FR2677665A1 - Plasmide contenant un gene d'un cytochrome specifique et procede de fermentation par oxydation. - Google Patents

Abstract

L'invention concerne un plasmide contenant un gène de cytochrome spécifique ainsi qu'une cellule contenant le plasmide. Selon l'invention, un substrat est soumis à une fermentation par oxydation en présence de la cellule. Grâce à la présente invention, la fermentation par oxydation est remarquablement favorisée ce qui améliore fortement sa productivité.

Description

La présente invention concerne un plasmide contenant un gène de cytochrome spécifique ainsi qu'un procédé pour sa fermentation par oxydation.

Plus particulièrement, la présente invention concerne un plasmide contenant un gène ayant une séquence de nucléotides codants pour une séquence d'acides aminés que l'on peut voir aux figures 1-(1) à 1-(3) ainsi qu'une cellule contenant le plasmide. La présente invention concerne également un procédé pour la fermentation par oxydation dans lequel un substrat est soumis à une fermentation par oxydation en présence de la cellule ci-dessus. Quand la fermentation par oxydation est entreprise selon le procédé de la présente invention, elle est remarquablement favorisée, donc la productivité de cette fermentation par oxydation est fortement améliorée.

Dans la fermentation par oxydation, un substrat est incomplètement oxydé tout en consommant l'oxygène de l'air, donc une métabolite intermédiaire s'accumule en une grande quantité. Cette réaction est l'une des réactions les plus importantes parmi les diverses réactions concernant la bioconversion d'un composé organique. Parmi les organismes qui sont bien connus comme ayant la capacité d'accomplir une fermentation par oxydation, il y a les bactéries de l'acide acétique. Dans ce type de bactéries, la réaction d'oxydation est entreprise par l'action des enzymes qui sont placées sur la membrane de la cellule.En ce qui concerne ces enzymes ainsi que le système de transport des électrons des bactéries de l'acide acétique, de nombreuses études ont été effectuées [voir par exemple, Minoru Ameyama, Nippon Nogeikagaku Kaishi (Journal of Japanese
Society of Agricultural Chemistry), X, 1185-1193, 1988] .En particulier, en ce qui concerne Gluconobacter suboxydans (que l'on appellera ci-après simplement "G. suboxvdans"), des études intensives ont été effectuées et des cytochromes dans le système de transport des électrons se trouvant sur la membrane de la cellule de G. suboxydans ont été isolés et purifiés. En tant que cytochromes présents dans G. suboxvdans, seul le type O et le type C sont connus.Le cytochrome du type O (cytochrome o) est une oxydase terminale et a une sensibilité au cyanure, une activité d'ubiquinol-oxydase et la capacité de produire de l'énergie (voir Matsushita, K et autres, Biochimica et Biphysica
Acta 894, 304-312, 1987). Pour le cytochrome du type C (cytochrome c), le cytochrome appelé c-553 (CO) (Matsushita, K et autres, FEMS Microbiol. Lett.

10 , 267-270, 1981), le cytochrome appelé c-551 (CO) (Ameyama M. et autres,
Agric. Biol. Chem., 51 2943-2950, 1987) et analogues, ont été isolés et purifiés.

Dans le système de transport des électrons de G. suboxydans, en plus de la présence de la voie qui implique le cytochrome du type O et sera probablement inhibée par le cyanure, on connaît la présence d'une dérivation qui sera moins probablement inhibée par le cyanure (Ameyama, M. et autres,
Agric. Biol. Chem. 51, 2943-2950, 1987). Par ailleurs, on sait également que dans cette dérivation, qui n'a pas la capacité de produire de l'énergie, un cytochrome du type C, c'est-à-dire le cytochrome appelé c-553(CO), participe fortement (Matsushita, K et autres, Agric. Biol. Chem. 53 2895-2902, 1989).

Une forme réduite du cytochrome c-553(CO) présente des bandes d'absorption '3,ça et gamma autour de 553 nm, 522 nm et 415 nm, respectivement, dues à la liaison de l'oxyde de carbone, avec une propriété identique à une oxydase terminale qui réagit avec l'oxygène (Matsushita, K et autres, FEMS Microbiol.

Lett. 10, 267-270, 1981). Cette propriété est différente des propriétés d'autres cytochromes du type C qui fonctionnent comme donneurs directs d'électrons pour l'oxydase du cytochrome ou autres enzymes dans la chaîne respiratoire.

Dans la fermentation par oxydation, on considère que, comme un substrat présent à une forte concentration est oxydé, il se produit une grande quantité d'électrons. Si la totalité de cette grande quantité d'électrons est transportée via le cytochrome du type O (qui est capable de produire de l'énergie), il se produit une quantité inutilement importante d'énergie. Cette énergie en excès pourra affecter de manière néfaste l'organisme, diminuant la capacité de l'organisme pour accomplir la fermentation par oxydation. Par ailleurs, on considère qu'il est difficile de réguler arbitrairement le courant des électrons s'écoulant à travers le cytochrome du type O.

Aucune méthode conventionnelle pour prévenir la production de l'énergie en excès affectant de manière néfaste l'organisme, afin d'améliorer la capacité d'accomplir la fermentation par oxydation, n'est connue.

Dans cette situation, des études intensives ont été effectuées selon la présente invention afin de développer un procédé pour la fermentation par oxydation ne présentant pas les problèmes de l'art antérieur. Par suite, les présents inventeurs ont trouvé de manière inattendue que pour améliorer la capacité d'un organisme à accomplir une fermentation par oxydation, il était efficace d'augmenter le courant des électrons s'écoulant à travers une voie incapable de produire de l'énergie.Ainsi, on a trouvé que la capacité d'accomplir la fermentation par oxydation pouvait être améliorée en activant la dérivation ci-dessus mentionnée qui sera moins probablement inhibée par le cyanure et qui n'a pas la capacité de produire de énergie. On a également trouvé de manière inattendue que la tâche ci-dessus pouvait être atteinte en utilisant un gène de cytochrome spécifique isolé, c'est-à-dire un gène du cytochrome appelé c-553 (CO). En vue d'atteindre cet objectif, le gène de structure du cytochrome c-553 (CO) a pu être isolé, dont la séquence des nucléotides code pour une séquence d'acides aminés que l'on peut voir aux figures 1-(1) à 1-(3), afin de préparer un plasmide contenant le gène de structure du cytochrome c-S 53 (CO) isolé.Une cellule a également pu être transformée avec succès, par le plasmide ci-dessus, et la fermentation par oxydation a pu être accomplie en utilisant la cellule ainsi transformée avec une haute productivité.

La présente invention est basée sur les découvertes ci-dessus.

Par conséquent, la présente invention a pour objet de procurer un plasmide contenant un gène de cytochrome spécifique, dont un produit d'expression sert à favoriser une réaction de fermentation par oxydation.

La présente invention a pour autre objet de produire une cellule qui contient le plasmide ci-dessus mentionné.

La présente invention a pour autre objet de procurer un procédé pour la fermentation par oxydation qui soit efficace pour améliorer la productivité de la fermentation par oxydation.

L'invention sera mieux comprise et d'autres buts, caractéristiques, détails et avantages de celle-ci apparaîtront plus clairement au cours de la description explicative qui va suivre faite en référence aux dessins schématiques annexés donnés uniquement à titre d'exemple illustrant un mode de réalisation de l'invention et dans lesquels::
- les figures 1-(1) à 1-(3) montre une séquence de nucléotides du cytochrome c-553 (CO) en même temps que la séquence d'acides aminés ainsi codée, qui est indiquée en dessous de la séquence de nucléotides;
- la figure 2 est un graphique montrant un schéma d'élution par chromatographie en phase liquide du cytochrome c-553(CO) qui a été partiellement hydrolysé par l'arginyl endopeptidase;
- la figure 3 est une carte de restriction d'un plasmide pCYT3 de la présente invention, où la portion du cercle en trait gras indique un fragment d'ADN d'environ 2,7 kb comprenant le gène de structure du cytochrome c-553 (CO) et la portion en trait fin restante du cercle indique un fragment d'ADN dérivé depHSG298; ;
- la figure 4 est une carte de restriction du plasmide pGEAl, qui est un vecteur navette utilisable dans la présente invention, où la partie en trait gras du cercle indique un fragment d'ADN dérivé de G. suboxydans souche IFO 3130 et la partie étroite restante du cercle indique un fragment d'ADN dérivé de pUC18; et
- la figure 5 est une carte de restriction d'un plasmide pGEAC1 de la présente invention, où la portion de en trait plein du cercle indique un fragment d'ADN drenviron 2,7 kb comprenant le gène de structure du cytochrome c553(CO), la portion en trait large et vide du cercle indique un fragment d'ADN dérive de G. suboxydans souche IFO 3130 et la portion étroite restante du cercle indique un fragment d'ADN dérivé de pUC18.

Sur les figures 4 et 5, "SalI/XhoI" indique un site de ligature entre le terminal scindé par SalI et le terminal scindé par XhoI.

Dans un aspect de la présente invention, on prévoit un plasmide qui contient un gène ayant une séquence de nucléotides codant par une séquence d'acides aminés que l'on peut voir aux figures 1-(1) à 1-(3).

Sous un autre aspect de la présente invention, on prévoit une cellule qui contient le plasmide défini ci-dessus.

Sous un autre aspect de la présente invention, on prévoit un procédé pour la fermentation par oxydation, caractérisé en ce qu'un substrat est soumis à une fermentation par oxydation en présence de la cellule définie ci-dessus, de préférence en présence de la cellule contenant un produit d'expression du gène ci-dessus mentionné du plasmide.

Dans la présente invention, les acides aminés sont représentés en utilisant les abréviations indiquées ci-dessous. Ala représente un résidu d'alanine, Arg un résidu d'arginine, Asn un résidu d'asparagine, Asp un résidu d'acide aspartique, Cys un résidu de cystéine, Gln un résidu de glutamine, Glu un résidu d'acide glutamique, Gly un résidu de glycine, His un résidu d'histidine, Ile un résidu d'isoleucine, Leu un résidu de leucine, Lys un résidu de lysine, Met un résidu de méthionine, Pro un résidu de proline, Ser un résidu de sérine, Thr un résidu de thréonine, Trp un résidu de tryptophane, Tyr un résidu de tyrosine et Val un résidu de valine. Sur la figure 1-(3), "***" indique un codon de terminaison. A moins que cela ne soit autrement spécifiqué, l'extrémité gauche de la séquence est le N-terminal.

Les polydésoxyribonucléotides et les oligodésoxyribonucléotides sont représentés par des séquences de résidus désoxynucléotidiques qui ont les abréviations suivantes:
A : résidu d'acide 2'-désoxyadénylique
C: résidu d'acide 2'-désoxycytidylique
G: résidu d'acide 2'-désoxyguanylique
T : résidu d'acide thymidylique.

A moins que cela ne soit spécifié autrement, l'extrémité gauche de la séquence des désoxynucléotides est l'extrémité 5'.

On sait que le cytochrome c-553(CO) est l'un des cytochromes du type
C (voir FEMS Microbial, Lett 10 267-270, 1981), et que c'est une protéine contenant l'hème c et ayant un poids moléculaire d'environ 48000. Le cytochrome c-553(CO) est produit par les bactéries du genre Gluconobacter comme G. suboxvdans IFO 12528 qui ont la capacité de produire le cytochrome c-553 (CO). Un fragment d'ADN contenant un gène de structure du cytochrome c-553(CO) peut être isolé de l'ADN entier de tout micro-organisme appartenant au genre Gluconobacter ci-dessus.On peut préparer l'ADN entier par les méthodes conventionnelles [voir par exemple, "Seikagaku Jikken Koza 2
Kakusan no Kagaku I: Bunri Seisei (Cours sur des Expériences Biochimiques 2; Chimie de l'Acide Nucléique Partie I: Séparation et Purification)", édité par
Biochemical Society of Japan et publié par Tokyo Kagaku Dojin Co., 1977,
Japon1.A partir de l'ADN entier, on peut isoler un fragment d'ADN contenant le gène de structure du cytochrome c-553 (CO), par exemple, selon la méthode employée dans l'exemple décrit ci-dessous, c'est-à-dire une méthode qui comprend la synthèse d'une sonde d'oligo-désoxynucléotide pour le gène du cytochrome c-553 (CO) ; le marquage de la sonde synthétisée par 32p ;et la sélection de clones contenant le gène de structure du cytochrome c-553(CO) par hybridation en utilisant la sonde marquée 32 P ci-dessus.

La sonde d'oligodésoxynucléotide pour le gène de structure du cytochrome c-553(CO) peut être chimiquement synthétisée en se basant sur une séquence partielle d'acides aminés du cytochrome c-553(CO) purifié, par exemple, en utilisant le synthétiseur d'ADN modèle 380A (fabriqué par
Applied Biosystems, E.U.A), ou bien selon la méthode décrite dans "Zoku
Seikagaku Jikken Koza; Kakusan No Kagaku I; Iden Kenkyuho : Kakusan No
Kagaku To Bunsekigijutsu (Cours sur des Expériences Biochimiques I, deuxième série ; Méthode d'Etudes Génétiques Partie I: Chimie de l'Acide
Nucléique et Technique Analytique)" (édité par Biochemical Society of Japan et publié par Tokyo Kagaku Dojin Co., 1986, Japon).

Le cytochrome c-553(CO) peut être isolé et purifié d'un organisme capable de produire le cytochrome c-553 (CO).Par exemple, le cytochrome c553(CO) purifié peut être obtenu de G. suboxydans selon la méthode décrite chez Matsushita K. et autres, FEMS Microbiol. Lett. 10, 267-270, 1981.En effet, on peut obtenir le cytochrome c-553(CO) purifié par une méthode dans laquelle on interrompt les cellules de G. suboxydans à la dernière phase de croissance logarithmique par une presse française, une fraction contenant les membranes des cellules est recueillie, les membranes recueillies de cellules sont solubilisées avec 0,2% de Triton X-100, et les membranes de cellules ainsi traitées sont soumises à une chromatographie en colonne en utilisant, par exemple, une colonne de DEAE-cellulose, une colonne de CM-cellulose ou analogue, pour ainsi obtenir le cytochrome c-553(CO) purifié.

La séquence partielle d'acides aminés du cytochrome c-553(CO) purifié peut être déterminée comme suit. Le cytochrome c-553(CO) purifié est soumis à une hydrolyse limitée en utilisant, par exemple, du bromure de cyanogène ou de l'arginyl endopeptidase pour obtenir les peptides partiellement hydrolysés. Les peptides partiellement hydrolysés obtenus sont isolés et purifiés par chromatographie en phase liquide ou analogue.Alors, on entreprend une détermination de la séquence d'acides aminés de chacun de ces peptides selon la méthode conventionnelle, par exemple, la méthode de dégradation d'Edman et la méthode décrite dans "Seikagaku Jikken Koza I, Tanpakushitsu No Kagaku Il: Ichijikozo Ketteiho (Cours sur des Expériences Biochimiques I, Chimie des
Protéines Partie Il: Méthode de Détermination d'une Structure Primaire) (edité par Biochemical Society of Japan et publié par Tokyo Kagaku Dojin Co., 1976).

La séquence partielle déterminée d'acides aminés du cytochrome c-553(CO) peut être une séquence d'acides aminés N-terminale ou C-terminale du cytochrome c-553(CO).

La liste des bactéries du genre G. suboxydans identifiées ici par les chiffres IFO est donnée dans "List of Cultures", 1988, huitième édition (publiée par l'Institute for Fermentation Osaka) et elle est disponible à l'Institute for
Fermentation Osaka, Japon).

Une librairie génétique peut être préparée par une méthode dans laquelle un ADN entier est scindé en fragments d'ADN par des enzymes appropriées de restriction, les fragments obtenus d'ADN sont, respectivement, liés par 1'ADN ligase T4 à des vecteurs qui ont été scindés au moyen d'enzymes de restriction afm d'avoir des extrémités scindées pouvant être liées dans les fragments ci dessus mentionnés et en transformant les cellules hôtes de E. coli par liar les vecteurs auxquels sont liés les fragments d'ADN ci-dessus mentionnés. Comme vecteurs, on peut utiliser divers vecteurs pour E. coli, comme pUCl9, M13mpl8RF et M13mpl9RF. La transformation de E. coli peut être accomplie par chacune des méthodes conventionnelles, mais il est préférable d'employer une méthode de transformation qui a une grande efficacité. Par exemple, la transformation peut être accomplie avec une haute efficacité selon la méthode révélée chez Hanahan, D.J. Mol. Biol. 166, 557-580(1983). La détection des souches de cellules ayant le gène souhaité parmi les transformants ainsi obtenus peut être entreprise par la méthode conventionnelle. Par exemple, la détection peut être accomplie par technique d'hybridation de colonies ou bien technique d'hybridation de plaques en utilisant une sonde ayant un marqueur radioactif ou fluorescent [T. Maniatis et autres ; Molecular Cloning : A Laboratory Manual,
Cold Spring Harbor Laboratory (1982)].Lorsqu'un fragment isolé d'ADN ne contient qu'une partie du gène souhaité, on peut obtenir la totalité de la région du gène souhaité par une méthode dans laquelle on utilise la partie obtenue du gène souhaité en tant que sonde pour l'hybridation d'un fragment d'ADN comprenant toute la région du gène souhaité.

Un fragment d'ADN comprenant le gène souhaité, c'est-à-dire le gène de structure du cytochrome c-553(CO) ainsi obtenu est utilisé pour donner un produit d'expression du gène de structure. Pour accomplir l'expression, il est nécessaire que le fragment d'ADN comprenant le gène de structure soit lié à un gène capable de présenter une activité de promoteur chez une cellule hôte de manière que le gène de structure puisse être exprimé.

Lorsqu'on utilise un micro-organisme appartenant au genre
Gluconobacter ou Acetobacter en tant que cellule hôte pour l'expression du gène de structure, les promoteurs utilisables comprennent non seulement le promoteur dérivé du gène du cytochrome c-553(CO) mais également d'autres gènes ayant une activité de promoteur qui sont dérivés des bactéries de l'acide acétique et des gènes ayant une activité de promoteur qui sont dérivés de microorganismes autres que les bactéries de l'acide acétique.Des exemples de promoteurs dérivés de micro-organismes autres que les bactéries de l'acide acétique comprennent ceux du gène résistant à l'ampicilline dans le plasmide pBR322 de E. coli et du gène résistant à la canamycine dans le plasmide pACYC 177 de E. coli.

Lorsqu'il est probable que le produit d'expression du gène de structure soit obtenu en une trop grande quantité, affectant ainsi de façon néfaste, par exemple, la croissance d'une cellule hôte, il est souhaitable de choisir un promoteur pouvant contrôler l'expression du gène de structure. I1 est possible que l'expression du gène de structure donne une protéine qui est différente par son poids moléculaire du cytochrome c-553(CO). Même dans un tel cas, tant que la protéine produite a sensiblement les mêmes fonctions que celles du cytochrome c-553(CO), la protéine peut être efficacement utilisée.

Comme hôte pour le plasmide de la présente invention, on peut employer toutes les cellules pouvant être génétiquement manipulées. Des exemples de telles cellules comprennent des cellules de micro-organismes et de plantes. Les exemples de tels micro-organismes comprennent les bactéries de l'acide acétique, Escherichia coli et Bacillus subtilis .

Comme vecteur du gène du cytochrome c-553(CO) , on peut mentionner par exemple pMG101 dans le cas des bactéries de l'acide acétique comme cellules hôtes, pBR325 dans le cas de E. coli comme cellule hôte et pUB110 dans le cas de Bacillus subtilis comme cellule hôte. Par ailleurs, un vecteur navette, que l'on peut utiliser dans un certain nombre de types de microorganismes (comme les bactéries de l'acide acétique et de E.coli) peut être employé.

I1 est possible que le gène du cytochrome c-553(CO) subisse une certaine modification du fait *une mutation ou d'une manipulation génétique.

Cependant, tant qu'un produit d'expression du gène modifié a la fonction de favoriser la fermentation souhaitée par oxydation, le gène modifié du cytochrome c-553(CO) peut être utilisé dans la présente invention.

Dans la présente invention, la terminologie "fermentation par oxydation" signifie un procédé dans lequel un subtrat est incomplètement oxydé par l'action d'une enzyme tout en consommant de l'oxygène, il y a donc accumulation d'une grande quantité d'une métabolite intermédiaire. La fermentation par oxydation est l'un des exemples représentatifs des procédés de conversion biologique.Des exemples de fermentation par oxydation comprennent la fermentation de l'acide acétique où l'acide acétique se forme à partir d'éthanol, la fermentation de l'acide gluconique où l'acide gluconique se forme à partir à partir du glucose, la fermentation du sorbose où le sorbose se forme à partir du sorbitol, la fermentation de la dihydroxyacétone où la dihydroxyacétone se forme à partir de la glycérine, et une fermentation dans laquelle divers acides organiques comme l'acide 2-cétogluconique, l'acide 5cétogluconique et l'acide 2,5-dicétogluconique sont formés à partir du glucose.

Dans la présente invention, la terminologie "fermentation par oxydation" couvre également une fermentation dans laquelle un substrat est converti, par une réaction en plusieurs stades, en un produit qui est grandement différent, par sa structure, du substrat.

Dans la méthode de la présente invention, une cellule contenant le plasmide de la présente invention est portée en contact avec un substrat dans un milieu réactionnel en conditions aérobies, pour ainsi forcer la cellule à donner le produit souhaité de fermentation par oxydation.

La cellule à utiliser dans la méthode de la présente invention peut être multipliée par une méthode conventionnelle de mise en culture tant que l'on est assuré que le plasmide de la présente invention sera retenu dans la cellule à un état où peut s'exprimer le gène de structure du cytochrome c-553(CO). Par exemple, quand la cellule est une cellule de bactéries de l'acide acétique, chacune des sources de carbone pouvant être assimilée par les bactéries peut être utilisée en tant que source de carbone. Usuellement, on utilise, comme source de carbone, un saccharide et également un alcool, comme glycérol, sorbitol et éthanol.Des exemples de sources d'azote utilisables pour la culture de la cellule comprennent divers composés organiques (comme peptone, extrait de levure, poudre de graine de coton, lie de soja et liqueur de trempage du maïs), composés inorganiques (comme des sels d'ammonium), urée et eau ammoniacale. Par ailleurs, si on le souhaite, en plus d'une source de carbone et d'une source d'azote, un milieu de culture à utiliser peut également contenir des sels de métaux comme potassium, sodium, magnésium, manganèse, fer, cuivre, zinc et cobalt. Par ailleurs, si on le souhaite, diverses vitamines comme la famille des vitamines B (comme l'acide pantothénique), des acides aminés et des sels d'acides nucléiques peuvent être incorporés dans le milieu de culture. Le mode de mise en culture peut être soit une culture solide ou une culture liquide.

Cependant, en général, une culture submergée avec aération et agitation est avantageuse. Pour la durée de la culture, une période d'environ 10 à 100 heures est généralement satisfaisante. La température de la culture est de préférence comprise entre environ 25 et 350C. Lorsque la culture est terminée, les cellules multipliées qui sont recueillies d'un bouillon de culture par filtration, centrifugation ou analogue, peuvent être utilisées pour donner le produit souhaité. Alternativement, on peut également utiliser le bouillon de culture tel qu'il est.

Dans la méthode de la présente invention, en tant que milieu réactionnel, on peut employer le bouillon de culture ci-dessus mentionné ou bien un tampon tel qu'un tampon de phosphate, un tampon d'acétate et analogues. Quand le bouillon de culture est utilisé comme milieu réactionnel, la fermentation par oxydation peut être entreprise tout en faisant croître les cellules.

Comme on l'a mentionné ci-dessus, un substrat est sélectionné selon l'objectif de la fermentation par oxydation. Des exemples de substrats comprennent l'éthanol dans le cas de la fermentation de l'acide acétique, le glucose dans le cas de la fermentation de l'acide gluconique, le sorbitol dans le cas de la fermentation du sorbose et la glycérine dans le cas de la fermentation de la dihydroxyacétone.

Lorsqu'un produit (métabolite intermédiaire) de la fermentation par oxydation doit être séparé d'un milieu réactionnel, la séparation du produit peut être accomplie par une méthode qui est usuellement employée dans ce but. Des exemples de méthode de séparation comprennent une chromatographie en colonne, une cristallisation et une distillation.

La cellule à utiliser dans la méthode de la présente invention contient de préférence un produit d'expression du gène du cytochrome c-553(CO) avant son utilisation dans la méthode de la présente invention.

La présente invention sera maintenant mieux illustrée en plus de détail en se référant aux exemples qui suivent qui ne doivent pas être pris comme limitant le cadre de la présente invention.

Dans les exemples suivants de la présente invention, les techniques générales utilisées pour la manipulation génétique sont selon la méthode de T.

Maniatis et autres (T. Maniatis et autres, Molecular cloning : A Laboratory
Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1982).

Exemples.

Etape 1.

Purification du cytochrome c-553(CO)
(1). Culture de Gluconobacter suboxydans IFO 12528:
On a versé 100 ml d'un milieu de culture (pH 6,5) comprenant 2% (poids/volume) de gluconate de sodium, 0,5% (poids/volume) de glucose, 0,3% (poids/volume) de glycérine, 0,3% (poids/volume) d'extrait de levure, 0,2% (poids/volume ) de polypeptone et 20% (volume/volume) d'extrait de pomme de terre dans un ballon à secousses ayant un volume de 500 ml, et le milieu de culture a été stérilisé selon la méthode habituelle. Une quantité en boucle de platine de Gluconobacter suboxvdans IFO 12528 qui avait été soumise à une culture oblique a été inoculée dans le milieu stérilisé de culture avec ensuite culture avec secousses à 30"C pendant 24 heures.Subséquemment, on a placé 1,5 litres du bouillon de culture dans 30 litres d'un milieu frais de culture tel que contenu. La culture a été effectuée dans un fermenteur à cuve ayant un volume de 50 litres sous une aération de 1 wm tout en agitation à 500 t/mn à 30"C pendant 24 heures.

(2). Préparation d'une fraction contenant des membranes de cellules de
G. suboxydans IFO 12528.

On a recueilli 110 g de cellules humides de G. suboxydans IFO 12528 du bouillon de culture obtenu à l'étape 1-(1) ci-dessus. Les cellules humides recueillies ont été lavées deux fois avec de l'eau froide distillée et les cellules lavées ont été mises en suspension dans un tampon de phosphate 0,01 M (pH 6,0) pour obtenir une suspension. La suspension obtenue a été soumise à un traitement à la presse française (1378 bars) pour interrompre les cellules puis la suspension a été soumise à une centrifugation à 5000xg pendant 10 minutes pour ainsi obtenir un extrait sans cellule. Par ailleurs, l'extrait obtenu a été soumis à une ultra-centrifugation à 130000x g pendant 60 minutes pour obtenir un précipité contenant les membranes de cellules (que l'on appellera ci-après souvent simplement "fraction de membranes de cellules").

(3). Solubilisation:
La fraction de membranes de cellules obtenue à l'étape 1-(2) ci-dessus a été mise en suspension dans un tampon de phosphate 0,01 M (pH 6,0) de manière que la concentration finale en protéine soit de 10 mg/ml. Alors, on a ajouté Triton X-100 à la suspension à une concentration finale de 0,2% et le mélange a été soumis à agitation à 0 C pendant 30 minutes. Le mélange sous agitation a alors été soumis à une ultra-centritugation à 68000xg pendant 90 minutes pour obtenir un produit surnageant sous la forme d'une fraction solubilisée.

(4). Chromatographie en colonne de DEAE-cellulose:
On a introduit 210 ml de la fraction solubilisée obtenue à l'étape 1-(3) ci-dessus dans une colonne de DEAE-cellulose (2,5 x 22 cm) qui avait été équilibrée avec un tampon de phosphate 0,01 M (pH 6,0) contenant 0,1% de
Triton X-100. La colonne chargée a été lavée avec un tampon de phosphate du même type que celui utilisé pour l'équilibrage et on élué avec le tampon de phosphate 0,03 M (pH 6,0) contenant 0,1% de Triton X-100. L'éluat a été recueilli sous la forme d'une fraction à chaque fois que l'on avait atteint un volume de 18 mi. On a mesuré la valeur de OD420 et l'activité d'alcool déshydrogénase de chacune des fractions. La mesure de l'activité d'alcool déshydrogénase a été effectuée comme suit.On a mélangé 0,1 ml d'une solution aqueuse d'éthanol 1 M, 0,1 ml d'un échantillon de la fraction obtenue et 0,6 ml d'un tampon de phosphate 50 mM (pH 6,0). On a laissé le mélange résultant reposer pendant S minutes. On a ajouté, au mélange, 0,2 ml d'une solution aqueuse de ferricyanure de potassium 0,1 M, avec ensuite agitation. Alors, le mélange a été soumis à incubation à 25"C pendant 5 minutes.On a ajouté, au mélange, pour ainsi terminer la réaction, 0,5ml d'un réactif de sulfate de fer (III)-Dupanol [qui avait été obtenu en dissolvant 5 g de Fe2(SO4) 3.H20, 3 g de dodécyl sulfate de sodium et 95 ml d'acide phosphorique à 85% dans de l'eau distillée de manière que le volume final de la solution aqueuse soit de 1 litre].

On a laissé le mélange réactionnel reposer à 25"C pendant 30 minutes avec ensuite addition de 3,5 ml d'eau distillée dans le mélange réactionnel. Le mélange réactionnel a été soumis à agitation puis on a mesuré l'activité d'alcool déshydrogénase en terme de OD660.

En se basant sur les résultats, les fractions ayant une forte valeur de
OD420 et ayant une faible activité d'alcool déshydrogénase en terme de OD660 ont été sélectionnées en tant que fractions contenant le cytochrome c-553(CO).

Les fractions ainsi obtenues ont été rassemblées et concentrées dix fois à travers la membrane d'ultra-filtration Toyo UP-20 (fabriquée par Toyo Roshi Kaisha,
Ltd., Japon). Le concentré a été dialysé avec un tampon d'acétate 0,01 M (pH 5,0) pendant une nuit.

(5). Chromatographie en colonne de CM-cellulose.

Le dialysat obtenu à l'étape 1-(4) ci-dessus a été introduit dans une colonne de CM-cellulose (1,5 x 7,5 cm) que l'on avait équilibrée avec un tampon d'acétate 0,01 M (pH 5,0) contenant 0,1% de Triton X-100. La colonne a été lavée avec le tampon d'acétate (pH 5,0) du même type que celui utilisé pour l'équilibrage et on a élué avec un tampon d'acétate 0,04 M contenant 0,1% de Triton X-100. Du résultat de la mesure de la valeur de OD420 ,on a obtenu et rassemblé les fractions contenant le cytochrome c-553(CO) (qui avait une concentration en protéine de 0,48 mg/ml et un volume de liquide de 10,5 ml).

Une méthode perfectionnée de Lowry [J.R. Dulley et P.A.Grieve, Anal.

Biochem., 64, 136-141(1975)] a été utilisée pour la détermination quantitative de la protéine, où l'on a utilisé l'albumine de sérum bovin comme standard.

Etape 2 .

Détermination de la séquence partielle d'acides aminés du cytochrome c-553 (CO),
(1).Hydrolyse limitée en utilisant l'arginyl endopeptidase.

Le tampon dans 700 ul de la fraction de cytochrome c-553(CO) obtenue à l'étape 1-(5) ci-dessus a été éliminé en utilisant Centricon 10 (fabriqué et vendu par Amicon, Ltd., E.U.A). Alors, la fraction a été soumise à une hydrolyse limitée en utilisant l'arginyl endopeptidase (fabriquée et vendue par
Takara Shuzo Co., Ltd., Japon) dans 220 ul d'une solution contenant Tris.HCl 50 mM (pH 8,0) et 2 ug d'arginyl endopeptidase, à 37"C pendant 18 heures.

(2). Isolement des peptides hydrolysés de façon limitée.

On a soumis 200 u1 du mélange réactionnel d'arginyl endopeptidase obtenu à l'étape 2-(1) ci-dessus à une chromatographie en phase liquide dans les conditions décrites ci-dessous. Le schéma d'élution est montré à la figure 2.

Comme le montre la figure 2, on a obtenu deux types de peptides partiellement hydrolysés (fractions de peptides I et II). A la figure 2, I représente une crête correspondant à la fraction de peptide I et II représente une crête correspondant à la fraction de peptide II.

[Conditions de chromatographie en phase liquide]
Colonne: colonne garnie de Cosmosil 5C4-300 (fabriquée et vendue par
Nakarai Chemical Ltd., Japon).

Solvant : une solution aqueuse d'acétonitrile contenant 0,1% d'acide trifluoroacétique (dans le solvant mélangé, la concentration de l'acétonitrile a été graduellement changée de 10% à 74%).

Débit du solvant: 0,8 même.

Détection : UV 280 nm
(3). Détermination de la séquence des acides aminés des peptides hydrolysés de façon limitée:
la séquence des acides aminés des peptides hydrolysés de façon limitée de chacune des fractions I et II obtenues à l'étape 2-(2) ci-dessus a été déterminée au moyen du séquenceur de protéines en phase gazeuse Modèle 470A (fabriqué et vendu par Applied Biosystems, E.U.A). La séquence Nterminale d'acides aminés de chacun des peptides hydrolysés de manière limitée contenus dans les fractions I et II (peptides I et II hydrolysés de façon limitée, respectivement) est comme suit.

Séquence N-terminale d'acides aminés du peptide I hydrolysé de manière limitée:
Lys-Gly-Trp-Gly-Asn-Asn-Ala-Pro-Gly-Thr-Val-Ser-Ala (I)
Séquence N-terminale d'acides aminés du peptide II hydrolysé de manière limitée:
Thr-Thr-Gly-Ala-Pro-Val-Ser-Thr-Ala-Gly-Trp-Asn-Val Ser-Ser-Lys . (II)
Etape 3.

Synthèse de la sonde d'oligodésoxynucléotide:
On a synthétisé 8 types d'oligodésoxynucléotides ayant respectivement les séquences de nucléotides décrites ci-dessous en utilisant un synthétiseur d'ADN modèle 380A (fabriqué et vendu par Applied Biosystems, E.U.A) sur la base de la séquence partielle d'acides aminés [Lys-Gly-Trp-Gly-Asn-Asn-Ala] du peptide I hydrolysé de façon limitée déterminée à l'étape 2-(3) ci-dessus, pour ainsi obtenir un mélange des oligodésoxynucléotides synthétisés. Les oligodésoxynucléotides synthétisés ont été purifiés deux fois par chromatographie rapide en phase liquide pour récupérer environ 100 ug d'un produit purifié selon le protocole donné par Applied Biosystems.Les oligodésoxynucléotides synthétisés ont été utilisés dans le processus subséquent en tant que sondes pour le clonage du gène de structure du cytochrome c-553(CO).

(Séquence de nucléotides des oligodésoxynucléotides)
a. 5' -GCATTATTICCCCAICCTTT-3'
b. 5' -GCATTATTICCCCAICCCTT-3'
c. 5' -GCATTGTTICCCCAICCTTT-3'
d. 5'-GCATTGTTICCCCAICCTTT-3'
e. 5' -GCATTGTTICCCCAICCTTT-3'
f. 5' -GCATTGTTICCCCAICCTTT-3'
g. 5' -GCATTGTTICCCCAICCTTT-3' et
h. 5' -GCATTGTTICCCCAICCTTT-3'
Dans la séquence des nucléotides des oligodésoxynucléotides ci-dessus mentionnés, les symboles alphabétiques donnés représentent respectivement les résidus des acides suivants:
A : Acide désoxyadénylique
C : Acide désoxycytidylique
G : Acide désoxyguanylique
T : Acide thymidylique
I Acide désoxyinosinique.

Retape 4.

Isolement d'un fragment d'ADN contenant un gène codant pour le cytochrome c-553(CO):
On a versé 100 ml d'un milieu de culture contenant 50 g/litre de sorbitol, 10 g/litre d'extrait de levure, 5 g/litre de peptone et 3 g/litre de carbonate de calcium dans un ballon à secousses d'un volume de 500 mi et on a stérilisé selon la méthode conventionnelle. Une pleine boucle de platine de culture oblique de la souche Gluconobacter suboxydans IFO 12528 a été inoculée dans le milieu stérilisé de culture et on a mis en culture à 30"C pendant 2 jours.On a recueilli 2,7 g des cellules humides de 1,5 litres du bouillon résultant de culture et les cellules ont été lavées avec de l'eau stérilisée. Alors, les cellules lavées ont été mises en suspension dans 32 ml d'un tampon contenant Tris-HCl 25 mM (pH 8,0) et EDTA 50 mM.A la suspension, on a ajouté 0,8 ml d'une solution de lysozyme (40 mg/ml) et on soumis à agitation à 37"C pendant une heure. On a de plus ajouté 4 ml d'une solution de pronase (2 mg/ml), dans le mélange, et on soumis à agitation. On a laissé le mélange reposer à température ambiante pendant 15 minutes. Subséquemment, on a ajouté 4 ml d'une solution à 10% de dodécyl sulfate de sodium dans le mélange, on a soumis à agitation et on a fait réagir le mélange à 370C pendant une heure. De plus, le mélange réactionnel a été chauffé à 55"C pendant 10 minutes. Au mélange réactionnel résultant, on a ajouté 40 ml d'un phénol saturé d'un tampon contenant Tris-HCl 50 mM (pH 8,0), EDTA 5 mM et du chlorure de sodium 100 mM pour ainsi entreprendre l'extraction au phénol pendant 10 minutes.Alors, on a entrepris la centrifugation avec ensuite récupération d'un produit surnageant. Le produit surnageant recueilli a été soumis à une extraction pendant 5 minutes avec 40 ml de phénolchloroforme (1:1) saturé du tampon ci-dessus mentionné puis on a entrepris la centrifugation pour obtenir un produit surnageant. Ce processus a été répété une autre fois. Au produit surnageant résultant, on a ajouté RNase de manière que sa concentration finale soit de 40,ug/ml. Le mélange a été soumis à agitation et à incubation pour une réaction à 37"C pendant une heure.Alors, on a ajouté 7ml d'une solution aqueuse de chlorure de sodium 5 M et 8,75 ml d'une solution aqueuse à 50% (poids/volume) de polyéthylène glycol 6000, à 35 ml du mélange réactionnel, avec ensuite agitation et le précipité d'ADN a été prélevé au moyen d'une tige de verre en faisant rouler le premier autour de cette dernière. Le précipité d'ADN obtenu a été lavé avec 70% d'éthanol puis dissous dans 10 ml d'un tampon contenant Tris-HCl 1 mM (pH 8,0) et EDTA 0,1mM.A la solution d'ADN, on a ajouté 1 ml d'une solution aqueuse d'acétate de sodium 3M et 24 ml d'éthanol froid pour ainsi précipiter l'ADN. Ce précipité d'ADN a été prélevé de la même manière qu'on l'a mentionné ci-dessus et le précipité obtenu d'ADN a été lavé avec 70% d'éthanol pour ainsi purifier l'ADN. A 1'ADN purifié, on a ajouté S ml d'un tampon contenant Tris-HCl lmM (pH 8,0) et EDTA 1 mM. Par suite de la mesure de OD260, on a trouvé que la concentration d'ADN dans la solution obtenue était de 0,6 mg/ml. La totalité de
L'ADN a été digéré par l'enzyme de restriction EcoRI (fabriquée et vendue par
Takara Shuzo Co., Ltd., Japon) pour ainsi obtenir des fragments d'ADN. Les fragments d'ADN ont été soumis à une électrophorèse avec 1% de gel agarose puis une portion du gel agarose contenant des fragments d'ADN d'environ 1 kb à environ 2kb a été découpée. Par l'utilisation de GENECLEAN (E) acheté chez
Funakoshi Pharmaceutical Co., Ltd., Japon, on a recueilli les fragments d'ADN d'environ lkb à environ 2kb, selon le protocole donné par la Société. La même méthode que dans le protocole est décrite chez Struhl, K, Biotechnique 3,452 (1985).Par l'utilisation de 1'ADN ligase T4 (fabriquée et vendue par Takara
Shizo Co., Ltd., Japon), on a lié les fragments recueillis d'ADN d'environ lkb à environ 2kb au vecteur M13mpl9RF de E. coli (fabriqué et vendu par Takara
Shuzo Co., Ltd., Japon) qui avait été digéré par l'enzyme de restriction EcoRI et avec déphosphorisation au moyen d'une alcaliphosphatase bactérienne (fabriquée et vendue par Takara Shuzo Co., Ltd., Japon) pour obtenir un mélange réactionnel de ligase.Les cellules compétentes de E. coli DH5a (fabriquées et vendues par Bethesda Research Laboratories Life Technologies,
Inc., E.U.A, que l'on appellera ci-après souvent simplement "BRL") ont été transformées par le mélange réactionnel de ligase selon le protocole offert par
BRL et on a obtenu environ 2000 souches transformantes sous la forme de plaques en utilisant E. coli DH5aF' (fabriquées et vendues par BRL, E.U.A) comme bactéries indicatrices. Les plaques ont été transférées sur un filtre de nitrocellulose et l'hybridation a été effectuée à 50"C pendant 90 minutes en utilisant un oligodésoxynucléotide synthétique comme sonde (synthétisé à l'étape 3 ci-dessus) ayant son extrémité 5' marquée par le radioisotope 32p.

Subséquemment, le filtre de nitrocellulose a été lavé avec une solution de 6xSSC (contenant du chlorure de sodium 0,9 M, du citrate de sodium 90 mM et 0,6 % de dodécyl sulfate de sodium) à température ambiante pendant 10 minutes et on encore lavé avec la même solution à 40"C pendant 5 minutes.

Ensuite, une autoradiographie a été effectuée. Des résultats de l'autoradiographie, on a sélectionné une souche contenant l'ADN qui s'hybridait fortement avec la sonde. On a extrait 100 g de L'ADN plasmidique contenu dans la souche selon la méthode de lyse alcaline conventionnelle. En utilisant une portion de l'extrait, on a préparé une carte de restriction de 1'ADN plasmidique. Par suite, on a trouvé que le plasmide extrait était un plasmide où le fragment de EcoRI d'environ 1,5 kb, s'hybdridant avec la sonde obtenue à l'étape 3 ci-dessus, était inséré au site de EcoRI des sites multiples de clonage de
M13mpl9RF.

EtareS
Détermination de la séquence des nucléotides du fragment de EcoRI.

La séquence des nucléotides du fragment de EcoRI d'environ 1,5 kb obtenu à l'étape 4 ci-dessus a été déterminée d'abord par digestion du fragment en longueurs appropriées, ensuite par insertion des fragments résultants dans des vecteurs M13 et troisièmement en déterminant la séquence des nucléotides de chaque insert selon la méthode de Sanger et autres (Sanger, F. Science, Volume 214, 1205-1210 (1981)). Pour le processus particulier de la détermination de la séquence des nucléotides, on a utilisé le nécessaire de Séquence 7-DEAZA (fabriqué et vendu par Takara Shuzo Co., Ltd., Japon) selon le protocole attaché au nécessaire. Sensiblement la même méthode que le protocole est décrite par
Mizusawa, S et autres, Nucleic Acids Res., 14 1319-1324 (1986).Pour l'insertion des divers fragments du fragment de EcoRI dans les vecteurs M13, on a utilisé les sites de restriction du fragment de EcoRI d'environ 1,5 kb.

La séquence déterminée de nucléotides du fragment de EcoRI a été analysée pour sa région pouvant être traduite. Par suite, la présence dans la région pouvant être traduite d'un gène consistant en 1062 nucléotides [à partir du 373 ième nucléotide (G) jusqu'au 1434 ième nucléotide (A) sur la figure 1] codant pour 354 résidus d'acides aminés (correspondant à un poids moléculaire de 37840) est devenu apparente. On a cependant trouvé que le fragment de
EcoRI d'environ 1,5 kb obtenu à l'étape 4 ci-dessus ne contenait aucun gène codant pour une région N-terminale du cytochrome c-553(CO) parce que le cytochrome c-553(CO) isolé d'une membrane de cellule avait un poids moléculaire de 48000.

Etape 6
Isolement d'un fragment d'ADN contenant un gène codant pour une région N-terminale du cytochrome c-553(CO):
L'ADN entier de Gluconobacter suboxydans IFO 12528, obtenu à l'étape 4 ci-dessus, a été digéré par l'enzyme de restriction SphI (fabriquée et vendue par Takara Shuzo Co., Ltd., Japon) avec ensuite électrophorèse avec 1% de gel agarose. On a découpé une portion du gel contenant les fragments d'ADN d'environ lkb à environ 3kb. En utilisant GENECLEAN (E3) acheté chez
Funakoshi Pharmaceutical Co., Ltd., J apon, on a recueilli, du gel, les fragments d'ADN d'environ lkb à environ 3kb selon le protocole donné par la Société.Par l'utilisation de 1'ADN ligase T4 (fabriquée et vendue par Takara SHUZO Co.,
Ltd., Japon), les fragments d'ADN ont été individuellement liés aux vecteurs M13mpl9RF de E. coli (fabriqués et vendus par Takara Shuzo Co., Ltd., Japon) qui avaient été soumis à digestion par l'enzyme de restriction SphI et à une déphosphoration par la phosphatase alcaline bactérienne (fabriquée et vendue par Takara Shuzo Co., Ltd., Japon) pour obtenir un mélange réactionnel de ligase. En utilisant le mélange réactionnel de ligase obtenu, les cellules compétentes de E. coli DHSa (fabriquées et vendues par BRL, E.U.A.) ont été transformées selon le protocole donné par la Société et on a obtenu environ 1500 transformants sous la forme de plaques en utilisant E. coli DHSaF' (fabriquées et vendues par BRL, E.U.A) comme bactéries indicatrices.Les plaques obtenues, formant une librairie génétique, ont été transférées sur un filtre de nitrocellulose.

La sonde utilisée dans cette étape a été préparée selon la méthode suivante. 20 g de l'ADN plasmidique obtenu à l'étape 4 ci-dessus ont été digérés par les enzymes de restriction EcoRI et SphI avec ensuite électrophorèse avec 1% de gel agarose et une portion du gel agarose contenant un fragment d'ADN d'environ 0,5 kb a été isolée. En utilisant GENECLEAN ) acheté chez
Funakoshi Co., Ltd., Japon, on a extrait un fragment de EcoRI-SphI d'environ 0,5 kb, de la portion isolée de gel agarose selon le protocole donné par la
Société. En utilisant 50 ng du fragment, une sonde marquée par [a- 32P] désoxycytidine triphosphate a été préparée au moyen du système de marquage d'ADN Multiprime d'Amersham International, Grande-Bretagne selon le protocole.Sensiblement la même méthode que dans le protocole est décrite chez
Feinberg, A.P. et autres. Analytical Biochemistry, 132, 6-13 (I 983). Le mélange réactionnel résultant a été soumis à une purification en utilisant une colonne
Nick R achetée chez Pharmacia Fine Chemicals AB, Suède, pour ainsi obtenir une sonde à utiliser dans cette étape 6.

Le filtre de nitricellulose auquel était transférée la librairie génétique et la sonde, que l'on avait préparés ci-dessus dans cette étape, ont été hybridés à 42"C pendant une nuit. Subséquemment, le filtre de nitrocellulose a été lavé à température ambiante pendant 30 minutes dans une solution de 5 x SSPE (contenant du chlorure de sodium 0,9 M, du phosphate de sodium 0,05 M (pH 7,7) et de l'éthylènediaminetétraacétate disodique 0,0005 M. Par ailleurs, on l'a lavé à 42"C pendant 30 minutes dans une solution de 1 x SSPE (obtenue en diluant 5 fois la solution ci-dessus mentionnée de SSPE contenant 0,1% de dodécylsulfate de sodium).Après lavage, on a soumis à autoradiographie. Par suite, on a obtenu 9 souches contenant respectivement des ADN plasmidiques capables de s'hybrider fortement avec la sonde. Subséquemment, les ADN plasmidiques contenus dans les souches ont été extraits selon la méthode de lyse alcaline simple conventionnelle, et les cartes respectives de restriction ont été préparées. Ensuite, on a trouvé que les plasmides obtenus ci-dessus se composaient d'un plasmide composite dans lequel le fragment de SphI d'environ 2kb, capable de s'hybrider à la sonde préparée ci-dessus dans cette étape, était inséré au site de SphI du site de clonage multiple de M13mpl9RF et d'un plasmide composite dans lequel le fragment de SphI ci-dessus mentionné était inséré de la même manière qu'on l'a mentionné ci-dessus à l'exception que son orientation était l'inverse.

Etape 7.

Détermination de la séquence de nucléotides 5' -terminale (N-terminale) du gène de structure du cytochrome c-553(CO).

La séquence des nucléotides du fragment de SphI d'environ 2kb, isolé à l'étape 6 ci-dessus, a été déterminée comme suit. En effet, on a préparé les sousclones de M13 contenant des fragments insérés ayant différentes longueurs à partir du fragment de SphI selon la méthode de délétion de Henikoff et autres (Henikoff, S., Gene, volume 28, 351-359, 1984), et la séquence de nucléotides de chaque portion insérée a été déterminée de la même manière qu'on l'a mentionné à l'étape 5 ci-dessus. Pour le processus expérimental particulier pour la préparation des sous-clones de M13 contenant les fragments insérés ayant des longueurs différentes, le processu a été effectué en utilisant un nécessaire de délétion Kilo-Séquence (fabriqué et vendu par Takara Shuzo Co., Ltd., Japon) selon le protocole accompagnant le nécessaire.

On a effectué un examen concernant la région pouvant être traduite de la séquence déterminée des nucléotides. Par suite, on a trouvé que la séquence se composait de 378 nucléotides [du premier nucléotide (A) au 378 ième nucléotide (C) de la séquence de nucléotides que l'on peut voir à la figure 1-(1) à 1-(3)] de la région pouvant être traduite, codant pour 126 résidus d'acides aminés à partir du N-terminal (poids moléculaire: 13651).

Par ailleurs, la séquence des nucléotides à partir du 379 ième nucléotide en aval était en accord parfait avec la séquence des nucléotides déterminée à l'étape 5 ci-dessus.

Retape 8
Construction d'un fragment d'ADN contenant la région entière du gène de structure du cytochrome c-553(CO):
(1) Insertion du fragment de EcoRI d'environ 1,5 kb dans le site de
EcoRI de M13mp18RF
10 ug de 1'ADN plasmidique obtenu à l'étape 4 ci-dessus ont été digérés avec l'enzyme de restriction EcoRI et on a soumis à une électrophorèse sur 1% de gel agarose et une portion du gel agarose contenant un fragment d'ADN d'environ 1,5 kb a été enlevée. En utilisant GENECLEAN (3 acheté chez Funakoshi Pharmaceutical Co., Ltd., J apon, le fragment de EcoRI d'environ 1,5kb a été extrait et isolé du gel agarose obtenu, selon le protocole donné par la
Société.

Le vecteur M13mp18RF (fabriqué et vendu par Takara Shuzo Co., Ltd.,
Japon) a été digéré par l'enzyme de restriction EcoRI et soumis à déphosphoration avec la phosphatase alcaline bactérienne (fabriquée et vendue par Takara Shuzo Co., Ltd., Japon). Le vecteur M13mpl8RF ainsi traité a été lié au fragment de EcoRI ci-dessus mentionné au moyen de l'ADN ligase T4.En utilisant le mélange réactionnel de ligase obtenu, les cellules compétentes (fabriquées et vendues par BRL, E.U.A )de E. coli DH5a ont été transformées selon le protocole donné par BRL.Les ADN plasmidiques des six souches transformantes obtenues ont été extraits selon la méthode de lyse alcaline simple et des cartes respectives de restriction ont été préparées.

Par suite, on a trouvé que chacun des plasmides obtenus ci-dessus se composaient d'un type d'un plasmide composite où le fragment de EcoRI d'environ 1,5 kb isolé à l'étape 8 ci-dessus était inséré dans le site de EcoRI du site de clonage multiple de M13mpl8RF et un type d'un plasmide composite où le fragment de EcoRI ci-dessus mentionné était inséré de la même manière qu'on l'a mentionné ci-dessus à l'exception que son orientation était inversée.

(2) Isolement du fragment d'ADN contenant le 3'-terminal (correspondant au C-terminal du gène:
Des deux types de plasmide obtenus à l'étape 8-(1) ci-dessus, on a provoqué la digestion de 10 ug du type d'ADN plasmidiques où l'extrémité 3' du gène du cytochrome c-553(CO) était la plus proche du site XbaI du site de clonage multiple du vecteur M13mp18RF, par les enzymes de restriction PstI
AxbI avec ensuite électrophorèse sur 1% de gel agarose. Alors, on a obtenu une portion du gel agarose contenant un fragment d'ADN d'environ 1,5kob. Du gel agarose, on a extrait et isolé le fragment de PstI-XbaI d'environ 1,5 kb en utilisant GENECLEAN r acheté chez Funakoshi Pharmaceutical Co., Ltd.,
Japon selon le protocole joint.

(3) Construction du gène de structure entier du cytochrome c-553(CO):
Des deux types de plasmide préparés à l'étape 6 ci-dessus (c'est-à-dire un plasmide composite dans lequel le fragment SphI d'environ 2kb capable d'être hybridé avec une sonde était inséré au site de SphI du site de clonage multiple de M13mpl9RF et un plasmide composite dans lequel le fragment SphI cidessus mentionné était inséré de la même manière qu'on l'a mentionné ci-dessus, à I'exception que son orientation était inversée), on a provoqué la digestion de 10 ug du type de l'ADN plasmidique où l'extrémité 3' (correspondant au Cterminal) du gène entier de structure du cytochrome c-553(CO) se trouvait le plus près du site de XbaI du site de clonage multiple du vecteur M13mpl9RF par les enzymes de rectriction PstI et XbaI. Le plasmide digéré a été soumis à une électrophorèse sur 1% de gel agarose et une portion du gel contenant un fragment d'ADN d'environ 9 kb a été prélevée. Du gel agarose obtenu, on a extrait et isolé le fragment de PstI-XbaI d'environ 9 kb en utilisant
GENECLEAN (2) acheté chez Funakoshi Pharmaceutical Co., Ltd., Japon selon le protocole donné par la Société.Le fragment de PstI-XbaI d'environ 9kb a été lié au fragment de PstI-XbaI d'environ 1,5 kb isolé à l'étape 8-(2) ci-dessus, par 1'ADN ligase T4 (fabriquée et vendue parTakara Shuzo Co., Ltd., Japon). En utilisant le mélange réactionnel de ligase, les cellules compétentes (fabriquées et vendues par BRL, E.U.A.) de E. coli DH5a ont été transformées selon le protocole donné par la société. Les ADN plasmidiques des six souches transformantes obtenues ont été extraits selon la méthode de lyse alcaline simple et les cartes respectives de restriction ont été préparées. Par suite, on a trouvé que la totalité des plasmides obtenus contenait un fragment de SphI-EcoRI d'environ 3kb. Les fragments de SphI-EcoRI d'environ 3 kb se sont révélés contenir à la fois le fragment de EcoRI d'environ 1,5 kb cloné à l'étape 4 cidessus et les fragments de SphI d'environ 2 kb clonés à l'étape 6 ci-dessus.

Les ADN plasmidiques contenant le fragment de SphI-EcoRI d'environ 3 kb obtenu à cette étape ont été obtenus en une quantité de 150 ug par la méthode de lyse alcaline employée à l'étape 4 ci-dessus. On a digéré 20 ug des
ADN plasmidiques obtenus avec les enzymes de restriction BamHI et SacI et on a soumis à une électrophorèse sur 1% de gel agarose et une portion du gel agarose contenant un fragment d'ADN d'environ 2,7 kb a été prélevée. Du gel agarose obtenu, on a extrait et isolé environ 1 g d'un fragment de BamHi-SacI d'environ 2,7 kb, en utilisant GENECLEAN (g) acheté chez Funakoshi
Pharmaceutical Co., Ltd., Japon, selon le protocole donné par la Société.

Le gène de structure entier codant pour le cytochrome c-553(CO), qui se compose de 1434 nucléotides montrés à la figure 1, est contenu dans le fragment de BamHI-SacI d'environ 2,7 kb.

(4) Insertion d'un fragment de BamHi-SacI d'environ 2,7 kb dans le vecteur pHSG298:
5 pg de 1'ADN du vecteur plasmidique pHSG298 de E. coli (fabriqué et vendu par Takara Shuzo Co., Ltd., Japon) ont été digérés par les enzymes de restriction BamHI et SacI avec ensuite électrophorèse avec 1% de gel agarose et on a isolé une portion du gel agarose contenant un fragment de vecteur plasmidique d'environ 2,7 kb. De la portion isolée du gel agarose, on a extrait un fragment de BamHi-SacI du vecteur plasmidique pHSG298 d'environ 2,7 kb en utilisant GENECLEAN ) acheté chez Funakoshi Pharmaceutical Co., Ltd.

Japon, selon le protocole donné par la Société.

Le fragment extrait de pHSG298 de BamHi-SacI d'environ 2,7 kb a été lié au fragment de BamHi-SacI d'environ 2,7 kb obtenu à l'étape 8-(3) ci-dessus en utilisant 1'ADN ligase T4 (fabriquée et vendue par Takara Shuzo Co., Ltd.,
Japon) pour ainsi obtenir un mélange réactionnel de ligase. En utilisant le mélange réactionnel de ligase, on a transformé des cellules compétentes de
E.coli DHSa (fabriquées et vendues par BRL, E.U.A) selon le protocole donné par BRL pour ainsi obtenir six souches transformantes. Les ADN plasmidiques ont été, respectivement, extraits des souches transformantes obtenues selon la méthode conventionnelle de lyse alcaline simple et les cartes respectives de restriction en ont été préparées.Par suite, on a trouvé que la totalité des ADN plasmidiques obtenus se composaient du plasmide composite pCYT3 dans lequel le fragment de BamHI-SacI d'environ 2,7 kb obtenu à l'étape 8-(3) cidessus était lié au fragment de BamHi-SacI d'environ 2,7 kb dérivé du vecteur plasmidique pHSG298. En utilisant la méthode de lyse alcaline conventionnelle, 100 pg de pCYT3 ont été extraits des cellules de E. coli le contenant.

Le fait que le gène de structure ayant la séquence des nucléotides montrée à la figure 1 code pour le cytochrome c-553(CO) a été confirmé par un accord parfait de la séquence des acides aminés déterminée à l'étape 2-(3) cidessus avec la séquence des acides aminés codée par la séquence des nucléotides que l'on peut voir à la figure 1.

A titre d'exemple, la séquence N-terminale d'acides aminés (séquence
No. I) du peptide I partiellement hydrolysé, déterminée à l'étape 2-(3) ci-dessus, était en accord avec la séquence d'acides aminés codée par la séquence de nucléotides allant du 1243 ième nucléotide (A) au 1281 ième nucléotide (T) que l'on peut voir à la figure 1, tandis que la séquence N-terminale d'acides aminés (séquence No. II) du peptide II partiellement hydrolysé, déterminée à l'étape 23, était en accord avec la séquence d'acides aminés codée par la séquence des nucléotides allant du 1303 ième nucléotide (A) au 1350 ième (G) que l'on peut voir à la figure 1.

Retape 9
Construction du vecteur navette de Gluconobacter- E. coli.:
(1) Acquisition du fragment plasmidique de Gluconobacter suboxydans IFO3130:
On a versé 50 ml d'un milieu de culture contenant 8 g/l de polypeptone, 5 g/l d'extrait de levure, 2,5 g/l de NaCl et 20 g/l de glycérine dans un flacon à secousses ayant un volume de 500 ml et le milieu de culture a été stérilisé selon la méthode habituelle. Une quantité d'une boucle de platine de culture oblique de Gluconobacter suboxydans IFO 3130 a été inoculée dans le milieu de culture stérilisé ci-dessus et on a soumis à une culture avec secousses à 300C pendant une nuit.Du bouillon résultant de culture, des cellules ont été recueillies et on en a extrait un ADN plasmidique selon la méthode de lyse alcaline traditionnellement utilisée pour E. coli. On a provoqué la digestion de 20 pg de 1'ADN plasmidique extrait avec l'enzyme de restriction XhoI (fabriquée et vendue par Takara Shuzo Co., Ltd., Japon) avec ensuite électrophorèse avec 1% de gel agarose et une portion du gel agarose contenant des fragments d'ADN d'environ 2kb à environ 4 kb a été isolée. De la portion isolée de gel agarose, on a extrait les fragments d'ADN en utilisant GENECLEAN ) acheté chez
Funakoshi Pharmaceutical Co., Ltd., Japon, selon le protocole donné par la
Société.

(2) Insertion du fragment plasmidique de Gluconobacter dans le vecteur pUC18 deE.coli.

En utilisant 1'ADN ligase T4 (fabriquée et vendue par Takara Shuzo Co.,
Ltd, Japon), on a lié les fragments d'ADN du plasmide de Gluconobacter obtenu à l'étape 9-(1) ci-desssus aux vecteurs pUC18 de E. coli (fabriqués et vendus par Takara Shuzo Co., Ltd. Japon), que l'on avait digérés par l'enzyme de restriction SalI (fabriquée et vendue par Takara Shuzo Co., Ltd., Japon) puis on a soumis à déphosphorisation avec la phosphatase alcaline bactérienne (fabriquée et vendue par Takara Shuzo Co., Ltd, Japon) pour ainsi obtenir un mélange réactionnel de ligase. Par l'utilisation de ce mélange réactionnel de ligase, les cellules compétentes de E. coli DH5a (fabriquées et vendues par
BRL, E.U.A) ont été transformées selon le protocole donné par la Société.Les
ADN plasmidiques ont été extraits des cellules transformantes résultantes selon la méthode de lyse alcaline conventionnelle. Une carte de restriction a été préparée en utilisant une aliquote des ADN extraits. Par suite, on a trouvé que les plasmides extraits se composaient du plasmide composite PIGEA1 où le fragment de plasmide d'environ 2,7 kb dérivé de Gluconobacter suboxydans
IFO3130 était inséré dans pUC18 à son site de Sall.

Etape 10.

Insertion du fragment de d'environ 2,7 kb contenant la totalité du gène codant pour le cytochrome c-553(CO) dans pGEAî:
On a fait digérer 5 g de 1'ADN de pGEAl par les enzymes de restriction BamHI et SacI, avec ensuite électrophorèse avec 1% de gel agarose et une portion du gel agarose contenant un fragment de vecteur plasmidique d'environ 5,4 kb a été isolée. De la portion isolée du gel agarose, on a extrait un fragment de BamHI-SacI d'environ 5,4 kb, dérivé du vecteur plasmidique PIGEA1 en utilisant GENECLEAN (E) acheté chez Funakoshi Pharmaceutical
Co., Ltd., Japon, selon le protocole donné par la Compagnie.

En utilisant 1'ADN ligase T4, on a lié le fragment de de PIGEA1 d'environ 5,4 kb au fragment de du plasmide composite pCYT3 obtenu à l'étape 8-(4) ci-dessus pour obtenir un mélange réactionnel de ligase. Des cellules compétentes de E. coli DHSa (fabriquées et vendues par BRL, E.U.A).

ont été transformées par ce mélange réactionnel de ligase selon le protocole donné par la Société pour ainsi obtenir des cellules transformées.Les plasmides contenus dans les cellules transformées ont été recherchés et par suite, on a confirmé le plasmide composite PIGEA1 dans lequel le fragment de d'environ 2,7 kb contenant la totalité du gène codant pour le cytochrome c-553(CO) était lié au fragment de d'environ 5,4 kb dérivé de pGEAl. Des cellules résultantes de E. coli contenant pGEACl, on a extrait 100pg de pGEACl selon la méthode de lyse alcaline conventionnelle.

Etape 11.

Transformation des bactéries de Gluconobacter
On a versé 500 mg du milieu de culture YPG (contenant 2g/litre de polypeptone, Sg/litre d'extrait de levure et 30 g/litre de glucose, où le glucose avait été stérilisé à la chaleur puis mélangé en conditions stériles aux autres composants du milieu stérilisés à la chaleur) dans un ballon à secousses d'un volume de 500 ml avec ensuite stérilisation selon la méthode conventionnelle.Ensuite, une quantité d'une boucle de platine de culture oblique de Gluconobacter suboxydans IFO 3254 a été inoculée dans le milieu de culture et on a mis en culture à 25"C pendant une nuit. Le bouillon résultat de culture a été refroidi avec de la glace pendant 10 minutes puis on a recueilli les cellules de Gluconobacter suboxydans IFO3254 et on a lavé deux fois avec 25 ml d'une solution de NaCl refroidie avec de la glace (contenant NaCl 100 mM, MgC12 5mM et Tris-HCl 10 mM, pH : 7,6). Ensuite, les cellules ainsi lavées ont été mises en suspension dans 20 ml d'une solution de LiCl refroidie par de la glace (contenant Licol 400 mM et Tris-HCl 10 mM, pH : 7,6) avec ensuite refroidissement avec de la glace pendant 30 minutes. Les cellules ont été recueillies de la suspension ci-dessus puis de nouveau mises en suspension dans 0,5 ml de la solution de LiCl pour ainsi obtenir une suspension de cellules compétentes.

On a mélangé 200u1 de la suspension de cellules compétentes ainsi obtenue avec 100 ,ul d'un tampon TE refroidi par de la glace (contenant EDTA lmM et Tris-HC1 10 mM, pH : 7,6) contenant 10 ug d'un ADN plasmidique à utiliser pour la transformation dans la présente invention. Le mélange résultant a été refroidi avec de la glace pendant 1 heure puis mélangé à 300 u1 d'une solution de PEG refroidie par de la glace (une solution aqueuse à 60% poids/volume de polyéthylène glycol d'un poids moléculaire de 4000) avec ensuite refroidissement avec de la glace pendant 30 minutes. La solution résultante de cellules a été mélangée à 5 ml du milieu de culture YPG puis on a soumis à une mise en culture avec secousses à 30 C pendant 3 heures.Le bouillon résultant de culture a été dilué de manière appropriée avec de l'eau stérile puis inoculé dans un milieu d'agar YPG (milieu préparé en ajoutant 15g/litre d'agar au milieu de culture YPG) contenant 100 pg/ml d'ampicilline avec ensuite mise en culture à 30 C pendant 3 jours.

En utilisant la méthode ci-dessus pour la transformation des bactéries de
Gluconobacter, on a soumis Gluconobacter suboxydans IFO3254 à une transformation avec chacun des ADN plasmidiques pGEAl et pGEACl. Par suite, on a obtenu les transformants Gluconobacter suboxydans IFO 3254 (pGEA)1 et Gluconobacter suboxvdans IFO 3254 (pGEAC1) .Gluconobacter suboxydans IFO 3254 (pGEAl) et Gluconobacter suboxydans IFO 3254 (pGEACl) contiennent des plasmides qui indiquent les mêmes schémas de restriction que ceux de PIGEAI et pGEACl, respectivement, et par conséquent on trouve que Gluconobacter suboxydans IFO 3254 (pGEAl) et Gluconobacter suboxydans IFO 3254 (pGEACl) sont les transformants avec pGEAl et pGEACl, respectivement,.Gluconobacter suboxydans IFO 3254 (pGEAC1) a été déposé au Fermentation Reasearch Institut, Japon, sous le Numéro d'accession FERM BP-3810. Dans les étapes suivantes, à moins que cela ne soit spécifié autrement, on ajoute l'ampicilline à une concentration de 200 g/ml dans un milieu de culture lorsque I'on met en culture le transformant contenant pGEAl ou pGEACl.

Retape 12
Evaluation de l'activité d'oxydase:
(1) Préparation des échantillons de la cellule et de la membrane de la cellule.

On a versé 100 ml du milieu de culture SG (contenant 10 g/litre de gluconate de sodium, 5 g/litre de polypeptone, 3g/litre de glycérol, 10 g/litre de sorbitol, 5 g/litre d'extrait de levure et 5 g/litre de glucose, où le glucose avait été stérilisé à la chaleur puis mélangé en conditions stériles aux autres composants du milieu stérilisé de la chaleur), dans chacun des trois ballons à secousses d'un volume de 500 ml puis on a stérilisé par la méthode conventionnelle.Ensuite, une boucle de platine de culture oblique de chacune des souches Gluconobacter suboxvdans IFO 3254, Gluconobacter suboxydans
IFO 3254 (pGEA1) et Gluconobacter suboxydans IFO 3254 (pGEAC1) a été inoculée dans le milieu dans l'un des ballons à secousses avec ensuite mise en culture à 30"C pendant une nuit pour ainsi obtenir des bouillons de culture contenant les bactéries. Ensuite, on a versé séparément, dans chacun des trois ballons à secousses d'un volume de 5 litres, 2,4 litres du milieu de culture SGG (milieu préparé en régulant la concentration du gluconate de sodium dans le milieu de culture SG ci-dessus mentionné à 20 g/litre,) puis on a stérilisé les ballons à secousses par la méthode conventionnelle.Les milieux de culture
SGG dans les ballons à secousses ont été respectivement inoculés des bouillons de culture contenant les bactéries obtenus ci-dessus avec ensuite mise en culture à 30"C pendant 2 jours. A partir de la moitié des cellules résultantes de chacune des souches, une membrane de cellule a été séparée selon le processus décrit à l'étape 1-(2) ci-dessus, tandis que l'autre moitié des cellules de chacune des souches était recueillie, lavée et mise en suspension dans un tampon de phosphate de potassium 10 mM (pH 6).

(2) Mesure de l'activitié d'oxydase.

Pour 3 ml d'un tampon contenant la suspension de membranes de cellule ou bien la suspension de cellules préparées à l'étape 12-(1) ci-dessus avec lOmM du substrat, on a mesuré le taux de diminution de la concentration d'oxygène dissous à 25"C au moyen d'une électrode d'oxygène du type Clark.

Lorsque l'on a utilisé l'éthanol ou le glucose comme substrat, on a employé un tampon de phosphate de potassium 50 mM (pH 6) et lorsque l'on a employé du sorbitol ou du glycérol comme substrat, on a utilisé un tampon de phosphate de potassium 50 mM (pH 5).

La concentration en protéines de la suspension de membranes des cellules utilisée dans la présente invention a été mesurée selon la méthode améliorée de Lowry mentionnée à l'étape 1-(5) ci-dessus. Les activités spécifiques d'oxydase par rapport à chacun des substrats sont montrées au tableau 1. Les activités spécifiques d'oxydase ont été définies comme le nombre de micromoles de molécules d'oxygène consommées par mg de la protéine par minute lorsque l'on a employé une suspension de membranes de cellule comme échantillon et elles sont définies comme le nombre de micromoles de molécules d'oxygène consommées par mg de cellules sèches par minute lorsque l'on a employé comme échantillon une suspension de cellules.

Des enzymes nécessitant la pyrroloquinoléine quinone comme coenzyme ont été employées dans la présente invention. Par conséquent, chacun des échantillons de la suspension de membranes de cellule et de la suspension de cellules a été mélangé à de la pyrroloquinoléine quinone 5 uM et à CaC12 5mM puis on a laissé reposer à température ambiante pendant 30 minutes pour ainsi obtenir des holoenzymes dans chacun des échantillons. Ensuite, les échantillons contenant les holoenzymes ont été mesurés individuellement pour leur activité d'oxydase.

TABLEAU 1
Activité spécifique d'oxydase

<SEP> Nom <SEP> des <SEP> bacteriés <SEP> à <SEP> partir <SEP> deasquelles <SEP> des <SEP> échantillons <SEP> sont
<tb> <SEP> préparés
<tb> <SEP> Type <SEP> des <SEP> Type <SEP> d'activité <SEP> Gluconobacter <SEP> Gluconobacter <SEP> Gluconobacter
<tb> <SEP> échantillons <SEP> d'oxydase <SEP> Suboxydans <SEP> suboxydans <SEP> suboxydans
<tb> <SEP> IFO <SEP> 3254 <SEP> IFO <SEP> 3254(pGEAl) <SEP> IFO <SEP> 3254(pGECl)
<tb> <SEP> Ethanol <SEP> oxydase <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0,175
<tb> <SEP> Echantillons <SEP> Glucose <SEP> oxydase <SEP> 0,524 <SEP> 0,41 <SEP> 0,650
<tb> <SEP> membranes
<tb> <SEP> cellules <SEP> Sorbitol <SEP> oxydase <SEP> 0,533 <SEP> 0,602 <SEP> 0,778
<tb> <SEP> Glycerol <SEP> oxydase <SEP> 0,404 <SEP> 0,545 <SEP> 0,669
<tb> <SEP> Ethanol <SEP> oxydase <SEP> 0,149 <SEP> 0,152 <SEP> 0,686
<tb> <SEP> Echantillons <SEP> Glucose <SEP> oxydase <SEP> 0,341 <SEP> 0,339 <SEP> 0,419
<tb> <SEP> cellules
<tb> <SEP> Sorbitol <SEP> oxydase <SEP> 0,273 <SEP> 0,304 <SEP> 0,391
<tb> <SEP> Glycerol <SEP> oxydase <SEP> 0,266 <SEP> 0,257 <SEP> 0,280
<tb> Etape 13.

Evaluation de la capacité de fermentation par oxydation:
Une quantité d'une boucle de platine de culture oblique des souches du
Gluconobacter suboxvdans IFO 3254, Gluconobacter suboxvdans IFO 3254 (pGEAl) et Gluconobacter suboxydans IFO 3254(pGEAC1) ont été respectivement inoculées dans 100 ml du milieu de culture SG défini ci-dessus, que l'on a versé dans chacun des trois ballons à secousses d'un volume de 500ml avec ensuite stérilisation selon la méthode habituelle. Les milieux de culture SG dans les ballons à secousse ont été mis en culture en secouant à 30"C pendant une nuit.Subséquemment, on a recueilli les cellules de chacune des souches puis on a inoculé la moitié des cellules dans 50 ml d'un milieu de culture stérilisé à la chaleur pour la fermentation. Les milieux inoculés de culture ont été placés séparément dans des ballons à secousses de 500 ml et on a mis en culture avec secousses à 30"C. L'échantillonnage a été effectué à un intervalle prédéterminé de temps et les composants de chaque bouillon de culture ont été analysés. Le milieu ci-dessus mentionné de culture pour la fermentation contenait lg/litre d'extrait de levure, 10 g/litre de CaC03 et un substrat choisi parmi le glucose (100 g/litre), le sorbitol (100 g/litre) et l'éthanol (30ml/litre).

Les analyses quantitatives de l'acide gluconique et de l'acide acétique contenus dans chacun des bouillons de culture échantillonnés ont été accomplies avec le nécessaire F acheté à Boehringer Mannheim Yamanouchi. Pour l'analyse quantitative du sorbose contenu dans chacun des échantillons, une chromatographie en phase liquide a été entreprise aux conditions suivantes:
Colonne: DC-613 (SHODEX) fabriquée et vendue par Showa Denko
K.K., Japon.

Température de la colonne : 70"C
Solvant : mélange d'acétonitrile et d'eau (3:1)
Débit du solvant: 1,2 ml/mn
Détecteur: DETECTEUR D'INDICE DE REFRACTION SHIMADZU
RID-6A.

Pour chacune des souches Gluconobacter suboxydans IFO 3254,
Gluconobacter suboxvdans IFO 3254 (pGEA1) et Gluconobacter suboxydans
IFO 3254 (pGEACl), les taux de formation spécifique de l'acide acétique, de l'acide gluconique et du sorbose sont montrés au tableau 2. Le taux de formation spécifique de chaque produit de fermentation est défini comme la valeur en gramme d'un produit de fermentation obtenu pour 1 g (à l'état sec) de chaque bactérie par heure.

Tableau 2
Taux de formation spécifique du produit de fermentation

<SEP> Gluconobacter <SEP> Gluconobacter <SEP> Gluconobacter
<tb> <SEP> suboxydans <SEP> suboxydans <SEP> suboxydans
<tb> <SEP> IFO <SEP> 3254 <SEP> IFO <SEP> 3254 <SEP> (pGEAl) <SEP> IFO <SEP> 3254 <SEP> (pGECl)
<tb> <SEP> Taux <SEP> de <SEP> formation
<tb> <SEP> spécifique <SEP> de <SEP> l'acide
<tb> <SEP> acétique <SEP> 1,6 <SEP> 1,1 <SEP> 5,3
<tb> <SEP> g-acide <SEP> acétique
<tb> <SEP> g-cellulessèches.heure
<tb> <SEP> Taux <SEP> de <SEP> formation
<tb> <SEP> de <SEP> l'acide
<tb> <SEP> g-acide <SEP> gluconique <SEP> 18 <SEP> 20 <SEP> 24
<tb> <SEP> g-cellulessèches.heure
<tb> <SEP> Taux <SEP> de <SEP> formation
<tb> <SEP> spécifique
<tb> <SEP> du <SEP> sorbose <SEP> 41 <SEP> 38 <SEP> 49
<tb> <SEP> g-sorbose
<tb> <SEP> g-cellulessèches.heure
<tb>

Claims (5)

REVENDICATIONS

1. Plasmide caractérisé en ce qu'il contient un gène ayant une séquence de nucléotides codant pour une séquence d'acides aminés que l'on peut voir aux figures 1-(1) à 1-(3).

2. Cellule caractérisée en ce qu'elle contient un plasmide ayant un gène ayant une séquence de nucléotides codant pour une séquence d'acides aminés que l'on peut voir aux figures 1-(1) à 1-(3).

3. Cellule selon la revendication 2, caractérisée en ce que c'est une cellule d'un micro-organisme.

4. Procédé de fermentation par oxydation, caractérisé en ce qu'un substrat est soumis à une fermentation par oxydation en présence d'une cellule qui contient un plasmide contenant un gène ayant une séquence de nucléotides codant pour une séquence d'acides aminés que l'on peut voir aux figures 1-(1) à 1-(3).

5. Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce que la cellule précitée contient un produit d'expression dudit gène.