KR19980067476A - 아스퍼질러스 나이거 변이주에 의한 글루코스 옥시다제 제조방법 - Google Patents

아스퍼질러스 나이거 변이주에 의한 글루코스 옥시다제 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 글로코스 옥시다제를 대량생산하기 위해서 유전자 조작에 의해 만들어진 재조합 균주인 아스퍼질러스 나이거 GOD4를 제조하는 방법과 이를 이용하여 글로코스 옥시다제를 대량 생산하는 방법에 관한 것이다. 좀더 구체적으로 아스퍼질러스 나이거에서 분리된 글로코스 옥시다제 유전자에 아스퍼질러스 나이드란스의 GPD 프로모터와 아스퍼질러스 오라이제의 알파아밀라제 시그날시컨스 및 터미네이터를 조립하여 발현벡터 pGDS3를 제조하고 이를 숙주세포 아스퍼질러스 나이거에 도입하여 재조합된 균주 아스퍼질러스 나이거 GOD4와 이를 발효시켜 글로코스 옥시다제를 대량으로 생산하는 방법에 관한 것이다.

Description

아스퍼질러스 나이거 변이주에 의한 글루코스 옥시다제 제조방법
본 발명은 글루코스 옥시다제를 대량생산하기 위해서 유전자 조작에 의해 만들어진 재조합 균주인 아스퍼질러스 나이거 GOD4를 제조하는 방법과 이를 이용하여 글루코스 옥시다제를 대량 생산하는 방법에 관한 것이다, 좀더 구체적으로 설명하면, 아스퍼질러스 나이거 ATCC-9029호에서 유래한 글루코스 옥시다제 유전자에 아스퍼질러스속의 다른 종으로부터 유래한 프로모터나 시그날시컨스를 조립시킨 후 아스퍼질러스에서 발현되는 발현 프라스미드에 도입시켜 글루코스 옥시다제를 아스퍼질러스 숙주균주 내에서 대량 발현시키기 위한 형질전환된 재조합 균주 및 이를 발효배양시켜 글루코스 옥시다제를 대량으로 생산하는 방법에 관한 것이다.
글루코스 옥시다제는 시료중 글루코스 농도를 측정하는데 사용되므로 혈당농도를 측정하는데 이용되는 진단 키트 제조에 널리 쓰이며 음료나 캔음식물 등 포장된 음식물 장기 저장을 위한 산화 방지제로서 용기내 산소를 제거하는데 사용된다.
글루코스 옥시다제는 베타디글루코스와 산소를 이용하여 디클루코노락톤과 과산화수소로 전환시키는데 관여하는 효소이며 이 반응을 통해서 나오는 부산물인 과산화수소는 카탈라아제에 의해 산소와 물로 전환된다. 이 효소는 베타디클루코스와 100% 친화력을 갖고 있다.
글루코스 옥시다제는 처음으로 독일의 뮬러가 1928년에 아스퍼질러스 나이거와 페니실리움 글라우큠의 세포 추출액으로부터 추출하였다. 미생물내에서 글루코스 옥시다제의 위치는 페니실리움의 경우 세포막 밖에 존재하고 아스퍼질러스 나이거의 경우는 세포막 밖과 안 동시에 존재한다고 알려져 있다. 라이스(Histochemie 7, 202-210 (1966))와 반 다이즈칸(Europ. J. Appl. Microbiol. Biotechnol. 9, 275-283(1980))은 마이셀(mycel)의 펄옥시조멘에서 글루코스 옥시다제를 분리하였고, 뮬러는 아스퍼질러스 나이거의 배양액으로부터 효소를 추출하였다.
아스퍼질러스 나이거의 글루코스 옥시다제 구조는 분자량이 150∼180kDa이며, FAD와 결합되어 있는 당단백질로써 각각 70∼80 kDa인 2개의 서브유니트로 구성되어 있고 각 유니트는 한분자의 FAD와 견고하게 결합되어 있으며, KD값은 1.3×10-10이다.
글루코스 옥시다제 유전자는 1815개의 뉴크레오타이트로 구성되어 있고 이것은 605개의 아미노산을 코딩하고 있다. 또한 이 유전자안에는 인트론이 존재하지 않고 5 프라임 말단부분에는 22개의 아미노산으로 구성된 시그날시컨스를 가지고 있다. 이 시그날시컨스는 아스퍼질러스 나이거로부터 글루코스 옥시다제를 분비시키도록 하여주며 그 과정중 이 시그날시컨스는 시그날펩티다아제에 의해 분해된다. 글루코스 옥시다제는 시그날시컨스가 분해된 후 활성화하게 된다.
글루코스 옥시다제 생산은 발효에 의한 아스퍼질러스속이나 페니실리움속에서 주로 추출을 하고 있다(미국특허 제2,482,724호, 미국특허 제3,701,715호). 유전자 조작을 통한 제조방법으로는 아스퍼질러스 나이거의 글루코스 옥시다제 유전자를 효모 발현 프라스미드에 도입함으로 만든 재조합 효모균주를 이용하여(미국특허 제5,266,688호). 아스퍼질러스 퍼티더스의 글루코스 옥시다제 유전자를 재조합시킨 아스퍼질러스 퍼티더스 균주를 사용하여 글루코스 옥시다제를 생산한다(유럽특허 제0 655 291 A1호).
기존의 아스퍼질러스나 페니실리움 발효에 의한 글루코스 옥시다제의 생산은 그 생산량이 0.29 Unit/mL로 (Markwell et al., Appl. Microbiol. Biotechnol. 30, 166-169(1989)) 매우 적기 때문에 대량생산을 목적으로 생산 균주를 변형시키거나 또는 이종의 균주에다 발현시켜 생산을 증가시키는 노력을 하고 있다. 이를 위해 돌연변이나 유전공학적 방법을 사용하기도 한다. 유전자조작에 의한 군쥬개량시 숙주 균주로 효모를 사용할 경우 효모내로 유전자 도입은 숙주균주로 곰팡이를 이용하는 경우에 비해 편리하다는 좋은 점이 있으나 목적유전자가 당단백질의 경우에는 발현되는 단백질의 당화현상이 과도하게 되는 문제점이 있다.
또한 글루코스 옥시다제는 현재 산업적으로 아스퍼질러스에서 생산을 하고 있는 현실을 감안할 때 대량생산을 위해서 본 발명에서는 기존의 생산균주인 아스퍼질러스 나이거를 숙주균주로 사용하고, 아스퍼질러스 나이거 고유의 글루코스 옥시다제 유전자를 이용하여 고유의 프로모터와 시그날시퀀스 유전자를 아스퍼질러스의 다른 종에서 유래한 강한 프로모터와 시그날시퀀스로 치환시켜 줌으로서 글루코스 옥시다제 발현 프라스미드를 제조하였다. 이 프라스미드를 아스퍼질러스 나이거내로 형질전환시켜 균내에서 글로코스 옥시다제 유전자를 대량으로 발현시켜 글루코스 옥시다제를 다량 분비시킬 수 있게 하였다.
제1도는 본 발명의 프라스미드 pGDS3의 유전자 조합을 나타낸 도면이다.
따라서 본 발명은 아스퍼질러스 나이거에서 분리된 글루코스 옥시다제 유전자에 아스퍼질러스 나이드란스의 GPD 프로모터와 아스퍼질러스 오라이제의 알파아밀라제 시그날 시컨스 및 터미네이터를 조립하여 제조된 발현벡터 pGDS3를 제조하고 이를 숙주세포 아스퍼질러스 나이거에 도입하여 재조합된 균주 아스퍼질러스 나이거 GOD4와 이를 발효시켜 글루코스 옥시다제를 대량으로 생산하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 재조합균주 아스퍼질러스 나이거 GOD4는 1997년 1월 10일 한국종균협회내에 한국미생물보존센터에 기탁번호 KFCC-10945호로 기탁하였다.
이때 숙주세포로는 아스퍼질러스 나이거 NRRL3을 사용하는 것이 가장 바람직하였고, 형질전환된 균주는 항생물질 하이그로마이신 B의 저항성을 이용 선별하였다. 재조합된 균주는 발현배지를 통해 발현의 정도를 확인할 수 있었고, 이때 생성된 H2O2의 농도에 따라 O-디아니시딘을 첨가 발현배지에서 그 양을 정량적으로 측정할 수 있었다. 숙주세포로는 아스퍼질러스 나이거가 아스퍼질러스속의 다른 종 아스퍼질러스 나이드란스 또는 아스퍼질러스 오라이제에 비해 우수한 발현효과를 나타내었다.
또한 본 발명은 재조합 균주 아스퍼질러스 나이거 GOD4를 발효배지에서 회분식 배양하여 글루코스 옥시다제를 제조하는 방법으로서, 이때 바람직한 발효배지는 (NH4)2HPO40.1∼0.5g/l, KH2PO40.1∼0.5 g/l, MgSO4·7H2O 0.1∼0.3g/l, CaCO32∼5%, 박토-펩톤 2∼6%, 글로코스 4∼10%로 구성된 발효배지임을 특징으로 한다.
이하 본 발명을 상세히 설명하면 다음과 같다.
아스퍼질러스 나이거의 글루코스 옥시다제 유전자는 아스퍼질러스 나이거 ATCC-9029호의 mRNA로부터 cDNA 라이브러리로부터 분리하였다. 이 유전자에다 효과적인 발현 및 분비를 유도하기 위해서 아스퍼질러스 나이드란스의 GPD 프로모터(글리세롤알데하이드-포스페이트-디하이드로지아나제, glycerolalde hyde-3'-phosphate-dehydrogenase)와 아스퍼질러스 오라이제의 알파아밀라아제 시그날펩타이드를 치환 합성하여 발현 프라스미드 pGDS3를 제조하였다.
아스퍼질러스 나이드란스의 GPD 프로모터를 조립하기 위해 GPD 프로모터를 찾고 있는 프라스미드 pAN 51-1을 제한 효소인 EcoR I과 Nco I를 이용하여 절단한 후 아스퍼질러스 오라이제의 알파-아밀라제 시그날시컨스와 글루코스 옥시다제 5 프레임 말단 아미노산 서열을 갖고 있는 프라스미드 pPp*4.13(Nasel)-Sal에 삽입시켰다. 이 중간 프라스미드를 p435로 명명하였다. 그 다음 글루코스 옥시다제 유전자를 함유하고 있는 프라스미드 pSK+3.0/2.0 Sal를 제한효소 Sal I으로 절단한 다음 Sal I으로 절단한 p435에 삽입시켰다. 이렇게 제조된 발현 프라스미드를 pGDS3으로 명명하였다.
재조합된 발현 프라스미드 벡터 pGDS3을 Tilburn 방법으로 실렉션 마커로 함께 사용하는 pAN 7-1과 함께 숙주균주된 아스퍼질러스 나이거 ATCC-9029호에 도입 형질전환시킨다. 실렉션 마커로 쓰인 pAN 7-1 프라스미드는 하이그로마이신 저항성 유전자를 가지고 있으므로 형질 전환된 숙주균주된 선별은 하이그로마이신이 함유된 배지에서 성장이 되는 클론을 선택함으로 진행하였다.
형질 전환된 균주가 생산하는 글루코스 옥시다제 생산정도는 효소 활성을 측정함으로써 확인하였다. 이때 정성 측정 방법으로는 퍼옥시다아제에 의해 환원된 과산화수소를 오-디아니시딘을 이용 측정하고 정량적으로 측정흘 할 경우에는 수용성이 훌륭한 에이비티에시(ABTS)를 오-디아니시딘 대신 사용하여 측정하였다.
글루코스 옥시다제 활성분석 결과 가장 우수한 클론을 선정하여 GOD4로 명명하였고 그 발현량은 1.2 Unit/mL 였다. 생산력 증강을 위해서 숙주균주를 변경하여 글루코스 옥시다제 생산능력을 비교하였다. 발현 프라스미드 pGDS3을 아스퍼질러스 나이드란스 그리고 아스퍼질러스 오라이제에 전이한 다음 각 형질전화체를 첵팍-독스배지(3% 설탕, 0.2% NaNO3, 0.05% KCL, 0.05% Mg-Glycerphosphate, 0.035% K2SO4, 0.001% FeSO4, pH 6.8)에서 온도 30℃, 250 rpm, 4일간 플라스크 배양하였다. 결과 형질전환된 아스퍼질러스 나이거, 아스퍼질러스 오라이제와 아스퍼질러스 나이드란스의 글루코스 옥시다제의 효소활성이 각각 1.9 Unit/mL, 1.4 Unit/mL, 0.5 Unit/mL로 숙주균주로는 아스퍼질러스 나이거가 가장 적합한 것으로 나타났다.
재조합 균주의 글루코스 옥시다제 생산을 최적화하기 위해서 5L 회분식 발효를 실시하였다. 배양후 발효액에서 효소역가 측정 결과는 형질전환된 균주를 아스퍼질러스 나이거 와일드 타입 균주보다 효소생산량이 약 150배 정도 향상되었음을 알 수 있었다.
이하 본 발명을 좀더 상세히 설명하면 다음과 같다.
[실시예 1] 재조합 벡터의 조립
글루코스 옥시다제의 재조합 생산균주 개발을 위하여 아스퍼질러스 나이드란스의 GPD(glycerolaldehyde-3'-phosphate-dehydrogenase) 프로모터, 아스퍼질러스 오라이제의 알파아밀라제 시그날시컨스, 아스퍼질러스 나이거의 글로코스 옥시다제 유전자와 터미네이터를 이용하여 발현벡터 pGDS3을 개발하였다. 발현벡터 pGDS3의 크로닝 방법은 다음과 같다.
아스퍼질러스 오라이제의 알파아밀라에 프로모터와 시그날시컨스, 그리고 글루코스 옥시다제 N-말단이 들어있는 pPp.*4.13(Nae)-Sal 프라스미드 200㎍과 아스퍼질러스 나이드란스의 GPD 프로모터가 있는 pAN 52-1 500㎍를 절단효소 EcoR I과 Nco I으로 37℃에서 절단한 후 T4DNA-라이가제 1 유니트를 이용하여 16시간동안 10℃하에서 접합을 시킨다. 재결합된 pAN 52-1의 형질전환을 방지하기 위해 잔유하는 T4DNA-라이가제를 불활성시키기 위하여 이 라이게이숀 프로브를 15분간, 65℃에 가열한 후 20 유니트 BanH I으로 절단, 37℃하에서 4시간 배양한 후, 이.콜라이 5-α 콤피턴트 셀에 형질전환을 시켰다. 얻어진 클론들을 아가로즈젤 상에서 분석하여 아스퍼질러스 나이거의 GPD 프로모터가 올바르게 삽입된 프라스미드 p435를 얻었다. 이 프라스미드에 글루코스 옥시다제 유전자(pGOD2)을 삽입시키기 위하여 p435 200㎍과 pGOD2 300㎍을 XmaⅢ와 HindⅢ로 절단, T4DNA 라이가제 1유니트를 이용하여 16시간, 10℃하에서 접합시킨 후, 이.콜라이 5-α 콤피턴트 셀에 형질전환 하였다. 얻어지는 클론들을 아가로즈 젤상에서 분석하여 글루코스 옥시다제 유전자의 N-말단부분이 올바르게 삽입된 프라스미드 p450를 얻었다. 나머지 글루코스 옥시다제 유전자를 삽입시키기 위하여 p435 200㎍과 p450 400㎍을 XmaⅢ로 절단한 후 T4DNA 라이가제 1유니트를 이용하여 16시간, 10℃하에서 접합시킨다. 인설트가 결합되지 않고 재결합된 p450의 형질전환을 방지하기 위해 잔유하는 T4DAN 라이가제를 불황시켰다. 이를 위해 반응물을 15분간 65℃에 가열하였다. 결합된 프라스미드는 이.콜라이 5-α 콤피턴트 셀에 형질전환시킨다. 형질전환체들로부터 프라스미드 DNA를 추출하여 아가로즈 젤 상에서 글루코스 옥시다제 유전자가 올바르게 삽입된 프라스미드를 선별하였다. 이렇게 얻은 발현프라스미드를 pGDS3라 명명하였다. 발현 프라스미드 pGDS3에는 아스퍼질러스 나이드란스의 GPD 프로모터, 아스퍼질러스 오라이제의 알파 아밀라제 시그날시컨스, 아스퍼질러스 나이거의 글루코스 옥시다제 유전자와 터미네이터가 포함되어 있다.
[실시예 2] 재조합 벡터의 숙주세포에의 전이
재조합 벡터 pGDS3의 숙주세포 아스퍼질러스 나이거 NRRL3으로의 전이는 Tilburn et al., (1983) 방법에 의해 실행되었다. 형질전환체의 선별은 코트랜스퍼 메이숀시 사용된 선별 프라스미드 pAN 7-1에 의해 선별하였다.
3개의 CM 배지(글루코스 2%, 맥아추출물 2%, 박토펩톤 0.1%)에 아스퍼질러스 나이거 NRRL3 포자를 골고루 분산시킨 후 37℃하에 포자가 골고루 형성될때까지 2∼3일간 배양한다. 10ml 0.01% 트윈 80에 잘 섞은 후 포자를 적절한 량의 0.02% (w/v) 카제인하이드로라이세이트(caseinhydrolysate)가 포함된 체팍독스배지에 접종한 후 30℃에서 균사가 형성될 때까지 배양한다. 여과지에 여과한 후 10mM 포타슘포스페이트 용액으로 잘 세척하였다. 균사를 건조시킨 후 적절한 량의 포타슘포스페이트 용액과 세포외벽을 파쇄하기 위해서 노보자임과 글루큐로닉다제를 넣은 후 2∼3시간 배양하여 프로토프라스트를 형성시켰다. 형성된 프로토프라스트는 솔비톨 그래디언트 원심분리를 이용 분리 수집하였다. 각 10㎍의 발현프라스미드 pGDS3와 선별 프라스미드 pAN 7-1을 200㎕의 프로토프라스트에 섞은 후 60% 폴리에틸렌글리콘 6000을 첨가 전이를 유도하였다.
형질전환체들은 항생물질인 하이그로마이신 B 저항성을 이용 선별하였다. 하이드로마이신 B는 리보좀내의 펩티딜-tRNA에 삽입되어 펩티딜-tRNA의 트랜스레이숀을 방해한다. 선별 프라스미드 pAN 7-1에는 하이그로마이신 B 포스포트랜스퍼라제 유전자가 포함되어 있고 이 효소는 하이그로마이신 B를 불활성화시키므로 선별 프라스미드와 같이 전이된 발현 프라스미드 pGDS3는 하이드로마이신 B가 함유된 배지를 통해 선별될 수 있다.
[실시예 3] 재조합 균주의 발현
형질전환된 재조합 균쥬들은 발현배지를 통해 발현정도를 확인할 수 있다. 글루코스 옥시다제는 산화반응시 1몰의 글루코스당 동량의 H2O2가 생성되는 반응에 관여하고 생성된 H2O2의 농도는 퍼옥시다제에 의해 H2O로 환원되므로 크로도젠인 O-디아니시딘이 존재할 경우 O-디아니시딘은 전자를 방출하여 산화되어 색깔이 짙은 갈색으로 변한다. 이 원리를 이용하여 적절한 배지에 O-디아니시딘을 첨가하여 만든 발현배지를 이용하여 형질전환된 재조합균주들이 생성 분비되어 나오는 글루코스 옥시다제 발현정도를 갈색의 환크기로 비교하여 우수 재조합균주를 선별하였다. 선별된 재조합균주들은 프라스크 배양을 통해 균주가 발현하는 글루코스 옥시다제의 활성을 분석하여 그 생산정도를 정량적으로 분석하였다. 정량분석시에는 O-디아니시딘 대신에 에에비티시(2,2'-Azino-di-[3-ethyl benzthiazolin-sulfonic acid)를 사용하였고 흡광도 측정은 420nm, 온도 25℃, 측정시간 4분, 측정간격 30초의 조건하에서 실시하였다. 선별된 우수 재조합균주들의 글루코스 옥시다제 발현정도의 비교는 플라스크 배양을 실시하여 실험하였다.
[실시예 4] 타 균주와의 생산 비교
발현 프라스미드 pGDS3의 다른 숙주균주에서의 발현을 위하여 아스퍼질러스 나이거외에 아스퍼질러스 나이드란스와 아스퍼질러스 오라이제에서 시도를 해 보았다. 아스퍼질러스 나이드란스와 아스퍼질러스 오라이제는 자체내에 하이드로마이신 B 저항성이 강하기 때문에 다른 선별체계인 우리딘 옥소트로프를 이용하여 재조합 균주의 선별을 시도하였다. 형질전환 방법 및 발현되는 글루코스 옥시다제의 분석은 실시예 2와 실시예 3의 방법을 이용하였다. 형질전환된 재조합 균주의 글루코스 옥시다제의 활성은 다음과 같다.
발현 프라스미드 pGDS3가 들어있는 재조합균주 숙주인 아스퍼질러스 나이거 NRRL3에서 1.88 Unit/mL 글루코스 옥시다제 활성을 나타낸 반면 아스퍼질러스 나이드란스 G191에서는 1.44 Unit/mL, 아스퍼질러스 오라이제 AO4.1에서는 0.46 Unit/mL를 나타냈다. 위 실험결과로 미루어 보아 발현 프라스미드 pGDS3의 발현은 원래 숙주인 아스퍼질러스 나이거 NRRL3에서 가장 일어나는 것으로 나타났다.
[실시예 5] 유전자 재조합 변이주의 발효실험
재조합 균주들 중 가장 높은 글루코스 옥시다제 활성을 보이는 아스퍼질러스 나이거 GOD4를 5L 회분식 발효조를 이용 배양을 실시하였다. 발효배지는 (NH4)2HPO40.1∼0.5g/l, KH2PO40.1∼0.5 g/l, MgSO4·7H2O 0.1∼0.3g/l, CaCO32∼5%, 박토-펩톤 2∼6%, 글로코스 4∼10%를 사용하였고, 발효조건으로는 교반속도 450∼500rpm, 공기주입 0.8 vvm(l/min), pH 5.1, 온도 30℃로 하여 실시하였다. 실험한 결과 발효시간에 따른 글루코스 옥시다제의 활성은 다음과 같다.
재조합 균주 아스퍼질러스 나이거 GOD4는 발효 209시간 경과 후 글루코스 옥시다제 활성 47.8 Unit/mL로 보여주었고 이 수치는 아스퍼질러스 나이거 와일드 균주가 보여준 0.3 Unit/mL보다 약 150배 정도 현저히 증가된 것을 알 수 있다.
본 발명의 형질전환 재조합 균주 아스퍼질러스 나이거 GOD4를 이용하여 종래의 야생형 아스퍼질러스 나이거 균주보다 글루코스 옥시다제 생산량이 약 150배 정도 향상된 방법으로 글루코스 옥시다제를 제조할 수 있었다.

Claims (5)

  1. 아스퍼질러스 나이거에서 분리된 글루코스 옥시다제 유전자에 아스퍼질러스 나이드란스의 GPD 프로모터와 아스퍼질러스 오라이제의 알파아밀라제 시그날 시컨스 및 터미네이터를 조립하여 제조된 발현벡터 pGDS3
  2. 제1항의 발현벡터 pGDS3를 숙주세포 아스퍼질러스 나이거에 도입하여 재조합된 균주 아스퍼질러스 나이거 GOD4 (KFCC-10945호)
  3. 제2항에 재조합 균주 아스퍼질러스 나이거 GOD4를 발효배지에서 회분식 배양하여 글루코스 옥시다제를 제조하는 방법
  4. 제3항에 있어서, 발효배지는 (NH4)2HPO40.1∼0.5g/l, KH2PO40.1∼0.5 g/l, MgSO4·7H2O 0.1∼0.3g/l, CaCO32∼5%, 박토-펩톤 2∼6%, 글로코스 4∼10%로 구성된 발효배지임을 특징으로 하는 글로코스 옥시다제의 제조방법
  5. 제3항의 방법에 따라 제조된 글로코스 옥시다제
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KR101320059B1 (ko) * 2011-10-18 2013-10-18 주식회사 글루칸 재조합 벡터, 상기 벡터를 포함하는 재조합 효모 및 상기 효모를 이용한 글루코스 옥시다아제의 대량 생산 방법

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