JPH0549480A - C型チトクロム遺伝子及び酸化発酵法 - Google Patents
C型チトクロム遺伝子及び酸化発酵法Info
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- JPH0549480A JPH0549480A JP23857991A JP23857991A JPH0549480A JP H0549480 A JPH0549480 A JP H0549480A JP 23857991 A JP23857991 A JP 23857991A JP 23857991 A JP23857991 A JP 23857991A JP H0549480 A JPH0549480 A JP H0549480A
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Abstract
(57)【要約】
【構成】チトクロムC−553(CO)遺伝子を組み込
んだ新規プラスミドを得、さらに該プラスミドを導入し
て新規細胞を得て、該細胞を酸化発酵に用いる。 【効果】チトクロムC−553(CO)遺伝子を含むプ
ラスミドおよび該プラスミドを保有した細胞を利用して
酸化発酵を行うことにより、該発酵の生産性を向上させ
ることができる。
んだ新規プラスミドを得、さらに該プラスミドを導入し
て新規細胞を得て、該細胞を酸化発酵に用いる。 【効果】チトクロムC−553(CO)遺伝子を含むプ
ラスミドおよび該プラスミドを保有した細胞を利用して
酸化発酵を行うことにより、該発酵の生産性を向上させ
ることができる。
Description
【0001】
【産業上の利用分野】本発明は、C型チトクロム遺伝
子、該C型チトクロム遺伝子を含むプラスミド、該プラ
スミドを保有する細胞、および、該細胞を用いることを
特徴とする酸化発酵法に関する。
子、該C型チトクロム遺伝子を含むプラスミド、該プラ
スミドを保有する細胞、および、該細胞を用いることを
特徴とする酸化発酵法に関する。
【0002】
【従来の技術】酸化発酵においては、空気中の酸素を消
費しながら基質を不完全酸化して中間代謝産物を大量に
蓄積する。これは、有機化合物の生物変換における反応
の中でもっとも重要なものの一つである。この酸化発酵
を行う生物として、最もよく知られている生物の一つと
して、酢酸菌がある。この菌種における酸化反応は、主
に膜に結合した酵素によって行われていて、これらの酵
素や電子伝達系については、多くの研究が行われている
(飴山實、日本農芸化学会誌、第63巻、1185頁〜
1193頁、1988年)。酢酸菌の一種であるグルコ
ノバクター サブオキシダンスについては、特に詳細に
研究が進んでおり、細胞膜電子伝達鎖中のチトクロム成
分が、単離精製されている。これらのチトクロム成分と
しては、C型とO型のみが知られている。このO型は、
末端酸化酵素としてのチトクロムOであり、シアン感受
性で、ユビキノールオキシダーゼ活性があり、エネルギ
ー生成能を有する{Matsushita,K.et.
al.,Biochimica et Biophys
ica Acta 894,304−312(198
7)}。またC型チトクロムについては、チトクロムC
−553(CO){Matsushita,K.et.
al.,FEMS Microbiol.Lett.1
0,267−270(1981)},チトクロムC−5
51(CO){Ameyama M.et.al.,A
gric.Biol.Chem.51,2943−29
50(1987)}等が精製されている。一方、同菌種
の細胞膜電子伝達系には、シアンで阻害されやすい経路
の他に、シアンで阻害されにくいバイパスが存在してい
る事が示されている{Ameyama,M.et.a
l.,Agric.Biol.Chem.51,294
3−2950(1987)}。更に、このシアンで阻害
されにくく、エネルギー生成能をもたないバイパスに
は、C型チトクロムの一種であるチトクロムC−553
(CO)が深く関与している事が示されている{Mat
sushita,K.et.al.,Agric.Bi
ol.Chem.53,2895−2902(198
9)}。また、本チトクロムC−553(CO)の還元
型は、一酸化炭素と結合して553nm付近、522n
m付近、415nm付近にそれぞれα,β,γ吸収帯を
示し、酸素と反応する末端酸化酵素のような性質を有し
ている{Matsushita,K.et.al.,F
EMS Microbiol.Lett.10,267
−270(1981)}。これは、呼吸系に存在してチ
トクロムオキシダーゼやそれに準じる酵素に対する直接
の電子供与体となっているという一般的なC型チトクロ
ムの性質と異なっている。
費しながら基質を不完全酸化して中間代謝産物を大量に
蓄積する。これは、有機化合物の生物変換における反応
の中でもっとも重要なものの一つである。この酸化発酵
を行う生物として、最もよく知られている生物の一つと
して、酢酸菌がある。この菌種における酸化反応は、主
に膜に結合した酵素によって行われていて、これらの酵
素や電子伝達系については、多くの研究が行われている
(飴山實、日本農芸化学会誌、第63巻、1185頁〜
1193頁、1988年)。酢酸菌の一種であるグルコ
ノバクター サブオキシダンスについては、特に詳細に
研究が進んでおり、細胞膜電子伝達鎖中のチトクロム成
分が、単離精製されている。これらのチトクロム成分と
しては、C型とO型のみが知られている。このO型は、
末端酸化酵素としてのチトクロムOであり、シアン感受
性で、ユビキノールオキシダーゼ活性があり、エネルギ
ー生成能を有する{Matsushita,K.et.
al.,Biochimica et Biophys
ica Acta 894,304−312(198
7)}。またC型チトクロムについては、チトクロムC
−553(CO){Matsushita,K.et.
al.,FEMS Microbiol.Lett.1
0,267−270(1981)},チトクロムC−5
51(CO){Ameyama M.et.al.,A
gric.Biol.Chem.51,2943−29
50(1987)}等が精製されている。一方、同菌種
の細胞膜電子伝達系には、シアンで阻害されやすい経路
の他に、シアンで阻害されにくいバイパスが存在してい
る事が示されている{Ameyama,M.et.a
l.,Agric.Biol.Chem.51,294
3−2950(1987)}。更に、このシアンで阻害
されにくく、エネルギー生成能をもたないバイパスに
は、C型チトクロムの一種であるチトクロムC−553
(CO)が深く関与している事が示されている{Mat
sushita,K.et.al.,Agric.Bi
ol.Chem.53,2895−2902(198
9)}。また、本チトクロムC−553(CO)の還元
型は、一酸化炭素と結合して553nm付近、522n
m付近、415nm付近にそれぞれα,β,γ吸収帯を
示し、酸素と反応する末端酸化酵素のような性質を有し
ている{Matsushita,K.et.al.,F
EMS Microbiol.Lett.10,267
−270(1981)}。これは、呼吸系に存在してチ
トクロムオキシダーゼやそれに準じる酵素に対する直接
の電子供与体となっているという一般的なC型チトクロ
ムの性質と異なっている。
【0003】
【発明が解決しようとする課題】酸化発酵では、通常高
濃度の基質が酸化されるので、そこから出る電子は極め
て多いと考えられる。この多量の電子の流れが、全てチ
トクロムOを通過すれば、必要以上のエネルギーを生成
してしまい、生物にとって不都合になる可能性が高く、
逆にチトクロムOを流れる電子の流れを任意に強化する
ことは困難であると思われる。
濃度の基質が酸化されるので、そこから出る電子は極め
て多いと考えられる。この多量の電子の流れが、全てチ
トクロムOを通過すれば、必要以上のエネルギーを生成
してしまい、生物にとって不都合になる可能性が高く、
逆にチトクロムOを流れる電子の流れを任意に強化する
ことは困難であると思われる。
【0004】従って、酸化発酵の酸化能を強化する場
合、エネルギー生成能を持たない電子の流れを強化した
方が、任意に酸化能を強化できる可能性が高い。つま
り、シアンで阻害されにくくエネルギー生成能を持たな
い前述のバイパス経路を強化することが、酸化発酵能増
強に有効であると考えられる。
合、エネルギー生成能を持たない電子の流れを強化した
方が、任意に酸化能を強化できる可能性が高い。つま
り、シアンで阻害されにくくエネルギー生成能を持たな
い前述のバイパス経路を強化することが、酸化発酵能増
強に有効であると考えられる。
【0005】しかし、このバイパス経路に深く関与して
いるチトクロムC−553(CO)遺伝子を利用して、
このバイパス経路を活用する研究はなされていない。
いるチトクロムC−553(CO)遺伝子を利用して、
このバイパス経路を活用する研究はなされていない。
【0006】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、永年にわ
たり、チトクロムC−553(CO)遺伝子の単離の研
究を続けた結果、配列番号1に示されたアミノ酸配列を
コードする塩基配列を有していることを特徴とするC型
チトクロム遣伝子を単離し、配列番号1に示されたアミ
ノ酸配列をコードする塩基配列を有する遺伝子を含んで
いることを特徴とするプラスミドを作製し、配列番号1
に示されたアミノ酸をコードする塩基配列を有する遺伝
子を含むプラスミドを保有していることを特徴とする細
胞を育種し、配列番号1に示されたアミノ酸配列をコー
ドする塩基配列を有する遺伝子を含むプラスミドを保有
した細胞を用いることを特徴とする酸化発酵法を実施で
きるようにし、本発明を完成するに至った。
たり、チトクロムC−553(CO)遺伝子の単離の研
究を続けた結果、配列番号1に示されたアミノ酸配列を
コードする塩基配列を有していることを特徴とするC型
チトクロム遣伝子を単離し、配列番号1に示されたアミ
ノ酸配列をコードする塩基配列を有する遺伝子を含んで
いることを特徴とするプラスミドを作製し、配列番号1
に示されたアミノ酸をコードする塩基配列を有する遺伝
子を含むプラスミドを保有していることを特徴とする細
胞を育種し、配列番号1に示されたアミノ酸配列をコー
ドする塩基配列を有する遺伝子を含むプラスミドを保有
した細胞を用いることを特徴とする酸化発酵法を実施で
きるようにし、本発明を完成するに至った。
【0007】すなわち、本発明は、配列番号1のアミノ
酸配列をコードする塩基配列を有していることを特徴と
するC型チトクロム遺伝子配列番号1に示されたアミノ
酸配列をコードする塩基配列を有する遺伝子を含んでい
ることを特徴とするプラスミド、配列番号1に示された
アミノ酸をコードする塩基配列を有する遺伝子を含むプ
ラスミドを保有していることを特徴とする細胞、およ
び、配列番号1に示されたアミノ酸配列をコードする塩
基配列を有する遣伝子を含むプラスミドを保有した細胞
を用いることを特徴とする酸化発酵法である。
酸配列をコードする塩基配列を有していることを特徴と
するC型チトクロム遺伝子配列番号1に示されたアミノ
酸配列をコードする塩基配列を有する遺伝子を含んでい
ることを特徴とするプラスミド、配列番号1に示された
アミノ酸をコードする塩基配列を有する遺伝子を含むプ
ラスミドを保有していることを特徴とする細胞、およ
び、配列番号1に示されたアミノ酸配列をコードする塩
基配列を有する遣伝子を含むプラスミドを保有した細胞
を用いることを特徴とする酸化発酵法である。
【0008】チトクロムC−553(CO)は、FEM
S Microbiol.Lett.10,267−2
70(1981)に記載されたC型チトクロムであり、
分子量が約48000のヘムCを含む蛋白質である。チ
トクロムC−553(CO)は、グルコノバクター サ
ブオキシダンス IFO 12528に代表される一群
のチトクロムC−553(CO)生産能を有するグルコ
ノバクター属細菌によって生産される。このチトクロム
C−553(CO)遺伝子を含むDNA断片は、同チト
クロムC−553(CO)を生産するグルコノバクター
属細菌の保有する全DNAから単離することができる。
この全DNAの調製は、常法に従えばよいが、例えば、
日本生化学会編、生化学実験講座2、核酸の化学I、分
離精製、東京化学同人、1977年の方法等を用いて行
うこともできる。この全DNAから、例えば、実施例に
示されているような方法、すなわち、チトクロムC−5
53(CO)をコードする遺伝子に対するオリゴデオキ
シヌクレオチドプローブを合成し、同プローブを32P
で標識した後、同32P標識プローブのハイブリダイゼ
イションを利用し、目的の遺伝子を含むクローンを選択
する方法、等によりチトクロムC−553(CO)遺伝
子を含むDNA断片を単離することができる。
S Microbiol.Lett.10,267−2
70(1981)に記載されたC型チトクロムであり、
分子量が約48000のヘムCを含む蛋白質である。チ
トクロムC−553(CO)は、グルコノバクター サ
ブオキシダンス IFO 12528に代表される一群
のチトクロムC−553(CO)生産能を有するグルコ
ノバクター属細菌によって生産される。このチトクロム
C−553(CO)遺伝子を含むDNA断片は、同チト
クロムC−553(CO)を生産するグルコノバクター
属細菌の保有する全DNAから単離することができる。
この全DNAの調製は、常法に従えばよいが、例えば、
日本生化学会編、生化学実験講座2、核酸の化学I、分
離精製、東京化学同人、1977年の方法等を用いて行
うこともできる。この全DNAから、例えば、実施例に
示されているような方法、すなわち、チトクロムC−5
53(CO)をコードする遺伝子に対するオリゴデオキ
シヌクレオチドプローブを合成し、同プローブを32P
で標識した後、同32P標識プローブのハイブリダイゼ
イションを利用し、目的の遺伝子を含むクローンを選択
する方法、等によりチトクロムC−553(CO)遺伝
子を含むDNA断片を単離することができる。
【0009】このチトクロムC−553(CO)に対す
るオリゴデオキシヌクレオチドプローブは、精製された
チトクロムC−553(CO)の部分アミノ酸配列をも
とにして、例えば、アプライドバイオシステム社のDN
A合成機モデル380A等のDNA合成機を用いたり、
日本生化学会論、続生化学実験講座I、遺伝研究法I、
核酸の化学と分析技術、東京化学同人1986年に記載
された方法等を用いることにより、化学合成することが
できる。
るオリゴデオキシヌクレオチドプローブは、精製された
チトクロムC−553(CO)の部分アミノ酸配列をも
とにして、例えば、アプライドバイオシステム社のDN
A合成機モデル380A等のDNA合成機を用いたり、
日本生化学会論、続生化学実験講座I、遺伝研究法I、
核酸の化学と分析技術、東京化学同人1986年に記載
された方法等を用いることにより、化学合成することが
できる。
【0010】精製チトクロムC−553(CO)は、こ
のチトクロムC−553(CO)を生産している生物よ
り単離精製することができる。例えば、グルコノバクタ
ーサブオキシダンス IFO 12528から、Mat
sushita,K.et.al.,FEMS Mic
robiol.Lett.10,267−270(19
81)に示された方法に従い、対数増殖期後期の菌体か
らフレンチプレスで破砕して膜画分を集め、0.2%ト
リトンX−100で可溶化し、DEAE−セルロースや
CM−セルロースを用いたカラムクロマトグラフィーを
行って、精製チトクロムC−553(CO)を取得する
ことができる。
のチトクロムC−553(CO)を生産している生物よ
り単離精製することができる。例えば、グルコノバクタ
ーサブオキシダンス IFO 12528から、Mat
sushita,K.et.al.,FEMS Mic
robiol.Lett.10,267−270(19
81)に示された方法に従い、対数増殖期後期の菌体か
らフレンチプレスで破砕して膜画分を集め、0.2%ト
リトンX−100で可溶化し、DEAE−セルロースや
CM−セルロースを用いたカラムクロマトグラフィーを
行って、精製チトクロムC−553(CO)を取得する
ことができる。
【0011】精製チトクロムC−553(CO)の部分
アミノ酸配列は、臭化シアンやアルギニルエンドペプチ
ダーゼ等により限定分解を行い、得られた限定分解ペプ
チドを、例えば液体クロマトグラフィー等で単離精製し
た後、例えばエドマン分解法、日本生化学会編、生化学
実験講座I、蛋白質の化学II、一次構造決定法、東京
化学同人 1976年、等により、アミノ酸配列を決定
することができる。また、精製チトクロムC−553
(CO)のN末端アミノ酸配列やC末端アミノ酸配列を
利用してもよい。
アミノ酸配列は、臭化シアンやアルギニルエンドペプチ
ダーゼ等により限定分解を行い、得られた限定分解ペプ
チドを、例えば液体クロマトグラフィー等で単離精製し
た後、例えばエドマン分解法、日本生化学会編、生化学
実験講座I、蛋白質の化学II、一次構造決定法、東京
化学同人 1976年、等により、アミノ酸配列を決定
することができる。また、精製チトクロムC−553
(CO)のN末端アミノ酸配列やC末端アミノ酸配列を
利用してもよい。
【0012】本発明においてIFO番号の付された微生
物は、財団法人発酵研究所発行のリスト・オブ・カルチ
ャーズ1988年第8版(Institute for
Fermentation Osaka List
of Cultures 1988 eighth e
dition)に収載されており、該発酵研究所から入
手することができる。
物は、財団法人発酵研究所発行のリスト・オブ・カルチ
ャーズ1988年第8版(Institute for
Fermentation Osaka List
of Cultures 1988 eighth e
dition)に収載されており、該発酵研究所から入
手することができる。
【0013】ジーンバンクの作製には、全DNAを適当
な制限酵素で切断したものと、切断したDNA断片と連
結可能な制限酵素切断末端を生じる制限酵素で切断した
ベクターとをT4DNAリガーゼにより連結し、その連
結物により大腸菌宿主を形質転換する。このベクターと
しては、例えばpUC18,pCU19,M13mp1
8RF,M13mp19RF等の大腸菌のベクターを用
いることができる。大腸菌の形質転換法は、常法に従え
ばよいが、なるべく遺伝子導入効率の高い形質転換法、
例えば、Hanahan,D.J.Mol.Biol.
166,557−580(1983)に準じて行うこと
が好ましい。得られた形質転換株の中から目的とする遺
伝子を保有する株を検出するためには、放射性又は蛍光
性の標識をもったプローブを用いて、例えばコロニーハ
イブリダイゼイション又はプラークハイブリダイゼイシ
ョン等の手法{T.Maniatis et al.,
Molecular Clonig A Labora
try Manual,Cold Spring Ha
rbor Laboratry(1982)}により、
目的とするDNA断片を保有する菌株を得ることができ
る。単離したDNA断片に一部の遺伝子しか含まれてい
ない場合には、既に得られている遺伝子をプローブとし
て前記と同様なハイブリダイゼイションの手法により、
目的のDNA断片を単離することによって、目的遺伝子
全体を得ることができる。
な制限酵素で切断したものと、切断したDNA断片と連
結可能な制限酵素切断末端を生じる制限酵素で切断した
ベクターとをT4DNAリガーゼにより連結し、その連
結物により大腸菌宿主を形質転換する。このベクターと
しては、例えばpUC18,pCU19,M13mp1
8RF,M13mp19RF等の大腸菌のベクターを用
いることができる。大腸菌の形質転換法は、常法に従え
ばよいが、なるべく遺伝子導入効率の高い形質転換法、
例えば、Hanahan,D.J.Mol.Biol.
166,557−580(1983)に準じて行うこと
が好ましい。得られた形質転換株の中から目的とする遺
伝子を保有する株を検出するためには、放射性又は蛍光
性の標識をもったプローブを用いて、例えばコロニーハ
イブリダイゼイション又はプラークハイブリダイゼイシ
ョン等の手法{T.Maniatis et al.,
Molecular Clonig A Labora
try Manual,Cold Spring Ha
rbor Laboratry(1982)}により、
目的とするDNA断片を保有する菌株を得ることができ
る。単離したDNA断片に一部の遺伝子しか含まれてい
ない場合には、既に得られている遺伝子をプローブとし
て前記と同様なハイブリダイゼイションの手法により、
目的のDNA断片を単離することによって、目的遺伝子
全体を得ることができる。
【0014】このようにして単離したチトクロムC−5
53(CO)の構造遺伝子を含むDNA断片を用いて、
同構造遺伝子産物を生成させるためには、同構造遺伝子
を含むDNA断片を宿主内でプロモーター活性を有する
遺伝子とを発現可能な状態で連結する必要がある。グル
コノバクター属やアセトバクター属の微生物内で、この
新たに移入した構造遺伝子を発現させるために用いるプ
ロモーターとしては、チトクロムC−553(CO)遺
伝子本来のプロモーターも使用できるが、酢酸菌由来の
他のプロモーター活性を有する遺伝子や同宿主内で発現
可能な他の微生物由来のプロモーター活性を有する遺伝
子も使用できる。他の微生物由来のプロモーターとして
は、例えば、大腸菌プラスミドpBR322のアンピシ
リン耐性遺伝子やpACYC177のカナマイシン耐性
遺伝子のプロモーター等が挙げられる。過剰に、同構造
遺伝子産物が生成されて宿主の生育等に影響を及ぼす場
合には、遺伝子の発現を制御するために、適当なプロモ
ーターを選択する必要がある。遺伝子発現の結果、分子
量の異なる蛋白質が生成される可能性もあるが、チトク
ロムC−553(CO)本来の機能を有していれば、同
蛋白質を利用することは可能である。
53(CO)の構造遺伝子を含むDNA断片を用いて、
同構造遺伝子産物を生成させるためには、同構造遺伝子
を含むDNA断片を宿主内でプロモーター活性を有する
遺伝子とを発現可能な状態で連結する必要がある。グル
コノバクター属やアセトバクター属の微生物内で、この
新たに移入した構造遺伝子を発現させるために用いるプ
ロモーターとしては、チトクロムC−553(CO)遺
伝子本来のプロモーターも使用できるが、酢酸菌由来の
他のプロモーター活性を有する遺伝子や同宿主内で発現
可能な他の微生物由来のプロモーター活性を有する遺伝
子も使用できる。他の微生物由来のプロモーターとして
は、例えば、大腸菌プラスミドpBR322のアンピシ
リン耐性遺伝子やpACYC177のカナマイシン耐性
遺伝子のプロモーター等が挙げられる。過剰に、同構造
遺伝子産物が生成されて宿主の生育等に影響を及ぼす場
合には、遺伝子の発現を制御するために、適当なプロモ
ーターを選択する必要がある。遺伝子発現の結果、分子
量の異なる蛋白質が生成される可能性もあるが、チトク
ロムC−553(CO)本来の機能を有していれば、同
蛋白質を利用することは可能である。
【0015】チトクロムC−553(CO)遺伝子を発
現させる宿主として、酢酸菌、大腸菌、枯草菌など遺伝
子操作が可能なものであれば、それぞれの宿主内でプロ
モーター活性を有する遺伝子と発現可能な状態で連結し
て使用することができる。この場合使用するベクターと
しては、例えば、酢酸菌ではpMG101、大腸菌では
pBR325、枯草菌ではpUB110等が挙げられ
る。また、酢酸菌、大腸菌等複数の宿主で使用可能なシ
ャトルベクターを用いることもできる。
現させる宿主として、酢酸菌、大腸菌、枯草菌など遺伝
子操作が可能なものであれば、それぞれの宿主内でプロ
モーター活性を有する遺伝子と発現可能な状態で連結し
て使用することができる。この場合使用するベクターと
しては、例えば、酢酸菌ではpMG101、大腸菌では
pBR325、枯草菌ではpUB110等が挙げられ
る。また、酢酸菌、大腸菌等複数の宿主で使用可能なシ
ャトルベクターを用いることもできる。
【0016】遺伝子において、突然変異や遺伝子操作等
によって変化が生じても、その遺伝子産物が生成され存
在することによって酸化発酵の生産性を向上させる機能
を有していれば、変化したC型チトクロム遺伝子を用い
ても、本発明のプラスミド及び該プラスミドを保有した
細胞及び該細胞を用いた酸化発酵法に含まれる。
によって変化が生じても、その遺伝子産物が生成され存
在することによって酸化発酵の生産性を向上させる機能
を有していれば、変化したC型チトクロム遺伝子を用い
ても、本発明のプラスミド及び該プラスミドを保有した
細胞及び該細胞を用いた酸化発酵法に含まれる。
【0017】酸化発酵とは、微生物により空気中の酸素
を消費しながら基質の不完全酸化で中間代謝産物を大量
に蓄積することで、化合物の微生物変換の一つである。
例えば、エタノールから酢酸が生成される酢酸発酵、グ
ルコースからグルコン酸が生成されるグルコン酸発酵、
ソルビトールからソルボースが生成されるソルボース発
酵、グリセリンからジヒドロキシアセトンが生成される
ジヒドロキシアセトン発酵、グルコースから2−ケトグ
ルコン酸、5−ケトグルコン酸、2,5−ジケトグルコ
ン酸及び種々の有機酸が生成される発酵が知られてい
る。また、多段階の反応を経て構造の著しく異なる物質
を生成する場合であっても、本発明に示しした方法によ
り発酵微生物を改良して発酵生成物の生産性を改善した
場合は、本発明の酸化発酵に含まれる。
を消費しながら基質の不完全酸化で中間代謝産物を大量
に蓄積することで、化合物の微生物変換の一つである。
例えば、エタノールから酢酸が生成される酢酸発酵、グ
ルコースからグルコン酸が生成されるグルコン酸発酵、
ソルビトールからソルボースが生成されるソルボース発
酵、グリセリンからジヒドロキシアセトンが生成される
ジヒドロキシアセトン発酵、グルコースから2−ケトグ
ルコン酸、5−ケトグルコン酸、2,5−ジケトグルコ
ン酸及び種々の有機酸が生成される発酵が知られてい
る。また、多段階の反応を経て構造の著しく異なる物質
を生成する場合であっても、本発明に示しした方法によ
り発酵微生物を改良して発酵生成物の生産性を改善した
場合は、本発明の酸化発酵に含まれる。
【0018】
【実施例】以下、実施例により本発明を詳述するが、本
発明は、本実施例によって限定されるものではない。本
実施例において、遺伝子操作に関する一般的な技法は、
T.Maniatis et al.,Molecul
ar cloning ALaboratory Ma
nual,Cold Spring Harbor L
aboratory 1982に準じた。
発明は、本実施例によって限定されるものではない。本
実施例において、遺伝子操作に関する一般的な技法は、
T.Maniatis et al.,Molecul
ar cloning ALaboratory Ma
nual,Cold Spring Harbor L
aboratory 1982に準じた。
【0019】工程1 チトクロムC−553(CO)精製 (1)グルコノバクター サブオキシダンス IFO
12528の培養工程 グルコン酸ナトリウム2%(w/v)、グルコース0.
5%(w/v)、グルセリン0.3%(w/v)、酵母
エキス0.3%(w/v)、ポリペプトン0.2%(w
/v)、ポテトエクストラクト20%(v/v)の組成
の培地(pH6.5)100mlを500mlの容振盪
フラスコに分注し、常法にしたがって滅菌後、グルコノ
バクター サブオキシダンス IFO 12528の斜
面培養物からその一白金耳を埴菌し、30℃で25時間
振盪培養した。同培養液1.5lを301の培地(上記
培地よりポテト・エクストラクトを除いた培地)に入れ
た。501容ジャーファーメンターで、温度30℃、通
気1vvm、撹拌500rpmで、24時間培養した。
12528の培養工程 グルコン酸ナトリウム2%(w/v)、グルコース0.
5%(w/v)、グルセリン0.3%(w/v)、酵母
エキス0.3%(w/v)、ポリペプトン0.2%(w
/v)、ポテトエクストラクト20%(v/v)の組成
の培地(pH6.5)100mlを500mlの容振盪
フラスコに分注し、常法にしたがって滅菌後、グルコノ
バクター サブオキシダンス IFO 12528の斜
面培養物からその一白金耳を埴菌し、30℃で25時間
振盪培養した。同培養液1.5lを301の培地(上記
培地よりポテト・エクストラクトを除いた培地)に入れ
た。501容ジャーファーメンターで、温度30℃、通
気1vvm、撹拌500rpmで、24時間培養した。
【0020】(2)膜画分調製工程 前記工程1−(1)培養工程により得られた培養液(3
01)から集められた湿菌体(110g)を、冷蒸留水
で2回洗浄後、0.01Mリン酸緩衝液(pH6.0)
に懸濁した。同懸濁液フレンチプレス(20000ps
i)に供し、菌体を破砕し、5000g、10分間の遠
心分離により、無細胞抽出液を得た。この抽出液を、1
30000g、60分の超遠心分離を行い、沈殿区分を
膜画分とした。
01)から集められた湿菌体(110g)を、冷蒸留水
で2回洗浄後、0.01Mリン酸緩衝液(pH6.0)
に懸濁した。同懸濁液フレンチプレス(20000ps
i)に供し、菌体を破砕し、5000g、10分間の遠
心分離により、無細胞抽出液を得た。この抽出液を、1
30000g、60分の超遠心分離を行い、沈殿区分を
膜画分とした。
【0021】(3)可溶化工程 前記工程1−(2)で得られた膜画分を蛋白質濃度10
mg/mlとなるように、0.01Mリン酸緩衝液(p
H6.0)に懸濁ののち、0.2%濃度となるようにト
リトンX−100を添加して、0℃で30分間撹拌し
た。得られた液を、68000g、90分間の超遠心分
離を行い、上清区分を可溶化画分とした。
mg/mlとなるように、0.01Mリン酸緩衝液(p
H6.0)に懸濁ののち、0.2%濃度となるようにト
リトンX−100を添加して、0℃で30分間撹拌し
た。得られた液を、68000g、90分間の超遠心分
離を行い、上清区分を可溶化画分とした。
【0022】(4)DEAE−セルロースカラム工程 前記工程1−(3)で得られた可溶化画分(210m
l)を、0.1%トリトンX−100を含む0.01M
リン酸緩衝液(pH6.0)で平衡化したDEAE−セ
ルロースカラム(2.5×22cm)にチャージしたの
ち、同リン酸緩衝液での洗浄後、0.1%トリトンX−
100を含む0.03Mリン酸緩衝液(pH6.0)で
溶出した。溶出液を18ml毎に分画し、得られた分画
について、OD420とアルコールデヒドロゲナーゼ活
性の測定を行った。アルコールデヒドロゲナーゼ活性
は、次のように測定した。先づ0.1mlの1Mエタノ
ール水溶液、0.1mlのサンプル及び0.6mlの5
0mMリン酸緩衝液(pH6.0)を混合し、25℃で
5分間置いた後、0.2mlの0.1Mフェリシアン化
カリウム水溶液を添加撹拌の後25℃で反応を行った。
硫酸第二鉄−デュパノール試薬{Fe2(SO4)3・
xH2O 5g、ドデシル硫酸ナトリウム3g、85%
リン酸 95mlを蒸留水で溶解して11とする。}
を、5分後に0.5ml添加して反応を停止させた。2
5℃で30分置いた後、蒸留水3.5mlを添加し、撹
拌の後OD660を測定した。測定の結果、OD420
の値が高く、アルコールデヒドロゲナーゼ活性の低い画
分を、チトクロムC−553(CO)とした。次に得ら
れた同画分を、限外濾過膜(TOYO UP−20)に
より10倍濃縮した後、0.01M酢酸緩衝液(pH
5.0)に対して一晩透析した。
l)を、0.1%トリトンX−100を含む0.01M
リン酸緩衝液(pH6.0)で平衡化したDEAE−セ
ルロースカラム(2.5×22cm)にチャージしたの
ち、同リン酸緩衝液での洗浄後、0.1%トリトンX−
100を含む0.03Mリン酸緩衝液(pH6.0)で
溶出した。溶出液を18ml毎に分画し、得られた分画
について、OD420とアルコールデヒドロゲナーゼ活
性の測定を行った。アルコールデヒドロゲナーゼ活性
は、次のように測定した。先づ0.1mlの1Mエタノ
ール水溶液、0.1mlのサンプル及び0.6mlの5
0mMリン酸緩衝液(pH6.0)を混合し、25℃で
5分間置いた後、0.2mlの0.1Mフェリシアン化
カリウム水溶液を添加撹拌の後25℃で反応を行った。
硫酸第二鉄−デュパノール試薬{Fe2(SO4)3・
xH2O 5g、ドデシル硫酸ナトリウム3g、85%
リン酸 95mlを蒸留水で溶解して11とする。}
を、5分後に0.5ml添加して反応を停止させた。2
5℃で30分置いた後、蒸留水3.5mlを添加し、撹
拌の後OD660を測定した。測定の結果、OD420
の値が高く、アルコールデヒドロゲナーゼ活性の低い画
分を、チトクロムC−553(CO)とした。次に得ら
れた同画分を、限外濾過膜(TOYO UP−20)に
より10倍濃縮した後、0.01M酢酸緩衝液(pH
5.0)に対して一晩透析した。
【0023】(5)CM−セルロースカラム工程 前記工程1−(4)で得られた透析終了液を、0.1%
トリトンX−100を含む0.01M酢酸緩衝液(pH
5.0)で平衡化したCM−セルロースカラム(1.5
×7.5cm)にチャージしたのち、同酢酸緩衝液(p
H5.0)での洗浄後、0.1%トリトンX−100を
含む0.04M酢酸緩衝液で溶出した。OD420の測
定により、チトクロムC−553(CO)画分(蛋白質
量濃度0.48mg/ml、液量10.5ml)を得
た。蛋白質の測定には、改良ローリー法{J.R.Du
lley and P.A.Grieve.Anal.
Biochem.,64,136−141(197
5)}を用いた。なお、同測定の標準物質は牛血清アル
ブミンとした。
トリトンX−100を含む0.01M酢酸緩衝液(pH
5.0)で平衡化したCM−セルロースカラム(1.5
×7.5cm)にチャージしたのち、同酢酸緩衝液(p
H5.0)での洗浄後、0.1%トリトンX−100を
含む0.04M酢酸緩衝液で溶出した。OD420の測
定により、チトクロムC−553(CO)画分(蛋白質
量濃度0.48mg/ml、液量10.5ml)を得
た。蛋白質の測定には、改良ローリー法{J.R.Du
lley and P.A.Grieve.Anal.
Biochem.,64,136−141(197
5)}を用いた。なお、同測定の標準物質は牛血清アル
ブミンとした。
【0024】工程2 チトクロムC−553(CO)の部分アミノ酸配列の決
定 (1)アルギニルエンドペプチターゼによる限定加水分
解 前記工程1−(5)より得たチトクロムC−553(C
O)画分700μlの緩衝液置換を、セントリコン10
(アミコン社製)により行った後、アルギニルエンドペ
プチターゼ(宝酒造株式会社製)処理を、反応液220
μl{50mMTris・HCl(pH8.0),2μ
gアルギニルエンドペプチターゼ}中で、37℃にて1
8時間行った。
定 (1)アルギニルエンドペプチターゼによる限定加水分
解 前記工程1−(5)より得たチトクロムC−553(C
O)画分700μlの緩衝液置換を、セントリコン10
(アミコン社製)により行った後、アルギニルエンドペ
プチターゼ(宝酒造株式会社製)処理を、反応液220
μl{50mMTris・HCl(pH8.0),2μ
gアルギニルエンドペプチターゼ}中で、37℃にて1
8時間行った。
【0025】(2)限定加水分解ペプチドの単離 前記工程2−(1)で得られたアルギニルエンドペプチ
ターゼ反応液200μlについて、下記液体クロマトグ
ラフィー条件により、アルギニルエンドペプチターゼ限
定加水分解ペプチドを、2種類(ペプチド分画I、ペプ
チド分画II)分画した。 (液体クロマトグラフィー条件) カラム:半井化学コスモシール 5C4−300パック
ドカラム 溶媒:0.1%トリフルオロ酢酸を含有したアセトニト
リル−水混合溶媒。同混合溶媒において、アセトニトリ
ル濃度を、10%から74%まで変化させた。 溶媒流速:0.8ml/分 検出:UV280nm
ターゼ反応液200μlについて、下記液体クロマトグ
ラフィー条件により、アルギニルエンドペプチターゼ限
定加水分解ペプチドを、2種類(ペプチド分画I、ペプ
チド分画II)分画した。 (液体クロマトグラフィー条件) カラム:半井化学コスモシール 5C4−300パック
ドカラム 溶媒:0.1%トリフルオロ酢酸を含有したアセトニト
リル−水混合溶媒。同混合溶媒において、アセトニトリ
ル濃度を、10%から74%まで変化させた。 溶媒流速:0.8ml/分 検出:UV280nm
【0026】(3)限定加水分解ペプチドのアミノ酸配
列の決定 前記工程2−(2)で得られたペプチド分画I、ペプチ
ド分画IIにそれぞれ含まれているペプチドのアミノ酸
配列は、アプライドバイオシステム社の気相プロテイン
シーケンサー モデル470Aにより、分析した。その
結果、ペプチド分画I、ペプチド分画IIにそれぞれ含
まれていた限定加水分解ペプチドI及び限定加水分解ペ
プチドIIのそれぞれのN末端アミノ酸配列が、配列番
号2,3のアミノ酸配列であることが明らかとなった。
列の決定 前記工程2−(2)で得られたペプチド分画I、ペプチ
ド分画IIにそれぞれ含まれているペプチドのアミノ酸
配列は、アプライドバイオシステム社の気相プロテイン
シーケンサー モデル470Aにより、分析した。その
結果、ペプチド分画I、ペプチド分画IIにそれぞれ含
まれていた限定加水分解ペプチドI及び限定加水分解ペ
プチドIIのそれぞれのN末端アミノ酸配列が、配列番
号2,3のアミノ酸配列であることが明らかとなった。
【0027】工程3 オリゴデオキシヌクレオチドプローブの合成 前記工程2−(3)でN末端アミノ酸配列が明らかとな
った限定加水分解ペプチドIの部分アミノ酸配列(Ly
s−Gly−Trp−Gly−Asn−Asn−Al
a)をもとにした下記に示したオリゴデオキシヌクレオ
チドを、チトクロムC−553(CO)遺伝子のクロー
ニングのためのプローブとした。下記に示した塩基配列
を有する8種類のオリゴデオキシヌクレオチド(配列番
号4から配列番号11)の混合物を、アプライドバイオ
システム社のDNA合成機モデル380Aを用いて合成
した。アプライドバイオシステム社のプロトコールに従
い、高速液体クロマトグラフィーで2回の精製を行い、
約100μgを回収した。
った限定加水分解ペプチドIの部分アミノ酸配列(Ly
s−Gly−Trp−Gly−Asn−Asn−Al
a)をもとにした下記に示したオリゴデオキシヌクレオ
チドを、チトクロムC−553(CO)遺伝子のクロー
ニングのためのプローブとした。下記に示した塩基配列
を有する8種類のオリゴデオキシヌクレオチド(配列番
号4から配列番号11)の混合物を、アプライドバイオ
システム社のDNA合成機モデル380Aを用いて合成
した。アプライドバイオシステム社のプロトコールに従
い、高速液体クロマトグラフィーで2回の精製を行い、
約100μgを回収した。
【0028】(オリゴデオキシヌクレオチドの塩基配
列) a.5’−GCATTATTICCCCAICCTTT
−3’、 b.5’−GCATTATTICCCCAICCCTT
−3’、 c.5’−GCATTGTTICCCCAICCTTT
−3’、 d.5’−GCATTGTTICCCCAICCCTT
−3’、 e.5’−GCGTTATTICCCCAICCTTT
−3’、 f.5’−GCGTTATTICCCCAICCCTT
−3’、 g.5’−GCGTTGTTICCCCAICCTTT
−3’及び h.5’−GCGTTGTTICCCCAICCCTT
−3’。 (上記オリゴタクレオチドの塩基配列において、 A:デオキシアデニル酸、 C:デオキシシチジル酸、 G:デオキシグアニル酸、 T:チミジル酸、 I:デオキシイノシン酸 残基をそれぞれ示している。)
列) a.5’−GCATTATTICCCCAICCTTT
−3’、 b.5’−GCATTATTICCCCAICCCTT
−3’、 c.5’−GCATTGTTICCCCAICCTTT
−3’、 d.5’−GCATTGTTICCCCAICCCTT
−3’、 e.5’−GCGTTATTICCCCAICCTTT
−3’、 f.5’−GCGTTATTICCCCAICCCTT
−3’、 g.5’−GCGTTGTTICCCCAICCTTT
−3’及び h.5’−GCGTTGTTICCCCAICCCTT
−3’。 (上記オリゴタクレオチドの塩基配列において、 A:デオキシアデニル酸、 C:デオキシシチジル酸、 G:デオキシグアニル酸、 T:チミジル酸、 I:デオキシイノシン酸 残基をそれぞれ示している。)
【0029】工程4 チトクロムC−553(CO)遺伝子を含むDNA断片
の単離 ソルトビール50g/l、酵母エキス10g/l、ペプ
トン5g/l、炭酸カルシウム3g/lの組成の培地1
00mlを500ml容振盪フラスコに分注し、常法に
したがって滅菌後、グルコノバクター サブオキシダン
ス IFO 12528の斜面培養物からその一白金耳
を植菌し、30℃で2日間培養した。同培養液1.5l
より湿菌体2.7gを集菌し、無菌水で清浄後、25m
MTris・HCl(pH8.0)、50mM EDT
Aの緩衝液32mlに懸濁した。同懸濁液に、リゾチウ
ム液(40mg/ml)を0.8ml添加撹拌し、37
℃で1時間の後、プロナーゼ液(2mg/ml)を4m
l添加撹拌した。室温で15分間置いた後、10%のド
デシル硫酸ナトリウム液4ml添加撹拌後、37℃で1
時間反応させた。更に55℃で10分間加熱した後同反
応液に、50mMTris.HCl(pH8.0)、5
mM EDTA、100mM塩化ナトリウム緩衝液で飽
和させたフェノール40mlを添加し、10分間抽出し
た後、遠心分離により上層液を分離した。上記の緩衝液
飽和フェノール・クロロホルム(1:1)40mlで5
分間抽出した後、遠心分離により上層液を分離した。同
操作を更にもう一度実施しした後、得られた上層液に、
最終濃度40μg/mlになるようにRNaseを添加
し、撹拌の後37℃で一時間反応させた。同反応液35
mlに7mlの5M塩化ナトリウム水溶液と8.75m
lの50%(w/v)ポリエチレングリコール6000
水溶液とを添加し、撹拌の後、DNA沈澱をガラス棒で
まき取った。得られたDNA沈澱を、70%エタノール
で洗浄の後、1mM Tris.HCl(pH8.
0)、0.1mM EDTAの緩衝液10mlに溶解し
た。同DNA液に、1mlの3M酢酸ナトリウム水溶液
と24mlの冷エタノールとを添加してDNAを沈澱さ
せた。このDNA沈澱をガラス棒でまきとり70%エタ
ノールで洗浄した後、1mM Tris・HCl(pH
8.0)、0.1mM EDTAの緩衝液5mlに溶解
した。OD260の測定により、同液のDNA濃度は、
0.6mg/mlであった。
の単離 ソルトビール50g/l、酵母エキス10g/l、ペプ
トン5g/l、炭酸カルシウム3g/lの組成の培地1
00mlを500ml容振盪フラスコに分注し、常法に
したがって滅菌後、グルコノバクター サブオキシダン
ス IFO 12528の斜面培養物からその一白金耳
を植菌し、30℃で2日間培養した。同培養液1.5l
より湿菌体2.7gを集菌し、無菌水で清浄後、25m
MTris・HCl(pH8.0)、50mM EDT
Aの緩衝液32mlに懸濁した。同懸濁液に、リゾチウ
ム液(40mg/ml)を0.8ml添加撹拌し、37
℃で1時間の後、プロナーゼ液(2mg/ml)を4m
l添加撹拌した。室温で15分間置いた後、10%のド
デシル硫酸ナトリウム液4ml添加撹拌後、37℃で1
時間反応させた。更に55℃で10分間加熱した後同反
応液に、50mMTris.HCl(pH8.0)、5
mM EDTA、100mM塩化ナトリウム緩衝液で飽
和させたフェノール40mlを添加し、10分間抽出し
た後、遠心分離により上層液を分離した。上記の緩衝液
飽和フェノール・クロロホルム(1:1)40mlで5
分間抽出した後、遠心分離により上層液を分離した。同
操作を更にもう一度実施しした後、得られた上層液に、
最終濃度40μg/mlになるようにRNaseを添加
し、撹拌の後37℃で一時間反応させた。同反応液35
mlに7mlの5M塩化ナトリウム水溶液と8.75m
lの50%(w/v)ポリエチレングリコール6000
水溶液とを添加し、撹拌の後、DNA沈澱をガラス棒で
まき取った。得られたDNA沈澱を、70%エタノール
で洗浄の後、1mM Tris.HCl(pH8.
0)、0.1mM EDTAの緩衝液10mlに溶解し
た。同DNA液に、1mlの3M酢酸ナトリウム水溶液
と24mlの冷エタノールとを添加してDNAを沈澱さ
せた。このDNA沈澱をガラス棒でまきとり70%エタ
ノールで洗浄した後、1mM Tris・HCl(pH
8.0)、0.1mM EDTAの緩衝液5mlに溶解
した。OD260の測定により、同液のDNA濃度は、
0.6mg/mlであった。
【0030】この調製した全DNAを制限酵素EcoR
I(宝酒造株式会社製)で切断後、1%アガロースゲル
電気泳動を行い、約1kbから約2kbのDNA断片を
含むアガロースゲルを切り出した。これをフナコシ社よ
り購入したジーンクリーン(GENECLEANTM)
を用いて、同社のプロトコールに従い、約1kbから約
2kbのDNA断片を分取した。尚、同プロトコールと
同様な方法は、Struhl,K.,BioTechn
iques.3,452(1985)にも記載されてい
る。取得したこの約1kbから約2kbのDNA断片と
制限酵素EcoRIで切断した後、細菌性アルカリホス
ファターゼ(宝酒造株式会社製)で脱リン酸化した大腸
菌ベクターM13mp19RF(宝酒造株式会社製)と
を、T4DNAリガーゼ(宝酒造株式会社製)を用いて
連結した。このリガーゼ反応液を用いて、大腸菌DH5
αのコンピタントセル(BRL社製)を、BRL社のプ
ロトコールに従い形質転換し、大腸菌DH5αF’(B
RL社製)を指示菌として約2000個の形質転換株を
得た。
I(宝酒造株式会社製)で切断後、1%アガロースゲル
電気泳動を行い、約1kbから約2kbのDNA断片を
含むアガロースゲルを切り出した。これをフナコシ社よ
り購入したジーンクリーン(GENECLEANTM)
を用いて、同社のプロトコールに従い、約1kbから約
2kbのDNA断片を分取した。尚、同プロトコールと
同様な方法は、Struhl,K.,BioTechn
iques.3,452(1985)にも記載されてい
る。取得したこの約1kbから約2kbのDNA断片と
制限酵素EcoRIで切断した後、細菌性アルカリホス
ファターゼ(宝酒造株式会社製)で脱リン酸化した大腸
菌ベクターM13mp19RF(宝酒造株式会社製)と
を、T4DNAリガーゼ(宝酒造株式会社製)を用いて
連結した。このリガーゼ反応液を用いて、大腸菌DH5
αのコンピタントセル(BRL社製)を、BRL社のプ
ロトコールに従い形質転換し、大腸菌DH5αF’(B
RL社製)を指示菌として約2000個の形質転換株を
得た。
【0031】得られたこれらのプラークを、ニトロセル
ロースフィルターに転写し、プローブとして5’末端を
放射性32Pで標識した合成オリゴデオキシヌクレオチ
ド(前記工程3にて合成した)を用いて、50℃で90
分間のハイブリダイゼイションを行った。次に同ニトロ
セルロースフィルターを、6XSSC液(0.9M塩化
ナトリウム、90mMクエン酸ナトリウム、0.6%ド
デシル硫酸ナトリウム)中、室温下10分間洗浄し、更
に同液にて40℃、5分間の洗浄の後、オートラジオグ
ラフィーを行った。その結果、プローブと強くハイブリ
ダイズするDNAを保有する菌株を1株取得した。次に
同菌株の保有するプラスミドDNAをアルカリ溶菌法に
より100μg抽出し、その一部を用いて制限酵素地図
を作成した。その結果、得られたプラスミドは、前記工
程3のプローブとハイブリダイズする約1.5kbのE
coRI断片がM13mp19RFのマルチプルクロー
ニングサイトのEcoRIサイトに組み込まれたもので
あった。
ロースフィルターに転写し、プローブとして5’末端を
放射性32Pで標識した合成オリゴデオキシヌクレオチ
ド(前記工程3にて合成した)を用いて、50℃で90
分間のハイブリダイゼイションを行った。次に同ニトロ
セルロースフィルターを、6XSSC液(0.9M塩化
ナトリウム、90mMクエン酸ナトリウム、0.6%ド
デシル硫酸ナトリウム)中、室温下10分間洗浄し、更
に同液にて40℃、5分間の洗浄の後、オートラジオグ
ラフィーを行った。その結果、プローブと強くハイブリ
ダイズするDNAを保有する菌株を1株取得した。次に
同菌株の保有するプラスミドDNAをアルカリ溶菌法に
より100μg抽出し、その一部を用いて制限酵素地図
を作成した。その結果、得られたプラスミドは、前記工
程3のプローブとハイブリダイズする約1.5kbのE
coRI断片がM13mp19RFのマルチプルクロー
ニングサイトのEcoRIサイトに組み込まれたもので
あった。
【0032】工程5 塩基配列の決定 前記工程4で分離した約1.5kbのEcoRI断片の
塩基配列は、同DNA断片を、適当な長さに切出し、種
々の断片をM13ベクターにサブクローニングしたの
ち、サンガーらの方法(Sanger,F,Scien
ce 第214巻、1205−1210(1981)な
ど)に基づき、挿入部分の塩基配列を決定した。具体的
な実験操作は、7−DEAZAシーケンスキット(宝酒
造株式会社製)を用いて、同キットのプロトコールに準
じた。尚、プロトコールと同様な方法は、Mizusa
wa,S.et al.Nucleic Acids
Res.,14,1319−1324(1986)にも
記載されている。M13ベクターへのサブクローニング
操作においては、約1.5kbのEcoRI断片中に存
在する制限酵素切断部位を利用した。
塩基配列は、同DNA断片を、適当な長さに切出し、種
々の断片をM13ベクターにサブクローニングしたの
ち、サンガーらの方法(Sanger,F,Scien
ce 第214巻、1205−1210(1981)な
ど)に基づき、挿入部分の塩基配列を決定した。具体的
な実験操作は、7−DEAZAシーケンスキット(宝酒
造株式会社製)を用いて、同キットのプロトコールに準
じた。尚、プロトコールと同様な方法は、Mizusa
wa,S.et al.Nucleic Acids
Res.,14,1319−1324(1986)にも
記載されている。M13ベクターへのサブクローニング
操作においては、約1.5kbのEcoRI断片中に存
在する制限酵素切断部位を利用した。
【0033】決定した塩基配列について、翻訳可能領域
を調べたところ、1062塩基からなるアミノ酸354
残基(分子量37840)をコードする翻訳可能領域の
C末端側{配列番号1の第373番目の塩基(G)から
第1434番目の塩基(A)}の遺伝子が存在している
ことが明らかとなった。しかしながら細胞膜より単離さ
れたチトクロムC−553(CO)の分子量が、480
00であることより、前記工程4で分離した約1.5k
bのEcoRI断片には、チトクロムC−553(C
O)のN末端側をコードする遺伝子は含まれていないこ
とがわかった。
を調べたところ、1062塩基からなるアミノ酸354
残基(分子量37840)をコードする翻訳可能領域の
C末端側{配列番号1の第373番目の塩基(G)から
第1434番目の塩基(A)}の遺伝子が存在している
ことが明らかとなった。しかしながら細胞膜より単離さ
れたチトクロムC−553(CO)の分子量が、480
00であることより、前記工程4で分離した約1.5k
bのEcoRI断片には、チトクロムC−553(C
O)のN末端側をコードする遺伝子は含まれていないこ
とがわかった。
【0034】工程6 チトクロムC−553(CO)遺伝子のN末端側の遺伝
子を含むDNA断片の単離 前記工程4で取得したグルコノバクター サブオキシダ
ンス IFO 12528の全DNAを、制限酵素Sp
hI(宝酒造株式会社製)で切断後、1%アガロースゲ
ル電気泳動を行い、約1kbから約3kbのDNA断片
を含むアガロースゲルを切り出した。これをフナコシ社
より購入したジーンクリーン(GENECLEA
NTM)を用いて、同社のプロトコールに従い、約1k
bから約3kbのDNA断片を分取した。この断片と、
制限酵素SphIで切断した後、細菌性アルカリホスフ
ァターゼ(宝酒造株式会社製)で脱リン酸化した大腸菌
ベクターM13mp19RF(宝酒造株式会社製)と
を、T4DNAリガーゼ(宝酒造株式会社製)を用いて
連結した。このリガーゼ反応液を用いて、大腸菌DH5
αのコンピタントセル(BRL社製)を、BRL社製の
プロトコールに従い形質転換し、大腸菌DH5αF’
(BRL社製)を指示菌として約1500個の形質転換
株を得た。得られたこれらのプラークを、ニトロセルロ
ースフィルターに転写した。
子を含むDNA断片の単離 前記工程4で取得したグルコノバクター サブオキシダ
ンス IFO 12528の全DNAを、制限酵素Sp
hI(宝酒造株式会社製)で切断後、1%アガロースゲ
ル電気泳動を行い、約1kbから約3kbのDNA断片
を含むアガロースゲルを切り出した。これをフナコシ社
より購入したジーンクリーン(GENECLEA
NTM)を用いて、同社のプロトコールに従い、約1k
bから約3kbのDNA断片を分取した。この断片と、
制限酵素SphIで切断した後、細菌性アルカリホスフ
ァターゼ(宝酒造株式会社製)で脱リン酸化した大腸菌
ベクターM13mp19RF(宝酒造株式会社製)と
を、T4DNAリガーゼ(宝酒造株式会社製)を用いて
連結した。このリガーゼ反応液を用いて、大腸菌DH5
αのコンピタントセル(BRL社製)を、BRL社製の
プロトコールに従い形質転換し、大腸菌DH5αF’
(BRL社製)を指示菌として約1500個の形質転換
株を得た。得られたこれらのプラークを、ニトロセルロ
ースフィルターに転写した。
【0035】本工程で使用したプローブは、次に示す方
法により作製した。前記工程4で取得したプラスミドD
NA20μgを制限酵素EcoRIとSphIとで消化
したのち、1%アガロースゲル電気泳動を行い、約0.
5kbのDNA断片を含むアガロースゲルを分画した。
同アガロースゲル分画より、フナコシ社より購入したジ
ーンクリーン(GENECLEANTM)を用いて、同
社のプロトコールに従い、約0.5kbのEcoRI−
SphI断片を抽出単離した。このDNA断片50ng
について、アマーシャム社より購入したマルチプライム
DNA標識システム(MultiprimeTMDNA
labelling system)を用い、これに
付属するプロトコールに従い、(α−32P)デオキシ
シチジル酸3リン酸(dCTP)で標識したプローブを
作製した。尚、同プロトコールと同様な方法は、Fei
nberg,A.P.etal.Analytical
Biochemistry.132、6−13、(19
83)に記載されている。こうして得た反応液を、ファ
ルマシア社より購入したニックカラム(NickTMc
olumn)を用いた精製に供し、本工程で使用するプ
ローブを得た。
法により作製した。前記工程4で取得したプラスミドD
NA20μgを制限酵素EcoRIとSphIとで消化
したのち、1%アガロースゲル電気泳動を行い、約0.
5kbのDNA断片を含むアガロースゲルを分画した。
同アガロースゲル分画より、フナコシ社より購入したジ
ーンクリーン(GENECLEANTM)を用いて、同
社のプロトコールに従い、約0.5kbのEcoRI−
SphI断片を抽出単離した。このDNA断片50ng
について、アマーシャム社より購入したマルチプライム
DNA標識システム(MultiprimeTMDNA
labelling system)を用い、これに
付属するプロトコールに従い、(α−32P)デオキシ
シチジル酸3リン酸(dCTP)で標識したプローブを
作製した。尚、同プロトコールと同様な方法は、Fei
nberg,A.P.etal.Analytical
Biochemistry.132、6−13、(19
83)に記載されている。こうして得た反応液を、ファ
ルマシア社より購入したニックカラム(NickTMc
olumn)を用いた精製に供し、本工程で使用するプ
ローブを得た。
【0036】本工程で調製したジーンバンクを転写した
ニトロセルロースフィルターとプローブとを用いて、4
2℃で一晩のハイブリダイゼイションを行った。次に同
ニトロセルロースフィルターを、5XSSPE液(0.
9M塩化ナトリウム、0.05Mクエン酸ナトリウムp
H7.7、0.0005Mエチレンジアミン四酢酸二ナ
トリウム)中、室温下30分間洗浄し、更に0.1%の
ドデシル硫酸ナトリウムを含んだ1XSSPE液(前記
5XSSPE液を5倍に希釈した液)にて42℃、30
分間の洗浄の後、オートラジオグラフィーを行った。そ
の結果、プローブと強くハイブリダイズするDNAを保
有する菌株を9株取得した。次に同菌株の保有するプラ
スミドDNAを、簡便アルカリ溶菌法により抽出し、そ
れぞれの制限酵素地図を作成した。その結果、得られた
プラスミドには、本工程で作成したプローブとハイブリ
ダイズする約2kbのSphI断片が、M13mp19
RFのマルチプルクローニングサイトのSphIサイト
に正逆2方向にそれぞれ組み込まれた複合プラスミドが
それぞれ存在していた。
ニトロセルロースフィルターとプローブとを用いて、4
2℃で一晩のハイブリダイゼイションを行った。次に同
ニトロセルロースフィルターを、5XSSPE液(0.
9M塩化ナトリウム、0.05Mクエン酸ナトリウムp
H7.7、0.0005Mエチレンジアミン四酢酸二ナ
トリウム)中、室温下30分間洗浄し、更に0.1%の
ドデシル硫酸ナトリウムを含んだ1XSSPE液(前記
5XSSPE液を5倍に希釈した液)にて42℃、30
分間の洗浄の後、オートラジオグラフィーを行った。そ
の結果、プローブと強くハイブリダイズするDNAを保
有する菌株を9株取得した。次に同菌株の保有するプラ
スミドDNAを、簡便アルカリ溶菌法により抽出し、そ
れぞれの制限酵素地図を作成した。その結果、得られた
プラスミドには、本工程で作成したプローブとハイブリ
ダイズする約2kbのSphI断片が、M13mp19
RFのマルチプルクローニングサイトのSphIサイト
に正逆2方向にそれぞれ組み込まれた複合プラスミドが
それぞれ存在していた。
【0037】工程7 チトクロムC−553(CO)遺伝子のN末端側の構造
遺伝子の塩基配列の決定 前記工程6で分離した約2kbのSphI断片の塩基配
列は、ヘニコフらのデリーション方法{Henikof
f,S,Gene 第28巻、351−359(198
4)など}に基づき、種々の長さの挿入断片を有するM
13サブクローン作製した後、前記5の方法により挿入
部分の塩基配列を決定した。種々の長さの挿入断片を有
するM13のサブクローンを作製の具体的な実験操作
は、キローシーケンス デレーション キット(宝酒造
株式会社製)を用いて、同キットのプロトコールに準じ
た。
遺伝子の塩基配列の決定 前記工程6で分離した約2kbのSphI断片の塩基配
列は、ヘニコフらのデリーション方法{Henikof
f,S,Gene 第28巻、351−359(198
4)など}に基づき、種々の長さの挿入断片を有するM
13サブクローン作製した後、前記5の方法により挿入
部分の塩基配列を決定した。種々の長さの挿入断片を有
するM13のサブクローンを作製の具体的な実験操作
は、キローシーケンス デレーション キット(宝酒造
株式会社製)を用いて、同キットのプロトコールに準じ
た。
【0038】決定した塩基配列について、翻訳可能領域
を調べたところ、378塩基からなるアミノ酸126残
基(分子量13651)をコードする翻訳可能領域のN
末端側{配列番号1の第1番目の塩基(A)から第37
8番目の塩基(C)}の遺伝子が存在していることが明
らかとなった。尚、第378番目以降の塩基配列は、前
記工程5で決定した塩基配列と完全に一致していた。
を調べたところ、378塩基からなるアミノ酸126残
基(分子量13651)をコードする翻訳可能領域のN
末端側{配列番号1の第1番目の塩基(A)から第37
8番目の塩基(C)}の遺伝子が存在していることが明
らかとなった。尚、第378番目以降の塩基配列は、前
記工程5で決定した塩基配列と完全に一致していた。
【0039】工程8 チトクロムC−553(CO)の全構造遺伝子を含むD
NA断片の構築 (1)M13mp18RFのEcoRIサイトへの約
1.5kbのEcoRI断片の組み込み 前記工程4で取得したプラスミドDNA10μgを、制
限酵素EcoRIで消化したのち、1%アガロースゲル
電気泳動を行い、約1.5kbのDNA断片を含むアガ
ロースゲルを分画した。同アガロースゲル分画より、フ
ナコシ社より購入したジーンクリーン(GENECLE
ANTM)を用いて、同社のプロトコールに従い、約
1.5kb EcoRI断片を抽出単離した。
NA断片の構築 (1)M13mp18RFのEcoRIサイトへの約
1.5kbのEcoRI断片の組み込み 前記工程4で取得したプラスミドDNA10μgを、制
限酵素EcoRIで消化したのち、1%アガロースゲル
電気泳動を行い、約1.5kbのDNA断片を含むアガ
ロースゲルを分画した。同アガロースゲル分画より、フ
ナコシ社より購入したジーンクリーン(GENECLE
ANTM)を用いて、同社のプロトコールに従い、約
1.5kb EcoRI断片を抽出単離した。
【0040】制限酵素EcoRI切断した後細菌性アル
カリホスファターゼ(宝酒造株式会社製)で脱リン酸化
した大腸菌ベクターM13mp18RF(宝酒造株式会
社製)とを、T4DNAリガーゼ(宝酒造株式会社製)
を用いて連結した。このリガーゼ反応液を用いて、大腸
菌DH5αのコンピタントセル(BRL社製)を、BR
L社のプロトコールに従い形質転換した。得られた形質
転換株6株について、同菌株の保有するプラスミドDN
Aを簡便アルカリ溶菌法により抽出し、それぞれの制限
酵素地図を作成した。その結果、得られたプラスミドに
は、本工程で単離した約1.5kbのEcoRI断片
が、M13mp18RFのマルチプルクローニングサイ
トのEcoRIサイトに正逆2方向にそれぞれ組み込ま
れた複合プラスミドがそれぞれ存在していた。
カリホスファターゼ(宝酒造株式会社製)で脱リン酸化
した大腸菌ベクターM13mp18RF(宝酒造株式会
社製)とを、T4DNAリガーゼ(宝酒造株式会社製)
を用いて連結した。このリガーゼ反応液を用いて、大腸
菌DH5αのコンピタントセル(BRL社製)を、BR
L社のプロトコールに従い形質転換した。得られた形質
転換株6株について、同菌株の保有するプラスミドDN
Aを簡便アルカリ溶菌法により抽出し、それぞれの制限
酵素地図を作成した。その結果、得られたプラスミドに
は、本工程で単離した約1.5kbのEcoRI断片
が、M13mp18RFのマルチプルクローニングサイ
トのEcoRIサイトに正逆2方向にそれぞれ組み込ま
れた複合プラスミドがそれぞれ存在していた。
【0041】(2)C末端側の遺伝子を含むDNA断片
の単離 前記工程8−(1)で取得した2種のプラスミドのう
ち、チトクロムC−553(CO)遺伝子のC末端部分
がM13mp18RFベクターのマルチプルクローニン
グサイトのXbaIサイトのより近くに位置する方のプ
ラスミドDNA10μgを、制限酵素PstIとXba
Iとで消化したのち、1%アガロースゲル電気泳動を行
い、約1.5kbのDNA断片を含むアガロースゲルを
分画した。同アガロースゲル分画より、フナコシ社より
購入したジーンクリーン(GENECLEANTM)を
用いて、同社のプロトコールに従い、約1.5kbのP
stI−XbaI断片を抽出単離した。
の単離 前記工程8−(1)で取得した2種のプラスミドのう
ち、チトクロムC−553(CO)遺伝子のC末端部分
がM13mp18RFベクターのマルチプルクローニン
グサイトのXbaIサイトのより近くに位置する方のプ
ラスミドDNA10μgを、制限酵素PstIとXba
Iとで消化したのち、1%アガロースゲル電気泳動を行
い、約1.5kbのDNA断片を含むアガロースゲルを
分画した。同アガロースゲル分画より、フナコシ社より
購入したジーンクリーン(GENECLEANTM)を
用いて、同社のプロトコールに従い、約1.5kbのP
stI−XbaI断片を抽出単離した。
【0042】(3)チトクロムC−553(CO)全構
造遺伝子の構築 プローブとハイブリダイズする約2kbのSphI断片
がM13mp19RFのマルチプルクローニングサイト
のSphIサイトに正逆2方向にそれぞれ組み込まれた
2種のプラスミド(前記工程6で調製した)のうち、チ
トクロムC−553(CO)構造遺伝子のC末端側の遺
伝子へとつながっている部分がM13mp19RFベク
ターのマルチプルクローニングサイトのXbaIサイト
のより近くに位置する方のプラスミドDAN10μg
を、制限酵素PstIとXbaIとで消化したのち、1
%アガロースゲル電気泳動を行い、約9kbのDNA断
片を含むアガロースゲルを分画した。同アガロースゲル
分画より、フナコシ社より購入したジーンクリーン(G
ENECLEANTM)を用いて、同社のプロトコール
に従い、約9kbのPstI−XbaI断片を抽出単離
した。
造遺伝子の構築 プローブとハイブリダイズする約2kbのSphI断片
がM13mp19RFのマルチプルクローニングサイト
のSphIサイトに正逆2方向にそれぞれ組み込まれた
2種のプラスミド(前記工程6で調製した)のうち、チ
トクロムC−553(CO)構造遺伝子のC末端側の遺
伝子へとつながっている部分がM13mp19RFベク
ターのマルチプルクローニングサイトのXbaIサイト
のより近くに位置する方のプラスミドDAN10μg
を、制限酵素PstIとXbaIとで消化したのち、1
%アガロースゲル電気泳動を行い、約9kbのDNA断
片を含むアガロースゲルを分画した。同アガロースゲル
分画より、フナコシ社より購入したジーンクリーン(G
ENECLEANTM)を用いて、同社のプロトコール
に従い、約9kbのPstI−XbaI断片を抽出単離
した。
【0043】この約9kbのPstI−XbaI断片と
前記工程8−(2)で単離した約1.5kbのPstI
−XbaI断片とを、T4DNAリガーゼ(宝酒造株式
会社製)を用いて連結した。このリガーゼ反応液を用い
て、大腸菌DH5αのコンピタントセル(BRL社製)
をBRL社のプロトコールに従い形質転換した。得られ
た形質転換株6株について、同菌株の保有するプラスミ
ドDNAを、簡便アルカリ溶菌法により抽出し、それぞ
れの制限酵素地図を作成した。その結果、得られたプラ
スミドには全て、約3kbのSphI−EcoRI断片
が含まれていた。この約3kbのSphI−EcoRI
断片は、前記工程4でクローニングした約1.5kbの
EcoRI断片及び、前記工程6でクローニングした約
2kbのSphI断片を、全てその断片内に含んでい
た。
前記工程8−(2)で単離した約1.5kbのPstI
−XbaI断片とを、T4DNAリガーゼ(宝酒造株式
会社製)を用いて連結した。このリガーゼ反応液を用い
て、大腸菌DH5αのコンピタントセル(BRL社製)
をBRL社のプロトコールに従い形質転換した。得られ
た形質転換株6株について、同菌株の保有するプラスミ
ドDNAを、簡便アルカリ溶菌法により抽出し、それぞ
れの制限酵素地図を作成した。その結果、得られたプラ
スミドには全て、約3kbのSphI−EcoRI断片
が含まれていた。この約3kbのSphI−EcoRI
断片は、前記工程4でクローニングした約1.5kbの
EcoRI断片及び、前記工程6でクローニングした約
2kbのSphI断片を、全てその断片内に含んでい
た。
【0044】本工程で取得した約3kbのSphI−E
coRI断片を含むプラスミドDNAは、同プラスミド
の保有菌から、前記工程4のアルカリ溶菌法により、1
50μg抽出された。同プラスミドDNA20μgを制
限酵素HindIIIとBglIIとで消化したのち、
1%アガロースゲル電気泳動を行い、約2.1kbのD
NA断片を含むアガロースゲル分画した。同アガロース
ゲル分画より、フナコシ社より購入したジーンクリーン
(GENECLEANTM)を用いて、同社のプロトコ
ールに従い、約2.1kbのHindIII−BglI
I断片を約1μg抽出単離した。この約2.1kbのH
indIII−BglIl断片の制限酵素地図を第1図
に示した。この約2.1kbのHindIII−Bgl
II断片中に、配列番号1で示した1434塩基からな
るチトクロムC−553(CO)構造遺伝子が全て含ま
れている。
coRI断片を含むプラスミドDNAは、同プラスミド
の保有菌から、前記工程4のアルカリ溶菌法により、1
50μg抽出された。同プラスミドDNA20μgを制
限酵素HindIIIとBglIIとで消化したのち、
1%アガロースゲル電気泳動を行い、約2.1kbのD
NA断片を含むアガロースゲル分画した。同アガロース
ゲル分画より、フナコシ社より購入したジーンクリーン
(GENECLEANTM)を用いて、同社のプロトコ
ールに従い、約2.1kbのHindIII−BglI
I断片を約1μg抽出単離した。この約2.1kbのH
indIII−BglIl断片の制限酵素地図を第1図
に示した。この約2.1kbのHindIII−Bgl
II断片中に、配列番号1で示した1434塩基からな
るチトクロムC−553(CO)構造遺伝子が全て含ま
れている。
【0045】(4)N末端側の遺伝子を含む0.7kb
のHindIII−PstI断片の単離 前記工程6で取得した約2kbのSphI断片がM13
mp19RFのマルチプルグルローニングサイトのSp
hIサイトに正逆2方向にそれぞれ組み込まれた複合プ
ラスミドの一方のプラスミドDNA10μgを、制限酵
素HindIIIとPstIとで消化した後、1%アガ
ロースゲル電気泳動を行い、約0.7kbのDNA断片
を含むアガロースゲルを分画した。同アガロースゲル分
画より、フナコシ社より購入したジーンクリーン(GE
NECLEANTM)を用いて、同社のプロトコールに
従い、約0.7kbのHindIII−PstI断片を
抽出単離した。
のHindIII−PstI断片の単離 前記工程6で取得した約2kbのSphI断片がM13
mp19RFのマルチプルグルローニングサイトのSp
hIサイトに正逆2方向にそれぞれ組み込まれた複合プ
ラスミドの一方のプラスミドDNA10μgを、制限酵
素HindIIIとPstIとで消化した後、1%アガ
ロースゲル電気泳動を行い、約0.7kbのDNA断片
を含むアガロースゲルを分画した。同アガロースゲル分
画より、フナコシ社より購入したジーンクリーン(GE
NECLEANTM)を用いて、同社のプロトコールに
従い、約0.7kbのHindIII−PstI断片を
抽出単離した。
【0046】(5)ベクターpHSG398への約1.
5kbのPstI−XbaI断片の組み込み 大腸菌ベクタープラスミドpHSG398(宝酒造株式
会社製)DNA5μgを、制限酵素PstIとXbaI
とで消化した後、1%アガロースゲル電気泳動を行い、
約2.2kbのベクタープラスミド断片を含むアガロー
スゲルを分画した。同アガロースゲル分画より、フナコ
シ社より購入したジーンクリーンを用いて、同社のプロ
トコールに従い、約2.2kbのベクタープラスミドp
HSG398PstI−XbaI断片を抽出単離した。
5kbのPstI−XbaI断片の組み込み 大腸菌ベクタープラスミドpHSG398(宝酒造株式
会社製)DNA5μgを、制限酵素PstIとXbaI
とで消化した後、1%アガロースゲル電気泳動を行い、
約2.2kbのベクタープラスミド断片を含むアガロー
スゲルを分画した。同アガロースゲル分画より、フナコ
シ社より購入したジーンクリーンを用いて、同社のプロ
トコールに従い、約2.2kbのベクタープラスミドp
HSG398PstI−XbaI断片を抽出単離した。
【0047】この約2.2kbのpHSG398Pst
I−XbaI断片と前記工程8−(2)で取得した約
1.5kbのPstI−XbaI断片とを、T4DNA
リガーゼ(宝酒造株式会社製)を用いて連結した。この
リガーゼ反応液を用いて、大腸菌DH5αのコンピタン
トセル(BRL社製)を、BRL社のプロトコールに従
い形質転換した。得られた形質転換株6株について、同
菌株の保有するプラスミドDNAを簡便アルカリ溶菌法
により抽出し、それぞれの制限酵素地図を作成した。そ
の結果、得られたプラスミドは全て、ベクタープラスミ
ドpHSG398の約2.2kbのPstI−XbaI
断片に前記工程8−(2)で取得した約1.5kbのP
stI−XbaI断片が組み込まれた複合プラスミドで
あった。
I−XbaI断片と前記工程8−(2)で取得した約
1.5kbのPstI−XbaI断片とを、T4DNA
リガーゼ(宝酒造株式会社製)を用いて連結した。この
リガーゼ反応液を用いて、大腸菌DH5αのコンピタン
トセル(BRL社製)を、BRL社のプロトコールに従
い形質転換した。得られた形質転換株6株について、同
菌株の保有するプラスミドDNAを簡便アルカリ溶菌法
により抽出し、それぞれの制限酵素地図を作成した。そ
の結果、得られたプラスミドは全て、ベクタープラスミ
ドpHSG398の約2.2kbのPstI−XbaI
断片に前記工程8−(2)で取得した約1.5kbのP
stI−XbaI断片が組み込まれた複合プラスミドで
あった。
【0048】(6)チトクロムC−553(CO)全構
造遺伝子を含むプラスミドの構築 前記工程8−(5)で取得した複合プラスミドDNA5
μgを、制限酵素HindIIIとPstIとで消化し
た後、1%アガロースゲル電気泳動を行い、約3.7k
bの複合プラスミド断片を含むアガロースゲルを分画し
た。同アガロースゲル分画よりフナコシ社のプロトコー
ルに従い、約3.7kbのプラスミド断片を抽出単離し
た。
造遺伝子を含むプラスミドの構築 前記工程8−(5)で取得した複合プラスミドDNA5
μgを、制限酵素HindIIIとPstIとで消化し
た後、1%アガロースゲル電気泳動を行い、約3.7k
bの複合プラスミド断片を含むアガロースゲルを分画し
た。同アガロースゲル分画よりフナコシ社のプロトコー
ルに従い、約3.7kbのプラスミド断片を抽出単離し
た。
【0049】この約3.7kbの複合プラスミドのHi
ndIII−PstI断片と、前記工程8−(4)で取
得した約0.7kbのHindIII−PstI断片と
を、T4DNAリガーゼ(宝酒造株式会社製)を用いて
連結した。このリガーゼ反応液を用いて、大腸菌DH5
αのコンセタントセル(BRL社製)を、BRL社のプ
ロトコールに従い形質転換した。得られた形質転換株6
株について、同株の保有するプラスミドDNAを簡便ア
ルカリ溶菌法により抽出し、それぞれの制限酵素地図を
作成した。その結果、得られたプラスミドは全て、前記
工程8−(5)で取得した複合プラスミドの約3.7k
bのHindIII−PstI断片に、前記工程8−
(4)で取得した約0.7kbのHindIII−Ps
tI断片が組み込まれた複合プラスミドpCYT1であ
った。尚、複合プラスミドpCYT1を保有した大腸菌
DH5αは、受託番号微工研菌寄第11497号で、工
業技術院微生物工業技術研究所に既に寄託されている。
ndIII−PstI断片と、前記工程8−(4)で取
得した約0.7kbのHindIII−PstI断片と
を、T4DNAリガーゼ(宝酒造株式会社製)を用いて
連結した。このリガーゼ反応液を用いて、大腸菌DH5
αのコンセタントセル(BRL社製)を、BRL社のプ
ロトコールに従い形質転換した。得られた形質転換株6
株について、同株の保有するプラスミドDNAを簡便ア
ルカリ溶菌法により抽出し、それぞれの制限酵素地図を
作成した。その結果、得られたプラスミドは全て、前記
工程8−(5)で取得した複合プラスミドの約3.7k
bのHindIII−PstI断片に、前記工程8−
(4)で取得した約0.7kbのHindIII−Ps
tI断片が組み込まれた複合プラスミドpCYT1であ
った。尚、複合プラスミドpCYT1を保有した大腸菌
DH5αは、受託番号微工研菌寄第11497号で、工
業技術院微生物工業技術研究所に既に寄託されている。
【0050】ところで、配列番号1の塩基配列で示され
る構造遺伝子が、チトクロムC−553(CO)をコー
ドしていることは、前記工程2−(3)で決定したアミ
ノ酸配列が全て、配列番号1の塩基配列より決まるアミ
ノ酸配列と一致したことにより確認された。具体的に
は、前記工程2−(3)において明らかとなった限定加
水分解ペプチドIのN末端アミノ酸配列は、配列番号1
の第1243番目の塩基(A)から第1281番目の塩
基(T)までの塩基配列に対応したアミノ酸配列と一致
し、同限定加水分解ペプチドIIのN末端アミノ酸配列
は、配列番号1の第1303番目の塩基(A)から第1
350番目の塩基(G)までの塩基配列に対応したアミ
ノ酸配列と一致した。
る構造遺伝子が、チトクロムC−553(CO)をコー
ドしていることは、前記工程2−(3)で決定したアミ
ノ酸配列が全て、配列番号1の塩基配列より決まるアミ
ノ酸配列と一致したことにより確認された。具体的に
は、前記工程2−(3)において明らかとなった限定加
水分解ペプチドIのN末端アミノ酸配列は、配列番号1
の第1243番目の塩基(A)から第1281番目の塩
基(T)までの塩基配列に対応したアミノ酸配列と一致
し、同限定加水分解ペプチドIIのN末端アミノ酸配列
は、配列番号1の第1303番目の塩基(A)から第1
350番目の塩基(G)までの塩基配列に対応したアミ
ノ酸配列と一致した。
【0051】Gluconobacter subox
ydans var.α株の上記で得られた遺伝子によ
る形質転換株においては、同遺伝子由来のC型チトクロ
ムが生成され、同C型チトクロムがチトクロムC−55
3(CO)と同様の機能を有することが確認された。
ydans var.α株の上記で得られた遺伝子によ
る形質転換株においては、同遺伝子由来のC型チトクロ
ムが生成され、同C型チトクロムがチトクロムC−55
3(CO)と同様の機能を有することが確認された。
【0052】(7)ベクタ−pHSG298への約2.
7kbのBamHI−SacI断片の組み込み 前記工程8−(3)で取得した約3kbのSphI−E
coRI断片を含むプラスミドDNAは、同プラスミド
の保有菌から、前記工程4のアルカリ溶菌法により、1
50μg抽出された。同プラスミドDNA20μgを制
限酵素BamHIとSacIとで消化したのち、1%ア
ガロースゲル電気泳動を行い、約2.7kbのDNA断
片を含むアガロースゲル分画した。同アガロースゲル分
画より、フナコシ社より購入したジーンクリーン(GE
NECLEANTM)を用いて、同社のプロトコールに
従い、約2.7kbのBamHI−SacI断片を約1
μg抽出単離した。この約2.7kbのBamHI−S
acI断片中に、配列番号1で示した1434塩基から
なるチトクロムC−553(CO)構造遺伝子が全て含
まれている。
7kbのBamHI−SacI断片の組み込み 前記工程8−(3)で取得した約3kbのSphI−E
coRI断片を含むプラスミドDNAは、同プラスミド
の保有菌から、前記工程4のアルカリ溶菌法により、1
50μg抽出された。同プラスミドDNA20μgを制
限酵素BamHIとSacIとで消化したのち、1%ア
ガロースゲル電気泳動を行い、約2.7kbのDNA断
片を含むアガロースゲル分画した。同アガロースゲル分
画より、フナコシ社より購入したジーンクリーン(GE
NECLEANTM)を用いて、同社のプロトコールに
従い、約2.7kbのBamHI−SacI断片を約1
μg抽出単離した。この約2.7kbのBamHI−S
acI断片中に、配列番号1で示した1434塩基から
なるチトクロムC−553(CO)構造遺伝子が全て含
まれている。
【0053】大腸菌ベクタープラスミドpHSG298
(宝酒造株式会社製)DNA5μgを、制限酵素Bam
HIとSacIとで消化した後、1%アガロースゲル電
気泳動を行い、約2.7kbのベクタープラスミド断片
を含むアガロースゲルを分画した。同アガロースゲル分
画より、フナコシ社より購入したジーンクリーンを用い
て、同社のプロトコールに従い、約2.7kbのベクタ
ープラスミドpHSG298BamHI−SacI断片
を抽出単離した。
(宝酒造株式会社製)DNA5μgを、制限酵素Bam
HIとSacIとで消化した後、1%アガロースゲル電
気泳動を行い、約2.7kbのベクタープラスミド断片
を含むアガロースゲルを分画した。同アガロースゲル分
画より、フナコシ社より購入したジーンクリーンを用い
て、同社のプロトコールに従い、約2.7kbのベクタ
ープラスミドpHSG298BamHI−SacI断片
を抽出単離した。
【0054】この約2.7kbのpHSG298Bam
HI−SacI断片と前記工程8−(3)で取得した約
2.7kbのBamHI−SacI断片とを、T4DN
Aリガーゼ(宝酒造株式会社製)を用いて連結した。こ
のリガーゼ反応液を用いて、大腸菌DH5αのコンピタ
ントセル(BRL社製)を、BRL社のプロトコールに
従い形質転換した。得られた形質転換株6株について、
同菌株の保有するプラスミドDNAを簡便アルカリ溶菌
法により抽出し、それぞれの制限酵素地図を作成した。
その結果、得られたプラスミドは全て、ベクタープラス
ミドpHSG298の約2.7kbのBamHI−Sa
cI断片に前記工程8−(3)で取得した約2.7kb
のBamHI−SacI断片が組み込まれた複合プラス
ミドpCYT3であった。得られたpCYT3を保有し
た大腸菌よりアルカリ溶菌法により、pCYT3を10
0μg抽出単離した。
HI−SacI断片と前記工程8−(3)で取得した約
2.7kbのBamHI−SacI断片とを、T4DN
Aリガーゼ(宝酒造株式会社製)を用いて連結した。こ
のリガーゼ反応液を用いて、大腸菌DH5αのコンピタ
ントセル(BRL社製)を、BRL社のプロトコールに
従い形質転換した。得られた形質転換株6株について、
同菌株の保有するプラスミドDNAを簡便アルカリ溶菌
法により抽出し、それぞれの制限酵素地図を作成した。
その結果、得られたプラスミドは全て、ベクタープラス
ミドpHSG298の約2.7kbのBamHI−Sa
cI断片に前記工程8−(3)で取得した約2.7kb
のBamHI−SacI断片が組み込まれた複合プラス
ミドpCYT3であった。得られたpCYT3を保有し
た大腸菌よりアルカリ溶菌法により、pCYT3を10
0μg抽出単離した。
【0055】ところで、配列番号1の塩基配列で示され
る構造遺伝子が、チトクロムC−553(CO)をコー
ドしていることは、前記工程2−(3)で決定したアミ
ノ酸配列が全て、配列番号1の塩基配列より決まるアミ
ノ酸配列と一致したことにより確認された。具体的に
は、前記工程2−(3)において明らかとなった限定加
水分解ペプチドIのN末端アミノ酸配列(配列番号2)
は、配列番号1の第1243番目の塩基(A)から第1
281番目の塩基(T)までの塩基配列に対応したアミ
ノ酸配列と一致し、同限定加水分解ペプチドIIのN末
端アミノ酸配列(配列番号3)は、配列番号1の第13
03番目の塩基(A)から第1350番目の塩基(G)
までの塩基配列に対応したアミノ酸配列と一致した。
る構造遺伝子が、チトクロムC−553(CO)をコー
ドしていることは、前記工程2−(3)で決定したアミ
ノ酸配列が全て、配列番号1の塩基配列より決まるアミ
ノ酸配列と一致したことにより確認された。具体的に
は、前記工程2−(3)において明らかとなった限定加
水分解ペプチドIのN末端アミノ酸配列(配列番号2)
は、配列番号1の第1243番目の塩基(A)から第1
281番目の塩基(T)までの塩基配列に対応したアミ
ノ酸配列と一致し、同限定加水分解ペプチドIIのN末
端アミノ酸配列(配列番号3)は、配列番号1の第13
03番目の塩基(A)から第1350番目の塩基(G)
までの塩基配列に対応したアミノ酸配列と一致した。
【0056】工程9 グルコノバクター菌−大腸菌のシャトルベクターの構築 (1)グルコノバクター サブオキシダンス IFO
3130からのプラスミド断片の取得 ポリペプトン8g/l,酵母エキス5g/l,NaCl
2.5g/l,グリセリン20g/lの組成の培地50
mlを500ml容振盪フラスコに分注し、常法にした
がって滅菌後、グルコノバクター サブオキシダンス
IFO 3130の斜面培養物からその一白金耳を植菌
し、30℃で一晩振盪培養した。同培養液より集菌した
菌体について、通常大腸菌で用いられているアルカリ溶
菌法により、プラスミドを抽出した。得られたプラスミ
ドDNA20μgを制限酵素XhoI(宝酒造株式会社
製)で消化した後、1%アガロースゲル電気泳動を行
い、約2kbから約4kbのDNA断片を含むアガロー
スゲルを分画した。同アガロースゲル分画より、フナコ
シ社より購入したジーンクリーン(GENECLEAN
TM)を用いて、同社のプロトコールに従い、同分画D
NA断片を抽出単離した。
3130からのプラスミド断片の取得 ポリペプトン8g/l,酵母エキス5g/l,NaCl
2.5g/l,グリセリン20g/lの組成の培地50
mlを500ml容振盪フラスコに分注し、常法にした
がって滅菌後、グルコノバクター サブオキシダンス
IFO 3130の斜面培養物からその一白金耳を植菌
し、30℃で一晩振盪培養した。同培養液より集菌した
菌体について、通常大腸菌で用いられているアルカリ溶
菌法により、プラスミドを抽出した。得られたプラスミ
ドDNA20μgを制限酵素XhoI(宝酒造株式会社
製)で消化した後、1%アガロースゲル電気泳動を行
い、約2kbから約4kbのDNA断片を含むアガロー
スゲルを分画した。同アガロースゲル分画より、フナコ
シ社より購入したジーンクリーン(GENECLEAN
TM)を用いて、同社のプロトコールに従い、同分画D
NA断片を抽出単離した。
【0057】(2)大腸菌ベクターpUC18へのグル
コノバクタープラスミド断片の組み込み 前記工程9−(1)で取得したグルコノバクタープラス
ミドのDNA断片と制限酵素SalI(宝酒造株式会社
製)で切断した後、細菌性アルカリホスファターゼ(宝
酒造株式会社製)で脱リン酸化した大腸菌ベクターpU
C18(宝酒造株式会社製)とを、T4DNAリガーゼ
(宝酒造株式会社製)を用いて連結した。このリガーゼ
反応液を用いて、大腸菌DH5αのコンピタントセル
(BRL社製)を、BRL社のプロトコールに従い形質
転換した。
コノバクタープラスミド断片の組み込み 前記工程9−(1)で取得したグルコノバクタープラス
ミドのDNA断片と制限酵素SalI(宝酒造株式会社
製)で切断した後、細菌性アルカリホスファターゼ(宝
酒造株式会社製)で脱リン酸化した大腸菌ベクターpU
C18(宝酒造株式会社製)とを、T4DNAリガーゼ
(宝酒造株式会社製)を用いて連結した。このリガーゼ
反応液を用いて、大腸菌DH5αのコンピタントセル
(BRL社製)を、BRL社のプロトコールに従い形質
転換した。
【0058】得られた形質転換株の保有するプラスミド
DNAをアルカリ溶菌法により抽出し、その一部を用い
て制限酵素地図を作成した。その結果、得られたプラス
ミドはpUC18のSalIサイトに、グルコノバクタ
ー サブオキシダンスIFO3130由来の約2.7k
bのプラスミド断片が組み込まれた複合プラスミドpG
EA1であった。
DNAをアルカリ溶菌法により抽出し、その一部を用い
て制限酵素地図を作成した。その結果、得られたプラス
ミドはpUC18のSalIサイトに、グルコノバクタ
ー サブオキシダンスIFO3130由来の約2.7k
bのプラスミド断片が組み込まれた複合プラスミドpG
EA1であった。
【0059】工程10 pGEA1へのチトクロムC−553(CO)全遺伝子
を含む約2.7kbのBamHI−SacI断片の組み
込み pGEA1DNA5μgを制限酵素BamHIとSac
Iとで消化した後、1%アガロースゲル電気泳動を行
い、約5.4kbのベクタープラスミド断片を含むアガ
ロースゲルを分画した。同アガロースゲル分画より、フ
ナコシ社より購入したジーンクリーンを用いて、同社の
プロトコールに従い、約5.4kbのベクタープラスミ
ドpGEA1のBamHI−SacI断片を抽出単離し
た。
を含む約2.7kbのBamHI−SacI断片の組み
込み pGEA1DNA5μgを制限酵素BamHIとSac
Iとで消化した後、1%アガロースゲル電気泳動を行
い、約5.4kbのベクタープラスミド断片を含むアガ
ロースゲルを分画した。同アガロースゲル分画より、フ
ナコシ社より購入したジーンクリーンを用いて、同社の
プロトコールに従い、約5.4kbのベクタープラスミ
ドpGEA1のBamHI−SacI断片を抽出単離し
た。
【0060】この約5.4kbのpGEA1 BamH
I−SacI断片と前記工程8−(4)で取得した複合
プラスミドpCYT3のBamHI−SacI断片と
を、T4DNAリガーゼを用いて連結した。このリガー
ゼ反応液を用いて、大腸菌DH5αのコンピテントセル
(BRL社製)を、BRL社のプロトコールに従い形質
転換した。得られた形質転換株についてそれらの保有す
るプラスミドを調べた結果、pGEA1の約5.4kb
のBamHI−SacI断片に、チトクロムC−553
(CO)全遺伝子を含んだ約2.7kbのBamHI−
SacI断片が組み込まれており、該複合プラスミドp
GEAC1と命名した。得られたpGEAC1を保有し
た大腸菌より、アルカリ溶菌法により、pGEAC1を
100μg抽出単離した。
I−SacI断片と前記工程8−(4)で取得した複合
プラスミドpCYT3のBamHI−SacI断片と
を、T4DNAリガーゼを用いて連結した。このリガー
ゼ反応液を用いて、大腸菌DH5αのコンピテントセル
(BRL社製)を、BRL社のプロトコールに従い形質
転換した。得られた形質転換株についてそれらの保有す
るプラスミドを調べた結果、pGEA1の約5.4kb
のBamHI−SacI断片に、チトクロムC−553
(CO)全遺伝子を含んだ約2.7kbのBamHI−
SacI断片が組み込まれており、該複合プラスミドp
GEAC1と命名した。得られたpGEAC1を保有し
た大腸菌より、アルカリ溶菌法により、pGEAC1を
100μg抽出単離した。
【0061】工程11 グルコノバクター菌の形質転換 YPG培地(ポリペプトン2g/l,酵母エキス5g/
l,グルコース30g/l,グルコースは加熱滅菌後、
他の加熱滅菌された培地成分と無菌条件下で混合す
る。)50mlを、500ml容振盪フラスコに分注
し、常法により滅菌後、グルコノバクター サブオキシ
ダンス IFO3254の斜面培養物からその一白金耳
を植菌し、25℃で一晩培養した。同培養液を10分間
氷冷後、氷冷した25mlのNaCl液(100mM
NaCl,5mM MgCl2,10mM Tris−
HCl pH7.6)で、菌体を2回洗浄した。次に、
同洗浄菌体を、氷冷した20mlのLiCl液(400
mM LiCl,10mM Tris−HCl pH
7.6)に懸濁して、30分間氷冷した。同懸濁液より
集菌した菌体を、0.5mlのLiCl液に再度懸濁
し、コンピタントセル懸濁液とした。
l,グルコース30g/l,グルコースは加熱滅菌後、
他の加熱滅菌された培地成分と無菌条件下で混合す
る。)50mlを、500ml容振盪フラスコに分注
し、常法により滅菌後、グルコノバクター サブオキシ
ダンス IFO3254の斜面培養物からその一白金耳
を植菌し、25℃で一晩培養した。同培養液を10分間
氷冷後、氷冷した25mlのNaCl液(100mM
NaCl,5mM MgCl2,10mM Tris−
HCl pH7.6)で、菌体を2回洗浄した。次に、
同洗浄菌体を、氷冷した20mlのLiCl液(400
mM LiCl,10mM Tris−HCl pH
7.6)に懸濁して、30分間氷冷した。同懸濁液より
集菌した菌体を、0.5mlのLiCl液に再度懸濁
し、コンピタントセル懸濁液とした。
【0062】同コンピタントセル懸濁液200μlを、
本形質転換に用いるプラスミドDNA10μgを含む氷
冷したTE緩衝液(1mM EDTA,10mMTri
s−HCl pH7.6)100μlと混合する。1時
間の氷冷後、氷冷したPEG液(ポリエチレングリコー
ル4000の60w/v%水溶液)300μlと混合
し、更に30分間氷冷した。同細胞感濁液を、YPG培
地5mlと混合した後、30℃で3時間振盪培養した。
同培養液を、滅菌水に適当に希釈し、アンピシリン10
0μg/mlを含有したYPG寒天培地(YPG培地に
寒天15g/lを添加した培地)に塗布し、30℃で3
日間培養した。
本形質転換に用いるプラスミドDNA10μgを含む氷
冷したTE緩衝液(1mM EDTA,10mMTri
s−HCl pH7.6)100μlと混合する。1時
間の氷冷後、氷冷したPEG液(ポリエチレングリコー
ル4000の60w/v%水溶液)300μlと混合
し、更に30分間氷冷した。同細胞感濁液を、YPG培
地5mlと混合した後、30℃で3時間振盪培養した。
同培養液を、滅菌水に適当に希釈し、アンピシリン10
0μg/mlを含有したYPG寒天培地(YPG培地に
寒天15g/lを添加した培地)に塗布し、30℃で3
日間培養した。
【0063】本グルコノバクター菌の形質転換法を用い
て、グルコノバクター サブオキシダンス IFO 3
254を、pGEA1又はpGEAC1のそれぞれのプ
ラスミドDNAにより形質転換した。
て、グルコノバクター サブオキシダンス IFO 3
254を、pGEA1又はpGEAC1のそれぞれのプ
ラスミドDNAにより形質転換した。
【0064】その結果、それぞれの形質転換株には、p
GEA1又はpGEAC1とそれぞれ同じ制限酵素切断
パターンを示すプラスミドが含まれており、それぞれグ
ルコノバクター サブオキシダンス IFO 3254
(pGEA1)及びグルコノバクター サブオキシダン
ス IFO 3254(pGEAC1)と命名した。
尚、グルコノバクター サブオキシダンスIFO 32
54(pGEAC1)は、受託番号微工研菌寄第122
10号で、工業技術院微生物工業技術研究所に既に寄託
されている。以後の工程において、特にことわりのない
限り、pGEA1又はpGEAC1の保有株の培養に
は、培地にアンピシリン200μg/mlを添加した。
GEA1又はpGEAC1とそれぞれ同じ制限酵素切断
パターンを示すプラスミドが含まれており、それぞれグ
ルコノバクター サブオキシダンス IFO 3254
(pGEA1)及びグルコノバクター サブオキシダン
ス IFO 3254(pGEAC1)と命名した。
尚、グルコノバクター サブオキシダンスIFO 32
54(pGEAC1)は、受託番号微工研菌寄第122
10号で、工業技術院微生物工業技術研究所に既に寄託
されている。以後の工程において、特にことわりのない
限り、pGEA1又はpGEAC1の保有株の培養に
は、培地にアンピシリン200μg/mlを添加した。
【0065】工程12 オキシダーゼ活性の評価 (1)菌体及び細胞膜サンプルの調製 SG培地(グルコン酸ナトリウム10g/l,ポリペプ
トン5g/l,グリセロール3g/l,ソルビトール1
0g/l,酵母エキス5g/l,グルコース5g/l,
グルコースは、加熱滅菌後、他の加熱滅菌された培地成
分と無菌条件下で混合する。)100mlを、500m
l容振盪フラスコに分注し、常法により滅菌後、グルコ
ノバクター サブオキシダンス IFO 3254,グ
ルコノバクター サブオキシダンス IFO 3254
(pGEA1),グルコノバクターサブオキシダンス
IFO 3254(pGEAC1)のそれぞれの斜面培
養物から、その一白金耳をそれぞれ別個の振盪フラスコ
に植菌し、30℃で一晩培養した。次にそれぞれの培養
液を、SGG培地(SG培地のグルコン酸ナトリウム濃
度を20g/lとした培地)2.4lを5l容振盪フラ
スコに分注し、常法により滅菌したそれぞれの振盪フラ
スコに移植し、30℃で2日培養した。それぞれの菌株
について得られた菌体の半分については、前記工程1−
(2)の方法により各菌株の細胞膜を分画し、残り半分
については、集菌洗浄後菌体懸濁液とした。
トン5g/l,グリセロール3g/l,ソルビトール1
0g/l,酵母エキス5g/l,グルコース5g/l,
グルコースは、加熱滅菌後、他の加熱滅菌された培地成
分と無菌条件下で混合する。)100mlを、500m
l容振盪フラスコに分注し、常法により滅菌後、グルコ
ノバクター サブオキシダンス IFO 3254,グ
ルコノバクター サブオキシダンス IFO 3254
(pGEA1),グルコノバクターサブオキシダンス
IFO 3254(pGEAC1)のそれぞれの斜面培
養物から、その一白金耳をそれぞれ別個の振盪フラスコ
に植菌し、30℃で一晩培養した。次にそれぞれの培養
液を、SGG培地(SG培地のグルコン酸ナトリウム濃
度を20g/lとした培地)2.4lを5l容振盪フラ
スコに分注し、常法により滅菌したそれぞれの振盪フラ
スコに移植し、30℃で2日培養した。それぞれの菌株
について得られた菌体の半分については、前記工程1−
(2)の方法により各菌株の細胞膜を分画し、残り半分
については、集菌洗浄後菌体懸濁液とした。
【0066】(2)オキシダーゼ活性の測定 前記工程12−(1)で調製した細胞膜懸濁液又は菌体
懸濁液と基質10mMとを含む3mlの緩衝液につい
て、25℃における溶存酵素濃度の減少速度をクラーク
型酸素電極により測定した。エタノール又はグルコース
を基質とした場合には、50mMリン酸カリウム緩衝液
(pH6)を用い、ソルビトール又はグリセロールを基
質とする場合には、50mMリン酸カリウム緩衝液(p
H5)を用いた。
懸濁液と基質10mMとを含む3mlの緩衝液につい
て、25℃における溶存酵素濃度の減少速度をクラーク
型酸素電極により測定した。エタノール又はグルコース
を基質とした場合には、50mMリン酸カリウム緩衝液
(pH6)を用い、ソルビトール又はグリセロールを基
質とする場合には、50mMリン酸カリウム緩衝液(p
H5)を用いた。
【0067】本測定に用いた細胞膜懸濁液の蛋白質濃度
は、前記工程1−(5)で示した改良ローリー法で測定
した。各基質に対するオキシダーゼ比活性を表1に示し
た。
は、前記工程1−(5)で示した改良ローリー法で測定
した。各基質に対するオキシダーゼ比活性を表1に示し
た。
【0068】細胞膜サンプルについては、蛋白質1mg
当たり1分間に消費される酸素分子のマイクロモル数
で、菌体サンプルについては、乾燥菌体1mg当たり1
分間に消費される酸素分子のマイクロモル数で、各オキ
シダーゼの比活性を示した。
当たり1分間に消費される酸素分子のマイクロモル数
で、菌体サンプルについては、乾燥菌体1mg当たり1
分間に消費される酸素分子のマイクロモル数で、各オキ
シダーゼの比活性を示した。
【0069】尚、ピロロキノリンキノンを補酵素とする
酵素があるため、細胞膜懸濁液や菌体懸濁液の各サンプ
ルについて、ピロロキノリンキノン5μM,CaCl2
5mMの濃度で室温で30分間処理することにより、各
サンプルのホロ化を行い、ホロ化を行ったサンプルにつ
いて各オキシダーゼ活性の測定を行った。
酵素があるため、細胞膜懸濁液や菌体懸濁液の各サンプ
ルについて、ピロロキノリンキノン5μM,CaCl2
5mMの濃度で室温で30分間処理することにより、各
サンプルのホロ化を行い、ホロ化を行ったサンプルにつ
いて各オキシダーゼ活性の測定を行った。
【0070】工程13 酸化発酵性の評価 SG培地100mlを、500ml容振盪フラスコに分
注し、常法により滅菌後、グルコノバクター サブオキ
シダンス IFO 3254,グルコノバクターサブオ
キシダンス IFO 3254(pGEA1),グルコ
ノバクター サブオキシダンス IFO 3254(p
GEAC1)のそれぞれの斜面培養物から、その一白金
耳をそれぞれ別個の振盪フラスコに植菌し、30℃で一
晩培養した。それぞれの菌体を集菌後、各取得菌体の半
分を、加熱滅菌された発酵培地50mlにそれぞれ別個
に移植し、500ml容振盪フラスコにて30℃で振盪
培養し、経時的にサンプリングを行って、各培養液の成
分を分析した。発酵培地には、酵母エキス1g/l,C
aCO310g/l,基質が含まれ、基質としては、グ
ルコース100g/l又はソルビトール100g/l又
は、エタノール30ml/lのうち一種類のみをそれぞ
れ単独で用いた。
注し、常法により滅菌後、グルコノバクター サブオキ
シダンス IFO 3254,グルコノバクターサブオ
キシダンス IFO 3254(pGEA1),グルコ
ノバクター サブオキシダンス IFO 3254(p
GEAC1)のそれぞれの斜面培養物から、その一白金
耳をそれぞれ別個の振盪フラスコに植菌し、30℃で一
晩培養した。それぞれの菌体を集菌後、各取得菌体の半
分を、加熱滅菌された発酵培地50mlにそれぞれ別個
に移植し、500ml容振盪フラスコにて30℃で振盪
培養し、経時的にサンプリングを行って、各培養液の成
分を分析した。発酵培地には、酵母エキス1g/l,C
aCO310g/l,基質が含まれ、基質としては、グ
ルコース100g/l又はソルビトール100g/l又
は、エタノール30ml/lのうち一種類のみをそれぞ
れ単独で用いた。
【0071】サンプリングした各培養液のグルコン酸、
酢酸の定量には、ベーリンガー山之内株式会社より購入
したF−キットをそれぞれ用いた。また、ソルボースの
定量には、下記液体クロマトグラフィー条件を用いた。 カラム:DC−613(SHODEX) カラム温度:70℃ 溶媒:アセトニトリル:水=3:1 溶媒流速:1.2ml/min 検出器:島津RID−6Aグルコノバクター サブオキシダンス IFO 325
4,グルコノバクターサブオキシダンス IFO 32
54(pGEA1),グルコノバクター サブオキシダ
ンス IFO 3254(pGEAC1)のそれぞれの
菌株について、酢酸比生成速度、グルコン酸比生成速
度、ソルボース比生成速度をそれぞれ表2に示した。各
発酵生成物の比生成速度は、乾燥重量1gの菌体が1時
間で生成する発酵生成物のグラム数を表している。
酢酸の定量には、ベーリンガー山之内株式会社より購入
したF−キットをそれぞれ用いた。また、ソルボースの
定量には、下記液体クロマトグラフィー条件を用いた。 カラム:DC−613(SHODEX) カラム温度:70℃ 溶媒:アセトニトリル:水=3:1 溶媒流速:1.2ml/min 検出器:島津RID−6Aグルコノバクター サブオキシダンス IFO 325
4,グルコノバクターサブオキシダンス IFO 32
54(pGEA1),グルコノバクター サブオキシダ
ンス IFO 3254(pGEAC1)のそれぞれの
菌株について、酢酸比生成速度、グルコン酸比生成速
度、ソルボース比生成速度をそれぞれ表2に示した。各
発酵生成物の比生成速度は、乾燥重量1gの菌体が1時
間で生成する発酵生成物のグラム数を表している。
【表1】
【表2】
【0072】
【配列表】配列番号:1 配列の長さ:1473 配列の型:核酸 鎖の数:二本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類:Genomic DNA 起源 生物名:グルコノバクター サブオキシダンス(Glu
conobacterSuboxydans) 株 名:IFO12528 配列の特徴 特徴を表す記号:CDS 存在位置:1..1437 特徴を決定した方法:E 特徴を表す記号:sig peptide 存在位置:1..108 特徴を決定した方法:S 特徴を表す記号:mat peptide 存在位置:109..1437 特徴を決定した方法:S 配列番号:2 配列の長さ:13 配列の型:アミノ酸 トポロジー:直鎖状 配列の種類:ペプチド 配列 配列番号:3 配列の長さ:16 配列の型:アミノ酸 トポロジー:直鎖状 配列の種類:ペプチド 配列 配列番号:4 配列の長さ:20 配列の型:核酸 鎖の数:一本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類:他の核酸 合成DNA 配列 GCATTATTiC CCCAiCCTTT 20 30配列番号:5 配列の長さ:20 配列の型:核酸 鎖の数:一本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類:他の核酸 合成DNA 配列 GCATTATTiC CCCAiCCCTT 20 配列番号:6 配列の長さ:20 配列の型:核酸 鎖の数:一本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類:他の核酸 合成DNA 配列 GCATTGTTiC CCCAiCCTTT 20 配列番号:7 配列の長さ:20 配列の型:核酸 鎖の数:一本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類:他の核酸 合成DNA 配列 GCATTGTTiC CCCAiCCCTT 20 配列番号:8 配列の長さ:20 配列の型:核酸 鎖の数:一本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類:他の核酸 合成DNA 配列 GCGTTATTiC CCCAiCCTTT 20 配列番号:9 配列の長さ:20 配列の型:核酸 鎖の数:一本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類:他の核酸 合成DNA 配列 GCGTTATTiC CCCAiCCCTT 20 配列番号:10 配列の長さ:20 配列の型:核酸 鎖の数:一本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類:他の核酸 合成DNA 配列 GCGTTGTTiC CCCAiCCTTT 20 配列番号:11 配列の長さ:20 配列の型:核酸 鎖の数:一本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類:他の核酸 合成DNA 配列 GCGTTGTTiC CCCAiCCCTT 20
conobacterSuboxydans) 株 名:IFO12528 配列の特徴 特徴を表す記号:CDS 存在位置:1..1437 特徴を決定した方法:E 特徴を表す記号:sig peptide 存在位置:1..108 特徴を決定した方法:S 特徴を表す記号:mat peptide 存在位置:109..1437 特徴を決定した方法:S 配列番号:2 配列の長さ:13 配列の型:アミノ酸 トポロジー:直鎖状 配列の種類:ペプチド 配列 配列番号:3 配列の長さ:16 配列の型:アミノ酸 トポロジー:直鎖状 配列の種類:ペプチド 配列 配列番号:4 配列の長さ:20 配列の型:核酸 鎖の数:一本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類:他の核酸 合成DNA 配列 GCATTATTiC CCCAiCCTTT 20 30配列番号:5 配列の長さ:20 配列の型:核酸 鎖の数:一本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類:他の核酸 合成DNA 配列 GCATTATTiC CCCAiCCCTT 20 配列番号:6 配列の長さ:20 配列の型:核酸 鎖の数:一本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類:他の核酸 合成DNA 配列 GCATTGTTiC CCCAiCCTTT 20 配列番号:7 配列の長さ:20 配列の型:核酸 鎖の数:一本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類:他の核酸 合成DNA 配列 GCATTGTTiC CCCAiCCCTT 20 配列番号:8 配列の長さ:20 配列の型:核酸 鎖の数:一本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類:他の核酸 合成DNA 配列 GCGTTATTiC CCCAiCCTTT 20 配列番号:9 配列の長さ:20 配列の型:核酸 鎖の数:一本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類:他の核酸 合成DNA 配列 GCGTTATTiC CCCAiCCCTT 20 配列番号:10 配列の長さ:20 配列の型:核酸 鎖の数:一本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類:他の核酸 合成DNA 配列 GCGTTGTTiC CCCAiCCTTT 20 配列番号:11 配列の長さ:20 配列の型:核酸 鎖の数:一本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類:他の核酸 合成DNA 配列 GCGTTGTTiC CCCAiCCCTT 20
【0073】
【発明の効果】本発明によれば、配列番号1に示された
アミノ酸配列をコードする塩基配列を有する遺伝子を含
むプラスミドを作製し、該プラスミドを保有する細胞を
育種し、該細胞を用いて酸化発酵を行うことにより、該
発酵の生産性を向上させることができる。
アミノ酸配列をコードする塩基配列を有する遺伝子を含
むプラスミドを作製し、該プラスミドを保有する細胞を
育種し、該細胞を用いて酸化発酵を行うことにより、該
発酵の生産性を向上させることができる。
【図1】約2.1kb HindIII−BglII断
片の制限酵素地図である。尚、kbは、キロベースを表
している。
片の制限酵素地図である。尚、kbは、キロベースを表
している。
【図2】実施例の工程2−(2)におけるアルギニルエ
ンドペプチダーゼ限定加水分解ペプチドの同工程で示し
た液体クロマトグラフィー条件での生成物の分離パター
ンを示している。ペプチド分画Iに対応するピークが分
離パターン中のIで示したピークであり、ペプチド分画
IIに対応するピークが図中のIIで示したピークであ
る。
ンドペプチダーゼ限定加水分解ペプチドの同工程で示し
た液体クロマトグラフィー条件での生成物の分離パター
ンを示している。ペプチド分画Iに対応するピークが分
離パターン中のIで示したピークであり、ペプチド分画
IIに対応するピークが図中のIIで示したピークであ
る。
【図3】pCYT3の制限酵素地図である。尚、同図面
において、太い線は、チトクロムC−553(CO)の
全遺伝子を含む約2.7kbのDNA断片を示し、細い
線は、大腸菌ベクターpHSG298由来のDNA断片
を示す。
において、太い線は、チトクロムC−553(CO)の
全遺伝子を含む約2.7kbのDNA断片を示し、細い
線は、大腸菌ベクターpHSG298由来のDNA断片
を示す。
【図4】pGEA1の制限酵素地図である。尚、同図面
において、太い線は、グルコノバクター サブオキシダ
ンス IFO 3130由来のプラスミド断片を示し、
細い線は大腸菌ベクターpUC18由来のDAN断片を
示す。
において、太い線は、グルコノバクター サブオキシダ
ンス IFO 3130由来のプラスミド断片を示し、
細い線は大腸菌ベクターpUC18由来のDAN断片を
示す。
【図5】pGEAC1の制限酵素地図である。尚、同図
面において、黒色の太い線はチトクロムC−553(C
O)の全遺伝子を含む約2.7kbのDNA断片を示
し、白ぬきの太い線は、グルコノバクター サブオキシ
ダンス IFO 3130由来のプラスミド断片を示
す。また、細い線は、大腸菌ベクターpUC18由来の
DNA断片を示す。図3、図4、および図5において、
BamHI,EcoRI,HindIII,PstI,
SacI,SalI,SmaI,SphI,XbaIは
それぞれ制限酵素BamHI,制限酵素EcoRI,制
限酵素HindIII,制限酵素PstI,制限酵素S
acI,制限酵素SalI,制限速度SmaI,制限酵
素SphI,制限酵素XbaIの切断部位を示す。図4
および図5において、SalI/XhoIは、制限酵素
SalIによって切断されて生じた切断末端と制限酵素
XhoIによって切断されて生じた切断末端との接続部
位を示す。
面において、黒色の太い線はチトクロムC−553(C
O)の全遺伝子を含む約2.7kbのDNA断片を示
し、白ぬきの太い線は、グルコノバクター サブオキシ
ダンス IFO 3130由来のプラスミド断片を示
す。また、細い線は、大腸菌ベクターpUC18由来の
DNA断片を示す。図3、図4、および図5において、
BamHI,EcoRI,HindIII,PstI,
SacI,SalI,SmaI,SphI,XbaIは
それぞれ制限酵素BamHI,制限酵素EcoRI,制
限酵素HindIII,制限酵素PstI,制限酵素S
acI,制限酵素SalI,制限速度SmaI,制限酵
素SphI,制限酵素XbaIの切断部位を示す。図4
および図5において、SalI/XhoIは、制限酵素
SalIによって切断されて生じた切断末端と制限酵素
XhoIによって切断されて生じた切断末端との接続部
位を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 FI 技術表示箇所 C12R 1:01) (C12N 1/21 C12R 1:01)
Claims (4)
- 【請求項1】配列番号1のアミノ酸配列をコードする塩
基配列を有していることを特徴とするC型チトクロム遺
伝子。 - 【請求項2】配列番号1のアミノ酸配列をコードする塩
基配列を有する遺伝子を含んでいることを特徴とするプ
ラスミド。 - 【請求項3】配列番号1のアミノ酸配列をコードする遺
伝子を含むプラスミドを保有していることを特徴とする
細胞。 - 【請求項4】配列番号1のアミノ酸配列をコードする塩
基配列を有する遣伝子を含むプラスミドを保有した細胞
を用いることを特徴とする酸化発酵法。
Priority Applications (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP23857991A JPH0549480A (ja) | 1990-06-14 | 1991-06-14 | C型チトクロム遺伝子及び酸化発酵法 |
FR9207131A FR2677665A1 (fr) | 1991-06-14 | 1992-06-12 | Plasmide contenant un gene d'un cytochrome specifique et procede de fermentation par oxydation. |
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2-154096 | 1990-06-14 | ||
JP15409690 | 1990-06-14 | ||
JP23857991A JPH0549480A (ja) | 1990-06-14 | 1991-06-14 | C型チトクロム遺伝子及び酸化発酵法 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPH0549480A true JPH0549480A (ja) | 1993-03-02 |
Family
ID=26482509
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP23857991A Withdrawn JPH0549480A (ja) | 1990-06-14 | 1991-06-14 | C型チトクロム遺伝子及び酸化発酵法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JPH0549480A (ja) |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO1999020763A1 (fr) * | 1997-10-17 | 1999-04-29 | Fujisawa Pharmaceutical Co., Ltd. | D-sorbitol deshydrogenase, genes et utilisation de celle-ci |
US6221439B1 (en) | 1996-07-18 | 2001-04-24 | Daimlerchrysler Ag | Method for applying a coating film on a three-dimensionally curved substrate |
-
1991
- 1991-06-14 JP JP23857991A patent/JPH0549480A/ja not_active Withdrawn
Cited By (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US6221439B1 (en) | 1996-07-18 | 2001-04-24 | Daimlerchrysler Ag | Method for applying a coating film on a three-dimensionally curved substrate |
US6596390B1 (en) * | 1996-07-18 | 2003-07-22 | Daimlerchrysler Ag | Coating film for coating on a three-dimensionally curved substrate |
WO1999020763A1 (fr) * | 1997-10-17 | 1999-04-29 | Fujisawa Pharmaceutical Co., Ltd. | D-sorbitol deshydrogenase, genes et utilisation de celle-ci |
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Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A300 | Withdrawal of application because of no request for examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A300 Effective date: 19980903 |