FR2754271A1 - Genes codant pour des kappa-carraghenases et leur utilisatio utilisation pour la production d'enzymes de biodegradation des carraghenanes - Google Patents
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Abstract
La présente invention a pour objet des gènes qui codent pour des glycosyle hydrolases, ayant un score HCA avec la kappa-carraghénase d'Alteromonas carrageenovora qui est supérieur ou égal à 75%, sur le domaine s'étendant entre les acides aminés 117 et 262 de la séquence protéique SEQ ID No 2 de ladite kappa-canaghénase.
Description
La présente invention concerne des gènes de glycosyle hydrolases pour la production biotechnologique d'oligosaccharides, notamment d'oligocarraghénanes sulfatés, plus particulièrement d'oligo-kappa-carraghénanes par biodégradation des carraghénanes.
Les galactanes sulfatés des Rhodophycées, tels que les agars et les carraghénanes, représentent les polysaccharides majeurs des Rhodophycées et sont très largement utilisés en tant qu'agents gélifiants ou épaississants dans diverses branches d'activité, notamment l'agro-alimentaire. Environ 6000 tonnes d'agars et 22000tonnes de carraghénanes sont extraits annuellement des algues rouges marines à cet effet. Les agars sont commercialement produits par des algues rouges des genres Gelidium et Gracilaria. Les carraghénanes sont quant à eux largement extraits des genres Chondnrs, Gigartina et Eucheuma.
Les carraghénanes sont constitués par la répétition d'unités de Dgalactose alternativement liées par des liaisons ,ss, 1- > 4 et a 1- > 3. Selon le nombre et la position de groupements ester-sulfate sur le dissacharide de répétition de la molécule, on distingue ainsi plusieurs types de carraghénanes à savoir: les kappacarraghénanes qui possèdent un groupement ester-sulfate, les iota-carraghénanes qui possèdent deux groupements ester-sulfate et les lambda-carraghénanes qui possèdent trois groupements ester-sulfate.
Les propriétés physico-chimiques et les utilisations de ces polysaccharides en tant que gélifiants reposent sur leur capacité à établir des transitions conformationnelles pelote-hélice en fonction de l'environnement thermique et ionique [Kloareg et al. Oceanography and Marine Biology - An annual review 26 :259-315(1988)]
Par ailleurs, les carraghénanes sont des analogues structuraux des polysaccharides sulfatés de la matrice extracellulaire animale (héparine, chondroitine, kératane, dermatane) et ils présentent des activités biologiques qui s'apparentent à certaines fonctions de ces glycosaminoglycanes.
Par ailleurs, les carraghénanes sont des analogues structuraux des polysaccharides sulfatés de la matrice extracellulaire animale (héparine, chondroitine, kératane, dermatane) et ils présentent des activités biologiques qui s'apparentent à certaines fonctions de ces glycosaminoglycanes.
En particulier, les carraghénanes sont connus:
(i) - pour leur action sur le système immunitaire en provoquant la sécrétion d'interleukine ou de prostaglandines,
(ii) - pour leur action antivirale sur les virus du sida HIV1, de l'herpès
HSV1 et de l'hépatite A,
(iii) - en tant qu'antagonistes de la fixation des facteurs de croissance des cellules humaine et aussi,
(iv) - pour leur action sur la prolifération des kératinocytes et leur action sur le pouvoir contractile des fibroblastes.
(i) - pour leur action sur le système immunitaire en provoquant la sécrétion d'interleukine ou de prostaglandines,
(ii) - pour leur action antivirale sur les virus du sida HIV1, de l'herpès
HSV1 et de l'hépatite A,
(iii) - en tant qu'antagonistes de la fixation des facteurs de croissance des cellules humaine et aussi,
(iv) - pour leur action sur la prolifération des kératinocytes et leur action sur le pouvoir contractile des fibroblastes.
Par ailleurs, les oligocarraghénanes agissent sur l'adhérence, la division et la synthèse protéique de cultures de cellules humaines, sans doute en tant qu'analogues structuraux de la partie glycosylée des protéines de la matrice extracellulaire. Dans les plantes, les oligocarraghénanes élicitent très significativement des activités enzymatiques marqueurs de la croissance (amylase) ou du métabolisme phénolique de défense (laminarinase, phénylalanineammonium lyase).
Les carraghénanes sont extraits des algues rouges marines par des procédés classiques, tels que l'extraction aqueuse à chaud et les oligocarraghénanes sont obtenus à partir de carraghénanes par hydrolyse chimique ou de préférence par hydrolyse enzymatique.
La production d'oligo-carraghénanes par hydrolyse enzymatique comprend généralement les étapes de:
1)production d'une glycosyle hydrolase par culture d'une bactérie marine;
2) hydrolyse enzymatique du carraghénane par la glycosyle hydrolase ainsi obtenue;
3) fractionnement et purification des oligo-carraghénanes obtenus.
1)production d'une glycosyle hydrolase par culture d'une bactérie marine;
2) hydrolyse enzymatique du carraghénane par la glycosyle hydrolase ainsi obtenue;
3) fractionnement et purification des oligo-carraghénanes obtenus.
Des microorganismes produisant des enzymes capables d'hydrolyser les iota- et kappa-carraghénanes ont été isolées par Bellion et al. en 1982 [Can. J.
Microbiol. 28 : 874-80, (1982)]. Certaines sont spécifiques pour le Ic- ou le Lcarraghénane et d'autres sont capables d'hydrolyser les deux substrats. Un autre groupe de bactéries capables de dégrader les carraghénanes a été caractérisé par
Sarwar et al. en 1983 [J. Gen. Appl. Microbiol. 29: 145-55, (1983)]. Ces bactéries de couleur jaune-orange sont assignées au groupe des bactéries de type Cytophaga et certaines de ces bactéries ont la propriété d'hydrolyser à la fois l'agar et les carraghénanes.
Sarwar et al. en 1983 [J. Gen. Appl. Microbiol. 29: 145-55, (1983)]. Ces bactéries de couleur jaune-orange sont assignées au groupe des bactéries de type Cytophaga et certaines de ces bactéries ont la propriété d'hydrolyser à la fois l'agar et les carraghénanes.
La production d'oligo-carraghénanes pourrait être nettement améliorée si l'on disposait d'enzymes spécifiques et d'outils pour leur obtention par génie génétique.
La Demanderesse a maintenant trouvé de nouveaux gènes de glycosyle hydrolases, qui permettent d'obtenir de manière spécifique des oligo-kappacarraghénanes.
Ainsi, la présente invention concerne des nouveaux gènes qui codent pour des glycosyle hydrolases ayant un score HCA avec la kappa-carraghénase d'Alteromonas carrageenovora qui est supérieur ou égal à 75 %, de préférence supérieur à 80 %, avantageusement supérieur à 85 %, sur le domaine s'étendant entre les acides aminés 117 et 262 de la séquence [SEQ ID N 2] de la kappacarraghénase d'Alteromonas carrageenovora.
En particulier, l'invention concerne la séquence nucléique [SEQ ID N" 3] qui code pour une kappa-carraghénase ayant un score tel que défini cidessus dont la séquence en acides aminés est la séquence [SEQ ID N 4].
Les gènes de glycosyle hydrolases de l'invention sont obtenus par le procédé qui consiste à sélectionner des protéines qui ont un score HCA avec la kappa-carraghénase d'Alteromonas carrageenovora qui est supérieur ou égal à 75 %, de préférence supérieur à 80 %, avantageusement supérieur à 85 %, sur le domaine s'étendant entre les acides aminés 117 et 262 de la séquence [SEQ ID N 2] de la kappa-carraghénase d'Alteromonas carrageenovora et à séquencer les gènes ainsi obtenus selon les techniques classiques bien connues de l'homme du métier.
Enfin, la présente invention concerne l'utilisation des gènes de glycosyle hydrolases ci-dessus pour l'obtention de glycosyle hydrolases par génie génétique, lesquelles sont utiles pour la production biotechnologique d'oligocarraghénanes.
Les glysosyle hydrolases selon l'invention sont donc caractérisées par le score HCA qu'elles possèdent avec un domaine particulier de la séquence en acides aminés de la kappa-carraghénase dAlteromonascarrageenovora.
La méthode HCA de l'anglais "Hydrophobic Cluster Analysis" est une méthode d'analyse des séquences de protéines représentées en structure bidimensionnelle, qui a été décrite par Gaboriaud et al. [FEBS Letters 224 149 155(1987)].
On sait que la structure tridimensionnelle d'une protéine conditionne ses propriétés biologiques, la production d'une protéine active exigeant un repliement correct.
On sait aussi que la structure primaire de protéines varie de façon beaucoup plus importante que les structures d'ordre supérieur et que les protéines peuvent être regroupées en familles montrant des structures secondaires et tertiaires similaires ayant parfois des séquences primaires si divergentes que la parenté de telles protéines entre elles n'est pas évidente. Le code reliant structure primaire et structure secondaire apparaît donc très dégénéré puisque des structures primaires très différentes peuvent aboutir à des structures secondaires et tertiaires similaires [Structure 3, 853-859 (1995) et Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92(1995)].
L'utilisation de la méthode HCA a montré que la répartition, la taille et la forme de ces amas hydrophobes le long des séquences d'acides aminés sont représentatifs du repliement 3D des protéines étudiées.
De plus, Woodcock et al. [Protein. Eng. 5, 629-635, (1992)] ont démontré que les amas hydrophobes définis par le diagramme 2D a-hélicoïdal sont statistiquement centrés sur les structures secondaires régulières (hélices a, brins ss), que le diagramme 2D basé sur l'hélice a porte la plus grande quantité d'information structurale et que la correspondance entre amas hydrophobes et éléments de structure secondaire est de même qualité pour tout type de repliement (tout a, tout ss, cl/ss et a + ss), démontrant ainsi que la méthode HCA peut être utilisée quel que soit le type de protéine.
L. Lemesle-Varloot et al. [Biochimie 72, 555-574, (1990)] ont montré que lorsque deux protéines présentent une distribution similaire des amas hydrophobes sur un domaine d'au moins 50 résidus, leurs structures tridimensionnelles dans ce domaine sont considérées comme superposables et leurs fonctions analogues.
La représentation bidimensionnelle utilisée dans la méthode HCA est une hélice a où, par traitement informatique, les acides aminés sont disposés à raison de 3,6 résidus par révolution. Afin d'obtenir une image plane facile à lire, l'hélice est coupée dans le sens longitudinal. Enfin, pour obtenir dans leur intégralité les amas hydrophobes qui sont situés sur les bords de l'image, le diagramme est dupliqué. La méthode utilise un code qui ne reconnaît que deux états : l'état hydrophobe et l'état hydrophile.
Les acides aminés reconnus comme étant hydrophobes sont identifiés et regroupés en figures géométriques caractéristiques. L'utilisation de ces deux états permet de s'affranchir de la tolérance que montrent les structures bi- et tridimensionnelles vis-à-vis de la variabilité des séquences primaires. De plus, cette représentation permet d'observer rapidement des interactions sur une courte ou une moyenne distance puisque le premier acide aminé et le second acide aminé voisin d'un résidu donné sont localisés sur un segment de 17 acides aminés. Enfin, aucune "fenêtre" de longueur prédéfinie n'est utilisée, contrairement aux méthodes d'analyses basées sur les structures primaires ou secondaires des protéines.
La caractéristique fondamentale de la représentation en hélice a est que, pour une protéine globulaire donnée ou seulement un domaine de cette protéine, la distribution des résidus hydrophobes sur le diagramme n'est pas aléatoire. Les résidus hydrophobes (VlLFWMY) forment des amas de géométrie et de taille variées. Sur le diagramme, les faces hydrophiles et hydrophobes des hélices amphiphiles sont très reconnaissables. Ainsi, un amas en diamant horizontal correspond à la face hydrophobe d'une hélice a, les hélices internes apparaissent comme de grands amas hydrophobes horizontaux et les brins ss comme des amas hydrophobes assez courts et verticaux. La méthode permet d'identifier les résidus hydrophobes formant le coeur des protéines globulaires et de localiser les éléments de structure secondaire que sont les hélices a et les brins ss, indépendamment de toute connaissance de la structure secondaire de la protéine étudiée.
Le score HCA entre deux protéines se calcule de la façon suivante:
pour chaque amas:
score HCA = 2CRJ(RC1 + RC2) x 100 %
où
- RC1 et RC2 représentent respectivement le nombre de résidus hydrophobes dans l'amas de la protéine 1 (amas 1) et l'amas de la protéine 2 (amas 2).
pour chaque amas:
score HCA = 2CRJ(RC1 + RC2) x 100 %
où
- RC1 et RC2 représentent respectivement le nombre de résidus hydrophobes dans l'amas de la protéine 1 (amas 1) et l'amas de la protéine 2 (amas 2).
- CR représente le nombre de résidus hydrophobes dans l'amas 1 qui sont en correspondance avec les résidus hydrophobes dans l'amas 2.
La valeur moyenne obtenue pour l'ensemble des amas le long des séquences protéiques comparées donne le score final HCA.
Sur les profils HCA, les acides aminés sont représentés par leur code standard à une seule lettre à l'exception de la proline (P), la glycine (G), la sérine (S), la thréonine (T).
En effet, du fait de leurs propriétés particulières, ces résidus sont représentés par les symboles spéciaux indiqués ci-après afin de faciliter leur identification visuelle sur les diagrammes HCA (voir liste des abbréviations).
La proline introduit de fortes contraintes dans la chaîne polypeptidique et est considérée de manière systématique comme une interruption dans les amas.
En effet, les résidus proline stoppent ou déforment les hélices et les feuillets. La glycine possède une flexibilité conformationnelle très importante en raison de l'absence de chaîne latérale dans cet acide aminé. La sérine et la thréonine sont normalement hydrophiles, mais on peut aussi les rencontrer dans des environnements hydrophobes, tels que les hélices Q, dans lesquels leur groupe hydroxyle perd leur caractère hydrophile du fait de la liaison hydrogène formée avec le groupe carbonyle de la chaîne principale. Au sein des feuillets ss hydrophobes, la thréonine est susceptible de remplacer parfois des résidus hydrophobes, grâce au groupe méthyle de sa chaîne latérale.
On peut distinguer quatre groupes d'acides aminés selon leur hydrophobicité:
(i) - les résidus fortement hydrophobes : V, I, L et F,
(ii) - les résidus moyennement hydrophobes : W, M et Y,
W W apparait à des sites de surface plus souvent que F,
M M est rencontré à des sites divers, internes ou non;
Y Y peut s'accommoder des environnements hydrophobes internes et est souvent trouvé dans des boucles;
(iii) - les résidus peu hydrophobes : A et C sont quasiment insensibles au caractère hydrophobe de leur environnement;
(iv) - les résidus hydrophiles : D, E, N, Q, H, K et R.
(i) - les résidus fortement hydrophobes : V, I, L et F,
(ii) - les résidus moyennement hydrophobes : W, M et Y,
W W apparait à des sites de surface plus souvent que F,
M M est rencontré à des sites divers, internes ou non;
Y Y peut s'accommoder des environnements hydrophobes internes et est souvent trouvé dans des boucles;
(iii) - les résidus peu hydrophobes : A et C sont quasiment insensibles au caractère hydrophobe de leur environnement;
(iv) - les résidus hydrophiles : D, E, N, Q, H, K et R.
Grâce à cette méthode HCA, la Demanderesse a trouvé que des protéines qui ont un score HCA avec la kappa-carraghénase d'Alteromonas carrageenovora supérieur ou égal à 75 % sur le domaine s'étendant entre les acides aminés 117 et 262 de ladite kappa-carraghénase sont des enzymes de type glycosyle hydrolase, et plus particulièrement des kappa-carraghénases appropriées pour la production d'oligo-kappa-carraghénanes à partir de carraghénanes.
Les protéines qui ont un score HCA supérieur ou égal à 80 %, de préférence supérieur ou égal à 85 %, avec le domaine 117-262 ci-dessus, sont particulièrement préférés aux fins de l'invention.
Les protéines ci-dessus sont avantageusement extraites de bactéries marines.
Un exemple particulier de glycosyle hydrolase obtenue avec un gène selon l'invention est la protéine ayant la séquence en acides aminés [SEQ ID n 2] extraite d'Alteromonas carrageenovora.
Un autre exemple particulier de glycosyle hydrolase obtenue avec un gène selon l'invention est la protéine ayant la séquence en acides aminés [SEQ ID n 4] extraite de Cytophaga drobachiensis.
Comme indiqué précédemment, les gènes codant pour les glycosyle hydrolases selon l'invention peuvent être obtenus par séquençage du patrimoine génétique des bactéries qui produisent les glycosyle hydrolases, telles que définies ci-dessus, selon les méthodes classiques bien connues de l'homme du métier.
L'invention concerne également les vecteurs d'expression qui portent, avec les moyens pour leur expression, les séquences nucléiques selon l'invention.
Ces vecteurs d'expression peuvent être utilisés pour transformer des microorganismes procaryotes, en particulier Escherichia coli ou des cellules eucaryotes, telles que des levures ou des champignons.
L'invention va être maintenant décrite plus en détail par l'exemple illustratif et non limitatif ci-après.
Les méthodes utilisées dans ces exemples sont des méthodes, bien connues de l'homme du métier, qui sont décrites en détail dans l'ouvrage de
Sambrook, Fristsch et Maniatis intitulé "Molecular cloning : a laboratory manual" publié en 1989 par les éditions Cold Spring Harbor Press à New-York (2ème édition).
Sambrook, Fristsch et Maniatis intitulé "Molecular cloning : a laboratory manual" publié en 1989 par les éditions Cold Spring Harbor Press à New-York (2ème édition).
La description ci-après sera mieux comprise à l'aide des figures 1 et 2 qui représentent respectivement:
Fig. 1: L'alignement d'après la similitude maximale selon la méthode de
Needleman et Wunsch 1970, J. Mol. Biol. 48, 443-453 de la séquence en acides aminés de la kappa-carraghénase d'Alteromonas carrageenovora (partie supérieure) et de Cytophaga drobachiensis (partie inférieure).
Fig. 1: L'alignement d'après la similitude maximale selon la méthode de
Needleman et Wunsch 1970, J. Mol. Biol. 48, 443-453 de la séquence en acides aminés de la kappa-carraghénase d'Alteromonas carrageenovora (partie supérieure) et de Cytophaga drobachiensis (partie inférieure).
Fig. 2: Les profils HCA des séquences en acides aminés des kappacarraghénases de Cytophaga drobachiensis et d'Alteromonasfortis.
Les abréviations ou symboles spéciaux utilisés dans les exemples ci-après pour les acides aminés sont les suivants:
Glycine:
Glycine:
Proline: *
Thréonine:
Thréonine:
Sérine:
Alanine : A
Valine : V
Leucine : L
Isoleucine: I
Méthionine: M
Phénylalanine: F
Tryptophane: W
Cystéine: C
Asparagine : N
Glutamine: Q
Tyrosine: Y Aspartate : D
Glutamate:E Lysine:K
Arginine: R
Histidine : H EXEMPLE:
Les kappa-carraghénases d'Alferomonas carrageenovora et de Cytophaga drobachiensis
SECTION 1: Clonage des gènes des kappa-carraghénases
Alteromonas carrageenovora ATCC 43555 a été obtenue auprès de l'American Type Culture Collection. Les souches A. carrageenovora et
C. drobachiensis ont été cultivées sur un milieu de Zobell à 250C.
Valine : V
Leucine : L
Isoleucine: I
Méthionine: M
Phénylalanine: F
Tryptophane: W
Cystéine: C
Asparagine : N
Glutamine: Q
Tyrosine: Y Aspartate : D
Glutamate:E Lysine:K
Arginine: R
Histidine : H EXEMPLE:
Les kappa-carraghénases d'Alferomonas carrageenovora et de Cytophaga drobachiensis
SECTION 1: Clonage des gènes des kappa-carraghénases
Alteromonas carrageenovora ATCC 43555 a été obtenue auprès de l'American Type Culture Collection. Les souches A. carrageenovora et
C. drobachiensis ont été cultivées sur un milieu de Zobell à 250C.
On a constitué des banques génomiques d'ADN de C. drobachiensis et d'A. carrageenovora.
La souche utilisée pour réaliser ces banques, qui est Escherichia coli DH5Q (Rec A, endAl, gyrA96, thil, hsdR17 [rk- mk+], supE44, relA1, lacZM15) a été cultivée sur milieu de Luria-Bertani (milieu LB) à 37iC ou sur un milieu appelé Zd (Bacto tryptone 5 g/l, extrait de levure 1 g/l, NaCl 10 g/l pH = 7,2) à 22 C auquel on a ajouté 2 % de ic-carraghénane.
Les milieux de culture gélosés ou non ont été additionnés d'ampicilline (50,ugZml) ou de tétracycline (15 g/ml), à partir de solutions stock préparées dans 50 % d'éthanol (pour éviter la prise en masse à la température de stockage, - 20 C) sauf pour la souche DH5Q non recombinante.
Le vecteur d'expression utilisé est le plasmide pAT153 décrit dans
Nature 283 : 216 (1980). Ce plasmide contient deux gènes de résistance aux antibiotiques : un gène de résistance à la tétracycline et un gène qui code pour une B-lactamase, enzyme de la membrane cytoplasmique qui dégrade l'ampicilline.
Nature 283 : 216 (1980). Ce plasmide contient deux gènes de résistance aux antibiotiques : un gène de résistance à la tétracycline et un gène qui code pour une B-lactamase, enzyme de la membrane cytoplasmique qui dégrade l'ampicilline.
L'ADN total de C drobachiensis et l'ADN total de A. carrageenovora ont été préparés selon le mode décrit par Barbeyron et al. [J. Bacteriol. 160. 586 590(1984)].
Les ADN génomiques de C. drobachiensis et A. carrageenovora ont été coupés avec les endonucléases de restriction, respectivement NdeII et Sau3AI.
En effet, dans le cas de C. drobachiensis, l'endonucléase de restriction Ndell a été utilisée de façon préférentielle du fait que l'ADN de cette bactérie est méthylé sur le résidu C de la séquence GATC.
Les fragments purifiés d'ADN de 5 000 à 10 000 pb ont été clonés sur le site BamHI du plasmide pAT153, qui coupe le gène de résistance à la tétracycline.
1. Clonage à partir d'Akemmonas carrageenovora
L'obtention de ce gène est décrite en détail par T. Barbeyron dans la Thèse de Doctorat de l'Université Pierre et Marie Curie, Roscoff, soutenue le 28 octobre 1993 et dans Gene 139, 105-109 (1994).
L'obtention de ce gène est décrite en détail par T. Barbeyron dans la Thèse de Doctorat de l'Université Pierre et Marie Curie, Roscoff, soutenue le 28 octobre 1993 et dans Gene 139, 105-109 (1994).
A partir de la banque génomique d'Alteromonas carrageenova, 4 clones d'E. coli appelés K1 à K4 ont été capables d'hydrolyser le kappacarraghénane.
Les plasmides pKA1 à pKA4 ont été purifiés à partir des quatre clones indépendants et cartographiés à l'aide des endonucléases de restriction BamHI,
DraI, EcoRi, Hindm, Glui, PstI, Pull, SalI, SspI, XbaI etMoI.
DraI, EcoRi, Hindm, Glui, PstI, Pull, SalI, SspI, XbaI etMoI.
Dans chaque plasmide, on a remarqué la présence d'un fragment DraI Hindmde 2,2 kb.
Ce fragment commun, qui est l'insert entier du plasmide pKA3, a été entièrement séquencé à partir du plasmide pKA3.
2. Clonage à partir de Cytophaga drobachiensis
A partir de la banque génomique de C. drobachiensis, cinq clones de
E. coli appelés pKC1 à pKC5 ont été capables de creuser un trou dans le substrat.
A partir de la banque génomique de C. drobachiensis, cinq clones de
E. coli appelés pKC1 à pKC5 ont été capables de creuser un trou dans le substrat.
les plasmides isolés et purifiés à partir desdits clones ont été cartographiés avec des endonucléases de restriction.
Des fragments internes de 1 100 pb et 600 pb, respectivement ont été sous-clonés à partir de pKC1 dans le phagemide pbluescript et ont été appelés pKCE11 et pKCN6.
Les plasmides pKC1, pKCE11 et pKCN6 ont été utilisés pour déterminer la séquence nucléotique du gène de la kappa-carraghénase.
SECTION 2: Détermination des séquences des gènes codant
pour les kappa-carraghénases d'A eromonas carrageenovora et de
Cytophaga drobachiensis
1. Séquence du gène d'Alteromonas carrageenovora
Le nombre de nucléotides de l'insert de pKA3, est de 2180 pb. La traduction dans les six cadres de lecture révèle la présence de trois phases ouvertes, dont une seule est complète, séparant les deux autres qui ne sont que partielles.
pour les kappa-carraghénases d'A eromonas carrageenovora et de
Cytophaga drobachiensis
1. Séquence du gène d'Alteromonas carrageenovora
Le nombre de nucléotides de l'insert de pKA3, est de 2180 pb. La traduction dans les six cadres de lecture révèle la présence de trois phases ouvertes, dont une seule est complète, séparant les deux autres qui ne sont que partielles.
Elles sont toutes les trois localisées sur le même brin d'ADN. La seconde phase ouverte appelée cgk4, lue dans le troisième cadre de lecture, contient 1 191 pb [SEQ ID N'1].
le produit de traduction du gène cgk4 correspond à une protéine de 397 acides aminés pour une masse moléculaire théorique de 44212 Da (SEQ ID N 2). Le profil hydropathique de cette protéine montre à l'extrémité N-terminale un domaine hautement hydrophobe qui s'étend sur 25 acides aminés. Ce domaine comprend un acide aminé chargé positivement (Lys), suivi d'un segment riche en acides aminés hydrophobes, puis de trois acides aminés polaires. Ces résultats suggèrent qu'il s'agit là d'un peptide signal. La séquence N-terminale de la protéine purifiée à partir du surnageant de culture a été déterminée, confirmant ainsi l'identité du gène. Ces résultats indiquent que la signal peptidase coupe la protéine entre les résidus 25 et 26, en accord avec la règle (-3, -1) de Von Heijne.
La protéine mature a donc une masse moléculaire théorique de 41,6 kDa.
2. Séquence du gène de Cytophaga drobachiensis
L'insert de pKC1 de 4425 pb contient un seul cadre ouvert de lecture de 1 635 pb appelé cgk4 (SEQ ID N3).
L'insert de pKC1 de 4425 pb contient un seul cadre ouvert de lecture de 1 635 pb appelé cgk4 (SEQ ID N3).
La protéine traduite à partir du gène de la kappa-carraghénase est une protéine comprenant 545 acides aminés avec une masse moléculaire de 61,466 kDa [SEQ ID N4]
Le profil hydropathique de cette protéine montre à l'extrémité N terminale un domaine hautement hydrophobe, suggérant qu'il s'agit là d'un peptide signal.
Le profil hydropathique de cette protéine montre à l'extrémité N terminale un domaine hautement hydrophobe, suggérant qu'il s'agit là d'un peptide signal.
En accord avec la règle (-3, -1) de Von Heijne, le site de clivage de la signal peptidase doit se situer entre la thréonine et la sérine aux positions respectives 35 et 36, avec comme codon initiateur le codon ATG875.
La masse moléculaire de la protéine calculée après retrait du peptide signal est de 57,4 kDa, supérieure à la masse moléculaire déterminée pour la K carraghénase purifiée extracellulaire de 40,0 kDa.
SECTION 3: Comparaison des séquences protéiques des K
carraghénases d'Alteromonas carrageenovora et de Cytophaga
drobachiensis
La K-carraghénase de C. drobachiensis est similaire à 36,1 % sur l'ensemble de l'alignement en séquences linéaires avec la K-carraghénase d'Alteromonas carrageenovora.
carraghénases d'Alteromonas carrageenovora et de Cytophaga
drobachiensis
La K-carraghénase de C. drobachiensis est similaire à 36,1 % sur l'ensemble de l'alignement en séquences linéaires avec la K-carraghénase d'Alteromonas carrageenovora.
Cette similitude est particulièrement forte entre les acides aminés 117 et 262 (51,8 %) (numérotation de la K-carraghénase d'Alteromonas carrageenovora) (Fig. 1).
Cette similitude est soulignée comme précédemment par analyse HCA qui montre un score HCA entre les deux protéines de 75,4 % sur ledit domaine de 145 acides aminés (Fig. 2).
L'analyse HCA montre également que ces deux protéines appartiennent à la famille 16 des glycosyle hydrolases qui comprend des endoxyglucane transférases (xi), des laminarinases, des lichénases et des agarases. En effet, le score HCA des deux kappa-carraghénases avec les XET est de 67,5 %, de 67,6 % avec les laminarinases, de 73,7 % avec les lichénases et de 71,5 % avec les agarases.
LISTE DE SEQUENCES (1) INFORMATIONS GENERALES:
(i) DEPOSANT:
(A) NOM: LABORATOIRES GOEMAR S.A.
(i) DEPOSANT:
(A) NOM: LABORATOIRES GOEMAR S.A.
(B) RUE: La Madeleine B.P. 55
(C) VILLE: Saint-Malo
(E) PAYS: France
(F) CODE POSTAL: 35413 Cedex
(G) TELEPHONE: 99 21 53 70
(H) TELECOPIE: 99 82 56 17
(ii) TITRE DE L' INVENTION: Gênes de glycolyse hydrolases et leur
utlisation pour la production d'enzymes de
biodégradation des carraghénanes
(iii) NOMBRE DE SEQUENCES: 4
(iv) FORME DECHIFFRABLE PAR ORDINATEUR:
(A) TYPE DE SUPPORT: Floppy disk
(B) ORDINATEUR: IBM PC compatible
(C) SYSTEME D' EXPLOITATION: PC-DOS/MS-DOS
(D) LOGICIEL: PatentIn Release #1.0, Version #1.30 (OEB) (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 1:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 2180 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (génomique)
(iii) HYPOTHETIQUE: NON
(ix) CARACTERISTIQUE:
(A) NOM/CLE: CDS
(B) EMPLACEMENT:join(1..498, 741..1940, 2009..2179)
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 1:
GAT CAT ATC ATT CCT TTG CAA ATT AAA AAT TCT CAA GAT AGT CAA ATA 48
Asp His Ile Ile Pro Leu Gln Ile Lys Asn Ser Gln Asp Ser Gln Ile
1 5 10 15
ATT AGT TTT TTT AAA GCT GAC AAA GGG AGT GTG AGC AGG CAA GTA CAC 96
Ile Ser Phe Phe Lys Ala Asp Lys Gly Ser Val Ser Arg Gln Val His
20 25 30
CCA CCT TGG CCT GTG CCT TGT AAA AGT AAA CTG CAA GAG CAA GAT AGT 144
Pro Pro Trp Pro Val Pro Cys Lys Ser Lys Leu Gln Glu Gln Asp Ser
35 40 45
AGT GAG TCT AAA GAG AGT AAG GCA GAG CAA GTT AAA ATT AAC AAC TGC 192
Ser Glu Ser Lys Glu Ser Lys Ala Glu Gln Val Lys Ile Asn Asn Cys
50 55 60
GTT GTA CAG AAC GCA ATG CTG TAC ATA GAA AAC AAT TAT TTC AAC GAT 240
Val Val Gln Asn Ala Met Leu Tyr Ile Glu Asn Asn Tyr Phe Asn Asp
65 70 75 80
ATA AAT ATA GAC ACG GTT GCT TTT TCT GTT GGC GTA AGT CGC TCT TAT 288
Ile Asn Ile Asp Thr Val Ala Phe Ser Val Gly Val Ser Arg Ser Tyr
85 90 95
CTC GTT AAA CAA TTT AAG TTA GCA ACG AAT AAA ACG ATT AAT AAT AGA 336
Leu Val Lys Gln Phe Lys Leu Ala Thr Asn Lys Thr Ile Asn Asn Arg
100 105 110
ATC ATA GAA GTA AGA ATA GAG CAG GCT AAA AAA GTA TTA CTA AAA AAA 384
Ile Ile Glu Val Arg Ile Glu Gln Ala Lys Lys Val Leu Leu Lys Lys
115 120 125
TCT GTT ACA GAA ACA GCT TAT GAA GTT GGT TTT AAT AAC TCA AAC TAC 432
Ser Val Thr Glu Thr Ala Tyr Glu Val Gly Phe Asn Asn Ser Asn Tyr
130 135 140
TTC GCG ACA GTT TTT AAA AAA AGA ACA AAC TAC ACG CCC AAG CAA TTT 480
Phe Ala Thr Val Phe Lys Lys Arg Thr Asn Tyr Thr Pro Lys Gln Phe 145 150 155 160
AAA CGT ACT TTT TCC AGC TAAAACTACA ACTAAATAAC GATTAAAAGC 528
Lys Arg Thr Phe Ser Ser
165
CATTTTTAGA GAACAGTAAA ACCATTTTTT GAGGTTTGGT GTTGTATATA AATATTAAAT 588
ATCCCCACTC GCTCAGC m TTTTGTGCGA GTTGTGAGAA TTAGCTTAAC AGGTAAGGTT 648
TACGTATCTG TATATCTAAA CTCTTCGAAT ATAACACTGT ATCTGTTGCT GAGCTGTGGC 708
TCAGTTCACA CTAACAAAGG ATGGATAAAT AA ATG AAA CCT ATA AGT ATT GTG 761
Met Lys Pro Ile Ser île Val
170
GCA TTC CCT ATA CCA GCT ATA AGT ATG CTT CTT TTA AGT GCA GTA TCA 809
Ala Phe Pro Ile Pro Ala Ile Ser Met Leu Leu Leu Ser Ala Val Ser
175 180 185
CAA GCA GCA TCT ATG CAA CCT CCC ATC GCA AAA CCT GGT GAA ACA TGG 857 Gln Ala Ala Ser Met Gln Pro Pro Ile Ala Lys Pro Gly Glu Thr Trp lgo 195 200 205
ATT TTA CAA GCC AAA CGC TCT GAC GAA TTT AAC GTA AAA GAT GCG ACA 905
Ile Leu Gln Ala Lys Arg Ser Asp Glu Phe Asn Val Lys Asp Ala Thr
210 215 220
AAG TGG AAC TTT CAA ACA GAA AAC TAT GGG GTA TGG TCT TGG AAA AAT 953
Lys Trp Asn Phe Gln Thr Glu Asn Tyr Gly Val Trp Ser Trp Lys Asn
225 230 235
GAA AAT GCG ACA GTA TCT AAT GGC AAA CTA AAA TTA ACC ACT AAG CGA 1001
Glu Asn Ala Thr Val Ser Asn Gly Lys Leu Lys Leu Thr Thr Lys Arg
240 245 250
GAA TCT CAT CAA CGT ACA TTC TGG GAT GGC TGT AAT CAG CAG CAA GTT 1049
Glu Ser His Gln Arg Thr Phe Trp Asp Gly Cys Asn Gln Gln Gln Val
255 260 265
GCA AAT TAC CCA CTT TAT TAT ACA TCG GGT GTC GCT AAA TCC AGA GCT 1097 Ala Asn Tyr Pro
GAA CTT ACT CAA AAA AGT GCA GTG AGA GAG TCT GAT CAT GAC TTA CAC 1289
Glu Leu Thr Gln Lys Ser Ala Val Arg Glu Ser Asp His Asp Leu His
335 340 345
AAT ATT GTA GTA AAA AAT GGA AAA CCA ACA TGG ATG CGT CCA GGG TCT 1337
Asn Ile Val Val Lys Asn Gly Lys Pro Thr Trp Met Arg Pro Gly Ser 350 355 360 365
TTT CCG CAG ACA AAT CAT AAC GGA TAC CAT CTA CCT TTC GAT CCT CGA 1385
Phe Pro Gln Thr Asn His Asn Gly Tyr His Leu Pro Phe Asp Pro Arg
370 375 380
AAT GAC TTT CAC ACC TAT GGT GTC AAT GTA ACT AAA GAC AAG ATC ACT 1433
Asn Asp Phe His Thr Tyr Gly Val Asn Val Thr Lys Asp Lys Ile Thr
385 390 395
TGG TAC GTA GAT GGT GAA ATT GTG GGC GAA AAG GAT AAC TTA TAC TGG 1481
Trp Tyr Val Asp Gly Glu Ile Val Gly Glu Lys Asp Asn Leu Tyr Trp
400 405 410
CAT CGT CAA ATG AAT CTC ACA TTA TCA CAA GGC TTA CGC GCG CCG CAT 1529
His Arg Gln Met Asn Leu Thr Leu Ser Gln Gly Leu Arg Ala Pro His
415 420 425
ACA CAA TGG AAA TGT AAT CAA TTT TAC CCA TCA GCG AAT AAA TCA GCA 1577
Thr Gln Trp Lys Cys Asn Gln Phe Tyr Pro Ser Ala Asn Lys Ser Ala 430 435 440 445
GAA GGC TTC CCA ACA TCA ATG GAA GTT GAT TAT GTA AGA ACG TGG GTA 1625
Glu Gly Phe Pro Thr Ser Met Glu Val Asp Tyr Val Arg Thr Trp Val
450 455 460
AAG GTG GGC AAT AAC AAC TCT GCT CCA GGC GAG GGG CAG TCA TGT CCT 1673
Lys Val Gly Asn Asn Asn Ser Ala Pro Gly Glu Gly Gln Ser Cys Pro
465 470 475
AAC ACG TTT GTA GCT GTC AAT AGT GTT CAA CTA AGC GCA GCA AAA CAA 1721
Asn Thr Phe Val Ala Val Asn Ser Val Gln Leu Ser Ala Ala Lys Gln
480 485 490
ACA CTT CGA AAG GGC CAA TCT ACA ACG CTA GAA AGC ACA GTT CTT CCA 1769
Thr Leu Arg Lys Gly Gln Ser Thr Thr Leu Glu Ser Thr Val Leu Pro
495 500 505
AAC TGT GCA ACC AAC AAG AAA GTC ATT TAT TCA TCA AGC AAT AAA AAT 1817
Asn Cys Ala Thr Asn Lys Lys Val Ile Tyr Ser Ser Ser Asn Lys Asn 510 515 520 525
GTG GCA ACT GTG AAC AGT GCT GGC GTT GTA AAA GCT AAA AAT AAA GGC 1865 Val Ala E r Val Asn Ser Ala Gly Val Val Lys Ala Lys Asn Lys Gly
530 535 540
ACT GCG ACG ATT ACG GTT AAA ACT AAA AAC AAA GGG AAA ATA GAT AAA 1913 Tnr Ala Thr île Thr Val Lys Thr Lys Asn Lys Gly Lys Ile Asp Lys
545 550 555
TTA ACC ATT GCG GTG AAT TAAGCTAACT CAAACTAGCC TCGAAGGATT 1961
Leu Thr Ile Ala Val Asn
560 GAGGCACTTT ATTTATAGGT CTCAGGCTTC GACTITITGG AGGGGGT ATG AAA AAG 2017
Met Lys Lys
565
GTA AAT TTA TCC AGC AAG TGG ATA ATT AGC ATT AGT TTA CTA ATC ATT 2065
Val Asn Leu Ser Ser Lys Trp île île Ser Ile Ser Leu Leu Ile Ile
570 575 580
TGT GAT TAT GTT TAT TTA ATA CGA ACA AAC GTT AAC GAG CAA GCT AAC 2113
Cys Asp Tyr Val Tyr Leu Ile Arg Thr Asn Val Asn Glu Gln Ala Asn
585 590 595
GCA GAA GCT ACT GCA CAT ATG CAT TAC AAA ATA AAT AAT ACG AAA CAC 2161 Ala Glu Ala E r Ala His Met His Tyr Lys Ile Asn Asn Thr Lys His
600 605 610
TCA AAA GGA AAG CTT GAT C 2180
Ser Lys Gly Lys Leu Asp 615 620 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 2:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 620 acides aminés
(B) TYPE: acide aminé
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: protéine
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 2:
Asp His Ile Ile Pro Leu Gln Ile Lys Asn Ser Gln Asp Ser Gln Ile
1 5 10 15
Ile Ser Phe Phe Lys Ala Asp Lys Gly Ser Val Ser Arg Gln Val His
20 25 30
Pro Pro Trp Pro Val Pro Cys Lys Ser Lys Leu Gln Glu Gln Asp Ser
35 40 45
Ser Glu Ser Lys Glu Ser Lys Ala Glu Gln Val Lys Ile Asn Asn Cys
50 55 60
Val Val Gln Asn Ala Met Leu Tyr Ile Glu Asn Asn Tyr Phe Asn Asp
65 70 75 80
Ile Asn île Asp Thr Val Ala Phe Ser Val Gly Val Ser Arg Ser Tyr
85 90 95
Leu Val Lys Gln Phe Lys Leu Ala Thr Asn Lys Thr Ile Asn Asn Arg
100 105 110
Ile Ile Glu Val Arg Ile Glu Gîn Ala Lys Lys Val Leu Leu Lys Lys
115 120 125
Ser Val Thr Glu Thr Ala Tyr Glu Val Gly Phe Asn Asn Ser Asn Tyr
130 135 140
Phe Ala Thr Val Phe Lys Lys Arg Thr Asn Tyr Thr Pro Lys Gln Phe 145 150 155 160
Lys Arg Thr Phe Ser Ser Met Lys Pro Ile Ser Ile Val Ala Phe Pro
165 170 175
Ile Pro Ala Ile Ser Met Leu Leu Leu Ser Ala Val Ser Gln Ala Ala
180 185 190
Ser Met Gln Pro Pro Ile Ala Lys Pro Gly Glu Thr Trp île Leu Gln
195 200 205
Ala Lys Arg Ser Asp Glu Phe Asn Val Lys Asp Ala Thr Lys Trp Asn
210 215 220
Phe Gln Thr Glu Asn Tyr Gly Val Trp Ser Trp Lys Asn Glu Asn Ala 225 230 235 240
Thr Val Ser Asn Gly Lys Leu Lys Leu Thr Thr Lys Arg Glu Ser His
245 250 255 Gln Arg Thr Phe Trp Asp Gly Cys Asn Gln Gln Gln Val Ala Asn Tyr
260 265 270
Pro Leu Tyr Tyr Thr Ser Gly Val Ala Lys Ser Arg Ala Thr Gly Asn
275 280 285
Tyr Gly Tyr Tyr Glu Ala Arg île Lys Gly Ala Ser Thr Phe Pro Gly
290 295 300
Val Ser Pro Ala Phe Trp Met Tyr Ser Thr Ile Asp Arg Ser Leu Thr 305 310 315 320
Lys Glu Gly Asp Val Gln Tyr Ser Glu Ile Asp Val Val Glu Leu Thr
325 330 335 Gln Lys Ser Ala Val Arg Glu Ser Asp His Asp Leu His Asn Ile Val
340 345 350
Val Lys Asn Gly Lys Pro Thr Trp Met Arg Pro Gly Ser Phe Pro Gln
355 360 365
Thr Asn His Asn Gly Tyr His Leu Pro Phe Asp Pro Arg Asn Asp Phe
370 375 380
His Thr Tyr Gly Val Asn Val Thr Lys Asp Lys Ile Thr Trp Tyr Val 385 390 395 400
Asp Gly Glu Ile Val Gly Glu Lys Asp Asn Leu Tyr Trp His Arg Gln
405 410 415
Met Asn Leu Thr Leu Ser Gln Gly Leu Arg Ala Pro His Thr Gln Trp
420 425 430
Lys Cys Asn Gln Phe Tyr Pro Ser Ala Asn Lys Ser Ala Glu Gly Phe
435 440 445
Pro Thr Ser Met Glu Val Asp Tyr Val Arg Thr Trp Val Lys Val Gly
450 455 460
Asn Asn Asn Ser Ala Pro Gly Glu Gly Gln Ser Cys Pro Asn Thr Phe 465 470 475 480
Val Ala Val Asn Ser Val Gln Leu Ser Ala Ala Lys Gln Thr Leu Arg
485 490 495
Lys Gly Gln Ser Thr Thr Leu Glu Ser Thr Val Leu Pro Asn Cys Ala
500 505 510
Thr Asn Lys Lys Val Ile Tyr Ser Ser Ser Asn Lys Asn Val Ala Thr
515 520 525
Val Asn Ser Ala Gly Val Val Lys Ala Lys Asn Lys Gly Thr Ala Thr
530 535 540
Ile Thr Val Lys Thr Lys Asn Lys Gly Lys île Asp Lys Leu Thr Ile 545 550 555 560
Ala Val Asn Met Lys Lys Val Asn Leu Ser Ser Lys Trp Ile Ile Ser
565 570 575
Ile Ser Leu Leu Ile Ile Cys Asp Tyr Val Tyr Leu Ile Arg Thr Asn
580 585 590
Val Asn Glu Gln Ala Asn Ala Glu Ala Thr Ala His Met His Tyr Lys
595 600 605
Ile Asn Asn Thr Lys His Ser Lys Gly Lys Leu Asp
610 615 620 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 3:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 2600 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (génomique)
(iii) HYPOTHETIQUE: NON
(ix) CARACTERISTIQUE:
(A) NOM/CLE: CDS
(B) EMPLACEMENT:875. .2509
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 3:
GCCTCCGTAT TCGACAATGT TGTACGATGC TTGGCGATTC GGACTCTGTT TAAGCACTCG 60
ATTTCGTAAA GGCACTATCC ACTCATTCAT TCCGACTCAA TATTCTTTTC GACAAATGCA 120
ACCGGTTCCA TTGAAAAGGC CCTAAAAATA CAGCTTTCCC GCCCCCCATC GTAGAAGGTT 180
CCAATATGCT TCAACCCCTT TTTCAGCCTT ACTTCAGGGG TATTACTTTC ATGCCTAGGG 240
CCGCAAATAC ATTCGCTTGG ACCCAGTCAC CTATATAATT GAATACGGAA CTACCCATGG 300
CTTCCTTCCC TTTGGGMCC TATGGTACAG ACTTGCCTTT TTTMACCGG TTACTTCAGC 360
TAATTCGCCA AGCTGGTTCC TTCATAACCT TTGGCCCGAA ACACCTTGCA AGCACATAAA 420 TCTTATCCAA TATTTTGCGG TCTCATGGGA CAMTCTATA ACAAACATTC MTTTTACCA 480
MCGTTCGGT AATAAATCTA GTCMMACG GGGTCCGATT CATTTTAGM GAAAGGTAAA 540
GCCCCCAAA GAGCGGTTTA CTTGAAGATA TGATTTATM MCACAATM GTGACAAAGG 600
MGATCATGG CTATMTTAG TTGAAAAAAC AGGGCTTACC ATGACATGGA GCTTTATTGA 660
AAACAGATGT CCAACAAGAA TAAAGGAGGG CCGTTCGACC GCGACGTTTA MTAAAAACA 720
TATTCCATAT CAAAATTTAA TTMGGTTCT TTCCTACAGT ATTTATAAGA AATTACTAAA 780
ATTAGTTAGG ATAATACTAC AAAATGGTAA MTTGGATTA CTCAGATTGA ACCATAGCCT 840
CTACTTTAGT CGGCTMCAA AAACAATTAT AGTA ATG MA AM CCA MT TTT 892
Met Lys Lys Pro Asn Phe
1 5
TAT GGC MG ATG GGT AGA ACT GCA CTT TCA AGT CTT TTC TAC CTC TTT 940
Tyr Gly Lys Met Gly Arg Thr Ala Leu Ser Ser Leu Phe Tyr Leu Phe
10 15 20
TTC CTA GGC CTT GTG TAT GGG CM CM CCT ACG AAG ACT TCA MT CCG 988
Phe Leu Gly Leu Val Tyr Gly Gln Gln Pro Thr Lys Thr Ser Asn Pro
25 30 35
AAC GAT CAG TGG ACC ATC AM TGG AGT GCT TCG GAC GM TTC MC MA 1036
Asn Asp Gln Trp Thr Ile Lys Trp Ser Ala Ser Asp Glu Phe Asn Lys
40 45 50
AAT GAC CCC GAC TGG GCA MA TGG ATC MG ACA GGA AAC CTT CCG AAT 1084
Asn Asp Pro Asp Trp Ala Lys Trp île Lys Thr Gly Asn Leu Pro Asn
55 60 65 70
ACA TCG GCA TGG MA TGG AAC AAT CAA AAA MC GTA AAG ATT TCC AAC 1132
Thr Ser Ala Trp Lys Trp Asn Asn Gln Lys Asn Val Lys Ile Ser Asn
75 80 85
GGA ATT GCG GAA CTA ACG ATG AGG CAT AAC GCC AAT AAT ACC CCA CCT 1180
Gly Ile Ala Glu Leu Thr Met Arg His Asn Ala Asn Asn Thr Pro Pro
90 95 100
GAC GGA GGA ACC TAT TTC ACC TCT GGG ATA TTT AAG TCG TAC CAA AAA 1228
Asp Gly Gly Thr Tyr Phe Thr Ser Gly Ile Phe Lys Ser Tyr Gln Lys
105 110 115
TTT ACG TAT GGA TAC TTT GAG GCC MA ATC CAA GGA GCG GAT ATA GGT 1276
Phe Thr Tyr Gly Tyr Phe Glu Ala Lys Ile Gln Gly Ala Asp île Gly
120 125 130 OAA GGC GTA TGC CCA TCG TTT TGG CTT TAT AGT GAT TTC GAC TAT TCC 1324
Glu Gly Val Cys Pro Ser Phe Trp Leu Tyr Ser Asp Phe Asp Tyr Ser 135 140 145 150
GTA GCC AAT GGG GAA ACG GTA TAC AGT OAA ATA GAT GTA GTT GAA CTA 1372
Val Ala Asn Gly Glu Thr Val Tyr Ser Glu Ile Asp Val Val Glu Leu
155 160 165
CAA CAA TTC GAT TGG TAT OAA GGC CAT CAG GAC GAC ATT TAC GAC ATG 1420 Gln Gln Phe Asp Trp Tyr Glu Gly His Gln Asp Asp Ile Tyr Asp Met
170 175 180
GAC TTA AAT CTA CAC GCC GTT GTC MA GAA AAC GGA CAG GGG GTT TGG 1468
Asp Leu Asn Leu His Ala Val Val Lys Glu Asn Gly Gln Gly Val Trp
185 lgo 195
MA AGG CCA MA ATG TAC CCT CAA OAA CAG TTG AAC MA TGG AGA GCC 1516
Lys Arg Pro Lys Met Tyr Pro Gln Glu Gln Leu Asn Lys Trp Arg Ala
200 205 210
ATG GAC CCG AGT MA GAC TTT CAT ATC TAT GGT TGT GAA GTG AAC CAG 1564
Met Asp Pro Ser Lys Asp Phe His Ile Tyr Gly Cys Glu Val Asn Gln 215 220 225 230
AAC OAA ATC ATA TGG TAT GTT GAC GGT GTC GAG GTT GCC CGA MA CCA 1612
Asn Glu île Ile Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val Ala Arg Lys Pro
235 240 245
AAT MA TAT TGG CAT CGC CCC ATG AAC GTT ACC CTT TCA TTG GGA CTC 1660
Asn Lys Tyr Trp His Arg Pro Met Asn Val Thr Leu Ser Leu Gly Leu
250 255 260
AGA MA CCA TTT GTC MA TIT TTC GAC AAT AAG AAC AAT GCC ATA AAT 1708
Arg Lys Pro Phe Val Lys Phe Phe Asp Asn Lys Asn Asn Ala Ile Asn
265 270 275
CCA OAA ACC GAT GCC AAG GCA AGG OAA MA TTA TCG GAT ATA CCT ACA 1756
Pro Glu Thr Asp Ala Lys Ala Arg Glu Lys Leu Ser Asp Ile Pro Thr
280 285 290
TCC ATG TAT GTG GAT TAC GTT CGG GTC TGG OAA MA TCA GCA GGT AAC 1804
Ser Met Tyr Val Asp Tyr Val Arg Val Trp Glu Lys Ser Ala Gly Asn 295 300 305 310
ACT ACC AAT CCC CCA ACC AGC GAG GTC CCC ACA CTA MA ACA AAG GGT 1852
Thr Thr Asn Pro Pro Thr Ser Glu Val Gly Thr Leu Lys Thr Lys Gly
315 320 325
TCG AAA CTG GTG ATT GAC CAT TGG GAT GCA AGT ACA CCC ACT ATT TCG 1900
Ser Lys Leu Val Ile Asp His Trp Asp Ala Ser Thr Gly Thr Ile Ser
330 335 340
GCT GTC AGT AAC AAT ACA AAG ACA GGT CAA TAT GCC GGT TCA GTC AAC 1948
Ala Val Ser Asn Asn Thr Lys Thr Gly Gln Tyr Ala Gly Ser Val Asn
345 350 355
AAC CCC AGC ATC GCC CAG ATA GTA ACA TTA MA CCC AAT ACT TCA TAT 1996
Asn Ala Ser Ile Ala Gln Ile Val Thr Leu Lys Ala Asn Thr Ser Tyr
360 365 370
AAG GTA TCC GCT TTC GGA AAG GCC AGC TCA CCC GGA ACA TCG GCT TAT 2044
Lys Val Ser Ala Phe Gly Lys Ala Ser Ser Pro Gly Thr Ser Ala Tyr 375 380 385 390
CTA GGC ATT AGT MA GCA TCC AAC AAC OAA CTC ATA AGC AAT TTT OAA 2092
Leu Gly île Ser Lys Ala Ser Asn Asn Glu Leu Ile Ser Asn Phe Glu
395 400 405
TTC MA ACA ACC TCA TAC TCC MA GGC GAG ATT GAG ATA AGA ACT GGA 2140
Phe Lys Thr Thr Ser Tyr Ser Lys Gly Glu Ile Glu Ile Arg Thr Gly
410 415 420
AAT GTT CAG OAA TCA TAT CGC ATA TCG TAT TCC TCT TCC CCC CAA GCC 2188
Asn Val Gln Glu Ser Tyr Arg Ile Trp Tyr Trp Ser Ser Gly Gln Ala
425 430 435
TAT TGC GAT GAT TTT AAC CTT GTT GAA ATA AAC AGC GGG GCT TCA OAA 2236
Tyr Cys Asp Asp Phe Asn Leu Val Glu Ile Asn Ser Gly Ala Ser Gln
440 445 450
CTC AAT OAA AAT GAG ACT OAA ACA GCA CTG OAA MA GGT ATA CAC ATT 2284
Leu Asn Glu Asn Glu Thr Glu Thr Ala Leu Glu Lys Gly Ile His Ile 455 460 465 470
TAT CCG AAT CCC TAT MA AAC GGT CCA TTG ACA ATC GAT TTT GGC AAA 2332
Tyr Pro Asn Pro Tyr Lys Asn Gly Pro Leu Thr Ile Asp Phe Gly Lys
475 480 485
CCC TTC AGC GGC GAG GTC OAA ATC ACC GGT TTA AAC GGT AGA ACA TTC 2380
Pro Phe Ser Gly Glu Val Gln Ile Thr Gly Leu Asn Gly Arg Thr Phe
490 495 500
TTA AGA AGA AAT GTT GTC GAT CAA ACT TCG GTT CAG CTC CTA GAA TCC 2428
Leu Arg Arg Asn Val Val Asp Gln Thr Ser Val Gln Leu Leu Glu Ser
505 510 515
MA TCT MA TTC AAG AGC GGT CTA TAT ATC GTT MA ATT AGT GGC CCG 2476
Lys Ser Lys Phe Lys Ser Gly Leu Tyr Ile Val Lys Ile Ser Gly Pro
520 525 530
GAT GGA GAG GTT TCA MA AAG ATA CTC GTG GAG TAACTAAMA TCAATTTTTA 2529
Asp Gly Glu Val Ser Lys Lys Ile Leu Val Glu 535 540 545
CAGGATTACA GACGGGCAAA GGGATIITCC TTTGCCCGTT TTTAMATTA TGGGCGGMA 2589
CGATTGTTGC G 2600 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 4:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 545 acides aminés
(B) TYPE: acide aminé
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: protéine
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 4:
Met Lys Lys Pro Asn Phe Tyr Gly Lys Met Gly Arg Thr Ala Leu Ser
1 5 10 15
Ser Leu Phe Tyr Leu Phe Phe Leu Gly Leu Val Tyr Gly Gln Gln Pro
20 25 30
Thr Lys Thr Ser Asn Pro Asn Asp Gln Trp Thr Ile Lys Trp Ser Ala
35 40 45
Ser Asp Glu Phe Asn Lys Asn Asp Pro Asp Trp Ala Lys Trp île Lys
50 55 60
Thr Gly Asn Leu Pro Asn Thr Ser Ala Trp Lys Trp Asn Asn Gln Lys
65 70 75 80
Asn Val Lys Ile Ser Asn Gly Ile Ala Glu Leu Thr Met Arg His Asn
85 90 95
Ala Asn Asn Thr Pro Pro Asp Gly Gly Thr Tyr Phe Thr Ser Gly île
100 105 110
Phe Lys Ser Tyr Gln Lys Phe Thr Tyr Gly Tyr Phe Glu Ala Lys Ile
115 120 125 Gln Gly Ala Asp Ile Gly Glu Gly Val Cys Pro Ser Phe Trp Leu Tyr
130 135 140
Ser Asp Phe Asp Tyr Ser Val Ala Asn Gly Glu Thr Val Tyr Ser Glu 145 150 155 160 île Asp Val Val Glu Leu Gln Gln Phe Asp Trp Tyr Glu Gly His Gln
165 170 175
Asp Asp île Tyr Asp Met Asp Leu Asn Leu His Ala Val Val Lys Glu
180 185 190
Asn Gly Gln Gly Val Trp Lys Arg Pro Lys Met Tyr Pro Gln Glu Gln
195 200 205
Leu Asn Lys Trp Arg Ala Met Asp Pro Ser Lys Asp Phe His Ile Tyr
210 215 220
Gly Cys Glu Val Asn Gln Asn Glu Ile Ile Trp Tyr Val Asp Gly Val 225 230 235 240
Glu Val Ala Arg Lys Pro Asn Lys Tyr Trp His Arg Pro Met Asn Val
245 250 255
Thr Leu Ser Leu Gly Leu Arg Lys Pro Phe Val Lys Phe Phe Asp Asn
260 265 270
Lys Asn Asn Ala île Asn Pro Glu Thr Asp Ala Lys Ala Arg Glu Lys
275 280 285
Leu Ser Asp Ile Pro Thr Ser Met Tyr Val Asp Tyr Val Arg Val Trp
290 295 300
Glu Lys Ser Ala Gly Asn Thr Thr Asn Pro Pro Thr Ser Glu Val Gly 305 310 315 320
Thr Leu Lys Thr Lys Gly Ser Lys Leu Val Ile Asp His Trp Asp Ala
325 330 335
Ser Thr Gly Thr Ile Ser Ala Val Ser Asn Asn Thr Lys Thr Gly Gln
340 345 350
Tyr Ala Gly Ser Val Asn Asn Ala Ser Ile Ala Gln Ile Val Thr Leu
355 360 365
Lys Ala Asn Thr Ser Tyr Lys Val Ser Ala Phe Gly Lys Ala Ser Ser
370 375 380
Pro Gly Thr Ser Ala Tyr Leu Gly Ile Ser Lys Ala Ser Asn Asn Glu 385 390 395 400
Leu Ile Ser Asn Phe Glu Phe Lys Thr Thr Ser Tyr Ser Lys Gly Glu
405 410 415
Ile Glu île Arg Thr Gly Asn Val Gln Glu Ser Tyr Arg Ile Trp Tyr
420 425 430
Trp Ser Ser Gly Gln Ala Tyr Cys Asp Asp Phe Asn Leu Val Glu Ile
435 440 445
Asn Ser Gly Ala Ser Gln Leu Asn Glu Asn Glu Thr Glu Thr Ala Leu
450 455 460
Glu Lys Gly Ile His Ile Tyr Pro Asn Pro Tyr Lys Asn Gly Pro Leu 465 470 475 480
Thr Ile Asp Phe Gly Lys Pro Phe Ser Gly Glu Val Gln Ile Thr Gly
485 490 495
Leu Asn Gly Arg Thr Phe Leu Arg Arg Asn Val Val Asp Gln Thr Ser
500 505 510
Val Gln Leu Leu Glu Ser Lys Ser Lys Phe Lys Ser Gly Leu Tyr Ile
515 520 525
Val Lys Ile Ser Gly Pro Asp Gly Glu Val Ser Lys Lys Ile Leu Val
530 535 540
Glu 545
(C) VILLE: Saint-Malo
(E) PAYS: France
(F) CODE POSTAL: 35413 Cedex
(G) TELEPHONE: 99 21 53 70
(H) TELECOPIE: 99 82 56 17
(ii) TITRE DE L' INVENTION: Gênes de glycolyse hydrolases et leur
utlisation pour la production d'enzymes de
biodégradation des carraghénanes
(iii) NOMBRE DE SEQUENCES: 4
(iv) FORME DECHIFFRABLE PAR ORDINATEUR:
(A) TYPE DE SUPPORT: Floppy disk
(B) ORDINATEUR: IBM PC compatible
(C) SYSTEME D' EXPLOITATION: PC-DOS/MS-DOS
(D) LOGICIEL: PatentIn Release #1.0, Version #1.30 (OEB) (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 1:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 2180 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (génomique)
(iii) HYPOTHETIQUE: NON
(ix) CARACTERISTIQUE:
(A) NOM/CLE: CDS
(B) EMPLACEMENT:join(1..498, 741..1940, 2009..2179)
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 1:
GAT CAT ATC ATT CCT TTG CAA ATT AAA AAT TCT CAA GAT AGT CAA ATA 48
Asp His Ile Ile Pro Leu Gln Ile Lys Asn Ser Gln Asp Ser Gln Ile
1 5 10 15
ATT AGT TTT TTT AAA GCT GAC AAA GGG AGT GTG AGC AGG CAA GTA CAC 96
Ile Ser Phe Phe Lys Ala Asp Lys Gly Ser Val Ser Arg Gln Val His
20 25 30
CCA CCT TGG CCT GTG CCT TGT AAA AGT AAA CTG CAA GAG CAA GAT AGT 144
Pro Pro Trp Pro Val Pro Cys Lys Ser Lys Leu Gln Glu Gln Asp Ser
35 40 45
AGT GAG TCT AAA GAG AGT AAG GCA GAG CAA GTT AAA ATT AAC AAC TGC 192
Ser Glu Ser Lys Glu Ser Lys Ala Glu Gln Val Lys Ile Asn Asn Cys
50 55 60
GTT GTA CAG AAC GCA ATG CTG TAC ATA GAA AAC AAT TAT TTC AAC GAT 240
Val Val Gln Asn Ala Met Leu Tyr Ile Glu Asn Asn Tyr Phe Asn Asp
65 70 75 80
ATA AAT ATA GAC ACG GTT GCT TTT TCT GTT GGC GTA AGT CGC TCT TAT 288
Ile Asn Ile Asp Thr Val Ala Phe Ser Val Gly Val Ser Arg Ser Tyr
85 90 95
CTC GTT AAA CAA TTT AAG TTA GCA ACG AAT AAA ACG ATT AAT AAT AGA 336
Leu Val Lys Gln Phe Lys Leu Ala Thr Asn Lys Thr Ile Asn Asn Arg
100 105 110
ATC ATA GAA GTA AGA ATA GAG CAG GCT AAA AAA GTA TTA CTA AAA AAA 384
Ile Ile Glu Val Arg Ile Glu Gln Ala Lys Lys Val Leu Leu Lys Lys
115 120 125
TCT GTT ACA GAA ACA GCT TAT GAA GTT GGT TTT AAT AAC TCA AAC TAC 432
Ser Val Thr Glu Thr Ala Tyr Glu Val Gly Phe Asn Asn Ser Asn Tyr
130 135 140
TTC GCG ACA GTT TTT AAA AAA AGA ACA AAC TAC ACG CCC AAG CAA TTT 480
Phe Ala Thr Val Phe Lys Lys Arg Thr Asn Tyr Thr Pro Lys Gln Phe 145 150 155 160
AAA CGT ACT TTT TCC AGC TAAAACTACA ACTAAATAAC GATTAAAAGC 528
Lys Arg Thr Phe Ser Ser
165
CATTTTTAGA GAACAGTAAA ACCATTTTTT GAGGTTTGGT GTTGTATATA AATATTAAAT 588
ATCCCCACTC GCTCAGC m TTTTGTGCGA GTTGTGAGAA TTAGCTTAAC AGGTAAGGTT 648
TACGTATCTG TATATCTAAA CTCTTCGAAT ATAACACTGT ATCTGTTGCT GAGCTGTGGC 708
TCAGTTCACA CTAACAAAGG ATGGATAAAT AA ATG AAA CCT ATA AGT ATT GTG 761
Met Lys Pro Ile Ser île Val
170
GCA TTC CCT ATA CCA GCT ATA AGT ATG CTT CTT TTA AGT GCA GTA TCA 809
Ala Phe Pro Ile Pro Ala Ile Ser Met Leu Leu Leu Ser Ala Val Ser
175 180 185
CAA GCA GCA TCT ATG CAA CCT CCC ATC GCA AAA CCT GGT GAA ACA TGG 857 Gln Ala Ala Ser Met Gln Pro Pro Ile Ala Lys Pro Gly Glu Thr Trp lgo 195 200 205
ATT TTA CAA GCC AAA CGC TCT GAC GAA TTT AAC GTA AAA GAT GCG ACA 905
Ile Leu Gln Ala Lys Arg Ser Asp Glu Phe Asn Val Lys Asp Ala Thr
210 215 220
AAG TGG AAC TTT CAA ACA GAA AAC TAT GGG GTA TGG TCT TGG AAA AAT 953
Lys Trp Asn Phe Gln Thr Glu Asn Tyr Gly Val Trp Ser Trp Lys Asn
225 230 235
GAA AAT GCG ACA GTA TCT AAT GGC AAA CTA AAA TTA ACC ACT AAG CGA 1001
Glu Asn Ala Thr Val Ser Asn Gly Lys Leu Lys Leu Thr Thr Lys Arg
240 245 250
GAA TCT CAT CAA CGT ACA TTC TGG GAT GGC TGT AAT CAG CAG CAA GTT 1049
Glu Ser His Gln Arg Thr Phe Trp Asp Gly Cys Asn Gln Gln Gln Val
255 260 265
GCA AAT TAC CCA CTT TAT TAT ACA TCG GGT GTC GCT AAA TCC AGA GCT 1097 Ala Asn Tyr Pro
GAA CTT ACT CAA AAA AGT GCA GTG AGA GAG TCT GAT CAT GAC TTA CAC 1289
Glu Leu Thr Gln Lys Ser Ala Val Arg Glu Ser Asp His Asp Leu His
335 340 345
AAT ATT GTA GTA AAA AAT GGA AAA CCA ACA TGG ATG CGT CCA GGG TCT 1337
Asn Ile Val Val Lys Asn Gly Lys Pro Thr Trp Met Arg Pro Gly Ser 350 355 360 365
TTT CCG CAG ACA AAT CAT AAC GGA TAC CAT CTA CCT TTC GAT CCT CGA 1385
Phe Pro Gln Thr Asn His Asn Gly Tyr His Leu Pro Phe Asp Pro Arg
370 375 380
AAT GAC TTT CAC ACC TAT GGT GTC AAT GTA ACT AAA GAC AAG ATC ACT 1433
Asn Asp Phe His Thr Tyr Gly Val Asn Val Thr Lys Asp Lys Ile Thr
385 390 395
TGG TAC GTA GAT GGT GAA ATT GTG GGC GAA AAG GAT AAC TTA TAC TGG 1481
Trp Tyr Val Asp Gly Glu Ile Val Gly Glu Lys Asp Asn Leu Tyr Trp
400 405 410
CAT CGT CAA ATG AAT CTC ACA TTA TCA CAA GGC TTA CGC GCG CCG CAT 1529
His Arg Gln Met Asn Leu Thr Leu Ser Gln Gly Leu Arg Ala Pro His
415 420 425
ACA CAA TGG AAA TGT AAT CAA TTT TAC CCA TCA GCG AAT AAA TCA GCA 1577
Thr Gln Trp Lys Cys Asn Gln Phe Tyr Pro Ser Ala Asn Lys Ser Ala 430 435 440 445
GAA GGC TTC CCA ACA TCA ATG GAA GTT GAT TAT GTA AGA ACG TGG GTA 1625
Glu Gly Phe Pro Thr Ser Met Glu Val Asp Tyr Val Arg Thr Trp Val
450 455 460
AAG GTG GGC AAT AAC AAC TCT GCT CCA GGC GAG GGG CAG TCA TGT CCT 1673
Lys Val Gly Asn Asn Asn Ser Ala Pro Gly Glu Gly Gln Ser Cys Pro
465 470 475
AAC ACG TTT GTA GCT GTC AAT AGT GTT CAA CTA AGC GCA GCA AAA CAA 1721
Asn Thr Phe Val Ala Val Asn Ser Val Gln Leu Ser Ala Ala Lys Gln
480 485 490
ACA CTT CGA AAG GGC CAA TCT ACA ACG CTA GAA AGC ACA GTT CTT CCA 1769
Thr Leu Arg Lys Gly Gln Ser Thr Thr Leu Glu Ser Thr Val Leu Pro
495 500 505
AAC TGT GCA ACC AAC AAG AAA GTC ATT TAT TCA TCA AGC AAT AAA AAT 1817
Asn Cys Ala Thr Asn Lys Lys Val Ile Tyr Ser Ser Ser Asn Lys Asn 510 515 520 525
GTG GCA ACT GTG AAC AGT GCT GGC GTT GTA AAA GCT AAA AAT AAA GGC 1865 Val Ala E r Val Asn Ser Ala Gly Val Val Lys Ala Lys Asn Lys Gly
530 535 540
ACT GCG ACG ATT ACG GTT AAA ACT AAA AAC AAA GGG AAA ATA GAT AAA 1913 Tnr Ala Thr île Thr Val Lys Thr Lys Asn Lys Gly Lys Ile Asp Lys
545 550 555
TTA ACC ATT GCG GTG AAT TAAGCTAACT CAAACTAGCC TCGAAGGATT 1961
Leu Thr Ile Ala Val Asn
560 GAGGCACTTT ATTTATAGGT CTCAGGCTTC GACTITITGG AGGGGGT ATG AAA AAG 2017
Met Lys Lys
565
GTA AAT TTA TCC AGC AAG TGG ATA ATT AGC ATT AGT TTA CTA ATC ATT 2065
Val Asn Leu Ser Ser Lys Trp île île Ser Ile Ser Leu Leu Ile Ile
570 575 580
TGT GAT TAT GTT TAT TTA ATA CGA ACA AAC GTT AAC GAG CAA GCT AAC 2113
Cys Asp Tyr Val Tyr Leu Ile Arg Thr Asn Val Asn Glu Gln Ala Asn
585 590 595
GCA GAA GCT ACT GCA CAT ATG CAT TAC AAA ATA AAT AAT ACG AAA CAC 2161 Ala Glu Ala E r Ala His Met His Tyr Lys Ile Asn Asn Thr Lys His
600 605 610
TCA AAA GGA AAG CTT GAT C 2180
Ser Lys Gly Lys Leu Asp 615 620 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 2:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 620 acides aminés
(B) TYPE: acide aminé
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: protéine
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 2:
Asp His Ile Ile Pro Leu Gln Ile Lys Asn Ser Gln Asp Ser Gln Ile
1 5 10 15
Ile Ser Phe Phe Lys Ala Asp Lys Gly Ser Val Ser Arg Gln Val His
20 25 30
Pro Pro Trp Pro Val Pro Cys Lys Ser Lys Leu Gln Glu Gln Asp Ser
35 40 45
Ser Glu Ser Lys Glu Ser Lys Ala Glu Gln Val Lys Ile Asn Asn Cys
50 55 60
Val Val Gln Asn Ala Met Leu Tyr Ile Glu Asn Asn Tyr Phe Asn Asp
65 70 75 80
Ile Asn île Asp Thr Val Ala Phe Ser Val Gly Val Ser Arg Ser Tyr
85 90 95
Leu Val Lys Gln Phe Lys Leu Ala Thr Asn Lys Thr Ile Asn Asn Arg
100 105 110
Ile Ile Glu Val Arg Ile Glu Gîn Ala Lys Lys Val Leu Leu Lys Lys
115 120 125
Ser Val Thr Glu Thr Ala Tyr Glu Val Gly Phe Asn Asn Ser Asn Tyr
130 135 140
Phe Ala Thr Val Phe Lys Lys Arg Thr Asn Tyr Thr Pro Lys Gln Phe 145 150 155 160
Lys Arg Thr Phe Ser Ser Met Lys Pro Ile Ser Ile Val Ala Phe Pro
165 170 175
Ile Pro Ala Ile Ser Met Leu Leu Leu Ser Ala Val Ser Gln Ala Ala
180 185 190
Ser Met Gln Pro Pro Ile Ala Lys Pro Gly Glu Thr Trp île Leu Gln
195 200 205
Ala Lys Arg Ser Asp Glu Phe Asn Val Lys Asp Ala Thr Lys Trp Asn
210 215 220
Phe Gln Thr Glu Asn Tyr Gly Val Trp Ser Trp Lys Asn Glu Asn Ala 225 230 235 240
Thr Val Ser Asn Gly Lys Leu Lys Leu Thr Thr Lys Arg Glu Ser His
245 250 255 Gln Arg Thr Phe Trp Asp Gly Cys Asn Gln Gln Gln Val Ala Asn Tyr
260 265 270
Pro Leu Tyr Tyr Thr Ser Gly Val Ala Lys Ser Arg Ala Thr Gly Asn
275 280 285
Tyr Gly Tyr Tyr Glu Ala Arg île Lys Gly Ala Ser Thr Phe Pro Gly
290 295 300
Val Ser Pro Ala Phe Trp Met Tyr Ser Thr Ile Asp Arg Ser Leu Thr 305 310 315 320
Lys Glu Gly Asp Val Gln Tyr Ser Glu Ile Asp Val Val Glu Leu Thr
325 330 335 Gln Lys Ser Ala Val Arg Glu Ser Asp His Asp Leu His Asn Ile Val
340 345 350
Val Lys Asn Gly Lys Pro Thr Trp Met Arg Pro Gly Ser Phe Pro Gln
355 360 365
Thr Asn His Asn Gly Tyr His Leu Pro Phe Asp Pro Arg Asn Asp Phe
370 375 380
His Thr Tyr Gly Val Asn Val Thr Lys Asp Lys Ile Thr Trp Tyr Val 385 390 395 400
Asp Gly Glu Ile Val Gly Glu Lys Asp Asn Leu Tyr Trp His Arg Gln
405 410 415
Met Asn Leu Thr Leu Ser Gln Gly Leu Arg Ala Pro His Thr Gln Trp
420 425 430
Lys Cys Asn Gln Phe Tyr Pro Ser Ala Asn Lys Ser Ala Glu Gly Phe
435 440 445
Pro Thr Ser Met Glu Val Asp Tyr Val Arg Thr Trp Val Lys Val Gly
450 455 460
Asn Asn Asn Ser Ala Pro Gly Glu Gly Gln Ser Cys Pro Asn Thr Phe 465 470 475 480
Val Ala Val Asn Ser Val Gln Leu Ser Ala Ala Lys Gln Thr Leu Arg
485 490 495
Lys Gly Gln Ser Thr Thr Leu Glu Ser Thr Val Leu Pro Asn Cys Ala
500 505 510
Thr Asn Lys Lys Val Ile Tyr Ser Ser Ser Asn Lys Asn Val Ala Thr
515 520 525
Val Asn Ser Ala Gly Val Val Lys Ala Lys Asn Lys Gly Thr Ala Thr
530 535 540
Ile Thr Val Lys Thr Lys Asn Lys Gly Lys île Asp Lys Leu Thr Ile 545 550 555 560
Ala Val Asn Met Lys Lys Val Asn Leu Ser Ser Lys Trp Ile Ile Ser
565 570 575
Ile Ser Leu Leu Ile Ile Cys Asp Tyr Val Tyr Leu Ile Arg Thr Asn
580 585 590
Val Asn Glu Gln Ala Asn Ala Glu Ala Thr Ala His Met His Tyr Lys
595 600 605
Ile Asn Asn Thr Lys His Ser Lys Gly Lys Leu Asp
610 615 620 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 3:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 2600 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (génomique)
(iii) HYPOTHETIQUE: NON
(ix) CARACTERISTIQUE:
(A) NOM/CLE: CDS
(B) EMPLACEMENT:875. .2509
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 3:
GCCTCCGTAT TCGACAATGT TGTACGATGC TTGGCGATTC GGACTCTGTT TAAGCACTCG 60
ATTTCGTAAA GGCACTATCC ACTCATTCAT TCCGACTCAA TATTCTTTTC GACAAATGCA 120
ACCGGTTCCA TTGAAAAGGC CCTAAAAATA CAGCTTTCCC GCCCCCCATC GTAGAAGGTT 180
CCAATATGCT TCAACCCCTT TTTCAGCCTT ACTTCAGGGG TATTACTTTC ATGCCTAGGG 240
CCGCAAATAC ATTCGCTTGG ACCCAGTCAC CTATATAATT GAATACGGAA CTACCCATGG 300
CTTCCTTCCC TTTGGGMCC TATGGTACAG ACTTGCCTTT TTTMACCGG TTACTTCAGC 360
TAATTCGCCA AGCTGGTTCC TTCATAACCT TTGGCCCGAA ACACCTTGCA AGCACATAAA 420 TCTTATCCAA TATTTTGCGG TCTCATGGGA CAMTCTATA ACAAACATTC MTTTTACCA 480
MCGTTCGGT AATAAATCTA GTCMMACG GGGTCCGATT CATTTTAGM GAAAGGTAAA 540
GCCCCCAAA GAGCGGTTTA CTTGAAGATA TGATTTATM MCACAATM GTGACAAAGG 600
MGATCATGG CTATMTTAG TTGAAAAAAC AGGGCTTACC ATGACATGGA GCTTTATTGA 660
AAACAGATGT CCAACAAGAA TAAAGGAGGG CCGTTCGACC GCGACGTTTA MTAAAAACA 720
TATTCCATAT CAAAATTTAA TTMGGTTCT TTCCTACAGT ATTTATAAGA AATTACTAAA 780
ATTAGTTAGG ATAATACTAC AAAATGGTAA MTTGGATTA CTCAGATTGA ACCATAGCCT 840
CTACTTTAGT CGGCTMCAA AAACAATTAT AGTA ATG MA AM CCA MT TTT 892
Met Lys Lys Pro Asn Phe
1 5
TAT GGC MG ATG GGT AGA ACT GCA CTT TCA AGT CTT TTC TAC CTC TTT 940
Tyr Gly Lys Met Gly Arg Thr Ala Leu Ser Ser Leu Phe Tyr Leu Phe
10 15 20
TTC CTA GGC CTT GTG TAT GGG CM CM CCT ACG AAG ACT TCA MT CCG 988
Phe Leu Gly Leu Val Tyr Gly Gln Gln Pro Thr Lys Thr Ser Asn Pro
25 30 35
AAC GAT CAG TGG ACC ATC AM TGG AGT GCT TCG GAC GM TTC MC MA 1036
Asn Asp Gln Trp Thr Ile Lys Trp Ser Ala Ser Asp Glu Phe Asn Lys
40 45 50
AAT GAC CCC GAC TGG GCA MA TGG ATC MG ACA GGA AAC CTT CCG AAT 1084
Asn Asp Pro Asp Trp Ala Lys Trp île Lys Thr Gly Asn Leu Pro Asn
55 60 65 70
ACA TCG GCA TGG MA TGG AAC AAT CAA AAA MC GTA AAG ATT TCC AAC 1132
Thr Ser Ala Trp Lys Trp Asn Asn Gln Lys Asn Val Lys Ile Ser Asn
75 80 85
GGA ATT GCG GAA CTA ACG ATG AGG CAT AAC GCC AAT AAT ACC CCA CCT 1180
Gly Ile Ala Glu Leu Thr Met Arg His Asn Ala Asn Asn Thr Pro Pro
90 95 100
GAC GGA GGA ACC TAT TTC ACC TCT GGG ATA TTT AAG TCG TAC CAA AAA 1228
Asp Gly Gly Thr Tyr Phe Thr Ser Gly Ile Phe Lys Ser Tyr Gln Lys
105 110 115
TTT ACG TAT GGA TAC TTT GAG GCC MA ATC CAA GGA GCG GAT ATA GGT 1276
Phe Thr Tyr Gly Tyr Phe Glu Ala Lys Ile Gln Gly Ala Asp île Gly
120 125 130 OAA GGC GTA TGC CCA TCG TTT TGG CTT TAT AGT GAT TTC GAC TAT TCC 1324
Glu Gly Val Cys Pro Ser Phe Trp Leu Tyr Ser Asp Phe Asp Tyr Ser 135 140 145 150
GTA GCC AAT GGG GAA ACG GTA TAC AGT OAA ATA GAT GTA GTT GAA CTA 1372
Val Ala Asn Gly Glu Thr Val Tyr Ser Glu Ile Asp Val Val Glu Leu
155 160 165
CAA CAA TTC GAT TGG TAT OAA GGC CAT CAG GAC GAC ATT TAC GAC ATG 1420 Gln Gln Phe Asp Trp Tyr Glu Gly His Gln Asp Asp Ile Tyr Asp Met
170 175 180
GAC TTA AAT CTA CAC GCC GTT GTC MA GAA AAC GGA CAG GGG GTT TGG 1468
Asp Leu Asn Leu His Ala Val Val Lys Glu Asn Gly Gln Gly Val Trp
185 lgo 195
MA AGG CCA MA ATG TAC CCT CAA OAA CAG TTG AAC MA TGG AGA GCC 1516
Lys Arg Pro Lys Met Tyr Pro Gln Glu Gln Leu Asn Lys Trp Arg Ala
200 205 210
ATG GAC CCG AGT MA GAC TTT CAT ATC TAT GGT TGT GAA GTG AAC CAG 1564
Met Asp Pro Ser Lys Asp Phe His Ile Tyr Gly Cys Glu Val Asn Gln 215 220 225 230
AAC OAA ATC ATA TGG TAT GTT GAC GGT GTC GAG GTT GCC CGA MA CCA 1612
Asn Glu île Ile Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val Ala Arg Lys Pro
235 240 245
AAT MA TAT TGG CAT CGC CCC ATG AAC GTT ACC CTT TCA TTG GGA CTC 1660
Asn Lys Tyr Trp His Arg Pro Met Asn Val Thr Leu Ser Leu Gly Leu
250 255 260
AGA MA CCA TTT GTC MA TIT TTC GAC AAT AAG AAC AAT GCC ATA AAT 1708
Arg Lys Pro Phe Val Lys Phe Phe Asp Asn Lys Asn Asn Ala Ile Asn
265 270 275
CCA OAA ACC GAT GCC AAG GCA AGG OAA MA TTA TCG GAT ATA CCT ACA 1756
Pro Glu Thr Asp Ala Lys Ala Arg Glu Lys Leu Ser Asp Ile Pro Thr
280 285 290
TCC ATG TAT GTG GAT TAC GTT CGG GTC TGG OAA MA TCA GCA GGT AAC 1804
Ser Met Tyr Val Asp Tyr Val Arg Val Trp Glu Lys Ser Ala Gly Asn 295 300 305 310
ACT ACC AAT CCC CCA ACC AGC GAG GTC CCC ACA CTA MA ACA AAG GGT 1852
Thr Thr Asn Pro Pro Thr Ser Glu Val Gly Thr Leu Lys Thr Lys Gly
315 320 325
TCG AAA CTG GTG ATT GAC CAT TGG GAT GCA AGT ACA CCC ACT ATT TCG 1900
Ser Lys Leu Val Ile Asp His Trp Asp Ala Ser Thr Gly Thr Ile Ser
330 335 340
GCT GTC AGT AAC AAT ACA AAG ACA GGT CAA TAT GCC GGT TCA GTC AAC 1948
Ala Val Ser Asn Asn Thr Lys Thr Gly Gln Tyr Ala Gly Ser Val Asn
345 350 355
AAC CCC AGC ATC GCC CAG ATA GTA ACA TTA MA CCC AAT ACT TCA TAT 1996
Asn Ala Ser Ile Ala Gln Ile Val Thr Leu Lys Ala Asn Thr Ser Tyr
360 365 370
AAG GTA TCC GCT TTC GGA AAG GCC AGC TCA CCC GGA ACA TCG GCT TAT 2044
Lys Val Ser Ala Phe Gly Lys Ala Ser Ser Pro Gly Thr Ser Ala Tyr 375 380 385 390
CTA GGC ATT AGT MA GCA TCC AAC AAC OAA CTC ATA AGC AAT TTT OAA 2092
Leu Gly île Ser Lys Ala Ser Asn Asn Glu Leu Ile Ser Asn Phe Glu
395 400 405
TTC MA ACA ACC TCA TAC TCC MA GGC GAG ATT GAG ATA AGA ACT GGA 2140
Phe Lys Thr Thr Ser Tyr Ser Lys Gly Glu Ile Glu Ile Arg Thr Gly
410 415 420
AAT GTT CAG OAA TCA TAT CGC ATA TCG TAT TCC TCT TCC CCC CAA GCC 2188
Asn Val Gln Glu Ser Tyr Arg Ile Trp Tyr Trp Ser Ser Gly Gln Ala
425 430 435
TAT TGC GAT GAT TTT AAC CTT GTT GAA ATA AAC AGC GGG GCT TCA OAA 2236
Tyr Cys Asp Asp Phe Asn Leu Val Glu Ile Asn Ser Gly Ala Ser Gln
440 445 450
CTC AAT OAA AAT GAG ACT OAA ACA GCA CTG OAA MA GGT ATA CAC ATT 2284
Leu Asn Glu Asn Glu Thr Glu Thr Ala Leu Glu Lys Gly Ile His Ile 455 460 465 470
TAT CCG AAT CCC TAT MA AAC GGT CCA TTG ACA ATC GAT TTT GGC AAA 2332
Tyr Pro Asn Pro Tyr Lys Asn Gly Pro Leu Thr Ile Asp Phe Gly Lys
475 480 485
CCC TTC AGC GGC GAG GTC OAA ATC ACC GGT TTA AAC GGT AGA ACA TTC 2380
Pro Phe Ser Gly Glu Val Gln Ile Thr Gly Leu Asn Gly Arg Thr Phe
490 495 500
TTA AGA AGA AAT GTT GTC GAT CAA ACT TCG GTT CAG CTC CTA GAA TCC 2428
Leu Arg Arg Asn Val Val Asp Gln Thr Ser Val Gln Leu Leu Glu Ser
505 510 515
MA TCT MA TTC AAG AGC GGT CTA TAT ATC GTT MA ATT AGT GGC CCG 2476
Lys Ser Lys Phe Lys Ser Gly Leu Tyr Ile Val Lys Ile Ser Gly Pro
520 525 530
GAT GGA GAG GTT TCA MA AAG ATA CTC GTG GAG TAACTAAMA TCAATTTTTA 2529
Asp Gly Glu Val Ser Lys Lys Ile Leu Val Glu 535 540 545
CAGGATTACA GACGGGCAAA GGGATIITCC TTTGCCCGTT TTTAMATTA TGGGCGGMA 2589
CGATTGTTGC G 2600 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 4:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 545 acides aminés
(B) TYPE: acide aminé
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: protéine
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 4:
Met Lys Lys Pro Asn Phe Tyr Gly Lys Met Gly Arg Thr Ala Leu Ser
1 5 10 15
Ser Leu Phe Tyr Leu Phe Phe Leu Gly Leu Val Tyr Gly Gln Gln Pro
20 25 30
Thr Lys Thr Ser Asn Pro Asn Asp Gln Trp Thr Ile Lys Trp Ser Ala
35 40 45
Ser Asp Glu Phe Asn Lys Asn Asp Pro Asp Trp Ala Lys Trp île Lys
50 55 60
Thr Gly Asn Leu Pro Asn Thr Ser Ala Trp Lys Trp Asn Asn Gln Lys
65 70 75 80
Asn Val Lys Ile Ser Asn Gly Ile Ala Glu Leu Thr Met Arg His Asn
85 90 95
Ala Asn Asn Thr Pro Pro Asp Gly Gly Thr Tyr Phe Thr Ser Gly île
100 105 110
Phe Lys Ser Tyr Gln Lys Phe Thr Tyr Gly Tyr Phe Glu Ala Lys Ile
115 120 125 Gln Gly Ala Asp Ile Gly Glu Gly Val Cys Pro Ser Phe Trp Leu Tyr
130 135 140
Ser Asp Phe Asp Tyr Ser Val Ala Asn Gly Glu Thr Val Tyr Ser Glu 145 150 155 160 île Asp Val Val Glu Leu Gln Gln Phe Asp Trp Tyr Glu Gly His Gln
165 170 175
Asp Asp île Tyr Asp Met Asp Leu Asn Leu His Ala Val Val Lys Glu
180 185 190
Asn Gly Gln Gly Val Trp Lys Arg Pro Lys Met Tyr Pro Gln Glu Gln
195 200 205
Leu Asn Lys Trp Arg Ala Met Asp Pro Ser Lys Asp Phe His Ile Tyr
210 215 220
Gly Cys Glu Val Asn Gln Asn Glu Ile Ile Trp Tyr Val Asp Gly Val 225 230 235 240
Glu Val Ala Arg Lys Pro Asn Lys Tyr Trp His Arg Pro Met Asn Val
245 250 255
Thr Leu Ser Leu Gly Leu Arg Lys Pro Phe Val Lys Phe Phe Asp Asn
260 265 270
Lys Asn Asn Ala île Asn Pro Glu Thr Asp Ala Lys Ala Arg Glu Lys
275 280 285
Leu Ser Asp Ile Pro Thr Ser Met Tyr Val Asp Tyr Val Arg Val Trp
290 295 300
Glu Lys Ser Ala Gly Asn Thr Thr Asn Pro Pro Thr Ser Glu Val Gly 305 310 315 320
Thr Leu Lys Thr Lys Gly Ser Lys Leu Val Ile Asp His Trp Asp Ala
325 330 335
Ser Thr Gly Thr Ile Ser Ala Val Ser Asn Asn Thr Lys Thr Gly Gln
340 345 350
Tyr Ala Gly Ser Val Asn Asn Ala Ser Ile Ala Gln Ile Val Thr Leu
355 360 365
Lys Ala Asn Thr Ser Tyr Lys Val Ser Ala Phe Gly Lys Ala Ser Ser
370 375 380
Pro Gly Thr Ser Ala Tyr Leu Gly Ile Ser Lys Ala Ser Asn Asn Glu 385 390 395 400
Leu Ile Ser Asn Phe Glu Phe Lys Thr Thr Ser Tyr Ser Lys Gly Glu
405 410 415
Ile Glu île Arg Thr Gly Asn Val Gln Glu Ser Tyr Arg Ile Trp Tyr
420 425 430
Trp Ser Ser Gly Gln Ala Tyr Cys Asp Asp Phe Asn Leu Val Glu Ile
435 440 445
Asn Ser Gly Ala Ser Gln Leu Asn Glu Asn Glu Thr Glu Thr Ala Leu
450 455 460
Glu Lys Gly Ile His Ile Tyr Pro Asn Pro Tyr Lys Asn Gly Pro Leu 465 470 475 480
Thr Ile Asp Phe Gly Lys Pro Phe Ser Gly Glu Val Gln Ile Thr Gly
485 490 495
Leu Asn Gly Arg Thr Phe Leu Arg Arg Asn Val Val Asp Gln Thr Ser
500 505 510
Val Gln Leu Leu Glu Ser Lys Ser Lys Phe Lys Ser Gly Leu Tyr Ile
515 520 525
Val Lys Ile Ser Gly Pro Asp Gly Glu Val Ser Lys Lys Ile Leu Val
530 535 540
Glu 545
Claims (6)
1. Gènes qui codent pour des glycosyle hydrolases ayant un score
HCA avec la kappa-carraghénase d'Alteromonas carrageenovora qui est supérieur ou égal à 75% sur le domaine s'étendant entre acides aminés 117 et 262 de la séquence protéique SEQ ID N 2 de ladite kappa-carraghénase.
2. Gènes selon la revendication 1, caractérisés en ce que le score HCA est supérieur ou égal à 80 %.
3. Gènes selon la revendication 1, caractérisés en ce que le score HCA est supérieur ou égal à 85 %
4. Gène selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il code pour la K-calraghénase de Cytophaga drobachiensis et qu'il comprend la séquence nucléique SEQ ID N 3.
5. Utilisation des gènes selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, pour l'obtention de glycosyle hydrolases par génie génétique.
6. Utilisation du gène selon la revendication 4 pour l'obtention de la kappa-carraghénase de Cytophaga drobachiensis par génie génétique.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FR9701148A FR2754271B1 (fr) | 1997-02-03 | 1997-02-03 | Genes codant pour des kappa-carraghenases et leur utilisatio utilisation pour la production d'enzymes de biodegradation des carraghenanes |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FR9701148A FR2754271B1 (fr) | 1997-02-03 | 1997-02-03 | Genes codant pour des kappa-carraghenases et leur utilisatio utilisation pour la production d'enzymes de biodegradation des carraghenanes |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| FR2754271A1 true FR2754271A1 (fr) | 1998-04-10 |
| FR2754271B1 FR2754271B1 (fr) | 1998-12-24 |
Family
ID=9503230
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| FR9701148A Expired - Fee Related FR2754271B1 (fr) | 1997-02-03 | 1997-02-03 | Genes codant pour des kappa-carraghenases et leur utilisatio utilisation pour la production d'enzymes de biodegradation des carraghenanes |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| FR (1) | FR2754271B1 (fr) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6620604B1 (en) | 1999-05-10 | 2003-09-16 | Centre National De La Recherche Scientifique (Cnrs) | Sulfohydrolases, corresponding amino acid and nucleotide sequences, sulfohydrolase preparations, processes, and products thereof |
-
1997
- 1997-02-03 FR FR9701148A patent/FR2754271B1/fr not_active Expired - Fee Related
Non-Patent Citations (5)
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6620604B1 (en) | 1999-05-10 | 2003-09-16 | Centre National De La Recherche Scientifique (Cnrs) | Sulfohydrolases, corresponding amino acid and nucleotide sequences, sulfohydrolase preparations, processes, and products thereof |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| FR2754271B1 (fr) | 1998-12-24 |
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