JP3524929B2 - 感染性化合物の分離および／または検出および／または定量を行うための方法およびこの方法を実施するための支持体 - Google Patents
感染性化合物の分離および／または検出および／または定量を行うための方法およびこの方法を実施するための支持体Info
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Description
【発明の詳細な説明】
本発明は、生物学的材料中の感染性化合物（compos
infectieux）の分離および／または検出および／また
は定量を行うための方法、およびこの方法を実施するた
めの支持体に関する。
infectieux）の分離および／または検出および／また
は定量を行うための方法、およびこの方法を実施するた
めの支持体に関する。
本発明によれば、感染性化合物（総体的に、以下、省
略型「IC」と称する）は、特定のタンパク質性化合物に
おいて、それが、感染因子の成分であるもの、および、
感染性化合物を含む構造体であるものの、両化合物を意
味することが理解される。これらの構造体は、特に、完
全または不完全な内因性または外因性の感染因子、それ
らの代謝物、または他にこれらの感染因子の成分化合物
を含む他の組み立て体である。これらは、上記感染因子
のある種の特性、特に、感染性化合物に特異的である特
定の抗体によって検出される特性を示す。ICはまた、既
に定義されたICによってまたは異常様式で発現される遺
伝子の発現によって生物において特異的に誘導される化
合物であり得る。言及され得るICは、例えば、ウイル
ス、細菌、カビ、マイコプラズマ、寄生虫、および異常
動物細胞である。ウイルス感染性化合物は、以下省略型
「VIC」と称され、一方、非ウイルス感染性化合物（す
なわち、単ウイルス型以外の感染性化合物）は、「nVI
C」と称される。
略型「IC」と称する）は、特定のタンパク質性化合物に
おいて、それが、感染因子の成分であるもの、および、
感染性化合物を含む構造体であるものの、両化合物を意
味することが理解される。これらの構造体は、特に、完
全または不完全な内因性または外因性の感染因子、それ
らの代謝物、または他にこれらの感染因子の成分化合物
を含む他の組み立て体である。これらは、上記感染因子
のある種の特性、特に、感染性化合物に特異的である特
定の抗体によって検出される特性を示す。ICはまた、既
に定義されたICによってまたは異常様式で発現される遺
伝子の発現によって生物において特異的に誘導される化
合物であり得る。言及され得るICは、例えば、ウイル
ス、細菌、カビ、マイコプラズマ、寄生虫、および異常
動物細胞である。ウイルス感染性化合物は、以下省略型
「VIC」と称され、一方、非ウイルス感染性化合物（す
なわち、単ウイルス型以外の感染性化合物）は、「nVI
C」と称される。
「生物学的材料」は、本明細書では、生物学的組織、
液体または固体標本、あるいは生物学的組織からの抽出
物、あるいは上記の意味での感染性化合物を含有し得る
天然媒体（例えば、ドレナージ水）であることは理解さ
れる。材料はまた、上述の少なくとも２種類の材料の混
合物であり得る。従って、このような生物学的材料は、
特に感染（例えば、ウイルス、細菌、寄生虫、真菌また
はマイコプラズマ感染）患者からの組織、器官、便、あ
るいは生物学的液体のいずれかから調製され得るか、ま
たは「インビトロ」培養物から得られ得る。このような
生物学的材料はまた、血清、血漿、尿、脳脊髄液、滑
液、腹膜液、胸膜液、精液、または腹水であり得る。
液体または固体標本、あるいは生物学的組織からの抽出
物、あるいは上記の意味での感染性化合物を含有し得る
天然媒体（例えば、ドレナージ水）であることは理解さ
れる。材料はまた、上述の少なくとも２種類の材料の混
合物であり得る。従って、このような生物学的材料は、
特に感染（例えば、ウイルス、細菌、寄生虫、真菌また
はマイコプラズマ感染）患者からの組織、器官、便、あ
るいは生物学的液体のいずれかから調製され得るか、ま
たは「インビトロ」培養物から得られ得る。このような
生物学的材料はまた、血清、血漿、尿、脳脊髄液、滑
液、腹膜液、胸膜液、精液、または腹水であり得る。
β２−糖タンパク質Ｉ（以下、「β2GPI」と省略）
は、特に、J.LOZIERら、Proc.Natl.Acad.Sci.ISA、第81
巻、3640〜3644頁、1984年７月、およびT.KRISTENSEN
ら、FEBS Letters、第289巻、1991年、183〜186頁の論
文において、その配列が示されている血漿糖タンパク質
である。β2GPIはまた、アポリポタンパク質Ｈと呼ばれ
る。このタンパク質が多型性を示すことが示されてお
り、名称β2GPIを、以下全形態に対する属名として見な
す。
は、特に、J.LOZIERら、Proc.Natl.Acad.Sci.ISA、第81
巻、3640〜3644頁、1984年７月、およびT.KRISTENSEN
ら、FEBS Letters、第289巻、1991年、183〜186頁の論
文において、その配列が示されている血漿糖タンパク質
である。β2GPIはまた、アポリポタンパク質Ｈと呼ばれ
る。このタンパク質が多型性を示すことが示されてお
り、名称β2GPIを、以下全形態に対する属名として見な
す。
EP−Ａ−0 600 088において、抗リン脂質抗体症候群
では、カルジオリピン−β2GPI複合体に特異的であり、
この症候群に出現する抗カルジオリピン抗体が、血清中
に検出されること、およびこれらの抗カルジオリピン抗
体が、血清をカルジオリピン−β2GPI複合体と反応させ
ることによってアッセイされ得ることが指摘されてい
る。カルジオリピンは、感染性化合物（Treponema pall
idum）と結合し得るが、他の供給源由来であり得、特に
病原性のない状態で存在するので、これは、感染因子に
よって生物において特異的に誘導され、従って、この感
染因子の生物中での存在を検出するために信頼のおける
方法では使用され得ない化合物である。
では、カルジオリピン−β2GPI複合体に特異的であり、
この症候群に出現する抗カルジオリピン抗体が、血清中
に検出されること、およびこれらの抗カルジオリピン抗
体が、血清をカルジオリピン−β2GPI複合体と反応させ
ることによってアッセイされ得ることが指摘されてい
る。カルジオリピンは、感染性化合物（Treponema pall
idum）と結合し得るが、他の供給源由来であり得、特に
病原性のない状態で存在するので、これは、感染因子に
よって生物において特異的に誘導され、従って、この感
染因子の生物中での存在を検出するために信頼のおける
方法では使用され得ない化合物である。
国際特許出願WO 94/18569に、ある種のウイルス化合
物が、β2GPIの１つの形態、すなわち、フランス特許出
願第2 701 263号に記載される形態であり、この形態の
β2GPIが、純粋状態であれ、またはタンパク質組成物に
含まれていても、これに特異的に結合することが示され
た。この形態のβ2GPIは、FR−Ａ−2 690 444に記載の
血漿からのアルブミン精製の方法で使用される、アフィ
ニティークロマトグラフィーカラムに結合される残留物
から単離される。それは、50,000±3000ダルトンの分子
量を有する。本特許出願に関しては、この形態のβ2GPI
を、省略型「β2'GPI」で称した。従って、ウイルス化
合物（VIC）（β2'GPIによって結合されるウイルス化合
物）を検出および／またはアッセイする方法が、WO 94/
18569において提案された。従って、このような方法で
は、β2'GPIが、検出および／またはアッセイするため
にこのように捕捉されたVICを分離するようにして、生
物学的材料に含有されているVICに添加される。
物が、β2GPIの１つの形態、すなわち、フランス特許出
願第2 701 263号に記載される形態であり、この形態の
β2GPIが、純粋状態であれ、またはタンパク質組成物に
含まれていても、これに特異的に結合することが示され
た。この形態のβ2GPIは、FR−Ａ−2 690 444に記載の
血漿からのアルブミン精製の方法で使用される、アフィ
ニティークロマトグラフィーカラムに結合される残留物
から単離される。それは、50,000±3000ダルトンの分子
量を有する。本特許出願に関しては、この形態のβ2GPI
を、省略型「β2'GPI」で称した。従って、ウイルス化
合物（VIC）（β2'GPIによって結合されるウイルス化合
物）を検出および／またはアッセイする方法が、WO 94/
18569において提案された。従って、このような方法で
は、β2'GPIが、検出および／またはアッセイするため
にこのように捕捉されたVICを分離するようにして、生
物学的材料に含有されているVICに添加される。
Journal of Virology,68,No.4,1994年４月、2415〜24
24頁には、HBsAgが、インビトロにおいてβ２糖タンパ
ク質と複合体を形成し得ることが報告されている。
24頁には、HBsAgが、インビトロにおいてβ２糖タンパ
ク質と複合体を形成し得ることが報告されている。
WO 92/19795は、ヒトβ２糖タンパク質Ｉと特異的に
反応し、これをアッセイし得るモノクローナル抗体を得
ることが可能であることを、指摘している。
反応し、これをアッセイし得るモノクローナル抗体を得
ることが可能であることを、指摘している。
一般に、少なくとも１つのICと１つのβ2GPIとの直接
あるいは間接的な会合は、本明細書では一般に「複合体
（complexe）」と称し、これらの複合体は、以下、「β
2GPI/IC」の表記によって呼ばれる。WO 94/18569に記載
の方法は、VICウイルス複合物と、β2'GPI（純粋状態で
あるかまたはタンパク質組成物に含有される）とのVIC/
β2'GPI複合体を、検出および／またはアッセイされる
べきVICを含有する生物学的材料に添加されるβ2'GPIを
用いて、検出および／またはアッセイする。
あるいは間接的な会合は、本明細書では一般に「複合体
（complexe）」と称し、これらの複合体は、以下、「β
2GPI/IC」の表記によって呼ばれる。WO 94/18569に記載
の方法は、VICウイルス複合物と、β2'GPI（純粋状態で
あるかまたはタンパク質組成物に含有される）とのVIC/
β2'GPI複合体を、検出および／またはアッセイされる
べきVICを含有する生物学的材料に添加されるβ2'GPIを
用いて、検出および／またはアッセイする。
下記の方法を実施する前に、生物学的材料中に天然に
存在し、そしてこのように意図的に添加されるのではな
いβ2GPIの形態を、本明細書では（β2GPI）ｎと称す
る。以前に定義されたIC/β2GPI複合体を形成するため
に意図的に添加されるβ2GPIの形態を、（β2GPI）ａと
称する。
存在し、そしてこのように意図的に添加されるのではな
いβ2GPIの形態を、本明細書では（β2GPI）ｎと称す
る。以前に定義されたIC/β2GPI複合体を形成するため
に意図的に添加されるβ2GPIの形態を、（β2GPI）ａと
称する。
本発明によれば、新規な方法で、WO 94/18569に記載
のもの以外の生物学的材料から、IC/β2GPI複合体を分
離、検出、および／または定量し得ることが見出され
た。すなわち、 IC部分が、VICウイルスまたはnVIC非ウイルス型であ
り得、（β2GPI）ｎ部分が、研究下の生物学的材料に天
然に由来する、（β2GPI）n/IC複合体； （β2GPI）ａ部分が、この目的のために意図的に添加
され、異なる純粋または混合形態で調製され、nVIC部分
が、研究下の生物学的材料中の非ウイルス感染性化合物
に由来する、（β2GPI）a/nVIP複合体。
のもの以外の生物学的材料から、IC/β2GPI複合体を分
離、検出、および／または定量し得ることが見出され
た。すなわち、 IC部分が、VICウイルスまたはnVIC非ウイルス型であ
り得、（β2GPI）ｎ部分が、研究下の生物学的材料に天
然に由来する、（β2GPI）n/IC複合体； （β2GPI）ａ部分が、この目的のために意図的に添加
され、異なる純粋または混合形態で調製され、nVIC部分
が、研究下の生物学的材料中の非ウイルス感染性化合物
に由来する、（β2GPI）a/nVIP複合体。
従って、本発明は、
（ａ）（β2GPI）n/IC複合体
（ｂ）（β2GPI）a/nVIC複合体
よりなる群から選択されるβ2GPI/IC複合体が、分離お
よび／または検出および／または定量されることによっ
て特徴づけられる、生物学的材料中の感染性化合物（I
C）を、分離および／または検出および／または定量す
るための方法に関する。
よび／または検出および／または定量されることによっ
て特徴づけられる、生物学的材料中の感染性化合物（I
C）を、分離および／または検出および／または定量す
るための方法に関する。
一般には、β2GPIは、ICと同様に、本方法のいくつか
の適用について、動物起源であり得るか、または遺伝子
工学および／または化学工学によって生成され得る。こ
の方法は、ヒトおよび動物の両方に適用され得る。
の適用について、動物起源であり得るか、または遺伝子
工学および／または化学工学によって生成され得る。こ
の方法は、ヒトおよび動物の両方に適用され得る。
本発明に従って、複合体のβ2GPI部分は、この部分に
優先的に結合し得るかまたは特異的に結合し得る基質の
助けにより認識されることによって同定され、そして、
IC部分は、任意の適切な手段によって同定される。
優先的に結合し得るかまたは特異的に結合し得る基質の
助けにより認識されることによって同定され、そして、
IC部分は、任意の適切な手段によって同定される。
複合体の形成は、直接的または間接的であり得、そし
て、ある種の脂質または界面活性剤、特にリン脂質のよ
うな、化学物質、生化学物質、または生物学的物質であ
り得る特定の添加物によって、媒介または促進され得
る。複合体は、生物学的材料の調製の間および／または
方法の一工程の間に、形成され得る。
て、ある種の脂質または界面活性剤、特にリン脂質のよ
うな、化学物質、生化学物質、または生物学的物質であ
り得る特定の添加物によって、媒介または促進され得
る。複合体は、生物学的材料の調製の間および／または
方法の一工程の間に、形成され得る。
既に指摘されたように、ICは、VICおよびnVICを包含
する。特に記載され得るVICは、HIV1、HIV2、HBV、HS
V、およびウイルス起源の粒子またはタンパク質からな
る群のものであり得る。特に記載され得るnVICは、細
菌、寄生虫、カビ、およびマイコプラズマによりなる群
のものであり、より詳細には、細菌の場合はBorelliaで
あり、そして寄生虫の場合はリーシュマニア属（（Leis
hmania）（特にinfantum））、トキソプラズマ（Toxopl
asma gondii）、および赤痢アメーバ（Entamoeba histo
lytica）である。
する。特に記載され得るVICは、HIV1、HIV2、HBV、HS
V、およびウイルス起源の粒子またはタンパク質からな
る群のものであり得る。特に記載され得るnVICは、細
菌、寄生虫、カビ、およびマイコプラズマによりなる群
のものであり、より詳細には、細菌の場合はBorelliaで
あり、そして寄生虫の場合はリーシュマニア属（（Leis
hmania）（特にinfantum））、トキソプラズマ（Toxopl
asma gondii）、および赤痢アメーバ（Entamoeba histo
lytica）である。
好都合には、複合体中に保持されるβ2GPIは、本方法
の実施態様に従って、標識され得るかまたはされ得な
い。この標識は、前もって実施され得るかまたは前もっ
ては実施され得ず、例えば、抗体、酵素、放射性産物、
蛍光産物、または金属剤によって、実施され得る。
の実施態様に従って、標識され得るかまたはされ得な
い。この標識は、前もって実施され得るかまたは前もっ
ては実施され得ず、例えば、抗体、酵素、放射性産物、
蛍光産物、または金属剤によって、実施され得る。
本発明によれば、異なる感染因子を検出し得る多重特
異テストは、各因子に対して異なる検出法、例えば、HI
V2p26に対するアルカリホスファターゼ複合体化抗体お
よびHBsAgに対するペルオキシダーゼ複合体化抗体を、
特に同時または連続的に使用して、実施され得る。
異テストは、各因子に対して異なる検出法、例えば、HI
V2p26に対するアルカリホスファターゼ複合体化抗体お
よびHBsAgに対するペルオキシダーゼ複合体化抗体を、
特に同時または連続的に使用して、実施され得る。
本発明の実施態様の第一部分（ここでは外来（β2GP
I）ａが生物学的媒体に添加される）では、β2'GPIが使
用され得る。これは、純粋であるか、または特に複合体
のβ2GPI部分のβ2GPI形態として他の糖タンパク質を含
有するタンパク質組成物の形態である。この組成物は、
フランス特許出願第2 701 263号に記載のように、特
に、硫酸基を有するゲルアフィニティーカラムの溶出に
よって得られる組成物であり得る。しかし、β2GPIの他
の形態もまた、J.ArvieuxらのJournal of Immunologica
l Methods（1991），143,223〜229頁により記載のプロ
トコールに従って得られるものが使用され得る。カルバ
ミル化β2GPIは、いくつかの複合体を形成し得る。
I）ａが生物学的媒体に添加される）では、β2'GPIが使
用され得る。これは、純粋であるか、または特に複合体
のβ2GPI部分のβ2GPI形態として他の糖タンパク質を含
有するタンパク質組成物の形態である。この組成物は、
フランス特許出願第2 701 263号に記載のように、特
に、硫酸基を有するゲルアフィニティーカラムの溶出に
よって得られる組成物であり得る。しかし、β2GPIの他
の形態もまた、J.ArvieuxらのJournal of Immunologica
l Methods（1991），143,223〜229頁により記載のプロ
トコールに従って得られるものが使用され得る。カルバ
ミル化β2GPIは、いくつかの複合体を形成し得る。
上記の第一部分に属する実施態様では、複合体は、nV
ICを分離および／またはアッセイおよび／または定量す
るために、（β2GPI）ａを生物学的材料に添加すること
によって形成される。
ICを分離および／またはアッセイおよび／または定量す
るために、（β2GPI）ａを生物学的材料に添加すること
によって形成される。
本発明に従う方法の実施態様の第二部分では、生物学
的材料中に天然および／または最初から存在する（β2G
PI）ｎが使用される。WO 94/18569の方法は、生物学的
材料が遊離VICを含有するとき、満足な結果を与えるこ
とが知られる。このVICは、生物学的材料に天然に存在
するβ2GPIに付着（fixer）されていないVICである。こ
の遊離VICは、結果的に、この方法に従って添加される
β2'GPIにそれ自身付着し得る。従って、この方法にお
いて、応答シグナルはVICの増加に伴って増加し、それ
は、依然遊離しているか、または生物学的材料中に天然
に存在する複合体から競合によって遊離され得る部位を
有する。一方、いくつかの場合において、例えば感染の
初期で、VICは、天然に存在する（β2GPI）ｎに比較し
て少ない量で存在し、そして従ってこのVICは主とし
て、（β2GPI）n/IC複合体の形態で（β2GPI）ｎに結合
されていると仮定することが可能である。出願WO 94/18
569で提案されるテストは、複合体化されたVICはマスク
され得るので、その場合には重要ではあり得ない。従っ
て、本発明のこの第二部分によれば、それは、生物学的
材料中に存在するICを、特に、これらの化合物が、通常
存在する（β2GPI）ｎと比較して、それらが主として
（β2GPI）ｎ形態の少なくとも１つと複合体化される
（または複合体化可能である）ような量で存在する場
合、または他にこのICが、（β2GPI）ａの導入によって
示され得ない場合、観察および／または分離および／ま
たは検出および／または定量するために提案される。
的材料中に天然および／または最初から存在する（β2G
PI）ｎが使用される。WO 94/18569の方法は、生物学的
材料が遊離VICを含有するとき、満足な結果を与えるこ
とが知られる。このVICは、生物学的材料に天然に存在
するβ2GPIに付着（fixer）されていないVICである。こ
の遊離VICは、結果的に、この方法に従って添加される
β2'GPIにそれ自身付着し得る。従って、この方法にお
いて、応答シグナルはVICの増加に伴って増加し、それ
は、依然遊離しているか、または生物学的材料中に天然
に存在する複合体から競合によって遊離され得る部位を
有する。一方、いくつかの場合において、例えば感染の
初期で、VICは、天然に存在する（β2GPI）ｎに比較し
て少ない量で存在し、そして従ってこのVICは主とし
て、（β2GPI）n/IC複合体の形態で（β2GPI）ｎに結合
されていると仮定することが可能である。出願WO 94/18
569で提案されるテストは、複合体化されたVICはマスク
され得るので、その場合には重要ではあり得ない。従っ
て、本発明のこの第二部分によれば、それは、生物学的
材料中に存在するICを、特に、これらの化合物が、通常
存在する（β2GPI）ｎと比較して、それらが主として
（β2GPI）ｎ形態の少なくとも１つと複合体化される
（または複合体化可能である）ような量で存在する場
合、または他にこのICが、（β2GPI）ａの導入によって
示され得ない場合、観察および／または分離および／ま
たは検出および／または定量するために提案される。
その事実を考慮して、本発明の実施態様のこの第二部
分によれば、β2GPIが添加されなければ、WO 94/18569
の方法のマスキング現象は回避され、そして生物学的材
料中に存在する複合体量の関数、従ってICの関数として
増加し得る応答シグナルが、これらのIC量が非常に少な
い場合でさえも、得られる。適切なところで、その方法
は、病変の初期状態を検出することを可能にし得、一
方、以前の方法は、例えば、IC過剰または（β2GPI）ｎ
不足、またはICに結合することに関して非関数性である
β2GPI形態の天然存在に対応して、確立している病状を
調査するのにより適している。
分によれば、β2GPIが添加されなければ、WO 94/18569
の方法のマスキング現象は回避され、そして生物学的材
料中に存在する複合体量の関数、従ってICの関数として
増加し得る応答シグナルが、これらのIC量が非常に少な
い場合でさえも、得られる。適切なところで、その方法
は、病変の初期状態を検出することを可能にし得、一
方、以前の方法は、例えば、IC過剰または（β2GPI）ｎ
不足、またはICに結合することに関して非関数性である
β2GPI形態の天然存在に対応して、確立している病状を
調査するのにより適している。
これらの２つの実施態様部分が、互いに矛盾しないこ
とは、注目されるべきである。
とは、注目されるべきである。
本発明に従って方法を実施するために、ICは、β2GPI
/IC複合体を前もって支持体へ付着させることなく、ま
たは、複合体に含まれる要素によってこの複合体を支持
体に付着させて、検出され得る。第一の場合には、検出
および／または定量が、複合体が形成される媒体におい
て達成される。この形成は、この媒体が、例えば、物理
的、化学的、または生化学的方法によって表面に付着さ
れた後、あるいはこの媒体を付着させずになされる。第
二の場合には、好都合には、支持体は固体支持体であり
得る。
/IC複合体を前もって支持体へ付着させることなく、ま
たは、複合体に含まれる要素によってこの複合体を支持
体に付着させて、検出され得る。第一の場合には、検出
および／または定量が、複合体が形成される媒体におい
て達成される。この形成は、この媒体が、例えば、物理
的、化学的、または生化学的方法によって表面に付着さ
れた後、あるいはこの媒体を付着させずになされる。第
二の場合には、好都合には、支持体は固体支持体であり
得る。
本発明の記載では、用語「支持体への付着」は、複合
体が形成される時間を早まって判断することなく使用さ
れる。
体が形成される時間を早まって判断することなく使用さ
れる。
本発明の１つの変形によれば、β2GPI/IC複合体は、
複合体のβ2GPI部分によって、すなわち、このβ2GPI部
分へ結合する化合物を支持体に提供することによって、
保持される。次に、ICに対応する複合体部分が、適切な
手段によって分離／検出／定量される。
複合体のβ2GPI部分によって、すなわち、このβ2GPI部
分へ結合する化合物を支持体に提供することによって、
保持される。次に、ICに対応する複合体部分が、適切な
手段によって分離／検出／定量される。
本発明の他の変形によれば、β2GPI/IC複合体は、該
複合体のIC部分によって、すなわち、後者を、複合体の
このIC部分へ結合する化合物を提供される支持体に付着
させることによって、保持される。次に、この複合体の
β2GPI部分が、任意の適切な手段によって検出および／
または分離および／または定量される。好都合には、特
に、複合体化され、β2GPIに特異的な抗体を用いる。界
面活性剤または脂質の天然状態での存在、または添加
が、これらの抗体の付着の助けとなり得る。
複合体のIC部分によって、すなわち、後者を、複合体の
このIC部分へ結合する化合物を提供される支持体に付着
させることによって、保持される。次に、この複合体の
β2GPI部分が、任意の適切な手段によって検出および／
または分離および／または定量される。好都合には、特
に、複合体化され、β2GPIに特異的な抗体を用いる。界
面活性剤または脂質の天然状態での存在、または添加
が、これらの抗体の付着の助けとなり得る。
本発明によれば、検出は、特に目視または顕微鏡（特
に、光学顕微鏡、電子顕微鏡、またはUV顕微鏡）によっ
て、ICに対して特徴的な構造体を可視化および／または
計測（counting）することによって実施され得る。この
検出は、これらの構造体上でICと会合される（β2GPI）
ｎを、特に、特異標識抗体（例えば、酵素分子または蛍
光分子に複合体化される抗体）の助けによって検出する
ことによる。生物学的材料のIC（これは、複合体化され
得るかまたはされ得ない）は、物理的、化学的、または
生物学的に支持体に付着され得るか、または液相（特
に、酸、ケトン、アルコール、パラフィン、またはアル
デヒド液）であり得る。各部分に特異的な二重標識もま
た、各部分に特異的であり、そして２つの異なるトレー
サー（例えば、異なる波長の蛍光を発するトレーサー）
に複合体化される抗体を特に使用して、複合体を検出す
るために使用され得る。最後に、生物学的材料中のIC
は、粒子または構造体の数、容積、大きさ、または形状
のようなシグナルを分析するための装置の助けによっ
て、例えば、特にフローサイトメトリーによって、検出
またはアッセイされ得る。
に、光学顕微鏡、電子顕微鏡、またはUV顕微鏡）によっ
て、ICに対して特徴的な構造体を可視化および／または
計測（counting）することによって実施され得る。この
検出は、これらの構造体上でICと会合される（β2GPI）
ｎを、特に、特異標識抗体（例えば、酵素分子または蛍
光分子に複合体化される抗体）の助けによって検出する
ことによる。生物学的材料のIC（これは、複合体化され
得るかまたはされ得ない）は、物理的、化学的、または
生物学的に支持体に付着され得るか、または液相（特
に、酸、ケトン、アルコール、パラフィン、またはアル
デヒド液）であり得る。各部分に特異的な二重標識もま
た、各部分に特異的であり、そして２つの異なるトレー
サー（例えば、異なる波長の蛍光を発するトレーサー）
に複合体化される抗体を特に使用して、複合体を検出す
るために使用され得る。最後に、生物学的材料中のIC
は、粒子または構造体の数、容積、大きさ、または形状
のようなシグナルを分析するための装置の助けによっ
て、例えば、特にフローサイトメトリーによって、検出
またはアッセイされ得る。
本発明の他の変形によれば、β2GPI/IC複合体は、複
合体のβ2GPI部分またはIC部分のいずれかに結合する化
合物によって、支持体に保持される。その後、この支持
体に付着される複合体が、この生物学的材料から分離さ
れ、そしてこの（IC/β2GPI）複合体は、複合体の他方
の部分の認識により分離および／または検出および／ま
たは定量および／またはアッセイされる。
合体のβ2GPI部分またはIC部分のいずれかに結合する化
合物によって、支持体に保持される。その後、この支持
体に付着される複合体が、この生物学的材料から分離さ
れ、そしてこの（IC/β2GPI）複合体は、複合体の他方
の部分の認識により分離および／または検出および／ま
たは定量および／またはアッセイされる。
支持体は、好都合には固体支持体である。これは、膜
（例えば、ニトロセルロース膜）、あるいはマイクロタ
イタープレート（例えば、ELISAマイクロタイタープレ
ート）、あるいは顕微鏡スライドであり得る。
（例えば、ニトロセルロース膜）、あるいはマイクロタ
イタープレート（例えば、ELISAマイクロタイタープレ
ート）、あるいは顕微鏡スライドであり得る。
複合体の部分の一方に結合する化合物（例えば抗体）
は、この化合物の反応基を支持体の反応部位と反応させ
ることによって、支持体に付着される。好ましくは、こ
の反応は、０℃と40℃との間の温度で実施される。複合
体の部分の一方に結合する化合物は、好都合には4.5と1
0.5との間のpH、好ましくは6.5と7.5との間のpHを有す
る緩衝液中に置かれる。この緩衝液は、好都合にはリン
酸型または酢酸型であり得る。支持体は、０℃と40℃と
の間の温度での30分と24時間との間のインキュベーショ
ン時間の間、化合物を含有する緩衝液と接触されて、好
都合に維持される。インキュベーション後、反応しなか
った緩衝液は支持体から分離され、そして支持体は洗浄
される。好ましくは、支持体は、それが上記化合物を含
有しないこと以外は以前の緩衝液と同じ緩衝液で洗浄さ
れる。この化合物と反応しなかった支持体の活性部位を
飽和する必要があり得る。この場合、他の活性基を、こ
れらの活性部位と反応させる。この目的のために、好都
合には、血清アルブミン（例えばウシ血清アルブミン）
溶液またはカゼイン溶液および／またはポリビニルピロ
リドン溶液および／またはゼラチン溶液および／または
界面活性剤溶液が使用され、これは同時または連続的に
使用される。反応後、支持体は、好ましくはリンスされ
て、乾燥される。
は、この化合物の反応基を支持体の反応部位と反応させ
ることによって、支持体に付着される。好ましくは、こ
の反応は、０℃と40℃との間の温度で実施される。複合
体の部分の一方に結合する化合物は、好都合には4.5と1
0.5との間のpH、好ましくは6.5と7.5との間のpHを有す
る緩衝液中に置かれる。この緩衝液は、好都合にはリン
酸型または酢酸型であり得る。支持体は、０℃と40℃と
の間の温度での30分と24時間との間のインキュベーショ
ン時間の間、化合物を含有する緩衝液と接触されて、好
都合に維持される。インキュベーション後、反応しなか
った緩衝液は支持体から分離され、そして支持体は洗浄
される。好ましくは、支持体は、それが上記化合物を含
有しないこと以外は以前の緩衝液と同じ緩衝液で洗浄さ
れる。この化合物と反応しなかった支持体の活性部位を
飽和する必要があり得る。この場合、他の活性基を、こ
れらの活性部位と反応させる。この目的のために、好都
合には、血清アルブミン（例えばウシ血清アルブミン）
溶液またはカゼイン溶液および／またはポリビニルピロ
リドン溶液および／またはゼラチン溶液および／または
界面活性剤溶液が使用され、これは同時または連続的に
使用される。反応後、支持体は、好ましくはリンスされ
て、乾燥される。
次に、複合体に結合する化合物が付着される支持体
は、探索IC（sought−after IC）を含有する生物学的材
料（特に液体）と接触させて置かれる。この生物学的材
料は、好都合には4.5と10.5との間のpH、好ましくは5.6
と7.5との間のpHを与える緩衝液で希釈される。支持体
での反応は、好ましくは０℃と40℃との間の温度で、好
都合には約37℃の温度で、継続時間が30分と24時間との
間の期間で実施される。次に、反応しなかったICを含有
する溶液が、好都合には支持体から分離される。適切な
ところで、次に、支持体が、生理食塩水、好ましくは緩
衝化生理食塩水で洗浄される。
は、探索IC（sought−after IC）を含有する生物学的材
料（特に液体）と接触させて置かれる。この生物学的材
料は、好都合には4.5と10.5との間のpH、好ましくは5.6
と7.5との間のpHを与える緩衝液で希釈される。支持体
での反応は、好ましくは０℃と40℃との間の温度で、好
都合には約37℃の温度で、継続時間が30分と24時間との
間の期間で実施される。次に、反応しなかったICを含有
する溶液が、好都合には支持体から分離される。適切な
ところで、次に、支持体が、生理食塩水、好ましくは緩
衝化生理食塩水で洗浄される。
複合体の支持体への付着が、複合体のβ2GPI部分によ
ってなされる場合には、β2GPIへ結合する化合物は、β
2GPIを認識する抗体であり得、または、別のタンパク質
（（例えば、ウイルス起源または原核あるいは真核細胞
起源のタンパク質）（例えば、アルブミン））、または
生物学的化合物（例えば、脂肪酸または脂質（例えば、
リン脂質））、または化学的化合物（例えば、デキスト
ラン硫酸、ヘパリン硫酸、または界面活性剤）であり得
る。支持体のフリーラジカルまたは活性型ラジカルが、
ときには優先的にβ2GPIと結合し得る。
ってなされる場合には、β2GPIへ結合する化合物は、β
2GPIを認識する抗体であり得、または、別のタンパク質
（（例えば、ウイルス起源または原核あるいは真核細胞
起源のタンパク質）（例えば、アルブミン））、または
生物学的化合物（例えば、脂肪酸または脂質（例えば、
リン脂質））、または化学的化合物（例えば、デキスト
ラン硫酸、ヘパリン硫酸、または界面活性剤）であり得
る。支持体のフリーラジカルまたは活性型ラジカルが、
ときには優先的にβ2GPIと結合し得る。
β2GPIによって支持体へ結合されるβ2GPI/IC複合体
のICは、感染性、特異酵素反応、トレーサー（例えば、
蛍光または放射性標識トレーサー）、標識プローブとの
ハイブリダイゼーションによる特異核酸の検出、ポリメ
ラーゼ連鎖反応（「PCR」）、アッセイ、計測、可視
化、または光学または（電子）顕微鏡法のような任意の
公知手段によって、分離および／またはアッセイおよび
／または定量され得る。しかし、検出および／またはア
ッセイは、検出されるべきICのタンパク質を特異的に認
識する抗体の助けによって好ましく実施される。公知の
様式で、この抗体は、酵素標識（例えばペルオキシダー
ゼ）に複合体化され得る。抗体の過剰分は、洗浄によっ
て除去される。次に、抗体に複合体化された酵素に特異
的な基質が添加され、公知の様式で、この基質は、予め
決定された条件下で、発色産物に転換し、この発色産物
の形成は、探索ICの存在を示し、このICがアッセイされ
ることを可能にする。同位体標識に結合され、次に放射
分析によって検出されるICに対する抗体もまた、使用さ
れ得る。
のICは、感染性、特異酵素反応、トレーサー（例えば、
蛍光または放射性標識トレーサー）、標識プローブとの
ハイブリダイゼーションによる特異核酸の検出、ポリメ
ラーゼ連鎖反応（「PCR」）、アッセイ、計測、可視
化、または光学または（電子）顕微鏡法のような任意の
公知手段によって、分離および／またはアッセイおよび
／または定量され得る。しかし、検出および／またはア
ッセイは、検出されるべきICのタンパク質を特異的に認
識する抗体の助けによって好ましく実施される。公知の
様式で、この抗体は、酵素標識（例えばペルオキシダー
ゼ）に複合体化され得る。抗体の過剰分は、洗浄によっ
て除去される。次に、抗体に複合体化された酵素に特異
的な基質が添加され、公知の様式で、この基質は、予め
決定された条件下で、発色産物に転換し、この発色産物
の形成は、探索ICの存在を示し、このICがアッセイされ
ることを可能にする。同位体標識に結合され、次に放射
分析によって検出されるICに対する抗体もまた、使用さ
れ得る。
支持体への付着が複合体のIC部分によってなされる場
合、特に特異検出が望まれるとき、それは、好都合に標
識に複合体化されるβ2GPIによって可視化される。IC
は、支持体に直接または間接に、例えば抗体によって、
付着され得る。好都合には、標識は、酵素、放射性産
物、または蛍光産物であり得る。ICは、付着が直接であ
るときにはICの反応基を支持体の反応部位と反応させる
ことによって、または化合物（例えば抗体）を支持体の
反応基に付着させ、そして前もって支持体に付着してお
いたこの化合物にICを付着させることによって、支持体
に付着され得る。
合、特に特異検出が望まれるとき、それは、好都合に標
識に複合体化されるβ2GPIによって可視化される。IC
は、支持体に直接または間接に、例えば抗体によって、
付着され得る。好都合には、標識は、酵素、放射性産
物、または蛍光産物であり得る。ICは、付着が直接であ
るときにはICの反応基を支持体の反応部位と反応させる
ことによって、または化合物（例えば抗体）を支持体の
反応基に付着させ、そして前もって支持体に付着してお
いたこの化合物にICを付着させることによって、支持体
に付着され得る。
IC部分に結合する化合物によって複合体が付着された
複合体のβ2GPI部分は、任意の適切な手段によって検出
され得るが、それは、β2GPIに特異的であり、そして例
えば複合体化される抗体を使用して、好都合に検出され
得る。
複合体のβ2GPI部分は、任意の適切な手段によって検出
され得るが、それは、β2GPIに特異的であり、そして例
えば複合体化される抗体を使用して、好都合に検出され
得る。
本発明はまた、上記の方法を実施するための固体支持
体に関連し、これは、β2GPI/IC複合体の要素の１つ、
またはこの複合体の要素の１つを付着するのに適した基
質を付着するのに適していることに特徴づけられる。
体に関連し、これは、β2GPI/IC複合体の要素の１つ、
またはこの複合体の要素の１つを付着するのに適した基
質を付着するのに適していることに特徴づけられる。
下記の実施例は、純粋に例示により、かつ限定ではな
く、本発明を説明することを助ける。いくらかは、フラ
ンス特許出願第2 701 263号に従って得られたβ2'GPIを
使用して、実施された。
く、本発明を説明することを助ける。いくらかは、フラ
ンス特許出願第2 701 263号に従って得られたβ2'GPIを
使用して、実施された。
実施例1.レーシュマニアの視覚化
ａ）蛍光β2'GPIの使用
血液寒天上でのインビトロ培養によって得たLeishman
ia infantumプロマスティゴート（promastigotes）の懸
濁液を、光学顕微鏡下での観察のためにスライド上で、
アセトンで０℃で10分間固定する。次に、スライドを、
リン酸緩衝液中に５分間浸漬する。この緩衝液は以下
「PB」と称し、0.01Mの濃度のリン酸一ナトリウムおよ
びリン酸二ナトリウム、および0.15Mの濃度の塩化ナト
リウムを含有し、7.2±0.1のpHである。β2'GPIをフル
オレセインに結合させる。次に、それを固定化プロマス
ティゴート懸濁液上に20μg/mlおよび２μg/mlの濃度で
堆積させ、次に、これを加湿チャンバー中に20℃にて30
分間置く。結合されなかった蛍光β2'GPIを、２つの連
続PB浴で５分間、そのスライドを浸漬することにより除
去する。寄生虫の蛍光可視（特にそれらの外面（pourto
ur））の蛍光は、複合体形成の証拠を提供し、そしてこ
れらの複合体が可視化および同定されることを可能にす
る。
ia infantumプロマスティゴート（promastigotes）の懸
濁液を、光学顕微鏡下での観察のためにスライド上で、
アセトンで０℃で10分間固定する。次に、スライドを、
リン酸緩衝液中に５分間浸漬する。この緩衝液は以下
「PB」と称し、0.01Mの濃度のリン酸一ナトリウムおよ
びリン酸二ナトリウム、および0.15Mの濃度の塩化ナト
リウムを含有し、7.2±0.1のpHである。β2'GPIをフル
オレセインに結合させる。次に、それを固定化プロマス
ティゴート懸濁液上に20μg/mlおよび２μg/mlの濃度で
堆積させ、次に、これを加湿チャンバー中に20℃にて30
分間置く。結合されなかった蛍光β2'GPIを、２つの連
続PB浴で５分間、そのスライドを浸漬することにより除
去する。寄生虫の蛍光可視（特にそれらの外面（pourto
ur））の蛍光は、複合体形成の証拠を提供し、そしてこ
れらの複合体が可視化および同定されることを可能にす
る。
ｂ）β2'GPIのための別の標識の使用
別の実験では、Avrameas（Immunochem.（1969）８,43
〜52頁）に従って、アルカリホスファターゼに結合させ
たβ2'GPI（以下「DAP」と呼ばれる）は、スライドにア
セトンで固定した寄生虫と反応した。リン酸緩衝液は、
アルカリホスファターゼを阻害しないように、取り替え
た。
〜52頁）に従って、アルカリホスファターゼに結合させ
たβ2'GPI（以下「DAP」と呼ばれる）は、スライドにア
セトンで固定した寄生虫と反応した。リン酸緩衝液は、
アルカリホスファターゼを阻害しないように、取り替え
た。
実験室温度で実施したプロトコールは、以下のようで
あった：生理食塩水中５分間の寄生虫の再水和;DAP形態
のβ2'GPIの37℃30分間のインキュベーションおよび「T
riton X100」の商品名で販売されている界面活性剤0.05
％を含有する酢酸緩衝液中での希釈;50mM Tris−HCl（p
H＝8.2）、50mM NaCl中10分間の１回洗浄、生理食塩水
中10分間の１回洗浄、および「速読TR/ナフトール（fas
t read TR/naphthol）」の商品名で販売されているシス
テムを用いるアルカリホスファターゼ活性の検出。これ
らの条件下では、光学顕微鏡下の観察は、β2'GPIが、
１μg/mlの濃度でまだ有意に反応することを示す。
あった：生理食塩水中５分間の寄生虫の再水和;DAP形態
のβ2'GPIの37℃30分間のインキュベーションおよび「T
riton X100」の商品名で販売されている界面活性剤0.05
％を含有する酢酸緩衝液中での希釈;50mM Tris−HCl（p
H＝8.2）、50mM NaCl中10分間の１回洗浄、生理食塩水
中10分間の１回洗浄、および「速読TR/ナフトール（fas
t read TR/naphthol）」の商品名で販売されているシス
テムを用いるアルカリホスファターゼ活性の検出。これ
らの条件下では、光学顕微鏡下の観察は、β2'GPIが、
１μg/mlの濃度でまだ有意に反応することを示す。
ｃ）数株のレーシュマニアについての蛍光アッセイ
種々の種のレーシュマニアを、蛍光β2'GPIとレーシ
ュマニアとの相互作用を示すために使用した。以下をこ
の内容に関してテストした:L.infantum、L.marjon、L.g
uyanensis、L.tronicer、L.donorium、およびL.brazili
ensis。全ての種が、反応の間、0.05％TX100および0.25
M NaClの添加存在下で、蛍光β2'GPIとの有意な反応を
示した。
ュマニアとの相互作用を示すために使用した。以下をこ
の内容に関してテストした:L.infantum、L.marjon、L.g
uyanensis、L.tronicer、L.donorium、およびL.brazili
ensis。全ての種が、反応の間、0.05％TX100および0.25
M NaClの添加存在下で、蛍光β2'GPIとの有意な反応を
示した。
実施例２
実施例１と同じ実験を、トキソプラズマ（Toxoplasma
gondji）［sic］を使用して実施し、寄生虫の蛍光を、
少なくとも20μｇのβ2'GPI/mlで観察した。
gondji）［sic］を使用して実施し、寄生虫の蛍光を、
少なくとも20μｇのβ2'GPI/mlで観察した。
これらの実施例１および２の場合、他の実験は、蛍光
β2'GPIによるレーシュマニアおよびトキソプラズマの
検出感度を、インキュベーション緩衝液中に0.05％TX10
0および0.25M NaClを添加することによって増大させ得
た。
β2'GPIによるレーシュマニアおよびトキソプラズマの
検出感度を、インキュベーション緩衝液中に0.05％TX10
0および0.25M NaClを添加することによって増大させ得
た。
寄生虫（レーシュマニア）およびウサギまたはヒト赤
血球細胞の混合物をアセトンでスライドに固定し、次
に、上記の改良条件下で反応させた。観察された画像
は、強く蛍光した寄生虫と赤血球（これは非常に弱く標
識されている）との間で鮮明な対照を示す。
血球細胞の混合物をアセトンでスライドに固定し、次
に、上記の改良条件下で反応させた。観察された画像
は、強く蛍光した寄生虫と赤血球（これは非常に弱く標
識されている）との間で鮮明な対照を示す。
コントロールとして、β2'GPI以外の蛍光試薬を、蛍
光β2'GPIと同じタンパク質およびフルオレセイン濃度
で、上記の改良条件下で実施した。この試薬は、免疫精
製し、フルオレセインに結合させ、かつヤギIgGに特異
的であり、従って先験的に寄生虫に対して特異性を有さ
ないウサギＦ（ab'）c'から構成される。ところで、こ
の試薬はまた、匹敵する濃度のフルオレセイン純粋溶液
と同様に、同じ条件で使用されるとき、寄生虫において
「バックグラウンドノイズ」程度の非常に弱い蛍光のみ
を与えた。
光β2'GPIと同じタンパク質およびフルオレセイン濃度
で、上記の改良条件下で実施した。この試薬は、免疫精
製し、フルオレセインに結合させ、かつヤギIgGに特異
的であり、従って先験的に寄生虫に対して特異性を有さ
ないウサギＦ（ab'）c'から構成される。ところで、こ
の試薬はまた、匹敵する濃度のフルオレセイン純粋溶液
と同様に、同じ条件で使用されるとき、寄生虫において
「バックグラウンドノイズ」程度の非常に弱い蛍光のみ
を与えた。
実施例３
実施例１と同じ実験を、赤痢アメーバ（Entamoeba hi
stolytica）において実施し、そして寄生虫の蛍光を、
少なくとも20μｇの蛍光β2'GPI/mlで観察した。
stolytica）において実施し、そして寄生虫の蛍光を、
少なくとも20μｇの蛍光β2'GPI/mlで観察した。
実施例4:可溶性Leishmania infantum抗原の検出
使用する支持体は、96ウエルを有し平底であるマイク
ロ−ELISAマイクロタイタープレートであり、これにLei
shmania infantum可溶性抗原を付着させる。この感作支
持体に、BIOKEMA−Affinity Products（Switerland）を
散布する。
ロ−ELISAマイクロタイタープレートであり、これにLei
shmania infantum可溶性抗原を付着させる。この感作支
持体に、BIOKEMA−Affinity Products（Switerland）を
散布する。
10μg/ml濃度を有するペルオキシダーゼ標識β2'GPI
溶液を、0.05mol/l酢酸および酢酸ナトリウム、0.01％
ウシ血清アルブミン、および0.05重量％「Triton X10
0」を含有する酢酸緩衝液（pH5.6±0.1）中で調製す
る。この溶液の100μｌを各ウエルに加え、プレートを3
7℃で１時間30分の間インキュベートさせる。このイン
キュベーション後に、プレートのウエル内容物を吸引し
て取り出す。300μｌリン酸緩衝液を各ウエルに入れ、
次に、２分間の接触時間後に、緩衝液を吸引して取り出
す：この洗浄操作を３回繰り返す。
溶液を、0.05mol/l酢酸および酢酸ナトリウム、0.01％
ウシ血清アルブミン、および0.05重量％「Triton X10
0」を含有する酢酸緩衝液（pH5.6±0.1）中で調製す
る。この溶液の100μｌを各ウエルに加え、プレートを3
7℃で１時間30分の間インキュベートさせる。このイン
キュベーション後に、プレートのウエル内容物を吸引し
て取り出す。300μｌリン酸緩衝液を各ウエルに入れ、
次に、２分間の接触時間後に、緩衝液を吸引して取り出
す：この洗浄操作を３回繰り返す。
クエン酸ナトリウム緩衝液中のｏ−フェニレンジアミ
ンOPD2 HClの溶液100μｌを、各ウエルに加える。プレ
ートを常温にて30分間インキュベートさせ、次に、反応
を、各ウエルに50μl 2N H2SO4を加えて停止させる。反
応の終点で得られる492nmでの吸光度を、光学密度単位
（ODU）で測定する。この測定は、自動プレートリーダ
ーを使用して実施される。
ンOPD2 HClの溶液100μｌを、各ウエルに加える。プレ
ートを常温にて30分間インキュベートさせ、次に、反応
を、各ウエルに50μl 2N H2SO4を加えて停止させる。反
応の終点で得られる492nmでの吸光度を、光学密度単位
（ODU）で測定する。この測定は、自動プレートリーダ
ーを使用して実施される。
得られた結果は、Leishmania infantumの可溶性抗原
がβ2'GPIにより認識されることを示す。同じ結果が、
未標識β2'GPIを使用するときに得られる。この後者の
場合には、結果は、ペルオキシダーゼ標識抗β2'GPIモ
ノクローナル抗体によって続いて検出される。
がβ2'GPIにより認識されることを示す。同じ結果が、
未標識β2'GPIを使用するときに得られる。この後者の
場合には、結果は、ペルオキシダーゼ標識抗β2'GPIモ
ノクローナル抗体によって続いて検出される。
実施例5:β2'GPIのBorrelia抗原への結合
Borrelia抗原（I.Nilssonからの寄贈）が電気泳動後
に移されたニトロセルロース膜を用いた。
に移されたニトロセルロース膜を用いた。
0.1重量％ゼラチンおよび0.5％「TX100」を含有し、
5.6±0.1のpHを有する1ml酢酸緩衝液（0.05mol/l酢酸／
酢酸ナトリウム）の溶液中の約40ngのアルカリホスファ
ターゼ結合β2'GPIを、常温で１時間30分間、この膜と
反応させる。次に、この膜を、0.05重量％「TX100」を
含有し、5.6±0.1のpHを有する0.05mol/l酢酸緩衝液で
１回リンスする。次に、この膜を、0.01mol/lリン酸一
ナトリウムおよび二ナトリウム、0.15mol/l塩化ナトリ
ウム、0.05重量％「TX100」を含有し、7.00±0.1のpHを
有するリン酸緩衝液で２回リンスする。アルカリホスフ
ァターゼ活性は、塩酸で中和してpH8.8にされた50mM Tr
is（ヒドロキシメチル）アミノメタン（Tris−HCl）、
および0.1M NaClを含有する溶液中のニトロブル−テト
ラゾリウム（NBT）および５−ブロモ−４−クロロ−３
−インドリルホスフェート（bomo4−chloro 3 ondolyl
phosphate）（BCIP）の存在下で検出される。β2'GPI
が、Borrelia afzelii抗原、特に、病原性を示すと考え
られる抗原（例えば、Ingrid Nilssonら（Serodiagn.Im
munother.Infect.Disease,1993,５,245〜250頁）による
刊行物に使用されている用語に従った、p39、osp B、os
p A、およびosp C）の存在を検出することを可能にする
ことが、膜上で見られる。同じ条件下で、アルカリホス
ファターゼ単独との反応はみられない。
5.6±0.1のpHを有する1ml酢酸緩衝液（0.05mol/l酢酸／
酢酸ナトリウム）の溶液中の約40ngのアルカリホスファ
ターゼ結合β2'GPIを、常温で１時間30分間、この膜と
反応させる。次に、この膜を、0.05重量％「TX100」を
含有し、5.6±0.1のpHを有する0.05mol/l酢酸緩衝液で
１回リンスする。次に、この膜を、0.01mol/lリン酸一
ナトリウムおよび二ナトリウム、0.15mol/l塩化ナトリ
ウム、0.05重量％「TX100」を含有し、7.00±0.1のpHを
有するリン酸緩衝液で２回リンスする。アルカリホスフ
ァターゼ活性は、塩酸で中和してpH8.8にされた50mM Tr
is（ヒドロキシメチル）アミノメタン（Tris−HCl）、
および0.1M NaClを含有する溶液中のニトロブル−テト
ラゾリウム（NBT）および５−ブロモ−４−クロロ−３
−インドリルホスフェート（bomo4−chloro 3 ondolyl
phosphate）（BCIP）の存在下で検出される。β2'GPI
が、Borrelia afzelii抗原、特に、病原性を示すと考え
られる抗原（例えば、Ingrid Nilssonら（Serodiagn.Im
munother.Infect.Disease,1993,５,245〜250頁）による
刊行物に使用されている用語に従った、p39、osp B、os
p A、およびosp C）の存在を検出することを可能にする
ことが、膜上で見られる。同じ条件下で、アルカリホス
ファターゼ単独との反応はみられない。
実施例6:B型肝炎ウイルスのHBs抗原の検出
使用する支持体は、96ウエルを有し平底であるマイク
ロ−ELISAマイクロタイタープレートであり、これは、
「DYNATECH」によって販売されている。「TRANSGENE」
から供給されたHIV2 p26 ROD組換えタンパク質の２μg/
ml溶液を、0.01mol/lリン酸一ナトリウムおよび二ナト
リウム、および0.15mol/l塩化ナトリウムを含有し、7.0
0±0.05のpHを有するリン酸緩衝液中に調製する。この
溶液の100μｌを、マイクロプレートの各ウエルの底に
堆積させる。次に後者を＋４℃で18時間インキュベーシ
ョンする。この後、各ウエルの液体を吸引して取り出
す。次に、0.05重量％界面活性剤（市販商品名「TX10
0」で販売されている）を含有する上記リン酸緩衝液300
〜400μｌを、各ウエルに入れる。この緩衝液を、支持
体と３分間接触させ、そして吸引して取り出す。この洗
浄操作を３回実施する。
ロ−ELISAマイクロタイタープレートであり、これは、
「DYNATECH」によって販売されている。「TRANSGENE」
から供給されたHIV2 p26 ROD組換えタンパク質の２μg/
ml溶液を、0.01mol/lリン酸一ナトリウムおよび二ナト
リウム、および0.15mol/l塩化ナトリウムを含有し、7.0
0±0.05のpHを有するリン酸緩衝液中に調製する。この
溶液の100μｌを、マイクロプレートの各ウエルの底に
堆積させる。次に後者を＋４℃で18時間インキュベーシ
ョンする。この後、各ウエルの液体を吸引して取り出
す。次に、0.05重量％界面活性剤（市販商品名「TX10
0」で販売されている）を含有する上記リン酸緩衝液300
〜400μｌを、各ウエルに入れる。この緩衝液を、支持
体と３分間接触させ、そして吸引して取り出す。この洗
浄操作を３回実施する。
健常ドナーからの３つの血清試料およびＢ型肝炎ウイ
ルス感染患者からの４つの血清試料を使用した。血清試
料を、0.05mol/ml酢酸および酢酸ナトリウム、0.5重量
％TX100、および0.01重量％ウシ血清アルブミンを含有
し、5.6±0.1のpHを有する酢酸緩衝液で、10、100、ま
たは1000倍に希釈する。100μｌ溶液を、上記のように
調製したプレートの各ウエルの底に堆積させる。このプ
レートを37℃で90分間インキュベートさせる。このイン
キュベーション後、0.05重量％TX100を含有するリン酸
緩衝液300μｌを各ウエルに入れることにより洗浄を行
う。この緩衝溶液を２分間接触させて、吸引して取り出
す。この洗浄操作を４回繰り返す。
ルス感染患者からの４つの血清試料を使用した。血清試
料を、0.05mol/ml酢酸および酢酸ナトリウム、0.5重量
％TX100、および0.01重量％ウシ血清アルブミンを含有
し、5.6±0.1のpHを有する酢酸緩衝液で、10、100、ま
たは1000倍に希釈する。100μｌ溶液を、上記のように
調製したプレートの各ウエルの底に堆積させる。このプ
レートを37℃で90分間インキュベートさせる。このイン
キュベーション後、0.05重量％TX100を含有するリン酸
緩衝液300μｌを各ウエルに入れることにより洗浄を行
う。この緩衝溶液を２分間接触させて、吸引して取り出
す。この洗浄操作を４回繰り返す。
次に、Ｂ型肝炎ウイルスのHBs抗原に対するペルオキ
シダーゼ複合体化特異モノクローナル抗体の溶液100μ
ｌを、各ウエルに加える。このプレートを37℃で60分間
インキュベートさせる。このインキュベーション後、プ
レートの各ウエルの内容物を吸引して取り出す。0.05重
量％TX100を含有するリン酸緩衝液300μｌを、各ウエル
に入れ、そして次に、この緩衝溶液を、２分間接触後に
吸引して取り出す。この洗浄操作を５回繰り返す。
シダーゼ複合体化特異モノクローナル抗体の溶液100μ
ｌを、各ウエルに加える。このプレートを37℃で60分間
インキュベートさせる。このインキュベーション後、プ
レートの各ウエルの内容物を吸引して取り出す。0.05重
量％TX100を含有するリン酸緩衝液300μｌを、各ウエル
に入れ、そして次に、この緩衝溶液を、２分間接触後に
吸引して取り出す。この洗浄操作を５回繰り返す。
クエン酸ナトリウム緩衝液中のｏ−フェニレンジアミ
ン、2HClの溶液100μｌを、各ウエルに加える。プレー
トを常温にて30分間インキュベートさせ、次に、反応
を、各ウエルに50μl 2N H2SO4を加えて停止させる。反
応の終点で得られる492nmでの吸光度を、自動プレート
リーダーを用いて測定する。
ン、2HClの溶液100μｌを、各ウエルに加える。プレー
トを常温にて30分間インキュベートさせ、次に、反応
を、各ウエルに50μl 2N H2SO4を加えて停止させる。反
応の終点で得られる492nmでの吸光度を、自動プレート
リーダーを用いて測定する。
各患者またはドナーから得た吸光度の平均値を表１に
示す（光学密度単位×1000）。HBsAgは、４人の患者の
場合には効率よく検出されたが、３人の健常被検体の場
合には検出されなかった。
示す（光学密度単位×1000）。HBsAgは、４人の患者の
場合には効率よく検出されたが、３人の健常被検体の場
合には検出されなかった。
実施例７
β2GPIに対して特異的なモノクローナル抗体（「8C
3」と呼ばれる:J.Arvieuxからの寄贈）を支持体に付着
させること以外は、実施例６と同様に、同じ方法を使用
した。同様の結果が得られた。
3」と呼ばれる:J.Arvieuxからの寄贈）を支持体に付着
させること以外は、実施例６と同様に、同じ方法を使用
した。同様の結果が得られた。
これらの２つの実施例６および７の場合には、一方で
は、β2GPIが支持体に付着するようになることが、特異
抗体によりそれを検出することにより示され、そして他
方では、Ｂ型肝炎を患う患者の血清中に存在する（β2G
PI/HBsAg）複合体の付着を、β2GPI付着のために調製し
た支持体へのその付着を、β2GPIに特異的な抗体と共に
患者の血清を37℃で30分間プレインキュベーションを行
うことによってブロックすることにより、阻害し得た。
これらの結果は、Ｂ型肝炎ウイルスのHBsAgが、血漿中
に存在するβ2GPIによって認識され得ることを示す。こ
の後者は、これらのアッセイで、HIV2 p26 RODまたは特
異抗体に結合される。
は、β2GPIが支持体に付着するようになることが、特異
抗体によりそれを検出することにより示され、そして他
方では、Ｂ型肝炎を患う患者の血清中に存在する（β2G
PI/HBsAg）複合体の付着を、β2GPI付着のために調製し
た支持体へのその付着を、β2GPIに特異的な抗体と共に
患者の血清を37℃で30分間プレインキュベーションを行
うことによってブロックすることにより、阻害し得た。
これらの結果は、Ｂ型肝炎ウイルスのHBsAgが、血漿中
に存在するβ2GPIによって認識され得ることを示す。こ
の後者は、これらのアッセイで、HIV2 p26 RODまたは特
異抗体に結合される。
実施例８
実施例６の場合と同じ方法を使用すると、結果は、感
染組織から抽出したレーシュマニア（LEISHMANIA）寄生
虫によってもたらされる表面抗原を検出するのにポジテ
ィブであった。
染組織から抽出したレーシュマニア（LEISHMANIA）寄生
虫によってもたらされる表面抗原を検出するのにポジテ
ィブであった。
実施例9:β2GPI/不死化リンパ球細胞系細胞複合体の形
成 蛍光β2GPIを、PBS緩衝液中で37℃で１時間、２回前
もってリンスした「CEM」細胞系細胞（106/ml）とイン
キュベートする。PBS緩衝液中３回の洗浄後、細胞を、
２％パラホルムアルデヒドで固定し、次にフローサイト
メトリーで分析する。結合スペクトルの分析は、ほとん
どの細胞にβ2GPIが存在することを示す。この量は、最
初の投与量に依存して存在し、10〜100μg/mlであっ
た。
成 蛍光β2GPIを、PBS緩衝液中で37℃で１時間、２回前
もってリンスした「CEM」細胞系細胞（106/ml）とイン
キュベートする。PBS緩衝液中３回の洗浄後、細胞を、
２％パラホルムアルデヒドで固定し、次にフローサイト
メトリーで分析する。結合スペクトルの分析は、ほとん
どの細胞にβ2GPIが存在することを示す。この量は、最
初の投与量に依存して存在し、10〜100μg/mlであっ
た。
この結合は、健常ドナーからの正常末梢血リンパ球と
は違って、他の不死化細胞系の場合（例えばＴ細胞系:S
VPT1およびMOLT4、または単球系:TFPIおよびU937）にお
いて観察された。この不死化細胞系は、市販「Ficoll」
溶液の緩衝を介して遠心分離により単離し、次にPBSで
リンスした。
は違って、他の不死化細胞系の場合（例えばＴ細胞系:S
VPT1およびMOLT4、または単球系:TFPIおよびU937）にお
いて観察された。この不死化細胞系は、市販「Ficoll」
溶液の緩衝を介して遠心分離により単離し、次にPBSで
リンスした。
実施例10:（β2GPI）n/HBsAg複合体の結合
本実施例では、（β2GPI）ｎ部分に結合する化合物
は、WO 93/21228に記載の方法によって精製されたヒト
血清アルブミン（HSA）である。ELISAプレート（Nunc M
axisorb）に0.1M Trisグリシン（pH8.8）中の１％HSA溶
液を予め添加し、次いでPBS（pH7.2）で全体的に洗浄す
る。
は、WO 93/21228に記載の方法によって精製されたヒト
血清アルブミン（HSA）である。ELISAプレート（Nunc M
axisorb）に0.1M Trisグリシン（pH8.8）中の１％HSA溶
液を予め添加し、次いでPBS（pH7.2）で全体的に洗浄す
る。
HBsAg＋血清または健常ドナー血清を、酢酸ナトリウ
ム（50mM、pH5.6）での1000倍希釈で、37℃で１時間イ
ンキュベートさせ、実施例６と同様に但しTX100非存在
下で実験を実施する。
ム（50mM、pH5.6）での1000倍希釈で、37℃で１時間イ
ンキュベートさせ、実施例６と同様に但しTX100非存在
下で実験を実施する。
ドナー血清または血清なしコントロールは、いかなる
著しいシグナルをも与えない（＜0.05odu）。HBsAg血清
は、有意なシグナルを与える（近似1.5odu）。従って、
HBsAgは捕捉される。血清希釈物がインキュベートされ
る場合、 （ａ）800μg HSA/mlの存在下では、シグナルは、80％
より大きく減少され、このことは、支持体に付着される
HSAへの結合が事実であることを示す； （ｂ）４μg β2GPI/mlの存在下、すなわち血清から生
じる内部β２の単なる20倍量で、シグナルはほとんど40
％減少され、このことは、内部複合体のいくらかが支持
体へ付着していることを表す。
著しいシグナルをも与えない（＜0.05odu）。HBsAg血清
は、有意なシグナルを与える（近似1.5odu）。従って、
HBsAgは捕捉される。血清希釈物がインキュベートされ
る場合、 （ａ）800μg HSA/mlの存在下では、シグナルは、80％
より大きく減少され、このことは、支持体に付着される
HSAへの結合が事実であることを示す； （ｂ）４μg β2GPI/mlの存在下、すなわち血清から生
じる内部β２の単なる20倍量で、シグナルはほとんど40
％減少され、このことは、内部複合体のいくらかが支持
体へ付着していることを表す。
同様の実験が、プレートへの予備添加を行わずに実施
される場合、HBsもまた可視化され、HSA存在下でのプレ
インキュベーションで97％阻害され、そして添加β2GPI
の存在下では65％阻害されることが観察される。
される場合、HBsもまた可視化され、HSA存在下でのプレ
インキュベーションで97％阻害され、そして添加β2GPI
の存在下では65％阻害されることが観察される。
実施例11:Mycoplasma penetransタンパク質との（β2'G
PI）ａの複合体の形成 本方法は、２％オクチルグルコシドで処理した数マイ
クログラムのICを含有し、EURIS法（14,rue du Chapeau
Rouge−34500 BEZIERS（フランス））によって飽和さ
れたニトロセルロース細片上で、実施例５と同様に実施
した。DAP形態で標識されたβ2GPIは、免疫特異血清、
またはp35（特に、35、40、および45Kdの抗原に対して
強く、そして65Kd抗原に対しては弱い）に特異的な血清
によって検出される特異抗原に明らかに結合される。
PI）ａの複合体の形成 本方法は、２％オクチルグルコシドで処理した数マイ
クログラムのICを含有し、EURIS法（14,rue du Chapeau
Rouge−34500 BEZIERS（フランス））によって飽和さ
れたニトロセルロース細片上で、実施例５と同様に実施
した。DAP形態で標識されたβ2GPIは、免疫特異血清、
またはp35（特に、35、40、および45Kdの抗原に対して
強く、そして65Kd抗原に対しては弱い）に特異的な血清
によって検出される特異抗原に明らかに結合される。
実施例12:破傷風トキソイドへの（β2'GPI）［sic］の
結合 破傷風トキソイド（ELOCORIDE,Behring）を、10％ア
クリルアミドゲルでの電気泳動後に、約0.5〜２μg/mm2
の速度でニトロセルロースへ移した。
結合 破傷風トキソイド（ELOCORIDE,Behring）を、10％ア
クリルアミドゲルでの電気泳動後に、約0.5〜２μg/mm2
の速度でニトロセルロースへ移した。
EURIS法により膜を飽和し、50mM Tris−HCl（pH＝8.
2）、50mM NaCl溶液で４回リンスし、50mM Hepes−NaOH
（pH6.8±0.1）で１回リンスした後、後者の緩衝液1ml
中の100ng DAPを膜に加え、これを、10μｇカルジオリ
ピン（「CL」と呼ぶ）の存在または非存在下で、25℃に
て１時間インキュベーションを行った。この膜を、50mM
Tris−HCl（pH＝7.2）、150mM NaClの1mlで４回リンス
した。
2）、50mM NaCl溶液で４回リンスし、50mM Hepes−NaOH
（pH6.8±0.1）で１回リンスした後、後者の緩衝液1ml
中の100ng DAPを膜に加え、これを、10μｇカルジオリ
ピン（「CL」と呼ぶ）の存在または非存在下で、25℃に
て１時間インキュベーションを行った。この膜を、50mM
Tris−HCl（pH＝7.2）、150mM NaClの1mlで４回リンス
した。
実施例５と同様に可視化した後、破傷風抗原を含有す
る帯が、CLの存在下で着色させる唯一のものである。CL
の非存在下では、反応は起こらず、これは、これらの条
件下で複合体を形成させるためにはCLの存在が必要であ
ることを示す。
る帯が、CLの存在下で着色させる唯一のものである。CL
の非存在下では、反応は起こらず、これは、これらの条
件下で複合体を形成させるためにはCLの存在が必要であ
ることを示す。
β2GPI/IC複合体形成での界面活性剤および／または
脂質の役割は、以下に報告されている実験によって、よ
り詳細に説明された。
脂質の役割は、以下に報告されている実験によって、よ
り詳細に説明された。
１リットルあたり7.5g Trisおよび14.4gグリシン、お
よび20％メタノールを含有する水溶液中の100〜200ngの
ウイルスタンパク質を、２〜4mm2のニトロセルロース膜
（「Schleicher and Schull」によって販売されているB
A04）にゆっくりと濾過させる。この膜を、メタノール
を含まないが、１％HSAを含有する同じ緩衝液で飽和さ
せる。この緩衝液は、実施例10に示されているようにし
て得た。次に、支持体を、50mM Tris−HCl（pH＝8.
2）、50mM NaCl中で４回、短時間予備洗浄し、次に、β
2GPIと、反応媒体中で１〜４時間インキュベートさせ、
最後に、アフターリンスで洗浄する。β2GPIは下記に示
すように可視化する。
よび20％メタノールを含有する水溶液中の100〜200ngの
ウイルスタンパク質を、２〜4mm2のニトロセルロース膜
（「Schleicher and Schull」によって販売されているB
A04）にゆっくりと濾過させる。この膜を、メタノール
を含まないが、１％HSAを含有する同じ緩衝液で飽和さ
せる。この緩衝液は、実施例10に示されているようにし
て得た。次に、支持体を、50mM Tris−HCl（pH＝8.
2）、50mM NaCl中で４回、短時間予備洗浄し、次に、β
2GPIと、反応媒体中で１〜４時間インキュベートさせ、
最後に、アフターリンスで洗浄する。β2GPIは下記に示
すように可視化する。
一般には、脂質および／または界面活性剤の非存在下
では、β2GPIは、飽和に使用されるアルブミンに結合
し、そして特定のウイルスタンパク質には結合しないこ
とが観察される。しかし、界面活性剤の存在下では、逆
が観察される。すなわち、β2GPIはアルブミンに結合し
ないが、特定のウイルスタンパク質に結合する。カルジ
オリピンのようなリン脂質はこのような結合を誘導す
る。
では、β2GPIは、飽和に使用されるアルブミンに結合
し、そして特定のウイルスタンパク質には結合しないこ
とが観察される。しかし、界面活性剤の存在下では、逆
が観察される。すなわち、β2GPIはアルブミンに結合し
ないが、特定のウイルスタンパク質に結合する。カルジ
オリピンのようなリン脂質はこのような結合を誘導す
る。
より正確には、以下の結果が観察された：
Ａ）以下の工程を実施する:1mlあたり50ngのDAPとの反
応;50mM Tris−HCl（pH＝8.2）、50mM NaClでの４回ア
フターリンス;Merck推奨条件に従って、0.1M Tris−HCl
（pH＝8.8）、NBT、およびBCIPでのDAPの可視化。
応;50mM Tris−HCl（pH＝8.2）、50mM NaClでの４回ア
フターリンス;Merck推奨条件に従って、0.1M Tris−HCl
（pH＝8.8）、NBT、およびBCIPでのDAPの可視化。
反応媒体（50mM酢酸ナトリウム、pH＝5.6）中に界面
活性剤が存在しない場合、組換えタンパク質HVI1p18お
よびp25およびHIV2p26（TRANSGENE）は、反応しない
（支持体の白色帯）た、一方、組換えタンパク質HIV gp
160は、DAPにわずかに結合し、そしてヒトアルブミンも
また反応する（着色バックグラウンド）。逆に、0.5％T
X100または「Triton 405」または0.2％「Tween 20」の
存在下では、アルブミンはもはやいかなる反応も示さな
いが、一方、HIV2p26およびHIV1p18は、強い反応を示
す。HIV1gp160は、界面活性剤なしでの反応より強い反
応を示し、そしてHIV1p25は、弱い反応を示す。
活性剤が存在しない場合、組換えタンパク質HVI1p18お
よびp25およびHIV2p26（TRANSGENE）は、反応しない
（支持体の白色帯）た、一方、組換えタンパク質HIV gp
160は、DAPにわずかに結合し、そしてヒトアルブミンも
また反応する（着色バックグラウンド）。逆に、0.5％T
X100または「Triton 405」または0.2％「Tween 20」の
存在下では、アルブミンはもはやいかなる反応も示さな
いが、一方、HIV2p26およびHIV1p18は、強い反応を示
す。HIV1gp160は、界面活性剤なしでの反応より強い反
応を示し、そしてHIV1p25は、弱い反応を示す。
Ｂ）同条件下であるが、50mM Tris−HCl（pH＝8.2）の
異なる反応媒体では、HIV1p18のみが、界面活性剤の存
在下で弱く反応する。
異なる反応媒体では、HIV1p18のみが、界面活性剤の存
在下で弱く反応する。
Ｃ）以下の工程を実施する:50mM Hepes、NaOH（pH＝6.
8）での１回前洗浄；同じ緩衝液中での、10μｇのカル
ジオリピン/mlの存在または非存在下での100ng DAP/ml
との１時間反応;0.15M NaCl、50mM Tris−HCl（pH＝7.
2）、150mM NaClでの４回アフターリンス、および0.15M
NaClでの１回アフターリンス、およびＡ）と同様の可
視化。
8）での１回前洗浄；同じ緩衝液中での、10μｇのカル
ジオリピン/mlの存在または非存在下での100ng DAP/ml
との１時間反応;0.15M NaCl、50mM Tris−HCl（pH＝7.
2）、150mM NaClでの４回アフターリンス、および0.15M
NaClでの１回アフターリンス、およびＡ）と同様の可
視化。
４つのHIVタンパク質はいずれもカルジオリピンの非
存在下では反応しないが、この４つはそれが存在すると
き反応する。
存在下では反応しないが、この４つはそれが存在すると
き反応する。
Ｄ）以下の工程を実施する:50mM Tris−HCl（pH＝7.6）
中、および１μｇのβ2'GPI/mlおよび20μｇのCL/mlの
存在下での１時間反応、反応緩衝液での４回洗浄、なら
びに0.15M NaClおよび0.05％「Tween 20」が加えられた
同じ緩衝液中での、溶液中の54μｇのアルカリホスファ
ターゼ結合モノクローナル抗体8C3/mlの存在下での１時
間インキュベーションによるβ2'GPIの可視化；次に、
同じ溶液での４回リンスおよび0.15M NaClでの１回リン
ス、ならびにＡ）と同様の可視化。
中、および１μｇのβ2'GPI/mlおよび20μｇのCL/mlの
存在下での１時間反応、反応緩衝液での４回洗浄、なら
びに0.15M NaClおよび0.05％「Tween 20」が加えられた
同じ緩衝液中での、溶液中の54μｇのアルカリホスファ
ターゼ結合モノクローナル抗体8C3/mlの存在下での１時
間インキュベーションによるβ2'GPIの可視化；次に、
同じ溶液での４回リンスおよび0.15M NaClでの１回リン
ス、ならびにＡ）と同様の可視化。
４つのウイルスタンパク質が反応し、そしてHIV1p25
が強く反応するが、一方、β2'GPIのないまたはCLのな
いコントロールは、眼に見える反応を全く示さない。
が強く反応するが、一方、β2'GPIのないまたはCLのな
いコントロールは、眼に見える反応を全く示さない。
とりわけ、これらの実施例は、界面活性剤およびまた
は脂質（特にリン脂質）が、もしこの相互作用に関与し
なければ、ウイルスタンパク質との相互作用を促進し得
ること、およびアルブミンとの結合は、それが使用され
る界面活性剤に感受性であるので、異なる特性のもので
あることを示す。
は脂質（特にリン脂質）が、もしこの相互作用に関与し
なければ、ウイルスタンパク質との相互作用を促進し得
ること、およびアルブミンとの結合は、それが使用され
る界面活性剤に感受性であるので、異なる特性のもので
あることを示す。
界面活性剤またはリン脂質は、β2GPIの存在の前の段
階で加えられ得ることもまた、注目される。HIV1ウイル
スタンパク質におけるリン脂質レベルは高いことが知ら
れ、そして界面活性剤の存在下でβ2GPIと組換えHBsAg
との間の結合が記載されたことは、注目される。いくつ
かのICの場合、およびいくつかの環境条件下では、界面
活性剤または脂質が、β2GPI/IC複合体を形成させるた
めに必要であることが、このことから分かる。
階で加えられ得ることもまた、注目される。HIV1ウイル
スタンパク質におけるリン脂質レベルは高いことが知ら
れ、そして界面活性剤の存在下でβ2GPIと組換えHBsAg
との間の結合が記載されたことは、注目される。いくつ
かのICの場合、およびいくつかの環境条件下では、界面
活性剤または脂質が、β2GPI/IC複合体を形成させるた
めに必要であることが、このことから分かる。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ
Ｃ１２Ｑ 1/68 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ
1/70 1/70
// Ｇ０１Ｎ 33/576 Ｇ０１Ｎ 33/576 Ｂ
(72)発明者 グラフラン， ユベール
フランス国 モンペリエ エフ−34000,
アベニュー デュ プロフェスール−
グラセ， 10 エイ
(72)発明者 ビアス，フランシスコ
フランス国 モギオ，エフ―34130，ル
ート ド バヤルグ，マス アブリガス
(56)参考文献 特表 昭60−501241（ＪＰ，Ａ)
国際公開93／016387（ＷＯ，Ａ１)
国際公開91／002816（ＷＯ，Ａ１)
仏国特許出願公開2701319（ＦＲ，Ａ
１)
Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｏｒｏｌ
ｏｇｙ，1994年，ｖｏｌ．68，ｎｏ.
４，ｐ2415−2424
(58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名)
G01N 33/53 - 33/577
Claims (23)
- 【請求項１】生物学的材料中の感染性化合物（IC）を分
離および／または検出および／または定量する方法であ
って、該化合物は、感染因子の特異構成性化合物、内因
性または外因性の完全または不完全な感染因子を含む構
造体、それらの代謝物を含む構造体、該感染因子のある
種の特異性を示すこれらの感染因子の組み立て体を含む
構造体、および上述の化合物によるかまたは異常様式で
発現される遺伝子の発現によって生物において特異的に
誘導される化合物からなる群より選択され、該方法は、
β２糖タンパク質Ｉと感染性化合物との複合体（β2GPI
/IC）が、分離および／または検出および／または定量
されることに特徴づけられ、該複合体は、適切な手段に
よって同定され得、かつ （ａ）（β2GPI）n/IC、ここで（β2GPI）ｎは生物学的
材料中に存在するβ２糖タンパク質Ｉであり、そしてIC
はウイルス化合物VICまたは非ウイルス化合物nVICであ
る；および （ｂ）（β2GPI）a/nVIC、ここで（β2GPI）ａは生物学
的材料に添加されるβ２糖タンパク質Ｉであり、そして
nVICは非ウイルス感染性化合物である、 からなる群より選択される、方法。 - 【請求項２】前記ICが、β2GPIに結合する物質を使用し
て、β2GPI/IC複合体を認識することによって、分離お
よび／または検出および／または定量されることに特徴
づけられる、請求項１に記載の方法。 - 【請求項３】前記β2GPI/IC複合体が、該複合体が形成
される媒体において、該複合体を支持体へ前もって付着
させずに、該媒体を付着させてまたは付着させないで、
分離および／または検出および／または定量されること
に特徴づけられる、請求項１または２に記載の方法。 - 【請求項４】前記β2GPI/IC複合体に含まれる要素の１
つが、支持体上に保持されることに特徴づけられる、請
求項１または２に記載の方法。 - 【請求項５】前記支持体が固体支持体であることに特徴
づけられる、請求項４に記載の方法。 - 【請求項６】使用される前記支持体が、膜、マイクロタ
イタープレート、または顕微鏡スライドであることに特
徴づけられる、請求項５に記載の方法。 - 【請求項７】前記β2GPI/IC複合体が、該複合体のβ2GP
I要素によって前記支持体に保持されることに特徴づけ
られる、請求項４から６のいずれか一項に記載の方法。 - 【請求項８】前記β2GPI/IC複合体が、該複合体のIC要
素によって前記支持体に保持されることに特徴づけられ
る、請求項４から６のいずれか一項に記載の方法。 - 【請求項９】前記IC要素が、前記β2GPI/IC複合体が形
成される前に前記支持体に付着され、次に、該複合体が
形成され、そして次に、該複合体の該β2GPI要素が分離
および／または検出および／または定量されることに特
徴づけられる、請求項８に記載の方法。 - 【請求項１０】物理的、化学的、または生化学的に支持
体へ付着される、生物学的材料のICが、前記複合体のβ
2GPIに結合する物質を使用して、分離および／または検
出および／または定量されることに特徴づけられる、請
求項８または９に記載の方法。 - 【請求項１１】前記β2GPI/IC複合体が、該複合体のβ2
GPI部分またはIC部分のいずれかに結合する化合物によ
って支持体に保持され、そこで該支持体に付着される複
合体が、前記生物学的材料から分離され、そして該複合
体が、該複合体の他方の部分の認識により分離および／
または検出および／または定量されることに特徴づけら
れる、請求項１または４に記載の方法。 - 【請求項１２】前記複合体が、該複合体のβ2GPI部分に
結合する化合物によって前記支持体に保持されることに
特徴づけられる、請求項11に記載の方法。 - 【請求項１３】前記複合体が、該複合体のIC部分に結合
する化合物によって前記支持体に保持されることに特徴
づけられる、請求項11に記載の方法。 - 【請求項１４】β2GPIに結合する化合物が、β2GPIに特
異的である抗体、別のタンパク質、およびβ2GPIに結合
する生物学的または化学的化合物からなる群より選択さ
れることに特徴づけられる、請求項２に記載の方法。 - 【請求項１５】β2GPIを認識するタンパク質がHIV2 p26
RODタンパク質であることに特徴づけられる、請求項14
に記載の方法。 - 【請求項１６】前記複合体のICが、HIV1、HIV2、HSV、H
BV、およびウイルス起源の粒子またはタンパク質からな
る群に属することに特徴づけられる、請求項１に記載の
方法。 - 【請求項１７】前記複合体のICが、細菌、寄生虫、マイ
コプラズマ、真菌、および異常動物細胞からなる群に属
することに特徴づけられる、請求項１に記載の方法。 - 【請求項１８】支持体に付着される前記β2GPI/IC複合
体のICが、感染性、特異酵素反応、蛍光または放射性標
識トレーサー、標識プローブとのハイブリダイゼーショ
ンまたはポリメラーゼ連鎖反応（PCR）による核酸の検
出、あるいはICに特異的である抗体の使用によって、分
離および／または検出および／または定量されることに
特徴づけられる、請求項７に記載の方法。 - 【請求項１９】使用されるβ2GPIの形態が、純粋形態で
あるかまたは純粋形態ではないβ2'GPIであることに特
徴づけられる、請求項１から18のいずれか一項に記載の
方法。 - 【請求項２０】前記ICとの複合体を組み立てるために使
用されるβ2GPIが標識され、該複合体が、該標識により
検出および／または定量されることに特徴づけられる、
請求項１から19のいずれか一項に記載の方法。 - 【請求項２１】前記β2GPIが、酵素、放射性産物、また
は蛍光産物によって標識されることに特徴づけられる、
請求項20に記載の方法。 - 【請求項２２】前記β2GPI要素が、前記β2GPI/IC複合
体が形成される前に前記支持体に付着され、次に、該複
合体が形成され、そして次に、該複合体のIC要素が検出
および／または定量されることに特徴づけられる、請求
項６に記載の方法。 - 【請求項２３】前記複合体の要素の少なくとも１つが、
動物起源であるか、あるいは遺伝子工学および／または
化学工学によって生成されることに特徴づけられる、請
求項１から22のいずれか一項に記載の方法。
Applications Claiming Priority (5)
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|---|---|---|---|
| FR94/09529 | 1994-08-01 | ||
| FR9409528A FR2723204B1 (fr) | 1994-08-01 | 1994-08-01 | Procede de detection et/ou de dosage de compose(s) infectueux dans un materiau biologique et support utilise pour ledit procede |
| FR9409529A FR2723203B1 (fr) | 1994-08-01 | 1994-08-01 | Procede de detection et/ou de quantification de composes infectueux autres que viraux et support pour la mise en oeuvre du procede |
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| PCT/FR1995/001032 WO1996004559A1 (fr) | 1994-08-01 | 1995-07-31 | Procede de separation et/ou de detection et/ou de quantification de compose(s) infectieux et support pour la mise en ×uvre du procede |
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|---|---|---|---|
| JP2003320444A Division JP2004037469A (ja) | 1994-08-01 | 2003-09-11 | 感染性化合物の分離および／または検出および／または定量を行うための方法およびこの方法を実施するための支持体 |
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| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH10503593A JPH10503593A (ja) | 1998-03-31 |
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ID=26231338
Family Applications (2)
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|---|---|---|---|
| JP50625996A Expired - Fee Related JP3524929B2 (ja) | 1994-08-01 | 1995-07-31 | 感染性化合物の分離および／または検出および／または定量を行うための方法およびこの方法を実施するための支持体 |
| JP2003320444A Withdrawn JP2004037469A (ja) | 1994-08-01 | 2003-09-11 | 感染性化合物の分離および／または検出および／または定量を行うための方法およびこの方法を実施するための支持体 |
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|---|---|---|---|
| JP2003320444A Withdrawn JP2004037469A (ja) | 1994-08-01 | 2003-09-11 | 感染性化合物の分離および／または検出および／または定量を行うための方法およびこの方法を実施するための支持体 |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| FR2701319A1 (fr) | 1993-02-09 | 1994-08-12 | Stefas Elie | Procédé de détection et/ou de dosage de composés viraux et support portant une glycoprotéine. |
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|---|---|---|---|---|
| DE3316464A1 (de) * | 1983-05-05 | 1984-11-08 | Heinrich Prof Dr Med Liehr | Virusantigen, verfahren zu seiner gewinnung und anwendung in diagnose und therapie (impfstoff) |
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- 1995-07-31 DE DE69528368T patent/DE69528368T2/de not_active Expired - Lifetime
-
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-
2003
- 2003-09-11 JP JP2003320444A patent/JP2004037469A/ja not_active Withdrawn
Patent Citations (1)
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Non-Patent Citations (1)
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|---|
| Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｏｒｏｌｏｇｙ，１９９４年，ｖｏｌ．６８，ｎｏ．４，ｐ２４１５−２４２４ |
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