FR2664290A1 - Sondes genetiques specifiques de toxoplasma gondii, et leur utilisation pour la detection in vitro de toxoplasma gondii et pour le typage des souches toxoplasmiques. - Google Patents
Sondes genetiques specifiques de toxoplasma gondii, et leur utilisation pour la detection in vitro de toxoplasma gondii et pour le typage des souches toxoplasmiques. Download PDFInfo
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Abstract
La présente invention concerne le dépistage de la toxoplasmose. Le but de l'invention est de permettre la détection de Toxoplasma gondii rapide, très sensible et applicable en routine. Ce but est atteint à l'aide d'acides nucléiques consistant en tout ou partie des séquences d'ADN choisies parmi TGR1A, TGR1E, TGR2 et TGR4 ou les séquences complémentaires correspondantes, ou lesdites séquences modifiées par des substitutions et/ou des additions et/ou des suppressions de un ou plusieurs nucléotides de sorte à ne pas affecter leurs propriétés. Le procédé pour la détection de Toxoplasma gondii selon l'invention consiste à sélectionner au préalable des oligonucléotides spécifiques, à amplifier l'ADN à analyser contenu dans un échantillon biologique par la méthode de la "Polymerase Chain Reaction", à séparer, dénaturer, transférer et fixer sur une membrane les fragments d'ADN amplifiés et à réaliser une tentative d'hybridation avec l'un des oligonucléotides sélectionnés, marqué. Les acides nucléiques selon l'invention peuvent également être utilisés pour le typage des souches de Toxoplasma gondii.
Description
"SONDES GENETIQUES SPECIFIQUES DE TOXOPLASMA
GONDII, ET LEUR UTILISATION POUR LA DETECTION IN VITRO
DE TOXOPLASMA GONDII ET POUR LE TYPAGE DES SOUCHES TOXOPLASMIQUES."
La présente invention concerne le dépistage de la toxoplasmose.
GONDII, ET LEUR UTILISATION POUR LA DETECTION IN VITRO
DE TOXOPLASMA GONDII ET POUR LE TYPAGE DES SOUCHES TOXOPLASMIQUES."
La présente invention concerne le dépistage de la toxoplasmose.
La toxoplasmose est une parasitose due à un sporozoaire : Toxoplasme sondes. Elle induit une immunité définitive prevenant tout risque de nouvelle contamination.
Cependant, la prophylaxie existante se révèle bien insuffisante dans le cas de formes graves de toxoplasmose telle celle rencontrée chez les sujets immuno-déficients et la toxoplasmose congénitale. Dans le premier cas, elle correspond à une décompensation immunitaire ayant pour conséquence la réactivation de parasites enkystés. Elle induit très souvent des encéphalites toxoplasmiques mortelles. Dans le second cas, elle fait suite à une infection contracte pendant la grossesse et transmise au foetus par voie transplacentaire. Selon la precarité de cette infection, elle peut provoquer un avortement spontané, des malformations du système nerveux ou des handicaps psycho-moteurs profonds chez le bébé, ou encore des risques de cécité.
Aussi, face à ces conséquences dramatiques, le diagnostic de la maladie revêt une importance primordiale. A ce jour, de nombreuses méthodes ont été mises au point. On distingue
- les méthodes indirectes : il s'agit du diagnostic serologique, qui consiste à rechercher la présence de certains anticorps témoignant d'une infection passée ou en cours d'évolution et à déceler leur variation au cours du temps dans des sérums, liquides céphalo-rachidiens ou amniotiques.
- les méthodes indirectes : il s'agit du diagnostic serologique, qui consiste à rechercher la présence de certains anticorps témoignant d'une infection passée ou en cours d'évolution et à déceler leur variation au cours du temps dans des sérums, liquides céphalo-rachidiens ou amniotiques.
Chez les sujets immuno-déficients et en particulier ceux atteints du SIDA, les résultats obtenus sont souvent ininterprétables en raison de variations non significatives des titres anticorps.
Chez les femmes enceintes, la toxoplasmose est facilement diagnostiquée. En revanche, il est difficile de savoir s'il y a eu contamination du foetus ; en effet, les causes d'erreurs ou d'impossibilité d'interprétation sont fréquentes, principalement du fait de l'immaturité foetale.
- les méthodes directes : il s'agit du diagnostic parasitologique. Etant donne qu' on ne connaît pas à ce jour de techniques immuno-enzymatiques ou immuno-chimiques fiables permettant de détecter la présence de toxoplasmes dans un échantillon biologique, l'inoculation à la souris ou la culture cellulaire in vitro restent les seules méthodes utilisables.
Malheureusement, le délai d'obtention des résultats est très long (4 à 6 semaines) et la mort par lésions cérébrales, en particulier chez les sujets atteints du
SIDA, intervient parfois avant le diagnostic. D'autre part, pour les infections congénitales, ce long délai retarde la décision d'un éventuel avortement thérapeutique. Quant à la culture cellulaire, l'isolement du toxoplasme s'accompagne de nombreuses contraintes techniques et n'est pas non plus exempt d'erreurs.
SIDA, intervient parfois avant le diagnostic. D'autre part, pour les infections congénitales, ce long délai retarde la décision d'un éventuel avortement thérapeutique. Quant à la culture cellulaire, l'isolement du toxoplasme s'accompagne de nombreuses contraintes techniques et n'est pas non plus exempt d'erreurs.
En résumé, les contraintes et les insuffisances du sérodiagnostic comme du diagnostic parasitologique direct rendent ces méthodes inadaptées au dépistage précoce des formes les plus graves de la toxoplasmose.
Très récemment, un diagnostic de la toxoplasmose par sonde génétique a été proposé dans les publications de D. SAWA et J.L. BURG. et al.
La sonde pJMBG55 décrite par SAWA présente une sensibilité de détection très faible. En effet, la sonde n'est pas ou peu répétée dans le génome de Toxoplasme sondes ; par suite, la détection obtenue est très peu efficace.
J.L. BURG et al. décrivent quant à eux, une sonde constituée d'un fragment du gène B1, répété 35 fois seulement et utilisent la méthode d'amplification enzymatique par la technique de "Polymerase Chain
Reaction" pour suppléer à cet inconvénient.
Reaction" pour suppléer à cet inconvénient.
D'une manière plus générale, les protocoles de traitement des echantillons proposés par ces deux equipes correspondent à ceux employés classiquement en recherche pour extraire de l'ADN. Ils sont longs, fastidieux et ne peuvent répondre aux exigences du travail en routine, par exemple en laboratoire d'analyses médicales. De plus, le traitement des échantillons lié au mode de leur conservation, n'a pas été abordé par ces auteurs.
Le but de la présente invention est de permettre un dépistage précoce et sûr de la toxoplasmose par hybridation moléculaire.
Pour ce faire, l'invention a pour objet de fournir un procédé de détection de Toxoplasme aondii rapide et très sensible à l'aide de sondes génétiques, applicable en routine au diagnostic de la toxoplasmose.
A cette fin, la présente invention a pour premier objectif le clonage, l'isolement et la caractérisation de séquences d'ADN recombinant issues du génome de Toxoplasma qondii.
Un second objectif est de définir des oligonucléotides au sein des séquences précédemment isolées, avantageusement choisis pour la détection de Toxonlasma qondii.
Un autre but est de permettre le typage des différentes souches toxoplasmiques à l'aide des séquences d'ADN recombinant isolées.
La présente invention a donc pour objet un acide nucléique caractérisé en ce qu'il comprend tout ou partie d'une séquence nucléotidique choisie parmi
TGR1A, TGR1E, TGR2 et TGR4 ou parmi les séquences complémentaires correspondantes, ou parmi lesdites séquences modifiees par des substitutions et/ou des additions et/ou des suppressions de un ou plusieurs nucleotides de sorte à ne pas affecter leurs propriétés, lesdits fragments appartenant à une famille de séquences nucléotidiques hautement repétées dans le génome de Toxoplasme sondes.
TGR1A, TGR1E, TGR2 et TGR4 ou parmi les séquences complémentaires correspondantes, ou parmi lesdites séquences modifiees par des substitutions et/ou des additions et/ou des suppressions de un ou plusieurs nucleotides de sorte à ne pas affecter leurs propriétés, lesdits fragments appartenant à une famille de séquences nucléotidiques hautement repétées dans le génome de Toxoplasme sondes.
Elle concerne également des sondes génétiques contenant tout ou partie des sequences d'ADN précitées, marquées.
En outre, l'invention a pour objet un procédé pour la détection de Toxoplasme sondes dans un échantillon biologique caractérise en ce qu'il comprend les étapes
- de selection au préalable d'oligonucléotides spécifiques parmi une famille de sequences nucleotidiques hautement répétées dans le génome des toxoplasmes, comprenant un fragment constitue d'au moins 10 bases et choisi dans les séquences TGR1A, TGR1E, TGR2 et TGR4 ou dans les séquences complémentaires correspondantes ou parmi lesdites séquences modifiées par des substitutions et/ou des additions et/ou des suppressions de un ou plusieurs nucléotides de sorte à ne pas affecter leurs propriétés
- d'amplification enzymatique de l'ADN à analyser contenu dans l'échantillon biologique, par la méthode de la "Polymerase Chain Reaction", au moyen d'un couple d'oligonucléotides choisis parmi lesdits oligonucléotides sélectionnés de manière à augmenter la quantité de sequences cibles, comprises entre ledit couple d'oligonucléotides ;
- de séparation desdits fragments d'ADN amplifié
- de dénaturation desdits fragments afin d'obtenir des fragments monocaténaires ;
- de transfert et de fixation sur un support desdits fragments d'ADN amplifié
- de tentative d'hybridation desdits fragments d'ADN avec l'un desdits oligonucléotides sélectionnés, marqué
- de détection de l'hybride éventuellement formé.
- de selection au préalable d'oligonucléotides spécifiques parmi une famille de sequences nucleotidiques hautement répétées dans le génome des toxoplasmes, comprenant un fragment constitue d'au moins 10 bases et choisi dans les séquences TGR1A, TGR1E, TGR2 et TGR4 ou dans les séquences complémentaires correspondantes ou parmi lesdites séquences modifiées par des substitutions et/ou des additions et/ou des suppressions de un ou plusieurs nucléotides de sorte à ne pas affecter leurs propriétés
- d'amplification enzymatique de l'ADN à analyser contenu dans l'échantillon biologique, par la méthode de la "Polymerase Chain Reaction", au moyen d'un couple d'oligonucléotides choisis parmi lesdits oligonucléotides sélectionnés de manière à augmenter la quantité de sequences cibles, comprises entre ledit couple d'oligonucléotides ;
- de séparation desdits fragments d'ADN amplifié
- de dénaturation desdits fragments afin d'obtenir des fragments monocaténaires ;
- de transfert et de fixation sur un support desdits fragments d'ADN amplifié
- de tentative d'hybridation desdits fragments d'ADN avec l'un desdits oligonucléotides sélectionnés, marqué
- de détection de l'hybride éventuellement formé.
L'invention concerne aussi un procédé pour le typage des souches de Toxoplasme sondes, caractérisé en ce qu'il consiste
- à traiter les ADN genomiques par une enzyme de restriction,
- à séparer les fragments d'ADN génomique obtenus,
- à transférer et à fixer lesdits fragments sur une membrane,
- à mettre en contact lesdits fragments d'ADN génomique avec une sonde telle que precitée.
- à traiter les ADN genomiques par une enzyme de restriction,
- à séparer les fragments d'ADN génomique obtenus,
- à transférer et à fixer lesdits fragments sur une membrane,
- à mettre en contact lesdits fragments d'ADN génomique avec une sonde telle que precitée.
Les caractéristiques et avantages de l'invention ressortiront mieux de la description suivante d'un mode de réalisation préférentiel de l'invention donne à titre illustratif et non limitatif ainsi que des dessins annexés dans lesquels
- les figures 1, 2, 3 et 4 représentent respectivement les séquences de base TGR1A, TGR1E, TGR2 et TGR4,
- la figure 5 schématise les homologies existant entre les séquences de base TGR1A, TGR1E, TGR2 et TGR4,
- les figures 6, 7, 8 et 9 représentent respectivement les séquences de bases des oligonucléotides D1, D2, G2 et S,
- la figure 10 schématise le positionnement des oligonucléotides selon les figures 6, 7, 8 et 9 le long de la séquence TGR1E,
- la figure 11 illustre le cycle d'amplification enzymatique par "Polymerase Chain
Reaction",
- la figure 12 représente les profils électrophorétiques d'ADN toxoplasmique amplifié par "Polymerase Chain Reaction",
- la figure 13 représente le "Southern-blot" d'ADN toxoplasmique amplifié par "Polymerase Chain Reaction puis hybridé en présence de I'oligonucléotide
S, marqué
- la figure 14 représente le "Southern-blot" d'ADN génomique de Toxoplasme sondes hybridé en présence de la sonde TGR1E.
- les figures 1, 2, 3 et 4 représentent respectivement les séquences de base TGR1A, TGR1E, TGR2 et TGR4,
- la figure 5 schématise les homologies existant entre les séquences de base TGR1A, TGR1E, TGR2 et TGR4,
- les figures 6, 7, 8 et 9 représentent respectivement les séquences de bases des oligonucléotides D1, D2, G2 et S,
- la figure 10 schématise le positionnement des oligonucléotides selon les figures 6, 7, 8 et 9 le long de la séquence TGR1E,
- la figure 11 illustre le cycle d'amplification enzymatique par "Polymerase Chain
Reaction",
- la figure 12 représente les profils électrophorétiques d'ADN toxoplasmique amplifié par "Polymerase Chain Reaction",
- la figure 13 représente le "Southern-blot" d'ADN toxoplasmique amplifié par "Polymerase Chain Reaction puis hybridé en présence de I'oligonucléotide
S, marqué
- la figure 14 représente le "Southern-blot" d'ADN génomique de Toxoplasme sondes hybridé en présence de la sonde TGR1E.
La présente invention a pour objectif la détection de Toxoplasme crondii.
A cette fin, les travaux de recherche réalisés par les inventeurs ont concerné le clonage, la sélection et le séquençage de fragments de l'ADN génomique de Toxoplasma qondii correspondant à des sequences hautement répétées dans le génome. Parmi l'ensemble des fragments obtenus après analyse d'un clone A , les fragments 1, 2 et 4 ont été sous-clones dans le plasmide pUCl9. Toutefois, d'autres vecteurs recombinants peuvent être envisagés.
Des clones sont alors sélectionnés et séquencés, deux pour le fragment 1 et un seul pour chacun des fragments 2 et 4. Ils sont désignés respectivement par les abréviations pTGRlA, pTGRlE, pTGR2 et pTGR4 dans lesquelles p signifie plasmide, TG signifie Toxoplasme sondes, R est le nom du clone
contenant les fragments sélectionnés et lA, lE, 2 et 4 correspondent aux noms donnés aux fragments clonés.
contenant les fragments sélectionnés et lA, lE, 2 et 4 correspondent aux noms donnés aux fragments clonés.
Pour chacun de ces plasmides recombinants, l'insert toxoplasmique est purifie après digestion par une enzyme, de préférence l'enzyme Sal I dont le site de coupure correspond au site de clonage des fragments.
L'insert et le plasmide, ici pUC19, sont séparés par électrophorèse. L'insert est ensuite purifié de manière classique.
Les séquences de bases TGR1A, TGR1E, TGR2 et
TGR4 sont representees respectivement sur les figures 1, 2, 3 et 4.
TGR4 sont representees respectivement sur les figures 1, 2, 3 et 4.
Ces inserts comportent respectivement
- pour TGR1A : 352 paires de bases dont 60,51 % de G + C
- pour TGR1E : 353 paires de bases dont 59,77 % de G + C
- pour TGR2 : 674 paires de bases dont 56,37 % de G + C
- pour TGR4 : 1032 paires de bases dont 57,94 % de G + C.
- pour TGR1A : 352 paires de bases dont 60,51 % de G + C
- pour TGR1E : 353 paires de bases dont 59,77 % de G + C
- pour TGR2 : 674 paires de bases dont 56,37 % de G + C
- pour TGR4 : 1032 paires de bases dont 57,94 % de G + C.
On rappelle la signification des symboles suivants
A = Adénine, T = Thymine, C = Cytosine et G =
Guanine.
A = Adénine, T = Thymine, C = Cytosine et G =
Guanine.
Ces inserts toxoplasmiques ou des séquences issues de ceux-ci peuvent être marqués afin de constituer des sondes pour mettre en évidence la présence d'hybrides (séquence d'ADN génomique cible/sonde) formés, le cas échéant, lors de la tentative d'hybridation moléculaire. Ce marquage peut être de nature radioactive, par exemple, par incorporation d'un nucléotide triphosphate marqué radioactivement par "Nick-Translation" ou par la méthode du "Randon Priming". Cependant, pour des raisons de sécurité et de courte demi-vie des radioisotopes, on préfère un marquage non-radioactif appele aussi marquage froid. Dans ce dernier cas, il peut s'agir d'un marquage enzymatique, antigénique, ligand, luminescent ou fluorescent.
Les acides nucléiques selon l'invention peuvent être utilises pour la détection de Toxoplasme sondes ou pour le typage des souches toxoplasmiques.
Nous allons maintenant decrire le procédé de détection in vitro de Toxoplasme qondii conforme à l'invention, par rapport à l'une des séquences nucleotidiques précédemment mentionnées.
Les séquences nucléotidiques TGR1A, TGR1E,
TGR2 et TGR4 présentent des homologies importantes et complexes qui sont schématisées sur la figure 5. Les pourcentages indiques représentent le degré d'homologie entre chacune des séquences de bases comparées, c'està-dire le poucentage de bases identiques rencontrées dans celles-ci. Selon une étude approfondie, les homologies entre TGR1E et les trois autres TGRlA, TGR2 et TGR4 montrent, dans leur ensemble, qu'il existe au sein de TGR1E des séquences appartenant à une famille de séquences hautement répétées.
TGR2 et TGR4 présentent des homologies importantes et complexes qui sont schématisées sur la figure 5. Les pourcentages indiques représentent le degré d'homologie entre chacune des séquences de bases comparées, c'està-dire le poucentage de bases identiques rencontrées dans celles-ci. Selon une étude approfondie, les homologies entre TGR1E et les trois autres TGRlA, TGR2 et TGR4 montrent, dans leur ensemble, qu'il existe au sein de TGR1E des séquences appartenant à une famille de séquences hautement répétées.
La sensibilité d'une sonde étant liée à son degré de répétition, le procédé conforme à l'invention va être décrit par rapport à la séquence TGR1E.
Le procédé conforme à l'invention permet de détecter in vitro la présence de Toxoplasme sondes dans un échantillon biologique.
Cet échantillon peut résulter notamment d'une biopsie placentaire pour le diagnostic de la toxoplasmose congénitale ou d'une biopsie cérébrale pour les sujets immuno-déficients. I1 peut s'agir egalement de prélèvements de sang total, de liquide amniotique, de liquide céphalo-rachidien, d'humeur aqueuse ou de lavages broncho-alveolaires.
Le procédé consiste tout d'abord à effectuer une étape d'amplification enzymatique de 1'ADN à analyser. La technique d'amplification utilisée est la "Polymerase Chain Reaction" (P.C.R.). Cette méthode repose sur l'emploi de la Taq polymerase, enzyme qui incorpore les nucléotides en copiant la matrice simple brin, à partir d'une extrémite 3'OH d'une amorce d'une dizaine de bases environ. La réaction comporte trois etapes schématisées en figure 11.
La première etape consiste à dénaturer 1'ADN par chauffage afin de séparer les deux brins.
La seconde est une étape d'hybridation de 1'ADN monocaténaire précédemment obtenu avec des amorces oligonucléotidiques. Pour des raisons pratiques de manipulation, il est avantageux de pouvoir travailler avec des séquences de taille peu élevée.
Ainsi, on emploie avantageusement comme amorces dans l'étape d'hybridation de la P.C.R., des oligonucleotides convenablement sélectionnés, contenant au moins 10 bases et de préférence 20 à 25 nucléotides en moyenne. Ces oligonucléotides sont sélectionnés de manière à contenir tout ou partie des séquences complementaires de régions situees en 5' des séquences à amplifier. Des exemples sont donnés en figures 6, 7, 8 et 9, la figure 10 schématisant le positionnement des oligonucléotides cités le long de la chaîne TGR1E. Pour l'étape d'hybridation, on utilise en fait comme amorces des couples d'oligonucleotides afin d'amplifier la séquence située entre les deux "bornes" qu'ils constituent. Ainsi, dans la phase suivante du procédé, à savoir la mise en évidence des séquences d'ADN amplifié par hybridation sur "Southern-blot", on choisira de préférence un oligonucleotide situé entre les deux premiers sélectionnes, pour la tentative d'hybridation. I1 peut s'agir, pour la P.C.R., par exemple du couple G2,D1 ou G2,D2, ce dernier cas étant illustré en figure 11, puis de l'oligonucléotide S marqué pour l'hybridation du "Southern-blot" : cet exemple est décrit ci-après. Les oligonucléotides sélectionnés peuvent être produits par synthèse chimique à l'aide, par exemple, d'un synthétiseur "d'Applied Biosystem".
Enfin, au cours de la troisième étape de la
P.C.R., l'enzyme Taq Polymerase étend le deuxième brin à partir des amorces.
P.C.R., l'enzyme Taq Polymerase étend le deuxième brin à partir des amorces.
Le cycle dénaturation - hybridation extension est renouvelé plusieurs fois (jusqu'à 30 fois par exemple) de manière à augmenter la quantité de séquences cibles, à savoir dans le cas illustré les régions comprises entre les oligonucléotides G2 et D2.
La P.C.R., qui permet donc d'augmenter la sensibilité de detection, est suivie d'une reconnaissance des sequences amplifiées par hybridation moléculaire. Pour ce faire, les fragments d'ADN amplifié, (obtenus à l'issue de la P.C.R.), sont traités par exemple selon la méthode du "Southern blot". Toutefois, l'homme de métier peut envisager d'autres méthodes.
En conséquence, ces fragments sont séparés par exemple par électrophorèse horizontale sur gel d'agarose.
Les fragments d'ADN sépares sont ensuite denaturés afin d'obtenir des fragments monocaténaires puis transférés sur une membrane selon la méthode du "Southern-blot", mais d'autres méthodes telles que notamment le "Dot-blot", ou le "Slot-blot" peuvent être envisagées. I1 peut s'agir d'une membrane de nitrocellulose, de nylon ou d'une membrane mixte (nitrocellulose/nylon melangés).
L'hybridation se déroule ensuite en trois étapes : préhybridation, hybridation et lavages.
L'étape de préhybridation consiste à mettre le filtre supportant 1'ADN amplifié à analyser dans un tampon d'hybridation contenant par exemple de 1'ADN de sperme de Hareng, denaturé également.
La tentative d'hybridation consiste ensuite en la mise en contact de 1'ADN à analyser avec une sonde selon l'invention. I1 peut s'agir de tout ou partie d'une séquence choisie parmi TGR1A, TGR1E, TGR2 et TGR4 ou parmi les séquences complémentaires correspondantes ou parmi lesdites sequences modifiees par des substitutions et/ou des additions et/ou des suppressions de un ou plusieurs nucleotides de sorte à ne pas affecter leurs proprietés d'hybridation, associée à un marqueur. L'homme de métier choisira avantageusement un oligonucléotide issu des séquences précitées. Ce dernier, sous forme marquée, est introduit dans le tampon d'hybridation.
Dans le cas décrit (TGR1E), on choisit avantageusement l'oligonucléotide S (figure 7) car il est situé dans une région entre ltoligonucleotide G2 et l'oligonucléotide D2 (voir figure 10). Cet oligonucléotide est avantageusement marqué à l'extrémité 5'. I1 peut s'agir par exemple d'un marquage radioactif par addition d'un phosphate marqué au 32p en position t ou d'un ou des nucléotides triphosphate marqué en position d . Mais tout autre marquage peut être envisagé en particulier un marquage non-radioactif par exemple avec un marqueur de type enzymatique, antigenique, ligand, luminescent ou fluorescent.
Après plusieurs lavages, le filtre est révélé par des moyens connus, par exemple par exposition en autoradiographie dans le cas d'une sonde marquée radioactivement.
Les sondes décrites précédemment permettent egalement de typer les souches de Toxoplasma sondii.Nous allons maintenant décrire cette application.
Si l'on considère la sonde TGR1E, l'hybridation du "Southern-blot" en présence de cette sonde, permet de différencier des souches de Toxoplasme sondes de pathogénicité différente.
Le procédé pour le typage des souches de Toxoplasme sondes consiste dans un premier temps à digérer les ADN génomiques par une enzyme de restriction, telle que par exemple Sal I.
Les fragments obtenus sont alors séparés par electrophorèse sur gel d'agarose. Ils sont ensuite transféres sur une membrane, par exemple, selon la méthode du "Southern-blot". On peut utiliser une membrane de nylon, de nitrocellulose ou mixte nitrocellulose/nylon.
L'étape suivante consiste à mettre les fragments d'ADN, fixes sur la membrane, en contact avec une sonde marquée selon l'invention. On peut choisir avantageusement la sonde TGR1E, séquence appartenant à une famille de séquences hautement répétées. Par ailleurs, on peut prévoir des témoins tels que 1'ADN humain et 1'ADN murin employés comme témoins négatifs pour le "Southern-blot".
Selon ce procédé, les ADN génomiques de six souches de Toxoplasme sondes différentes ont été étudiés.
L'analyse des hybrides obtenus montre que la sonde TGR1E est spécifique vis-à-vis de Toxoplasme sondes. Elle reconnaît en effet six souches différentes mais n'hybride pas 1'ADN humain ni 1'ADN murin. Par ailleurs, l'analyse des profils de restriction obtenus pour ces six souches permet de différencier quatre polymorphismes différents, ces polymorphismes pouvant être corrélés au caractère pathogène des souches.
Les sondes génétiques conformes à l'invention présentent donc l'avantage d'être très sensibles, beaucoup plus que celles connues jusqu'à présent.
Le procédé de détection décrit est fiable et rapide. Ce procédé est d'autant plus avantageux qu'il permet un dépistage pouvant être employé "en routine".
Ainsi, chez les sujets immuno-déficients, il permet un diagnostic fiable en un minimum de temps.Cet avantage est d'autant plus important que le nombre de sujets atteints du SIDA ou ayant fait l'objet de greffes sont en progression constante. Chez les femmes enceintes, le dépistage réalisé sur le foetus peut être décisif quant à un éventuel avortement thérapeutique.
Les sondes selon l'invention permettent également le typage des souches toxoplasmiques. Elles peuvent ainsi constituer des outils de choix pour l'étude épidémiologique de la toxoplasmose, à savoir l'étude des prévalences pour une population donnée, l'étude de la transmission de la maladie en fonction des souches. Ces sondes présentent donc un interêt médical certain puisque notamment, elles peuvent permettre d'adapter les mesures prophylactiques et therapeutiques développées pour lutter contre la toxoplasmose.
L'invention et ses applications seront mieux comprises à l'aide de l'exemple suivant.
EXEMPLE
Production de pTGR1A, pTRG1E pTGR2 et pTGR4
Chacune des sondes est amplifiée dans la souche Escherichia coli DH5wdérivée de la souche K12 (Génotype DH5 α : F , endAl, hsdR17 (r kt supE44,thi-l, , recAl, gyrA96, relAl,+080dlacZA M15).
Production de pTGR1A, pTRG1E pTGR2 et pTGR4
Chacune des sondes est amplifiée dans la souche Escherichia coli DH5wdérivée de la souche K12 (Génotype DH5 α : F , endAl, hsdR17 (r kt supE44,thi-l, , recAl, gyrA96, relAl,+080dlacZA M15).
A partir d'un congelat conservé à -70 C dans 15% de glycérol, la souche DH5 α est ensemencée sur un milieu solide SOB-agar (Bactotryptone 2% (P/V), Extrait de Levure 0,5% (P/V), NaCl 10 mM, KC1 2,5mM, MgC1210 mM, MgSO4 10 mM) à 1,5% (P/V) d'agar contenant de l'ampicilline (50/t g/ml). Cette culture est incubée pendant une nuit à 37 C sous agitation orbitale (200 t.p.m.).
10 ml de milieu liquide SOB contenant 50+ g/ml d'ampicilline sont ensemencés à l'aide d'une colonie DH, mis en culture pendant 16 heures, à 37"C sous une agitation orbitale de 200 t.p.m..2 ml de cette préculture servent à ensemencer 1 litre de milieu liquide SOB (ampicilline 50 g/ml). La culture se fait sur 9 heures, à 37"C, sous agitation orbitale (200 t.p.m.).
L'addition de chloramphénicol (170 e g/ml) permet d'amplifier le nombre de copies du plasmide par cellule. L'amplification est menée à 37"C, sous agitation (200 t.p.m.) durant 16 heures. Les bactéries sont récupérées par centrifugation à 5000 x g pendant 10 mm à 4"C.
Le plasmide est extrait de façon classique selon la technique de Birnboim et Doly, décrite par
Maniatis et coll. (Maniatis T. et al. 1982. Molecular cloning: a laboratory manual. Cold Spring Harbor
Laboratory Press.). I1 est purifié en dernière étape par ultracentrifugation sur gradient de chlorure de césium (Ig par ml de solution à centrifuger), à 100 000 x g pendant 16 heures (BECKMAN TL 100), à 20"C en présence de 600,/Lg/ml de bromure d'éthidium.
Maniatis et coll. (Maniatis T. et al. 1982. Molecular cloning: a laboratory manual. Cold Spring Harbor
Laboratory Press.). I1 est purifié en dernière étape par ultracentrifugation sur gradient de chlorure de césium (Ig par ml de solution à centrifuger), à 100 000 x g pendant 16 heures (BECKMAN TL 100), à 20"C en présence de 600,/Lg/ml de bromure d'éthidium.
Le bromure d'éthidium est éliminé par plusieurs extractions au n-butanol saturé, jusqu'à disparition de la coloration rosée. Le n-butanol est ensuite éliminé par trois lavages au diéthyl-oxyde.
Purification des inserts toxoplasmiques
Après précipitation à l'éthanol 70%, 1'ADN plasmidial est solubilisé dans l'eau et dosé au spectophomètre, la densite optique (DO) étant mesurée à 260 nm.
Après précipitation à l'éthanol 70%, 1'ADN plasmidial est solubilisé dans l'eau et dosé au spectophomètre, la densite optique (DO) étant mesurée à 260 nm.
Pour chacun des quatre plasmides recombinants, la purification de l'insert toxoplasmique se fait après une digestion par l'enzyme Sal I, le site de coupure Sal I correspond au site de clonage des fragments. Pour une quantité d'insert voulue, la quantité de plasmide correspondante est digérée à raison de l/lg/ml dans le tampon Sal I (TRIS-HC1 50 mM,
NaCl 100 mM, MgC1210 mM, Dithiothréitol 1 mM, pH 7,5) à raison de 2 unités d'enzyme Sal I/ g d'ADN. La digestion se poursuit pendant 3 heures à 37"C.
NaCl 100 mM, MgC1210 mM, Dithiothréitol 1 mM, pH 7,5) à raison de 2 unités d'enzyme Sal I/ g d'ADN. La digestion se poursuit pendant 3 heures à 37"C.
Insert et plasmide pUC 19 (2686 pb) sont sépares par électrophorèse sur gel d'agarose à 0,8t en ce qui concerne pTGR4, sur gel d'agarose à 1,2% en ce qui concerne les trois autres clones. L'électrophorèse est effectuée dans le tampon TAE (TRIS-acetate 40 mM,
EDTANa2 1 mM) à 0,5 g/ml de bromure d'éthidium.
EDTANa2 1 mM) à 0,5 g/ml de bromure d'éthidium.
La bande correspondant à l'insert est alors découpée et électroeluée en boudin de dialyse dans le tampon TAE. L'insert purifié est débarrassé du bromure d'ethidium par 6 lavages au n-butanol saturé. Après une série d'extractions au phenol-chloroforme (2 phenol/ 2 phénol-chloroforme/3 chloroforme), 1'ADN est précipité dans l'méthanol 70%. Après remise en solution dans du tampon TE (TRIS-HC1 10 mM, EDTANa2 1 mM, pH=8), la qualité de la sonde est contrôlée par électrophorèse analytique et sa concentration est mesurée par spectrophotométrie.
Marquage des sondes
Les inserts toxoplasmiques obtenus ci-dessus peuvent être marqués radioactivement, par incorporation d'un nucléotide triphosphate marque au 32P en position
par exemple 1' & 32P dCTP (800 Ci/mmol). 200 ng d'insert peuvent être marqués avec 50 9 Ci par "Nick
Translation". L'activité specifique est de 2 à 5.108 cpm/9 g. On peut également marquer l'insert par la technique du "Randon Priming". Cette méthode est généralement plus performante à condition toutefois de ne pas dépasser une quantité de 50 ng d'ADN à marquer l'activité spécifique peut alors atteindre 1 à 2.109 cpm/+ g.
Les inserts toxoplasmiques obtenus ci-dessus peuvent être marqués radioactivement, par incorporation d'un nucléotide triphosphate marque au 32P en position
par exemple 1' & 32P dCTP (800 Ci/mmol). 200 ng d'insert peuvent être marqués avec 50 9 Ci par "Nick
Translation". L'activité specifique est de 2 à 5.108 cpm/9 g. On peut également marquer l'insert par la technique du "Randon Priming". Cette méthode est généralement plus performante à condition toutefois de ne pas dépasser une quantité de 50 ng d'ADN à marquer l'activité spécifique peut alors atteindre 1 à 2.109 cpm/+ g.
L'ADN marqué est séparé des nucleotides libres par chromatocentrifugation.
Pour des raisons de sécurité, et également en raison de la courte demi-vie du 32P (15 jours), il peut être préférable d'utiliser un marquage froid, à l'aide par exemple
* de kits de marquage chimique
- kit de sulfonation des cytosines (commercialisé par PBS Orgenics)
- kit E.C.L. (commercialisé par
Amersham)
- kit de marquage à la photobiotine (commercialise par BRL)
* de kits de marquages enzymatiques
- kit d'incorporation de nucléotides marqués par la biotine (commercialisé par BRL)
- kit d'incorporation de nucléotides marqués par la digoxygénine (commercialise par
Boerhinger Mannheim).
* de kits de marquage chimique
- kit de sulfonation des cytosines (commercialisé par PBS Orgenics)
- kit E.C.L. (commercialisé par
Amersham)
- kit de marquage à la photobiotine (commercialise par BRL)
* de kits de marquages enzymatiques
- kit d'incorporation de nucléotides marqués par la biotine (commercialisé par BRL)
- kit d'incorporation de nucléotides marqués par la digoxygénine (commercialise par
Boerhinger Mannheim).
Production des oligonucléotides D1. D2. S et G2
Ces quatres séquences oligonucléotidiques sont produites par synthèse chimique sur un appareil automatique (synthétiseur "d'Applied Biosystem"). Près de 120 nmoles, soit environ 1 mg d'ADN, peuvent être synthétisées en une fois.
Ces quatres séquences oligonucléotidiques sont produites par synthèse chimique sur un appareil automatique (synthétiseur "d'Applied Biosystem"). Près de 120 nmoles, soit environ 1 mg d'ADN, peuvent être synthétisées en une fois.
Les oligonucléotides peuvent ensuite être marqués par addition en 5' terminal d'un groupement phosphate marqué au 32P issu, par exemple du Y 32p ATP, à l'aide de l'enzyme : T4 Polynucléotide kinase.
15 pmoles de sonde peuvent être marquees avec 5 Ci d'ATP. Ce marquage est obtenu par une incubation de 30 minutes à 37"C et une incubation de 10 minutes à 65 C pour que ltoligonucleotide soit prêt à 1 'hybridation.
Amplification enzymatique par la "Polvmerase
Chain Reaction"
La réaction d'amplification est effectuée dans un milieu (volume total 10 1) comprenant
- un tampon : Tris-HCl 100mM, pH 8,3, KC1 50mM, MgC12 1,5 mM, Gélatine 0,1%
- 800/ICM de chaque déoxynucleotide : dATP, dCTP, dGTP et dTTP ; et
- 0,5/LM d'oligonucleotides "amorces".
Chain Reaction"
La réaction d'amplification est effectuée dans un milieu (volume total 10 1) comprenant
- un tampon : Tris-HCl 100mM, pH 8,3, KC1 50mM, MgC12 1,5 mM, Gélatine 0,1%
- 800/ICM de chaque déoxynucleotide : dATP, dCTP, dGTP et dTTP ; et
- 0,5/LM d'oligonucleotides "amorces".
Le milieu reactionnel est recouvert d'un volume (100/l) d'huile minérale pour éviter toute évaporation à haute température.
La réaction est effectuée dans un appareil automatique, le "Perkin Elmer Cetus thermal cycler" (Commercialisé par CETUS CORPORATION). Les tubes sont placés dans un bloc métallique dont la température est modulable en durée et en intensité. On peut ainsi programmer des cycles de température répétitifs.
L'ADN est dénaturé à 940C pendant 7 minutes et les cycles thermiques débutent après addition de 2,5 unités de Taq Polymérase et sont répétés 30 fois selon la chronologie suivante
- 1 min à 94"C (dénaturation)
- 2 min à 55"C (hybridation)
- 3 min à 72"C (extension)
La dernière extension est réalisée à 72"C pendant 7 minutes. Les tubes sont ensuite conservés à 10"C jusqu'à leur analyse en Southern-blot. D'autres techniques telles que le "Dot-blot" ou le "Slot-blot" peuvent être envisagées.
- 1 min à 94"C (dénaturation)
- 2 min à 55"C (hybridation)
- 3 min à 72"C (extension)
La dernière extension est réalisée à 72"C pendant 7 minutes. Les tubes sont ensuite conservés à 10"C jusqu'à leur analyse en Southern-blot. D'autres techniques telles que le "Dot-blot" ou le "Slot-blot" peuvent être envisagées.
Les profils électrophorétiques d'ADN toxoplasmique amplifié par P.C.R. sont représentés en figure 12.
Hybridation selon la technique du "Southernblot"
La technique du Southern-blot (SOUTHERN E.M.
La technique du Southern-blot (SOUTHERN E.M.
1975, Detection of specific sequences among DNA fragments separated by gel electrophoresis. J. Mol.
Biol., 98, 503-517.) comporte trois phases
- migration électrophorétique
- transfert
- hybridation
a) Electrophorèse
Les fragments d'ADN amplifié obtenus à l'issue de la P.C.R. sont séparés par électrophorèse sur un gel d'agarose horizontal à 1,6% (taille 20 cm x 20 cm) sous une tension de 80 Volts dans le tampon TAE en présence de 05/Lg/ml de bromure d'éthidium.
- migration électrophorétique
- transfert
- hybridation
a) Electrophorèse
Les fragments d'ADN amplifié obtenus à l'issue de la P.C.R. sont séparés par électrophorèse sur un gel d'agarose horizontal à 1,6% (taille 20 cm x 20 cm) sous une tension de 80 Volts dans le tampon TAE en présence de 05/Lg/ml de bromure d'éthidium.
b) Transfert
Le gel est immergé dans trois bains successivement pour dépuriner 1'ADN, le dénaturer puis neutraliser le pH du gel.
Le gel est immergé dans trois bains successivement pour dépuriner 1'ADN, le dénaturer puis neutraliser le pH du gel.
- dépurination : deux bains de HC1 0,25 N pendant 15 minutes, puis un rinçage dans de l'eau bidistillée stérile.
- dénaturation : un bain d'une heure dans la solution de dénaturation (NaOH 0,5 N, NaCl 1,5 M) puis un rinçage dans l'eau bidistillée stérile.
- neutralisation : un bain d'une heure dans le tampon (Tris-HCl, pH 8, 1 M, NaCl 1,5 M) puis un rinçage dans l'eau bidistillee stérile.
Les fragments sont transférés sur une membrane de nitrocellulose ou de nylon selon la technique de SOUTHERN, en utilisant comme tampon de transfert, du tampon SSC concentré 10 fois (10 x SSC/ 1 x SSC = NaCl 0,15 M, Citrate de Sodium 0,015 M). Le transfert s'effectue sur 16 heures. La membrane est rinçée dans un tampon 5 x SSC, et séchée pendant une heure à température ambiante. Sur la nitrocellulose, les fragments d'ADN sont fixés au support après chauffage à 80"C pendant 2 heures. Sur nylon, 1'ADN est fixé au support par exposition aux rayonnements u.v.
pendant 3 minutes et 30 secondes.
c) Hybridation
L'hybridation se déroule en trois étapes
- préhybridation
- hybridation
- lavages
* Préhybridation
Dans la préhybridation, le filtre supportant les fragments d'ADN (amplifies séparés, transféres et fixés sur une membrane) est placé dans une boîte plastique contenant 30 ml de tampon d'hybridation.
L'hybridation se déroule en trois étapes
- préhybridation
- hybridation
- lavages
* Préhybridation
Dans la préhybridation, le filtre supportant les fragments d'ADN (amplifies séparés, transféres et fixés sur une membrane) est placé dans une boîte plastique contenant 30 ml de tampon d'hybridation.
Tampon d'hybridation
5 x SSC
Phosphate de Sodium pH 6,5 50 mM
Ficoll 400 0,1 % (P/V)
Polyvinylpyrolidone 0,1 % (P/V)
Glycine 1% (P/V)
SDS (Sodium Dodécyl Sulfate) 0,1% (P/V)
ADN de sperme de hareng
dénaturé 100Jug/ml.
5 x SSC
Phosphate de Sodium pH 6,5 50 mM
Ficoll 400 0,1 % (P/V)
Polyvinylpyrolidone 0,1 % (P/V)
Glycine 1% (P/V)
SDS (Sodium Dodécyl Sulfate) 0,1% (P/V)
ADN de sperme de hareng
dénaturé 100Jug/ml.
La prehybridation est faite à 42"C sur 2 heures sous agitation modérée.
* Hybridation
L'hybridation se fait en ajoutant dans le tampon d'hybridation 15 pmoles de I'oligonucléotide S marqué à l'extrémité 5'. Elle est faite à 42"C sur 16 heures sous agitation moderee.
L'hybridation se fait en ajoutant dans le tampon d'hybridation 15 pmoles de I'oligonucléotide S marqué à l'extrémité 5'. Elle est faite à 42"C sur 16 heures sous agitation moderee.
* Lavages
La membrane est rincée par quatre lavages
- 3 lavages de 5 min à température ambiante dans un tampon (2 x SSC ; SDS 0,1% (P/V))
- 1 lavage de 30 min à 50"C dans un tampon (0,1 x SSC ; SDS 0,1% (P/V))
Révélation de l'hybridation
Après lavages, le filtre est séché à température ambiante pendant 30 min, disposé sur un papier Whatman 3 MM, enveloppé dans un film plastique, et exposé en autoradiographie, à -70 C pendant 18 heures.
La membrane est rincée par quatre lavages
- 3 lavages de 5 min à température ambiante dans un tampon (2 x SSC ; SDS 0,1% (P/V))
- 1 lavage de 30 min à 50"C dans un tampon (0,1 x SSC ; SDS 0,1% (P/V))
Révélation de l'hybridation
Après lavages, le filtre est séché à température ambiante pendant 30 min, disposé sur un papier Whatman 3 MM, enveloppé dans un film plastique, et exposé en autoradiographie, à -70 C pendant 18 heures.
La figure 13 represente le "Southern-blot" d'ADN toxoplasmique amplifié par P.C.R. et hybridé en présence de I'oligonucléotide S.
Typaqe des souches de Toxoplasma aondii
Les ADN genomiques sont digérés par une enzyme de restriction, par exemple Sal I(conditions 2 unites/g d'ADN; 37"C pendant 16 heures).
Les ADN genomiques sont digérés par une enzyme de restriction, par exemple Sal I(conditions 2 unites/g d'ADN; 37"C pendant 16 heures).
Les fragments de restriction sont separés par électrophorèse horizontale sur gel d'agarose 0,8% et transférés sur nylon. L'ADN humain et 1'ADN murin digérés par la même enzyme, sont utilisés comme témoins négatifs.
Le "southern blot" est préhybridé pendant 2 heures à 42"C puis hybride en présence de la sonde
TGR1E marquée au 32P (2.106 c.p.m./ml de tampon d'hybridation contenant 50% de formamide (V/V)) à 42"C pendant 16 heures.
TGR1E marquée au 32P (2.106 c.p.m./ml de tampon d'hybridation contenant 50% de formamide (V/V)) à 42"C pendant 16 heures.
Les lavages apres hybridation sont faits dans 4 bains successifs
- trois lavages à température ambiante pendant 5 minutes dans un tampon (2 x SSC, SDS 0,1% (P/V))
- un lavage à 42"C pendant 30 minutes dans un tampon (0,1 x SSC ; SDS 0,1% (P/V)).
- trois lavages à température ambiante pendant 5 minutes dans un tampon (2 x SSC, SDS 0,1% (P/V))
- un lavage à 42"C pendant 30 minutes dans un tampon (0,1 x SSC ; SDS 0,1% (P/V)).
Le film d'autoradiographie est exposé pendant 4 jours à -70 C.
La figure 14 représente un "Southern-blot" d'ADN génomiques de Toxoplasme sondes de six souches différentes, hybridé en présence de la sonde TGR1E.
TGR1E est spécifique vis-à-vis de 1'ADN de Toxoplasme sondes : elle reconnaît 1'ADN de six souches toxoplasmiques différentes, mais n'hybride pas 1'ADN humain ni 1'ADN murin.
Les profils de restriction des six souches montrent une vingtaine de bandes dont la taille est comprise entre 350 pb et 20 000 pb. Cette image signe le caractère répétitif de la sonde TGR1E : elle existe donc en de nombreuses copies dans le génome de
Toxoplasma qondii (figure 14).
Toxoplasma qondii (figure 14).
L'analyse de ces profils met en évidence quatre polymorphismes de restriction différents. Ils se répartissent en trois degrés de pathogenicité distincts, definis selon des critères observés chez des souris infectees par voie intrapéritonéale
- souches virulentes : souches qui provoquent la mort des souris en quelques jours, avec apparition d'une ascite abondante. Ces souches sont non kystogènes.
- souches virulentes : souches qui provoquent la mort des souris en quelques jours, avec apparition d'une ascite abondante. Ces souches sont non kystogènes.
- souches intermédiaires : souches kystogènes qui provoquent la mort des souris en une douzaine de jours environ.
- souches chroniques : souches kystogènes non lethales.
Si les quatre polymorphismes sont désignés par les lettres A, B, C et D, la répartition est la suivante
A: souche virulente RH et souche chronique C
B: souche intermédiaire C56
C : souche intermédiaire M7741
D: souches chroniques PRUGNIAUD et HARAN
Par ailleurs, trois des six souches présentees ci-dessus ont été caractérisées par analyse isoenzymatique (Darde M.L. et al. 1988. Isoenzymatic characterization of seven strains of Toxoplasme gondii by isoelectrofocusing in polyacrylamide gels. Am. J.
A: souche virulente RH et souche chronique C
B: souche intermédiaire C56
C : souche intermédiaire M7741
D: souches chroniques PRUGNIAUD et HARAN
Par ailleurs, trois des six souches présentees ci-dessus ont été caractérisées par analyse isoenzymatique (Darde M.L. et al. 1988. Isoenzymatic characterization of seven strains of Toxoplasme gondii by isoelectrofocusing in polyacrylamide gels. Am. J.
Trop. Med. Hyg., 39 (6), 551-558.). Elles correspondent chacune à l'un des trois zymodèmes définis par Darde, à savoir, le zymodème I, qui regroupe trois souches virulentes dont la souche RH, le zymodème II, qui regroupe des souches chroniques dont la souche
PRUGNIAUD, et le zymodème III qui ne comprend que la souche M7741.
PRUGNIAUD, et le zymodème III qui ne comprend que la souche M7741.
Ainsi sur trois souches, une corrélation peut être établie entre virulence, polymorphisme de restriction et profil enzymatique
- souche RH: virulente, polymorphisme A, zymodème I
- souche M7741: intermediaire, polymorphisme
C, zymodème III
- souche PRUGNIAUD: chronique, polymorphisme
D, zymodème II.
- souche RH: virulente, polymorphisme A, zymodème I
- souche M7741: intermediaire, polymorphisme
C, zymodème III
- souche PRUGNIAUD: chronique, polymorphisme
D, zymodème II.
Bien entendu, l'invention n'est pas limitée à la description ci-dessus, pour laquelle on pourra prévoir d'autres variantes de réalisation sans pour cela sortir du cadre de l'invention.
Claims (1)
- 28 - Procédé selon la revendication 25, caractérisé en ce que lesdits fragments d'ADN génomique sont transférés et fixés sur une membrane selon la méthode du "Southern-blot".29 - Procédé selon la revendication 28, caractérisé en ce que la membrane est une membrane en nylon, une membrane en nitrocellulose ou une membrane mixte nitrocellulose/nylon.30 - Procédé selon la revendication 25, caractérisé en ce que la sonde utilisée consiste en la séquence TGR1E marquée.
Priority Applications (2)
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|---|---|---|---|
| FR9008548A FR2664290B1 (fr) | 1990-07-05 | 1990-07-05 | Sondes genetiques specifiques de toxoplasma gondii, et leur utilisation pour la detection in vitro de toxoplasma gondii et pour le typage des souches toxoplasmiques. |
| PCT/FR1991/000546 WO1992001067A1 (fr) | 1990-07-05 | 1991-07-05 | Sondes genetiques specifiques de toxoplasma gondii, et leur utilisation pour la detection in vitro de toxoplasma gondii et pour le typage des souches toxoplasmiques |
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| FR2664290B1 FR2664290B1 (fr) | 1993-01-29 |
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Citations (2)
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|---|---|---|---|---|
| WO1989001050A1 (fr) * | 1987-07-31 | 1989-02-09 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Accroissement selectif de sequences de polynucleotides cibles |
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-
1990
- 1990-07-05 FR FR9008548A patent/FR2664290B1/fr not_active Expired - Fee Related
-
1991
- 1991-07-05 WO PCT/FR1991/000546 patent/WO1992001067A1/fr unknown
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1989001050A1 (fr) * | 1987-07-31 | 1989-02-09 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Accroissement selectif de sequences de polynucleotides cibles |
| WO1989012683A1 (fr) * | 1988-06-24 | 1989-12-28 | Institut Pasteur | Acide nucleique codante pour la proteine p30 de toxoplasma gondii |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| BIOLOGICAL ABSTRACTS, vol. 88, no. 7, 1989, page AB-781, abrégé no. 77133, Biological Abstracts, Inc., Philadelphia, PA, US; D. SAVVA: "Isolation of a potential DNA probe for Toxoplasma gondii", & MICROBIOS 58(236/237): 165-172, 1989 * |
| BIOLOGICAL ABSTRACTS, vol. 88, no. 7, 1989, page AB-782, abrwgé no. 77141, Biological Abstracts, Inc., Philadelphia, PA, US; J.L. BURG et al.: "Direct and sensitive detection of a pathogenic protozoan, Taxoplasma gondii, by polymerase chain reaction", & J. CLIN. MICROBIOL. 27(8): 1787-1792, 1989 * |
| BIOLOGICAL ABSTRACTS, vol. 90, no. 4, 15 août 1990, page AB-867, Abrégé no. 43011, Biological Abstracts, Inc., Philadelphia, PA, US; D. SAVVA et al.: "Polymerase chain reaction for detection of Toxoplasma gondii", J. MED. MICROBIOL. 32(1): 25-32, 1990 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| FR2664290B1 (fr) | 1993-01-29 |
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