JPH0549480A - Ｃ型チトクロム遺伝子及び酸化発酵法 - Google Patents
Ｃ型チトクロム遺伝子及び酸化発酵法Info
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- JPH0549480A JPH0549480A JP23857991A JP23857991A JPH0549480A JP H0549480 A JPH0549480 A JP H0549480A JP 23857991 A JP23857991 A JP 23857991A JP 23857991 A JP23857991 A JP 23857991A JP H0549480 A JPH0549480 A JP H0549480A
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Abstract
(57)【要約】
【構成】チトクロムＣ−５５３（ＣＯ）遺伝子を組み込
んだ新規プラスミドを得、さらに該プラスミドを導入し
て新規細胞を得て、該細胞を酸化発酵に用いる。 【効果】チトクロムＣ−５５３（ＣＯ）遺伝子を含むプ
ラスミドおよび該プラスミドを保有した細胞を利用して
酸化発酵を行うことにより、該発酵の生産性を向上させ
ることができる。
んだ新規プラスミドを得、さらに該プラスミドを導入し
て新規細胞を得て、該細胞を酸化発酵に用いる。 【効果】チトクロムＣ−５５３（ＣＯ）遺伝子を含むプ
ラスミドおよび該プラスミドを保有した細胞を利用して
酸化発酵を行うことにより、該発酵の生産性を向上させ
ることができる。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、Ｃ型チトクロム遺伝
子、該Ｃ型チトクロム遺伝子を含むプラスミド、該プラ
スミドを保有する細胞、および、該細胞を用いることを
特徴とする酸化発酵法に関する。
子、該Ｃ型チトクロム遺伝子を含むプラスミド、該プラ
スミドを保有する細胞、および、該細胞を用いることを
特徴とする酸化発酵法に関する。
【０００２】
【従来の技術】酸化発酵においては、空気中の酸素を消
費しながら基質を不完全酸化して中間代謝産物を大量に
蓄積する。これは、有機化合物の生物変換における反応
の中でもっとも重要なものの一つである。この酸化発酵
を行う生物として、最もよく知られている生物の一つと
して、酢酸菌がある。この菌種における酸化反応は、主
に膜に結合した酵素によって行われていて、これらの酵
素や電子伝達系については、多くの研究が行われている
（飴山實、日本農芸化学会誌、第６３巻、１１８５頁〜
１１９３頁、１９８８年）。酢酸菌の一種であるグルコ
ノバクター サブオキシダンスについては、特に詳細に
研究が進んでおり、細胞膜電子伝達鎖中のチトクロム成
分が、単離精製されている。これらのチトクロム成分と
しては、Ｃ型とＯ型のみが知られている。このＯ型は、
末端酸化酵素としてのチトクロムＯであり、シアン感受
性で、ユビキノールオキシダーゼ活性があり、エネルギ
ー生成能を有する｛Ｍａｔｓｕｓｈｉｔａ，Ｋ．ｅｔ．
ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓ
ｉｃａ Ａｃｔａ ８９４，３０４−３１２（１９８
７）｝。またＣ型チトクロムについては、チトクロムＣ
−５５３（ＣＯ）｛Ｍａｔｓｕｓｈｉｔａ，Ｋ．ｅｔ．
ａｌ．，ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．１
０，２６７−２７０（１９８１）｝，チトクロムＣ−５
５１（ＣＯ）｛Ａｍｅｙａｍａ Ｍ．ｅｔ．ａｌ．，Ａ
ｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．５１，２９４３−２９
５０（１９８７）｝等が精製されている。一方、同菌種
の細胞膜電子伝達系には、シアンで阻害されやすい経路
の他に、シアンで阻害されにくいバイパスが存在してい
る事が示されている｛Ａｍｅｙａｍａ，Ｍ．ｅｔ．ａ
ｌ．，Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．５１，２９４
３−２９５０（１９８７）｝。更に、このシアンで阻害
されにくく、エネルギー生成能をもたないバイパスに
は、Ｃ型チトクロムの一種であるチトクロムＣ−５５３
（ＣＯ）が深く関与している事が示されている｛Ｍａｔ
ｓｕｓｈｉｔａ，Ｋ．ｅｔ．ａｌ．，Ａｇｒｉｃ．Ｂｉ
ｏｌ．Ｃｈｅｍ．５３，２８９５−２９０２（１９８
９）｝。また、本チトクロムＣ−５５３（ＣＯ）の還元
型は、一酸化炭素と結合して５５３ｎｍ付近、５２２ｎ
ｍ付近、４１５ｎｍ付近にそれぞれα，β，γ吸収帯を
示し、酸素と反応する末端酸化酵素のような性質を有し
ている｛Ｍａｔｓｕｓｈｉｔａ，Ｋ．ｅｔ．ａｌ．，Ｆ
ＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．１０，２６７
−２７０（１９８１）｝。これは、呼吸系に存在してチ
トクロムオキシダーゼやそれに準じる酵素に対する直接
の電子供与体となっているという一般的なＣ型チトクロ
ムの性質と異なっている。
費しながら基質を不完全酸化して中間代謝産物を大量に
蓄積する。これは、有機化合物の生物変換における反応
の中でもっとも重要なものの一つである。この酸化発酵
を行う生物として、最もよく知られている生物の一つと
して、酢酸菌がある。この菌種における酸化反応は、主
に膜に結合した酵素によって行われていて、これらの酵
素や電子伝達系については、多くの研究が行われている
（飴山實、日本農芸化学会誌、第６３巻、１１８５頁〜
１１９３頁、１９８８年）。酢酸菌の一種であるグルコ
ノバクター サブオキシダンスについては、特に詳細に
研究が進んでおり、細胞膜電子伝達鎖中のチトクロム成
分が、単離精製されている。これらのチトクロム成分と
しては、Ｃ型とＯ型のみが知られている。このＯ型は、
末端酸化酵素としてのチトクロムＯであり、シアン感受
性で、ユビキノールオキシダーゼ活性があり、エネルギ
ー生成能を有する｛Ｍａｔｓｕｓｈｉｔａ，Ｋ．ｅｔ．
ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓ
ｉｃａ Ａｃｔａ ８９４，３０４−３１２（１９８
７）｝。またＣ型チトクロムについては、チトクロムＣ
−５５３（ＣＯ）｛Ｍａｔｓｕｓｈｉｔａ，Ｋ．ｅｔ．
ａｌ．，ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．１
０，２６７−２７０（１９８１）｝，チトクロムＣ−５
５１（ＣＯ）｛Ａｍｅｙａｍａ Ｍ．ｅｔ．ａｌ．，Ａ
ｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．５１，２９４３−２９
５０（１９８７）｝等が精製されている。一方、同菌種
の細胞膜電子伝達系には、シアンで阻害されやすい経路
の他に、シアンで阻害されにくいバイパスが存在してい
る事が示されている｛Ａｍｅｙａｍａ，Ｍ．ｅｔ．ａ
ｌ．，Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．５１，２９４
３−２９５０（１９８７）｝。更に、このシアンで阻害
されにくく、エネルギー生成能をもたないバイパスに
は、Ｃ型チトクロムの一種であるチトクロムＣ−５５３
（ＣＯ）が深く関与している事が示されている｛Ｍａｔ
ｓｕｓｈｉｔａ，Ｋ．ｅｔ．ａｌ．，Ａｇｒｉｃ．Ｂｉ
ｏｌ．Ｃｈｅｍ．５３，２８９５−２９０２（１９８
９）｝。また、本チトクロムＣ−５５３（ＣＯ）の還元
型は、一酸化炭素と結合して５５３ｎｍ付近、５２２ｎ
ｍ付近、４１５ｎｍ付近にそれぞれα，β，γ吸収帯を
示し、酸素と反応する末端酸化酵素のような性質を有し
ている｛Ｍａｔｓｕｓｈｉｔａ，Ｋ．ｅｔ．ａｌ．，Ｆ
ＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．１０，２６７
−２７０（１９８１）｝。これは、呼吸系に存在してチ
トクロムオキシダーゼやそれに準じる酵素に対する直接
の電子供与体となっているという一般的なＣ型チトクロ
ムの性質と異なっている。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】酸化発酵では、通常高
濃度の基質が酸化されるので、そこから出る電子は極め
て多いと考えられる。この多量の電子の流れが、全てチ
トクロムＯを通過すれば、必要以上のエネルギーを生成
してしまい、生物にとって不都合になる可能性が高く、
逆にチトクロムＯを流れる電子の流れを任意に強化する
ことは困難であると思われる。
濃度の基質が酸化されるので、そこから出る電子は極め
て多いと考えられる。この多量の電子の流れが、全てチ
トクロムＯを通過すれば、必要以上のエネルギーを生成
してしまい、生物にとって不都合になる可能性が高く、
逆にチトクロムＯを流れる電子の流れを任意に強化する
ことは困難であると思われる。
【０００４】従って、酸化発酵の酸化能を強化する場
合、エネルギー生成能を持たない電子の流れを強化した
方が、任意に酸化能を強化できる可能性が高い。つま
り、シアンで阻害されにくくエネルギー生成能を持たな
い前述のバイパス経路を強化することが、酸化発酵能増
強に有効であると考えられる。
合、エネルギー生成能を持たない電子の流れを強化した
方が、任意に酸化能を強化できる可能性が高い。つま
り、シアンで阻害されにくくエネルギー生成能を持たな
い前述のバイパス経路を強化することが、酸化発酵能増
強に有効であると考えられる。
【０００５】しかし、このバイパス経路に深く関与して
いるチトクロムＣ−５５３（ＣＯ）遺伝子を利用して、
このバイパス経路を活用する研究はなされていない。
いるチトクロムＣ−５５３（ＣＯ）遺伝子を利用して、
このバイパス経路を活用する研究はなされていない。
【０００６】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、永年にわ
たり、チトクロムＣ−５５３（ＣＯ）遺伝子の単離の研
究を続けた結果、配列番号１に示されたアミノ酸配列を
コードする塩基配列を有していることを特徴とするＣ型
チトクロム遣伝子を単離し、配列番号１に示されたアミ
ノ酸配列をコードする塩基配列を有する遺伝子を含んで
いることを特徴とするプラスミドを作製し、配列番号１
に示されたアミノ酸をコードする塩基配列を有する遺伝
子を含むプラスミドを保有していることを特徴とする細
胞を育種し、配列番号１に示されたアミノ酸配列をコー
ドする塩基配列を有する遺伝子を含むプラスミドを保有
した細胞を用いることを特徴とする酸化発酵法を実施で
きるようにし、本発明を完成するに至った。
たり、チトクロムＣ−５５３（ＣＯ）遺伝子の単離の研
究を続けた結果、配列番号１に示されたアミノ酸配列を
コードする塩基配列を有していることを特徴とするＣ型
チトクロム遣伝子を単離し、配列番号１に示されたアミ
ノ酸配列をコードする塩基配列を有する遺伝子を含んで
いることを特徴とするプラスミドを作製し、配列番号１
に示されたアミノ酸をコードする塩基配列を有する遺伝
子を含むプラスミドを保有していることを特徴とする細
胞を育種し、配列番号１に示されたアミノ酸配列をコー
ドする塩基配列を有する遺伝子を含むプラスミドを保有
した細胞を用いることを特徴とする酸化発酵法を実施で
きるようにし、本発明を完成するに至った。
【０００７】すなわち、本発明は、配列番号１のアミノ
酸配列をコードする塩基配列を有していることを特徴と
するＣ型チトクロム遺伝子配列番号１に示されたアミノ
酸配列をコードする塩基配列を有する遺伝子を含んでい
ることを特徴とするプラスミド、配列番号１に示された
アミノ酸をコードする塩基配列を有する遺伝子を含むプ
ラスミドを保有していることを特徴とする細胞、およ
び、配列番号１に示されたアミノ酸配列をコードする塩
基配列を有する遣伝子を含むプラスミドを保有した細胞
を用いることを特徴とする酸化発酵法である。
酸配列をコードする塩基配列を有していることを特徴と
するＣ型チトクロム遺伝子配列番号１に示されたアミノ
酸配列をコードする塩基配列を有する遺伝子を含んでい
ることを特徴とするプラスミド、配列番号１に示された
アミノ酸をコードする塩基配列を有する遺伝子を含むプ
ラスミドを保有していることを特徴とする細胞、およ
び、配列番号１に示されたアミノ酸配列をコードする塩
基配列を有する遣伝子を含むプラスミドを保有した細胞
を用いることを特徴とする酸化発酵法である。
【０００８】チトクロムＣ−５５３（ＣＯ）は、ＦＥＭ
Ｓ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．１０，２６７−２
７０（１９８１）に記載されたＣ型チトクロムであり、
分子量が約４８０００のヘムＣを含む蛋白質である。チ
トクロムＣ−５５３（ＣＯ）は、グルコノバクター サ
ブオキシダンス ＩＦＯ １２５２８に代表される一群
のチトクロムＣ−５５３（ＣＯ）生産能を有するグルコ
ノバクター属細菌によって生産される。このチトクロム
Ｃ−５５３（ＣＯ）遺伝子を含むＤＮＡ断片は、同チト
クロムＣ−５５３（ＣＯ）を生産するグルコノバクター
属細菌の保有する全ＤＮＡから単離することができる。
この全ＤＮＡの調製は、常法に従えばよいが、例えば、
日本生化学会編、生化学実験講座２、核酸の化学Ｉ、分
離精製、東京化学同人、１９７７年の方法等を用いて行
うこともできる。この全ＤＮＡから、例えば、実施例に
示されているような方法、すなわち、チトクロムＣ−５
５３（ＣＯ）をコードする遺伝子に対するオリゴデオキ
シヌクレオチドプローブを合成し、同プローブを３２Ｐ
で標識した後、同３２Ｐ標識プローブのハイブリダイゼ
イションを利用し、目的の遺伝子を含むクローンを選択
する方法、等によりチトクロムＣ−５５３（ＣＯ）遺伝
子を含むＤＮＡ断片を単離することができる。
Ｓ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．１０，２６７−２
７０（１９８１）に記載されたＣ型チトクロムであり、
分子量が約４８０００のヘムＣを含む蛋白質である。チ
トクロムＣ−５５３（ＣＯ）は、グルコノバクター サ
ブオキシダンス ＩＦＯ １２５２８に代表される一群
のチトクロムＣ−５５３（ＣＯ）生産能を有するグルコ
ノバクター属細菌によって生産される。このチトクロム
Ｃ−５５３（ＣＯ）遺伝子を含むＤＮＡ断片は、同チト
クロムＣ−５５３（ＣＯ）を生産するグルコノバクター
属細菌の保有する全ＤＮＡから単離することができる。
この全ＤＮＡの調製は、常法に従えばよいが、例えば、
日本生化学会編、生化学実験講座２、核酸の化学Ｉ、分
離精製、東京化学同人、１９７７年の方法等を用いて行
うこともできる。この全ＤＮＡから、例えば、実施例に
示されているような方法、すなわち、チトクロムＣ−５
５３（ＣＯ）をコードする遺伝子に対するオリゴデオキ
シヌクレオチドプローブを合成し、同プローブを３２Ｐ
で標識した後、同３２Ｐ標識プローブのハイブリダイゼ
イションを利用し、目的の遺伝子を含むクローンを選択
する方法、等によりチトクロムＣ−５５３（ＣＯ）遺伝
子を含むＤＮＡ断片を単離することができる。
【０００９】このチトクロムＣ−５５３（ＣＯ）に対す
るオリゴデオキシヌクレオチドプローブは、精製された
チトクロムＣ−５５３（ＣＯ）の部分アミノ酸配列をも
とにして、例えば、アプライドバイオシステム社のＤＮ
Ａ合成機モデル３８０Ａ等のＤＮＡ合成機を用いたり、
日本生化学会論、続生化学実験講座Ｉ、遺伝研究法Ｉ、
核酸の化学と分析技術、東京化学同人１９８６年に記載
された方法等を用いることにより、化学合成することが
できる。
るオリゴデオキシヌクレオチドプローブは、精製された
チトクロムＣ−５５３（ＣＯ）の部分アミノ酸配列をも
とにして、例えば、アプライドバイオシステム社のＤＮ
Ａ合成機モデル３８０Ａ等のＤＮＡ合成機を用いたり、
日本生化学会論、続生化学実験講座Ｉ、遺伝研究法Ｉ、
核酸の化学と分析技術、東京化学同人１９８６年に記載
された方法等を用いることにより、化学合成することが
できる。
【００１０】精製チトクロムＣ−５５３（ＣＯ）は、こ
のチトクロムＣ−５５３（ＣＯ）を生産している生物よ
り単離精製することができる。例えば、グルコノバクタ
ーサブオキシダンス ＩＦＯ １２５２８から、Ｍａｔ
ｓｕｓｈｉｔａ，Ｋ．ｅｔ．ａｌ．，ＦＥＭＳ Ｍｉｃ
ｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．１０，２６７−２７０（１９
８１）に示された方法に従い、対数増殖期後期の菌体か
らフレンチプレスで破砕して膜画分を集め、０．２％ト
リトンＸ−１００で可溶化し、ＤＥＡＥ−セルロースや
ＣＭ−セルロースを用いたカラムクロマトグラフィーを
行って、精製チトクロムＣ−５５３（ＣＯ）を取得する
ことができる。
のチトクロムＣ−５５３（ＣＯ）を生産している生物よ
り単離精製することができる。例えば、グルコノバクタ
ーサブオキシダンス ＩＦＯ １２５２８から、Ｍａｔ
ｓｕｓｈｉｔａ，Ｋ．ｅｔ．ａｌ．，ＦＥＭＳ Ｍｉｃ
ｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．１０，２６７−２７０（１９
８１）に示された方法に従い、対数増殖期後期の菌体か
らフレンチプレスで破砕して膜画分を集め、０．２％ト
リトンＸ−１００で可溶化し、ＤＥＡＥ−セルロースや
ＣＭ−セルロースを用いたカラムクロマトグラフィーを
行って、精製チトクロムＣ−５５３（ＣＯ）を取得する
ことができる。
【００１１】精製チトクロムＣ−５５３（ＣＯ）の部分
アミノ酸配列は、臭化シアンやアルギニルエンドペプチ
ダーゼ等により限定分解を行い、得られた限定分解ペプ
チドを、例えば液体クロマトグラフィー等で単離精製し
た後、例えばエドマン分解法、日本生化学会編、生化学
実験講座Ｉ、蛋白質の化学ＩＩ、一次構造決定法、東京
化学同人 １９７６年、等により、アミノ酸配列を決定
することができる。また、精製チトクロムＣ−５５３
（ＣＯ）のＮ末端アミノ酸配列やＣ末端アミノ酸配列を
利用してもよい。
アミノ酸配列は、臭化シアンやアルギニルエンドペプチ
ダーゼ等により限定分解を行い、得られた限定分解ペプ
チドを、例えば液体クロマトグラフィー等で単離精製し
た後、例えばエドマン分解法、日本生化学会編、生化学
実験講座Ｉ、蛋白質の化学ＩＩ、一次構造決定法、東京
化学同人 １９７６年、等により、アミノ酸配列を決定
することができる。また、精製チトクロムＣ−５５３
（ＣＯ）のＮ末端アミノ酸配列やＣ末端アミノ酸配列を
利用してもよい。
【００１２】本発明においてＩＦＯ番号の付された微生
物は、財団法人発酵研究所発行のリスト・オブ・カルチ
ャーズ１９８８年第８版（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ
Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ Ｏｓａｋａ Ｌｉｓｔ
ｏｆ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ １９８８ ｅｉｇｈｔｈ ｅ
ｄｉｔｉｏｎ）に収載されており、該発酵研究所から入
手することができる。
物は、財団法人発酵研究所発行のリスト・オブ・カルチ
ャーズ１９８８年第８版（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ
Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ Ｏｓａｋａ Ｌｉｓｔ
ｏｆ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ １９８８ ｅｉｇｈｔｈ ｅ
ｄｉｔｉｏｎ）に収載されており、該発酵研究所から入
手することができる。
【００１３】ジーンバンクの作製には、全ＤＮＡを適当
な制限酵素で切断したものと、切断したＤＮＡ断片と連
結可能な制限酵素切断末端を生じる制限酵素で切断した
ベクターとをＴ４ＤＮＡリガーゼにより連結し、その連
結物により大腸菌宿主を形質転換する。このベクターと
しては、例えばｐＵＣ１８，ｐＣＵ１９，Ｍ１３ｍｐ１
８ＲＦ，Ｍ１３ｍｐ１９ＲＦ等の大腸菌のベクターを用
いることができる。大腸菌の形質転換法は、常法に従え
ばよいが、なるべく遺伝子導入効率の高い形質転換法、
例えば、Ｈａｎａｈａｎ，Ｄ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．
１６６，５５７−５８０（１９８３）に準じて行うこと
が好ましい。得られた形質転換株の中から目的とする遺
伝子を保有する株を検出するためには、放射性又は蛍光
性の標識をもったプローブを用いて、例えばコロニーハ
イブリダイゼイション又はプラークハイブリダイゼイシ
ョン等の手法｛Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ ｅｔ ａｌ．，
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｇ Ａ Ｌａｂｏｒａ
ｔｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａ
ｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｒｙ（１９８２）｝により、
目的とするＤＮＡ断片を保有する菌株を得ることができ
る。単離したＤＮＡ断片に一部の遺伝子しか含まれてい
ない場合には、既に得られている遺伝子をプローブとし
て前記と同様なハイブリダイゼイションの手法により、
目的のＤＮＡ断片を単離することによって、目的遺伝子
全体を得ることができる。
な制限酵素で切断したものと、切断したＤＮＡ断片と連
結可能な制限酵素切断末端を生じる制限酵素で切断した
ベクターとをＴ４ＤＮＡリガーゼにより連結し、その連
結物により大腸菌宿主を形質転換する。このベクターと
しては、例えばｐＵＣ１８，ｐＣＵ１９，Ｍ１３ｍｐ１
８ＲＦ，Ｍ１３ｍｐ１９ＲＦ等の大腸菌のベクターを用
いることができる。大腸菌の形質転換法は、常法に従え
ばよいが、なるべく遺伝子導入効率の高い形質転換法、
例えば、Ｈａｎａｈａｎ，Ｄ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．
１６６，５５７−５８０（１９８３）に準じて行うこと
が好ましい。得られた形質転換株の中から目的とする遺
伝子を保有する株を検出するためには、放射性又は蛍光
性の標識をもったプローブを用いて、例えばコロニーハ
イブリダイゼイション又はプラークハイブリダイゼイシ
ョン等の手法｛Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ ｅｔ ａｌ．，
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｇ Ａ Ｌａｂｏｒａ
ｔｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａ
ｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｒｙ（１９８２）｝により、
目的とするＤＮＡ断片を保有する菌株を得ることができ
る。単離したＤＮＡ断片に一部の遺伝子しか含まれてい
ない場合には、既に得られている遺伝子をプローブとし
て前記と同様なハイブリダイゼイションの手法により、
目的のＤＮＡ断片を単離することによって、目的遺伝子
全体を得ることができる。
【００１４】このようにして単離したチトクロムＣ−５
５３（ＣＯ）の構造遺伝子を含むＤＮＡ断片を用いて、
同構造遺伝子産物を生成させるためには、同構造遺伝子
を含むＤＮＡ断片を宿主内でプロモーター活性を有する
遺伝子とを発現可能な状態で連結する必要がある。グル
コノバクター属やアセトバクター属の微生物内で、この
新たに移入した構造遺伝子を発現させるために用いるプ
ロモーターとしては、チトクロムＣ−５５３（ＣＯ）遺
伝子本来のプロモーターも使用できるが、酢酸菌由来の
他のプロモーター活性を有する遺伝子や同宿主内で発現
可能な他の微生物由来のプロモーター活性を有する遺伝
子も使用できる。他の微生物由来のプロモーターとして
は、例えば、大腸菌プラスミドｐＢＲ３２２のアンピシ
リン耐性遺伝子やｐＡＣＹＣ１７７のカナマイシン耐性
遺伝子のプロモーター等が挙げられる。過剰に、同構造
遺伝子産物が生成されて宿主の生育等に影響を及ぼす場
合には、遺伝子の発現を制御するために、適当なプロモ
ーターを選択する必要がある。遺伝子発現の結果、分子
量の異なる蛋白質が生成される可能性もあるが、チトク
ロムＣ−５５３（ＣＯ）本来の機能を有していれば、同
蛋白質を利用することは可能である。
５３（ＣＯ）の構造遺伝子を含むＤＮＡ断片を用いて、
同構造遺伝子産物を生成させるためには、同構造遺伝子
を含むＤＮＡ断片を宿主内でプロモーター活性を有する
遺伝子とを発現可能な状態で連結する必要がある。グル
コノバクター属やアセトバクター属の微生物内で、この
新たに移入した構造遺伝子を発現させるために用いるプ
ロモーターとしては、チトクロムＣ−５５３（ＣＯ）遺
伝子本来のプロモーターも使用できるが、酢酸菌由来の
他のプロモーター活性を有する遺伝子や同宿主内で発現
可能な他の微生物由来のプロモーター活性を有する遺伝
子も使用できる。他の微生物由来のプロモーターとして
は、例えば、大腸菌プラスミドｐＢＲ３２２のアンピシ
リン耐性遺伝子やｐＡＣＹＣ１７７のカナマイシン耐性
遺伝子のプロモーター等が挙げられる。過剰に、同構造
遺伝子産物が生成されて宿主の生育等に影響を及ぼす場
合には、遺伝子の発現を制御するために、適当なプロモ
ーターを選択する必要がある。遺伝子発現の結果、分子
量の異なる蛋白質が生成される可能性もあるが、チトク
ロムＣ−５５３（ＣＯ）本来の機能を有していれば、同
蛋白質を利用することは可能である。
【００１５】チトクロムＣ−５５３（ＣＯ）遺伝子を発
現させる宿主として、酢酸菌、大腸菌、枯草菌など遺伝
子操作が可能なものであれば、それぞれの宿主内でプロ
モーター活性を有する遺伝子と発現可能な状態で連結し
て使用することができる。この場合使用するベクターと
しては、例えば、酢酸菌ではｐＭＧ１０１、大腸菌では
ｐＢＲ３２５、枯草菌ではｐＵＢ１１０等が挙げられ
る。また、酢酸菌、大腸菌等複数の宿主で使用可能なシ
ャトルベクターを用いることもできる。
現させる宿主として、酢酸菌、大腸菌、枯草菌など遺伝
子操作が可能なものであれば、それぞれの宿主内でプロ
モーター活性を有する遺伝子と発現可能な状態で連結し
て使用することができる。この場合使用するベクターと
しては、例えば、酢酸菌ではｐＭＧ１０１、大腸菌では
ｐＢＲ３２５、枯草菌ではｐＵＢ１１０等が挙げられ
る。また、酢酸菌、大腸菌等複数の宿主で使用可能なシ
ャトルベクターを用いることもできる。
【００１６】遺伝子において、突然変異や遺伝子操作等
によって変化が生じても、その遺伝子産物が生成され存
在することによって酸化発酵の生産性を向上させる機能
を有していれば、変化したＣ型チトクロム遺伝子を用い
ても、本発明のプラスミド及び該プラスミドを保有した
細胞及び該細胞を用いた酸化発酵法に含まれる。
によって変化が生じても、その遺伝子産物が生成され存
在することによって酸化発酵の生産性を向上させる機能
を有していれば、変化したＣ型チトクロム遺伝子を用い
ても、本発明のプラスミド及び該プラスミドを保有した
細胞及び該細胞を用いた酸化発酵法に含まれる。
【００１７】酸化発酵とは、微生物により空気中の酸素
を消費しながら基質の不完全酸化で中間代謝産物を大量
に蓄積することで、化合物の微生物変換の一つである。
例えば、エタノールから酢酸が生成される酢酸発酵、グ
ルコースからグルコン酸が生成されるグルコン酸発酵、
ソルビトールからソルボースが生成されるソルボース発
酵、グリセリンからジヒドロキシアセトンが生成される
ジヒドロキシアセトン発酵、グルコースから２−ケトグ
ルコン酸、５−ケトグルコン酸、２，５−ジケトグルコ
ン酸及び種々の有機酸が生成される発酵が知られてい
る。また、多段階の反応を経て構造の著しく異なる物質
を生成する場合であっても、本発明に示しした方法によ
り発酵微生物を改良して発酵生成物の生産性を改善した
場合は、本発明の酸化発酵に含まれる。
を消費しながら基質の不完全酸化で中間代謝産物を大量
に蓄積することで、化合物の微生物変換の一つである。
例えば、エタノールから酢酸が生成される酢酸発酵、グ
ルコースからグルコン酸が生成されるグルコン酸発酵、
ソルビトールからソルボースが生成されるソルボース発
酵、グリセリンからジヒドロキシアセトンが生成される
ジヒドロキシアセトン発酵、グルコースから２−ケトグ
ルコン酸、５−ケトグルコン酸、２，５−ジケトグルコ
ン酸及び種々の有機酸が生成される発酵が知られてい
る。また、多段階の反応を経て構造の著しく異なる物質
を生成する場合であっても、本発明に示しした方法によ
り発酵微生物を改良して発酵生成物の生産性を改善した
場合は、本発明の酸化発酵に含まれる。
【００１８】
【実施例】以下、実施例により本発明を詳述するが、本
発明は、本実施例によって限定されるものではない。本
実施例において、遺伝子操作に関する一般的な技法は、
Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌ
ａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａ
ｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌ
ａｂｏｒａｔｏｒｙ １９８２に準じた。
発明は、本実施例によって限定されるものではない。本
実施例において、遺伝子操作に関する一般的な技法は、
Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌ
ａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａ
ｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌ
ａｂｏｒａｔｏｒｙ １９８２に準じた。
【００１９】工程１ チトクロムＣ−５５３（ＣＯ）精製 （１）グルコノバクター サブオキシダンス ＩＦＯ
１２５２８の培養工程 グルコン酸ナトリウム２％（ｗ／ｖ）、グルコース０．
５％（ｗ／ｖ）、グルセリン０．３％（ｗ／ｖ）、酵母
エキス０．３％（ｗ／ｖ）、ポリペプトン０．２％（ｗ
／ｖ）、ポテトエクストラクト２０％（ｖ／ｖ）の組成
の培地（ｐＨ６．５）１００ｍｌを５００ｍｌの容振盪
フラスコに分注し、常法にしたがって滅菌後、グルコノ
バクター サブオキシダンス ＩＦＯ １２５２８の斜
面培養物からその一白金耳を埴菌し、３０℃で２５時間
振盪培養した。同培養液１．５ｌを３０１の培地（上記
培地よりポテト・エクストラクトを除いた培地）に入れ
た。５０１容ジャーファーメンターで、温度３０℃、通
気１ｖｖｍ、撹拌５００ｒｐｍで、２４時間培養した。
１２５２８の培養工程 グルコン酸ナトリウム２％（ｗ／ｖ）、グルコース０．
５％（ｗ／ｖ）、グルセリン０．３％（ｗ／ｖ）、酵母
エキス０．３％（ｗ／ｖ）、ポリペプトン０．２％（ｗ
／ｖ）、ポテトエクストラクト２０％（ｖ／ｖ）の組成
の培地（ｐＨ６．５）１００ｍｌを５００ｍｌの容振盪
フラスコに分注し、常法にしたがって滅菌後、グルコノ
バクター サブオキシダンス ＩＦＯ １２５２８の斜
面培養物からその一白金耳を埴菌し、３０℃で２５時間
振盪培養した。同培養液１．５ｌを３０１の培地（上記
培地よりポテト・エクストラクトを除いた培地）に入れ
た。５０１容ジャーファーメンターで、温度３０℃、通
気１ｖｖｍ、撹拌５００ｒｐｍで、２４時間培養した。
【００２０】（２）膜画分調製工程 前記工程１−（１）培養工程により得られた培養液（３
０１）から集められた湿菌体（１１０ｇ）を、冷蒸留水
で２回洗浄後、０．０１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）
に懸濁した。同懸濁液フレンチプレス（２００００ｐｓ
ｉ）に供し、菌体を破砕し、５０００ｇ、１０分間の遠
心分離により、無細胞抽出液を得た。この抽出液を、１
３００００ｇ、６０分の超遠心分離を行い、沈殿区分を
膜画分とした。
０１）から集められた湿菌体（１１０ｇ）を、冷蒸留水
で２回洗浄後、０．０１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）
に懸濁した。同懸濁液フレンチプレス（２００００ｐｓ
ｉ）に供し、菌体を破砕し、５０００ｇ、１０分間の遠
心分離により、無細胞抽出液を得た。この抽出液を、１
３００００ｇ、６０分の超遠心分離を行い、沈殿区分を
膜画分とした。
【００２１】（３）可溶化工程 前記工程１−（２）で得られた膜画分を蛋白質濃度１０
ｍｇ／ｍｌとなるように、０．０１Ｍリン酸緩衝液（ｐ
Ｈ６．０）に懸濁ののち、０．２％濃度となるようにト
リトンＸ−１００を添加して、０℃で３０分間撹拌し
た。得られた液を、６８０００ｇ、９０分間の超遠心分
離を行い、上清区分を可溶化画分とした。
ｍｇ／ｍｌとなるように、０．０１Ｍリン酸緩衝液（ｐ
Ｈ６．０）に懸濁ののち、０．２％濃度となるようにト
リトンＸ−１００を添加して、０℃で３０分間撹拌し
た。得られた液を、６８０００ｇ、９０分間の超遠心分
離を行い、上清区分を可溶化画分とした。
【００２２】（４）ＤＥＡＥ−セルロースカラム工程 前記工程１−（３）で得られた可溶化画分（２１０ｍ
ｌ）を、０．１％トリトンＸ−１００を含む０．０１Ｍ
リン酸緩衝液（ｐＨ６．０）で平衡化したＤＥＡＥ−セ
ルロースカラム（２．５×２２ｃｍ）にチャージしたの
ち、同リン酸緩衝液での洗浄後、０．１％トリトンＸ−
１００を含む０．０３Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）で
溶出した。溶出液を１８ｍｌ毎に分画し、得られた分画
について、ＯＤ４２０とアルコールデヒドロゲナーゼ活
性の測定を行った。アルコールデヒドロゲナーゼ活性
は、次のように測定した。先づ０．１ｍｌの１Ｍエタノ
ール水溶液、０．１ｍｌのサンプル及び０．６ｍｌの５
０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）を混合し、２５℃で
５分間置いた後、０．２ｍｌの０．１Ｍフェリシアン化
カリウム水溶液を添加撹拌の後２５℃で反応を行った。
硫酸第二鉄−デュパノール試薬｛Ｆｅ２（ＳＯ４）３・
ｘＨ２Ｏ ５ｇ、ドデシル硫酸ナトリウム３ｇ、８５％
リン酸 ９５ｍｌを蒸留水で溶解して１１とする。｝
を、５分後に０．５ｍｌ添加して反応を停止させた。２
５℃で３０分置いた後、蒸留水３．５ｍｌを添加し、撹
拌の後ＯＤ６６０を測定した。測定の結果、ＯＤ４２０
の値が高く、アルコールデヒドロゲナーゼ活性の低い画
分を、チトクロムＣ−５５３（ＣＯ）とした。次に得ら
れた同画分を、限外濾過膜（ＴＯＹＯ ＵＰ−２０）に
より１０倍濃縮した後、０．０１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ
５．０）に対して一晩透析した。
ｌ）を、０．１％トリトンＸ−１００を含む０．０１Ｍ
リン酸緩衝液（ｐＨ６．０）で平衡化したＤＥＡＥ−セ
ルロースカラム（２．５×２２ｃｍ）にチャージしたの
ち、同リン酸緩衝液での洗浄後、０．１％トリトンＸ−
１００を含む０．０３Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）で
溶出した。溶出液を１８ｍｌ毎に分画し、得られた分画
について、ＯＤ４２０とアルコールデヒドロゲナーゼ活
性の測定を行った。アルコールデヒドロゲナーゼ活性
は、次のように測定した。先づ０．１ｍｌの１Ｍエタノ
ール水溶液、０．１ｍｌのサンプル及び０．６ｍｌの５
０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）を混合し、２５℃で
５分間置いた後、０．２ｍｌの０．１Ｍフェリシアン化
カリウム水溶液を添加撹拌の後２５℃で反応を行った。
硫酸第二鉄−デュパノール試薬｛Ｆｅ２（ＳＯ４）３・
ｘＨ２Ｏ ５ｇ、ドデシル硫酸ナトリウム３ｇ、８５％
リン酸 ９５ｍｌを蒸留水で溶解して１１とする。｝
を、５分後に０．５ｍｌ添加して反応を停止させた。２
５℃で３０分置いた後、蒸留水３．５ｍｌを添加し、撹
拌の後ＯＤ６６０を測定した。測定の結果、ＯＤ４２０
の値が高く、アルコールデヒドロゲナーゼ活性の低い画
分を、チトクロムＣ−５５３（ＣＯ）とした。次に得ら
れた同画分を、限外濾過膜（ＴＯＹＯ ＵＰ−２０）に
より１０倍濃縮した後、０．０１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ
５．０）に対して一晩透析した。
【００２３】（５）ＣＭ−セルロースカラム工程 前記工程１−（４）で得られた透析終了液を、０．１％
トリトンＸ−１００を含む０．０１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ
５．０）で平衡化したＣＭ−セルロースカラム（１．５
×７．５ｃｍ）にチャージしたのち、同酢酸緩衝液（ｐ
Ｈ５．０）での洗浄後、０．１％トリトンＸ−１００を
含む０．０４Ｍ酢酸緩衝液で溶出した。ＯＤ４２０の測
定により、チトクロムＣ−５５３（ＣＯ）画分（蛋白質
量濃度０．４８ｍｇ／ｍｌ、液量１０．５ｍｌ）を得
た。蛋白質の測定には、改良ローリー法｛Ｊ．Ｒ．Ｄｕ
ｌｌｅｙ ａｎｄ Ｐ．Ａ．Ｇｒｉｅｖｅ．Ａｎａｌ．
Ｂｉｏｃｈｅｍ．，６４，１３６−１４１（１９７
５）｝を用いた。なお、同測定の標準物質は牛血清アル
ブミンとした。
トリトンＸ−１００を含む０．０１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ
５．０）で平衡化したＣＭ−セルロースカラム（１．５
×７．５ｃｍ）にチャージしたのち、同酢酸緩衝液（ｐ
Ｈ５．０）での洗浄後、０．１％トリトンＸ−１００を
含む０．０４Ｍ酢酸緩衝液で溶出した。ＯＤ４２０の測
定により、チトクロムＣ−５５３（ＣＯ）画分（蛋白質
量濃度０．４８ｍｇ／ｍｌ、液量１０．５ｍｌ）を得
た。蛋白質の測定には、改良ローリー法｛Ｊ．Ｒ．Ｄｕ
ｌｌｅｙ ａｎｄ Ｐ．Ａ．Ｇｒｉｅｖｅ．Ａｎａｌ．
Ｂｉｏｃｈｅｍ．，６４，１３６−１４１（１９７
５）｝を用いた。なお、同測定の標準物質は牛血清アル
ブミンとした。
【００２４】工程２ チトクロムＣ−５５３（ＣＯ）の部分アミノ酸配列の決
定 （１）アルギニルエンドペプチターゼによる限定加水分
解 前記工程１−（５）より得たチトクロムＣ−５５３（Ｃ
Ｏ）画分７００μｌの緩衝液置換を、セントリコン１０
（アミコン社製）により行った後、アルギニルエンドペ
プチターゼ（宝酒造株式会社製）処理を、反応液２２０
μｌ｛５０ｍＭＴｒｉｓ・ＨＣｌ（ｐＨ８．０），２μ
ｇアルギニルエンドペプチターゼ｝中で、３７℃にて１
８時間行った。
定 （１）アルギニルエンドペプチターゼによる限定加水分
解 前記工程１−（５）より得たチトクロムＣ−５５３（Ｃ
Ｏ）画分７００μｌの緩衝液置換を、セントリコン１０
（アミコン社製）により行った後、アルギニルエンドペ
プチターゼ（宝酒造株式会社製）処理を、反応液２２０
μｌ｛５０ｍＭＴｒｉｓ・ＨＣｌ（ｐＨ８．０），２μ
ｇアルギニルエンドペプチターゼ｝中で、３７℃にて１
８時間行った。
【００２５】（２）限定加水分解ペプチドの単離 前記工程２−（１）で得られたアルギニルエンドペプチ
ターゼ反応液２００μｌについて、下記液体クロマトグ
ラフィー条件により、アルギニルエンドペプチターゼ限
定加水分解ペプチドを、２種類（ペプチド分画Ｉ、ペプ
チド分画ＩＩ）分画した。 （液体クロマトグラフィー条件） カラム：半井化学コスモシール ５Ｃ４−３００パック
ドカラム 溶媒：０．１％トリフルオロ酢酸を含有したアセトニト
リル−水混合溶媒。同混合溶媒において、アセトニトリ
ル濃度を、１０％から７４％まで変化させた。 溶媒流速：０．８ｍｌ／分 検出：ＵＶ２８０ｎｍ
ターゼ反応液２００μｌについて、下記液体クロマトグ
ラフィー条件により、アルギニルエンドペプチターゼ限
定加水分解ペプチドを、２種類（ペプチド分画Ｉ、ペプ
チド分画ＩＩ）分画した。 （液体クロマトグラフィー条件） カラム：半井化学コスモシール ５Ｃ４−３００パック
ドカラム 溶媒：０．１％トリフルオロ酢酸を含有したアセトニト
リル−水混合溶媒。同混合溶媒において、アセトニトリ
ル濃度を、１０％から７４％まで変化させた。 溶媒流速：０．８ｍｌ／分 検出：ＵＶ２８０ｎｍ
【００２６】（３）限定加水分解ペプチドのアミノ酸配
列の決定 前記工程２−（２）で得られたペプチド分画Ｉ、ペプチ
ド分画ＩＩにそれぞれ含まれているペプチドのアミノ酸
配列は、アプライドバイオシステム社の気相プロテイン
シーケンサー モデル４７０Ａにより、分析した。その
結果、ペプチド分画Ｉ、ペプチド分画ＩＩにそれぞれ含
まれていた限定加水分解ペプチドＩ及び限定加水分解ペ
プチドＩＩのそれぞれのＮ末端アミノ酸配列が、配列番
号２，３のアミノ酸配列であることが明らかとなった。
列の決定 前記工程２−（２）で得られたペプチド分画Ｉ、ペプチ
ド分画ＩＩにそれぞれ含まれているペプチドのアミノ酸
配列は、アプライドバイオシステム社の気相プロテイン
シーケンサー モデル４７０Ａにより、分析した。その
結果、ペプチド分画Ｉ、ペプチド分画ＩＩにそれぞれ含
まれていた限定加水分解ペプチドＩ及び限定加水分解ペ
プチドＩＩのそれぞれのＮ末端アミノ酸配列が、配列番
号２，３のアミノ酸配列であることが明らかとなった。
【００２７】工程３ オリゴデオキシヌクレオチドプローブの合成 前記工程２−（３）でＮ末端アミノ酸配列が明らかとな
った限定加水分解ペプチドＩの部分アミノ酸配列（Ｌｙ
ｓ−Ｇｌｙ−Ｔｒｐ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ａｓｎ−Ａｌ
ａ）をもとにした下記に示したオリゴデオキシヌクレオ
チドを、チトクロムＣ−５５３（ＣＯ）遺伝子のクロー
ニングのためのプローブとした。下記に示した塩基配列
を有する８種類のオリゴデオキシヌクレオチド（配列番
号４から配列番号１１）の混合物を、アプライドバイオ
システム社のＤＮＡ合成機モデル３８０Ａを用いて合成
した。アプライドバイオシステム社のプロトコールに従
い、高速液体クロマトグラフィーで２回の精製を行い、
約１００μｇを回収した。
った限定加水分解ペプチドＩの部分アミノ酸配列（Ｌｙ
ｓ−Ｇｌｙ−Ｔｒｐ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ａｓｎ−Ａｌ
ａ）をもとにした下記に示したオリゴデオキシヌクレオ
チドを、チトクロムＣ−５５３（ＣＯ）遺伝子のクロー
ニングのためのプローブとした。下記に示した塩基配列
を有する８種類のオリゴデオキシヌクレオチド（配列番
号４から配列番号１１）の混合物を、アプライドバイオ
システム社のＤＮＡ合成機モデル３８０Ａを用いて合成
した。アプライドバイオシステム社のプロトコールに従
い、高速液体クロマトグラフィーで２回の精製を行い、
約１００μｇを回収した。
【００２８】（オリゴデオキシヌクレオチドの塩基配
列） ａ．５’−ＧＣＡＴＴＡＴＴＩＣＣＣＣＡＩＣＣＴＴＴ
−３’、 ｂ．５’−ＧＣＡＴＴＡＴＴＩＣＣＣＣＡＩＣＣＣＴＴ
−３’、 ｃ．５’−ＧＣＡＴＴＧＴＴＩＣＣＣＣＡＩＣＣＴＴＴ
−３’、 ｄ．５’−ＧＣＡＴＴＧＴＴＩＣＣＣＣＡＩＣＣＣＴＴ
−３’、 ｅ．５’−ＧＣＧＴＴＡＴＴＩＣＣＣＣＡＩＣＣＴＴＴ
−３’、 ｆ．５’−ＧＣＧＴＴＡＴＴＩＣＣＣＣＡＩＣＣＣＴＴ
−３’、 ｇ．５’−ＧＣＧＴＴＧＴＴＩＣＣＣＣＡＩＣＣＴＴＴ
−３’及び ｈ．５’−ＧＣＧＴＴＧＴＴＩＣＣＣＣＡＩＣＣＣＴＴ
−３’。 （上記オリゴタクレオチドの塩基配列において、 Ａ：デオキシアデニル酸、 Ｃ：デオキシシチジル酸、 Ｇ：デオキシグアニル酸、 Ｔ：チミジル酸、 Ｉ：デオキシイノシン酸 残基をそれぞれ示している。）
列） ａ．５’−ＧＣＡＴＴＡＴＴＩＣＣＣＣＡＩＣＣＴＴＴ
−３’、 ｂ．５’−ＧＣＡＴＴＡＴＴＩＣＣＣＣＡＩＣＣＣＴＴ
−３’、 ｃ．５’−ＧＣＡＴＴＧＴＴＩＣＣＣＣＡＩＣＣＴＴＴ
−３’、 ｄ．５’−ＧＣＡＴＴＧＴＴＩＣＣＣＣＡＩＣＣＣＴＴ
−３’、 ｅ．５’−ＧＣＧＴＴＡＴＴＩＣＣＣＣＡＩＣＣＴＴＴ
−３’、 ｆ．５’−ＧＣＧＴＴＡＴＴＩＣＣＣＣＡＩＣＣＣＴＴ
−３’、 ｇ．５’−ＧＣＧＴＴＧＴＴＩＣＣＣＣＡＩＣＣＴＴＴ
−３’及び ｈ．５’−ＧＣＧＴＴＧＴＴＩＣＣＣＣＡＩＣＣＣＴＴ
−３’。 （上記オリゴタクレオチドの塩基配列において、 Ａ：デオキシアデニル酸、 Ｃ：デオキシシチジル酸、 Ｇ：デオキシグアニル酸、 Ｔ：チミジル酸、 Ｉ：デオキシイノシン酸 残基をそれぞれ示している。）
【００２９】工程４ チトクロムＣ−５５３（ＣＯ）遺伝子を含むＤＮＡ断片
の単離 ソルトビール５０ｇ／ｌ、酵母エキス１０ｇ／ｌ、ペプ
トン５ｇ／ｌ、炭酸カルシウム３ｇ／ｌの組成の培地１
００ｍｌを５００ｍｌ容振盪フラスコに分注し、常法に
したがって滅菌後、グルコノバクター サブオキシダン
ス ＩＦＯ １２５２８の斜面培養物からその一白金耳
を植菌し、３０℃で２日間培養した。同培養液１．５ｌ
より湿菌体２．７ｇを集菌し、無菌水で清浄後、２５ｍ
ＭＴｒｉｓ・ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、５０ｍＭ ＥＤＴ
Ａの緩衝液３２ｍｌに懸濁した。同懸濁液に、リゾチウ
ム液（４０ｍｇ／ｍｌ）を０．８ｍｌ添加撹拌し、３７
℃で１時間の後、プロナーゼ液（２ｍｇ／ｍｌ）を４ｍ
ｌ添加撹拌した。室温で１５分間置いた後、１０％のド
デシル硫酸ナトリウム液４ｍｌ添加撹拌後、３７℃で１
時間反応させた。更に５５℃で１０分間加熱した後同反
応液に、５０ｍＭＴｒｉｓ．ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、５
ｍＭ ＥＤＴＡ、１００ｍＭ塩化ナトリウム緩衝液で飽
和させたフェノール４０ｍｌを添加し、１０分間抽出し
た後、遠心分離により上層液を分離した。上記の緩衝液
飽和フェノール・クロロホルム（１：１）４０ｍｌで５
分間抽出した後、遠心分離により上層液を分離した。同
操作を更にもう一度実施しした後、得られた上層液に、
最終濃度４０μｇ／ｍｌになるようにＲＮａｓｅを添加
し、撹拌の後３７℃で一時間反応させた。同反応液３５
ｍｌに７ｍｌの５Ｍ塩化ナトリウム水溶液と８．７５ｍ
ｌの５０％（ｗ／ｖ）ポリエチレングリコール６０００
水溶液とを添加し、撹拌の後、ＤＮＡ沈澱をガラス棒で
まき取った。得られたＤＮＡ沈澱を、７０％エタノール
で洗浄の後、１ｍＭ Ｔｒｉｓ．ＨＣｌ（ｐＨ８．
０）、０．１ｍＭ ＥＤＴＡの緩衝液１０ｍｌに溶解し
た。同ＤＮＡ液に、１ｍｌの３Ｍ酢酸ナトリウム水溶液
と２４ｍｌの冷エタノールとを添加してＤＮＡを沈澱さ
せた。このＤＮＡ沈澱をガラス棒でまきとり７０％エタ
ノールで洗浄した後、１ｍＭ Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ（ｐＨ
８．０）、０．１ｍＭ ＥＤＴＡの緩衝液５ｍｌに溶解
した。ＯＤ２６０の測定により、同液のＤＮＡ濃度は、
０．６ｍｇ／ｍｌであった。
の単離 ソルトビール５０ｇ／ｌ、酵母エキス１０ｇ／ｌ、ペプ
トン５ｇ／ｌ、炭酸カルシウム３ｇ／ｌの組成の培地１
００ｍｌを５００ｍｌ容振盪フラスコに分注し、常法に
したがって滅菌後、グルコノバクター サブオキシダン
ス ＩＦＯ １２５２８の斜面培養物からその一白金耳
を植菌し、３０℃で２日間培養した。同培養液１．５ｌ
より湿菌体２．７ｇを集菌し、無菌水で清浄後、２５ｍ
ＭＴｒｉｓ・ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、５０ｍＭ ＥＤＴ
Ａの緩衝液３２ｍｌに懸濁した。同懸濁液に、リゾチウ
ム液（４０ｍｇ／ｍｌ）を０．８ｍｌ添加撹拌し、３７
℃で１時間の後、プロナーゼ液（２ｍｇ／ｍｌ）を４ｍ
ｌ添加撹拌した。室温で１５分間置いた後、１０％のド
デシル硫酸ナトリウム液４ｍｌ添加撹拌後、３７℃で１
時間反応させた。更に５５℃で１０分間加熱した後同反
応液に、５０ｍＭＴｒｉｓ．ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、５
ｍＭ ＥＤＴＡ、１００ｍＭ塩化ナトリウム緩衝液で飽
和させたフェノール４０ｍｌを添加し、１０分間抽出し
た後、遠心分離により上層液を分離した。上記の緩衝液
飽和フェノール・クロロホルム（１：１）４０ｍｌで５
分間抽出した後、遠心分離により上層液を分離した。同
操作を更にもう一度実施しした後、得られた上層液に、
最終濃度４０μｇ／ｍｌになるようにＲＮａｓｅを添加
し、撹拌の後３７℃で一時間反応させた。同反応液３５
ｍｌに７ｍｌの５Ｍ塩化ナトリウム水溶液と８．７５ｍ
ｌの５０％（ｗ／ｖ）ポリエチレングリコール６０００
水溶液とを添加し、撹拌の後、ＤＮＡ沈澱をガラス棒で
まき取った。得られたＤＮＡ沈澱を、７０％エタノール
で洗浄の後、１ｍＭ Ｔｒｉｓ．ＨＣｌ（ｐＨ８．
０）、０．１ｍＭ ＥＤＴＡの緩衝液１０ｍｌに溶解し
た。同ＤＮＡ液に、１ｍｌの３Ｍ酢酸ナトリウム水溶液
と２４ｍｌの冷エタノールとを添加してＤＮＡを沈澱さ
せた。このＤＮＡ沈澱をガラス棒でまきとり７０％エタ
ノールで洗浄した後、１ｍＭ Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ（ｐＨ
８．０）、０．１ｍＭ ＥＤＴＡの緩衝液５ｍｌに溶解
した。ＯＤ２６０の測定により、同液のＤＮＡ濃度は、
０．６ｍｇ／ｍｌであった。
【００３０】この調製した全ＤＮＡを制限酵素ＥｃｏＲ
Ｉ（宝酒造株式会社製）で切断後、１％アガロースゲル
電気泳動を行い、約１ｋｂから約２ｋｂのＤＮＡ断片を
含むアガロースゲルを切り出した。これをフナコシ社よ
り購入したジーンクリーン（ＧＥＮＥＣＬＥＡＮＴＭ）
を用いて、同社のプロトコールに従い、約１ｋｂから約
２ｋｂのＤＮＡ断片を分取した。尚、同プロトコールと
同様な方法は、Ｓｔｒｕｈｌ，Ｋ．，ＢｉｏＴｅｃｈｎ
ｉｑｕｅｓ．３，４５２（１９８５）にも記載されてい
る。取得したこの約１ｋｂから約２ｋｂのＤＮＡ断片と
制限酵素ＥｃｏＲＩで切断した後、細菌性アルカリホス
ファターゼ（宝酒造株式会社製）で脱リン酸化した大腸
菌ベクターＭ１３ｍｐ１９ＲＦ（宝酒造株式会社製）と
を、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（宝酒造株式会社製）を用いて
連結した。このリガーゼ反応液を用いて、大腸菌ＤＨ５
αのコンピタントセル（ＢＲＬ社製）を、ＢＲＬ社のプ
ロトコールに従い形質転換し、大腸菌ＤＨ５αＦ’（Ｂ
ＲＬ社製）を指示菌として約２０００個の形質転換株を
得た。
Ｉ（宝酒造株式会社製）で切断後、１％アガロースゲル
電気泳動を行い、約１ｋｂから約２ｋｂのＤＮＡ断片を
含むアガロースゲルを切り出した。これをフナコシ社よ
り購入したジーンクリーン（ＧＥＮＥＣＬＥＡＮＴＭ）
を用いて、同社のプロトコールに従い、約１ｋｂから約
２ｋｂのＤＮＡ断片を分取した。尚、同プロトコールと
同様な方法は、Ｓｔｒｕｈｌ，Ｋ．，ＢｉｏＴｅｃｈｎ
ｉｑｕｅｓ．３，４５２（１９８５）にも記載されてい
る。取得したこの約１ｋｂから約２ｋｂのＤＮＡ断片と
制限酵素ＥｃｏＲＩで切断した後、細菌性アルカリホス
ファターゼ（宝酒造株式会社製）で脱リン酸化した大腸
菌ベクターＭ１３ｍｐ１９ＲＦ（宝酒造株式会社製）と
を、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（宝酒造株式会社製）を用いて
連結した。このリガーゼ反応液を用いて、大腸菌ＤＨ５
αのコンピタントセル（ＢＲＬ社製）を、ＢＲＬ社のプ
ロトコールに従い形質転換し、大腸菌ＤＨ５αＦ’（Ｂ
ＲＬ社製）を指示菌として約２０００個の形質転換株を
得た。
【００３１】得られたこれらのプラークを、ニトロセル
ロースフィルターに転写し、プローブとして５’末端を
放射性３２Ｐで標識した合成オリゴデオキシヌクレオチ
ド（前記工程３にて合成した）を用いて、５０℃で９０
分間のハイブリダイゼイションを行った。次に同ニトロ
セルロースフィルターを、６ＸＳＳＣ液（０．９Ｍ塩化
ナトリウム、９０ｍＭクエン酸ナトリウム、０．６％ド
デシル硫酸ナトリウム）中、室温下１０分間洗浄し、更
に同液にて４０℃、５分間の洗浄の後、オートラジオグ
ラフィーを行った。その結果、プローブと強くハイブリ
ダイズするＤＮＡを保有する菌株を１株取得した。次に
同菌株の保有するプラスミドＤＮＡをアルカリ溶菌法に
より１００μｇ抽出し、その一部を用いて制限酵素地図
を作成した。その結果、得られたプラスミドは、前記工
程３のプローブとハイブリダイズする約１．５ｋｂのＥ
ｃｏＲＩ断片がＭ１３ｍｐ１９ＲＦのマルチプルクロー
ニングサイトのＥｃｏＲＩサイトに組み込まれたもので
あった。
ロースフィルターに転写し、プローブとして５’末端を
放射性３２Ｐで標識した合成オリゴデオキシヌクレオチ
ド（前記工程３にて合成した）を用いて、５０℃で９０
分間のハイブリダイゼイションを行った。次に同ニトロ
セルロースフィルターを、６ＸＳＳＣ液（０．９Ｍ塩化
ナトリウム、９０ｍＭクエン酸ナトリウム、０．６％ド
デシル硫酸ナトリウム）中、室温下１０分間洗浄し、更
に同液にて４０℃、５分間の洗浄の後、オートラジオグ
ラフィーを行った。その結果、プローブと強くハイブリ
ダイズするＤＮＡを保有する菌株を１株取得した。次に
同菌株の保有するプラスミドＤＮＡをアルカリ溶菌法に
より１００μｇ抽出し、その一部を用いて制限酵素地図
を作成した。その結果、得られたプラスミドは、前記工
程３のプローブとハイブリダイズする約１．５ｋｂのＥ
ｃｏＲＩ断片がＭ１３ｍｐ１９ＲＦのマルチプルクロー
ニングサイトのＥｃｏＲＩサイトに組み込まれたもので
あった。
【００３２】工程５ 塩基配列の決定 前記工程４で分離した約１．５ｋｂのＥｃｏＲＩ断片の
塩基配列は、同ＤＮＡ断片を、適当な長さに切出し、種
々の断片をＭ１３ベクターにサブクローニングしたの
ち、サンガーらの方法（Ｓａｎｇｅｒ，Ｆ，Ｓｃｉｅｎ
ｃｅ 第２１４巻、１２０５−１２１０（１９８１）な
ど）に基づき、挿入部分の塩基配列を決定した。具体的
な実験操作は、７−ＤＥＡＺＡシーケンスキット（宝酒
造株式会社製）を用いて、同キットのプロトコールに準
じた。尚、プロトコールと同様な方法は、Ｍｉｚｕｓａ
ｗａ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ
Ｒｅｓ．，１４，１３１９−１３２４（１９８６）にも
記載されている。Ｍ１３ベクターへのサブクローニング
操作においては、約１．５ｋｂのＥｃｏＲＩ断片中に存
在する制限酵素切断部位を利用した。
塩基配列は、同ＤＮＡ断片を、適当な長さに切出し、種
々の断片をＭ１３ベクターにサブクローニングしたの
ち、サンガーらの方法（Ｓａｎｇｅｒ，Ｆ，Ｓｃｉｅｎ
ｃｅ 第２１４巻、１２０５−１２１０（１９８１）な
ど）に基づき、挿入部分の塩基配列を決定した。具体的
な実験操作は、７−ＤＥＡＺＡシーケンスキット（宝酒
造株式会社製）を用いて、同キットのプロトコールに準
じた。尚、プロトコールと同様な方法は、Ｍｉｚｕｓａ
ｗａ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ
Ｒｅｓ．，１４，１３１９−１３２４（１９８６）にも
記載されている。Ｍ１３ベクターへのサブクローニング
操作においては、約１．５ｋｂのＥｃｏＲＩ断片中に存
在する制限酵素切断部位を利用した。
【００３３】決定した塩基配列について、翻訳可能領域
を調べたところ、１０６２塩基からなるアミノ酸３５４
残基（分子量３７８４０）をコードする翻訳可能領域の
Ｃ末端側｛配列番号１の第３７３番目の塩基（Ｇ）から
第１４３４番目の塩基（Ａ）｝の遺伝子が存在している
ことが明らかとなった。しかしながら細胞膜より単離さ
れたチトクロムＣ−５５３（ＣＯ）の分子量が、４８０
００であることより、前記工程４で分離した約１．５ｋ
ｂのＥｃｏＲＩ断片には、チトクロムＣ−５５３（Ｃ
Ｏ）のＮ末端側をコードする遺伝子は含まれていないこ
とがわかった。
を調べたところ、１０６２塩基からなるアミノ酸３５４
残基（分子量３７８４０）をコードする翻訳可能領域の
Ｃ末端側｛配列番号１の第３７３番目の塩基（Ｇ）から
第１４３４番目の塩基（Ａ）｝の遺伝子が存在している
ことが明らかとなった。しかしながら細胞膜より単離さ
れたチトクロムＣ−５５３（ＣＯ）の分子量が、４８０
００であることより、前記工程４で分離した約１．５ｋ
ｂのＥｃｏＲＩ断片には、チトクロムＣ−５５３（Ｃ
Ｏ）のＮ末端側をコードする遺伝子は含まれていないこ
とがわかった。
【００３４】工程６ チトクロムＣ−５５３（ＣＯ）遺伝子のＮ末端側の遺伝
子を含むＤＮＡ断片の単離 前記工程４で取得したグルコノバクター サブオキシダ
ンス ＩＦＯ １２５２８の全ＤＮＡを、制限酵素Ｓｐ
ｈＩ（宝酒造株式会社製）で切断後、１％アガロースゲ
ル電気泳動を行い、約１ｋｂから約３ｋｂのＤＮＡ断片
を含むアガロースゲルを切り出した。これをフナコシ社
より購入したジーンクリーン（ＧＥＮＥＣＬＥＡ
ＮＴＭ）を用いて、同社のプロトコールに従い、約１ｋ
ｂから約３ｋｂのＤＮＡ断片を分取した。この断片と、
制限酵素ＳｐｈＩで切断した後、細菌性アルカリホスフ
ァターゼ（宝酒造株式会社製）で脱リン酸化した大腸菌
ベクターＭ１３ｍｐ１９ＲＦ（宝酒造株式会社製）と
を、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（宝酒造株式会社製）を用いて
連結した。このリガーゼ反応液を用いて、大腸菌ＤＨ５
αのコンピタントセル（ＢＲＬ社製）を、ＢＲＬ社製の
プロトコールに従い形質転換し、大腸菌ＤＨ５αＦ’
（ＢＲＬ社製）を指示菌として約１５００個の形質転換
株を得た。得られたこれらのプラークを、ニトロセルロ
ースフィルターに転写した。
子を含むＤＮＡ断片の単離 前記工程４で取得したグルコノバクター サブオキシダ
ンス ＩＦＯ １２５２８の全ＤＮＡを、制限酵素Ｓｐ
ｈＩ（宝酒造株式会社製）で切断後、１％アガロースゲ
ル電気泳動を行い、約１ｋｂから約３ｋｂのＤＮＡ断片
を含むアガロースゲルを切り出した。これをフナコシ社
より購入したジーンクリーン（ＧＥＮＥＣＬＥＡ
ＮＴＭ）を用いて、同社のプロトコールに従い、約１ｋ
ｂから約３ｋｂのＤＮＡ断片を分取した。この断片と、
制限酵素ＳｐｈＩで切断した後、細菌性アルカリホスフ
ァターゼ（宝酒造株式会社製）で脱リン酸化した大腸菌
ベクターＭ１３ｍｐ１９ＲＦ（宝酒造株式会社製）と
を、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（宝酒造株式会社製）を用いて
連結した。このリガーゼ反応液を用いて、大腸菌ＤＨ５
αのコンピタントセル（ＢＲＬ社製）を、ＢＲＬ社製の
プロトコールに従い形質転換し、大腸菌ＤＨ５αＦ’
（ＢＲＬ社製）を指示菌として約１５００個の形質転換
株を得た。得られたこれらのプラークを、ニトロセルロ
ースフィルターに転写した。
【００３５】本工程で使用したプローブは、次に示す方
法により作製した。前記工程４で取得したプラスミドＤ
ＮＡ２０μｇを制限酵素ＥｃｏＲＩとＳｐｈＩとで消化
したのち、１％アガロースゲル電気泳動を行い、約０．
５ｋｂのＤＮＡ断片を含むアガロースゲルを分画した。
同アガロースゲル分画より、フナコシ社より購入したジ
ーンクリーン（ＧＥＮＥＣＬＥＡＮＴＭ）を用いて、同
社のプロトコールに従い、約０．５ｋｂのＥｃｏＲＩ−
ＳｐｈＩ断片を抽出単離した。このＤＮＡ断片５０ｎｇ
について、アマーシャム社より購入したマルチプライム
ＤＮＡ標識システム（ＭｕｌｔｉｐｒｉｍｅＴＭＤＮＡ
ｌａｂｅｌｌｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍ）を用い、これに
付属するプロトコールに従い、（α−３２Ｐ）デオキシ
シチジル酸３リン酸（ｄＣＴＰ）で標識したプローブを
作製した。尚、同プロトコールと同様な方法は、Ｆｅｉ
ｎｂｅｒｇ，Ａ．Ｐ．ｅｔａｌ．Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ
Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．１３２、６−１３、（１９
８３）に記載されている。こうして得た反応液を、ファ
ルマシア社より購入したニックカラム（ＮｉｃｋＴＭｃ
ｏｌｕｍｎ）を用いた精製に供し、本工程で使用するプ
ローブを得た。
法により作製した。前記工程４で取得したプラスミドＤ
ＮＡ２０μｇを制限酵素ＥｃｏＲＩとＳｐｈＩとで消化
したのち、１％アガロースゲル電気泳動を行い、約０．
５ｋｂのＤＮＡ断片を含むアガロースゲルを分画した。
同アガロースゲル分画より、フナコシ社より購入したジ
ーンクリーン（ＧＥＮＥＣＬＥＡＮＴＭ）を用いて、同
社のプロトコールに従い、約０．５ｋｂのＥｃｏＲＩ−
ＳｐｈＩ断片を抽出単離した。このＤＮＡ断片５０ｎｇ
について、アマーシャム社より購入したマルチプライム
ＤＮＡ標識システム（ＭｕｌｔｉｐｒｉｍｅＴＭＤＮＡ
ｌａｂｅｌｌｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍ）を用い、これに
付属するプロトコールに従い、（α−３２Ｐ）デオキシ
シチジル酸３リン酸（ｄＣＴＰ）で標識したプローブを
作製した。尚、同プロトコールと同様な方法は、Ｆｅｉ
ｎｂｅｒｇ，Ａ．Ｐ．ｅｔａｌ．Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ
Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．１３２、６−１３、（１９
８３）に記載されている。こうして得た反応液を、ファ
ルマシア社より購入したニックカラム（ＮｉｃｋＴＭｃ
ｏｌｕｍｎ）を用いた精製に供し、本工程で使用するプ
ローブを得た。
【００３６】本工程で調製したジーンバンクを転写した
ニトロセルロースフィルターとプローブとを用いて、４
２℃で一晩のハイブリダイゼイションを行った。次に同
ニトロセルロースフィルターを、５ＸＳＳＰＥ液（０．
９Ｍ塩化ナトリウム、０．０５Ｍクエン酸ナトリウムｐ
Ｈ７．７、０．０００５Ｍエチレンジアミン四酢酸二ナ
トリウム）中、室温下３０分間洗浄し、更に０．１％の
ドデシル硫酸ナトリウムを含んだ１ＸＳＳＰＥ液（前記
５ＸＳＳＰＥ液を５倍に希釈した液）にて４２℃、３０
分間の洗浄の後、オートラジオグラフィーを行った。そ
の結果、プローブと強くハイブリダイズするＤＮＡを保
有する菌株を９株取得した。次に同菌株の保有するプラ
スミドＤＮＡを、簡便アルカリ溶菌法により抽出し、そ
れぞれの制限酵素地図を作成した。その結果、得られた
プラスミドには、本工程で作成したプローブとハイブリ
ダイズする約２ｋｂのＳｐｈＩ断片が、Ｍ１３ｍｐ１９
ＲＦのマルチプルクローニングサイトのＳｐｈＩサイト
に正逆２方向にそれぞれ組み込まれた複合プラスミドが
それぞれ存在していた。
ニトロセルロースフィルターとプローブとを用いて、４
２℃で一晩のハイブリダイゼイションを行った。次に同
ニトロセルロースフィルターを、５ＸＳＳＰＥ液（０．
９Ｍ塩化ナトリウム、０．０５Ｍクエン酸ナトリウムｐ
Ｈ７．７、０．０００５Ｍエチレンジアミン四酢酸二ナ
トリウム）中、室温下３０分間洗浄し、更に０．１％の
ドデシル硫酸ナトリウムを含んだ１ＸＳＳＰＥ液（前記
５ＸＳＳＰＥ液を５倍に希釈した液）にて４２℃、３０
分間の洗浄の後、オートラジオグラフィーを行った。そ
の結果、プローブと強くハイブリダイズするＤＮＡを保
有する菌株を９株取得した。次に同菌株の保有するプラ
スミドＤＮＡを、簡便アルカリ溶菌法により抽出し、そ
れぞれの制限酵素地図を作成した。その結果、得られた
プラスミドには、本工程で作成したプローブとハイブリ
ダイズする約２ｋｂのＳｐｈＩ断片が、Ｍ１３ｍｐ１９
ＲＦのマルチプルクローニングサイトのＳｐｈＩサイト
に正逆２方向にそれぞれ組み込まれた複合プラスミドが
それぞれ存在していた。
【００３７】工程７ チトクロムＣ−５５３（ＣＯ）遺伝子のＮ末端側の構造
遺伝子の塩基配列の決定 前記工程６で分離した約２ｋｂのＳｐｈＩ断片の塩基配
列は、ヘニコフらのデリーション方法｛Ｈｅｎｉｋｏｆ
ｆ，Ｓ，Ｇｅｎｅ 第２８巻、３５１−３５９（１９８
４）など｝に基づき、種々の長さの挿入断片を有するＭ
１３サブクローン作製した後、前記５の方法により挿入
部分の塩基配列を決定した。種々の長さの挿入断片を有
するＭ１３のサブクローンを作製の具体的な実験操作
は、キローシーケンス デレーション キット（宝酒造
株式会社製）を用いて、同キットのプロトコールに準じ
た。
遺伝子の塩基配列の決定 前記工程６で分離した約２ｋｂのＳｐｈＩ断片の塩基配
列は、ヘニコフらのデリーション方法｛Ｈｅｎｉｋｏｆ
ｆ，Ｓ，Ｇｅｎｅ 第２８巻、３５１−３５９（１９８
４）など｝に基づき、種々の長さの挿入断片を有するＭ
１３サブクローン作製した後、前記５の方法により挿入
部分の塩基配列を決定した。種々の長さの挿入断片を有
するＭ１３のサブクローンを作製の具体的な実験操作
は、キローシーケンス デレーション キット（宝酒造
株式会社製）を用いて、同キットのプロトコールに準じ
た。
【００３８】決定した塩基配列について、翻訳可能領域
を調べたところ、３７８塩基からなるアミノ酸１２６残
基（分子量１３６５１）をコードする翻訳可能領域のＮ
末端側｛配列番号１の第１番目の塩基（Ａ）から第３７
８番目の塩基（Ｃ）｝の遺伝子が存在していることが明
らかとなった。尚、第３７８番目以降の塩基配列は、前
記工程５で決定した塩基配列と完全に一致していた。
を調べたところ、３７８塩基からなるアミノ酸１２６残
基（分子量１３６５１）をコードする翻訳可能領域のＮ
末端側｛配列番号１の第１番目の塩基（Ａ）から第３７
８番目の塩基（Ｃ）｝の遺伝子が存在していることが明
らかとなった。尚、第３７８番目以降の塩基配列は、前
記工程５で決定した塩基配列と完全に一致していた。
【００３９】工程８ チトクロムＣ−５５３（ＣＯ）の全構造遺伝子を含むＤ
ＮＡ断片の構築 （１）Ｍ１３ｍｐ１８ＲＦのＥｃｏＲＩサイトへの約
１．５ｋｂのＥｃｏＲＩ断片の組み込み 前記工程４で取得したプラスミドＤＮＡ１０μｇを、制
限酵素ＥｃｏＲＩで消化したのち、１％アガロースゲル
電気泳動を行い、約１．５ｋｂのＤＮＡ断片を含むアガ
ロースゲルを分画した。同アガロースゲル分画より、フ
ナコシ社より購入したジーンクリーン（ＧＥＮＥＣＬＥ
ＡＮＴＭ）を用いて、同社のプロトコールに従い、約
１．５ｋｂ ＥｃｏＲＩ断片を抽出単離した。
ＮＡ断片の構築 （１）Ｍ１３ｍｐ１８ＲＦのＥｃｏＲＩサイトへの約
１．５ｋｂのＥｃｏＲＩ断片の組み込み 前記工程４で取得したプラスミドＤＮＡ１０μｇを、制
限酵素ＥｃｏＲＩで消化したのち、１％アガロースゲル
電気泳動を行い、約１．５ｋｂのＤＮＡ断片を含むアガ
ロースゲルを分画した。同アガロースゲル分画より、フ
ナコシ社より購入したジーンクリーン（ＧＥＮＥＣＬＥ
ＡＮＴＭ）を用いて、同社のプロトコールに従い、約
１．５ｋｂ ＥｃｏＲＩ断片を抽出単離した。
【００４０】制限酵素ＥｃｏＲＩ切断した後細菌性アル
カリホスファターゼ（宝酒造株式会社製）で脱リン酸化
した大腸菌ベクターＭ１３ｍｐ１８ＲＦ（宝酒造株式会
社製）とを、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（宝酒造株式会社製）
を用いて連結した。このリガーゼ反応液を用いて、大腸
菌ＤＨ５αのコンピタントセル（ＢＲＬ社製）を、ＢＲ
Ｌ社のプロトコールに従い形質転換した。得られた形質
転換株６株について、同菌株の保有するプラスミドＤＮ
Ａを簡便アルカリ溶菌法により抽出し、それぞれの制限
酵素地図を作成した。その結果、得られたプラスミドに
は、本工程で単離した約１．５ｋｂのＥｃｏＲＩ断片
が、Ｍ１３ｍｐ１８ＲＦのマルチプルクローニングサイ
トのＥｃｏＲＩサイトに正逆２方向にそれぞれ組み込ま
れた複合プラスミドがそれぞれ存在していた。
カリホスファターゼ（宝酒造株式会社製）で脱リン酸化
した大腸菌ベクターＭ１３ｍｐ１８ＲＦ（宝酒造株式会
社製）とを、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（宝酒造株式会社製）
を用いて連結した。このリガーゼ反応液を用いて、大腸
菌ＤＨ５αのコンピタントセル（ＢＲＬ社製）を、ＢＲ
Ｌ社のプロトコールに従い形質転換した。得られた形質
転換株６株について、同菌株の保有するプラスミドＤＮ
Ａを簡便アルカリ溶菌法により抽出し、それぞれの制限
酵素地図を作成した。その結果、得られたプラスミドに
は、本工程で単離した約１．５ｋｂのＥｃｏＲＩ断片
が、Ｍ１３ｍｐ１８ＲＦのマルチプルクローニングサイ
トのＥｃｏＲＩサイトに正逆２方向にそれぞれ組み込ま
れた複合プラスミドがそれぞれ存在していた。
【００４１】（２）Ｃ末端側の遺伝子を含むＤＮＡ断片
の単離 前記工程８−（１）で取得した２種のプラスミドのう
ち、チトクロムＣ−５５３（ＣＯ）遺伝子のＣ末端部分
がＭ１３ｍｐ１８ＲＦベクターのマルチプルクローニン
グサイトのＸｂａＩサイトのより近くに位置する方のプ
ラスミドＤＮＡ１０μｇを、制限酵素ＰｓｔＩとＸｂａ
Ｉとで消化したのち、１％アガロースゲル電気泳動を行
い、約１．５ｋｂのＤＮＡ断片を含むアガロースゲルを
分画した。同アガロースゲル分画より、フナコシ社より
購入したジーンクリーン（ＧＥＮＥＣＬＥＡＮＴＭ）を
用いて、同社のプロトコールに従い、約１．５ｋｂのＰ
ｓｔＩ−ＸｂａＩ断片を抽出単離した。
の単離 前記工程８−（１）で取得した２種のプラスミドのう
ち、チトクロムＣ−５５３（ＣＯ）遺伝子のＣ末端部分
がＭ１３ｍｐ１８ＲＦベクターのマルチプルクローニン
グサイトのＸｂａＩサイトのより近くに位置する方のプ
ラスミドＤＮＡ１０μｇを、制限酵素ＰｓｔＩとＸｂａ
Ｉとで消化したのち、１％アガロースゲル電気泳動を行
い、約１．５ｋｂのＤＮＡ断片を含むアガロースゲルを
分画した。同アガロースゲル分画より、フナコシ社より
購入したジーンクリーン（ＧＥＮＥＣＬＥＡＮＴＭ）を
用いて、同社のプロトコールに従い、約１．５ｋｂのＰ
ｓｔＩ−ＸｂａＩ断片を抽出単離した。
【００４２】（３）チトクロムＣ−５５３（ＣＯ）全構
造遺伝子の構築 プローブとハイブリダイズする約２ｋｂのＳｐｈＩ断片
がＭ１３ｍｐ１９ＲＦのマルチプルクローニングサイト
のＳｐｈＩサイトに正逆２方向にそれぞれ組み込まれた
２種のプラスミド（前記工程６で調製した）のうち、チ
トクロムＣ−５５３（ＣＯ）構造遺伝子のＣ末端側の遺
伝子へとつながっている部分がＭ１３ｍｐ１９ＲＦベク
ターのマルチプルクローニングサイトのＸｂａＩサイト
のより近くに位置する方のプラスミドＤＡＮ１０μｇ
を、制限酵素ＰｓｔＩとＸｂａＩとで消化したのち、１
％アガロースゲル電気泳動を行い、約９ｋｂのＤＮＡ断
片を含むアガロースゲルを分画した。同アガロースゲル
分画より、フナコシ社より購入したジーンクリーン（Ｇ
ＥＮＥＣＬＥＡＮＴＭ）を用いて、同社のプロトコール
に従い、約９ｋｂのＰｓｔＩ−ＸｂａＩ断片を抽出単離
した。
造遺伝子の構築 プローブとハイブリダイズする約２ｋｂのＳｐｈＩ断片
がＭ１３ｍｐ１９ＲＦのマルチプルクローニングサイト
のＳｐｈＩサイトに正逆２方向にそれぞれ組み込まれた
２種のプラスミド（前記工程６で調製した）のうち、チ
トクロムＣ−５５３（ＣＯ）構造遺伝子のＣ末端側の遺
伝子へとつながっている部分がＭ１３ｍｐ１９ＲＦベク
ターのマルチプルクローニングサイトのＸｂａＩサイト
のより近くに位置する方のプラスミドＤＡＮ１０μｇ
を、制限酵素ＰｓｔＩとＸｂａＩとで消化したのち、１
％アガロースゲル電気泳動を行い、約９ｋｂのＤＮＡ断
片を含むアガロースゲルを分画した。同アガロースゲル
分画より、フナコシ社より購入したジーンクリーン（Ｇ
ＥＮＥＣＬＥＡＮＴＭ）を用いて、同社のプロトコール
に従い、約９ｋｂのＰｓｔＩ−ＸｂａＩ断片を抽出単離
した。
【００４３】この約９ｋｂのＰｓｔＩ−ＸｂａＩ断片と
前記工程８−（２）で単離した約１．５ｋｂのＰｓｔＩ
−ＸｂａＩ断片とを、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（宝酒造株式
会社製）を用いて連結した。このリガーゼ反応液を用い
て、大腸菌ＤＨ５αのコンピタントセル（ＢＲＬ社製）
をＢＲＬ社のプロトコールに従い形質転換した。得られ
た形質転換株６株について、同菌株の保有するプラスミ
ドＤＮＡを、簡便アルカリ溶菌法により抽出し、それぞ
れの制限酵素地図を作成した。その結果、得られたプラ
スミドには全て、約３ｋｂのＳｐｈＩ−ＥｃｏＲＩ断片
が含まれていた。この約３ｋｂのＳｐｈＩ−ＥｃｏＲＩ
断片は、前記工程４でクローニングした約１．５ｋｂの
ＥｃｏＲＩ断片及び、前記工程６でクローニングした約
２ｋｂのＳｐｈＩ断片を、全てその断片内に含んでい
た。
前記工程８−（２）で単離した約１．５ｋｂのＰｓｔＩ
−ＸｂａＩ断片とを、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（宝酒造株式
会社製）を用いて連結した。このリガーゼ反応液を用い
て、大腸菌ＤＨ５αのコンピタントセル（ＢＲＬ社製）
をＢＲＬ社のプロトコールに従い形質転換した。得られ
た形質転換株６株について、同菌株の保有するプラスミ
ドＤＮＡを、簡便アルカリ溶菌法により抽出し、それぞ
れの制限酵素地図を作成した。その結果、得られたプラ
スミドには全て、約３ｋｂのＳｐｈＩ−ＥｃｏＲＩ断片
が含まれていた。この約３ｋｂのＳｐｈＩ−ＥｃｏＲＩ
断片は、前記工程４でクローニングした約１．５ｋｂの
ＥｃｏＲＩ断片及び、前記工程６でクローニングした約
２ｋｂのＳｐｈＩ断片を、全てその断片内に含んでい
た。
【００４４】本工程で取得した約３ｋｂのＳｐｈＩ−Ｅ
ｃｏＲＩ断片を含むプラスミドＤＮＡは、同プラスミド
の保有菌から、前記工程４のアルカリ溶菌法により、１
５０μｇ抽出された。同プラスミドＤＮＡ２０μｇを制
限酵素ＨｉｎｄＩＩＩとＢｇｌＩＩとで消化したのち、
１％アガロースゲル電気泳動を行い、約２．１ｋｂのＤ
ＮＡ断片を含むアガロースゲル分画した。同アガロース
ゲル分画より、フナコシ社より購入したジーンクリーン
（ＧＥＮＥＣＬＥＡＮＴＭ）を用いて、同社のプロトコ
ールに従い、約２．１ｋｂのＨｉｎｄＩＩＩ−ＢｇｌＩ
Ｉ断片を約１μｇ抽出単離した。この約２．１ｋｂのＨ
ｉｎｄＩＩＩ−ＢｇｌＩｌ断片の制限酵素地図を第１図
に示した。この約２．１ｋｂのＨｉｎｄＩＩＩ−Ｂｇｌ
ＩＩ断片中に、配列番号１で示した１４３４塩基からな
るチトクロムＣ−５５３（ＣＯ）構造遺伝子が全て含ま
れている。
ｃｏＲＩ断片を含むプラスミドＤＮＡは、同プラスミド
の保有菌から、前記工程４のアルカリ溶菌法により、１
５０μｇ抽出された。同プラスミドＤＮＡ２０μｇを制
限酵素ＨｉｎｄＩＩＩとＢｇｌＩＩとで消化したのち、
１％アガロースゲル電気泳動を行い、約２．１ｋｂのＤ
ＮＡ断片を含むアガロースゲル分画した。同アガロース
ゲル分画より、フナコシ社より購入したジーンクリーン
（ＧＥＮＥＣＬＥＡＮＴＭ）を用いて、同社のプロトコ
ールに従い、約２．１ｋｂのＨｉｎｄＩＩＩ−ＢｇｌＩ
Ｉ断片を約１μｇ抽出単離した。この約２．１ｋｂのＨ
ｉｎｄＩＩＩ−ＢｇｌＩｌ断片の制限酵素地図を第１図
に示した。この約２．１ｋｂのＨｉｎｄＩＩＩ−Ｂｇｌ
ＩＩ断片中に、配列番号１で示した１４３４塩基からな
るチトクロムＣ−５５３（ＣＯ）構造遺伝子が全て含ま
れている。
【００４５】（４）Ｎ末端側の遺伝子を含む０．７ｋｂ
のＨｉｎｄＩＩＩ−ＰｓｔＩ断片の単離 前記工程６で取得した約２ｋｂのＳｐｈＩ断片がＭ１３
ｍｐ１９ＲＦのマルチプルグルローニングサイトのＳｐ
ｈＩサイトに正逆２方向にそれぞれ組み込まれた複合プ
ラスミドの一方のプラスミドＤＮＡ１０μｇを、制限酵
素ＨｉｎｄＩＩＩとＰｓｔＩとで消化した後、１％アガ
ロースゲル電気泳動を行い、約０．７ｋｂのＤＮＡ断片
を含むアガロースゲルを分画した。同アガロースゲル分
画より、フナコシ社より購入したジーンクリーン（ＧＥ
ＮＥＣＬＥＡＮＴＭ）を用いて、同社のプロトコールに
従い、約０．７ｋｂのＨｉｎｄＩＩＩ−ＰｓｔＩ断片を
抽出単離した。
のＨｉｎｄＩＩＩ−ＰｓｔＩ断片の単離 前記工程６で取得した約２ｋｂのＳｐｈＩ断片がＭ１３
ｍｐ１９ＲＦのマルチプルグルローニングサイトのＳｐ
ｈＩサイトに正逆２方向にそれぞれ組み込まれた複合プ
ラスミドの一方のプラスミドＤＮＡ１０μｇを、制限酵
素ＨｉｎｄＩＩＩとＰｓｔＩとで消化した後、１％アガ
ロースゲル電気泳動を行い、約０．７ｋｂのＤＮＡ断片
を含むアガロースゲルを分画した。同アガロースゲル分
画より、フナコシ社より購入したジーンクリーン（ＧＥ
ＮＥＣＬＥＡＮＴＭ）を用いて、同社のプロトコールに
従い、約０．７ｋｂのＨｉｎｄＩＩＩ−ＰｓｔＩ断片を
抽出単離した。
【００４６】（５）ベクターｐＨＳＧ３９８への約１．
５ｋｂのＰｓｔＩ−ＸｂａＩ断片の組み込み 大腸菌ベクタープラスミドｐＨＳＧ３９８（宝酒造株式
会社製）ＤＮＡ５μｇを、制限酵素ＰｓｔＩとＸｂａＩ
とで消化した後、１％アガロースゲル電気泳動を行い、
約２．２ｋｂのベクタープラスミド断片を含むアガロー
スゲルを分画した。同アガロースゲル分画より、フナコ
シ社より購入したジーンクリーンを用いて、同社のプロ
トコールに従い、約２．２ｋｂのベクタープラスミドｐ
ＨＳＧ３９８ＰｓｔＩ−ＸｂａＩ断片を抽出単離した。
５ｋｂのＰｓｔＩ−ＸｂａＩ断片の組み込み 大腸菌ベクタープラスミドｐＨＳＧ３９８（宝酒造株式
会社製）ＤＮＡ５μｇを、制限酵素ＰｓｔＩとＸｂａＩ
とで消化した後、１％アガロースゲル電気泳動を行い、
約２．２ｋｂのベクタープラスミド断片を含むアガロー
スゲルを分画した。同アガロースゲル分画より、フナコ
シ社より購入したジーンクリーンを用いて、同社のプロ
トコールに従い、約２．２ｋｂのベクタープラスミドｐ
ＨＳＧ３９８ＰｓｔＩ−ＸｂａＩ断片を抽出単離した。
【００４７】この約２．２ｋｂのｐＨＳＧ３９８Ｐｓｔ
Ｉ−ＸｂａＩ断片と前記工程８−（２）で取得した約
１．５ｋｂのＰｓｔＩ−ＸｂａＩ断片とを、Ｔ４ＤＮＡ
リガーゼ（宝酒造株式会社製）を用いて連結した。この
リガーゼ反応液を用いて、大腸菌ＤＨ５αのコンピタン
トセル（ＢＲＬ社製）を、ＢＲＬ社のプロトコールに従
い形質転換した。得られた形質転換株６株について、同
菌株の保有するプラスミドＤＮＡを簡便アルカリ溶菌法
により抽出し、それぞれの制限酵素地図を作成した。そ
の結果、得られたプラスミドは全て、ベクタープラスミ
ドｐＨＳＧ３９８の約２．２ｋｂのＰｓｔＩ−ＸｂａＩ
断片に前記工程８−（２）で取得した約１．５ｋｂのＰ
ｓｔＩ−ＸｂａＩ断片が組み込まれた複合プラスミドで
あった。
Ｉ−ＸｂａＩ断片と前記工程８−（２）で取得した約
１．５ｋｂのＰｓｔＩ−ＸｂａＩ断片とを、Ｔ４ＤＮＡ
リガーゼ（宝酒造株式会社製）を用いて連結した。この
リガーゼ反応液を用いて、大腸菌ＤＨ５αのコンピタン
トセル（ＢＲＬ社製）を、ＢＲＬ社のプロトコールに従
い形質転換した。得られた形質転換株６株について、同
菌株の保有するプラスミドＤＮＡを簡便アルカリ溶菌法
により抽出し、それぞれの制限酵素地図を作成した。そ
の結果、得られたプラスミドは全て、ベクタープラスミ
ドｐＨＳＧ３９８の約２．２ｋｂのＰｓｔＩ−ＸｂａＩ
断片に前記工程８−（２）で取得した約１．５ｋｂのＰ
ｓｔＩ−ＸｂａＩ断片が組み込まれた複合プラスミドで
あった。
【００４８】（６）チトクロムＣ−５５３（ＣＯ）全構
造遺伝子を含むプラスミドの構築 前記工程８−（５）で取得した複合プラスミドＤＮＡ５
μｇを、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩとＰｓｔＩとで消化し
た後、１％アガロースゲル電気泳動を行い、約３．７ｋ
ｂの複合プラスミド断片を含むアガロースゲルを分画し
た。同アガロースゲル分画よりフナコシ社のプロトコー
ルに従い、約３．７ｋｂのプラスミド断片を抽出単離し
た。
造遺伝子を含むプラスミドの構築 前記工程８−（５）で取得した複合プラスミドＤＮＡ５
μｇを、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩとＰｓｔＩとで消化し
た後、１％アガロースゲル電気泳動を行い、約３．７ｋ
ｂの複合プラスミド断片を含むアガロースゲルを分画し
た。同アガロースゲル分画よりフナコシ社のプロトコー
ルに従い、約３．７ｋｂのプラスミド断片を抽出単離し
た。
【００４９】この約３．７ｋｂの複合プラスミドのＨｉ
ｎｄＩＩＩ−ＰｓｔＩ断片と、前記工程８−（４）で取
得した約０．７ｋｂのＨｉｎｄＩＩＩ−ＰｓｔＩ断片と
を、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（宝酒造株式会社製）を用いて
連結した。このリガーゼ反応液を用いて、大腸菌ＤＨ５
αのコンセタントセル（ＢＲＬ社製）を、ＢＲＬ社のプ
ロトコールに従い形質転換した。得られた形質転換株６
株について、同株の保有するプラスミドＤＮＡを簡便ア
ルカリ溶菌法により抽出し、それぞれの制限酵素地図を
作成した。その結果、得られたプラスミドは全て、前記
工程８−（５）で取得した複合プラスミドの約３．７ｋ
ｂのＨｉｎｄＩＩＩ−ＰｓｔＩ断片に、前記工程８−
（４）で取得した約０．７ｋｂのＨｉｎｄＩＩＩ−Ｐｓ
ｔＩ断片が組み込まれた複合プラスミドｐＣＹＴ１であ
った。尚、複合プラスミドｐＣＹＴ１を保有した大腸菌
ＤＨ５αは、受託番号微工研菌寄第１１４９７号で、工
業技術院微生物工業技術研究所に既に寄託されている。
ｎｄＩＩＩ−ＰｓｔＩ断片と、前記工程８−（４）で取
得した約０．７ｋｂのＨｉｎｄＩＩＩ−ＰｓｔＩ断片と
を、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（宝酒造株式会社製）を用いて
連結した。このリガーゼ反応液を用いて、大腸菌ＤＨ５
αのコンセタントセル（ＢＲＬ社製）を、ＢＲＬ社のプ
ロトコールに従い形質転換した。得られた形質転換株６
株について、同株の保有するプラスミドＤＮＡを簡便ア
ルカリ溶菌法により抽出し、それぞれの制限酵素地図を
作成した。その結果、得られたプラスミドは全て、前記
工程８−（５）で取得した複合プラスミドの約３．７ｋ
ｂのＨｉｎｄＩＩＩ−ＰｓｔＩ断片に、前記工程８−
（４）で取得した約０．７ｋｂのＨｉｎｄＩＩＩ−Ｐｓ
ｔＩ断片が組み込まれた複合プラスミドｐＣＹＴ１であ
った。尚、複合プラスミドｐＣＹＴ１を保有した大腸菌
ＤＨ５αは、受託番号微工研菌寄第１１４９７号で、工
業技術院微生物工業技術研究所に既に寄託されている。
【００５０】ところで、配列番号１の塩基配列で示され
る構造遺伝子が、チトクロムＣ−５５３（ＣＯ）をコー
ドしていることは、前記工程２−（３）で決定したアミ
ノ酸配列が全て、配列番号１の塩基配列より決まるアミ
ノ酸配列と一致したことにより確認された。具体的に
は、前記工程２−（３）において明らかとなった限定加
水分解ペプチドＩのＮ末端アミノ酸配列は、配列番号１
の第１２４３番目の塩基（Ａ）から第１２８１番目の塩
基（Ｔ）までの塩基配列に対応したアミノ酸配列と一致
し、同限定加水分解ペプチドＩＩのＮ末端アミノ酸配列
は、配列番号１の第１３０３番目の塩基（Ａ）から第１
３５０番目の塩基（Ｇ）までの塩基配列に対応したアミ
ノ酸配列と一致した。
る構造遺伝子が、チトクロムＣ−５５３（ＣＯ）をコー
ドしていることは、前記工程２−（３）で決定したアミ
ノ酸配列が全て、配列番号１の塩基配列より決まるアミ
ノ酸配列と一致したことにより確認された。具体的に
は、前記工程２−（３）において明らかとなった限定加
水分解ペプチドＩのＮ末端アミノ酸配列は、配列番号１
の第１２４３番目の塩基（Ａ）から第１２８１番目の塩
基（Ｔ）までの塩基配列に対応したアミノ酸配列と一致
し、同限定加水分解ペプチドＩＩのＮ末端アミノ酸配列
は、配列番号１の第１３０３番目の塩基（Ａ）から第１
３５０番目の塩基（Ｇ）までの塩基配列に対応したアミ
ノ酸配列と一致した。
【００５１】Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｓｕｂｏｘ
ｙｄａｎｓ ｖａｒ．α株の上記で得られた遺伝子によ
る形質転換株においては、同遺伝子由来のＣ型チトクロ
ムが生成され、同Ｃ型チトクロムがチトクロムＣ−５５
３（ＣＯ）と同様の機能を有することが確認された。
ｙｄａｎｓ ｖａｒ．α株の上記で得られた遺伝子によ
る形質転換株においては、同遺伝子由来のＣ型チトクロ
ムが生成され、同Ｃ型チトクロムがチトクロムＣ−５５
３（ＣＯ）と同様の機能を有することが確認された。
【００５２】（７）ベクタ−ｐＨＳＧ２９８への約２．
７ｋｂのＢａｍＨＩ−ＳａｃＩ断片の組み込み 前記工程８−（３）で取得した約３ｋｂのＳｐｈＩ−Ｅ
ｃｏＲＩ断片を含むプラスミドＤＮＡは、同プラスミド
の保有菌から、前記工程４のアルカリ溶菌法により、１
５０μｇ抽出された。同プラスミドＤＮＡ２０μｇを制
限酵素ＢａｍＨＩとＳａｃＩとで消化したのち、１％ア
ガロースゲル電気泳動を行い、約２．７ｋｂのＤＮＡ断
片を含むアガロースゲル分画した。同アガロースゲル分
画より、フナコシ社より購入したジーンクリーン（ＧＥ
ＮＥＣＬＥＡＮＴＭ）を用いて、同社のプロトコールに
従い、約２．７ｋｂのＢａｍＨＩ−ＳａｃＩ断片を約１
μｇ抽出単離した。この約２．７ｋｂのＢａｍＨＩ−Ｓ
ａｃＩ断片中に、配列番号１で示した１４３４塩基から
なるチトクロムＣ−５５３（ＣＯ）構造遺伝子が全て含
まれている。
７ｋｂのＢａｍＨＩ−ＳａｃＩ断片の組み込み 前記工程８−（３）で取得した約３ｋｂのＳｐｈＩ−Ｅ
ｃｏＲＩ断片を含むプラスミドＤＮＡは、同プラスミド
の保有菌から、前記工程４のアルカリ溶菌法により、１
５０μｇ抽出された。同プラスミドＤＮＡ２０μｇを制
限酵素ＢａｍＨＩとＳａｃＩとで消化したのち、１％ア
ガロースゲル電気泳動を行い、約２．７ｋｂのＤＮＡ断
片を含むアガロースゲル分画した。同アガロースゲル分
画より、フナコシ社より購入したジーンクリーン（ＧＥ
ＮＥＣＬＥＡＮＴＭ）を用いて、同社のプロトコールに
従い、約２．７ｋｂのＢａｍＨＩ−ＳａｃＩ断片を約１
μｇ抽出単離した。この約２．７ｋｂのＢａｍＨＩ−Ｓ
ａｃＩ断片中に、配列番号１で示した１４３４塩基から
なるチトクロムＣ−５５３（ＣＯ）構造遺伝子が全て含
まれている。
【００５３】大腸菌ベクタープラスミドｐＨＳＧ２９８
（宝酒造株式会社製）ＤＮＡ５μｇを、制限酵素Ｂａｍ
ＨＩとＳａｃＩとで消化した後、１％アガロースゲル電
気泳動を行い、約２．７ｋｂのベクタープラスミド断片
を含むアガロースゲルを分画した。同アガロースゲル分
画より、フナコシ社より購入したジーンクリーンを用い
て、同社のプロトコールに従い、約２．７ｋｂのベクタ
ープラスミドｐＨＳＧ２９８ＢａｍＨＩ−ＳａｃＩ断片
を抽出単離した。
（宝酒造株式会社製）ＤＮＡ５μｇを、制限酵素Ｂａｍ
ＨＩとＳａｃＩとで消化した後、１％アガロースゲル電
気泳動を行い、約２．７ｋｂのベクタープラスミド断片
を含むアガロースゲルを分画した。同アガロースゲル分
画より、フナコシ社より購入したジーンクリーンを用い
て、同社のプロトコールに従い、約２．７ｋｂのベクタ
ープラスミドｐＨＳＧ２９８ＢａｍＨＩ−ＳａｃＩ断片
を抽出単離した。
【００５４】この約２．７ｋｂのｐＨＳＧ２９８Ｂａｍ
ＨＩ−ＳａｃＩ断片と前記工程８−（３）で取得した約
２．７ｋｂのＢａｍＨＩ−ＳａｃＩ断片とを、Ｔ４ＤＮ
Ａリガーゼ（宝酒造株式会社製）を用いて連結した。こ
のリガーゼ反応液を用いて、大腸菌ＤＨ５αのコンピタ
ントセル（ＢＲＬ社製）を、ＢＲＬ社のプロトコールに
従い形質転換した。得られた形質転換株６株について、
同菌株の保有するプラスミドＤＮＡを簡便アルカリ溶菌
法により抽出し、それぞれの制限酵素地図を作成した。
その結果、得られたプラスミドは全て、ベクタープラス
ミドｐＨＳＧ２９８の約２．７ｋｂのＢａｍＨＩ−Ｓａ
ｃＩ断片に前記工程８−（３）で取得した約２．７ｋｂ
のＢａｍＨＩ−ＳａｃＩ断片が組み込まれた複合プラス
ミドｐＣＹＴ３であった。得られたｐＣＹＴ３を保有し
た大腸菌よりアルカリ溶菌法により、ｐＣＹＴ３を１０
０μｇ抽出単離した。
ＨＩ−ＳａｃＩ断片と前記工程８−（３）で取得した約
２．７ｋｂのＢａｍＨＩ−ＳａｃＩ断片とを、Ｔ４ＤＮ
Ａリガーゼ（宝酒造株式会社製）を用いて連結した。こ
のリガーゼ反応液を用いて、大腸菌ＤＨ５αのコンピタ
ントセル（ＢＲＬ社製）を、ＢＲＬ社のプロトコールに
従い形質転換した。得られた形質転換株６株について、
同菌株の保有するプラスミドＤＮＡを簡便アルカリ溶菌
法により抽出し、それぞれの制限酵素地図を作成した。
その結果、得られたプラスミドは全て、ベクタープラス
ミドｐＨＳＧ２９８の約２．７ｋｂのＢａｍＨＩ−Ｓａ
ｃＩ断片に前記工程８−（３）で取得した約２．７ｋｂ
のＢａｍＨＩ−ＳａｃＩ断片が組み込まれた複合プラス
ミドｐＣＹＴ３であった。得られたｐＣＹＴ３を保有し
た大腸菌よりアルカリ溶菌法により、ｐＣＹＴ３を１０
０μｇ抽出単離した。
【００５５】ところで、配列番号１の塩基配列で示され
る構造遺伝子が、チトクロムＣ−５５３（ＣＯ）をコー
ドしていることは、前記工程２−（３）で決定したアミ
ノ酸配列が全て、配列番号１の塩基配列より決まるアミ
ノ酸配列と一致したことにより確認された。具体的に
は、前記工程２−（３）において明らかとなった限定加
水分解ペプチドＩのＮ末端アミノ酸配列（配列番号２）
は、配列番号１の第１２４３番目の塩基（Ａ）から第１
２８１番目の塩基（Ｔ）までの塩基配列に対応したアミ
ノ酸配列と一致し、同限定加水分解ペプチドＩＩのＮ末
端アミノ酸配列（配列番号３）は、配列番号１の第１３
０３番目の塩基（Ａ）から第１３５０番目の塩基（Ｇ）
までの塩基配列に対応したアミノ酸配列と一致した。
る構造遺伝子が、チトクロムＣ−５５３（ＣＯ）をコー
ドしていることは、前記工程２−（３）で決定したアミ
ノ酸配列が全て、配列番号１の塩基配列より決まるアミ
ノ酸配列と一致したことにより確認された。具体的に
は、前記工程２−（３）において明らかとなった限定加
水分解ペプチドＩのＮ末端アミノ酸配列（配列番号２）
は、配列番号１の第１２４３番目の塩基（Ａ）から第１
２８１番目の塩基（Ｔ）までの塩基配列に対応したアミ
ノ酸配列と一致し、同限定加水分解ペプチドＩＩのＮ末
端アミノ酸配列（配列番号３）は、配列番号１の第１３
０３番目の塩基（Ａ）から第１３５０番目の塩基（Ｇ）
までの塩基配列に対応したアミノ酸配列と一致した。
【００５６】工程９ グルコノバクター菌−大腸菌のシャトルベクターの構築 （１）グルコノバクター サブオキシダンス ＩＦＯ
３１３０からのプラスミド断片の取得 ポリペプトン８ｇ／ｌ，酵母エキス５ｇ／ｌ，ＮａＣｌ
２．５ｇ／ｌ，グリセリン２０ｇ／ｌの組成の培地５０
ｍｌを５００ｍｌ容振盪フラスコに分注し、常法にした
がって滅菌後、グルコノバクター サブオキシダンス
ＩＦＯ ３１３０の斜面培養物からその一白金耳を植菌
し、３０℃で一晩振盪培養した。同培養液より集菌した
菌体について、通常大腸菌で用いられているアルカリ溶
菌法により、プラスミドを抽出した。得られたプラスミ
ドＤＮＡ２０μｇを制限酵素ＸｈｏＩ（宝酒造株式会社
製）で消化した後、１％アガロースゲル電気泳動を行
い、約２ｋｂから約４ｋｂのＤＮＡ断片を含むアガロー
スゲルを分画した。同アガロースゲル分画より、フナコ
シ社より購入したジーンクリーン（ＧＥＮＥＣＬＥＡＮ
ＴＭ）を用いて、同社のプロトコールに従い、同分画Ｄ
ＮＡ断片を抽出単離した。
３１３０からのプラスミド断片の取得 ポリペプトン８ｇ／ｌ，酵母エキス５ｇ／ｌ，ＮａＣｌ
２．５ｇ／ｌ，グリセリン２０ｇ／ｌの組成の培地５０
ｍｌを５００ｍｌ容振盪フラスコに分注し、常法にした
がって滅菌後、グルコノバクター サブオキシダンス
ＩＦＯ ３１３０の斜面培養物からその一白金耳を植菌
し、３０℃で一晩振盪培養した。同培養液より集菌した
菌体について、通常大腸菌で用いられているアルカリ溶
菌法により、プラスミドを抽出した。得られたプラスミ
ドＤＮＡ２０μｇを制限酵素ＸｈｏＩ（宝酒造株式会社
製）で消化した後、１％アガロースゲル電気泳動を行
い、約２ｋｂから約４ｋｂのＤＮＡ断片を含むアガロー
スゲルを分画した。同アガロースゲル分画より、フナコ
シ社より購入したジーンクリーン（ＧＥＮＥＣＬＥＡＮ
ＴＭ）を用いて、同社のプロトコールに従い、同分画Ｄ
ＮＡ断片を抽出単離した。
【００５７】（２）大腸菌ベクターｐＵＣ１８へのグル
コノバクタープラスミド断片の組み込み 前記工程９−（１）で取得したグルコノバクタープラス
ミドのＤＮＡ断片と制限酵素ＳａｌＩ（宝酒造株式会社
製）で切断した後、細菌性アルカリホスファターゼ（宝
酒造株式会社製）で脱リン酸化した大腸菌ベクターｐＵ
Ｃ１８（宝酒造株式会社製）とを、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ
（宝酒造株式会社製）を用いて連結した。このリガーゼ
反応液を用いて、大腸菌ＤＨ５αのコンピタントセル
（ＢＲＬ社製）を、ＢＲＬ社のプロトコールに従い形質
転換した。
コノバクタープラスミド断片の組み込み 前記工程９−（１）で取得したグルコノバクタープラス
ミドのＤＮＡ断片と制限酵素ＳａｌＩ（宝酒造株式会社
製）で切断した後、細菌性アルカリホスファターゼ（宝
酒造株式会社製）で脱リン酸化した大腸菌ベクターｐＵ
Ｃ１８（宝酒造株式会社製）とを、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ
（宝酒造株式会社製）を用いて連結した。このリガーゼ
反応液を用いて、大腸菌ＤＨ５αのコンピタントセル
（ＢＲＬ社製）を、ＢＲＬ社のプロトコールに従い形質
転換した。
【００５８】得られた形質転換株の保有するプラスミド
ＤＮＡをアルカリ溶菌法により抽出し、その一部を用い
て制限酵素地図を作成した。その結果、得られたプラス
ミドはｐＵＣ１８のＳａｌＩサイトに、グルコノバクタ
ー サブオキシダンスＩＦＯ３１３０由来の約２．７ｋ
ｂのプラスミド断片が組み込まれた複合プラスミドｐＧ
ＥＡ１であった。
ＤＮＡをアルカリ溶菌法により抽出し、その一部を用い
て制限酵素地図を作成した。その結果、得られたプラス
ミドはｐＵＣ１８のＳａｌＩサイトに、グルコノバクタ
ー サブオキシダンスＩＦＯ３１３０由来の約２．７ｋ
ｂのプラスミド断片が組み込まれた複合プラスミドｐＧ
ＥＡ１であった。
【００５９】工程１０ ｐＧＥＡ１へのチトクロムＣ−５５３（ＣＯ）全遺伝子
を含む約２．７ｋｂのＢａｍＨＩ−ＳａｃＩ断片の組み
込み ｐＧＥＡ１ＤＮＡ５μｇを制限酵素ＢａｍＨＩとＳａｃ
Ｉとで消化した後、１％アガロースゲル電気泳動を行
い、約５．４ｋｂのベクタープラスミド断片を含むアガ
ロースゲルを分画した。同アガロースゲル分画より、フ
ナコシ社より購入したジーンクリーンを用いて、同社の
プロトコールに従い、約５．４ｋｂのベクタープラスミ
ドｐＧＥＡ１のＢａｍＨＩ−ＳａｃＩ断片を抽出単離し
た。
を含む約２．７ｋｂのＢａｍＨＩ−ＳａｃＩ断片の組み
込み ｐＧＥＡ１ＤＮＡ５μｇを制限酵素ＢａｍＨＩとＳａｃ
Ｉとで消化した後、１％アガロースゲル電気泳動を行
い、約５．４ｋｂのベクタープラスミド断片を含むアガ
ロースゲルを分画した。同アガロースゲル分画より、フ
ナコシ社より購入したジーンクリーンを用いて、同社の
プロトコールに従い、約５．４ｋｂのベクタープラスミ
ドｐＧＥＡ１のＢａｍＨＩ−ＳａｃＩ断片を抽出単離し
た。
【００６０】この約５．４ｋｂのｐＧＥＡ１ ＢａｍＨ
Ｉ−ＳａｃＩ断片と前記工程８−（４）で取得した複合
プラスミドｐＣＹＴ３のＢａｍＨＩ−ＳａｃＩ断片と
を、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いて連結した。このリガー
ゼ反応液を用いて、大腸菌ＤＨ５αのコンピテントセル
（ＢＲＬ社製）を、ＢＲＬ社のプロトコールに従い形質
転換した。得られた形質転換株についてそれらの保有す
るプラスミドを調べた結果、ｐＧＥＡ１の約５．４ｋｂ
のＢａｍＨＩ−ＳａｃＩ断片に、チトクロムＣ−５５３
（ＣＯ）全遺伝子を含んだ約２．７ｋｂのＢａｍＨＩ−
ＳａｃＩ断片が組み込まれており、該複合プラスミドｐ
ＧＥＡＣ１と命名した。得られたｐＧＥＡＣ１を保有し
た大腸菌より、アルカリ溶菌法により、ｐＧＥＡＣ１を
１００μｇ抽出単離した。
Ｉ−ＳａｃＩ断片と前記工程８−（４）で取得した複合
プラスミドｐＣＹＴ３のＢａｍＨＩ−ＳａｃＩ断片と
を、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いて連結した。このリガー
ゼ反応液を用いて、大腸菌ＤＨ５αのコンピテントセル
（ＢＲＬ社製）を、ＢＲＬ社のプロトコールに従い形質
転換した。得られた形質転換株についてそれらの保有す
るプラスミドを調べた結果、ｐＧＥＡ１の約５．４ｋｂ
のＢａｍＨＩ−ＳａｃＩ断片に、チトクロムＣ−５５３
（ＣＯ）全遺伝子を含んだ約２．７ｋｂのＢａｍＨＩ−
ＳａｃＩ断片が組み込まれており、該複合プラスミドｐ
ＧＥＡＣ１と命名した。得られたｐＧＥＡＣ１を保有し
た大腸菌より、アルカリ溶菌法により、ｐＧＥＡＣ１を
１００μｇ抽出単離した。
【００６１】工程１１ グルコノバクター菌の形質転換 ＹＰＧ培地（ポリペプトン２ｇ／ｌ，酵母エキス５ｇ／
ｌ，グルコース３０ｇ／ｌ，グルコースは加熱滅菌後、
他の加熱滅菌された培地成分と無菌条件下で混合す
る。）５０ｍｌを、５００ｍｌ容振盪フラスコに分注
し、常法により滅菌後、グルコノバクター サブオキシ
ダンス ＩＦＯ３２５４の斜面培養物からその一白金耳
を植菌し、２５℃で一晩培養した。同培養液を１０分間
氷冷後、氷冷した２５ｍｌのＮａＣｌ液（１００ｍＭ
ＮａＣｌ，５ｍＭ ＭｇＣｌ２，１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−
ＨＣｌ ｐＨ７．６）で、菌体を２回洗浄した。次に、
同洗浄菌体を、氷冷した２０ｍｌのＬｉＣｌ液（４００
ｍＭ ＬｉＣｌ，１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ
７．６）に懸濁して、３０分間氷冷した。同懸濁液より
集菌した菌体を、０．５ｍｌのＬｉＣｌ液に再度懸濁
し、コンピタントセル懸濁液とした。
ｌ，グルコース３０ｇ／ｌ，グルコースは加熱滅菌後、
他の加熱滅菌された培地成分と無菌条件下で混合す
る。）５０ｍｌを、５００ｍｌ容振盪フラスコに分注
し、常法により滅菌後、グルコノバクター サブオキシ
ダンス ＩＦＯ３２５４の斜面培養物からその一白金耳
を植菌し、２５℃で一晩培養した。同培養液を１０分間
氷冷後、氷冷した２５ｍｌのＮａＣｌ液（１００ｍＭ
ＮａＣｌ，５ｍＭ ＭｇＣｌ２，１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−
ＨＣｌ ｐＨ７．６）で、菌体を２回洗浄した。次に、
同洗浄菌体を、氷冷した２０ｍｌのＬｉＣｌ液（４００
ｍＭ ＬｉＣｌ，１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ
７．６）に懸濁して、３０分間氷冷した。同懸濁液より
集菌した菌体を、０．５ｍｌのＬｉＣｌ液に再度懸濁
し、コンピタントセル懸濁液とした。
【００６２】同コンピタントセル懸濁液２００μｌを、
本形質転換に用いるプラスミドＤＮＡ１０μｇを含む氷
冷したＴＥ緩衝液（１ｍＭ ＥＤＴＡ，１０ｍＭＴｒｉ
ｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．６）１００μｌと混合する。１時
間の氷冷後、氷冷したＰＥＧ液（ポリエチレングリコー
ル４０００の６０ｗ／ｖ％水溶液）３００μｌと混合
し、更に３０分間氷冷した。同細胞感濁液を、ＹＰＧ培
地５ｍｌと混合した後、３０℃で３時間振盪培養した。
同培養液を、滅菌水に適当に希釈し、アンピシリン１０
０μｇ／ｍｌを含有したＹＰＧ寒天培地（ＹＰＧ培地に
寒天１５ｇ／ｌを添加した培地）に塗布し、３０℃で３
日間培養した。
本形質転換に用いるプラスミドＤＮＡ１０μｇを含む氷
冷したＴＥ緩衝液（１ｍＭ ＥＤＴＡ，１０ｍＭＴｒｉ
ｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．６）１００μｌと混合する。１時
間の氷冷後、氷冷したＰＥＧ液（ポリエチレングリコー
ル４０００の６０ｗ／ｖ％水溶液）３００μｌと混合
し、更に３０分間氷冷した。同細胞感濁液を、ＹＰＧ培
地５ｍｌと混合した後、３０℃で３時間振盪培養した。
同培養液を、滅菌水に適当に希釈し、アンピシリン１０
０μｇ／ｍｌを含有したＹＰＧ寒天培地（ＹＰＧ培地に
寒天１５ｇ／ｌを添加した培地）に塗布し、３０℃で３
日間培養した。
【００６３】本グルコノバクター菌の形質転換法を用い
て、グルコノバクター サブオキシダンス ＩＦＯ ３
２５４を、ｐＧＥＡ１又はｐＧＥＡＣ１のそれぞれのプ
ラスミドＤＮＡにより形質転換した。
て、グルコノバクター サブオキシダンス ＩＦＯ ３
２５４を、ｐＧＥＡ１又はｐＧＥＡＣ１のそれぞれのプ
ラスミドＤＮＡにより形質転換した。
【００６４】その結果、それぞれの形質転換株には、ｐ
ＧＥＡ１又はｐＧＥＡＣ１とそれぞれ同じ制限酵素切断
パターンを示すプラスミドが含まれており、それぞれグ
ルコノバクター サブオキシダンス ＩＦＯ ３２５４
（ｐＧＥＡ１）及びグルコノバクター サブオキシダン
ス ＩＦＯ ３２５４（ｐＧＥＡＣ１）と命名した。
尚、グルコノバクター サブオキシダンスＩＦＯ ３２
５４（ｐＧＥＡＣ１）は、受託番号微工研菌寄第１２２
１０号で、工業技術院微生物工業技術研究所に既に寄託
されている。以後の工程において、特にことわりのない
限り、ｐＧＥＡ１又はｐＧＥＡＣ１の保有株の培養に
は、培地にアンピシリン２００μｇ／ｍｌを添加した。
ＧＥＡ１又はｐＧＥＡＣ１とそれぞれ同じ制限酵素切断
パターンを示すプラスミドが含まれており、それぞれグ
ルコノバクター サブオキシダンス ＩＦＯ ３２５４
（ｐＧＥＡ１）及びグルコノバクター サブオキシダン
ス ＩＦＯ ３２５４（ｐＧＥＡＣ１）と命名した。
尚、グルコノバクター サブオキシダンスＩＦＯ ３２
５４（ｐＧＥＡＣ１）は、受託番号微工研菌寄第１２２
１０号で、工業技術院微生物工業技術研究所に既に寄託
されている。以後の工程において、特にことわりのない
限り、ｐＧＥＡ１又はｐＧＥＡＣ１の保有株の培養に
は、培地にアンピシリン２００μｇ／ｍｌを添加した。
【００６５】工程１２ オキシダーゼ活性の評価 （１）菌体及び細胞膜サンプルの調製 ＳＧ培地（グルコン酸ナトリウム１０ｇ／ｌ，ポリペプ
トン５ｇ／ｌ，グリセロール３ｇ／ｌ，ソルビトール１
０ｇ／ｌ，酵母エキス５ｇ／ｌ，グルコース５ｇ／ｌ，
グルコースは、加熱滅菌後、他の加熱滅菌された培地成
分と無菌条件下で混合する。）１００ｍｌを、５００ｍ
ｌ容振盪フラスコに分注し、常法により滅菌後、グルコ
ノバクター サブオキシダンス ＩＦＯ ３２５４，グ
ルコノバクター サブオキシダンス ＩＦＯ ３２５４
（ｐＧＥＡ１），グルコノバクターサブオキシダンス
ＩＦＯ ３２５４（ｐＧＥＡＣ１）のそれぞれの斜面培
養物から、その一白金耳をそれぞれ別個の振盪フラスコ
に植菌し、３０℃で一晩培養した。次にそれぞれの培養
液を、ＳＧＧ培地（ＳＧ培地のグルコン酸ナトリウム濃
度を２０ｇ／ｌとした培地）２．４ｌを５ｌ容振盪フラ
スコに分注し、常法により滅菌したそれぞれの振盪フラ
スコに移植し、３０℃で２日培養した。それぞれの菌株
について得られた菌体の半分については、前記工程１−
（２）の方法により各菌株の細胞膜を分画し、残り半分
については、集菌洗浄後菌体懸濁液とした。
トン５ｇ／ｌ，グリセロール３ｇ／ｌ，ソルビトール１
０ｇ／ｌ，酵母エキス５ｇ／ｌ，グルコース５ｇ／ｌ，
グルコースは、加熱滅菌後、他の加熱滅菌された培地成
分と無菌条件下で混合する。）１００ｍｌを、５００ｍ
ｌ容振盪フラスコに分注し、常法により滅菌後、グルコ
ノバクター サブオキシダンス ＩＦＯ ３２５４，グ
ルコノバクター サブオキシダンス ＩＦＯ ３２５４
（ｐＧＥＡ１），グルコノバクターサブオキシダンス
ＩＦＯ ３２５４（ｐＧＥＡＣ１）のそれぞれの斜面培
養物から、その一白金耳をそれぞれ別個の振盪フラスコ
に植菌し、３０℃で一晩培養した。次にそれぞれの培養
液を、ＳＧＧ培地（ＳＧ培地のグルコン酸ナトリウム濃
度を２０ｇ／ｌとした培地）２．４ｌを５ｌ容振盪フラ
スコに分注し、常法により滅菌したそれぞれの振盪フラ
スコに移植し、３０℃で２日培養した。それぞれの菌株
について得られた菌体の半分については、前記工程１−
（２）の方法により各菌株の細胞膜を分画し、残り半分
については、集菌洗浄後菌体懸濁液とした。
【００６６】（２）オキシダーゼ活性の測定 前記工程１２−（１）で調製した細胞膜懸濁液又は菌体
懸濁液と基質１０ｍＭとを含む３ｍｌの緩衝液につい
て、２５℃における溶存酵素濃度の減少速度をクラーク
型酸素電極により測定した。エタノール又はグルコース
を基質とした場合には、５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液
（ｐＨ６）を用い、ソルビトール又はグリセロールを基
質とする場合には、５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐ
Ｈ５）を用いた。
懸濁液と基質１０ｍＭとを含む３ｍｌの緩衝液につい
て、２５℃における溶存酵素濃度の減少速度をクラーク
型酸素電極により測定した。エタノール又はグルコース
を基質とした場合には、５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液
（ｐＨ６）を用い、ソルビトール又はグリセロールを基
質とする場合には、５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐ
Ｈ５）を用いた。
【００６７】本測定に用いた細胞膜懸濁液の蛋白質濃度
は、前記工程１−（５）で示した改良ローリー法で測定
した。各基質に対するオキシダーゼ比活性を表１に示し
た。
は、前記工程１−（５）で示した改良ローリー法で測定
した。各基質に対するオキシダーゼ比活性を表１に示し
た。
【００６８】細胞膜サンプルについては、蛋白質１ｍｇ
当たり１分間に消費される酸素分子のマイクロモル数
で、菌体サンプルについては、乾燥菌体１ｍｇ当たり１
分間に消費される酸素分子のマイクロモル数で、各オキ
シダーゼの比活性を示した。
当たり１分間に消費される酸素分子のマイクロモル数
で、菌体サンプルについては、乾燥菌体１ｍｇ当たり１
分間に消費される酸素分子のマイクロモル数で、各オキ
シダーゼの比活性を示した。
【００６９】尚、ピロロキノリンキノンを補酵素とする
酵素があるため、細胞膜懸濁液や菌体懸濁液の各サンプ
ルについて、ピロロキノリンキノン５μＭ，ＣａＣｌ２
５ｍＭの濃度で室温で３０分間処理することにより、各
サンプルのホロ化を行い、ホロ化を行ったサンプルにつ
いて各オキシダーゼ活性の測定を行った。
酵素があるため、細胞膜懸濁液や菌体懸濁液の各サンプ
ルについて、ピロロキノリンキノン５μＭ，ＣａＣｌ２
５ｍＭの濃度で室温で３０分間処理することにより、各
サンプルのホロ化を行い、ホロ化を行ったサンプルにつ
いて各オキシダーゼ活性の測定を行った。
【００７０】工程１３ 酸化発酵性の評価 ＳＧ培地１００ｍｌを、５００ｍｌ容振盪フラスコに分
注し、常法により滅菌後、グルコノバクター サブオキ
シダンス ＩＦＯ ３２５４，グルコノバクターサブオ
キシダンス ＩＦＯ ３２５４（ｐＧＥＡ１），グルコ
ノバクター サブオキシダンス ＩＦＯ ３２５４（ｐ
ＧＥＡＣ１）のそれぞれの斜面培養物から、その一白金
耳をそれぞれ別個の振盪フラスコに植菌し、３０℃で一
晩培養した。それぞれの菌体を集菌後、各取得菌体の半
分を、加熱滅菌された発酵培地５０ｍｌにそれぞれ別個
に移植し、５００ｍｌ容振盪フラスコにて３０℃で振盪
培養し、経時的にサンプリングを行って、各培養液の成
分を分析した。発酵培地には、酵母エキス１ｇ／ｌ，Ｃ
ａＣＯ３１０ｇ／ｌ，基質が含まれ、基質としては、グ
ルコース１００ｇ／ｌ又はソルビトール１００ｇ／ｌ又
は、エタノール３０ｍｌ／ｌのうち一種類のみをそれぞ
れ単独で用いた。
注し、常法により滅菌後、グルコノバクター サブオキ
シダンス ＩＦＯ ３２５４，グルコノバクターサブオ
キシダンス ＩＦＯ ３２５４（ｐＧＥＡ１），グルコ
ノバクター サブオキシダンス ＩＦＯ ３２５４（ｐ
ＧＥＡＣ１）のそれぞれの斜面培養物から、その一白金
耳をそれぞれ別個の振盪フラスコに植菌し、３０℃で一
晩培養した。それぞれの菌体を集菌後、各取得菌体の半
分を、加熱滅菌された発酵培地５０ｍｌにそれぞれ別個
に移植し、５００ｍｌ容振盪フラスコにて３０℃で振盪
培養し、経時的にサンプリングを行って、各培養液の成
分を分析した。発酵培地には、酵母エキス１ｇ／ｌ，Ｃ
ａＣＯ３１０ｇ／ｌ，基質が含まれ、基質としては、グ
ルコース１００ｇ／ｌ又はソルビトール１００ｇ／ｌ又
は、エタノール３０ｍｌ／ｌのうち一種類のみをそれぞ
れ単独で用いた。
【００７１】サンプリングした各培養液のグルコン酸、
酢酸の定量には、ベーリンガー山之内株式会社より購入
したＦ−キットをそれぞれ用いた。また、ソルボースの
定量には、下記液体クロマトグラフィー条件を用いた。 カラム：ＤＣ−６１３（ＳＨＯＤＥＸ） カラム温度：７０℃ 溶媒：アセトニトリル：水＝３：１ 溶媒流速：１．２ｍｌ／ｍｉｎ 検出器：島津ＲＩＤ−６Ａグルコノバクター サブオキシダンス ＩＦＯ ３２５
４，グルコノバクターサブオキシダンス ＩＦＯ ３２
５４（ｐＧＥＡ１），グルコノバクター サブオキシダ
ンス ＩＦＯ ３２５４（ｐＧＥＡＣ１）のそれぞれの
菌株について、酢酸比生成速度、グルコン酸比生成速
度、ソルボース比生成速度をそれぞれ表２に示した。各
発酵生成物の比生成速度は、乾燥重量１ｇの菌体が１時
間で生成する発酵生成物のグラム数を表している。
酢酸の定量には、ベーリンガー山之内株式会社より購入
したＦ−キットをそれぞれ用いた。また、ソルボースの
定量には、下記液体クロマトグラフィー条件を用いた。 カラム：ＤＣ−６１３（ＳＨＯＤＥＸ） カラム温度：７０℃ 溶媒：アセトニトリル：水＝３：１ 溶媒流速：１．２ｍｌ／ｍｉｎ 検出器：島津ＲＩＤ−６Ａグルコノバクター サブオキシダンス ＩＦＯ ３２５
４，グルコノバクターサブオキシダンス ＩＦＯ ３２
５４（ｐＧＥＡ１），グルコノバクター サブオキシダ
ンス ＩＦＯ ３２５４（ｐＧＥＡＣ１）のそれぞれの
菌株について、酢酸比生成速度、グルコン酸比生成速
度、ソルボース比生成速度をそれぞれ表２に示した。各
発酵生成物の比生成速度は、乾燥重量１ｇの菌体が１時
間で生成する発酵生成物のグラム数を表している。
【表１】
【表２】
【００７２】
【配列表】配列番号：１ 配列の長さ：１４７３ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ 起源 生物名：グルコノバクター サブオキシダンス（Ｇｌｕ
ｃｏｎｏｂａｃｔｅｒＳｕｂｏｘｙｄａｎｓ） 株 名：ＩＦＯ１２５２８ 配列の特徴 特徴を表す記号：ＣＤＳ 存在位置：１．．１４３７ 特徴を決定した方法：Ｅ 特徴を表す記号：ｓｉｇ ｐｅｐｔｉｄｅ 存在位置：１．．１０８ 特徴を決定した方法：Ｓ 特徴を表す記号：ｍａｔ ｐｅｐｔｉｄｅ 存在位置：１０９．．１４３７ 特徴を決定した方法：Ｓ 配列番号：２ 配列の長さ：１３ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 配列番号：３ 配列の長さ：１６ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 配列番号：４ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 ＧＣＡＴＴＡＴＴｉＣ ＣＣＣＡｉＣＣＴＴＴ ２０ ３０配列番号：５ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 ＧＣＡＴＴＡＴＴｉＣ ＣＣＣＡｉＣＣＣＴＴ ２０ 配列番号：６ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 ＧＣＡＴＴＧＴＴｉＣ ＣＣＣＡｉＣＣＴＴＴ ２０ 配列番号：７ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 ＧＣＡＴＴＧＴＴｉＣ ＣＣＣＡｉＣＣＣＴＴ ２０ 配列番号：８ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 ＧＣＧＴＴＡＴＴｉＣ ＣＣＣＡｉＣＣＴＴＴ ２０ 配列番号：９ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 ＧＣＧＴＴＡＴＴｉＣ ＣＣＣＡｉＣＣＣＴＴ ２０ 配列番号：１０ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 ＧＣＧＴＴＧＴＴｉＣ ＣＣＣＡｉＣＣＴＴＴ ２０ 配列番号：１１ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 ＧＣＧＴＴＧＴＴｉＣ ＣＣＣＡｉＣＣＣＴＴ ２０
ｃｏｎｏｂａｃｔｅｒＳｕｂｏｘｙｄａｎｓ） 株 名：ＩＦＯ１２５２８ 配列の特徴 特徴を表す記号：ＣＤＳ 存在位置：１．．１４３７ 特徴を決定した方法：Ｅ 特徴を表す記号：ｓｉｇ ｐｅｐｔｉｄｅ 存在位置：１．．１０８ 特徴を決定した方法：Ｓ 特徴を表す記号：ｍａｔ ｐｅｐｔｉｄｅ 存在位置：１０９．．１４３７ 特徴を決定した方法：Ｓ 配列番号：２ 配列の長さ：１３ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 配列番号：３ 配列の長さ：１６ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 配列番号：４ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 ＧＣＡＴＴＡＴＴｉＣ ＣＣＣＡｉＣＣＴＴＴ ２０ ３０配列番号：５ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 ＧＣＡＴＴＡＴＴｉＣ ＣＣＣＡｉＣＣＣＴＴ ２０ 配列番号：６ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 ＧＣＡＴＴＧＴＴｉＣ ＣＣＣＡｉＣＣＴＴＴ ２０ 配列番号：７ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 ＧＣＡＴＴＧＴＴｉＣ ＣＣＣＡｉＣＣＣＴＴ ２０ 配列番号：８ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 ＧＣＧＴＴＡＴＴｉＣ ＣＣＣＡｉＣＣＴＴＴ ２０ 配列番号：９ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 ＧＣＧＴＴＡＴＴｉＣ ＣＣＣＡｉＣＣＣＴＴ ２０ 配列番号：１０ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 ＧＣＧＴＴＧＴＴｉＣ ＣＣＣＡｉＣＣＴＴＴ ２０ 配列番号：１１ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 ＧＣＧＴＴＧＴＴｉＣ ＣＣＣＡｉＣＣＣＴＴ ２０
【００７３】
【発明の効果】本発明によれば、配列番号１に示された
アミノ酸配列をコードする塩基配列を有する遺伝子を含
むプラスミドを作製し、該プラスミドを保有する細胞を
育種し、該細胞を用いて酸化発酵を行うことにより、該
発酵の生産性を向上させることができる。
アミノ酸配列をコードする塩基配列を有する遺伝子を含
むプラスミドを作製し、該プラスミドを保有する細胞を
育種し、該細胞を用いて酸化発酵を行うことにより、該
発酵の生産性を向上させることができる。
【図１】約２．１ｋｂ ＨｉｎｄＩＩＩ−ＢｇｌＩＩ断
片の制限酵素地図である。尚、ｋｂは、キロベースを表
している。
片の制限酵素地図である。尚、ｋｂは、キロベースを表
している。
【図２】実施例の工程２−（２）におけるアルギニルエ
ンドペプチダーゼ限定加水分解ペプチドの同工程で示し
た液体クロマトグラフィー条件での生成物の分離パター
ンを示している。ペプチド分画Ｉに対応するピークが分
離パターン中のＩで示したピークであり、ペプチド分画
ＩＩに対応するピークが図中のＩＩで示したピークであ
る。
ンドペプチダーゼ限定加水分解ペプチドの同工程で示し
た液体クロマトグラフィー条件での生成物の分離パター
ンを示している。ペプチド分画Ｉに対応するピークが分
離パターン中のＩで示したピークであり、ペプチド分画
ＩＩに対応するピークが図中のＩＩで示したピークであ
る。
【図３】ｐＣＹＴ３の制限酵素地図である。尚、同図面
において、太い線は、チトクロムＣ−５５３（ＣＯ）の
全遺伝子を含む約２．７ｋｂのＤＮＡ断片を示し、細い
線は、大腸菌ベクターｐＨＳＧ２９８由来のＤＮＡ断片
を示す。
において、太い線は、チトクロムＣ−５５３（ＣＯ）の
全遺伝子を含む約２．７ｋｂのＤＮＡ断片を示し、細い
線は、大腸菌ベクターｐＨＳＧ２９８由来のＤＮＡ断片
を示す。
【図４】ｐＧＥＡ１の制限酵素地図である。尚、同図面
において、太い線は、グルコノバクター サブオキシダ
ンス ＩＦＯ ３１３０由来のプラスミド断片を示し、
細い線は大腸菌ベクターｐＵＣ１８由来のＤＡＮ断片を
示す。
において、太い線は、グルコノバクター サブオキシダ
ンス ＩＦＯ ３１３０由来のプラスミド断片を示し、
細い線は大腸菌ベクターｐＵＣ１８由来のＤＡＮ断片を
示す。
【図５】ｐＧＥＡＣ１の制限酵素地図である。尚、同図
面において、黒色の太い線はチトクロムＣ−５５３（Ｃ
Ｏ）の全遺伝子を含む約２．７ｋｂのＤＮＡ断片を示
し、白ぬきの太い線は、グルコノバクター サブオキシ
ダンス ＩＦＯ ３１３０由来のプラスミド断片を示
す。また、細い線は、大腸菌ベクターｐＵＣ１８由来の
ＤＮＡ断片を示す。図３、図４、および図５において、
ＢａｍＨＩ，ＥｃｏＲＩ，ＨｉｎｄＩＩＩ，ＰｓｔＩ，
ＳａｃＩ，ＳａｌＩ，ＳｍａＩ，ＳｐｈＩ，ＸｂａＩは
それぞれ制限酵素ＢａｍＨＩ，制限酵素ＥｃｏＲＩ，制
限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ，制限酵素ＰｓｔＩ，制限酵素Ｓ
ａｃＩ，制限酵素ＳａｌＩ，制限速度ＳｍａＩ，制限酵
素ＳｐｈＩ，制限酵素ＸｂａＩの切断部位を示す。図４
および図５において、ＳａｌＩ／ＸｈｏＩは、制限酵素
ＳａｌＩによって切断されて生じた切断末端と制限酵素
ＸｈｏＩによって切断されて生じた切断末端との接続部
位を示す。
面において、黒色の太い線はチトクロムＣ−５５３（Ｃ
Ｏ）の全遺伝子を含む約２．７ｋｂのＤＮＡ断片を示
し、白ぬきの太い線は、グルコノバクター サブオキシ
ダンス ＩＦＯ ３１３０由来のプラスミド断片を示
す。また、細い線は、大腸菌ベクターｐＵＣ１８由来の
ＤＮＡ断片を示す。図３、図４、および図５において、
ＢａｍＨＩ，ＥｃｏＲＩ，ＨｉｎｄＩＩＩ，ＰｓｔＩ，
ＳａｃＩ，ＳａｌＩ，ＳｍａＩ，ＳｐｈＩ，ＸｂａＩは
それぞれ制限酵素ＢａｍＨＩ，制限酵素ＥｃｏＲＩ，制
限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ，制限酵素ＰｓｔＩ，制限酵素Ｓ
ａｃＩ，制限酵素ＳａｌＩ，制限速度ＳｍａＩ，制限酵
素ＳｐｈＩ，制限酵素ＸｂａＩの切断部位を示す。図４
および図５において、ＳａｌＩ／ＸｈｏＩは、制限酵素
ＳａｌＩによって切断されて生じた切断末端と制限酵素
ＸｈｏＩによって切断されて生じた切断末端との接続部
位を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:01） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:01）
Claims (4)
- 【請求項１】配列番号１のアミノ酸配列をコードする塩
基配列を有していることを特徴とするＣ型チトクロム遺
伝子。 - 【請求項２】配列番号１のアミノ酸配列をコードする塩
基配列を有する遺伝子を含んでいることを特徴とするプ
ラスミド。 - 【請求項３】配列番号１のアミノ酸配列をコードする遺
伝子を含むプラスミドを保有していることを特徴とする
細胞。 - 【請求項４】配列番号１のアミノ酸配列をコードする塩
基配列を有する遣伝子を含むプラスミドを保有した細胞
を用いることを特徴とする酸化発酵法。
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP23857991A JPH0549480A (ja) | 1990-06-14 | 1991-06-14 | Ｃ型チトクロム遺伝子及び酸化発酵法 |
| FR9207131A FR2677665A1 (fr) | 1991-06-14 | 1992-06-12 | Plasmide contenant un gene d'un cytochrome specifique et procede de fermentation par oxydation. |
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2-154096 | 1990-06-14 | ||
| JP15409690 | 1990-06-14 | ||
| JP23857991A JPH0549480A (ja) | 1990-06-14 | 1991-06-14 | Ｃ型チトクロム遺伝子及び酸化発酵法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0549480A true JPH0549480A (ja) | 1993-03-02 |
Family
ID=26482509
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP23857991A Withdrawn JPH0549480A (ja) | 1990-06-14 | 1991-06-14 | Ｃ型チトクロム遺伝子及び酸化発酵法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0549480A (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1999020763A1 (fr) * | 1997-10-17 | 1999-04-29 | Fujisawa Pharmaceutical Co., Ltd. | D-sorbitol deshydrogenase, genes et utilisation de celle-ci |
| US6221439B1 (en) | 1996-07-18 | 2001-04-24 | Daimlerchrysler Ag | Method for applying a coating film on a three-dimensionally curved substrate |
-
1991
- 1991-06-14 JP JP23857991A patent/JPH0549480A/ja not_active Withdrawn
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6221439B1 (en) | 1996-07-18 | 2001-04-24 | Daimlerchrysler Ag | Method for applying a coating film on a three-dimensionally curved substrate |
| US6596390B1 (en) * | 1996-07-18 | 2003-07-22 | Daimlerchrysler Ag | Coating film for coating on a three-dimensionally curved substrate |
| WO1999020763A1 (fr) * | 1997-10-17 | 1999-04-29 | Fujisawa Pharmaceutical Co., Ltd. | D-sorbitol deshydrogenase, genes et utilisation de celle-ci |
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