FR2714915A1 - Fragment de gène, etc, d'un anticorps reconnaissant une mucine spécifique de cancers . - Google Patents
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Abstract
Cette invention concerne une séquence d'acides aminés dans le domaine V de la chaîne H ou dans le domaine V de la chaîne L d'un anticorps reconnaissant une mucine spécifique de cancers et un gène, etc, codant pour ladite séquence, permettant la préparation, par exemple d'un anticorps chimère reconnaissant une mucine spécifique de cancers, etc, efficace comme agent pour le diagnostic intracorporel du cancer ou comme agent thérapeutique contre le cancer.
Description
-- 1 --
TITRE DE L'INVENTION
Fragment de gène, etc, d'un anticorps reconnaissant une mucine spécifique de cancers
ARRIERE-PLAN DE L'INVENTION
La présente invention concerne un gène, etc, d'un anticorps recon-
naissant une mucine spécifique de cancers. Plus particulièrement, elle concerne une section du domaine V de la chaîne H ou de la chaine L d'un anticorps reconnaissant une mucine spécifique de cancers, un gène codant pour celle-ci, un vecteur contenant ce gène et un procédé pour préparer ladite section du domaine ou d'anticorps reconnaissant une mucine spécifique de cancers comprenant l'étape consistant à cultiver une cellule hôte transformée par ce vecteur. En plus, elle concerne un procédé pour préparer un anticorps chimère reconnaissant une mucine
spécifique de cancers.
On sait que l'anticorps reconnaissant un antigène exprimé d'une manière spécifique dans les cellules cancéreuses (antigène spécifique
de cancers) est efficace pour le diagnostic et le traitement de can-
cers. Une glycoprotéine dans laquelle la N-acétylgalactosamine et la serine ou la thréonine sont fixées par une liaison O-glycosidique est appelée génétiquement mucine et une certaine mucine est connue pour
être un antigène spécifique de cancers.
Ho et ai ont injecté la mucine extraite d'une souche de cellules cancéreuses du pancréas humain à des souris pour les immuniser et ils ont réalisé un hybridome produisant un anticorps monoclonal de souris reconnaissant spécifiquement le tissu cancéreux du pancréas (Ho et al Cancer Res., vol. 51, p 372, 1991). Sawada et al ont prouvé que Nd2,
qui était l'un des anticorps préparés par Ho et al, reconnaissait spé-
cifiquement le cancer du pancréas humain lorsqu'on administrait du Nd2 à des souris transplantées avec le cancer de pancréas humain (Sawada et ai, Antibody, Immunoconjugates and Radiopharmaceuticals, vol. 4, p.
493, 1991).
En outre, Sawada et al ont administré du Nd2 provenant de souris à un patient souffrant de cancer du pancréas et ils ont suggéré que Nd2 était utile pour le diagnostic intracorporel du cancer du pancréas (Sawada et ai, General Meeting of Japanese Cancer Assoc., p. 329,
1991).
- 2 -
Pour pouvoir utiliser l'anticorps monoclonal reconnaissant une mu-
cine spécifique de cancers comme agent de diagnostic intracorporel ou
comme agent thérapeutique, il est nécessaire d'administrer ledit anti-
corps en grande quantité ou d'une manière répétée. Toutefois, on sait bien que si on administre un anticorps provenant d'une souris tel que
Nd2, etc, à des humains, il apparaît alors dans le sérum humain un an-
ticorps reconnaissant l'anticorps de souris (Levy et al, Annu. Rev.
Med. vol 34 p. 107, 1983). Par conséquent, l'administration en grandes quantités ou l'administration répétée d'anticorps provenant de souris
à des humains comporte le risque d'une anaphylaxie par suite de la ré-
ponse immunitaire, d'une dégradation rapide de l'anticorps administré
avec perte de son activité inhérente, et similaire.
Pour surmonter cela, on peut utiliser un anticorps humain, mais il est difficile d'isoler des cellules B qui produisent l'anticorps visé à partir d'une population de cellules B humaines et d'effectuer leur culture. Au cours des dernières années, pour résoudre ces problèmes, on a
proposé un anticorps chimère souris-homme. L'anticorps chimère sou-
ris-homme est un anticorps comprenant un domaine se liant à l'antigène
d'origine autre que humaine (i. e. animale) qui est le domaine va-
riable (domaine V) et un domaine constant (domaine C) d'origine hu-
maine (Oi et Morrison, Biotechnology, vol. 4. p. 214, 1986), ce qui peut diminuer le danger d'anaphylaxie, etc, parce que le domaine C d'origine humaine ne provoque aucune réponse immunitaire d'anticorps humains.
Tout récemment, un anticorps de type humanisé a été proposé. L'an-
ticorps du type humanisé est un anticorps comprenant un domaine mini-
mum se liant à l'antigène non humain provenant d'une espèce animale,
c'est-à-dire le domaine CDR, les autres domaines V et C étant d'ori-
gine humaine, ce qui diminue encore le risque de provoquer une réponse
immunitaire par des anticorps humains.
En outre, pour augmenter l'activité d'un anticorps comme agent de diagnostic intracoroprel ou comme agent thérapeutique, on a proposé également une protéine fusionnée comprenant un anticorps, une autre protéine et un anticorps ne comprenant que le domaine V (Ward et ai,
Nature, vol 341, p. 344, 1989).
- 3 -
Comme décrit ci-dessus, en appliquant à Nd2 différentes technolo-
gies proposées au cours des dernières années, etc, il est possible d'obtenir des anticorps plus efficaces pour une utilisation comme agents de diagnostic intracorporel ou comme agents thérapeutiques, mais pour préparer ces anticorps, il faut des gènes pour coder les chaines H et L de l'anticorps. Par suite d'études approfondies sur le gène de la chaîne H ou de la chaîne L d'anticorps de souris actifs contre la mucine spécifique de cancers pour l'utilisation décrite ci-dessus, les inventeurs ont
trouvé un gène du domaine V de ces chaînes, ce qui a permis de réali-
ser la présente invention.
RESUME DE L'INVENTION L'invention concerne le domaine V de la chaîne H d'un anticorps reconnaissant une mucine spécifique de cancers, contenant une séquence
d'acides aminés comme représenté par la séquence N' 1.
Séquence N' 1 Longueur de la séquence: 122 Type de séquence: acides aminés Topologie: chaîne droite Nature de la séquence: protéine Séquence:
10 15
GAA GIC AAG CIG GIG GAG ICr GOG MGA GIC TITA GIt AAG IOE CGA GOG Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Val Leu Val Lys Ser Gly Gly
25 30
TO CIG AAA CIC TOC TGT GCA GTC TCT GGA TMC ACT TC AGT AAC TAT
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr
40 45
GGC ATG TCI' TGG GIT CGC CAG ACT C(3 GAG AAG AGG CIG GAG TGC GIC
Gly Met Ser Trp Val Arg Gin Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val
55 60
GCA ACM ATT AOC AAT AGT GGT AGA TAC ACC TAC TIT CA GAC AGT GIG
Ala Thr lie Ser Asn Ser Gly Arg Tyr Thr Tyr Phe Pro Asp Ser Val - 4 -
70 75 80
AAG GOG CO TIC GC AIC TCC AGA GAC AAT Gc AAG AAC AAC CIG TAC Lys Gly Pro Phe Ala Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Asn Leu Tyr
90 95
CIG CAA AIG AGC AGT CIG AGG TCT GCU GAC AO3 GOC TIG TAT TAC TGT
Leu Gln Met Ser Ser Leu Arg Ser Ala Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys
105 110
ACA AGA CAT TA GAC TAT OCT AAC TAC GAT CT ATG GAC TAT 1TOG GGT
Thr Arg His Leu Asp Tyr Ala Asn Tyr Asp Ala Met Asp Tyr Trp Gly
120
CAA GGA ACC TCT GTC ACC GTC TCC TCA GGT
Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser GIy L'invention concerne l'ADN codant pour le domaine V de la chaîne H de l'anticorps reconnaissant ladite mucine spécifique de cancers, un
vecteur contenant ledit ADN et pouvant exprimer ledit ADN dans la cel-
lule hôte et un procédé pour préparer le domaine V de la chaîne H
d'un anticorps reconnaissant une mucine spécifique de cancers, compre-
nant l'étape consistant à cultiver les cellules hôtes transformées par ledit vecteur. En outre, l'invention concerne le domaine V de la chaîne L d'un anticorps reconnaissant une mucine spécifique de cancers, contenant
une séquence d'acides aminés représentée par la séquence N- 2.
Séquence N' 2 Longueur de la séquence: 112 Type de séquence: acides aminés Topologie: chaîne droite Nature de la séquence: protéine Séquence
10 15
GAC AT GTG CIG ACA CAG Tc (-T G CT T(C lTA OCT GTA Tr CG GGG Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
25 30
CAG AGG GO ACC AIC ICA TOC AGG GCT AOC AAA AGT GIE ACT ACA TCT
Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Lys Ser Val Thr Thr Ser
40 45
GAC TIT AGT TAT ATG CAC TOCG TAC CAA CAG AAA (IE GGA CAG CirA (C Asp Phe Ser Tyr Met His Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Pro Pro
55 60
AAA CIC Crc CIC TAT CIT OCA lCO AAC CfA GAA 'T GCG GC I GAG Lys Leu Leu Leu Tyr Leu Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Asp
70 75 80
AO_ TIC AG GGOC AGT GG C' GM G ACA GAC TIC AC CIE AAC ATC CAT
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly ThrAsp Phe Thr Leu Asn Ile His
90 95
CT GIG GAG GAG GAG GAT Gf GCA AOC TAI TAC iGT CAG CAC AGI AGG Pro Val Glu Glu Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys GIn His Ser Arg
105 110
GAG TT C(G TGGC ACG TIC GGrT GGA GOC AOC AAA CIG GAA ATC AAA (-T Glu Phe Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg L'invention concerne l'ADN codant pour le domaine V de la chaîne L de l'anticorps reconnaissant ladite mucine spécifique de cancers, un
vecteur contenant ledit ADN et pouvant exprimer ledit ADN dans la cel-
lule hôte et un procédé pour préparer le domaine V de la chaîne L d'un anticorps reconnaissant une mucine spécifique de cancers, comprenant
l'étape consistant à cultiver des cellules hôtes transformées par le-
dit vecteur. En outre l'invention concerne un vecteur contenant l'ADN codant - 6 - pour le domaine V de la chaîne H de l'anticorps reconnaissant ladite mucine spécifique de cancers et l'ADN codant pour le domaine V de la chaine L de l'anticorps reconnaissant la mucine spécifique de cancers, ces ADN pouvant s'exprimer dans un hôte et un procédé pour préparer un anticorps chimère reconnaissant ladite mucine spécifique de cancers,
comprenant l'étape consistant à cultiver les cellules hôtes transfor-
mées par ledit vecteur.
BREVE DESCRIPTION DES DESSINS
La Fig. 1 est un diagramme montrant une carte de l'enzyme de res-
triction dans le domaine V de la chaîne L de Nd2 et E, H. K et En mon-
trent respectivement le site ECoRI, le site HindIII, le site Xbal, le
site SacI et l'activateur.
La Fig. 2 est un diagramme montrant une carte de l'enzyme de res-
triction du domaine V de la chaîne L de Nd2 et E, B et X montrent res-
pectivement le site EcoRI, le site BamHI, le site HindIII et le site XbaI. La Fig. 3 montre une séquence de bases dans le domaine V de la chaîne H de Nd2 et une séquence d'acides aminés dans le domaine V de
la chaîne H que l'on peut déduire de ladite séquence. Dans le dia-
gramme, trois séquences de bases soulignées montrent des zones hyper-
variables (CDR1, CDR2 et CDR3 en partant depuis l'amont).
La Fig. 4 montre une séquence de bases dans le domaine V de la chaîne L de Nd2 et une séquence d'acides aminés du domaine V de la chaîne L que l'on peut déduire de ladite séquence. Dans le diagramme,
trois séquences de bases soulignées montrent les régions hypervaria-
bles (respectivement CDR1, CDR2 et CDR3, en partant depuis l'amont).
La Fig. 5 est un diagramme montrant un vecteur d'expression
pSV2-HGlgpt/NdH4 et les symboles dans le diagramme ont une significa-
tion similaire à celle utilisée habituellement en génie génétique.
La Fig. 6 est un diagramme montrant un vecteur d'expression
pSV2-HCKneo/Ndk19 et les symboles dans le diagramme ont une significa-
tion similaire à celle utilisée habituellement en génie génétique.
La Fig. 7 montre la courbe de l'absorbance pour une plaque lors-
qu'on examine les liaisons de l'anticorps chimère Nd2 (o) et d'anti-
corps de souris Nd2 (e) avec la mucine, en utilisant la méthode de l'exemple 4. Sur l'axe des ordonnées, on a porté l'absorbance à 500 nm - 7 - et sur l'axe des abscisses le degré de dilution de la mucine au moment
de la détermination.
DESCRIPTION DETAILLÉE DE L'INVENTION
Dans la suite, l'invention sera illustrée en détail.
Le gène de l'invention d'un anticorps reconnaissant une mucine spécifique de cancers est un gène codant pour le domaine V de la
chaine H ou un gène codant pour le domaine V de la chaîne L qui pro-
duit un anticorps reconnaissant une mucine spécifique de cancers et qui a une séquence de bases représentée concrètement par la séquence N* I (Fig. 3) ou la séquence N' 2 (Fig 4). Le gène de l'invention peut être isolé par la méthode décrite, par exemple, dans l'exemple 1, en utilisant l'hybridome qui produit l'anticorps reconnaissant une mucine spécifique de cancers comme produit de départ et un tel hybridome qui produit Nd2 (Ho et al, Cancer Res. vol. 51, p. 372, 1991) peut être
cité en exemple.
Par ailleurs, le gène de la séquence N' 1 ou de la séquence N' 2 peut également être préparé en utilisant, par exemple, un synthétiseur d'ADN. Dans le gène de la séquence N' 1 ou de la séquence N 2, on
peut ajouter une ou plusieurs bases, on peut supprimer une ou plu-
sieurs bases ou on peut remplacer une ou plusieurs bases.
L'anticorps de l'invention (domaine V) reconnaissant une mucine spécifique de cancers est codé par le gène susmentionné et celui-ci a
la séquence N 1 (Fig. 3) ou la séquence N' 2 (Fig. 4). Dans l'anti-
corps (domaine V) de la séquence N' 1 ou de la séquence N' 2, on peut
ajouter un acide aminé ou une pluralité d'acides aminés, on peut sup-
primer un acide aminé ou une pluralité d'acides aminés, ou on peut re-
placer un acide aminé ou une pluralité d'acides aminés.
Pour préparer par génie génétique l'anticorps reconnaissant une
mucine spécifique de cancers, il faut un vecteur contenant le gène co-
dant pour cet anticorps. Le vecteur de l'invention contient, par exemple, tous les fragments ou une partie de fragments du gène de la séquence N 1 et/ou de la séquence N 2 et il peut.exprimer ledit gène dans la cellule hôte. Pour cette raison, ledit vecteur peut contenir
un gène avec une séquence qui est du domaine public tel qu'un promo-
teur/opérateur pour exprimer (transcrire) le gène, un terminateur pour terminer l'expression (transcription) du gène et un gène pour assurer
-- 8 --
une amplification dans les cellules hôtes du gène de l'invention. En outre, l'invention concerne les vecteurs contenant le gène codant pour le domaine V de la chaîne H et le gène codant pour le domaine V de la chaîne L. Avec ce vecteur, on peut préparer un anticorps reconnaissant une mucine spécifique de cancers, mais ne contenant pas de domaine C
et constitué du seul domaine V (anticorps Fv).
En ajoutant en outre au vecteur le fragment de gène codant pour le
domaine C de l'anticorps humain, il est possible de réaliser un vec-
teur pour préparer la chaîne H ou la chaîne L de l'anticorps chimère
souris-homme. Dans ce cas et pour ce qui concerne le gène de l'anti-
corps humain, le domaine C de la chaîne H est préparé pour être en conformité avec le domaine V selon l'invention de la chaîne H et le domaine C de la chaîne L est préparé pour être en conformité avec le domaine V selon l'invention de la chaîne L. En outre, le fragment de gène codant pour le domaine C de la chaîne H ou de la chaîne L de l'anticorps humain est dans le domaine public (par exemple Kameyama et
ai, FEBS Left., vol. 244, p. 301, 1989).
Selon l'invention, le vecteur pour préparer l'anticorps chimère sourishomme reconnaissant une mucine spécifique de cancers est un vecteur contenant, par exemple, tout le gène ou une partie du gène de la séquence N' 1, tout le gène ou une partie du gène de la séquence N'
2, le gène codant pour le domaine C de la chaîne H de l'anticorps hu-
main et le gène codant pour le domaine C de la chaîne L de l'anticorps humain, et il est capable d'exprimer lesdits fragments de gène dans la cellule hôte. Pour ce qui concerne le fragment de gène de l'anticorps humain utilisé pour réaliser le vecteur, le domaine C de la chaine H est préparé pour être en conformité avec le domaine V de la chaine H et le domaine C de la chaîne L est préparé pour être en conformité avec le domaine V de la chaîne L. La transformation de la cellule hôte par un vecteur tel que celui ci-dessus peut se faire suivant la méthode usuelle et il n'y a pas de limitation particulière. Par exemple, s'il s'agit. d'un vecteur pour Escherichia coli, on peut utiliser Escherichia coli comme hôte et s'il s'agit d'un vecteur pour levure, on peut alors utiliser une levure
comme hôte.
En cultivant les cellules hôtes transformées de cette manière dans - 9 des conditions appropriées, on peut préparer différentes formes
d'anticorps (protéines). Dans l'invention, on peut préparer différen-
tes formes d'anticorps (protéines) en fonction du vecteur utilisé,
mais lorsqu'on sélectionne le vecteur de l'invention comme décrit ci-
dessus pour son utilisation, on peut préparer une protéine du domaine V de la chaine H d'un anticorps reconnaissant une mucine spécifique de
cancers, une protéine du domaine V de la chaine L d'un anticorps re-
connaissant une mucine spécifique de cancers, une protéine chimère constituée du domaine V de la chaîne H d'un anticorps reconnaissant une mucine spécifique de cancers et le domaine C de la chaine H de l'anticorps humain, une protéine chimère constituée du domaine V de la
chaine L d'un anticorps reconnaissant un anticorps une mucine spécifi-
que de cancers et le domaine C de la chaine L de l'anticorps humain,
une protéine chimère constituée du domaine V d'un anticorps recon-
naissant la mucine spécifique de la mucine et le domaine C de l'anti-
corps humain ou similaire. En outre, on peut également préparer un an-
ticorps (protéine) constitué du domaine V de la chaîne H et de la chaîne L d'un anticorps reconnaissant une mucine spécifique de cancers. L'invention concerne également une région hypervariable (CDR) de Nd2 de souris. Concrètement, ce sont les séquences soulignées dans la séquence de bases du domaine V de la chaine H de Nd2 ou du domaine V de la chaine L de Nd2 représentées sur la Fig. 3 ou sur la Fig. 4. En conservant uniquement cette CDR et en convertissant d'autres sections en, par exemple, sections correspondantes d'anticorps humain, il est possible d'obtenir un type d'anticorps humanisé avec une capacité de
fixation à la mucine égale à celle de Nd2 de souris.
Dans la suite, on va illustrer l'invention d'une manière plus dé-
taillée, mais l'invention n'est pas limitée à ces exemples.
Exemple 1 Séparation du gène de l'anticorps Nd2 Tout d'abord on a préparé un hybridome d'ADN de Nd2 par la méthode suivante. Après avoir lavé i x 108 hybridomes. Nd2 cultivés sur RPMI1640 (Ho et col, Cancer Res,. vol. 51, p. 372, 1991), avec du PBS,
on les a mis en suspension dans une solution d'isothiocyanate de gua-
nidine et soumis à une ultracentrifugation, par application en couche sur du chlorure de césium pour séparer l'ADN (surnageant) de l'ARN
- 10 -
(précipité). Après dialyse, le surnageant a été traité avec une pro-
téase et une RNAse par des méthodes usuelles pour assurer une dépro-
téinisation et une purification. On a pu ainsi purifier 10 mg d'ADN. A partir du précipité, on a obtenu 1 mg d'ARN déprotéinisé et purifié,
en utilisant des méthodes usuelles.
Ensuite, une librairie génomique a été réalisée de la manière sui-
vante. Après ligature de l'ADN (2 gg) digéré complètement par l'enzyme de restriction EcoRI et du XDASHII (de Toyobo Co., Ltd, 1.g) digéré complètement avec EcoRI de manière similaire pendant 24 heures à 4'C, ils ont été mélangés avec de l'extrait de phage du tube 1 du système prêt à l'emploi (kit) de Toyobo Co., Ltd et incubés pendant 2 heures à C. Ensuite, 400 gl de tampon SM ont été ajoutés pour réaliser la
libraire génomique.
La séparation du gène de l'anticorps a été effectuée comme suit.
De l'Escherichia coli SRB (P2) cultivé pendant 24 heures a été inoculé à 100 ml de milieu TB contenant 0,2% de maltose et 10 mM de MgSO4 et
cultivé jusqu'à une DO de 0,5. Ensuite, les bactéries ont été recueil-
lies et mises en suspension dans 20 ml de MgSO4 10 mM. Puis, du tampon SM contenant la librairie correspondant à 1 x 106 cellules et le P2392
ont été mélangés en quantités égales, puis on a incubé le mélange pen-
dant 30 minutes à 37'C et on l'a appliqué sur des plaques d'agarose 10 TB (diamètre 15 cm) contenant 8 mM de MgSO4 et on a incubé les plaques pendant 24 heures à 37'C. Le jour suivant, on a placé un filtre en
nylon sur chaque plaque, et après avoir laissé reposer pendant 2 minu-
tes, le filtre a été détaché doucement. Après cela, le filtre a été soumis à un traitement alcalin en le trempant dans une solution de NaOH 0,5 N et de NaCl 1,5 M, puis on a neutralisé la plaque en la trempant dans une solution de Tris-HCl (pH 8,0) 0,5 M de NaCI 1,5 M, puis on l'a trempée dans une solution à 0,2% de SSC et finalement on l'a séchée dans l'air. Ensuite, en utilisant la sonde JH ou la sonde JK (Kameyama et col. , FEBS Left., vol 244, p. 301, 1989), la plaque d'hybridation a été perforée pour isoler un clone NdH4 hybridé avec la sonde JH et un clone Ndk.9 hybridé avec une sonde JK. Le fragment hybridé avec la sonde JH avait 2,5 kbp et le fragment hybridé avec la
sonde JK avait 6,2 kbp.
Les fragments ci-dessus ont été insérés dans pBLUEscript pour pré-
- Il -
parer respectivement pBLUE/NdH4 et pBLUE/NdK,9. En plus, on a réalisé une carte d'enzyme de restriction de l'ADN d'insertion pour confirmer
qu'il s'agissait d'un gène d'anticorps dans lequel les fragments iso-
lés de gènes étaient réarrangés. La Fig. 1 montre une carte d'enzyme de restriction du domaine V de la chaîne H de Nd2 et la Fig. 2 montre
une carte d'enzyme de restriction du domaine V de la chaîne L de Nd2.
Exemple 2 Détermination de la séquence des bases du gène de d'anti-
corps Nd2.
Les séquences de bases du domaine V de la chaîne H et du domaine V de la chaîne L de l'anticorps Nd2, isolés par la méthode décrite dans
l'exemple 1 ont été déterminées par la méthode suivante.
Après avoir introduit pBLUE/NdH4 et pBLUE/NdK,9 dans la souche MV1184 d'Escherichia coli, ledit Escherichia coli a été cultivé et un
ADN à un brin a été préparé par la méthode habituelle, et on l'a uti-
lisé comme matrice pour le séquencçage. Pour le séquençage, on a utili-
sé le système prêt à l'emploi (kit) "Sequence Version 2,0 DNA" (de Toyobo Co., Ltd) pour déterminer la structure des bases du gène dans le domaine V de la chaîne H ou de la chaîne L de l'anticorps Nd2. Les
résultats relatifs à pBLUE/NdH4 (domaine V de la chaîne L) sont repré-
sentés sur la Fig. 4.
Exemple 3 Préparation de l'anticorps chimère souris-homme Nd2 Les ADN d'insertion pBLUE/NdH4 et pBLUE/NdK,9 ont été introduits
dans un vecteur d'expression pSV2-HGlgtp de chaine de type H de chi-
mère souris-homme et dans un vecteur d'expression pSV2-HCkneo de chaine de type L de chimère souris-homme (Kameyama et al, FEBS Left., vol 244, p. 301, 1989), pour préparer respectivement pSV2-HGlgpt/NdH4
et pSV2-HCKneo/Ndk1g. La Fig. 5 montre une carte d'enzyme de restric-
tion de pSLV2-HGlgpt/NdH4 et la Fig. 6 montre une carte d'enzyme de
restriction de pSLV2-HC neo/Ndk,9.
L'introduction d'un vecteur d'expression dans la cellule a été ef-
fectuée comme suit. Après avoir lavé 1 x 107 de cellules SP2/0 culti-
vées par la méthode usuelle en utilisant un milieu DMEM contenant 10% de sérumalbumine bovine dans du PBS, elles ont été mises en suspension dans 0,4 ml de PBS refroidi au préalable à 4C. Cette suspension a été mélangée avec une solution dissoute dans 50,g de pSV2-HGlgpt/NdH4 ou de pSV2-HCkneo/Ndk,9 dans 0,4 ml de PBS et refroidie dans de la glace
- 12 -
et le mélange a été placé pendant 10 minutes sur de la glace et on lui
a appliqué des impulsions dans des conditions de 1100 V et de 25 mi-
crofarads, en utilisant un appareil Gene Pulser I (de Biorad Co.).
Après avoir placé le mélange pendant 10 minutes de plus sur de la glace, le mélange a été lavé avec du milieu et cultivé ensuite sur un milieu usuel. Trois jours plus tard, le milieu a été remplacé par un milieu sélectif contenant 0,8 mg/ml de G418 (de Gypco Co), en plus du
milieu usuel et le mélange a été réparti sur une plaque à 96 trous.
Sept jours et 14 jours plus tard, le milieu a été échangé et au bout
de 21 jours, on a mesuré le titre en anticorps chimère et on a sélec-
tionné 156 des clones positifs. Finalement, on a retenu le clone
HCNd8A présentant l'expression la plus élevée.
Exemple 4 Aptitude de l'anticorps chimère souris-homme Nd2 à se fixer à la mucine L'évaluation du titre de l'anticorps chimère a été faite comme suit. Une plaque avec de l'IgGl anti-humaine a été placée dans du PBS contenant 1% de sérumalbumine bovine. Apres avoir ajouté la culture au surnageant, la plaque a été laissée au repos pendant plus de 2 heures
à la température ambiante. Après avoir lavé la plaque, de l'Igk anti-
humaine liée à de l'HRP a été ajoutée et la plaque a été laissée au repos pendant plus de 2 heures à température ambiante. Finalement, après avoir lavé la plaque, on a ajouté l'agent colorant (provenant de Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd) et on a mesuré la coloration avec
un appareil "Immunoreader" (MPR-A4 de Tosch Corp). Dans ces condi-
tions, on a établi que le HCNd8A produit environ 10 tig/ml d'anticorps
chimère dans le surnageant, après la culture.
L'aptitude de l'anticorps chimère Nd2 à se fixer à la mucine a été mesurée comme suit. A une plaque à 96 trous ayant recu de la mucine extraite d'une souche de cellules cancéreuses du pancréas humain SW1990 (Ho et al, Cancer Res., vol 51, p. 372, 1991), on a appliqué l'échantillon par la méthode usuelle et on a laissé reposer pendant plus de 2 heures à température ambiante. Après avoir lavé la plaque,
on a ajouté de l'Igk anti-humaine liée à de l'HRP, et on a laissé re-
poser pendant plus de 2 heures à température ambiante. Apres avoir la-
vé la plaque, on a ajouté un agent colorant (de Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd) et on a mesuré la coloration avec l'appareil
- 13 -
"Immunoreader" (MPR-A4, de Tosch Corp.).
Les résultats sont représentés sur la Fig. 7. Comme il ressort
clairement de la Fig. 7, l'anticorps chimère contenu dans le surna-
geant après culture de l'HCNd8A conservait son aptitude à se fixer à
la mucine.
Exemple 5 Coloration par anticorps du tissu du pancréas humain en uti-
lisant un anticorps chimère souris-homme Nd2 La coloration par anticorps des tissus cancéreux humains par
* l'utilisation d'un anticorps chimère Nd2 a été effectuée par la mé-
thode ABC (Yuan et ai, Cancer Res,, vol. 45, p. 6179, 1989) comme suit. D'abord, on a inhibé l'activité peroxydase endogène avec 1% de
peroxyde d'hydrogène. Ensuite, on a ajouté au surnageant successive-
ment et de la manière conventionnelle, la culture du HCNd8A diluée avec 5% de sérum de lapin, de l'Igk anti-humaine marquée avec de l'HPR et du réactif ABC (de Vector Laboratories). A des fins de comparaison, on a effectué une coloration par anticorps en utilisant l'anticorps de
souris Nd2.
Les résultats sont donnés dans le tableau 1. Comme cela ressort du
tableau 1, l'anticorps chimère Nd2 et l'anticorps de souris Nd2 pré-
sentaient un comportement similaire. Ceci prouve que l'aptitude à lafixation de l'anticorps chimère Nd2 à l'antigène est similaire à celle
de l'anticorps de souris Nd2.
- 14 -
Tableau 1
Tissu N Intensité de la colo- Intensité de la colo- Intensité de la colora-
ration avec l'anti- ration avec l'anti- tion avec l'anticorps corps chimère de Nd2 corps de souris Nd2 standard de souris
1 ++ ++
2 +.. +.+
3 + +
4 ++ ++
+ +
6 + +
8 +++...
9 ++ ++
+++ +++
Avec les gènes codant pour le domaine V de la chaîne H et de la
chaîne L d'un anticorps reconnaissant une mucine spécifique de can-
cers réalisés selon l'invention et en outre grâce aux moyens et procé-
dés permettant de produire ledit anticorps en utilisant des techniques de génie génétique, il est possible de produire ledit anticorps avec différentes fonctions additionnelles, en grandes quantités. Ceci est
important pour l'analyse du rôle physiologique de la mucine spécifi-
que de cancers et pour le développement d'un agent permettant le dia-
gnostic du cancer et d'un agent thérapeutique contre le cancer.
- 15 -
Claims (14)
10 15
GAA G AAG CIG GIG GAG Il- GOG CGA GIC TA GG AAG TO CGA OCMG Glu Val Lys Leu Val Glu Ser GIy GIy Val Leu Val Lys Ser GIy Gly
25 30
1E CIG AAA CIC Toe TGT CCA GTC Tcr CGGA TIC ACI TIC AGT AAC TAT SerLeu Lys Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr
40 45
CGC AIG IrOlTG GIT CGC CAG ACT COC GAG AAG ACG CIG GAG TOC GTC Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val
55 60
GCA ACC ATT AOC AAT AGT (GGT AGA TAC ACE TAC TIT (CA GAC AGT GTG
Ala Thr Ile Ser Asn Ser GIy Arg Tyr Thr Tyr Phe Pro Asp Ser Val
70 75 80
AAG OG CI TIC CGCC AIC TE AGA GAC AAT CCC AAG AAC AAC CIG TAC
Lys GIy Pro Phe Ala Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Asn Leu Tyr
90 95
CQG CAA AIG AGC AGT CG ACGG TC GCG GAC ACM GOC TIG TAT TAC TGT
Leu Gln Met Ser Ser Leu Arg Ser Ala Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys
- 16 -
105 110
AC AGA CAT 1TA GAC TAT GCr AAC TAC GAI GCT AF GAC TAT IG GGT Thr Arg His Leu Asp Tyr Ala Asn Tyr Asp Ala Met Asp Tyr Trp Gly
120
CAA GGA ACC TCT GTC ACC GTC TCC TCA GGT
Gin Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Gly
2. Gène codant pour le domaine V de la chaîne H de l'anticorps recon-
naissant une mucine spécifique de cancers, décrit dans la revendica-
tion 1.
3. Gène décrit dans la revendication 2, contenant une séquence de ba-
ses qui est la séquence N' 1.
4. Vecteur contenant l'ADN décrit dans la revendication 2, et pouvant
exprimer ledit gène dans une cellule hôte.
5. Procédé pour préparer le domaine V de la chaîne H d'un anticorps reconnaissant la mucine spécifique de cancers, comprenant l'étape
consistant à cultiver les cellules hôtes transformées par ledit vec-
teur décrit dans la revendication 4.
6. Domaine V de la chaîne L d'un anticorps reconnaissant une mucine
spécifique de cancers contenant une séquence d'acides aminés comme re-
présenté par la séquence N 2.
Séquence N 2 Longueur de la séquence: 112 Type de séquence: acides aminés Topologie: chaîne droite Nature de la séquence: protéine Séquence:
10 15
GAC AIT GTG CIG ACA CAG TCF CCT GOCT To ITA OT GTA TCTU CIG GGG Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu GIy
- 17 -
25 30
CAG A3 G C ACC ATC TlEA TOC AC Goe AOC AAA AGI GIC ACT ACA lTT Gin Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Lys Ser Val Thr Thr Ser
40 45
GAC TT AG TAI AIG CAC TIOG TAC CAA CAG AAA CC GGA CAG CEA CIc Asp Phe Ser Tyr Met His Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Pro Pro
55 60
AAA CIC CIC CIC TAT CrT GCA TCC AAC CIA GAA C OG GICG C CT GAG Lys Leu Leu Leu Tyr Leu Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Asp
70 75 80
AG TI AGI CGC AGI O TCI COG ACA GAClTIC AC CIC AAC ATC CAT Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His
90 95
i-T GIG GAG GAG GAG GAT CC OCA ACC TAT TAC AIG CAG CAC AGT AGG Pro Val Glu Glu Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin His Ser Arg
105 110
GAG TIT OC TG AMG TIC GI GGA GC ACE AAA CIG GAAATC AAA CDT
Glu Phe Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu le Lys Arg
7. Gène codant pour le domaine V de la chaîne L de l'anticorps recon-
naissant une mucine spécifique de cancers, décrit dans la revendica-
tion 6.
8. Gène décrit dans la revendication 7, contenant une séquence de ba-
ses qui est la séquence N' 2.
9. Vecteur contenant l'ADN décrit dans la revendication 7, et pouvant
exprimer ledit gène dans une cellule hôte.
10. Procédé pour préparer le domaine V de la chaîne L d'un anticorps
- 18 -
reconnaissant une mucine spécifique de cancers, comprenant l'étape consistant a cultiver les cellules hôtes transformées par le vecteur
décrit dans la revendication 9.
11. Vecteur contenant aussi bien le gène codant pour le domaine V de
la chaîne H d'un anticorps reconnaissant une mucine spécifique de can-
cers décrit dans la revendication 2 que le gène codant pour le domaine V de la chaîne L d'un anticorps reconnaissant une mucine spécifique de
cancers décrit dans la revendication 7, qui permet d'exprimer ces gè-
nes dans un hôte.
12. Vecteur décrit dans la revendication 11, renfermant en outre un gène codant pour le domaine V de la chaîne H d'un anticorps d'origine
humaine et un gène codant pour le domaine V de la chaîne L d'un anti-
corps d'origine humaine.
13. Procédé pour préparer un anticorps chimère reconnaissant une mu-
cine spécifique de cancers, comprenant l'étape consistant à cultiver les cellules transformées par le vecteur décrit dans la revendication 12.
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- 1994-01-13 JP JP6002131A patent/JPH07203974A/ja active Pending
-
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