FR2723203A1 - Procede de detection et/ou de quantification de composes infectueux autres que viraux et support pour la mise en oeuvre du procede - Google Patents

Procede de detection et/ou de quantification de composes infectueux autres que viraux et support pour la mise en oeuvre du procede Download PDF

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Abstract

L'invention concerne un procédé de détection et/ou de quantification de composés infectieux non viraux (CInV) existant dans un milieu, caractérisé par le fait que l'on fixe la glycoprotéine beta2GPI sous au moins une de ses formes au(x) CInV et que l'on détecte et/ou quantifie le complexe (CInV/ beta2GPI) ainsi formé.L'invention concerne aussi un support sur lequel est fixée une beta2-glycoprotéine pour la mise en oeuvre d'une variante du procédé.

Description

PROCÉDÉ DE DÉTECTION ET/OU DE QUANTIFICATION DE
COMPOSÉS INFECTIEUX AUTRES QUE VIRAUX ET SUPPORT
POUR LA MISE EN OEUVRE DU PROCEDE
La présente invention concerne un procédé de détection et/ou de quantification de composés infectieux autres que viraux et un support pour la mise en oeuvre de l'une des variantes du procédé.
Selon la présente invention, on entend par composé infectieux autre que viral, ci-après en abrégé "CInV", aussi bien des composés, en particulier protéiniques, constitutifs d'un agent infectieux autre que viral, que des structures infectieuses de type autre que virales. Les structures infectieuses de type autre que viral sont ou bien des agents infectieux non viraux, complets ou incomplets, ou bien des assemblages contenant des composés constitutifs de ces agents infectieux, assemblages qui présentent certaines propriétés desdits agents infectieux, notamment la propriété d'être détectés par certains anticorps spécifiques de composés infectieux autres que viraux. Les
CInV peuvent être aussi des composés spécifiquement induits dans l'organisme par les CInV précédemment définis.
La ss2-glycoprotéine I, ci-après en abrégé B2GPI, est une glycoprotéine plasmatique, qui a été notamment séquencée dans les articles de J. LOZIER et coll. Proc. Natl. Acad. Sci. ISA, Vol. 81, pages 3640-3644, Juillet 1984 et de T. KRISTENSEN et coll., FEBS
Letters, Vol. 289, 1991, pages 183-186. La ss2-glycoprotéine I est également appelée Apolipoprotéine H (en abrégé ApoH). Les 20 premiers acides aminés de cette glycoprotéine à compter de l'extrémité
N-terminale sont les suivants : Gly-Arg-Thr-Cys-Pro-Lys-Pro-Asp Asp-Leu-Pro-Phe-Ser-Thre-Val-Val-Pro-Leu-Lys-Thre .
Dans la demande internationale PCT/FR 94/00142 déposée le 9 Février 1994 et non publiée à ce jour, on a indiqué que certains composés viraux se fixaient de façon spécifique sur une forme de B2GPI, à savoir la B2'-glycoprotéine I, ci-après en abrégé B2'GPI, que cette glycoprotéine soit à l'état pur ou dans une composition protéinique la contenant. On a, en conséquence, proposé un procédé de détection et/ou de dosage de composés viraux, caractérisé par le fait que l'on fixe les composés viraux à l'aide de la ss2'GPI. Dans un tel procédé, on ajoute donc la ss2'GPI sur des composés viraux contenus dans un matériau biologique, de façon à séparer les composés viraux pour ensuite les détecter.
La B2'GPI est la glycoprotéine isolée à partir du résidu fixé sur la (les) colonne(s) de chromatographie d'affinité utilisée(s) dans le procédé de purification de l'albumine du plasma sanguin décrit dans
FR-A 2 690 444. Selon ce document, on sépare l'albumine des autres protéines par un procédé chromatographique en phase liquide, dans lequel on fait passer la solution aqueuse contenant l'albumine dans au moins une colonne de chromatographie dite "hydrophobe" remplie d'un matériau particulaire apte à retenir une partie des protéines autres que l'albumine ; pour compléter la séparation, on propose également de faire passer la solution aqueuse d'albumine dans au moins une colonne de chromatographie d'affinité contenant un support particulaire neutre ou voisin de la neutralité chargé d'un composé polysulfaté. L'effluent obtenu par ce procédé est constitué par une solution d'albumine purifiée, la majeure partie des protéines autres que l'albumine étant fixée, soit sur la (les) colonne(s) de chromatographie hydrophobe, soit sur la (les) colonne(s) de chromatographie d'affinité. En soumettant le support de la (des) colonne(s) de chromatographie d'affinité précitée(s) à une élution, de préférence à une élution par augmentation de la force ionique, on obtient une composition protéinique dont le contenu protéinique comporte de 5 à 100 Sc en poids de B2'GPI.
La ss2'GPI a un poids moléculaire de 50 000 + 3 000 daltons ; les 20 premiers acides aminés de la région N-terminale de la
B2'GPI sont ceux identifiés pour la 02GUI et la séquence des acides aminés 315 à 321 est Phe-Trp-Lys-Ser-Asp-Ala-Ser.
Selon la présente invention, on a trouvé que certains CInV se fixaient de façon spécifique sur la B2GPI sous au moins une de ses formes en constituant un complexe (CInV/B2GPI). Selon la présente invention, on utilise cette propriété pour capter les CInV, les détecter et/ou les quantifier.
La fixation de la 02GUI à certains CInV peut être directe ou indirecte, médiée ou favorisée par certains adjuvants qui peuvent être chimiques, biochimiques, ou biologiques, tels certains lipides ou détergents.
La présente invention a donc pour objet un procédé de détection et/ou de quantification de CInV existants dans un milieu, caractérisé par le fait qu'on fixe la B2GPI, sous au moins une de ses formes, au(x) CInV et que l'on détecte et/ou quantifie le complexe ainsi formé.
Selon la présente invention, on peut utiliser, comme forme de B2GPI, la ss2'GPI pure ou sous forme de composition protéinique contenant, en particulier, d'autres glycoprotéines. Cette composition peut, en particulier, être celle obtenue par élution d'une colonne d'affinité sur un gel portant des groupes sulfates comme décrit dans la demande de brevet français 93-01399. Par ailleurs, la ss2GPI utilisée pour la fixation au(x) CInV peut, suivant les modes de mise en oeuvre du procédé, avoir été ou non préalablement marquée, par exemple au moyen d'une enzyme, d'un produit radioactif ou d'un produit fluorescent ou d'un agent métallique.
La détection et/ou la quantification, par dosage ou numération par exemple, est faite dans un milieu, qui peut être soit dans un matériau biologique, c'est-à-dire, ou un tissu biologique ou une préparation, un extrait ou une culture issue d'un tissu biologique, soit un milieu naturel ou une préparation ou un extrait ou une culture qui en sont issus.
Les CInV susceptibles d'être reconnus par la B2'GPI sont plus particulièrement - pour les bactéries : Borellia - pour les parasites : Leishmania infantum, Plasmodium falciparum,
Toxoplasma gondii, Entamoeba histolytica - pour les champignons : Candida krusei, Aspergillus fumigatus.
Pour mettre en oeuvre le procédé selon l'invention, on peut effectuer la détection de CInV sans fixation préalable du complexe (CInV/B2GPI) sur un support ou avec fixation dudit complexe sur un support par un élément constitutif du complexe ; dans le premier cas, la détection et/ou la quantification s'effectue dans le milieu où le complexe s'est formé, après fixation dudit milieu par une méthode physique, chimique ou biochimique, par exemple sur une surface, ou sans fixation dudit milieu ; dans le deuxième cas, le support peut, avantageuse ment, être un support solide. Lorsqu'on fixe le complexe sur un support, la fixation peut s effectuer par la partie B2GPI du complexe : dans ce cas, on peut avantageusement fixer la ss2GPI sur le support avant la formation du complexe, puis former le complexe (CInV/ss2GPI) et, ensuite, détecter et/ou quantifier le(s) CInV. Selon un autre mode de mise en oeuvre, l'élément constitutif du complexe fixé sur un support est le(s) CInV ; avantageusement, cette fixation est effectuée avant complexation avec la B2GPI, après quoi on réalise la formation du complexe (CInV/B2GPI) puis on détecte etlou on quantifie la B2GPI complexée ; on peut, avantageuse ment, former le complexe avec une 62GUI préalablement marquée.
Selon un premier mode de mise en oeuvre préféré du procédé, on fixe, de façon connue, la B2GPI sur un support, on fixe ensuite sur la B2GPI au moins un composé CInV contenu dans un milieu pour constituer un complexe (CInV/B2GPI), on sépare le(s)dit(s)
CInV complexe(s) des composés, qui ne sont pas fixés sur la B2GPI, et on détecte et/ou quantifie le(s) CInV fixé(s) sur la ss2GPI par tout procédé connu de détection et/ou de quantification du(des) CInV. Il faut noter que, lorsque l'on utilise une composition protéinique contenant la ss2GPI, sous au moins une de ses formes, et des contaminants, ces contaminants peuvent également se fixer sur le support. On utilise, de préférence, un support solide, plus particulièrement constitué par une microplaque de titration, par exemple une microplaque ELISA, ou une membrane, par exemple de nitrocellulose.
La fixation de la B2GPI sur le support se fait avantageusement par réaction de groupes réactifs de la glycoprotéine avec des sites réactifs du support. Cette réaction est, de préférence, effectuée à une température de 0 à 40"C, la ss9GPI étant, de préférence, mise dans un tampon ayant un pH compris entre 4,5 et 10,5, de préférence entre 5,5 et 6,5. Le tampon peut être du type phosphate ou acétate. La solution obtenue a avantageusement une concentration comprise entre 0,01 à 100 mg/l de B2GPI. Le support est avantageusement maintenu en contact avec le tampon contenant la ss2GPI à une température de 0 à 40"C et pendant un temps d'incubation compris entre 30 minutes et 3 jours.
Après incubation, on sépare du support le tampon contenant la B2GPI n'ayant pas réagi et on effectue avantageusement un lavage du support, de préférence avec le même tampon que celui qui contenait la B2GPI. Il peut être nécessaire de saturer les sites actifs du support, qui n'ont pas réagi avec la B2GPI ou avec des contaminants.
Dans ce cas, on fait réagir sur ces sites actifs d'autres groupes actifs on utilise avantageusement, dans ce but, une solution d'albumine sérique bovine ou de caséine, en particulier une solution à 2 % dans le tampon utilisé pour la ss2GPI. Après réaction, le support est de préférence, rincé et séché.
Le support sur lequel est ainsi fixée la ss9GPI est ensuite mis en contact avec un milieu susceptible de contenir des CInV. Ce milieu est plus particulièrement, soit préparé à partir de tissus, d'organes, de selles ou de liquides biologiques d'un malade atteint d'une infection non virale, par exemple bactérienne, parasitaire, mycosique ou mycoplasmmique, soit obtenu à partir de cultures "in vitro" ; un tel liquide biologique peut être un sérum, du plasma, de l'urine, du liquide céphalorachidien, du liquide synovial, du liquide péritonéal, du liquide pleural, du liquide séminal ou du liquide ascitique, soit obtenu à partir d'un milieu naturel (eau d'écoulement, par exemple). On dilue, de préférence, le fluide biologique à l'aide d'un tampon donnant un pH compris entre 4,5 et 10, avantageusement 5,6. La réaction est, de préférence. effectuée à une température de 00C à 40"C, avantageusement voisine de 37"C, pendant une période de 30 minutes à 24 heures. On sépare ensuite le fluide biologique et le support portant la B2GPI, qui a éventuellement fixé un CInV. On peut effectuer ensuite un lavage avec une solution, tamponnée de préférence.
La détection et/ou la quantification du CInV complexé sur la B2GPI peuvent se faire par tout moyen connu, tel l'infectiosité, des réactions enzymatiques, ou la détection d'acides nucléiques spécifiques par la technique dite "Polymerase Chain Reaction (PCR)". Cette technique est, par exemple, décrite dans l'article de MULLIS K.B. et
FALOONA F.A. dans Methods Enzymol. 1987 155 pages 335-350. La détection et/ou la quantification se font, de préférence, à l'aide d'un anticorps reconnaissant spécifiquement les structures des CInV à détecter. De façon connue, cet anticorps peut être conjugué à un marqueur, avantageusement à un marqueur enzymatique, comme de la peroxydase. L'excès d'anticorps est éliminé par lavage, si besoin est.
On ajoute ensuite, de façon connue, un substrat spécifique de l'enzyme conjuguée à l'anticorps, substrat qui se transforme, dans des conditions fixées, en un produit coloré. La formation dudit composé coloré indique la présence du CInV recherché et permet sa quantification.
Selon un second mode de mise en oeuvre préféré du procédé selon l'invention, on fixe le(s) CInV, spécifiquement si l'on veut une détection spécifique, sur un support et on le révèle avec la ss2GPI, avantageusement conjuguée à un marqueur. Le CInV peut être fixé, soit directement sur le support, soit indirectement, par exemple par l' intermédiaire d'un anticorps. Le marqueur peut, avantageusement, être une enzyme, un produit radioactif. ou un produit fluorescent. Le support solide, sur lequel on fixe le(s) CInV, peut être une membrane, par exemple de nitrocellulose, ou une microplaque de titration, par exemple une microplaque ELISA. La fixation du CInV sur le support peut se faire par réaction de groupes réactifs du CInV sur les sites réactifs du support lorsque la fixation est directe, ou par fixation d'un composé, par exemple un anticorps, sur les sites réactifs du support et fixation du CInV sur ledit composé préalablement fixé sur le support. Cette réaction est, de préférence, effectuée à une température de 0 à 40"C, le CInV étant, de préférence, mis dans un tampon ayant un pH compris entre 4,5 et 10,5, de préférence entre 6,5 et 7,5 ; le tampon peut être du type phosphate ou acétate. Le support est avantageusement maintenu en contact avec le tampon contenant le
CInV à une température de 0 à 40"C et pendant un temps d'incubation compris entre 30 minutes et 24 heures. Après incubation, on sépare du support le tampon contenant le CInV n'ayant pas réagi et on effectue un lavage du support, de préférence avec le même tampon que celui qui contenait le CInV. Il peut être nécessaire de saturer les sites actifs du support qui n'ont pas réagi avec le CInV ; dans ce cas, on fait réagir sur ces sites actifs d'autres groupes actifs. On utilise avantageusement, dans ce but, une solution d'albumine sérique bovine ou de caséine.
Après réaction, le support est, de préférence, rincé et séché.
Le support, sur lequel est fixé le CInV, est ensuite mis en contact avec une solution de ss2GPI conjuguée à un marqueur. On dilue, de préférence, la solution contenant la B2GPI à l'aide d'un tampon donnant un pH compris entre 4,5 et 10, avantageusement 5,6.
La réaction est, de préférence, effectuée à une température de 00C à 40"C, avantageusement voisine de 37"C, pendant une période allant de 30 minutes à 24 heures. On sépare ensuite la solution contenant la ss2GPI, qui n'a pas réagi, du support portant le CInV, qui a éventuellement fixé la B2GPI. On peut effectuer ensuite un lavage avec une solution, tamponnée de préférence.
La détection et/ou la quantification du CInV reconnu par la
B2GPI est effectuée en ajoutant un substrat spécifique du marqueur conjugué à la g2GPI, lorsque le marqueur est une enzyme, ou par mesure de la radioactivité, lorsque le marqueur est radioactif, ou par mesure de la fluorescence, lorsque le marqueur est fluorescent.
Selon un troisième mode de mise en oeuvre préféré du procédé, on forme, à partir d'un milieu contenant le(s) CInV, le complexe (B2GPI/CInV). Le milieu peut être fixé par toute méthode physique, chimique ou biochimique avant ou après complexation. On procède ensuite à l'identification du complexe par ses deux éléments l'élément B2GPI pourra avoir été préalablement marqué à cet effet, directement ou indirectement, notamment par un anticorps spécifique.
L'élément CInV ayant fixé la 02GUI peut être détecté ou visualisé par tout moyen approprié ; ainsi, par exemple, on peut détecter le complexe ou en microscopie, sur une lame d'observation, ou à l'aide d'un appareil d'analyse tel un cytofluoromètre, capable d'analyser le nombre et/ou le volume et/ou la taille et/ou la forme et/ou l'intensité du marquage des CInV ayant fixé la B2GPI marqués.
On pourra notamment, lorsque la détection et/ou la quantification s'effectue sans fixation préalable du complexe (CInV/ss2GPI) sur un support mais après fixation du milieu sur une surface, réaliser ladite fixation du milieu au moyen d'un solvant organique, tel que l'acétone, à une température comprise entre -25 C et +20"C et pendant une durée allant de 5 minutes à 1 heure, la surface pouvant être notamment une lame de verre.
Selon la présente invention, et notamment pour les deuxième et troisième modes de mise en oeuvre préférés, on pourra réaliser une détection multi ou polyspécifique de différents CInV simultanément ou successivement, éventuellement en employant des méthodes de détection différentes pour chacun des CInV.
Les exemples ci-après donnés, à titre purement illustratif et non limitatif, permettront de mieux comprendre l'invention. Ils ont été réalisés avec une ss2'GPI obtenue selon la demande de brevet français 93-01399.
EXEMPLE 1
Une suspension de promastigotes de Leishmania infantum obtenue par culture in vitro sur gelose au sang est fixée par l'acétone à 00C pendant 10 mn sur une lame porte-objet pour observation au microscope optique. La lame est ensuite plongée pendant 5 mn dans un tampon phosphate, ci-après désigné par "TP",contenant 0,01 M/I de phosphates monosodique et disodique et 0,15 M/I de chlorure de sodium ; ce tampon a un pH de 7,2 + 0,05. La ss2'GPI est couplée à la fluorescéine ; elle est ensuite déposée à une concentration de 20 yg/ml et 2 yg/ml sur la suspension fixée de promastigotes, puis laissée pendant 30 mn à 20"C en chambre humide. L'élimination de la ss2'GPI fluorescente non fixée se fait en plongeant les lames pendant 5 mn dans deux bains successifs de TP. La positivité du test est avérée par la fluorescence des parasites, notamment de leur pourtour aux deux concentrations de B2 'GPl fluorescente utilisée.
EXEMPLE 2
La même manipulation qu'à l'exemple 1 a été effectuée sur
Entamoeba histolytica et la fluorescence du parasite a été observée avec au moins 20yg/ml de ss2'GPI fluorescente.
EXEMPLE 3
La même manipulation qu'à l'exemple 1 a été effectuée avec Toxoplasma gondii et la fluorescence du parasite a été observée avec au moins 20 yg/ml de 2'GUI fluorescente.
EXEMPLE 4
La même manipulation qu'à l'exemple 1 a été effectuée avec Plasmodium falciparum, et la fluorescence du parasite a été observée avec au moins 20 yg/ml de B2'GPI fluorescente.
EXEMPLE 5
La même manipulation qu'à l'exemple 1 a été effectuée avec Candida krusei, et la fluorescence de l'agent mycosique a été observée avec au moins 100 yg/ml de ss2'GPI fluorescente.
EXEMPLE 6
La même manipulation qu'à l'exemple 1 a été effectuée avec Aspergillus fumigatus, où la fluorescence a été observée avec une concentration de 100 yg/ml de B2'GPI fluorescente.
EXEMPLE 7 Détection d'antigènes solubles de Leishmania infantum
Le support utilisé est une plaque de microtitration, de type micro-ELISA, à 96 puits et à fond plat, sur lequel sont fixés des antigènes solubles de Leishmania infantum. Ce support sensibilisé est distribué par la société BIOKEMA-Affinity Products (Suisse).
On prépare une solution de ss2'GPI marquée à la peroxydase ayant une concentration de 10 yg/ml dans un tampon acétate contenant 0,05 mole/l d'acide acétique et d'acétate de sodium, 0,01 % d'albumine bovine sérique et 0,05 ra en poids de "Triton
X100", ce tampon ayant un pH de 5,6 t 0,0.
On ajoute 100 yI par puits de la solution précédente et on laisse incuber pendant lh30 à 37"C. A la suite de cette incubation, le contenu des puits de la plaque est aspiré. On introduit 300 ,lll de tampon phosphate dans chaque puits et après un temps de contact de 2 minutes, on aspire le tampon : cette opération de lavage est renouvelée 3 fois.
On ajoute par puits 100 yl d'une solution d'o-phénylènediamine, 2 HCI dans un tampon citrate de sodium. On laisse incuber pendant 30 minutes à température ambiante, puis on arrête la réaction en rajoutant à chaque puits 50 Fl de H2SO4, 2N. On mesure en unités de densité optique (UDO) l'absorbance à 492 nm obtenue en fin de réaction, cette mesure étant faite à l'aide d'un robot lecteur de plaque.
Les résultats obtenus démontrent une reconnaissance des antigènes solubles de Leishmania infantum par la ss2'GPI. Les mêmes résultats sont obtenus en utilisant de la ss2'GPI non marquée. La liaison de cette dernière est révélée à l'aide d'un anticorps monoclonal anti
B2'GPI marqué à la peroxydase.
EXEMPLE 8 Liaison de la ss2'GPI sur des antigènes de Borrelia
On a utilisé une membrane de nitrocellulose sur laquelle sont transférés, après électrophorèse, des antigènes de Borrelia.
On fait réagir pendant 1 h 30 à température ambiante sur ladite membrane environ 40 ssg de ss2'GPI, couplée à de la phosphatase alcaline, en solution dans 1 ml de tampon acétate (acide acétique/acétate de sodium) à 0,05 mole/l, contenant 0,1 % en poids de gélatine et 0,5 % en poids de "TRITON X 100", ce tampon ayant un pH de 5,6 t 0,05. On rince ensuite une fois avec un tampon acétate à 0,05 mole/l, contenant 0,05 % en poids de "TRITON X 100" et ayant un pH de 5,6 + ost5. On rince ensuite deux fois avec du tampon phosphate contenant 0,01 mole/I de phosphates monosodique et disodique, 0,15 mole/l de chlorure de sodium, 0,05 % en poids de "TRITON X 100", ce tampon ayant un pH de 7,00 + 0,05. On relève l'activité de la phosphatase alcaline en présence de nitro-blue-tétrazolium (NBT) et de -bromo 4-chloro 3-indoyl phosphate (BCIP), dans une solution à 50 mM de tri(hydroxyméthyl) aminométhane, à pH 8,8 et à 0,1 hl de NaCl. On voit sur la membrane que la B2'GPI permet de révéler la présence d'antigènes de Borrelia
Afzelii, notamment ceux qui pourraient indiquer une pathogénicité, par exemple p39, osp B, osp A, osp C, selon les désignations indiquées dans la publication de Nilson et autres (Serodiagn. Immunother. Infect.
Disease, 1993, 5, p. 245-250).
Dans les mêmes conditions, il n'y a pas de réaction avec la phosphatase alcaline seule.

Claims (31)

  1. REVENDICATIONS
    i - Procédé de détection et/ou de quantification de composés infectieux non viraux (CInV) existant dans un milieu, caractérisé par le fait que l'on fixe la glycoprotéine ss2GPI sous au moins une de ses formes au(x) CInV et que l'on détecte et/ou quantifie le(s) complexe(s) (CInV/n2GPI) ainsi formé(s).
  2. 2 - Procédé selon la revendication 1, caractérisé par le fait que l'on utilise, comme forme de B2GPI, la B2'GPI sous forme pure ou sous forme de composition protéinique en mélange avec des contaminants.
  3. 3 - Procédé selon l'une des revendications 1 ou 2, caractérisé par le fait que la B2GPI utilisée pour constituer le complexe avec le(s) CInV est marquée, la détection et/ou quantification du complexe s'effectuant grâce audit marquage.
  4. 4 - Procédé selon la revendication 3, caractérisé par le fait que le marquage de la 02GUI est réalisé au moyen d'une enzyme, d'un produit radioactif ou d'un produit fluorescent.
  5. 5 - Procédé selon l'une des revendications 1 ou 2, caractérisé par le fait que la ss2GPI utilisée pour constituer le complexe avec le(s) CInV n'est pas marquée.
  6. 6 - Procédé selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisé par le fait que l'on fixe sur un support l'un des éléments constitutifs du complexe (CInV/B2GPI).
  7. 7 - Procédé selon la revendication 6, caractérisé par le fait que le support est un support solide.
  8. 8 - Procédé selon la revendication 7, caractérisé par le fait que le support solide utilisé est une membrane ou une microplaque de titration.
  9. 9 - Procédé selon l'une des revendications 6 à 8, caractérisé par le fait que l'on fixe le complexe (CInV/B2GPI) sur le support par l'élément ss9GPI du complexe.
  10. 10 - Procédé selon la revendication 9, caractérisé par le fait que l'on réalise la fixation de l'élément B2GPI sur le support avant formation du complexe (CInV/B2GPI), que l'on forme ensuite ledit complexe, puis que l'on détecte et/ou quantifie l'élément CInV du complexe.
  11. 11 - Procédé selon l'une des revendications 6 à 8, caractérisé par le fait que l'on fixe le complexe (CInV/02GPI) sur le support par l'élément CInV du complexe.
  12. 12 - Procédé selon la revendication 11, caractérisé par le fait que l'on réalise la fixation de l'élément CInV sur le support avant formation du complexe (CInV/02GPI), que l'on forme ensuite ledit complexe, puis que l'on détecte et/ou quantifie l'élément B2GPI du complexe.
  13. 13 - Procédé selon l'une des revendications 11 ou 12, caractérisé par le fait que la ss2GPI utilisée pour former le complexe est préalablement marquée.
  14. 14 - Procédé selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisé par le fait que l'on détecte et/ou quantifie le complexe (CInV/B2GPI) dans le milieu où il s'est formé, sans fixation préalable du complexe sur un support.
  15. 15 - Procédé selon la revendication 14, caractérisé par le fait que l'on détecte et/ou quantifie le complexe (CInV/ss2GPI) dans le milieu où il s'est formé, sans fixation dudit milieu.
  16. 16 - Procédé selon la revendication 14, caractérisé par le fait que l'on détecte et/ou quantifie le complexe (CInV/02GPI) dans le milieu où il s'est formé, après fixation dudit milieu.
  17. 17 - Procédé selon l'une des revendications 11 à 13, caractérisé par le fait que la fixation de CInV sur un support s'effectue directement ou par l'intermédiaire d'un anticorps.
  18. 18 - Procédé selon l'une des revendications 9 ou 10, caractérisé par le fait que l'on détecte le CInV du complexe (CInV/B2GPI) fixé sur le support par infectiosité, par une réaction enzymatique spécifique, par marquage fluorescent ou radioactif, par la détection d'acides nucléiques par hybridation avec une sonde marquée ou par une réaction de polymérae en chaîne (PCR) ou encore à l'aide d'anticorps spécifique(s) du (ou des) CInV.
  19. 19 - Procédé selon l'une des revendications 1 à 18, caractérisé par le fait que le CInV fait partie du groupe formé par les bactéries, les parasites, les champignons et les mycoplasmes.
  20. 20 - Procédé selon l'une des revendications 9 ou 10, caractérisé par le fait qu'avant la réaction de fixation de la ss2GPI sur le support, la B2GPI est mise en solution dans un tampon ayant un pH compris entre 4,5 et 10,5.
  21. 21 - Procédé selon la revendication 20, caractérisé par le fait que le tampon est un tampon phosphate ou acétate.
  22. 22- Procédé selon l'une des revendications 20 ou 21, caractérisé par le fait que la ss2GPI est à une concentration comprise entre 0,01 et 100 mg/l dans le tampon.
  23. 23 - Procédé selon l'une des revendications 20 à 22, caractérisé par le fait que l'on réalise la réaction de fixation de la
    B2GPI sur le support en mettant le tampon contenant la B2GPI en contact avec le support à une température de 0 à 40 C pendant un temps d'incubation compris entre 30 minutes et 3 jours.
  24. 24 - Procédé selon l'une des revendications 20 à 23, caractérisé par le fait que l'on sépare du support la quantité de solution contenant la B2GPI, qui n'a pas réagi avec ledit support, et on lave le support.
  25. 25 - Procédé selon la revendication 24, caractérisé par le fait qu'on lave le support avec le même tampon que celui utilisé pour mettre en solution la B2GPI.
  26. 26- Procédé selon la revendication 12 , caractérisé par le fait que l'on fixe le(s) CInV sur le support à une température comprise entre 0 et 400C, le(s)dit(s) CInV étant mis dans un tampon ayant un pH compris entre 4,5 et 10,5 pour constituer une solution, le support étant maintenu en contact avec ladite solution à une température comprise entre 0 et 40"C pendant un temps d'incubation compris entre 30 minutes et 24 heures et qu'après incubation, on sépare le support de la solution.
  27. 27 - Procédé selon l'une des revendications 12 ou 26, caractérisé par le fait que l'on met en contact le support, sur lequel est fixé le(s) CInV, avec une solution contenant la B2GPI dans un tampon donnant un pH compris entre 4,5 et 10, à une température comprise entre 0 et 40"C et pendant un temps compris entre 30 mn et 24 h et que l'on sépare du support la solution qui n'a pas réagi.
  28. 28 - Procédé selon la revendication 10, caractérisé par le fait que l'on fixe la B2GPI sur le support à une température comprise entre 0 et 40"C, la 02GUI étant mise dans un tampon ayant un pH compris entre 4,5 et 10,5 pour constituer une solution, le support étant maintenu en contact avec ladite solution à une température comprise entre 0 et 40"C pendant un temps d'incubation compris entre 30 mn et 24 heures, et qu'après incubation on sépare le support de la solution.
  29. 29 - Procédé selon l'une des revendications 10 ou 28, caractérisé par le fait que l'on dilue le milieu liquide contenant le(s)
    CInV à l'aide d'un tampon donnant un pH compris entre 4,5 et 10 pour constituer une solution, que l'on met en contact ladite solution à une température comprise entre 0 et 40 "C avec le support sur lequel est fixée la B2GPI, pendant un temps compris entre 30 mn et 2 h, et que l'on sépare la solution quin'a pas réagi.
  30. 30 - Procédé selon la revendication 16, caractérisé par le fait que la fixation du milieu s'effectue sur une surface au moyen d'un solvant organique, à une température comprise entre -25"C et +20"C et pendant une durée allant de 5 minutes à 1 heure.
  31. 31 - Support, sur lequel est fixée la ss2GPI, utilisable pour la mise en oeuvre du procédé selon la revendication 10 et obtenu selon les étapes définies à la revendication 28.
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