SbPIN4(Stg1候选基因)的差异表达图示。在水分缺乏的条件下，该基因在Tx642及Stg1 NIL的多数组织中，尤其是在扩大叶中相比Tx7000有所上调。
图57C为灌溉良好条件下SbPIN2(Stg2候选基因)的差异表达图示。在灌溉良好的条件下，该基因在Tx642及Stg1 NIL的茎和根组织中相比Tx7000有所下调。
图57D为水分缺乏条件下SbPIN2(Stg2候选基因)的差异表达图示。在水分缺乏的条件下，该基因在Tx642及Stg1 NIL的多数组织中相比Tx7000有所上调。
发明详述
整个说明书中，除非上下文另有要求，否则词语“包含”或其变体如“包含了”或“包含有”都应被理解为意指包括所陈述的元素或整数或方法步骤或者一组元素或整数或方法步骤，但不排除任何其他元素或整数或方法步骤或者一组元素或整数或方法步骤。
如本说明书主体内容中所使用的，单数形式“一”、“一个”和“这个”包括复数方面，除非上下文清楚地表明不含有。因此，例如，提到“一个基因座”包括一个单一基因座，也包括两个或多个基因座；提到“一种生长素”，包括一种单一的生长素，也包括两种或更多种生长素；提到“本公开”包括本公开提供的单一和多个方面。术语“本发明”包括本文所包括的方面。本文包括、描述或要求的所有方面都能在本公开的广度内使用。
本公开教导了QTL，其关系到或促进包括谷类植物的作物中的持绿表型。QTL通常称为StgX，其中X为大于等于1的数字，对应着作物植物中具体染色体上的遗传基因座或遗传基因座区域。亚区域被称为StgXm，其中m为StgX内区域的字母标注。本文教导了对植物中所有或选定组织中StgX的表达的调制，以促进某些生理学或遗传学的工作网络，其诱导或促进作物植物对水分的利用转移至开花后阶段，或导致作物生长中水分利用度增加，或增加蒸腾作用效率，并由此增加水分有限条件下的收获指数(HI)和谷物产率。StgX的“表达”包括上调或下调某个基因座的表达水平(即，对表达的调制)也包括对多态性变体的选择，所述变体在植物中所有或选定组织中表达水平更高或更低，或其编码的产物活性更高或更低。基因座可能是自身产生所述表型，或是其功能等价物如与所述基因座编码相同蛋白质的 cDNA产生的表型。
QTL鉴别出编码PIN蛋白质的基因座。PIN蛋白质为生长素输出载体，其含有跨膜结构域，主要定位于细胞质膜上。术语“PIN”来源于“针样花序”。高粱的pin是“SbPIN”。本公开教导来自任何植物的PIN(例如来自水稻的OsPIN)。来自高粱的SbPIN的基因组定位在表1A中有所描述。
本文提供了用于生成遗传修饰植物的方法，所述遗传修饰植物比相同种属的非遗传修饰植物利用水分的效率更高，所述方法包括向植物或植物亲本中引入编码PIN蛋白质或其功能同源物或直向同源物的遗传试剂；或调制内源PIN蛋白质的表达的遗传试剂；其中PIN表达的水平和定位促进持绿表型，所述表型尤其包括冠层结构，其促进水分利用转移至开花后阶段或促进作物生长中水分利用度的增加，这样使得在水分有限的条件下收获指数和谷物产率增加。
本公开进一步教导了生成遗传修饰植物的方法，所述遗传修饰植物比相同种属的非遗传修饰植物更有效地利用水分，所述方法包括向植物或植物亲本中引入编码选自SbPIN1-SbPIN11的高粱SbPIN蛋白质或其在其他植物中的等价物的遗传试剂，或调制内源PIN蛋白质的表达的遗传试剂。PIN的实例包括SbPIN4和SbPIN2，以及表1A中列出的其他SbPIN，在其他植物中其的等价物，以及具有具体所需的多态性变化的PIN，如，其允许PIN蛋白质表达形式改变，表达水平提高。其他植物中PIN的实例有OsPIN5，其对应SbPIN4，以及OsPIN3a，其对应SbPIN2。
遗传试剂可为基因座或基因组区域或其功能等价物如cDNA或基因组DNA片段。备选地，所述试剂可调制例如具体植物中内源PIN 基因座的表达。通过“引入”，指的是通过重组干预，或通过诱变或杂交后进行选择而完成。
不意欲将本说明书的技术限制于任何理论或作用形式，对PIN的表达单独进行调制或与遗传或生理学网络组合对其进行调制改变了植物结构，以增强或促进有效的水分利用。在一方面，经修饰的结构是修饰的植物冠层结构。
术语“子代”包括直接的后代以及植物的远亲，只要其稳定表达首先引入较早亲本的持绿性状，就可称为子代。
提到“作物植物”，包括稻谷植物。本文可使用的作物植物包括高粱、小麦、燕麦、玉蜀黍、大麦、黑麦、水稻、蕉麻、苜蓿、杏、苹果、芦笋、香蕉、菜豆,黑莓、蚕豆、油菜、腰果、木薯、鹰嘴豆、柑橘、椰子、咖啡、玉米、棉花、亚麻、无花果、葡萄、落花生、大麻、洋麻、薰衣草、mano、蘑菇、橄榄、洋葱、豌豆、花生、梨、珍珠米、马铃薯、苎麻、菜籽、黑麦草、大豆、草莓、甜菜、甘蔗、向日葵、甘薯、芋头、茶、烟草、番茄、黑小麦、松露和山药。在一个实施例中，高粱的耐干旱机制被用于在高粱及其他作物植物中促进干旱耐受性。在一个实施例中，遗传修饰的植物比相同种属的非遗传修饰植物更有效地利用水分。上述每种植物中存在的PIN基因座被称为“内源”PIN。本公开教导如何上调和下调内源PIN，或选择具有具有表达谱的PIN。“内源”PIN是亲本植物在任何操作(重组、诱变或杂交)之前的PIN基因座。
“干旱耐受”包括干旱逃避、干旱适应、干旱抵抗、对干旱条件敏感度降低、水分利用效率增加以及将水分利用转移至开花后阶段的能力或作物生长中水利用度增加，由此在水分有限条件下增加HI和谷物产率。显示了干旱耐受性的植物被描述为“干旱适应性植物”或“对水分有限条件显示出降低敏感度的植物”。本文教导的是，干旱耐受性是由持绿性性状诱导、促进的，或与之相关。
在植物的情况下，“遗传修饰的”包括原始来源的遗传修饰植物以及任何稳定表达持绿性性状的子代、中间体或远亲。因此，本公开教导了引入遗传试剂(即，持绿QTL或其功能等价物如cDNA或上调或下调(即调制)所述QTL由其编码的蛋白质的cDNA或基因组片段或试剂)的经典杂交技术以及遗传工程技术。术语“遗传工程方式”及“重组方式”包括后者。限定持绿性的标记物也可在杂交操作流程中进行筛选，以监测具体遗传区域的转移。进一步地，具体的持绿性区域是通过重组方式遗传插入植物细胞或植物愈伤组织及再生的幼株中。“遗传修饰的”植物包括亲本或其任何子代，以及植物的任何产物如谷物、种子、繁殖器官、花粉和卵细胞。此外，PIN基因座可表达于某个具体植物组织中但在其他组织中不表达或表达降低。进一步地，植物可经过诱变如遗传、放射或化学诱变，或为选择具有所需表型的 PIN的突变植物。
提到“持绿表型”，包括选自以下的特征：冠层结构柔性增加、冠层大小减少、开花期酶单位叶片面积的生物质增加、蒸腾作用效率提高、谷物灌浆期水分利用增加、谷物灌浆期植物水分状况增加、开花期前生物质：开花期后生物质比率减少、衰老延迟、谷物产率增加、谷物大小增加、倒伏减少。
本文提供了用于生成遗传修饰植物的方法，所述植物比相同种属的非遗传修饰植物更有效地利用水分，所述方法包括向植物或植物亲本中引入编码与持绿表型相关或促进持绿表型的产物的遗传试剂，所述持绿表型包括水分利用转移至开花后阶段或作物生长中水分利用度的增加或蒸腾作用效率的增加，这些导致水分有限条件下收获指数和谷物产率的增加，其中所述产物选自以下列表：SbPIN1-11，包括 SbPIN4和SbPIN2,以及表1A中列出的其他SbPIN，或其他植物中其的等价物，或调制植物中内源PIN的表达的试剂。
因此，本文教导了编码PIN的遗传材料或调制内源PIN水平的遗传材料的用途，用于促进持绿表型。
本文提供了遗传修饰的植物，其显示了遗传修饰造成的持绿表型，还提供了其种子、果实、花和其他生殖或繁殖材料。本文还提供了根茎及繁殖原种。这基于的前体条件是所述种子、果实、花和其他生殖或繁殖材料可显示持绿表型或将引入最终亲本的持绿表型传递下去。
提到“调制PIN表达水平的试剂”包括促进所述基因在所有或选定组织中表达增加或降低或者促进基因产物活性增加或降低的启动子、微小RNA、基因和化学化合物，以及cDNA和基因组片段。试剂还可为基因组基因的内含子，其为促进表达调制的天然遗传网络的一部分。
PIN蛋白质在细胞中产生生长素梯度并含有跨膜结构域，并且主要定位于细胞质膜上。PIN蛋白质为生长素传输的限速因素，并未生长素流向提供了矢量方向。本文教导至少Stg1或Stg2中的一个编码了PIN蛋白质。教导了在植物中从新引入Stg1或Stg2或者提高内源 Stg1或Stg2的调制或表达的方法，以促进一种或多种与持绿表型相关的特征或亚特征的表现。
如上文所提出的，PIN蛋白质是生长素的输出载体，其介导生长素从细胞到细胞的极性传输(PAT)，而不是生长素穿过木质部的传输(Rashotte等人，Plant Cell 13:1683-1697,2000；Friml等人，Current Opinion in Plant Biology 6:7-12,2003)。术语“PIN”来源于针样花序，这种现象在拟南芥中缺乏生物素传输时会表现出来。本文提供了来自高粱的SbPINn，其中n为1-11的数字，还提供了来自任何其他植物的PIN。
本文还教导了用于生成遗传修饰植物的方法，其中植物比相同种属的非遗传修饰植物更有效地利用水分，所述方法包括向植物或植物亲本中引入遗传试剂，其编码选自以下列表的蛋白质：SbPIN1-11，包括SbPIN4和SbPIN2,以及表1A中列出的其他SbPIN，或其他植物中其的等价物，或调制植物中内源PIN的表达的试剂。
本公开教导了高粱SbPIN4和SbPIN2与其他SbPIN以及其他植物中其的等价物都是主要的干旱适应性基因。生长素信号传导的差异解释了具有PIN表达谱的植物中观察到的所有多种表型。SbPIN4或 SbPIN2植物表现的表型可例如通过生长素输出变化来解释，包括分蘖减少、叶片变小(包括长度和宽度)、叶片质量减少以及生根：发芽比率增加。SbPIN4或SbPIN2植物表现的表型也可例如间接(或作为这些直接效应的立即结果)得到解释，包括开花期水分利用度增加、开花期叶片N浓度更高、蒸腾作用及每单位叶片面积生物质的增加、蒸腾作用效率提高、灌浆期绿叶面积的保留、收获指数增加、谷物产率提高、谷物大小增加以及抗倒伏性增加。本文提供了SbPIN4和 SbPIN2和其他SbPIN的等价物，其在其他主要稻谷和作物种属中都是可操作的，以增强世界上水分限制了开花后作物生长的地区的干旱适应性。
根据本说明书的教导，对选自SbPIN1-11的PIN如SbPIN4(Stg1) 和SbPIN2(Stg2)或其他植物中其的等价物在所有或选定组织中的表达进行调制会直接或间接赋予植物干旱适应性，最终在水分有限条件下达到更高的谷物产率、更大的谷物大小以及抗倒伏性。
在一个实施例中，持绿表型涉及多种蛋白质的存在，如SbPIN1-11 中的两种或更多种，如SbPIN4和SbPIN2。
本文教导了用于生成遗传修饰植物的方法，其中植物比相同种属的非遗传修饰植物更有效地利用水分，所述方法包括向植物或植物亲本中引入遗传试剂，所述遗传试剂编码两种或更多种PIN或与持绿表型相关或促进该表型的其功能同源物或直向同源物，所述表型包括水分利用转移至开花后阶段或作物生长中水分利用度的增加或蒸腾作用效率的增加，这些导致水分有限条件下收获指数和谷物产率的增加；或引入调制两种或更多种PIN表达水平的试剂。
通过“两种或更多种”意指2或3或4或5或6或7或8或9或 10或11种。还可表达或抑制单个或多个PIN基因座。
在一个实施例中，遗传材料选自(i)编码SbPIN4的试剂；以及(ii) 调制SbPIN4或其他植物中其的等价物的表达水平的试剂。在另一个实施例中，遗传材料选自(i)编码SbPIN2的试剂；以及(ii)调制SbPIN2 或其他植物中其的等价物的表达的试剂。
在含有Stg1区域的植物中，开花期水分利用度的增加是通过减少水分利用而实现的，后者是由两种机制(分蘖减少和叶片变小)造成的。两种机制分别平均减少冠层大小大约9％。“低分蘖”机制在分蘖潜能很高的低密度环境下起主导作用。“小叶”机制在分蘖潜能很低的高密度环境下起主导作用。结合起来，这两种机制提供了这样的作物植物，其在对严重水分受限的应答时具有显著的修饰冠层结构柔性。
持绿性通过组成性和适应性应答增加了冠层结构柔性。Stg1或 Stg2的冠层大小减少了大约5％,甚至是在水分并不受限的时候(组成性应答)。冠层大小在轻度干旱(～10％)及更严重的干旱条件(～15％) 下有进一步减少(适应性应答)。低分蘖主要是组成性应答。叶片大小更小是组成性同时也是适应性应答。
进一步地，本文教导了Stg1或Stg2区域通过减少冠层大小(这是通过减少分蘖和更小的叶片而实现的)及减少开花期作物的水分利用而赋予干旱适应性。这显示为人工干旱(防雨棚[ROS])和蒸渗计研究中冠层大小和作物水分利用之间的高度相关性表示(r2＝0.9)。
开花期水分利用度的增加也是通过水分利用度的增加(更好的水分提取及更深或更大范围的横向扩展)而实现的。
持绿性增加了开花期每单位叶片单位的生物质。假定根质量相等 (或至少不会明显较少)，这些差异可通过每单位叶片面积[LA]的蒸腾作用(T)(T/LA)和/或蒸腾作用效率(TE)的差异而解释。蒸渗计研究表明，T/LA的增加驱动了观察到的每单位叶面积生物质的增加，而不是TE的增加。注意到增加的T/LA只发生于水分缺乏足以减小叶片面积的情况下。当水分缺乏不那么严重的时候(即，不足以减少叶片面积)，T/LA会降低，导致更高的TE。
当水分缺乏不那么严重时，在StgX品系如Stg1或Stg2品系中也观察到了更高的TE。有人提出通过基因渗入Stg1或Stg2导致TE的增加是由于a)相比于气孔导度成比例的更高的光合能力，所述更高的光合能力是由于更小较薄较绿的叶片造成，及/或b)维持生物质的同时蒸腾作用降低。蒸渗计研究表明这两种机制都有助于Stg1品系中的更高TE，其中蒸腾作用的减少是主要的机制。
本文教导的每单位叶片面积的蒸腾作用的变化的原因是因为a) 气孔数量,b)气孔孔隙大小，c)气孔开启和关闭相对于VPD的时间安排，及/或d)毛基底细胞(其影响边界层，因此影响到T/LA)的数量。 Stg1例如向RTx7000的基因渗透通过增加维管束周围的维管束鞘细胞修饰了叶片的解剖学结构。
叶片形态学的差异在RTx7000和Stg1或Stg2之间显而易见。在此情况下，Stg1和Stg2的维管周围有更多更小的维管束鞘。而且， Stg1相比于RTx7000，其每单位的叶片面积(叶片7和10)有更少的气孔，更多的毛基底细胞。
谷物灌浆过程中水分利用的增加是通过(i)开花期增加的水分利用度以及(ii)谷物灌浆过程中增加的水分利用度(更好的水浸提，更深更广的侧向扩展)而实现的。
在人工干旱(防雨棚[ROS])实验中，开花期前的作物水分利用 (CWU)与开花期后的CWU是负相关的。例如，在一个实验中，开花后水分利用增加25％(80对比60mm)导致谷物产率增加25％(400对比300g/m2)。这转换成每增加额外的1mm可用的水有50kg/ha的谷物产率。
在防雨棚(ROS)实验中，Stg1或Stg2在低密度和高密度处理下都显示出灌浆过程中水分利用的增加。这主要是由于(i)高密度下开花期水分利用减少，以及(ii)低密度下谷物灌浆过程中水分利用度增加。
本文教导的是，StgX如Stg1或Stg2通过与开花前后生物质生产相结合而赋予干旱适应性。例如，Stg1或Stg2区域减少了临界水平以下的开花前：开花后生物质比率，增加了谷物产率和抗倒伏性。
根据本公开的教导，StgX如Stg1,Stg2,Stg3和/或Stg4的表达促进一种或多种以下表型：
(i)叶片衰老延迟(持绿)，谷物产率和抗倒伏性更高，这些是由于谷物灌浆期间植物水分状态更高的结果(由于谷物灌浆期水分利用增加)；
(ii)将StgX引入例如RTx7000背景增加了中等谷物灌浆下的植物水分状态，这可由a)更高的相对水含量(RWC)，及b)更低叶片水势能(LWP)表示；
(iii)更高谷物产率和更大的谷物大小是谷物灌浆过程中水分利用度增加的结果；
(iv)更高谷物产率、更大谷物大小和增加的抗倒伏性不是相互排斥的(即，StgX显示所有三个性状)；
(v)严重极端干旱时产率和谷物大小优势相对比轻度极端干旱条件下更高；
(vi)持绿基因在RTx7000背景(自交系)中的益处(12-22％)在产率范围为1-3t/ha,紧随其后的是产率范围为3-4t/ha，此时有较少但仍然显著的益处(8-10％)。然而，在更高产率水平时(5-8t/ha)与这些区域相关的是少量罚分(2-4％)，这是由于较湿的环境造成的。注意到这些产率范围在杂交品系中会显著更高。因为北方粮食带的杂交品系的高粱平均谷物产率为大约2.5t/ha，所以持绿基因的益处应该很显著。在较潮湿的条件下(水分不受限制)杂交品系中未观察到由于持绿性导致的谷物产率的减少；
(vii)将StgX基因渗入到例如RTx7000中在极度干旱条件下，也将谷物大小平均增加了11％。在轻度终极干旱条件下或不干旱条件下，StgX QTL对谷物大小没有影响；并且，
(viii)每种关键StgX的机制都定位于限定的区域，这表明单一基因的作用有多种多营养效应。
本公开进一步教导了增强作物生产的经济回报率的商业模型。根据这些教导，提供了提高作物产率的经济回报的商业模型。所述模型包括生成具有PIN表达谱的作物植物，该表达谱使得所述作物植物的植物水分利用转移至开花后阶段或使得作物生长中水分利用度增加，由此增加水分有限条件下的HI和谷物产率，包括从所生成的作物中获得种子，以及将种子分配给谷物生产商以产生增强的产率和收益。提到PIN，包括SbPIN1-11如SbPIN4和SbPIN2，以及其他植物中其的等价物。
本文教导了植物管理系统，以减少作物对水分的依赖或提高水分利用效率及增强谷物或产品产率。所述植物管理系统包括单独对如本文所限定的PIN基因座或其功能等价物的表达进行选择和调制或者结合引入其他有用的性状如谷物大小、根大小、盐耐受性、除草剂抗性、害虫抗性等等，以生成干旱适应性作物，包括稻谷植物。备选地或此外地，所述植物管理系统包括生成干旱适应性植物，以及农业步骤如灌溉、营养需求、作物密度和几何学形态、杂草控制、昆虫控制、翻土、减少耕地、提高床层等等。
本说明书是指导性的，说明了通过从新引入一种或多种持绿表型的特征或者提高或减少植物中已存在的一种或多种PIN基因座的表达及/或选择具有提高或增强的表达或产物活性的PIN多态性变体以诱导或增强植物的干旱适应能力的方式。对持绿表型的操作可单独完成或作为完整的植物管理系统的一部分而完成，其可包括进一步的性状选择和/或提高的农艺学技术。所得的作物更有效地利用水分，并具有更高的谷物产率和增加的谷物大小。
本教义包括从干旱适应性或增强的作物植物中收集种子以分配至培育者，最终增加谷物产率的商业模型。
本公开能够用于使用编码PIN蛋白质的或调制内源PIN蛋白质表达水平的遗传试剂用于制造干旱适应性植物的方面。
QTL在本文被鉴定为携带一个或多个PIN基因座，其中其的表达水平是在杂交操作流程或通过遗传工程改造而选择的，以促进持绿表型。
本文还教导了表现出持绿表型的遗传修饰植物及其子代以及种子、果实和花及其他生殖或繁殖材料。
本文还提供了编码与持绿表型相关或促进持绿表型的PIN蛋白质或其功能同源物或直向同源物的遗传材料，其中所述表型包括冠层结构，其促进水分利用转移至开花后阶段或促进作物生长中水分利用度的增加或蒸腾作用效率的增加，使得水分有限条件下的收获指数和谷物产率增加；还提供了调制PIN水平的试剂。
在一个实施例中，遗传材料选自：(i)编码列于表1A的SbPIN的试剂；以及(ii)调制列于表1A的SbPIN或其他植物中其的等价物的表达水平的试剂。
在一个实施例中，所述遗传材料选自(i)编码SbPIN4的试剂；以及(ii)调制SbPIN4或其他植物中其的等价物的表达水平的试剂.在另一个实施例中，所述遗传材料选自(i)编码SbPIN2的试剂；以及(ii) 调制SbPIN2或其他植物中其的等价物的表达水平的试剂。
所述遗传材料包括编码与持绿表型相关或促进持绿表型的PIN蛋白质或其功能同源物或直向同源物的试剂，其中所述表型包括冠层结构，其促进水分利用转移至开花后阶段或促进作物生长中水分利用度的增加或蒸腾作用效率的增加，使得水分有限条件下的收获指数和谷物产率增加。所述活性试剂包括上调或下调PIN水平的试剂。所述基因还可用作标志物，以将包含一种或多种所述基因或其他植物中其的等价物的基因组区域转移至具体植物中以包括持绿表型。
实施例
本文教导和提供的方面通过以下非限制性实施例进行进一步描述。
实施例1
鉴定StgX基因
数量性状基因座(QTL)，在本文称为Stg1，是StgX的一个实例，其因为增加或增强高粱植物的水分利用效率而被鉴定。Stg1编码生长素输出载体组分4家族的一个高粱双色成员,PIN4(或SbPIN4)。
这个主要的干旱适应性基因已经在高粱基因组上有精细定位。生长素输出的变化可解释含有SbPIN4的植物中观察到的所有多种表型。在精细定位群体的两个亲本中(RTx7000和Tx642)都对候选基因 (及启动子区域)进行了测序以鉴定单核苷酸多态性。还对Stg1精细定位群体就品系亚群、时间和器官进行了RNA表达谱的测定。SbPIN4 植物显示出的可由生长素输出变化直接解释的表型包括分蘖减少、叶片更小(长度和宽度皆更小)、叶片质量减少以及生根:发芽比率减少。 SbPIN4植物显示出的可由生长素输出变化间接解释(或为这些直接效应的立即结果)的表型包括开花期水分利用度增加、开花期叶片N 浓度增高、蒸腾作用及每单位叶片面积的生物质增加、开花前：开花后生物质比率减少、蒸腾作用效率提高、谷物灌浆期绿叶面积保持、收获指数增高、谷物产率更高、谷物大小变大以及抗倒伏性增加。有人提出，SbPIN4也能在其他主要稻谷和作物种属中起作用增强世界范围内水分限制开花期后作物生长的地区的干旱适应性。
Stg1(SbPIN4)直接和间接地赋予了干旱适应性，最终导致在水分有限的条件下谷物产率更高、谷物大小变大以及产生抗倒伏性。
含有Stg1区域的植物中在开花期水分利用度的增加是通过两种机制(分蘖减少和叶片更小)的水分利用减少而实现的。两种机制的每种平均减少了冠层大小的大约9％。“低分蘖”机制在分蘖潜能高的低密度环境下起主导作用。“小叶”机制在分蘖潜能低的高密度环境下起主导作用。组合而言，这两种机制为植物提供了很大的柔性，以对水分限制的严重性产生应答而修饰冠层结构。
持绿性通过组成性和适应性应答增强冠层结构的柔性。Stg1中的冠层大小甚至在水分不受限制时也减少了大约5％(组成性应答)。冠层大小在轻度干旱(～10％)及更严重的干旱条件(～15％)下有进一步减少(适应性应答)。低分蘖主要是组成性应答。叶片大小更小是组成性同时也是适应性应答。
(通过分蘖减少和叶片更小造成的)冠层大小减小与开花期作物水分利用减少有关联。ROS及蒸渗计研究中冠层大小和作物水分利用有高度相关性(r2＝0.9)。
开花期水分可用性增加也是通过水分利用度增加而实现的(更好的水浸提或更大的侧向扩展范围)。
持绿增加了开花期每单位叶片面积的生物质。假定根质量相等 (或至少不会明显较少)，这些差异可通过每单位叶片面积的蒸腾作用(T/LA)和/或蒸腾作用效率(TE)的差异而解释。蒸渗计研究表明，是T/LA的增加驱动了观察到的每单位叶面积生物质的增加，而不是 TE的增加。注意到增加的T/LA只发生于低的VPD条件下；在高的 VPD条件下T/LA实际会降低，一般认为这是一种水分保持机制。
Stg1品系中的高TE也在更高VPD条件下观察到。通过基因渗入 Stg1导致TE的增加可能是由于a)相比于气孔导度成比例的更高的光合能力，所述更高的光合能力是由于更小较薄较绿的叶片造成，及/ 或b)维持生物质的同时蒸腾作用降低。蒸渗计研究表明这两种机制都有助于Stg1品系中的更高TE，其中蒸腾作用的减少是主要的机制。
每单位叶片面积的蒸腾作用的变化的原因可能是因为a)气孔数量,b)气孔孔隙大小，c)气孔开启和关闭相对于VPD的时间安排，及/或d)毛基底细胞(其影响边界层，因此影响到T/LA)的数量。Stg1 向RTx7000的基因渗透减少了叶片7和10中每单位叶片面积的气孔数量并增加了毛基底细胞数量；两种机制都可通过减少T/LA保持水分。
Stg1向RTx7000的基因渗入通过增加维管束周围的维管束鞘细胞的数量而修饰了叶片的解剖学形态。维管束鞘中细胞数量的增加也可能有助于增加光合作用同化，因此增加TE。
Tx7000和Stg1之间的叶片(如叶片7和10)形态学差异明显。在此情况下，Stg1植物中维管束周围的维管束鞘更多更小。维管束鞘中细胞数量增加也可能有助于增加光合作用同化，因此增加TE。
谷物灌浆过程中水分利用增加是通过(i)开花期水分可用性增加以及(ii)谷物灌浆过程中水分利用度增加(更好的水抽提及更深或更广范围的侧向扩展)而实现的。
a)开花期水分可用性增加
在一项ROS实验中，开花期前的作物水分利用(CWU)与开花期后CWU负相关。例如，在一项实验中，开花期后水分利用增加25％ (80 vs 60mm)导致谷物产率增加25％(400 vs300g/m2)。这转换成每增加1mm可用的水分，有50kg/ha的稻谷产率。
b)谷物灌浆过程中水分利用度增加
在一项ROS实验中，Stg1植物在低密度和高密度处理下都显示出谷物灌浆期过程中水分利用的增加。这主要是由于(i)高密度下开花期水分利用减少，以及(ii)低密度下谷物灌浆过程中水分利用度增加。
Stg1区域通过开花前后生物质产量之间的关联赋予了干旱适应性。Stg1区域减少了临界水平以下的开花前：开花后生物质比率，这样增加了谷物产率及抗倒伏性。
叶片衰老延迟(持绿)，谷物产率和抗倒伏性更高，这些是谷物灌浆期间植物水分状态更高的结果(由于谷物灌浆期水分利用增加)。
Stg1向RTx7000背景植物的基因渗入增加了中等谷物灌浆下的植物水分状态，这可由a)更高水分含量(RWC),以及b)更低叶片水势能(LWP)表示。
更高谷物产率和更大谷物大小为灌浆过程中水分可用性增加的结果。
更高的谷物产率、更大的谷物大小和增加的抗倒伏性并非相互排斥的(即，Stg1表现出所有三种性状)。
在严重终极干旱条件下产率及谷物大小的优势比轻度终极干旱条件下相对更高。
研究表明，在RTx7000背景品系(自交系)中，产率范围为1-3 t/ha时持绿基因产生的益处最大(12-22％),紧随其后的是产率范围为 3-4t/ha时，此时有较少但仍然显著的益处(8-10％)。然而，在更高产率水平时(5-8t/ha)与这些区域相关的是少量罚分(2-4％)，这是由于较湿的环境造成的。注意到这些产率范围在杂交品系中会显著更高。因为北方粮食带的杂交品系的高粱平均谷物产率为大约2.5t/ha，所以持绿基因的益处应该很显著。总体来说，杂交品系中未观察到在较潮湿的条件下(水分不受限制)由于持绿性导致的谷物产率的减少。
Stg1向RTx7000的基因渗入在严重终极干旱条件下还使谷物大小平均增加了11％。所述QTL在轻度终极干旱条件或非干旱条件下对谷物大小没有影响。
关键Stg1机制中每种都定位于相同区域，表示单一基因起到多种多营养效应。
实施例2
分蘖减少(田地中进行的NIL生理学研究)
数据显示了高水分(HW)和低水分(LW)条件下Stg1对分蘖的影响。开花前冠层发育的差异大部分是品系间分蘖差异的结果。开花期每m2的茎杆数量是分蘖对冠层动态的效应的最好的总体量度。在两种给水方案下，每m2的茎杆数量是相等的(12.89)，这表明分蘖减少是组成性性状。此项参数上，表型变化显著(P<0.001)，范围为 8.59-16.67。然而，表型和处理方式对此项参数没有显著的交互作用。
根据Stg状态分析植物的每m2的茎杆数量，分类方式列于表1。 RTx7000比B35产生多出41％的茎杆数量/m2(14.07 vs.10.00) (P<0.05)。单独将Stg1区域向RTx7000(6078-1)中进行基因渗透相比 RTx7000显著减少了茎杆数量/m2(9.40 vs.14.07)(P<0.05)。相比于只基因渗透Stg1，另外基因渗透Stg2或Stg4使茎杆数量增加至10.49 (1,2组合)和10.74(1,4组合)。注意到不含Stg区域(2212-3,2235-11和 6120-16)三个近等基因系也显示出等同于Tx7000的高分蘖现象。因此，这些品系中总体分蘖排序为：Stg1<B35<Stg4<Stg2<Stg3<无渗透<RTx7000。
开花期时，茎杆数量与总绿叶面积(GLAA；图1)高度相关 (r2＝0.71)。
表1
回交亲本(RTx7000)及含有Stg1 QTL基因渗透(单独渗透或与 Stg QTL组合渗透)的多种品系中每m2的茎杆数量。
开花期绿叶面积(GLAA)的差异主要是由于开花期分蘖绿叶面积(GLAAt)的差异，因为GLAAt与GLAA高度相关(r2＝0.78),而主茎叶片面积并不相关。
根据Stg状态分析开花期分蘖绿叶面积，分类方式列于表2。RTx7000产生的GLAAt比B35多出几乎8倍(15460 vs.1980)(P<0.05)。单独将Stg1区域向RTx7000(6078-1)中进行基因渗透相比RTx7000 显著减少了GLAAt(3121 vs 15460)(P<0.05)。相比于只基因渗透Stg1，另外基因渗透Stg2或Stg4使GLAAt增加至4187(1,2组合)和 4797(1,4组合)。(以任何组合方式)含有Stg1的所有品系的GLAAt 与单独Stg1之间没有显著差异(P<0.05)。注意到不含Stg区域(2212-3, 2235-11和6120-16)三个近等基因系中GLAAt与RTx7000之间没有显著差异。因此，这些品系中显著不同(P<0.05)的GLAAt的排序为B35 ＝Stg1＝Stg4<Stg2＝Stg3<无渗透＝RTx7000。
表2
回交亲本(RTx7000)及含有Stg1 QTL基因渗透(单独渗透或与 Stg QTL组合渗透)的多种品系中的分蘖绿叶面积。
在防雨棚实验中，开花期绿叶面积和每m2茎杆数量在高密度 (HD)和低密度(LD)处理下都是高度相关的(图2)。在两种密度下将Stg1或Stg1a基因渗透入RTx7000减少每m2茎杆数量及 GLAA。
实施例3
分蘖减少(精细定位研究)
Stg1精细定位群体在高密度和低密度条件下于田地中连续生长三年。每年对开花期每株植物的茎杆数量进行测量，对几年的结果进行组合分析。总体而言，RTx7000比6078-1产生的每株植物茎杆多出47％(1.85 vs.1.26；图3)。
在这些田地研究中，对所述性状(每株植物的茎杆数量)进行定位。用于定位目的，每株植物1.54个茎杆作为强制值，为高分蘖和低分蘖之间给出最佳分界(即，少于1.54个茎杆的重组子为BB基因型，而超过1.54个茎杆的为TT基因型)。根据标记物逐步向下进行分析，表明功能获得(低分蘖)在三种基因型中达到(10564-2、10704-1和 10620-4)。一个重组子(10568-2)显示了高分蘖表型，而其他三个 (10620-4、10704-1和10564-2)显示了低分蘖表型。生长素输出载体组分5基因被认为是候选基因。
实施例4
分蘖减少(ROS中Stg1精细定位研究)
一个亚组的Stg1精细定位群体在高水分和低水分条件的防雨棚 (ROS)中生长田地中，每种给水处理都分为高密度和低密度。这形成了四种给水方案，水分缺乏程度依次增加：HWLD(缺水压力最小) <HWHD<LWLD<LWHD(缺水压力最大)。在每块试验田中导入期后 44天测量每株植物的茎杆数量。低密度(LD)处理中差异最明显，因为分蘖表达在此实验中得到最大化。平均地，RTx7000、10568-2 和10709-5在LWLD条件下每株植物产生的茎杆比6078-1和10604-5 多出27％(2.05 vs.1.62；图4)，在HWLD条件下每株植物产生的茎杆多出23％(1.49 vs.1.22)。
实施例5
分蘖减少(igloo中Stg1精细定位研究)
在控制条件下的igloo中对Stg1群体进行了三项另外的精细定位研究。在这些研究中，与早先的田地研究相比较，对分蘖进行更详细的分析。对分蘖总数进行计数，更具体地，对出现于叶片2(T2)、3(T3) 和4(T4)的分蘖数量进行计数。T2的存在与否是给定重组子总体分蘖潜能的最佳标志物。T2也是用于对所述基因进行精细定位的最好性状。
在此项实验中，分蘖总数为T2、T3和T4的总和，其中T2为从叶片2的叶腋出现的分蘖(对于T3、T4也是同样)，包括二级分蘖。在此研究中观察到所有分蘖相关性状的显著基因型变化(表34),遗传度通常超过30。
表3
表3提供了L11收获时测量的预测方式、P值及分蘖性状遗传度的总结。显著差异(P<0.05)用黄色阴影表示，遗传度>20以绿色阴影表示。
对T2、T3和T4数据进行独立分析发现6078-1在四组重复中未产生任何T2分蘖，而RTx7000在4组重复的2组中产生有T2分蘖 (图5)。
T3数量上的差异也显而易见。6078-1在4组重复中的一组产生了T3分蘖，而RTx7000在所有4组重复中都产生了T3分蘖(图6)。
T4分蘖数在不同基因型之间也有变化。6078-1在4组重复中的3 组产生了T4分蘖，而RTx7000在所有4组重复中都产生了T4分蘖。因此Stg1基因渗入基本上阻止了RTx7000背景的植物中T2和T3分蘖的生长。
将在0-2组重复(低分蘖组；8株重组子)中产生T2分蘖的品系与在3-4组重复(高分蘖组；8株重组子)中产生T2分蘖的品系分开 [表4,图7]。
表4
表4显示了8株高分蘖重组子以及来自Stg1精细定位群体的8 株低分蘖重组子(绿色阴影)的分蘖存在情况(T1-T3)和分蘖总数 (棕色阴影)。
在重组子10604-1-157-5中有功能获得(低分蘖)。在3株重组子(10604-1-195-5、10604-1-56-7、10604-1-477-4)中也有功能获得(低分蘖)。
该实验中使用了一个亚组的品系以验证分蘖区域。对每株重组子使用了更多的重复(20)用于进一步减少误差偏差并增加品系之间的个体识别率。结果表明存在有生长素输出囤积基因。
根据这些品系的基因型(BB或TT)对其进行断点分析，对目的区域“逐步向上”或“逐步向下”进行分析，以进一步对低分蘖基因进行精确定位。明显存在一个清晰的断点，其将产生总分蘖数>2.5的品系 (高分蘖组；5株重组子)与产生总分蘖数<2.5的品系(低分蘖组；3 株重组子)分开[表5；图8]。
表5
表5显示了来自Stg1精细定位群体的五株高分蘖重组子(棕色阴影)及三株低分蘖重组子(绿色阴影)分蘖(T1-T4)的存在情况，包括二级分蘖，以及分蘖总数。
在重组子10604-1-157-5中达到功能获得(低分蘖)。因此双色高粱中的PIN4基因(本文记为“SbPIN4”)是Stg1低分蘖基因的强有力的候选基因。
实施例6
更小的叶
总体来看，将Stg1区域基因渗透入RTx7000在灌溉良好和水分有限的条件下都减少了叶片大小(长度和宽度)，表明这是一种组成性基因作用。然而，叶片大小一般在水分有限条件下减少更多，这在一定程度上表明在组成性应答之外还有适应性(可诱导)应答。因此， Stg1赋予两种减少冠层大小的机制：a)分蘖减少，以及b)叶片大小减少。组合起来，这两种机制为植物提供了相当程度的柔性，以修饰冠层结构对环境和/或管理因素产生应答。
一系列蒸渗计研究在评估不同程度的蒸汽压差(VPD)条件下的叶片大小形式上尤其有说明作用(图9A-D)。在两项试验中都对盆栽进行规律的给水，但冠层大小在季节间有差异，认为这是因为温度和 VPD上的季节差异，其产生了高(1.8kPa)和低(1.3kPa)的VPD条件。对于主茎和最大的分蘖(T3)，叶片大小的减少在高VPD及低VPD条件下都很显著(图9A-D)，尽管主茎(L12 vs L9)和T3(L7 vs L5)中的所述减少在低VPD下相比于高VPD下出现较晚。
然而，对于其余的分蘖(T4-T6)，叶片大小分布在实验之间差异很大。RTx7000和6078-1在高VPD下叶片大小之间没有差异，而低VPD 下6078-1的叶片显著更小。这表明对于T4-T6在特定环境条件下VPD 对叶片大小减少的适应性(可诱导)应答。
因此，在低的水分压力下，将Stg1基因渗透入RTx7000导致主茎和最大分蘖(T3)中叶片变小，但在T4-T6中并非如此。这种应答会使植物在条件改善时后期分蘖中的截光作用得到最大化。在高的水分压力下，将Stg1基因渗透入RTx7000导致所有茎杆中产生更小叶片。这种应答会使植物在水分有限条件下极大地减少其冠层大小。
实施例7
更小的叶(防雨棚研究)
在防雨棚(ROS)中进行实验以评估两种作物密度下Stg1区域的影响，由此创造出两种水分缺乏水平(高密度＝高压力；低密度＝低压力)。通常，在HD(20株植物/m2)下分蘖更低或没有，在LD(10 株植物/m2)下分蘖正常。
在高密度(HD)处理下，两年中冠层大小都更小，反映了这种处理产生的水分缺乏较严重。在较轻度(LD)和较严重(HD)的水分缺乏条件下，在两年中，叶片大小通常在6078-1(Stg1)中比RTx7000 中更小。例外的是在较轻的水分缺陷(LD)条件下6078-1和RTx7000 的叶片大小分布形式是类似的，然而，在较严重的水分缺乏(HD)条件下6078-1的叶片显著更小(变小了多至18％)，表示这是Stg1植物对不断增加的水分缺乏的适应性应答。事实上，在较严重的水分缺乏(HD)下，将Stg1区域基因渗入到RTx7000中减少了四片最大叶片(L10-L13)的大小，平均减少了16.5％。因为在此处理中任何基因型中都很少分蘖，所以6078-1中的叶片大小减少应当极大地减少了冠层大小，因此减少了作物水分利用(假定每单位叶片面积的蒸腾作用类似)。
注意到与Stg1相关的叶片大小减少机制似乎在分蘖存在(LD) 或不存在(HD)的条件下都能工作，但似乎在通常发生单一茎杆和高度水分缺乏条件的HD下有最好的表达。
实施例8
更小的叶(防雨棚下Stg1精细定位研究)
一个亚组的Stg1精细定位群体在高水分和低水分条件的防雨棚 (ROS)中生长于田地中，每种给水处理都分为高密度和低密度。这形成了四种给水方案，水分缺乏程度依次增加：HWLD(缺水压力最小)<HWHD<LWLD<LWHD(缺水压力最大)。测量所有表型在所有处理中的完全展开的主茎叶片的面积。
将整个Stg1区域(6078-1)进行基因渗透，或更具体地，将更小的记为10604-5的区域进行基因渗透，导致低水分和高密度条件下叶片9-13大小减少(图10)。例如，与RTx7000相比,10604-5和6078-1 中的L11分别小了9％和16％。由于分蘖在此处理中是可以忽略的，所以冠层大小的差异基本上是由于叶片大小差异造成的。
在低密度条件下，叶片大小分布受到分蘖的影响，与高密度处理相比，导致一些混合的出现(见图10)。然而，注意到HD和LD处理下，10604-5比10709-5、10568-2和RTx7000产生的叶片9-13都更小。
“小叶大小”基因定位于候选基因，生长素输出载体组分5上。
实施例9
更小的叶(igloo中的精细定位研究)
叶片面积在不同基因型之间相差十分显著(P<0.001)，对叶片4 和5的遗传度接近60。将Stg1区域基因渗入RTx7000中减少了叶片 1-6的面积(图16)。例如，RTx7000中的L6面积(67.4cm2)比6078-1 中(55.3cm2)高出22％，尽管所述差异在P＝0.05水平上并不显著。L6 面积范围为47.8cm2-93.9cm2(LSD[0.05]＝21),遗传度为42。
叶片面积的差异更多是由于叶片长度的差异(图17)，而不是叶片宽度的差异(图13)。叶片面积随着叶片编号指数增长(图16)，而叶片长度随之线性增长(图12)。叶片宽度和编号的关系是抛物线式的。因此，6078-1和RTx7000随着叶片编号增加其叶片面积之间的差别主要是由于这些基因型之间叶片长度的差别。这表示减少叶片大小的基因功能更可能与细胞延长(叶片长度)相关，而非与细胞分裂(叶片宽度)相关。
在Stg1精细定位群体中叶片(n)面积和叶片(n+1)面积之间的异速生长关系表明大约叶片8处(同时开始花蕾形成)有显著变化。因此，叶片大小的增加以较少的速率发生。
Stg1区域向RTx7000渗入减少了叶片9-11的面积(图14)，也减少了叶片1-6的面积(前面已经讨论过)。L9的面积在不同基因型之间变化显著(P＝0.06)，范围为234-300cm2，遗传度为21(表6)。 RTx7000中L9面积(263cm2)比6078-1中L9面积大8％(244cm2)[图 14]。对叶片10和11也明显有类似的趋势。
表6
表6显示了L11收获时测量的预测平均值、P值和叶片大小性状遗传度的总结。显著差异以黄色阴影表示(P<0.05)，遗传度>20以绿色阴影表示。GLA＝绿叶面积。DW＝干重。SLW_L9_L11＝具体叶片重量。
叶片11收获时绿叶面积的变化大多归因于分蘖差异。然而， 6078-1中的叶片9-11相比RTx7000更小。这些差异是显著的(P<0.05)。注意到“低分蘖”和“小叶”都与相同基因区域相关，这表明单一基因控制两种冠层结构性状的可能性。
实施例10
小叶研究(igloo中的精细定位研究)
对于Stg1精细定位群体的亲本，其叶片编号和长度线性相关(图 15)。基因渗透Stg1入RTx7000导致叶片8-10长度减少，其中6078-1 的L10比RTx7000短7％(550vs.592mm)。
用于定位目的，选择了Stg1精细定位群体的“尾巴”。有两种基因型表现出尤其长的叶片(10604-1-157-5和10604-1-318-1)，而三种基因型表现出尤其短的叶片(10604-1-222-1,10604-1-501-327-3和 6078-1)。
在重组子10604-1-222-1中有功能获得(短叶片)。“小叶”基因被认为应与“低分蘖”基因定位于相同区域。
用于定位目的，选择了Stg1精细定位群体的“尾巴”(图16)。有三种基因型表现出尤其长的叶片(10604-1-157-5,10604-1-318-1和 RTx7000)，而两种基因型表现出尤其短的叶片(10604-1-222-1and 6078-1)。
沿着标记物逐步向上，在重组子10604-1-222-1中达到功能获得 (短叶片)。因此，再一次将“小叶”基因与“低分蘖”基因定位于相同区域。注意到L9和L10的叶片长度定位于相同区域。
对此的一个解释为单一基因具有多种多营养效应。生长素的可用性增强可解释含有所述区域的植物中观察到的低分蘖和叶片大小更小的表型。一种生长素输出载体组分5基因定位于靶标区域，因此被鉴定为候选基因。
实施例11
持绿性通过组成性和适应性应答增强冠层结构柔性
含有Stg1区域的植物在开花期水分可用性的增加是通过减少水分利用而实现的，这是由于两种机制(分蘖减少和叶片变小)造成的 (图17)。两种机制似乎都可单独使冠层大小平均减少大约9％。“低分蘖”机制在分蘖潜能高的低密度环境下起主导作用。“小叶”机制在分蘖潜能低的高密度环境下起主导作用。结合起来，这两种机制提供了这样的作物植物，其在对水分限制产生严重性的应答时具有显著的柔性以修饰冠层结构。
持绿性显示了组成性和适应性应答(图18)。Stg1的冠层大小减少了大约5％,甚至是在水分并不受限的时候(组成性应答)。冠层大小在轻度干旱(～10％)及更严重的干旱条件(～15％)下有进一步减少(适应性应答)。低分蘖主要是组成性应答，但是分蘖中对不断增加的水分缺乏产生应答的叶片更小是适应性应答。叶片大小更小是组成性同时也是适应性应答。
实施例12
冠层大小减少(通过分蘖减少和叶片变小)及开花期作物水分利用减
少之间的关联
开花期作物水分利用减少可通过以下原因引起：a)冠层大小更小，而每单位叶片面积的蒸腾作用相等，b)冠层大小相等，而每单位叶片面积的蒸腾作用更低，或c)冠层大小更小，而每单位叶片面积的蒸腾作用降低。ROS和蒸渗计研究表明，在高度水分压力条件下，Stg1区域，尤其是含有Stg1候选基因的重组子(10604-5)显示了更低的作物水分利用，这是由于冠层大小更小，而非每单位叶片面积蒸腾作用更低。在ROS和蒸渗计研究中观察到冠层大小和作物水分利用之间的高度相关性(r2＝0.9)。
(a)叶片更小产生的节水
在此项实验中，由于高的作物密度，所以分蘖是可以忽略的。因此，冠层大小的差异是由叶片大小差异造成的(图20)，叶片12的大小和开花期总的绿叶面积之间高度相关(图21)，这也是一项证据。
转而，开花期绿叶面积与开花期作物水分利用高度相关(图22)。相对于RTx7000，含有Stg1候选基因的两种品系(6078-1和10604-5) 都显示有更小的叶片(L10-L13)，更低的开花期绿叶面积(GLAA)，以及更低的开花期作物水分利用。
(b)单位叶片面积蒸腾作用更小产生的节水(蒸渗计研究)
蒸腾作用(T)是叶片面积(LA)和每单位叶片面积蒸腾作用 (T/LA)的产物。在高VPD条件下，Stg1和RTx7000之间LA是类似的(11795 vs 11628cm2),而T/LA在Stg1中比在Tx7000中更少 (2.60 vs 2.85),导致Stg1中每株植物的水分利用(T)比RTx7000中更少(30.7 vs 32.8)。因此，Stg1中的水分节约(高VPD环境下)完全是由T/LA的减少而实现的，表示这是Stg1赋予的一种组成性水分保持的策略。在此情况下，Stg1中蒸腾作用效率(TE)更高是等价生物质和更低蒸腾作用的结果。
为进行更广泛的分析，将四种Stg QTL(Stg1,Stg2,Stg3和Stg4) 与RTx7000进行比较，帮助各方面分析Stg1应答。在高VPD条件下， T/LA与T是正相关的。然而，在低VPD条件下，T/LA与T负相关(r2＝0.52)。在低和高VPD条件下，绿叶面积和蒸腾作用都是正相关的(图22)。在两项实验中，Stg QTL相比于RTx7000其绿叶面积和蒸腾作用减少。
(c)叶片面积减少产生的节水
蒸腾作用(T)为LA和T/LA的产物。在低VPD条件下，Stg1 中LA比RTx7000中少31％(4898 vs 7082cm2)。这由Stg1中T/LA 相比RTx7000增加9％(5.15 vs 4.70)而得到略微抵消。净结果是Stg1 中每株植物的水分利用(T)比RTx7000减少了22％(25.6 vs 32.7l)，主要是由于冠层大小减少。Stg1显示的T/LA的增加自身可为一种干旱适应机制，使叶片冷却并使光合作用能够继续。
T/LA的柔性似乎在植物水分状态调控方面尤其重要。在高VPD 条件下，Stg1的T/LA减少是减少T并增加TE的关键机制。在低VPD 条件下，Stg1的T/LA增加可能有助于通过冷却维持叶片功能。
对Stg1精细定位亚组的蒸渗计研究提供了对此区域的其他了解。在高VPD条件下，10604-5(Stg1候选基因定位)的每株植物的LA比 RTx7000更低(10283 vs 11628cm2)，而10604-5和RTx7000中的T/LA 是相等的(～2.86)，导致10604-5中每株植物的水分利用比RTx7000更少(28.0 vs 32.8l)。因此，10604-5中的水分节约完全是通过冠层大小减少而实现的。
在低VPD条件下，所有Stg1品系的每株植物LA比RTx7000更少，使得所有Stg1品系中有水分节约。因此，很难对此区域进行精细定位，因为所有重组子都对有类似于6078-1的应答。
(d)农艺学仿真
以5株植物/m2种植犁地，列间距为1m。土壤深度＝1800mm；土壤PAWC＝324mm；N无限制。结果显示于图56A-C。
处理
HT高分蘖(2分蘖/植物)
LT低分蘖(1分蘖/植物)
WW灌溉良好(起始为100％形式及雨养)
TS终极压力(起始为半满形式[162mm]，之后没有雨水)。
实施例13
开花期水分可用性增加还可通过水分利用度增加达到，后者是由含有Stg1区域植物中更好的水浸提和/或根向更深或更广的区域扩展造成的。
Stg1在叶片6阶段的根质量和生根:发芽比率(图23)比RTx7000 更高。在Stg1精细定位群体中，这些性状有极大的越亲分离。根质量和生根:发芽比率之间的关系指出了这些性状上产生进一步遗传进化的机会。
幼苗期每单位叶片面积的根质量的比率可被用作干旱适应指数，因为其将植物获得水分的能力(根质量)与植物利用水分的能力(叶片面积)整合起来。更高的指数表明每单位叶片面积获得水分的能力更高。Stg1显示了相对于RTx7000的更高的每单位叶片面积的根质量比是由更高的根质量和更小叶片面积二者造成的。
Stg1在L6阶段显示每单位叶片面积的更高根质量可解释为何在作物生长早期其在LWLD处理下比RTx7000使用的水(20-50 DAE) 更多(图24)。目前仍不清楚谷物灌浆过程中Stg1显示的相比RTx7000 增加的水分利用度(图24)是否是由于更佳的水浸提及/或更广的根扩展范围。
在Gatton,Queensland,Australia(Van Oosterom等人，2010见上文)的一项根室实验中，A35(持绿)的水浸提的测重下限比AQL39 (衰老)杂交系低0.26％。其中A35含有Stg1区域，而AQL39不含。假定体积密度为1.3g cm-3，土壤深度150cm,这可潜在地使田地中可用水分在作物整个生命周期中增加>5mm。
实施例14
持绿增强了开花期每单位叶片面积的生物质。假定根质量相等 (或至少不会显著较少)，这些差异可通过每单位叶片面积蒸腾作用和/或蒸腾作用效率的差异进行解释。
Stg1在低的水分压力(35.2 vs 26.2g/m2/cm2)和高的水分压力 (40.6 vs31.4g/m2/cm2)条件下，其开花期每单位叶片面积的主茎生物质(B/LA)比RTx7000高出～24％(表7)。对于Stg1和RTx7000二者来说，高水分压力条件下的开花期主茎B/LA比低水分压力条件下高～14％，即，水分缺乏情况下B/LA会增加。注意到在低和高水分压力条件下Stg1和RTx7000中分蘖的B/LA是相等的。
表7
表7显示了生长于Biloela、Queensland、Australia高和低水分压力下的RTx7000(回交亲本)以及大量含有多种Stg1基因渗入的近等基因系的每单位叶片面积的主茎、分蘖及总生物质。
对水分利用的详细测量表明在Biloela的Stg1品系中观察到的更高的每单位叶片面积的生物质可能是由于每单位叶片面积的蒸腾作用更高，而非由于TE更高。
低水分压力
Stg1和RTx7000在低水分压力下显示了相等的B/LA。然而， Stg1中的T低了～7％，这是由于T/LA低了～10％，这转而将TE 增加了～9％(图45)。因此，Stg1维持了生物质，但相比于RTx7000，其使用了较少的水。
高水分压力
在高水分压力下，Stg1中的B/LA比RTx7000高～6％。B/LA与 T/LA正相关，但不与TE正相关。因此，Stg1显示的更高B/LA是由于更高的T/LA。通常，在高水分压力下，B/LA与T/LA正相关而与TE负相关。
在此情况下，Stg1在开花前阶段比RTx7000使用的水分少～22％。因此，Stg1会有显著更多可用的水分以进行灌浆，尽管其在开花期生物质更低。
实施例15
通过基因渗入Stg1使得TE增加可能由于a)相比于气孔导度成比例的更高的光合能力，原因是更小较薄更绿的叶片，或b)维持生物质的同时每单位叶片面积的蒸腾作用降低。
在Stg1精细定位群体中，叶片10的长度和绿度(SPAD)之间有高度的负相关性(r2＝0.72,图25)。因此，在此群体中降低叶片大小增加叶片中的氮浓度。Stg1向RTx7000背景的基因渗入降低了L10长度的～7％(从592降低至550mm)并将L10的SPAD增加了～4％(从47.1增加至48.9)。
更绿的叶片可增加光合能力并因此增加水分利用效率。在一个亚组的Stg1精细定位群体中，光合作用随着SPAD值增加，直至达到 SPAD为～48.5的平台(图26)。然而，具有最高SPAD值(51.6)的品系(6078-1)显示了相对低速率的光合作用(32.1MJ/m2/d)。该结果或者是a)异常的，或者b)表明了高SPAD值下光合作用有真是的下降。
在一个亚组的Stg1精细定位群体中，叶片绿度(SPAD)和WUE(基于Licor软件计算的指数)是正相关的(图27)。Stg1的基因渗透植株中无一达到6078-1的值(0.8)，尽管在10604-5和10709-5近等基因系(NIL)中有相对高的SPAD。
与RTx7000及其他Stg QTL相比，Stg1显示有更绿的叶片(SPAD 值更高)及更高的WUE(基于Licor软件计算的指数)[图28]。
实施例16
通过基因渗入Stg1使得TE增加可能由于a)相比于气孔导度成比例的更高的光合能力，原因是更小更薄更绿的叶片，或b)维持每单位叶片面积生物质的同时每单位叶片面积的蒸腾作用降低。
在低和高VPD条件下，一组Stg NIL中的蒸腾效率(TE)与每叶片面积的蒸腾作用(T/LA)是负相关的(图29)，包括回交亲本 (RTx7000)。然而，Stg NIL相对于RTx7000的排序情况与VPD条件有交互作用。例如，高VPD条件下Stg1的T/LA相比RTx7000更低，而在低VPD条件下相比RTx7000更高。
在高VPD条件下，T/LA和TE之间负相关的斜率比较陡，这样 T/LA会有轻微下降，从2.9mm/cm2(Stg4)降至2.6mm/cm2(Stg1)，导致TE从4.2g/m2/mm(Stg4)显著上升至5.1g/m2/mm(Stg1)[图29]。在低VPD条件下，梯度更不陡，这样，相比于高VPD条件，TE每增加一个单位要求T/LA降低多出六倍(1.2 vs 0.2单位)。注意到在TE 相等时，在低VPD，Stg1比TRx7000显示出更高的T/LA(5.1 vs 4.6 mm/cm2)。这可能提供了一种机制，使得Stg1叶片在特定环境条件下保持更冷的状态。
实施例17
每单位叶片面积蒸腾作用的变化可能由于a)气孔数量，b)气孔间隙c)气孔开启和关闭相对于VPD的时间安排变化，及 /或d)毛基底细胞(其影响边界层并因此影响T/LA)的数量。
Stg1向RTx7000的基因渗入多方面地影响T/LA，这取决于VPD 条件。相比于RTx7000,Stg1在低VPD下使T/LA增加了～9％，在高VPD下使T/LA降低了～10％。T/LA尤其可由以下因素调控a) 每单位叶片面积的气孔数量b)气孔间隙大小c)气孔开启和关闭时间安排，及/或d)毛基底细胞(其影响边界层，因此影响到T/LA)的数量。可对这四种因素中二者(a和d)进行测量。在一个防雨棚实验中，收获在灌溉控制的高密度处理中的个体叶片，除去角质层，并对角质层表面拍照。这些照片用于确定a)每单位叶片面积的气孔数量,b)每单位叶片面积的表皮细胞数量，以及c)每单位叶片面积的毛基底细胞数量。
同时，取横向叶片切片。对这些数据进行初步分析表明，Stg1向 RTx7000的基因渗入修饰了叶片解剖学结构。叶片(例如，叶片7和 10)形态学的差异在RTx7000和Stg1之间很明显。在此情况下，Stg1 的维管束周围有更多更小的维管束鞘。维管束鞘中细胞数量增加还可能有助于增加光合同化(PNAS 2007)并因此增强TE。
实施例18
谷物灌浆过程中水分利用增加是通过(i)增加开花期水分可用性及(ii)增加谷物灌浆过程中水分利用度(更佳的水浸提及更深更广范围的侧向扩展)而实现的。
a)增加开花期水分可用性
ROS实验中，开花期前的作物水分利用(CWU)与开花期后的 CWU为负相关(图30)。例如，开花期前节水20mm(165 vs 185mm) 使得开花期后能利用额外的20mm(80mm vs60mm)。所以，开花期前保留的所有水都在开花期后被作物利用。总体而言，此实验中开花期后水分利用增加25％使得谷物产率增加了25％(400 vs 300g/m2)。这转换成每mm额外的可用水分收获50kg/ha谷物。尽管这些数据支持谷物灌浆过程中水分利用增加是通过开花期水分可用性增加完成的这一概念，但是其未解释谷物灌浆过程中水分利用度的增加。
b)谷物灌浆过程中水分利用度的增加
在ROS实验中，Stg1在低密度和高密度处理时都显示出谷物灌浆阶段过程中水分利用增加。这主要是由于(i)在高密度下开花期水分可用性增加，以及(ii)在低密度下谷物灌浆过程中水分利用度增加 (图31A和31B)。
在对RTx7000和四种Stg NIL(Stg1、Stg2、Stg3和Stg4)进行的研究中，低密度条件下的ROS实验中，开花期前的CWU和开花期后的CWU负相关(图32)。在此情况下，开花期前节水～25mm(168 vs 191mm)有助于开花期后～50mm的水分利用(135mm vs 86mm), 表示水分可用性(～25mm)和利用度(～25mm)的增加同等重要。然而， Stg1在此实施例中不正常，因为开花期后高的水分利用与开花期前高的水分利用相关。对Stg1中此异常情况的解释为a)开花前水分数据出现错误b)开花后水分数据出现错误或c)水分测量中无错误(Stg1仅仅是与其他NIL有不同应答)。对生物质数据的检查表明，出于一些原因，在LWLD下，Stg1在开花期前相比其他NIL产生更高的生物质，这表示开花期前水分利用形式仅仅反映了此实验中的生物质产生情况。然而，此实施例提供了证据，说明Stg1在谷物灌浆阶段有增加的水分利用度。
实施例19
开花期前后生物质产生情况之间的关联
在低密度下(LD),开花期前生物质减少23％(从700至640g/m2) 使开花期后生物质的增加超过两倍(从～200增加至425g/m2)。在 LD下,Stg1产生的开花期前生物质类似于RTx7000(～610g/m2),但其产生的开花期后生物质更少(265 vs 327g/m2).然而，在HD下，Stg1 和RTx7000产生了类似的开花期前生物质(～840g/m2)，然而Stg1产生了更多的开花期后生物质(195 vs 17g/m2)。
GLAA和开花期前：开花期后生物质比率之间的关系在Stg1的作用中很关键。必须将GLAA减少到<3才能确保有足够的可用水分用于谷物灌浆，这是Stg1基因的关键作用。在此实验中，Stg1充分减少了GLAA以达到LD下开花期前：开花期后生物质比率<3，但 HD下并非如此。在HD下，注意到Stg1向RTx7000的基因渗入将 GLAA从31200减少至29300cm2/m2,将开花期前：开花期后生物质比率从8.2减少至6.5(但仍然没有减少至<3)。这突出了合适管理策略如作物密度在最大化有限水分上的重要性。
GLAA和开花期前：开花期后生物质比率之间的负相关性也对 Stg1的作用十分关键。更低的GLAA使得开花期水分利用减少，这与更高的开花期后茎质量(抗倒伏性的一个因素)相关。Stg1向RTx7000 的基因渗入增加了LD(边缘增加)和HD(显著增加)条件下的开花期后茎质量。
开花期前：开花期后生物质比率(PPBR)与开花期后生物质的关系是有益的。两种密度处理提供了从<2至>8的PPBR范围内的连续统。PPBR从>8减少至～3导致开花期后生物质逐渐增加。然而， PPBR进一步减少到低于3导致开花期后生物质有相对急剧的增加，可能是因为在PPBR比率低于3时谷物灌浆过程中会有更多水可用。 Stg1向RTx7000的基因渗入增加了HD下开花期后生物质，而不增加 LD下的开花期后生物质。
开花期前：开花期后生物质比率(PPBR)与开花期后茎质量的关系是同样有益的。开花期后茎质量是抗倒伏性的一个因素。对此因素的分析提供了对Stg基因渗入如何影响抗倒伏性的理解。PPBR从>8减少至～4导致开花期后茎质量逐渐增加。然而，PPBR进一步减少到低于4导致开花期后茎质量有相对急剧的增加。Stg1向RTx7000的基因渗入增加了LD(边缘增加)和HD(显著增加)下开花期后茎质量。
PPBR和谷物产率之间的关系在此实验中不那么清楚。在两种密度下，Stg1的谷物产率都比RTx7000高，然而更高的产率只能通过 HD下Stg1的PPBR更低得到解释。
在此实验中检查了两种Stg1基因渗入：a)6078-1(整个Stg1区域), 及b)10946-5(重组子，其覆盖了Sb03QGM116和Sb03QGM106标记物之间的Stg1区域中大约1/3)。
将开花期前生物质减少20％(从920减少至735g/m2)使开花期后生物质增加了大约100％(从200增加到400g/m2)[图40]。通常，各品系的开花期前生物质关系为RTx7000＝Stg2>Stg3＝Stg4>Stg1，开花期后生物质关系为Stg1>Stg3＝Stg4>Stg2>RTx7000。
根据GLAA可见，冠层大小很大程度上决定了开花期前：开花期后生物质比率(图34)。在高密度和低密度处理下，Stg1或Stg1a向 RTx7000背景的基因渗入减少了GLAA，这转而使开花期前：开花期后生物质减少至<3，确保这些水分有限条件下谷物灌浆有充分可用的水分。
根据GLAA可见，冠层大小是开花期后茎质量(PASM)的一个决定因素[图35]。在高密度和低密度处理下，Stg1向RTx7000背景的基因渗入减少了GLAA，这转而增加了PASM。在HD条件下，相比于LD，所利用的茎储备多出大约40g/m2，这反映了所述处理施加的压力更高。
开花期前：开花期后生物质比率(PPBR)和开花期后生物质(PAB) 之间的关系很强(图36)。所述两种密度处理提供了从<1.5至>4的 PPBR范围内的连续统。PPBR从～4.5减少至～3.5对PAB没有影响。然而，PPBR进一步减少到低于～3.5导致PAB有相对急剧的增加，可能是因为在PPBR比率低于3.5时谷物灌浆过程中会有更多水可用。 Stg1向RTx7000的基因渗入在HD和LD下使PPBR降低至低于3，由此增加了两种密度处理下的PAB。
开花期前：开花期后生物质比率(PPBR)还影响了抗倒伏性(图37)。在此情况下，开花期后茎质量(PASM)被用作抗倒伏性的标志值。在高密度和低密度下，PPBR与开花期后茎质量负相关。即，开花期前：开花期后生物质比率高增加了谷物灌浆过程中再动用的茎储备量，由此减少了茎生物质并增加了倒伏的可能性。与RTx7000相比，Stg1a显著减少了LD(～5vs 65g/m2)和HD(～80 vs 140g/m2)下动用的茎储备量。与RTx7000相比，Stg1显著减少了HD(～80 vs 140g/m2) 下动用的茎储备量，但未减少LD下动用的茎储备量。在HD下动用的茎储备的程度高于LD下，这反映了HD下水分缺乏更严重。例如， RTx7000中HD和LD之间茎储备动用的差异为2倍(大约140 vs 70 g/m2)。
谷物产率维持在低的状态(基准量为～4.2t/ha)，直到开花期前：开花期后生物质比率降至低于～3(HD)或～2.5(LD)[图38]。在这些临界值下，这些比率中每种累积减少都使谷物产率显著增加，谷物产率增加的速率在LD下比HD下略高。这表示开花期后水分可用性与开花期前GLAA和生物质紧密联系，要求GLAA有某种程度的减少以确保谷物灌浆有充分可用的水分。在两种密度下，Stg1使开花期前: 开花期后生物质比率减少至低于临界水平，导致产率相对RTx7000增加28％(LD)和22％(HD)。这些数据提供了Stg1基因作用(在开花期降低的冠层大小)和终极干旱下谷物产率之间的关键联系。注意到 Stg1a基因渗入对减少PPBR(HD和LD)和增加谷物产率(只在LD下) 相对于RTx7000有一些影响，但影响程度不如Stg1。因此，此实验中不能得到有力证据证明关键Stg1基因位于Stg1a区域。这支持了较早提出的证据，因为Stg1(SbPIN4)的最强候选物位于Stg1a基因渗入之上。
在此实验中检查了四种Stg1基因渗入植株：a)6078-1(整个Stg1 区域)；b)10709-5(覆盖了Stg1区域的大约1/3的重组子)；c)10604-5 (覆盖了Stg1区域的大约3/4的重组子)；以及d)10568-2(覆盖了Stg1 区域的几乎1/2的重组子)。
在低密度(LD)下，不同基因型之间的开花期前生物质差异为仅仅～5％(从522至552g/m2)，而开花期后生物质变化了几乎2倍(从 173至313g/m2)。这表示开花期后生物质的极大差异受到开花期前生物质之外的某些因素的影响，例如，受到水分利用度差异的影响。例如，10709-5和RTx7000都产生了～550g/m2的开花期前生物质，而 Stg1重组子(10709-5)产生的开花期后生物质多出～60％。
在高密度(HD)下，开花期前和开花期后生物质是高度负相关的。Stg1向RTx7000中的基因渗入使开花期前生物质减少了9％，使开花期后生物质增加23％。
基因型之间的开花期作物水分利用(CWU)比开花期前生物质有更好的区分。结合HD和LD数据，开花期后生物质(PAB)保持在低水平(基准量为～150g/m2)，直到开花期CWU降至低于～180mm. 在此临界值下，对于175mm的水平以上的每次CWU累积减少,PAB 会有增加，PAB平台为大约310g/m2。开花期CWU低于175mm时的进一步减少不导致PAB额外的增加。
根据GLAA可见，冠层大小很大程度上确定了开花期前:开花期后生物质比率(PPBR)。在高密度和低密度处理中，Stg1向RTx7000 背景的基因渗入(或具体重组子如10709-5)减少了GLAA，这转而减少开花期前:开花期后生物质比率，由此增加了这些水分有限条件下谷物灌浆可用的水分。6078-1的PPBR值似乎是异常的(太高)，因为这种基因型刚好处于GLAA/PPBR回归线之上。
根据GLAA可见，冠层大小为开花期后茎质量(PASM)的一个决定因素。在高密度处理中，Stg1向RTx7000背景的基因渗入(或Stg1 重组子如10604-5和10709-5)减少了GLAA，这转而增加了PASM。在HD条件下，相比于LD，所利用的茎储备多出大约60g/m2，这反映了所述处理施加的压力更高。
开花期前：开花期后生物质比率(PPBR)和开花期后生物质 (PAB)之间的关系很强。所述两种密度处理提供了从<2至>5的 PPBR范围内的连续统，尽管LD的回归斜率比HD大。在HD下，PPBR从～6减少至～3.5使PAB从～130g/m2(RTx7000)逐渐增加至～180g/m2(10604-5)。在LD下PPBR进一步减少到低于～3导致PAB 有更急剧的增加，可能是因为在PPBR比率低于3时谷物灌浆过程中会有更多水可用。
开花期前：开花期后生物质比率(PPBR)还影响了抗倒伏性。在此情况下，开花期后茎生物质(PASM)被用作抗倒伏性的标志值。在高密度和低密度下，PPBR与开花期后茎质量负相关。即，开花期前：开花期后生物质比率高增加了谷物灌浆过程中再动用的茎储备量，由此减少了茎生物质并增加了倒伏的可能性。与RTx7000相比，Stg1 显著减少了HD(～100vs 160g/m2)下动用的茎储备量。在HD下动用的茎储备的程度高于LD下，这反映了HD下水分缺乏更严重。例如， RTx7000中HD和LD之间茎储备动用的差异为超过2倍(大约160 vs 60g/m2)。有趣的是，PASM随着PPBR在整个PPBR范围内(1.5-6) 的降低而增加，而谷物产率只在PPBR低于～3时增加，PAB在此情况下也有较少的增加。这表示开花期前相对少量的节水仍然能够提高抗倒伏性，尽管在谷物产率有应答前要求更大量的节水。
谷物产率维持低水平(基准量为～3.1t/ha)，直至开花期前:开花期后生物质比率低于～3。在此临界值之下，谷物产率在此比率每次有累积减少时都有显著增加。因为Stg1基因渗入植株无一在HD下将 PPBR减少至<3，所以此处理中没有从Stg1得到产率上的益处。在 LD下，Stg1基因渗入植株中有一些将PPBR降低至临界水平以下，导致产率相对RTx7000增加12％(10568-2)和5％(10709-5)。这些数据提供了Stg1基因作用(开花期冠层大小减少)与终极干旱下谷物产率之间的关键联系。
谷物灌浆过程中CWU维持低水平(基准量为～60mm)，直至开花期前:开花期后生物质比率低于～3.5(图39)。在此临界值下，谷物灌浆过程中CWU在此比率每次有累积减少时都有显著增加。因为Stg1 基因渗入植株无一在HD下使PPBR减少至<3.5，所以此处理中可从Stg1重组子实现谷物灌浆过程中CWU的增加。在LD下,Stg1基因渗入植株中有一些(以及RTx7000)将PPBR降低至临界水平以下，这相比于HD基线(～60mm)将谷物灌浆过程中的CWU增加至多达～80 mm。
谷物灌浆过程中CWU和谷物产率之间的关系是正向的(图40)。然而，这些参数之间的相关性相对低(r2＝0.23)，很可能是由于田地中土壤水分的测量本身就变化更大。
实施例20
叶片衰老延迟(持绿)是谷物灌浆过程中植物水分状态更高(由于水分利用增加)的结果
在中等灌浆下确定了FL-2(标志旗下的两片叶片)的植物水分状态，使用了两种方法：叶片水势能(LWP)以及相对水分含量(RWC)。用压力计测量田地中的LWP。在确定田地中LWP后，将相同叶片的样品置于冰上，并在数分钟内将其带到大约300m远的实验室通过标准方法确定RWC。
在高密度和低密度下，一组Stg NIL(包括回交亲本)的FL-2的RWC与中等灌浆下叶片衰老相对速率相关。HD和LD的相关性是平行的，但二者间大约有0.35单位的叶片衰老的抵消，即，对于给定水平的RWC，例如70，叶片衰老相对速率对于LD和HD来说分别为 2.1和2.45。Stg1区域向RTx7000中的基因渗入增加了中等谷物灌浆下(FL-2)的RWC并降低了HD和LD下的叶片衰老相对速率，尽管 HD下的影响更大。
HD和LD下叶片衰老相对速率转而与成熟期绿叶面积(GLAM) 高度负相关(图49)，其中HD下显示出的叶片衰老速率更高。Stg1 在HD下产生的GLAM比RTx7000高几乎两倍(2106 vs 859cm2/m2)，在LD下产生的GLAM高几乎19％(2145 vs.1725cm2/m2),另见图 42。
实施例21
增加的抗倒伏性是谷物灌浆过程中植物水分状态更高(由于水分利用增加)的结果
成熟期茎质量更高是抗倒伏性的一个因素。在两种作物密度下生长于水分有限条件下的一组Stg NIL在中等谷物灌浆下(FL-2)的 RWC与成熟期茎质量高度负相关(图43)。Stg1向RTx7000的基因渗入增加了在HD和LD下中等谷物灌浆(FL-2)的RWC与成熟期茎质量，其中HD下的影响更大。相比于RTx7000,Stg1使在LD下成熟期茎质量增加9％(224 vs.203g/m2)，在HD下增加了29％(286 vs. 204g/m2)。因此，Stg1在抗倒伏性上的益处随着水分缺乏程度而增加。
开花期后生物质主要由a)开花期后茎质量(PASM)，对茎储备动用情况的量度及抗倒伏性的一个因素和b)谷物产率构成。谷物培育者要求谷物产率和抗倒伏性都要得到最大化，即，他们不希望以其中之一为代价达到另一方面。HD和LD条件下开花期后茎质量与PAB高度线性相关(图44)。尽管较轻的干旱(LD)下Stg1对PASM影响很小，但是在更严重的干旱(HD)下谷物灌浆过程中Stg1中从茎转运的干物质的量比RTx7000少很多(85 vs.139g/m2)。这导致Stg1中成熟期茎质量相对RTx7000更高(286 vs.204g/m2)，这转而应当增加了抗倒伏性。
尽管PASM和PAB之间的相关性在HD和LD下很高(图43)，但是谷物产率和PAB之间的相关性在两种密度下都很低(图44)。 Stg1向RTx7000的基因渗入增加了HD和LD下的谷物产率，尽管 PAB只在HD下更高。注意到HD下Stg1中相比于RTx7000更高的谷物产率(290vs.184g/m2)在Stg1中茎储备比RTx7000显著较少(85 vs.139g/m2)时达到，这表明谷物灌浆过程中碳的需求量很大程度上是分别通过Stg1和RTx7000中当前的光合同化和茎储备满足的。
PASM和谷物产率之间潜在的取舍在图45中有着重强调。在HD 下，Stg1在任何基因渗透植株中都达到最高的谷物产率(290g/m2)，同时使茎损失维持在85g/m2。相对于RTx7000，Stg1优化了PASM 和谷物产率之间的取舍。通过Stg24的茎储备利用上进一步的减少(38 g/m2)导致谷物产率更低(263g/m2)。在LD下,Stg1相对RTx7000也达到了高的谷物产率(282 vs.214g/m2)，而同时使用的茎储备略少(46 vs.50g/m2)。因此，在两种密度下，Stg1比RTx7000获得更高的谷物产率及抗倒伏性。
在HD和LD下，PASM和成熟期茎质量之间的关系对于多种Stg 基因渗入植株相对平淡，尽管RTx7000在两种情况下都跌至回归线以下。对于给定水平的茎储备利用(例如HD下为～140g/m2，或LD 下为50g/m2)，Stg区域向RTx7000的基因渗入显著增加了成熟期的茎质量，这表明所利用的茎储备量之外的一些其他因素(例如茎强度) 也很重要。
在HD和LD条件下，开花期后茎质量(PASM)与PAB有高度的线性相关性(图46)。HD和LD相关性几乎是平行的，尽管二者之间差值为大约50g/m2,即，对于给定水平的PAB,例如300g/m2, HD中PASM比LD中少～50g/m2(-100 vs.-50g/m2)。这反映了HD 处理中压力水平更高。在HD下，Stg1和Stg1a都利用了～80g/m2的茎储备，相比而言，RTx7000中为几乎140g/m2，然而在茎储备利用相等时，Stg1比Stg1a产生的PAB多出～28％。在LD下,Stg1a和Stg1都相对RTx7000增加了PAB，其中Stg1增加程度稍低。然而，尽管 Stg1a比RTx7000使用的茎储备少了～60g/m2，但Stg1比RTx7000使用的茎储备高出～20g/m2。
在HD和LD下的谷物产率与PAB正相关。在HD下，Stg1产率比RTx7000超出24％，而Stg1a的谷物产率与RTx7000相等。在LD 下，Stg1和Stg1a的产率分别超出RTx7000为42％和20％。
在此实验中，PASM和谷物产率之间没有取舍，因为在两种作物密度下这些参数之间都是线性正相关的(图47)。在HD下,Stg1在所有Stg基因渗入植株中显示出最高的茎质量和谷物产率，这表明谷物产率和抗倒伏性不是相互排斥的。
PASM和成熟期茎质量之间的关系在HD下是正相关的，但在LD 下为负相关。在HD下，Stg1的PASM和成熟期茎质量都比RTx7000 显著更高。在LD下，Stg1的成熟期茎质量比RTx7000显著更高(314 vs.271g/m2)，尽管Stg1相比RTx7000使用了更多的茎储备(87 vs66 g/m2)。总体而言，Stg1相对RTx7000增加了22％(HD)和16％(LD) 的成熟期茎质量。而且，在两种作物密度下Stg1a利用的茎储备比 RTx7000显著更少。
在HD和LD下的开花期后茎质量(PASM)与PAB高度线性相关 (图48)。开花期后茎储备的利用上的遗传学变化范围为LD下～30-110 g/m2，HD下～100-160g/m2，反映了HD处理中压力水平更高。在HD 下，Stg1亲本(6078-1)和两种Stg1重组子(10604-5和10709-5)相比RTx7000利用的茎储备显著更少(～100 vs.160g/m2)，然而比RTx7000 产生更多的PAB(～170 vs.130g/m2)。在LD下，只有一种Stg1重组子(10568-2)比RTx7000利用的茎储备显著较少(～30 vs.60g/m2)，而产生了比RTx7000更多的PAB(～310 vs.230g/m2)。
谷物产率在LD下与PAB正相关，在HD下负相关，尽管总体上 (结合HD和LD的情况)二者之间的关系为正相关，其中RTx7000 (HD)为离群值。
在此实验中，PASM和谷物产率之间没有取舍，因为在两种作物密度下这些参数之间都是线性正相关的。在HD下，Stg1亲本(6078-1) 与其他Stg1基因渗入植株相比显示了高的茎质量和谷物产率。 RTx7000在HD下情况异常，显示了低的茎质量和高的谷物产率。在LD下，10709-5和10568-2显示了相对RTx7000更高的茎质量和谷物产率。
在两种密度下PASM和成熟期茎质量之间的关系都是正相关的。在HD下，PASM和成熟期茎质量在6078-1和10709-5中都比 RTx7000显著更高。在LD下,只有一株Stg1重组子(10568-2)在PASM 和成熟期茎质量上超过RTx7000。
实施例22
更高的谷物产率是谷物灌浆过程中植物水分状态更高的结果
Stg1向RTx7000背景的基因渗透增加了中等谷物灌浆下的植物水分状态，如由a)LD和HD下FL-2中相对水分含量(RWC)更高及b)LD和HD下FL-2中叶片水势能(LWP)更低表示。总体而言，植物在LD下比HD下承受的压力更大，LD下RWC更低即是证明。然而，Stg1对植物水分状态的有益影响在HD下更显著，其中Stg1 中的RWC比RTx7000高出26％。
在HD和LD下，FL-2中中等谷物灌浆的RWC与谷物产率正相关。植物水分压力程度越高(RWC<73),在给定RWC水平下谷物产率在LD下比在HD下高出越多。在两种作物密度下，Stg1中RWC 和谷物产率都比RTx7000更高。例如HD下，Stg1中RWC相对 RTx7000增加26％与谷物产率增加58％相关。
在HD和LD条件下，中等谷物灌浆FL-2的叶片水势能(LWP) 与谷物产率负相关(图49)。在两种密度下，Stg1相对RTx7000都显示出更低的LWP(压力更小)及更高的谷物产率。这些数据连同 RWC数据强有力地证明了谷物灌浆过程中更高水分状态与Stg1区域造成的谷物产率增强之间有关联。
实施例23
更高谷物产率和更大谷物大小是谷物灌浆过程中水分可用性增加的结果
对Stg1功能的假说关键点在于开花期前和开花期后水分利用之间的关联，以及由此形成的开花期后水分利用和谷物产率之间的关联。在田地水平Stg1基因的值很小所以谷物灌浆过程的水分可用性增加和谷物产率或谷物大小之间没有关联。
首先，重要的是建立开花期前：开花期后生物质比率(PPBR) 和谷物灌浆过程中作物水分利用(CWU)之间的关联。谷物灌浆过程中的CWU保持更低水平(LD和HD下的基准量分别为～85和95mm)，直至LD和HD下的开花期前：开花期后生物质比率分别跌至～3和 2.5以下(图50)。在此临界值之下，谷物灌浆过程中的CWU在此比率每次有积累减少时都会显著增加。在两种密度下，Stg1基因渗入充分地使PPBR减少，使CWU得相对于RTx7000有显著增加。
第二，重要的是显示谷物灌浆过程中CWU和谷物产率之间的关联。通常，这些参数在ROS实验中正相关，除了LD下有两个明显的离群值(Stg2和Stg3)[图51]。Stg1向RTx7000的基因渗入增加了两种作物密度下谷物灌浆过程中CWU和谷物产率。
最后，水分有限条件下PPBR和谷物产率之间的关联完成了整个蓝图(图51)。谷物产率维持低水平(基准量为～410g/m2)，直至开花期前：开花期后生物质比率分别跌至～2.7以下(图52)。在此临界值下，谷物产率在此比率每次有积累减少时都会显著增加。在两种密度下，Stg1基因渗入充分减少了PPBR，使得相对RTx7000谷物产率有显著增加。这些数据提供了Stg1基因作用(开花期冠层大小减少)和终极干旱下谷物产率之间的关键关联。
在HD和LD处理下，谷物灌浆过程中CWU与谷物大小正相关 (图53)。Stg1向RTx7000的基因渗入显著增加了HD下的谷物大小，而不增加LD下的谷物大小。
水分有限条件下PPBR和谷物大小之间的关系突出了开花期前水分保持的重要性，这是谷物大小的一个决定因素(图54)。谷物大小保持低水平(HD和LD下的基准量分别为～17和17.5mg)，直至开花期前：开花期后生物质比率跌至～2.7以下(图54)。在此临界值下，谷物大小在此比率每次有积累减少时都会显著增加。在HD下，Stg1 的基因渗入充分减少了PPBR，使得相对RTx7000谷物大小有显著增加，但在LD下并非如此。这些数据提供了Stg1基因作用(开花期冠层大小减少)和终极干旱下谷物大小之间的关键关联。
谷物灌浆过程中的CWU保持低水平(HD下的基准量分别为～58 mm)，直至开花期前：开花期后生物质比率跌至～3.5以下。注意到 HD下任何基因型中，PPBR都未掉落至临界阈值以下，因此在此处理中所有基因型在谷物灌浆过程中的CWU都维持相对低。然而，在 LD处理中当各基因型跌落至所述临界值以下时，谷物灌浆过程中的 CWU在此比率每次有积累减少时都会显著增加。只有一种Stg1重组子(10709-5)相对RTx7000在谷物灌浆过程中的CWU增加。
通常，使用来自HD和LD处理中的结合数据组得出谷物灌浆过程中的CWU和谷物产率之间是正相关的，其中各基因型在LD下使用更多水分并产生更多谷物。然而，这些参数之间的关系并不是很强。而且具体的Stg1重组子也不是总是在HD和LD处理中相对RTx7000 有更高的产率。见图55。
实施例24
QTL和PIN基因分析
QTL分析
持绿QTL数据收集自7项研究(Crasta等人，1999；Hausmann 等人，2002；Kebede等人，Theoretical and Applied Genetics 103:266-276,2001；Srininvas等人，Theor ApplGenet 118:703-717, 2009；Subudhi等人，Theor App Genet 101:733-741,2000；Tao等人，Theor Appl Genet 100:1225-1232,2000；Xu等人，Genome 43:461-469, 2000)。在7项研究中，鉴定出47个单个的QTL，并规划入高粱保守序列图谱中(Mace等人，BMC Plant Biol.9:13,2009)。当相同性状 QTL的估计置信区间(CI)重叠时，将这些QTL分到一个meta QTL 组。以此方式鉴定出九个持绿的meta-QTL。如果CI没有共同区域且平均QTL定位相互距离少于或等于15cM，则将相同性状的QTL分类为分离的QTL。
对一组超过500条的关于DEEDI高粱pyt雄性试验的记录进行统计机器学习(SML)QTL分析(Bedo等人，BMC Genetics 9:35,2008)。 23个概率<0.05的QTL也在保守序列图谱上作图。
PIN基因分析
通过NCBI搜索水稻和拟南芥中所有可用的PIN基因 (www.ncbi.org)。总计鉴定了9种水稻PIN基因(OsPIN1,OsPIN1b, OsPIN1c,OsPIN2,OsPIN3a,OsPIN3b,OsPIN4,OsPIN5,OsPIN6)和 3种拟南芥PIN基因(AtPIN1,AtPIN2,AtPIN4)的序列。所有基因(蛋白质序列)都针对高粱WGS(www.gramene.org)进行BLAST，鉴定出前100条命中记录。收集1200条命中中每个的得分(S值：对查询值与显示的序列之间相似度的量度)、E-值(使得存在有相似度大于给定S得分的另一种比对的机会概率)、％ID和序列同源性长度。分析这4种测量值之间的关系并选择S得分作为评估序列相似度可能性的主要量度。在对S得分值的分布进行分析后，鉴定出3个S得分分类(>1000；>499和<1000；<499)并产生了得分>499的11个高粱基因的列表(即，存在于前2个分类中)(表8)。
表8
高粱基因ID 靶标基因 JGI注释
Sb02g029210 OsPIN6 "类似于Os09g0505400蛋白质"
Sb03g029320 OsPIN3a "类似于可能的生长素输出载体组分3a"
Sb03g032850 OsPIN1 "类似于推测的未鉴定蛋白质"
Sb03g037350 OsPIN5 "类似于可能的生长素输出载体组分5"
Sb03g043960 OsPIN6 "类似于可能的生长素输出载体组分6"
Sb04g028170 OsPIN1 "类似于生长素输出载体组分1"
Sb05g002150 OsPIN1b "类似于可能的生长素输出载体组分1b"
Sb07g026370 OsPIN4 "类似于可能的生长素输出载体组分4"
Sb10g004430 OsPIN1 "类似于推测的生长素输出载体组分3b"
Sb10g008290 OsPIN1c "类似于可能的生长素输出载体组分1c"
Sb10g026300 OsPIN2 "类似于可能的生长素输出载体组分2"
比较
将这11个鉴定的PIN直向同源物中的10个(90.9％)与已知的 QTL就持绿相比对。这11个高粱PIN基因中只有一个(SBI-03上的 Sb03g043960)不与任何已报道的QTL相比对。在79个作图的QTL 中(23个SML-QTL及56个来自文献/meta-QTL),将其中30各 (38％)与PIN直向同源物进行比对。
实施例25
对PIN2,PIN3,PIN4和PIN5进行分析
将持绿来源BTx642(B35)及含有Stg1、Stg2、Stg4 QTL的近等基因系(NILs)、以及对比的衰老品系Tx7000在温室中根管里进行培养。
本实验的目的是测量在本文鉴定为持绿基因候选物的基因在灌溉良好的条件下以及在对植物施加干旱压力后的表达水平，以研究持绿植物相比于衰老植物其中所述基因的表达是否有差异。
本实验分为两部分：早期干旱压力(Exp1)以及晚期干旱压力 (Exp2)。
来自早期干旱压力实验的结果显示于表9。
表9
Gene GeneID 水稻同源基因 Stg QTL 注释
SbPIN2 Sb03g029320 OsPIN3a Stg2 Stg2候选物
SbPIN3 Sb03g032850 OsPIN1 Stg1 靠上Stg1 QTL
SbPIN4 Sb03g037350 OsPIN5 Stg1 Stg1候选物
SbPIN5 Sb03g043960 OsPIN6 Stg1 靠下Stg1 QTL
这些PIN基因表达的主要差异总结于下表(表10)。
表10
对SbPIN4和SbPIN2,Stg1和Stg2分别鉴定表达形式。
在两种情况下，这些基因在对水分缺乏产生应答时在持绿品系中的表达都比衰老品系更高。
这两种PIN基因在组织特异性上显示出差异。SbPIN4通常(在所有条件下)在根和茎中表达很高，在叶片中表达更低，而SbPIN2通常在叶片和茎中表达更高，在根中更低。
本领域技术人员会清楚，本文描述的方面会受到这些具体描述情况之外的变动和修饰的影响。应当理解，这些方面包括所有这些变动和修饰。本文描述的方面还包括本说明书中提到或指出的所有步骤、特征、组合物和化合物，以及任何两种或更多种步骤或特征的任何及所有组合。
本领域技术人员会清楚，本文描述的方面会受到这些具体描述情况之外的变动和修饰的影响。应当理解，这些方面包括所有这些变动和修饰。本文描述的方面还包括本说明书中提到或指出的所有步骤、特征、组合物和化合物，以及任何两种或更多种步骤或特征的任何及所有组合。
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Xu等人，Genome 43:461-469,2000
Zheng等人，Plant Breed 128:54-62,2009
本申请还涉及以下实施方案：
1.分离的遗传材料，当其表达于植物细胞时赋予植物这样的表型，所述表型包括水分利用转移至开花期后阶段或在作物生长过程中水分利用度增加或蒸腾作用增加，由此使得水分有限的条件下的收获指数及谷物产率增加，并且其中遗传材料编码选自SbPIN1-11的蛋白质或来自其他植物的其的等价物。
2.实施方案1的分离的遗传材料，其中SbPIN蛋白质选自SbPIN4 和SbPIN2或其他植物中其的等价物。
3.实施方案1或2的分离的遗传材料，其中遗传材料表达于遗传修饰高粱植物中。
4.实施方案1的分离的遗传材料，其中遗传材料表达于遗传修饰植物中，所述植物选自小麦、燕麦、玉蜀黍、大麦、黑麦和水稻。
5.实施方案1的分离的遗传材料，其中遗传材料表达于遗传修饰植物中，所述植物选自蕉麻、苜蓿、杏、苹果、芦笋、香蕉、菜豆、黑莓、蚕豆、油菜、腰果、木薯、鹰嘴豆、柑橘、椰子、咖啡、玉米、棉花、亚麻、无花果、葡萄、落花生、大麻、洋麻、薰衣草、mano、蘑菇、橄榄、洋葱、豌豆、花生、梨、珍珠米、马铃薯、苎麻、菜籽、黑麦草、大豆、草莓、甜菜、甘蔗、向日葵、甘薯、芋头、茶、烟草、番茄、黑小麦、松露和山药。
6.用于提高作物产率的经济回报的商业模型，所述模型包括生成包含这样的冠层结构的作物植物，所述冠层结构促进植物的水分利用转移至开花期后阶段或作物生长过程中水分利用度增加或蒸腾作用增加，这由此使得水分有限的条件下的HI及谷物产率增加，由所生成的作物植物获得种子，以及将种子分配至谷物生产商，以增强产率和收益，其中作物植物是通过本文所述的方法生成的。

Claims (18)

1.用于生成遗传修饰植物的方法，所述遗传修饰植物比相同种属的非遗传修饰植物更有效地利用水分，所述方法包括在植物的所有或选定组织中调制存在的或引入的针样花序(PIN)基因座的表达水平，以促进持绿表型，所述表型包括水分利用转移至开花期后阶段或在作物生长过程中水分利用度增加或蒸腾作用增加，由此使得水分有限的条件下的收获指数及谷物产率增加。
2.权利要求1的方法，其中PIN基因座编码的PIN蛋白质选自由高粱SbPIN1-SbPIN11或其他植物中其的等价物。
3.权利要求1的方法，其中PIN为SbPIN4或在其他植物中其的等价物。
4.权利要求1的方法，其中PIN为SbPIN2或在其他植物中其的等价物。
5.权利要求1的方法，其中PIN为OsPIN5或OsPIN3a或在其他植物中其的等价物。
6.权利要求1的方法，其包括引入编码PIN蛋白质或者增加或降低内源PIN蛋白质水平的遗传试剂。
7.权利要求1的方法，其中遗传试剂是选定的具有特定PIN表达谱的区域或植物基因组。
8.权利要求7的方法，其中遗传试剂是通过遗传工程方法或通过杂交操作流程引入的。
9.权利要求1的方法，其中遗传修饰植物是高粱植物。
10.权利要求1的方法，其中遗传修饰植物选自小麦、燕麦、玉蜀黍、大麦、黑麦和水稻。
11.权利要求1的方法，其中遗传修饰植物选自蕉麻、苜蓿、杏、苹果、芦笋、香蕉、菜豆、黑莓、蚕豆、油菜、腰果、木薯、鹰嘴豆、柑橘、椰子、咖啡、玉米、棉花、亚麻、无花果、葡萄、落花生、大麻、洋麻、薰衣草、mano、蘑菇、橄榄、洋葱、豌豆、花生、梨、珍珠米、马铃薯、苎麻、菜籽、黑麦草、大豆、草莓、甜菜、甘蔗、向日葵、甘薯、芋头、茶、烟草、番茄、黑小麦、松露和山药。
12.权利要求1的方法，其中持绿表型进一步包括选自如下的表型：冠层结构柔性增加、冠层大小减少、开花期每单位叶片面积生物质增强、蒸腾效率更高、谷物灌浆过程中水分利用增加、开花期前和开花期后生物质产生减少以及衰老延迟。
13.权利要求1的方法，其中持绿表型进一步包括谷物大小更大。
14.由权利要求1-13中任何一项的方法生成的遗传修饰植物。
15.权利要求14的植物子代，其经过遗传修饰显示出持绿表型。
16.权利要求14或权利要求15的植物的种子或果实或其他生殖或繁殖部分。
17.用于生成遗传修饰植物的方法，所述遗传修饰植物比相同种属的非遗传修饰植物更有效地利用水分，所述方法包括向植物或植物亲本中引入遗传试剂，所述遗传试剂编码选自来自高粱的SbPIN1-11的PIN蛋白质或来自其他植物的与持绿表型相关的功能等价物，所述表型包括水分利用转移至开花期后阶段或在作物生长过程中水分利用度增加或蒸腾作用增加，由此使得水分有限的条件下的收获指数及谷物产率增加；或引入调制内源PIN基因座表达的试剂。
18.权利要求17的方法，其中SbPIN蛋白质选自SbPIN4、SbPIN2、OsPIN5和OsPIN3a或其他植物中其的等价物。
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