FR2754714A1 - Nouvelles utilisations d'extraits de ginkgo biloba pour la preparation de compositions pharmaceutiques,et methode de traitement cosmetique mettant en oeuvre un extrait de ginkgo biloba - Google Patents
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Abstract
L'invention concerne l'utilisation d'au moins un principe actif susceptible d'être obtenu par extraction à partir de Ginkgo biloba pour la préparation d'une composition à activité immunomodulatrice. L'invention concerne également une méthode de traitement cosmétique des peaux sensibles.
Description
La présente invention se rapporte à l'utilisation dans le domaine de l'immunomodulation, d'extraits susceptibles d'être obtenus à partir de
Ginkgo biloba. Ces extraits sont utiles en particulier pour traiter, prévenir ou moduler les manifestations cutanées des désordres immunitaires.
Ginkgo biloba. Ces extraits sont utiles en particulier pour traiter, prévenir ou moduler les manifestations cutanées des désordres immunitaires.
Le Ginkgo biloba est un arbre dioïque originaire d'Extrême Orient, dont les feuilles servent à la préparation de médicaments.
Les extraits de Ginkgo ont été proposés pour améliorer les symptômes du déficit intellectuel chez le sujet âgé, ou de la claudication intermittente des artériopathies oblitérantes et de la maladie de Raynaud il est également préconisé en cas de déficit rétinien, où les composants du groupe des Ginkgolides seraient alors plus particulièrement impliqués dans l'activité recherchée.
De manière inattendue, la Demanderesse a maintenant trouvé que des extraits obtenus à partir du Ginkgo biloba possèdent une activité immunomodulatrice. C'est pourquoi la présente invention a pour objet l'utilisation d'au moins un principe actif susceptible d'être obtenu par extraction à partir de Ginkgo biloba pour la préparation d'une composition à activité immunomodulatrice, notamment par voie topique.
Les réactions immunitaires sont régulées par un système complexe et interviennent dans le maintien du bon état général de l'organisme.
Elles contribuent à la défense contre des particules étrangères, en particulier les agents pathogènes, ou contre les cellules de l'hôte ayant subi une transformation néoplasique.
Cette défense passe par la reconnaissance de la nature étrangère d'un antigène et l'activation de médiateurs cellulaires ou humoraux. Elle est sous la dépendance de facteurs génétiques, par l'intermédiaire des gènes du complexe majeur d'histocompatibilité.
Toutefois, ce mécanisme peut parfois être indésirable lorsqu'il s'exerce de façon trop intense, ou à l'encontre d'antigènes de l'environnement qui ne sont pas intrinsèquement nocifs ; c'est également le cas lors de transplantations d'organes ou de greffes tissulaires. Par ailleurs, certains dysfonctionnements conduisent à une reconnaissance erronée des cellules de l'hôte, qui sont détruites par son propre système immunitaire, et peuvent entraîner un ensemble de pathologies (comme le lupus érythémateux disséminé, la dermatomyosite, la polyarthrite rhumatoïde ou certaines hépatites fulminantes par exemple).
On a de plus constaté que chez les sujets allergiques, il existait une prévalence de personnes présentant également une peau dite "sensible".
De manière générale, de plus en plus d'individus se plaignent d'une telle peau sensible. Bien que leur étiologie soit complexe, il semble que des facteurs de nature allergique et inflammatoire soient souvent impliqués.
La notion de peaux sensibles recouvre un ensemble de manifestations comprenant les peaux réactives et les peaux intolérantes.
Les facteurs déclenchants peuvent être les agressions de l'environnement comme, le vent, la pollution, les variations de température, des eaux trop calcaires ou des produits d'hygiène, cosmétiques ou de soins mal adaptés ces phénomènes peuvent aussi être associés à des stress ou des émotions ressentis par le sujet, certains régimes alimentaires ou la prise de médicaments. I1 existe en outre des facteurs prédisposants individuels (notamment neurologiques ou hormonaux) ou familiaux qui amplifient ces réactions.
De manière générale, le sujet ressent un inconfort cutané qui peut se manifester par des signes subjectifs et/ou objectifs. La peau tiraille, démange ou picote facilement, il peut y avoir des sensations de chaleur, piqûre, brûlure. La peau peut rougir ou desquamer. On constate de façon irrégulière une xérose, une dermite séborrhéique, des télangiectasies, des vésicules ou même un oedème.
Cet état peut se manifester au niveau de la peau, des muqueuses, ou du cuir chevelu. Dans ce dernier cas, il pourra être associé à un état pelliculaire et/ou une alopécie.
Comme indiqué plus haut, cet état comporte souvent une composante allergique. En outre il peut évoluer vers des affections dermatologiques de type immunoallergique telles que l'atopie, l'eczéma ou les neurodermites.
Les affections allergiques ont été classées en quatre types, fondés sur la nature de la réaction immunologique, et résultent d'un mécanisme immunologique d'inflammation.
I1 a maintenant été trouvé que les extraits de Ginkgo présentent une activité immunomodulatrice. Ceci peut être mis en évidence sur des cultures mixtes lympho-épidermiques.
En effet la peau, et plus particulièrement l'épiderme, où se trouvent localisées les cellules de Langerhans, joue un rôle dans la défense immunitaire de l'organisme. C'est la détermination de la fonction des cellules de Langerhans (LC) en tant que cellules présentant l'antigène et le fait que les kératinocytes puissent générer des facteurs intervenant dans la réponse immune, qui ont été à l'origine de la notion de système immunitaire cutané. La position périphérique des cellules de Langerhans leur confère un rôle essentiel dans la prise en charge, l'apprêtement et la présentation de l'antigène aux lymphocytes T. La présentation de l'antigène implique l'interaction entre les molécules de classe II du complexe majeur d'histocompatibilité (HLA-DR) exprimé par les cellules de
Langerhans et le récepteur T des lymphocytes CD4+. Lors de la phase précoce de la sensibilisation, les antigènes sont pris en charge dans l'épiderme par les cellules de Langerhans et transformés en peptides immunogéniques. La présentation antigénique aux lymphocytes T s'effectue dans les ganglions via l'interaction entre le complexe HLA-DRpeptides immunogéniques à la surface des cellules de Langerhans et le récepteur T des lymphocytes CD4+.
Langerhans et le récepteur T des lymphocytes CD4+. Lors de la phase précoce de la sensibilisation, les antigènes sont pris en charge dans l'épiderme par les cellules de Langerhans et transformés en peptides immunogéniques. La présentation antigénique aux lymphocytes T s'effectue dans les ganglions via l'interaction entre le complexe HLA-DRpeptides immunogéniques à la surface des cellules de Langerhans et le récepteur T des lymphocytes CD4+.
Les CMLE constituent un modèle permettant de déterminer les propriétés immunomodulatrices d'une substance susceptible de modifier l'équilibre immunologique cutané, par la mesure de la prolifération lymphocytaire induite par les cellules épidermiques allogéniques, présentatrices d'antigènes, avec ou sans traitement par la substance.
L'activité anti-allergique est confirmée sur des kératinocytes et des cellules macrophagiques. Les macrophages sont des cellules particulièrement intéressantes car ce sont des cellules résidantes au niveau de la peau qui régulent non seulement les réactions inflammatoires locales mais également les réponses immunitaires par leur capacité à présenter l'antigène et à produire un grand nombre de cytokines qui régulent l'immunité locale. Ces macrophages sont également impliqués dans les communications avec le système circulatoire pouvant, le cas échéant, mobiliser différents types cellulaires (monocytes, neutrophiles, éosinophiles et lymphocytes T) augmentant ainsi le pouvoir de défense non spécifique et spécifique du tissu considéré.
L'activité du principe actif extrait du Ginkgo a donc été recherchée sur des cultures de kératinocytes et de macrophages humains stimulés ou non par l'IL-4 qui induit le récepteur CD23 à la surface des cellules, puis par des complexes immuns à IgE. Ce type de stimulation rend compte de l'inflammation allergique (IgE), elle met les cellules dans le cadre d'une réponse pro-oxydante (génération de radicaux libres, NO, anion superoxyde, dont la mesure peut être évaluée par la mesure de la production de dérivés nitrogénés) et immuno-inflammatoire (production de cytokines comme le TNF-a).
En outre, cette activité immunomodulatrice est renforcée par le fait que des principes actifs extraits du Ginkgo présentent également une activité sur l'inflammation non spécifique observée localement.
Plus particulièrement, le ou les principes actifs utiles selon l'invention sont présents dans la composition sous forme d'un extrait obtenu à partir de feuilles de Ginkgo biloba. Différents extraits de Ginkgo biloba peuvent convenir à la mise en oeuvre de l'invention; de préférence, la concentration en terpènes dans ces extraits est inférieure à environ 7% p/p.
En effet, le Ginkgo biloba possède une composition chimique complexe, qui comprend des hydrocarbures et des alcools aliphatiques, des stéroïdes, des acides aminés, des polyphénols comme la lutéoline, le quercétol et des biflavones plus spécifiques dérivés de l'amentaflavone (bilobétine, ginkgétine) ; il contient également de l'acide ginkgolique et des dérivés anacardiques à chaîne sesquiterpénique, des terpènes dérivés du limonène et des terpènes à groupement tertiobutyle (bilobalides et
Ginkgolides).
Ginkgolides).
Des extraits appropriés pour la mise en oeuvre de l'invention, peuvent avoir une teneur en dérivés terpéniques d'une valeur inférieure à environ 3% p/p de matière sèche, notamment inférieure à 1% p/p et avantageusement inférieure à 0,5% p/p.
De préférence, on élimine substantiellement la chlorophylle, les lipides, cires et lectines de l'extrait utilisé.
L'extrait est également substantiellement dépourvu de substances comme l'acide ginkgolique, les biflavonoides ou les aglycones libres.
La concentration en proanthocyanidines est de préférence inférieure à 5% p/p de l'extrait sec.
Des extraits utilisables selon l'invention présentent de préférence une concentration en flavones hétérosides supérieure à 24% p/p de matière sèche, encore de préférence supérieure à -28% p/p; elle est avantageusement comprise entre environ 29 et 35% p/p.
Les flavones hétérosides sont des composés dont l'aglycone est un flavonol comme la quercétine, le kaempférol ou l'isorhamnétine. Ce sont des mono-, tri- et surtout di-glucosides, dont les principaux constituants glucidiques sont le glucose et le rhamnose. Ils se trouvent en proportion importante sous forme d'esters coumariques de quercétine et de kaempférol glucorhamnoside.
Un extrait de Ginkgo convenant particulièrement à la mise en oeuvre de l'invention, présente, pour une teneur en eau inférieure à 3% p/p, une concentration en flavones hétérosides de 32 + 3% p/p, une concentration en acide ginkgolique inférieure à 10 ppm, une concentration en pro-anthocyanidines inférieure à 5% p/p et une concentration en terpènes inférieure à 0,5% p/p.
Selon l'un de ses aspects, l'invention concerne donc l'utilisation d'au moins un principe actif susceptible d'être obtenu à partir du Ginkgo biloba, pour la préparation d'une composition permettant de prévenir, de traiter et/ou de moduler les réactions des peaux sensibles telles que définies ci-dessus.
Selon un autre aspect, l'invention concerne l'utilisation de principes actifs extraits du Ginkgo tels que définis ci-dessus pour la préparation de compositions destinées au traitement ou à la prévention d'une affection choisie dans le groupe comprenant : atopie, vitiligo, psoriasis, érythème polymorphe, neurodermite, xérodermie, rosacea, urticaire, pemphigus, lupus érythémateux, dermatite, lucite estivale bénigne et eczéma.
Les extraits de Ginkgo biloba peuvent conformément à l'invention, être utilisés en adaptant leur dosage, pour moduler certains mécanismes immunitaires.
On peut ainsi les proposer pour certaines affections dermatologiques associées au SIDA ; par exemple la conception actuelle de la maladie de Kaposi, qui présente classiquement 4 formes cliniques (et pour laquelle un virus du groupe herpès est supposé être l'agent causal), est celle d'une hyperplasie constituée notamment de cellules inflammatoires.
De préférence, dans les compositions selon l'invention, l'extrait de
Ginkgo biloba est présent dans la composition à une concentration comprise entre 0,0001 et 10% p/p, avantageusement entre 0,01 et 2% p/p.
Ginkgo biloba est présent dans la composition à une concentration comprise entre 0,0001 et 10% p/p, avantageusement entre 0,01 et 2% p/p.
Les extraits peuvent être utilisés en tant que tels dans les formulations, ou pré-associés à des phospholipides améliorant leur biodisponibilité dans des véhicules du type liposome, ou Phytosome .
L'invention a également pour objet une méthode de traitement cosmétique des peaux hyperréactives, caractérisée en ce qu'on applique par voie topique au moins un principe actif susceptible d'être obtenu par extraction à partir de Ginkgo biloba.
Les compositions selon l'invention seront formulées avec des excipients cosmétologiquement et/ou dermatologiquement acceptables, connus de l'homme du métier.
Les exemples qui suivent sont destinés à illustrer l'invention.
Dans ces exemples, on se référera à la figure suivante
Figure : Prolifération de cellules lymphoépidermiques en présence ou
non de différentes concentrations d'un extrait de Ginkgo
biloba.
Figure : Prolifération de cellules lymphoépidermiques en présence ou
non de différentes concentrations d'un extrait de Ginkgo
biloba.
Exemple 1 1. Matériels et Méthodes
Produits
Les produits suivants ont été utilisés au cours de cette étude : 1'IL-4 provient de chez Immugenex (Los Angeles CA) et est utilisée à 10 ng/ml, les IgE monoclonaux proviennent de chez Stallergène (Fresnes, France) et les anti-IgE sont de chez Nordic (Tilburg, Hollande).
Produits
Les produits suivants ont été utilisés au cours de cette étude : 1'IL-4 provient de chez Immugenex (Los Angeles CA) et est utilisée à 10 ng/ml, les IgE monoclonaux proviennent de chez Stallergène (Fresnes, France) et les anti-IgE sont de chez Nordic (Tilburg, Hollande).
Culture de kératinocytes
Les primo-cultures de kératinocytes sont obtenues à partir de prépuces néonataux et sont maintenues en prolifération ex vivo dans un milieu ne contenant pas de sérum de veau. Les cultures confluentes de kératinocytes sont trypsinisées et transférées dans des plaques 24 puits dans du milieu frais à la densité cellulaire de 105 cellules/ml/puits. La présence du récepteur à l'IgE (CD23) à la surface des cellules est vérifiée par immuno-marquage.
Les primo-cultures de kératinocytes sont obtenues à partir de prépuces néonataux et sont maintenues en prolifération ex vivo dans un milieu ne contenant pas de sérum de veau. Les cultures confluentes de kératinocytes sont trypsinisées et transférées dans des plaques 24 puits dans du milieu frais à la densité cellulaire de 105 cellules/ml/puits. La présence du récepteur à l'IgE (CD23) à la surface des cellules est vérifiée par immuno-marquage.
Culture de macrophages
Les cellules macrophagiques sont obtenues à partir du sang périphérique de donneurs normaux (non allergique). Les cellules mononucléées sont isolées sur gradient de ficoll et l'anneau de cellules lymphoïdes est récupéré, lavé trois fois, puis les cellules sont mises en culture de manière à faire adhérer les cellules macrophagiques. Ces cellules sont récupérées après 1 heure d'adhérence et sont mises en culture (106 cellules/ml/puits). Avant la stimulation par IL-4, la présence du récepteur à l'lgE (CD23) à la surface des cellules est vérifiée par immuno-marquage.
Les cellules macrophagiques sont obtenues à partir du sang périphérique de donneurs normaux (non allergique). Les cellules mononucléées sont isolées sur gradient de ficoll et l'anneau de cellules lymphoïdes est récupéré, lavé trois fois, puis les cellules sont mises en culture de manière à faire adhérer les cellules macrophagiques. Ces cellules sont récupérées après 1 heure d'adhérence et sont mises en culture (106 cellules/ml/puits). Avant la stimulation par IL-4, la présence du récepteur à l'lgE (CD23) à la surface des cellules est vérifiée par immuno-marquage.
Activation cellulaire
Les cellules sont d'abord activées par 1'IL-4 de manière à induire le
CD23 puis sont ensuite mises en cultures et stimulées par les complexes immuns à IgE pendant 3 à 5 jours avant de récupérer les différents surnageants. Le dosage des dérivés nitrogénés est réalisé à l'aide du Griess et le taux de TNF est mesuré en utilisant des kits de dosage de chez
Medgénix (Fleurus, Belgique).
Les cellules sont d'abord activées par 1'IL-4 de manière à induire le
CD23 puis sont ensuite mises en cultures et stimulées par les complexes immuns à IgE pendant 3 à 5 jours avant de récupérer les différents surnageants. Le dosage des dérivés nitrogénés est réalisé à l'aide du Griess et le taux de TNF est mesuré en utilisant des kits de dosage de chez
Medgénix (Fleurus, Belgique).
2. Résultats
Effet d'un extrait de Ginkgo Biloba sur les kératinocytes et les macrophages stimulés par 1'IL-4
Des feuilles sèches de Ginkgo Biloba ont été soumises à une extraction en continu par un mélange acétone-eau sous vide, puis plusieurs étapes d'élimination de solvant ainsi que dé la chlorophylle, lipides, cires, lectines et de certaines substances conduisent à un extrait désigné dans ce qui suit par H37.
Effet d'un extrait de Ginkgo Biloba sur les kératinocytes et les macrophages stimulés par 1'IL-4
Des feuilles sèches de Ginkgo Biloba ont été soumises à une extraction en continu par un mélange acétone-eau sous vide, puis plusieurs étapes d'élimination de solvant ainsi que dé la chlorophylle, lipides, cires, lectines et de certaines substances conduisent à un extrait désigné dans ce qui suit par H37.
I1 se présente sous forme d'une poudre fine, répondant aux spécifications suivantes - solvants résiduels
. éthanol < 3 HO
acétone < 0,1%
. butanol < 0,1%
acétate d'éthyle < 0,1% - cendres sulfuriques < 1,5% - teneur en eau < 3% - pro-anthocyanidines < 5% - terpènes < 0,5% - acide ginkgolique < 10 ppm - métaux lourds < 20 ppm - flavones hétérosides 32 + 3%
I1 est soluble à 6% (p/p) dans PEG 400 et à 4% (p/v) dans l'éthanol 90 .
. éthanol < 3 HO
acétone < 0,1%
. butanol < 0,1%
acétate d'éthyle < 0,1% - cendres sulfuriques < 1,5% - teneur en eau < 3% - pro-anthocyanidines < 5% - terpènes < 0,5% - acide ginkgolique < 10 ppm - métaux lourds < 20 ppm - flavones hétérosides 32 + 3%
I1 est soluble à 6% (p/p) dans PEG 400 et à 4% (p/v) dans l'éthanol 90 .
Les cellules sont stimulées pendant 48 h en présence d'IL-4 (10 ng/ml) de manière à induire le récepteur de basse affinité pour les IgE (CD23) à leur surface. Au terme de cette période de culture 30 à 80 % des kératinocytes et des macrophages expriment le CD23. Les variations individuelles ne sont en aucun cas l'image d'une situation allergique différente entre ces individus. Quoiqu'il en soit dans cette phase d'induction le produit testé ne modifie pas cette induction du CD23, en effet moins de 5% de diminution ne peut être observé (n=8).
Tableau 1 : Induction de l'expression du CD23 par les
différentes cellules stimulées par IL-4 en présence
ou non de 10 mg/ml H37
Cellules Milieu + IL-4
Macrophages < 5% 45 +/- 4
+ H37 < 5% 41+/-2
Kératinocytes ND 55 +/- 7
+H37 ND 51+/-4 * Les cellules sont stimulées pendant 48 h en présence ou non de 10 ng/ml d'IL-4 et en présence ou en l'absence des différents produits, ND = non détectable.
différentes cellules stimulées par IL-4 en présence
ou non de 10 mg/ml H37
Cellules Milieu + IL-4
Macrophages < 5% 45 +/- 4
+ H37 < 5% 41+/-2
Kératinocytes ND 55 +/- 7
+H37 ND 51+/-4 * Les cellules sont stimulées pendant 48 h en présence ou non de 10 ng/ml d'IL-4 et en présence ou en l'absence des différents produits, ND = non détectable.
Après engagement du CD23 par des complexes immuns à IgE on induit la production d'une grand nombre de médiateurs et cytokines (TNF notamment) et de produits issus du métabolisme oxydatif comme les dérivés nitrogénés. Cette stimulation redéfinit in vitro une réaction inflammatoire de type allergique.
Les résultats obtenus sont résumés dans les deux tableaux suivants
Tableau 2A : Production de dérivés nitrés ( NO2 - FM) après
stimulation par les complexes immuns à IgE +/- 10
mg/ml H37
Cellules Expt- 1 Expt-2 Expt-3 Expt-4
Macrophages 25 (5)* 30 (2) 55 (11) ils (2)
+H37 15 (2) 17 (75) 21(50) 6 (2)
Kératinocytes 17 (13) 13 (3) 23 (12) 13 (5)
+1137 12(11) 8(2) 10(10) 8 (6) * Les valeurs entre parenthèses sont celles de cellules non-stimulées par les complexes immuns à IgE.
Tableau 2A : Production de dérivés nitrés ( NO2 - FM) après
stimulation par les complexes immuns à IgE +/- 10
mg/ml H37
Cellules Expt- 1 Expt-2 Expt-3 Expt-4
Macrophages 25 (5)* 30 (2) 55 (11) ils (2)
+H37 15 (2) 17 (75) 21(50) 6 (2)
Kératinocytes 17 (13) 13 (3) 23 (12) 13 (5)
+1137 12(11) 8(2) 10(10) 8 (6) * Les valeurs entre parenthèses sont celles de cellules non-stimulées par les complexes immuns à IgE.
Le produit H37 présente une activité inhibitrice sur la production de dérivés nitrés par les macrophages et les kératinocytes stimulés par les complexes immuns à IgE.
Tableau 2B : Production de TNF (pg/ml) après stimulation par
les immuns complexes à IgE +/- 10 mg/ml H37
Cellules E,xpt- 1 Expt-2 Expt-3 Expt-4
Macrophages 975 (105)* 275 (35) 455 (40) 310 (89)
+1137 850(105) 215 (25) 365 (35) 275 (87)
Kératinocytes 185 (ND) 158 (ND) 315 (35) 308 (ND)
+H37 155 (ND) 120 (ND) 245 (30) 276 (ND) * Les valeurs entre parenthèses sont celles de cellules non-stimulées par les complexes immuns à IgE, ND = non détectable.
les immuns complexes à IgE +/- 10 mg/ml H37
Cellules E,xpt- 1 Expt-2 Expt-3 Expt-4
Macrophages 975 (105)* 275 (35) 455 (40) 310 (89)
+1137 850(105) 215 (25) 365 (35) 275 (87)
Kératinocytes 185 (ND) 158 (ND) 315 (35) 308 (ND)
+H37 155 (ND) 120 (ND) 245 (30) 276 (ND) * Les valeurs entre parenthèses sont celles de cellules non-stimulées par les complexes immuns à IgE, ND = non détectable.
Le produit H37 diminue légèrement la production de TNF par les macrophages et les kératinocytes stimulés par les complexes immuns à IgE.
I1 apparaît donc que le produit H37 présente une activité antiinflammatoire allergique. Cette caractéristique est très importante car la gravité des réponses inflammatoires notamment d'origine allergique résulte d'un déséquilibre du métabolisme oxydatif de ces cellules. C'est notamment ce déséquilibre qui est à l'origine, en partie du moins, de la régulation des phénomènes immunologiques associés à ces réactions : c'est le cas des réactions allergènes spécifiques et de la production de cytokines.
Exemple 2: Etude de l'effet de H37 sur des cultures mixtes
lympho-épidermiques (CMLE) allogéniques
(présentation de l'antigène aux lymphocytes T)
Le principe des cultures mixtes lympho-épidermiques (CMLE) est celui des cultures mixtes lymphocytaires, à ceci près que la population stimulante est une suspension de cellules épidermiques totales (kératinocytes, cellules de Langerhans...). Comme cette co-culture permet d'évaluer la capacité des cellules de Langerhans à présenter l'antigène aux lymphocytes T elle est, en particulier, très utile pour tester les molécules (ou stress) susceptibles de modifier les réponses immunitaires cutanées.
lympho-épidermiques (CMLE) allogéniques
(présentation de l'antigène aux lymphocytes T)
Le principe des cultures mixtes lympho-épidermiques (CMLE) est celui des cultures mixtes lymphocytaires, à ceci près que la population stimulante est une suspension de cellules épidermiques totales (kératinocytes, cellules de Langerhans...). Comme cette co-culture permet d'évaluer la capacité des cellules de Langerhans à présenter l'antigène aux lymphocytes T elle est, en particulier, très utile pour tester les molécules (ou stress) susceptibles de modifier les réponses immunitaires cutanées.
De façon résumée, des lots de cellules épidermiques totales témoins, ainsi que des lots de cellules épidermiques sont mis en culture avec des lymphocytes T. Le traitement par la molécule exogène se fait au moment de la mise en co-culture. La prolifération lymphocytaire induite par les cellules épidermiques est ensuite mesurée. Cette méthode permet de suivre les fonctions immunes des cellules de Langerhans lors d'une co-culture lympho-épidermique et leur modification par des traitements exogènes.
Les études ont été réalisées en situation allogénique (donneurs différents pour les cellules épidermiques et les lymphocytes T) avec des cellules épidermiques totales fraichement prélevées provenant de plasties mammaires.
Protocole
Cette étude a été réalisée avec des cellules épidermiques provenant de 2 ou 3 donneurs distincts.
Cette étude a été réalisée avec des cellules épidermiques provenant de 2 ou 3 donneurs distincts.
Les cellules épidermiques sont mises en co-culture avec des lymphocytes T allogéniques dans des plaques de 96 puits : le nombre de cellules épidermiques totales est équivalent au nombre de lymphocytes (10s cellules épidermiques - 105 lymphocytes T par puits).
Le temps total de co-culture est de 6 jours, l'incorporation de thymidine tritiée étant effectuée 18 heures avant la fin de la co-culture (Sième jour).
La prolifération lymphocytaire est déterminée par mesure de l'incorporation de thymidine tritiée (comptage en radioactivité après "mash" des plaques).
Les molécules (extrait H37 ou cyclosporine) ont été additionnées au moment de la mise en co-culture des cellules épidermiques et des lymphocytes T allogéniques.
- Echantillons traités par les molécules à tester
Mise en co-culture des cellules épidermiques et des lymphocytes T allogéniques avec la molécule à étudier en concentrations croissantes par ajout d'un faible volume d'une solution concentrée de la molécule (4 concentrations finales). Pour H37, soluble dans l'eau la solution mère a été préparée dans l'eau puis dans le milieu. Pour la cyclosporine soluble dans le DMSO, la solution mère a été préparée dans le DMSO puis les solutions filles dans le milieu.
Mise en co-culture des cellules épidermiques et des lymphocytes T allogéniques avec la molécule à étudier en concentrations croissantes par ajout d'un faible volume d'une solution concentrée de la molécule (4 concentrations finales). Pour H37, soluble dans l'eau la solution mère a été préparée dans l'eau puis dans le milieu. Pour la cyclosporine soluble dans le DMSO, la solution mère a été préparée dans le DMSO puis les solutions filles dans le milieu.
On a utilisé de faibles proportions de DMSO final dans les puits (0,1% final pour le contrôle DMSO et pour la cyclosporine).
Les contrôles négatifs sont les suivants - cellules épidermiques seules non traitées (EC témoin) - lymphocytes T seuls non traités (PBMC témoin) autres contrôles : cellules épidermiques seules traitées avec du DMSO (solvant utilisé pour la cyclosporine), lymphocytes T seuls traités avec du
DMSO (solvant utilisé pour la cyclosporine), cellules épidermiques seules traitées avec la molécule à la plus forte concentration et lymphocytes T seuls traités avec la molécule à la plus forte concentration.
DMSO (solvant utilisé pour la cyclosporine), cellules épidermiques seules traitées avec la molécule à la plus forte concentration et lymphocytes T seuls traités avec la molécule à la plus forte concentration.
Les contrôles positifs sont les suivants - cellules épidermiques + lymphocytes T allogéniques (EC = PBMC témoin) - cellules épidermiques + lymphocytes T traités avec du DMSO à 0,1% (v/v) (solvant utilisé pour la cyclosporine)
L'Etalon est de la cyclosporine (Cyclo) 106 M.
L'Etalon est de la cyclosporine (Cyclo) 106 M.
Le produit H 37 a été utilisé aux concentrations finales suivantes
1: 0,03%
2: 0,01%
3: 0,001%
4: 0,0001%
Résultats
Des expériences préliminaires ont montré que le produit H37, jusqu'à la concentration 0,03%, ne présentait pas d'activité cytotoxique à la fois sur les lymphocytes et les cellules épidermiques.
1: 0,03%
2: 0,01%
3: 0,001%
4: 0,0001%
Résultats
Des expériences préliminaires ont montré que le produit H37, jusqu'à la concentration 0,03%, ne présentait pas d'activité cytotoxique à la fois sur les lymphocytes et les cellules épidermiques.
Les résultats de CMLE sont présentés sur la figure en annexe.
Les symboles suivants ont été utilisés
PBMC : lymphocytes T seuls
EC : Cellules épidermiques totales seules
EC + PBMC : Cellules épidermiques totales en présence allogéniques de lymphocytes T
Les résultats sont présentés en pourcentage d'incorporation de thymidine tritiée (%). La valeur 100% correspond au taux d'incorporation de thymidine pour le système EC+PBMC (cellules épidermiques totales en présence de lymphocytes T sanguins allogéniques) en l'absence de tout produit (témoin).
PBMC : lymphocytes T seuls
EC : Cellules épidermiques totales seules
EC + PBMC : Cellules épidermiques totales en présence allogéniques de lymphocytes T
Les résultats sont présentés en pourcentage d'incorporation de thymidine tritiée (%). La valeur 100% correspond au taux d'incorporation de thymidine pour le système EC+PBMC (cellules épidermiques totales en présence de lymphocytes T sanguins allogéniques) en l'absence de tout produit (témoin).
Les expériences représentées montrent que la prolifération des lymphocytes T se produit en présence des cellules épidermiques totales (augmentation de l'incorportation de thymidine tritiée). L'amplification de la prolifération lymphocytaire est relative à la souche des cellules épidermiques qui est différente dans chaque expérience. Cette prolifération induite correspondant à la présentation par les cellules de
Langerhans de la préparation de cellules épidermiques totales de l'antigène aux lymphocytes T.
Langerhans de la préparation de cellules épidermiques totales de l'antigène aux lymphocytes T.
La cyclosporine qui est un immuno-modulateur connu inhibe la prolifération lymphocytaire dans la CMLE (70% d'inhibition).
Le produit H37 présente un net effet d'inhibition de la prolifération lymphocytaire dans la CMLE aux concentrations 1 (0,03%) et 2 (0,01%).
Ces résultats montrent que le produit H37 présente des propriétés immunomodulatrices mises en évidence lors de la CMLE "in vitro".
Claims (11)
1. Utilisation d'au moins un principe actif susceptible d'être obtenu par extraction à partir de Ginkgo biloba pour la préparation d'une composition à activité immunomodulatrice.
2. Utilisation d'au moins un principe actif susceptible d'être obtenu à partir de Ginkgo biloba selon la revendication 1, caractérisée en ce que la composition est destinée à prévenir ou à traiter les réactions cutanées immunodépendantes.
3. Utilisation selon l'une des revendications 1 ou 2, caractérisée en ce que le ou les principes actifs sont présents dans la composition sous forme d'un extrait obtenu à partir de feuilles de Ginkgo biloba.
4. Utilisation selon la revendication 3, caractérisée en ce que l'extrait de Ginkgo biloba présente une concentration en terpènes inférieure à 3% p/p de matière sèche.
5. Utilisation selon l'une des revendications 3 ou 4, caractérisée ce que l'extrait de Ginkgo biloba présente une concentration en flavones hétérosides supérieure à 24% p/p de matière sèche.
6. Utilisation selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisée en ce que la composition est destinée au traitement ou à la prévention des réactions d'intolérance et/ou d'allergie de la peau et des muqueuses.
7. Utilisation selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisée en ce que la composition est destinée au traitement ou à la prévention d'une affection choisie dans le groupe constitué de : atopie, vitiligo, psoriasis, érythème polymorphe, neurodermite, xérodermie, urticaire, pemphigus, rosacea, lupus érythémateux, dermatite, lucite estivale bénigne, eczéma et manifestations dermatologiques associées au SIDA.
8. Utilisation selon la revendication 7, caractérisée en ce que l'extrait de Ginkgo biloba est présent dans la composition à une concentration comprise entre 0,0001 et 10% p/p.
9. Utilisation selon l'une des revendications 3 à 8, caractérisée en ce que l'extrait de Ginkgo est présent dans la composition à une concentration comprise entre 0,01% et 2% p/p.
10. Méthode de traitement cosmétique des peaux sensibles, hyperréactives et/ou intolérantes, caractérisée en ce qu'on applique par voie topique au moins un principe actif susceptible d'être obtenu par extraction à partir de Ginkgo biloba.
11. Méthode selon la revendication 10, caractérisée en ce qu'on applique par voie topique une composition dermocosmétique contenant un extrait de Ginkgo biloba en combinaison avec des excipients dermatologiquement acceptables.
Priority Applications (17)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
FR9612822A FR2754714B1 (fr) | 1996-10-22 | 1996-10-22 | Nouvelles utilisations d'extraits de ginkgo biloba pour la preparation de compositions pharmaceutiques,et methode de traitement cosmetique mettant en oeuvre un extrait de ginkgo biloba |
DE69713484T DE69713484T2 (de) | 1996-10-22 | 1997-10-21 | Verwendung von ginkgo biloba extrakten zur herstellung von pharmazeutischen zusammenstellungen |
JP10519167A JP2000517345A (ja) | 1996-10-22 | 1997-10-21 | 医薬組成物の調製のためのイチョウ抽出物の使用およびイチョウ抽出物を用いた美容的処置方法 |
EA199800589A EA000974B1 (ru) | 1996-10-22 | 1997-10-21 | Применение экстракта гинкго двудольного для изготовления композиции топического использования, обладающей иммуномодулирующей активностью, и способ косметического ухода за сверхчувствительной кожей с его использованием |
CA002240997A CA2240997A1 (fr) | 1996-10-22 | 1997-10-21 | Utilisation d'extraits de ginkgo biloba dans la preparation de compositions pharmaceutiques, et procede de traitement cosmetique utilisant un extrait de ginkgo biloba |
AT97943121T ATE219371T1 (de) | 1996-10-22 | 1997-10-21 | Verwendung von ginkgo biloba extrakten zur herstellung von pharmazeutischen zusammenstellungen |
BR9706889-6A BR9706889A (pt) | 1996-10-22 | 1997-10-21 | Uso de extratos de ginkgo biloba para a preparação de composições farmacêuticas e processo de tratamento cosmético usando um extrato de ginkgo biloba |
AU44704/97A AU743822B2 (en) | 1996-10-22 | 1997-10-21 | Use of ginkgo biloba extracts for the preparation of pharmaceutical comp ositions, and method of cosmetic treatment using a ginkgo biloba extract |
ARP970104864A AR010019A1 (es) | 1996-10-22 | 1997-10-21 | Uso de por lo menos un principio activo, capaz de ser obtenido por extraccion de ginkgo biloba para la preparacion de composiciones farmaceuticas,y metodo de tratamiento cosmetico de pieles hiperreactivas. |
CZ981953A CZ195398A3 (cs) | 1996-10-22 | 1997-10-21 | Použití extraktů jinanu dvojlaločného pro přípravu farmaceutických kompozic a způsob kosmetického ošetření za použití extraktu jinanu dvojlaločného |
CN97192462A CN1211925A (zh) | 1996-10-22 | 1997-10-21 | 银杏提取物在药物组合物制备中的应用,以及银杏提取物用作美容性治疗的方法 |
PL97327540A PL327540A1 (en) | 1996-10-22 | 1997-10-21 | Application of ginkogo biloba extracts in production of pharmaceutic composition and cosmetic care method employing a ginkogo biloba extract |
KR1019980704722A KR19990076619A (ko) | 1996-10-22 | 1997-10-21 | 약학조성물을제조하기위하여사용되는은행나무추출물의용도,및은행나무추출물을사용하는화장치료방법 |
EP97943121A EP0877619B1 (fr) | 1996-10-22 | 1997-10-21 | Utilisation d'extraits de ginkgo biloba dans la preparation de compositions pharmaceutiques |
SK873-98A SK87398A3 (en) | 1996-10-22 | 1997-10-21 | Use of ginkgo biloba extracts for the preparation of pharmaceutical compositions, and method of cosmetic treatment using a ginkgo biloba extract |
PCT/IB1997/001319 WO1998017295A1 (fr) | 1996-10-22 | 1997-10-21 | Utilisation d'extraits de ginkgo biloba dans la preparation de compositions pharmaceutiques, et procede de traitement cosmetique utilisant un extrait de ginkgo biloba |
ES97943121T ES2176786T3 (es) | 1996-10-22 | 1997-10-21 | Uso de extractos de ginkgo biloba para la preparacion de composicionesfarmaceuticas. |
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FR9612822A FR2754714B1 (fr) | 1996-10-22 | 1996-10-22 | Nouvelles utilisations d'extraits de ginkgo biloba pour la preparation de compositions pharmaceutiques,et methode de traitement cosmetique mettant en oeuvre un extrait de ginkgo biloba |
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FR2754714B1 FR2754714B1 (fr) | 1999-01-22 |
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ID=9496869
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