FR2741087A1 - Complexe proteique dodecaedrique adenoviral, procede de preparation, composition le contenant et ses applications - Google Patents
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Abstract
Complexe protéique adénoviral natif ou recombinant, composition pharmaceutique comprenant ledit complexe protéique ainsi que leurs applications dans le traitement et la prévention des maladies humaines et animales. Ledit complexe protéique adénoviral est constitué exclusivement de 12 pentons, comprenant chacun au moins une fibre et une base de penton, lesquelles fibre(s) et base du penton sont dérivées soit du même adénovirus soit d'adénovirus différents, lesdits pentons étant liés par les bases de penton et formant une structure en dodécaèdre, stable aux enzymes protéolytiques, et présente un poids moléculaire compris entre 4,8.10**6 et 6,6.10**6.
Description
La présente invention est relative à un complexe protéique adénoviral natif ou recombinant, à une composition pharmaceutique comprenant ledit complexe protéique ainsi qu'à leurs applications dans le traitement (médicaments) et la prévention (vaccins) des maladies humaines et animales. Ledit complexe protéique est notamment apte à dispenser à des cellules cibles convenables, des séquences nucléiques, des protéines ou des substances chimiques d'intérêt.
La présente invention est également relative à des vecteurs d'expression dudit complexe protéique.
Les adénovirus constituent une famille de virus animaux à ADN regroupant plus de 90 sérotypes infectant différentes espéces, dont presque 50 sérotypes humains différents. Le tropisme cellulaire des adénovirus a pour conséquence l'infection des voies respiratoires, gastro-intestinales, urinaires et des yeux.
Ces virus sont responsables de 3 % de la totalité des infections chez l'homme, de 10 % des pneumonies infantiles et de 15 % des infections intestinales chez l'enfant.
La particule d'adénovirus est relativement complexe et comprend plusieurs sous-structures , en particulier, la partie externe ou capside est formée majoritairement de trois protéines: I'hexon, la base du penton et la fibre (voir figure 1).
Le penton, un complexe non covalent formé d'une protéine trimérique, la fibre et d'une protéine pentamérique, la base du penton, forme les sommets de l'icosaèdre viral.
Chacune des deux protéines formant le penton joue un rôle fondamental dans l'infection: la fibre permet l'attachement du virion à un récepteur cellulaire, la base du penton permet l'internalisation du virion, probablement grâce à l'interaction avec les intégrines cellulaires (liaison aux récepteurs des intégrines, vitronectine, fibronectine, par l'intermédiaire de la séquence arg-gly-asp présente au niveau de la base du penton) (Wickham et al., Cell, 1993, 73, 309-319). Il existe en outre des observations qui suggérent que la base du penton a une activité endosomolytique, permettant l'échappement dans le cytoplasme des molécules co-internalisées avec le virus (Seth et al., Virus Attachment and Entre into Cells, 1986, Ed. R.L.
Crowell & K. Lonberg-Holm, 191-195).
La liaison des adénovirus aux cellules et leur internalisation sont donc deux événements distincts mais qui coopèrent.
La capacité à infecter des cellules quiescentes variées fait de l'adénovirus un vecteur de choix pour la thérapie génique.
Les méthodes couramment employées sont basées sur l'administration répétée d'adénovirus recombinants, déficients pour la réplication, véhiculant le gène-cible (Demandes internationales PCT WO 95/02697 et WO 95/14101, au nom de
Rhone-Poulenc Rorer SA).
Rhone-Poulenc Rorer SA).
Toutefois, les traitements préconisés avec de tels adénovirus déficients présentent au moins les inconvénients suivants:
- risque de restauration en trans de la pathogénicité du virus recombinant chez un sujet traité et simultanément infecté par un adénovirus sauvage;
- réactions immunitaires et inflammatoires, lors de l'administration répétée de l'adénovirus recombinant, dues à l'introduction massive de particules virales apportant des protéines étrangères, qui mettent un frein à leur utilisation en tant que vecteur en thérapie génique, chez l'homme.
- risque de restauration en trans de la pathogénicité du virus recombinant chez un sujet traité et simultanément infecté par un adénovirus sauvage;
- réactions immunitaires et inflammatoires, lors de l'administration répétée de l'adénovirus recombinant, dues à l'introduction massive de particules virales apportant des protéines étrangères, qui mettent un frein à leur utilisation en tant que vecteur en thérapie génique, chez l'homme.
Pour éviter de tels inconvénients, il a été proposé d'utiliser uniquement le penton ou la base du penton, indépendamment du reste de génome de l'adénovirus, pour faciliter le transfert de gênes exogènes dans des cellules hôtes (Demande Internationale PCT WO 94/17832, au nom de The Scripps Research
Institute). Bien qu'une telle approche présente des avantages par rapport aux adénovirus recombinants déficients pour la réplication, de telles structures (penton ou base du penton) sont fragiles, notamment la base du penton, qui peut être détruite par protéolyse.
Institute). Bien qu'une telle approche présente des avantages par rapport aux adénovirus recombinants déficients pour la réplication, de telles structures (penton ou base du penton) sont fragiles, notamment la base du penton, qui peut être détruite par protéolyse.
En conséquence, le Demandeur s'est donné pour but de pourvoir à un vecteur utilisable en thérapie génique qui réponde mieux aux besoins de la pratique que les vecteurs de l'Art antérieur, un tel vecteur ne présente ni les inconvénients des adénovirus recombinants, ni la fragilité du penton ou de la base du penton, telle que précisée ci-dessus.
La présente invention a pour objet un complexe protéique adénoviral, caractérisé en ce qu'il est constitué exclusivement de 12 pentons, comprenant chacun au moins une fibre et une base de penton, lesquelles fibre(s) et base du penton sont dérivées soit du même adénovirus, soit d'adénovirus différents, lesdits pentons étant liés par les bases de penton et formant une structure en dodécaédre, stable aux enzymes protéolytiques, lequel complexe présente un poids moléculaire compris entre 4,8.106 et 6,6.106
Ledit complexe ne comprend donc aucun autre élément du génome d'un desdits adénovirus.Ledit complexe protéique dodécaêdrique natif ou recombinant, également dénommé ci-après dodécaêdre, facilite le transfert de gènes étrangers, de séquences nucléiques, de protéines ou de molécules chimiques dans les cellules cibles.
Ledit complexe ne comprend donc aucun autre élément du génome d'un desdits adénovirus.Ledit complexe protéique dodécaêdrique natif ou recombinant, également dénommé ci-après dodécaêdre, facilite le transfert de gènes étrangers, de séquences nucléiques, de protéines ou de molécules chimiques dans les cellules cibles.
Conformément à l'invention, lesdits adénovirus sont sélectionnés parmi les adénovirus humains et notamment l'adénovirus de type 2 (Ad2), l'adénovirus de type 3 (Ad3), I'adénovirus de type 5 (Ad5) ou les adénovirus entériques (Ad40 et
Ad41) et les adénovirus aviaires.
Ad41) et les adénovirus aviaires.
Selon un mode de réalisation avantageux dudit complexe protéique dodécaêdrique recombinant, I'un des pentons peut être modifié pour augmenter l'affinité vis-à-vis d'un type cellulaire particulier.
Un tel complexe protéique ainsi modifié ne présente pas de diminution dans ses propriétés d'attachement à la cellule cible et d'internalisation dans ladite cellule.
Par exemple, une séquence d'attachement à d'autres récepteurs, tels que le récepteur CD4 présent sur les cellules T, peut être incorporée sur la fibre par des techniques d'ADN recombinant (conjugué ligand-fibre).
On peut citer comme exemples de ligands appropriés, la boucle V3 de la gp120 d'HIV (liaison avec le CD4), la transferrine (liaison au récepteur de la transferrine), les LDL (liaison aux récepteurs LDL), des protéines déglycosylées et des anticorps.
Un complexe protéique dodécaèdrique préféré selon l'invention est constitué de 12 pentons dont les séquences des fibres et des bases du penton correspondent à celles de l'adénovirus de type 3 (Ad3).
Un autre complexe protéique dodécaèdrique préféré selon l'invention est constitué de 12 pentons, dont les séquences des fibres correspondent à celles de l'adénovirns de type 3 (Ad3) et dont les séquences des bases du penton correspondent à celles de l'adénovirus de type 2 (Ad2).
L'utilisation du complexe protéique selon l'invention à la place du virion de l'adénovirus élimine le danger de l'infection fortuite par l'adénovirus et est accompagnée par de beaucoup plus faibles réactions immunitaires et inflammatoires; il est en outre particulièrement stable et la présence des 12 bases du penton augmente de manière significative la vitesse de lyse des endosomes (passage cytoplasmique plus rapide), par rapport à une structure ne contenant qu'un penton.
La présente invention a également pour objet une composition pharmaceutique, caractérisée en ce qu'elle comprend essentiellement un complexe protéique dodécaèdrique adénoviral selon l'invention et au moins une autre substance chimique.
Selon un mode de réalisation avantageux de ladite composition, ladite autre substance chimique est sélectionnée dans le groupe constitué par des séquences nucléiques, des protéines et des substances chimiques pharmacologiquement actives.
Lorsque la substance chimique est une protéine, cette dernière a de préférence des propriétés immunoprotectrices et antigéniques, et est particulièrement bien adaptée à la préparation d'un vaccin.
Lorsque la substance chimique est une substance chimique pharmacologiquement active, elle est notamment sélectionnée parmi les toxines cellulaires, telles que les agents anticancéreux et notamment les anthracyclines.
Dans ce dernier cas, la composition selon l'invention a l'avantage d'éviter le mécanisme de résistance habituellement rencontré avec les anticancéreux. En effet, le développement d'une résistance à une chimiothérapie antitumorale constitue un obstacle majeur au traitement des cancers humains. Cette résistance est due en grande partie à l'induction de l'activité d'une pompe extracellulaire très efficace qui ne permet pas le transport de la substance pharmacologiquement active à l'intérieur de la cellule.
Or, de manière surprenante, la composition selon l'invention permet l'introduction de la substance pharmacologiquement active dans la cellule, en contournant ce mécanisme de résistance.
Lorsque la substance active est une séquence nucléique, elle est sélectionnée parmi les gènes qui codent pour un polypeptide présentant une activité thérapeutique, les séquences anti-sens et les ribozymes.
Dans le cas d'une séquence codante, elle comprend en outre un promoteur actif pour l'expression du polypeptide.
Selon une disposition avantageuse de ce mode de réalisation, le promoteur est sélectionné dans le groupe constitué par des promoteurs constitutifs et des promoteurs inductibles.
Selon un autre mode réalisation avantageux de ladite composition, lorsque ladite substance chimique est une séquence d'acide nucléique ou une protéine, elles peuvent être associées (de manière covalente ou non-covalente) à un ligand convenable.
Selon une disposition avantageuse de ce mode de réalisation, ledit ligand est constitué de transferrine/poly-L-lysine, qui s'associe à ladite séquence nucléique ou à ladite protéine, pour former un conjugué acide nucléique ou protéine et transferrine/poly-L-Lysine, et dans lequel la transferrine se lie aux récepteurs de la transferrine à la surface des cellules cibles.
L'association d'un tel conjugué avec le complexe protéique selon l'invention permet un meilleur transport de la substance chimique, des endosomes vers le cytoplasme.
Un autre mode de transfert des séquences nucléiques ou des protéines est possible, en utilisant une réaction de complexation avidine-biotine et un anticorps anti-fibre, anti-base du penton ou anti-complexe protéique dodécaèdrique.
Une telle composition met en oeuvre : un complexe protéique dodécaèdrique selon l'invention, un anticorps qui réagit soit avec la fibre, soit avec la base du penton, soit avec le complexe protéique dodécaèdrique, mais n'inhibe pas la fonctionnalité dudit complexe protéique, un vecteur contenant une séquence nucléique d'intérêt dans laquelle au moins un nucléotide est biotinylé, éventuellement liée à une séquence marqueur ou une protéine biotinylée et une protéine chimérique consistant en protéine A liée à de la streptavidine (SA-PA). Du fait qu'un nucléotide ou la protéine est biotinylé, ils peuvent se lier à la protéine chimérique SA-PA.Dans une telle composition, I'ADN biotinylé ou la protéine biotinylée se lie à la protéine chimérique SA-PA, le complexe
ADN lié à la SA-PA se lie ensuite via la moitié PA, à un anticorps qui réagit soit avec une fibre, soit avec une base du penton, soit avec le complexe protéique dodécaèdrique. Le produit complexe ainsi formé comprenant PA-anticorps immobilisécomplexe protéique dodécaédrique se lie, par l'intermédiaire du complexe protéique, aux récepteurs spécifiques de ce dernier, exprimés à la surface des cellules cibles.
ADN lié à la SA-PA se lie ensuite via la moitié PA, à un anticorps qui réagit soit avec une fibre, soit avec une base du penton, soit avec le complexe protéique dodécaèdrique. Le produit complexe ainsi formé comprenant PA-anticorps immobilisécomplexe protéique dodécaédrique se lie, par l'intermédiaire du complexe protéique, aux récepteurs spécifiques de ce dernier, exprimés à la surface des cellules cibles.
Dans tous les cas, la séquence d'acide nucléique exogène, la protéine d'intérêt ou toute autre substance chimique, incluse dans ou associée à la composition selon l'invention, pénètre dans la cellule (internalisation) par l'intermédiaire du complexe protéique dodécaédrique selon l'invention.
De manière surprenante, l'interaction dodécaèdre-récepteur cellulaire accroît, de manière significative, à la fois l'internalisation de la composition selon l'invention et la perméabilité des endosomes, ce qui augmente, de manière significative, le passage de l'acide nucléique exogéne, de la protéine d'intérêt ou de toute autre substance chimique, des endosomes vers le cytoplasme, en comparaison avec l'utilisation d'une composition ne contenant qu'un seul penton.
Selon un autre mode de réalisation de ladite composition pharmaceutique, elle comprend, en outre, au moins un véhicule pharmaceutiquement acceptable.
Parmi les véhicules pharmaceutiquement acceptables, on peut citer aussi bien des véhicules adaptés à la voie d'administration recherchée tels que l'eau, des sels, le dextrose, le glycérol, I'éthanol des huiles végétales, le propylène glycol, le polyéthylène glycol, I'alcool berizylique (administration parentérale ou préparations liquides), que des liposomes.
De telles compositions peuvent, en outre, contenir des agents mouillants ou émulsifiants, des agents isotoniques, des agents de dissolution, des stabilisants, des colorants, des agents antiseptiques etc..
Conformément à l'invention, ladite substance chimique active est soit incluse dans ledit complexe protéique dodécaédrique selon l'invention, soit associée audit complexe; dans les deux cas, elle peut être libre ou liée audit complexe.
Les compositions selon l'invention peuvent être administrées sous différentes formes et par différentes voies, telles que voie pulmonaire (aérosol), voie intrapéritonéale, voie parentérale ou implant chirurgical.
Les compositions selon l'invention ont de nombreuses applications comme médicaments, en médecine humaine et vétérinaire:
- en thérapie génique humaine et animale, notamment dans les maladies héréditaires impliquant l'épithélium respiratoire telles que l'emphysème ou la mucoviscidose,
- comme agents antiviraux (séquences anti-sens ou ribozymes),
- comme agents immunogènes ou vaccinaux,
- comme agents anti-bactériens, anti-cancéreux etc...
- en thérapie génique humaine et animale, notamment dans les maladies héréditaires impliquant l'épithélium respiratoire telles que l'emphysème ou la mucoviscidose,
- comme agents antiviraux (séquences anti-sens ou ribozymes),
- comme agents immunogènes ou vaccinaux,
- comme agents anti-bactériens, anti-cancéreux etc...
La présente invention a, également, pour objet une composition comprenant essentiellement un complexe protéique dodécaèdrique adénoviral, tel que défini ci-dessus et une substance chimique sélectionnée parmi les séquences nucléotidiques, les protéines et les substance chimiques actives pharmacologiquement, en tant que médicament.
La présente invention a également pour objet une composition, comprenant un complexe protéique dodécaèdrique adénoviral, tel que défini ci-dessus et une substance chimique sélectionnée parmi les séquences nucléotidiques, les substances immunogènes, et les substances anticancéreuses, pour son utilisation dans le traitement des maladies humaines ou animales impliquant des cellules exprimant des récepteurs spécifiques des fibres d'adénovirus et/ou des cellules exprimant les récepteurs des intégrines, notamment des intégrines chez ou crVPs, telles que les cellules épithéliales, les cellules endothéliales, les plaquettes sanguines, les cellules lymphoïdes et les cellules cancéreuses et libérant une quantité efficace de ladite substance chimique active aux dites cellules.
La présente invention a, en outre, pour objet un procédé de préparation dudit complexe protéique dodécaèdrique adénoviral conforme à l'invention.
Un tel procédé comprend, de préférence les étapes suivantes
(1) le clonage séparé ou simultané du (ou des) gène(s) codant pour la/les fibre(s) d'un adénovirus et du gène codant pour la base du penton d'un adénovirus, lesdits gènes étant issus soit du même adénovirus, soit d'adénovirus différents, dans au moins un vecteur baculovirus, pour l'obtention de plusieurs plasmides recombinants contenant soit un gène, soit deux gènes (expression simultanée des deux fibres dans le cas d'un adénovirus contenant deux fibres par penton) ou pour l'obtention d'un plasmide recombinant contenant simultanément deux gènes (ou trois gènes, dans le cas de l'utilisation d'un adénovirus contenant deux fibres par penton) dans ce dernier cas, le vecteur baculovirus utilisé comprend une cassette de double ou de triple expression;;
(2) la co-transfection du ou des plasmides recombinants et d'un fragment linéarisé d'ADN de baculovirus, dans une cellule d'insecte,
(3) le criblage et la sélection des clones recombinants de baculovirus exprimant, séparément ou à la fois lanes fibres et la base du penton,
(4) la purification des clones sélectionnés correspondant à des baculovirus recombinants replicables, contenant un ou plusieurs desdits gènes, issus d'au moins un adénovirus et exprimant les protéines correspondantes,
(5) I'extraction des protéines exprimées par lesdits baculovirus recombinants, comprenant essentiellement la lyse des cellules d'insecte, I'élimination des débris cellulaires et des noyaux par centrifugation et la récupération du surnageant; et
(6) la purification du complexe protéique dodécaèdrique selon l'invention, par application dudit surnageant (extrait de protéines) sur un gradient de saccharose, dont la fourchette de concentrations varie en fonction du poids moléculaire et de la densité des dodécaèdres obtenus et récupération des fractions, dans la zone des concentrations élevées en saccharose; par exemple, pour les complexes formés à partir d'Ad2 et/ou d'Ad3, le gradient de saccharose varie de 15 à 40 %, et l'on récupère la fraction correspondant à une concentration en saccharose comprise entre 31 et 38 %.
(1) le clonage séparé ou simultané du (ou des) gène(s) codant pour la/les fibre(s) d'un adénovirus et du gène codant pour la base du penton d'un adénovirus, lesdits gènes étant issus soit du même adénovirus, soit d'adénovirus différents, dans au moins un vecteur baculovirus, pour l'obtention de plusieurs plasmides recombinants contenant soit un gène, soit deux gènes (expression simultanée des deux fibres dans le cas d'un adénovirus contenant deux fibres par penton) ou pour l'obtention d'un plasmide recombinant contenant simultanément deux gènes (ou trois gènes, dans le cas de l'utilisation d'un adénovirus contenant deux fibres par penton) dans ce dernier cas, le vecteur baculovirus utilisé comprend une cassette de double ou de triple expression;;
(2) la co-transfection du ou des plasmides recombinants et d'un fragment linéarisé d'ADN de baculovirus, dans une cellule d'insecte,
(3) le criblage et la sélection des clones recombinants de baculovirus exprimant, séparément ou à la fois lanes fibres et la base du penton,
(4) la purification des clones sélectionnés correspondant à des baculovirus recombinants replicables, contenant un ou plusieurs desdits gènes, issus d'au moins un adénovirus et exprimant les protéines correspondantes,
(5) I'extraction des protéines exprimées par lesdits baculovirus recombinants, comprenant essentiellement la lyse des cellules d'insecte, I'élimination des débris cellulaires et des noyaux par centrifugation et la récupération du surnageant; et
(6) la purification du complexe protéique dodécaèdrique selon l'invention, par application dudit surnageant (extrait de protéines) sur un gradient de saccharose, dont la fourchette de concentrations varie en fonction du poids moléculaire et de la densité des dodécaèdres obtenus et récupération des fractions, dans la zone des concentrations élevées en saccharose; par exemple, pour les complexes formés à partir d'Ad2 et/ou d'Ad3, le gradient de saccharose varie de 15 à 40 %, et l'on récupère la fraction correspondant à une concentration en saccharose comprise entre 31 et 38 %.
Selon un mode de mise en oeuvre avantageux dudit procédé, les cellules d'insecte de l'étape (2) sont sélectionnées dans le groupe constitué par les cellules de Spodopterafrugiperda et les cellules de Trichoplusia ni.
En variante, la co-transfection de l'étape (2) est mise en oeuvre dans des cellules de Spodopterafn^giperda et le procédé comprend une deuxième étape (4') de transfection des clones purifiés de baculovirus recombinants obtenus à l'étape (4), dans des cellules d'insecte Trichoplusia ni.
Selon un autre mode de mise en oeuvre avantageux dudit procédé, le vecteur baculovirus comprenant une cassette de double ou de triple expression selon l'étape (1) est un vecteur comprenant deux ou trois promoteurs forts.
On peut citer, par exemple, le vecteur de transfert pAcUW31 (Clontechg), qui comprend (i) le promoteur de la polyédrine et le promoteur p 10, le promoteur de la polyédrine étant suivi d'un site unique de clonage BamHI et des signaux de polyadénylation de la polyédrine, alors que le promoteur p 10 est suivi des sites uniques de clonage Bgl ll et EcoRI et d'un signal de polyadénylation du SV40, (ii) une origine de réplication M13, (iii) une origine de réplication pUC et (iv) un gène reporter, tel que luciférase, ss-galactosidase ou gène de résistance à un antibiotique (ampicilline, par exemple).
Selon un autre mode de mise en oeuvre avantageux dudit procédé, ledit fragment linéarisé d'ADN de baculovirus de l'étape (2) est obtenu à partir d'un vecteur contenant trois sites de restriction Bsu36I et le gène lacZ à la place de la séquence codant pour la polyédrine, par exemple, le vecteur d'ADN viral BacPAK6 (Clontech), lequel vecteur est digéré par l'enzyme de restriction Bsu36I avant ladite co-transfection de l'étape (2).
Selon un autre mode de mise en oeuvre avantageux dudit procédé, la cellule d'insecte Spodopterafrugiperda de l'étape (2) est sélectionnée dans le groupe constitué par les cellules Sf21 et les cellules 519.
Selon un autre mode de mise en oeuvre avantageux dudit procédé, la purification des clones de l'étape (4) est réalisée par la mise en oeuvre d'au moins deux sous-clonages successifs.
Selon un autre mode de mise en oeuvre avantageux dudit procédé, les cellules d'insecte Trichoplusia ni de l'étape (5) sont des cellules BTI-TN-5B1-4 (High Fief9 d'Invitrogen).
En variante, la transfection de l'étape (4') comprend la co-transfection de baculovirus recombinants qui contiennent les deux gènes (ou les trois gènes, dans le cas d'un adénovirus contenant deux fibres par penton), issus d'adénovirus précités, éventuellement associés à des baculovirus recombinants qui contiennent un seul des deux gènes issus d'adénovirus.
Conformément à l'invention, la transfection peut être réalisée par différentes méthodes, selon le vecteur utilisé méthode au phosphate de calcium, méthode au DEAE-dextran, méthode de transfert stable, électroporation.
Selon un autre mode de mise en oeuvre avantageux dudit procédé,
L'étape (5) d'extraction de l'ensemble des protéines exprimées par le baculovirus recombinant sélectionné comprend l'obtention d'un extrait cellulaire par lyse des cellules de Trichoplusia ni, au moyen de plusieurs cycles de congélation-décongélation, dans un tampon Tris 10 mM pH8, I'élimination des débris cellulaires et des noyaux présents dans ledit extrait cellulaire par centrifugation pendant quelques minutes à 7 000-10 000 g et la récupération du surnageant.
L'étape (5) d'extraction de l'ensemble des protéines exprimées par le baculovirus recombinant sélectionné comprend l'obtention d'un extrait cellulaire par lyse des cellules de Trichoplusia ni, au moyen de plusieurs cycles de congélation-décongélation, dans un tampon Tris 10 mM pH8, I'élimination des débris cellulaires et des noyaux présents dans ledit extrait cellulaire par centrifugation pendant quelques minutes à 7 000-10 000 g et la récupération du surnageant.
Selon encore un autre mode de mise en oeuvre avantageux dudit procédé, L'étape (6) de purification du complexe protéique selon l'invention comprend une centrifugation à 121 000 g au haut du tube et à 275 000 g au fond du tube, pendant 17 à 19 heures et à froid (4"C).
Selon encore un autre mode de mise en oeuvre avantageux du procédé, le complexe protéique dodécaèdrique purifiée à l'étape (6) est soumis à une concentration.
Les dodécaèdres natifs sont avantageusement obtenus par extraction des protéines exprimées par des cellules infectées par un adénovirus (voir étape (5) cidessus) et purification du complexe dodécaèdrique sur un gradient de saccharose, dans les mêmes conditions que celles énoncées ci-dessus, pour la préparation des dodécaèdres recombinants.
Outre les dispositions qui précèdent, I'invention comprend encore d'autres dispositions, qui ressortiront de la description qui va suivre, qui se réfere à des exemples de mise en oeuvre du procédé objet de la présente invention ainsi qu'aux dessins annexés, dans lesquels
- la figure 1 représente une vue schématique d'un adénovirus;
- les figures 2A et 2B montrent un dodécaèdre formé de fibres et de bases du penton issus d'un Ad3 (dodécaèdre Ad3) et représentent deux gels d'électrophorèse SDS-PAGE, obtenus à partir des fractions du gradient de saccharose: figure 2A: résultat du transfert de protéine (Western blot ou immuno blot), figure 2B : résultat après coloration au Bleu de Coomasie,
- la figure 3 montre les résultats obtenus à partir de cellules exprimant soit le dodécadèdre Ad3 (a), soit un dodécaèdre formé de fibres issues d'un Ad3 et de bases du penton issues d'un Ad2 (dodécaèdre Ad2/Ad3) (b) et représente des gels d'électrophorèse SDS-PAGE, obtenus à partir des fractions du gradient de saccharose, après transfert de protéine (Western blot ou immuno blot) (a) et (b)
- la figure 4 représente une photo en microscopie électronique du dodécaèdre purifié et concentré à partir de la fraction 31-38 % du gradient de saccharose;
- la figure 5 représente l'accumulation intracellulaire (cellules HeLa) de dodécaèdres conformes à l'invention,
- les figures 6A et 6B illustrent l'internalisation du complexe protéique dodécaêdrique selon l'invention, dans des cellules HeLa.
- la figure 1 représente une vue schématique d'un adénovirus;
- les figures 2A et 2B montrent un dodécaèdre formé de fibres et de bases du penton issus d'un Ad3 (dodécaèdre Ad3) et représentent deux gels d'électrophorèse SDS-PAGE, obtenus à partir des fractions du gradient de saccharose: figure 2A: résultat du transfert de protéine (Western blot ou immuno blot), figure 2B : résultat après coloration au Bleu de Coomasie,
- la figure 3 montre les résultats obtenus à partir de cellules exprimant soit le dodécadèdre Ad3 (a), soit un dodécaèdre formé de fibres issues d'un Ad3 et de bases du penton issues d'un Ad2 (dodécaèdre Ad2/Ad3) (b) et représente des gels d'électrophorèse SDS-PAGE, obtenus à partir des fractions du gradient de saccharose, après transfert de protéine (Western blot ou immuno blot) (a) et (b)
- la figure 4 représente une photo en microscopie électronique du dodécaèdre purifié et concentré à partir de la fraction 31-38 % du gradient de saccharose;
- la figure 5 représente l'accumulation intracellulaire (cellules HeLa) de dodécaèdres conformes à l'invention,
- les figures 6A et 6B illustrent l'internalisation du complexe protéique dodécaêdrique selon l'invention, dans des cellules HeLa.
n doit être bien entendu, toutefois, que ces exemples sont donnés uniquement à titre d'illustration de l'objet de l'invention, dont ils ne constituent en aucune manière une limitation.
EXEMPLE 1: Clonage, expression et purification du dodécaèdre d'adénovirus de type 3.
1. Amplification par PCR des gènes de fibres et de la base du penton.
En utilisant la PCR, il est possible de synthétiser des séquences nucléotidiques codant pour des polypeptides utiles, qui peuvent être insérés dans un vecteur approprié et utilisés pour transformer une cellule spécifique et les exprimer dans cette dernière.
La méthode pour produire les gènes exprimant la base du penton et la fibre du dodécaèdre d'adénovirus selon l'invention dépend de la présélection d'oligonucléotides en tant qu'amorces dans une réaction de polymérisation en chaîne (PCR).
La séquence des gènes de la base du penton et de la fibre de l'Ad3 a été décrite respectivement dans CUZANGE et al., Gene, 1994, 146, 257-259 et
SIGNAS et al., J. Virol., 1985, 53, 672-678.
SIGNAS et al., J. Virol., 1985, 53, 672-678.
Les amorces en 5' et en 3' utilisées pour amplifier le gène codant pour la base du penton sont respectivement 5'-GGATCCGATGAGGAGACGAGCC 3' et 5'-GGATCCTTAGAAAGTGCGGCTTG-3'
Les amorces 5' et 3' utilisées pour amplifier le gène codant pour la fibre sont respectivement 5'-TTTCTTGAATTCCAGATGGCCAAGCGAGCT-3' et 5'-AAAAGGAATTCCAATAAAATGTTG-3'
Les sites de clonage sont soulignés et sont respectivement Bainfli,
BamHI, EcoRI, EcoRI. Le codon d'initiation ATG est en gras et le codon stop TAA (ou TTA dans le brin complémentaire) est en italique.
Les amorces 5' et 3' utilisées pour amplifier le gène codant pour la fibre sont respectivement 5'-TTTCTTGAATTCCAGATGGCCAAGCGAGCT-3' et 5'-AAAAGGAATTCCAATAAAATGTTG-3'
Les sites de clonage sont soulignés et sont respectivement Bainfli,
BamHI, EcoRI, EcoRI. Le codon d'initiation ATG est en gras et le codon stop TAA (ou TTA dans le brin complémentaire) est en italique.
Les séquences des fibres et bases du penton de l'Ad2 et de l'Ad5 sont notamment décrites dans Chroboczek J. et al., Virology, 1987, 161, 549-554 et
Virology, 1992, 186, 280-285 ,Neumann R. et al., Gene, 1988 69, 153-157.
Virology, 1992, 186, 280-285 ,Neumann R. et al., Gene, 1988 69, 153-157.
L'amplification par PCR est réalisée sur les extraits d'ADN isolés à partir du virus, obtenus par propagation dans des cellules HeLa comme décrit dans
HORWITZ ( Adenoviridae and their replication , in Virology, Fields and Knipe, éds. Raven Press, New York, 1990).
HORWITZ ( Adenoviridae and their replication , in Virology, Fields and Knipe, éds. Raven Press, New York, 1990).
Le tampon de PCR contient par exemple: KCI 50 mM, Tris-HCl à pH 8,3 10 mM, MgC12 1,5 mM, gélatine à 0,001%, ATP 200 M, dTTP 200 LM, dCTP 200 llM, dGTP 200 M et 2,5 unités d'ADN polymérase de Thennus aquaticus/100 ul de tampon. La PCR est réalisée dans les conditions suivantes: après dénaturation 2 minutes à 940C, la PCR comprend 25 cycles de 1 min à 94 C, 1 min à 55 C et 1 min à 72 C.
2. Clonage des produits PCR dans le vecteur intermédiaire pCR Scripto.
Le vecteur de clonage pCR-Scripto (Stratagene, Catalogue n 211190, 1994) présente une grande efficacité de ligation d'ADN, lors du clonage des produits PCR.
Les produits de l'amplification PCR sont fractionnés par électrophorèse sur gel d'agarose à 1 % dans un tampon TAE, les bandes convenables sont séparées et l'ADN est extrait selon la procédure GENECLEAN II (BiolOl, Inc.). Les fragments d'ADN contenant les gènes codant pour la base du penton et la fibre sont clonés, de manière séparée, dans le vecteur pCR-Scripta précité selon les indications du fournisseur.
Les clones sont ensuite traités pour obtenir l'ADN, selon le procédé décrit dans Sambrook et al (Molenrlar Cloning, a Laboratory Manuel, deuxième édition), au chapitre concernant les minipréparations d'ADN plasmidique. Dans ces conditions, la présence des gènes codant pour la fibre et la base du penton de l'adénovirus est confirmée, en comparant la taille des fragments obtenus après digestion par BamHI et EcoRI avec des produits standards, sur gel d'agarose.
Les clones positifs sont amplifiés, I'ADN plasmidique est isolé et les gènes de la fibre et de la base du penton sont obtenus après digestion avec les mêmes enzymes de restriction (BamHI et EcoRI), conformément aux méthodes de génie génétique usuellement utilisées dans le clonage moléculaire.(Sambrook et al, précité).
3. Clonage des gènes de fibres et de base du penton dans un vecteur d'expression.
Le vecteur de double-expression pAcUW31 (Clontech) est utilisé pour exprimer le dodécaèdre.
Premièrement, le gène de la base du penton est introduit au niveau du site BamHI de ce vecteur, en amont du promoteur de la polyédrine. Le clonage est vérifié par hybridation avec une sonde non-radioactive correspondant à la base du penton contenant du dUTI > lié à de la fluorescéine conformément à la procédure du kit ECL L'orientation de l'insert par rapport au promoteur est déterminée dans les clones positifs par une analyse de restriction.
Dans une seconde étape, le gène codant pour la fibre est inséré au niveau du site EcoRI dudit vecteur, en aval du promoteur du gène p10. Le clonage et l'orientation de l'insert sont vérifiés comme précisé ci-dessus.
La séquence du gène codant pour la base et du gène codant pour la fibre sont vérifiées dans le plasmide résultant. Aucune mutation n'est détectée. De manière similaire, les vecteurs qui portent seulement soit le gène codant pour la fibre, soit le gène codant pour la base du penton sont préparés et analysés comme décrit cidessus.
Les plasmides d'expression qui portent soit les deux gènes, soit l'un des deux gènes d'intérêt, sont transformés dans une souche d'E. coli TG-1, comme décrit dans HANAHAN (J. Mol. Biol.,1983, 166, 557-580) et une purification du
plasmide à grande échelle est réalisée en utilisant les techniques de génie génétique bien
connues (Sambrook et al,, précité).
plasmide à grande échelle est réalisée en utilisant les techniques de génie génétique bien
connues (Sambrook et al,, précité).
On peut également, si nécessaire (dans le cas de l'utilisation d'adénovirus comprenant deux fibres), mettre en oeuvre un vecteur de triple expres
sion, tel que décrit dans A.J. Belyaev et T. Roy (N.A.R., 1993, 21, 1219-1223).
sion, tel que décrit dans A.J. Belyaev et T. Roy (N.A.R., 1993, 21, 1219-1223).
4. Transfection dans des cellules d'insectes.
Les plasmides recombinants (100 ng) sont (séparément) cotransfectés avec un baculovirus linéarisé (Clontech ADN viral BacPAK6 digéré par l'enzyme Bru361) en présence de lipofectinet (GIBCO) dans des cellules de Spodoptera frugiperda (Sf2 1) et des cellules de Trichoplusia ni (High-Five) selon la technique décrite par KITTS et al. (N.A.R., 1990, 18, 19, 5667-5672). Cette méthode permet d'obtenir une efficacité de transformation supérieure à 80 %. Quelques clones sont choisis dans chaque cas et l'expression est détectée par la technique en Western bic t, réalisée avec des anticorps de lapin polyclonaux spécifiques des antigènes de fibres et de bases du penton.
5. Purification des clones positifs.
Les isolats de baculovirus recombinants sont soumis à 3 repiquages sur plaques, suivis d'un titrage selon la méthode de KING et POSSEE (The baculovirus expression system, A Iaboratory guide, L.A. KING and R.D. POSSEE, ed.:
CHAPMAN & HALL, 1992). L'expression des deux protéines est suivie par la technique en Western blot telle que précisée ci-dessus.
CHAPMAN & HALL, 1992). L'expression des deux protéines est suivie par la technique en Western blot telle que précisée ci-dessus.
6. Purification de la protéine.
La cinétique de l'expression de dodécaèdre est suivie dans les deux types de cellules pendant 5 jours, sur les cellules adhérentes, cultivées à 27"C sur milieu
TC 100 GIBCO contenant 5 % de sérum de veau fétal (cellules Sf21 ou Sf9) ou sur milieu TC 100 GIBCO contenant 10 % de sérum de veau fétal (cellules High Fivs')).
TC 100 GIBCO contenant 5 % de sérum de veau fétal (cellules Sf21 ou Sf9) ou sur milieu TC 100 GIBCO contenant 10 % de sérum de veau fétal (cellules High Fivs')).
Dans la mesure où le rendement en expression protéique est significativement plus important dans les cellules High-Fivet', une expression de protéines à grande échelle est réalisée uniquement dans ces cellules.
Les essais pour augmenter le taux d'expression par co-transfection dans des cellules d'insectes avec un baculovirus portant les deux gênes et différentes quantités de baculovirus ne portant qu'un seul gène, n'ont pas été significatifs.
3 jours après l'infection avec le baculovirus recombinant (multiplicité de l'infection 5), des cellules High-FiveX sont récoltées dans un tampon Tris 10 mM pH 8, contenant des inhibiteurs de la protéase.
La lyse cellulaire est réalisée en mettant en oeuvre 3 cycles de congélation-décongélation dans le même tampon Tris. L'extrait de la lyse est débarrassé des éléments solides (débris cellulaires et noyaux) par centrifugation pendant 5 min à 7 000-10 000 g, puis est soumis à un gradient de saccharose variant de 15 à 40 % (11 ml) dans un tampon de gradient comprenant du glycérol 10 %, NaCI 150 mM, Tris-HC1 10 mM pH 7,4 et EDTA 2 mM.
Après 18 heures de centrifugation à 4"C dans un rotor Beckman SW 41, à 121 000 g, en haut du tube et à 275 000g en bas du tube, I'échantillon ainsi traité est récupéré par le haut, par fractions de 800 1.
Dans ces conditions, le dodécaèdre est récupéré dans les fractions contenant 31-38 % de saccharose. Ces fractions sont mélangées et dialysées contre un tampon de gradient sans saccharose et glycérol.
Le dodécaèdre est concentré par centrifugation sur Centritrep (Amicon).
Les figures 2A et 2B illustrent les résultats obtenus après purification du dodécaèdre: elles sont obtenues à partir d'aliquots de chaque fraction, obtenue à partir du gradient de saccharose comme décrit ci-dessus, dénaturés à la chaleur en présence de SDS à 1 % et électrophorèse dans deux gels SDS-polyacrylamide à 10 %, les protéines sont analysées sur l'un des gels par transfert de protéines, suivi d'une réaction avec des anticorps spécifiques anti-fibre et anti- base du penton (Western blot) (figure 2A) et sur le deuxième gel, par coloration au Bleu de Coomasie Brilliant. Les fractions situées en haut du tube contiennent les bases du pentons et fibres libres et les fractions récupérées dans la zone 31-38 % de saccharose, contiennent le complexe protéique dodécaèdrique selon l'invention.
Les figures 3 (a) et (b) illustrent les résultats comparatifs obtenus dans les mêmes conditions qu'à la figure 2A, après purification d'un dodécaèdre Ad3 (a) et d'un dodécaèdre Ad2/Ad3 (b).
La figure 4 illustre une photographie en microscopie électronique du dodécaèdre purifié, l'échantillon de matériel obtenu après centrifugation du gradient de saccharose variant de 31 à 38 % est mélangé, dialysé et concentré comme précisé ci-dessus.
La protéine est colorée négativement avec du silicotungstate de sodium à 1 % et soumise à une microscopie électronique à faible dose (grossissement 169 000).
EXEMPLE 2 : Accumulation intracellulaire de dodécaèdres.
La figure 5 illustre l'accumulation intracellulaire de dodécaèdre. Des cellules HeLa sont cultivées dans des plaques contenant 96 puits (Falcon) à 5.104 cellules/puits.
Des quantités croissantes (30 à 500 ng) de dodécaèdre sont ajoutées à chaque puits et incubées avec des cellules pendant 3 heures à 4"C ou pendant 2 heures à 37"C dans un tampon PBS-BSA à 3 %. Les cellules sont lavées deux fois avec du PBS, puis fixées et perméabilisées avec du méthanol froid. Ces cellules sont ensuite incubées avec des anticorps dirigés soit contre la fibre (1:500), soit contre la base du penton (1:500) et ensuite incubées avec un anticorps anti-lapin conjugué à la fluorescéine (1:100; Cappel). La fluorescence résultante est mesurée avec un système de mesure de fluorescence (Cytofluora 2350 Millipore).
Les figures 5 et 6 illustrent l'internalisation du dodécaèdre dans les cellules HeLa. La figure 5 qui comprend en abscisse la quantité de dodécaèdre (en ng) et en ordonnée l'intensité de fluorescence, illustre ces résultats (courbe -A- : incubation à 37"C en présence d'anticorps anti-fibre, courbe -A-: incubation à 37"C, en présence d'anticorps anti-base courbe -O-: incubation à 4"C, en présence d'anticorps antibase).
Pour réaliser les photos illustrées aux figures 6A et 6B, des portions de 5.104 cellules HeLa sont cultivées dans un milieu DMEM contenant 10 % de sérum de veau fétal, sur lamelles (diamètre: 1,2 cm). Chaque lamelle est incubée 2 heures à 4"C avec 1 ug de dodécaèdre dans 50 u1 de PBS-BSA à 3 %. Les cellules sont lavées 2 fois avec du PBS froid et incubées à 37"C dans du PBS-BSA à 3 % pendant 0 à 45 min.Les cellules sont fixées et perméabilisées par un traitement au méthanol pendant 5 min à -20 C. Les lamelles sont ensuite incubées pendant 1 heure 137"C avec un anticorps contre la fibre (1:200, 50 u1 dans du PBS-BSA à 3 %lamelle), lavées 2 fois avec du PBS, puis incubées pendant 30 min avec un anticorps conjugué à la fluorescéine (1:250, 50 RI dans du PBS-BSA à 3 %/lamelle). Après un dernier lavage dans du
PBS, les lamelles sont montées sur une plaque de microscope avec une goutte de 1,4diazabicyclo[2.2.2.]octane (Sigma) à 50 mg/ml dans du glycérol à 50 %-PBS à 50 %.
PBS, les lamelles sont montées sur une plaque de microscope avec une goutte de 1,4diazabicyclo[2.2.2.]octane (Sigma) à 50 mg/ml dans du glycérol à 50 %-PBS à 50 %.
Les observations sont réalisées sur un microscope confocal MRC600 (Bio-Rad).
Aussi bien la figure 5 que les figures 6 montrent qu'après incubation à 4"C (figure 5, courbe -O-), il y a seulement attachement du complexe protéique dodécaêdrique auxdites cellules, alors qu'à 37"C (figure 5, courbes -A- et -A-), il y a internalisation dudit complexe.
La figure 6 illustre plus particulièrement le devenir du complexe protéique dodécaêdrique (ou dodécaêdre) dans des cellules HeLa: à 4"C, le dodécaèdre est à la surface des cellules (visible après coloration avec un anticorps anti-fibre, voir figure 5); lorsque les cellules HeLa sont transférées à 37"C, la figure 6 illustre l'évolution de l'intemalisation du dodécaèdre, en fonction du temps: jusqu'à 5 minutes, I'image est très similaire (pas d'internalisation) ; après 10-15 minutes (figure 6A) d'incubation, on observe un transfert massif du dodécaèdre au voisinage de la membrane nucléaire. Une incubation plus longue (2045 minutes, figure 6B) montre un signal plus diffus, ce qui illustre l'évacuation cytoplasmique du dodécaèdre. Des résultats similaires sont obtenus lorsque le devenir du dodécaèdre est suivi avec un sérum anti-base.
Ainsi que cela ressort de ce qui précède, l'invention ne se limite nullement à ceux de ses modes de mise en oeuvre, de réalisation et d'application qui viennent d'être décrits de façon plus explicite, elle en embrasse au contraire toutes les variantes qui peuvent venir à l'esprit du technicien en la matière, sans s'écarter du cadre, ni de la portée, de la présente invention.
Claims (2)
1") Complexe protéique adénoviral, caractérisé en ce qu'il est constitué exclusivement de 12 pentons, comprenant chacun au moins une fibre et une base de penton, lesquelles fibre(s) et base du penton sont dérivées soit du même adénovirus, soit d'adénovirus différents, lesdits pentons étant liés par les bases de penton et formant une structure en dodécaèdre, stable aux enzymes protéolytiques, lequel complexe présente un poids moléculaire compris entre 4,8.106 et 6,6.106
3 ) Complexe protéique dodécaèdrique selon la revendication 1 ou la revendication 2, caractérisé en ce que l'un des pentons est modifié pour augmenter l'affinité vis-à-vis d'un type cellulaire particulier.
4 ) Composition pharmaceutique, caractérisée en ce qu'elle comprend essentiellement un complexe protéique dodécaèdrique adénoviral selon l'une quelconque des revendications 1 à 3 et au moins une autre substance chimique.
5 ) Composition selon la revendication 4, caractérisée en ce que ladite substance chimique est sélectionnée dans le groupe constitué par des séquences nucléiques, des protéines et des substances chimiques pharmacologiquement actives.
6 ) Composition selon la revendication 4 ou la revendication 5, caractérisée en ce que lorsque la substance chimique est une protéine, elle présente, de préférence, des propriétés immunoprotectrices et antigéniques, et en ce que lorsque la substance chimique est une substance chimique pharmacologiquement active, elle est notamment sélectionnée parmi les toxines cellulaires.
7 ) Composition selon la revendication 4 ou la revendication 5, caractérisée en ce que lorsque la substance chimique est une séquence nucléique, elle est sélectionnée parmi les gènes qui codent pour un polypeptide présentant une activité thérapeutique, les séquences anti-sens et les ribozymes.
8 ) Composition selon la revendication 7, caractérisée en ce que lorsqu'elle comprend une séquence codante, elle comprend en outre un promoteur actif pour l'expression du polypeptide, lequel promoteur est sélectionné dans le groupe constitué par des promoteurs constitutifs et des promoteurs inductibles.
9 ) Composition selon l'une quelconque des revendications 4, 5, 7 ou 8, caractérisée en ce que lorsque ladite substance active est une séquence d'acide nucléique ou une protéine, elles peuvent être associées à un ligand convenable.
10 ) Composition selon l'une quelconque des revendications 4 à 9, caractérisée en ce qu'elle comprend, en outre, au moins un véhicule pharmaceutiquement acceptable.
11") Composition comprenant essentiellement un complexe protéique dodécaêdrique adénoviral et une substance chimique sélectionnée parmi les séquences nucléotidiques, les protéines et les substance chimiques actives pharmacologiquement, selon l'une quelconque des revendications 4 à 10, en tant que médicament.
12") Composition, comprenant un complexe protéique dodécaédrique adénoviral et une substance chimique sélectionnée parmi les séquences nucléotidiques, les substances immunogènes, et les substances anticancéreuses, selon l'une quelconque des revendications 4 à 10, pour son utilisation dans le traitement des maladies humaines ou animales impliquant des cellules exprimant des récepteurs spécifiques des fibres d'adénovirus et/ou des cellules exprimant les récepteurs des intégrines, notamment des intégrines chez ou aVss5, telles que les cellules épithéliales, les cellules endothéliales, les plaquettes sanguines, les cellules lymphoïdes et les cellules cancéreuses et libérant une quantité efficace de ladite substance chimique active aux dites cellules.
(6) la purification du complexe protéique dodécaèdrique, par application de l'extrait obtenu en (5) sur un gradient de saccharose, dont la fourchette de concentrations varie en fonction du poids moléculaire et de la densité des dodécaèdres obtenus et récupération des fractions, dans la zone des concentrations élevées en saccharose.
(5) I'extraction des protéines exprimées par lesdits baculovirus recombinants ; et
(4) la purification des clones sélectionnés correspondant à des baculovirus recombinants replicables, contenant un ou plusieurs desdits gênes, issus d'au moins un adénovirus et exprimant les protéines correspondantes,
(3) le criblage et la sélection des clones recombinants de baculovirus exprimant, séparément ou à la fois la/les fibres et la base du penton,
(2) la co-transfection du ou des plasmides recombinants et d'un fragment linéarisé d'ADN de baculovirus, dans une cellule d'insecte,
(1) le clonage séparé ou simultané du (ou des) gène(s) codant pour la/les fibre(s) d'un adénovirus et du gène codant pour la base du penton d'un adénovirus, lesdits gènes étant issus soit du même adénovirus, soit d'adénovirus différents, dans au moins un vecteur baculovirus, pour l'obtention de plusieurs plasmides recombinants contenant soit un gêne, soit deux gènes ou pour l'obtention d'un plasmide recombinant contenant simultanément deux ou trois gènes,
13 ) Procédé de préparation dudit complexe protéique dodécaèdri- que, dérivé d'un adénovirus selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes
14") Procédé selon la revendication 13, caractérisé en ce que le vecteur baculovirus utilisé comprend une cassette de double ou de triple expression incluant deux ou trois promoteurs forts.
15 ) Procédé selon la revendication 13 ou la revendication 14, caractérisé en ce cellules d'insecte de l'étape (2) sont sélectionnées dans le groupe constitué par les cellules de Spodopterafrugiperda et les cellules de Trichoplusia ni.
16 ) Procédé selon l'une quelconque des revendications 13 à 15, caractérisé en ce que la co-transfection de l'étape (2) est mise en oeuvre dans des cellules de Spodoptera frugiperda et le procédé comprend une deuxième étape (4') de transfection des clones purifiés de baculovirus recombinants obtenus à l'étape (4), dans des cellules d'insecte Trichoplusia ni.
17 ) Procédé selon l'une quelconque des revendications 13 à 16, caractérisé en ce que la cellule d'insecte Spodoptera frugiperda de l'étape (2) est sélectionnée dans le groupe constitué par les cellules Sf21 et les cellules Sf9.
18 ) Procédé selon la revendication 16, caractérisé en ce que la transfection de l'étape (4') comprend la co-transfection de baculovirus recombinants qui contiennent les deux gènes issus d'adénovirus précités, éventuellement associés à des baculovirus recombinants qui contiennent un seul des deux gènes issus d'adénovirus.
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| EP96938303A EP0861329B1 (fr) | 1995-11-13 | 1996-11-13 | Complexe proteique dodecaedrique adenoviral, composition le contenant et ses applications |
| DE69634489T DE69634489T2 (de) | 1995-11-13 | 1996-11-13 | Adenovirus dodekahedrischer proteinkomplex, dieser enthaltende zusammensetzung und verwendungen davon |
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|---|---|---|---|---|
| WO1994017832A1 (fr) * | 1993-02-09 | 1994-08-18 | The Scripps Research Institute | Ciblage et transport de genes et d'agents antiviraux dans des cellules par l'adenovirus penton |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| L. KARAYAN ET AL: "Oligomerization of recombinant penton base of Adenovirus Type 2 and its assembly with fiber in Baculovirus-infected cells", VIROLOGY, vol. 202, no. 2, 1994, ORLANDO US, pages 782 - 795, XP002012045 * |
| M.-L. BOUDIN ET AL: "Assembly of Adenovirus penton base and fiber", VIROLOGY, vol. 116, 1982, ORLANDO US, pages 589 - 604, XP000565558 * |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2010117287A3 (fr) * | 2009-04-10 | 2011-06-30 | Instytut Bio Chemii I Biofizki Pan | Vecteur de particule de type virus destiné à l'administration d'agents pharmaceutiques, procédé de fabrication correspondant, utilisations correspondantes et composition pharmaceutique |
| WO2010151159A2 (fr) | 2009-06-26 | 2010-12-29 | Instytut Biochemii I Biofizyki | Vecteur de particules de type virus comme plateforme polyvalente pour une distribution intracellulaire de substances thérapeutiques de poids moléculaire élevé, procédé pour générer un vecteur de particules de type virus et utilisation d'un vecteur de particules de type virus et composition pharmaceutique contenant ledit vecteur de particules de type virus |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| FR2741087B1 (fr) | 1998-01-09 |
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