FR2625101A1 - Anticorps monoclonal, procede pour sa preparation et pour son utilisation - Google Patents

Abstract

Procédé de préparation d'un anticorps monoclonal capable de reconnaître spécifiquement une protéine appartenant à la famille 36K qui comprend la synthèse chimique d'un peptide correspondant à une séquence d'aminoacides dans la région N-terminale d'une protéine appartenant à la famille 36K et la collecte d'un anticorps en utilisant comme antigène ce peptide, qui peut si on le désire être lié à un support.

Description

26 2 5 1 0 1

1. La présente invention concerne un nouvel anticorps monoclonal, et plus particulièrement un anticorps monoclonal

extrêmement utile comme médicament en ce sens qu'il recon-

nait un site particulier de la protéine du cyto-squelette de la membrane qui est présent autour de la membrane cel- lulaire et qui est considéré comme participant au système

de transfert de l'information.

Ces dernières années, il a été établi, grâce au

développement remarquable des techniques de la biologie molé-

culaire,que le système de transfert de l'information et le système de cyto-squelette,qui étaient considérés comme jouant des rôles très différents,étaient étroitement liés l'un à l'autre.

Il a été établi par de nombreuses études qu'en-

tre autres une série de protéines nommées protéines du cyto-squelette de la membrane faisaient office de premiers véhicules pour transférer l'information dans les cellules, 2. après qu'une stimulation physiologique provenant d'une source extérieure aux cellules ait été transformée en une information chimique précise par un récepteur sur la

surface de la cellule.

Parmi ces protéines du cyto-squelette de la mem- brane, une série de protéines ayant une masse moléculaire d'environ 36 000 ont reçu le nom de groupe de protéines

36K (lequel est désigné par "famille 36K" dans la descrip-

tion) et sont connues pour être des protéines particuliè-

res qui remplissent de multiples fonctions pour prendre part

au:transfert d'informationstell esque transformation, inflam-

mation, immunité, etc. Les protéines désignées collectivement sous le nom de famille 36K sont considérées comme étant la cause S15 de 1 'interaction associée aux lipides et au calcium, en même temps que des protéines telles que l'actine, la fodrine,

etc. présentes autour d'elles.

Diverses études ont été effectuées sur la famille 36K; la présence de Calpactine 1 (également désignée sous le nom de lipocortine 2), de Calpactine 2 (également désignée sous le nom de lipocortine 1), etc. et leurs structures primaires ont été établies.[Cell, 46, 201-212 (1986), Cell,

46, 191-199 (1986)].

De plus,en ce qui concerne la protéine désignée sous le nom de IBC (inhibiteur de la coagulation du sang), sa structure primaire a été établie p. Biochem. (Tokyo),

102, 1261-1273 (1987)].

En outre, en ce qui concerne d'autres protéines appartenant à la famille 36K, leur présence est suggérée et on s'attend à ce que le rôle cytophysiologique de la famille 36K dans le fonctionnement et la participation

à diverses maladies soit établi.

On a déjà signalé des relations entre la famille 36K et la transformation [Proc. Natl. Acad. Sci., 6: 5212-521'6 (1979)],à partir desquelles il a été établi que dans des 3. cellules de culture transformées par un virus portant un gène cancérigène, l'introduction de la phosphorylation

dans leurs radicaux tyrosine augmentait fortement. On pen-

se que la Calpactine 1 décrite ci-dessus a été observée dans cette étude, mais on ne sait toujours pas comment l'augmentation de la phosphorylation dans la transformation entraîne une prolifération indéfinie des cellules, etc. Les relations entre l'importance physiologique de l'inflammation et la famille 36K ont également

été étudiées.

La prostaglandine, le leukotriène, le PAF, etc.

qui sont des substances chimiques transférant l'inflamma-

tion in vivo sont libérées de la membrane cellulaire par la phospholipase A2 au site inflammatoire. Il a été établi que des protéines antiinflammatoires,désignées jusqu'à présent sous les noms de lipomoduline, macrocortine, rénocortine, sont des membres de la famille 36K et il

a été confirmé que leur activité anti-inflammatoire se mani-

festait en inhibant la phospholipase A2 précitée.

Cette activité d'inhibition de la phospholipase A2 est une propriété que possèdent toutes les protéines connues jusqu'à present appartenant à la famille 36K. Il est également connu que cette activité est perdue par phosphorylation. Les relations entre le mécanisme physiologique

de l'immunité et la famille 36K ont également été étu-

diées. Il a été établi que le facteur d'inhibition de la

glycosylation (GIF) produit par les lymphocytes suppres-

seurs, les macrophages, etc. est un membre de la famille 36K [Proc. Natl. Acad. Sci., 83, 160-164 (1986)], ce qui conduit à un objet d'étude.futur portant sur la relation avec des maladies immunes telles que l'allergie, les rhumatismes, etc.

On estime également que les protéines intra-

4.

cellulaires nommées calélectrine, chromobindine, calcimédi-

ne, endonexine, annexine, etc. appartiendraient à la famil-

le 36K et on suppose qu'elles prennent part au transfert

de diverses informations physiologiques.

Comme il a été indiqué ci-dessus, une série de protéines cellulaires collectivement désignées sous le nom

de famille 36K sont des substances qui ont une grande im-

portance du point de vue physiologique. Leur identifica-

tion et leur détermination quantitative posaient un problème extrêmement important à étudier,pouvant conduire

directement à la mise au point d'excellents médicaments.

Comme il a été indiqué ci-dessus, il est extrême-

ment important,pour la mise au point de médicaments, de met-

tre au point un moyen pour identifier et déterminer quanti-

tativement les protéines appartenant à la famille 36K.

Comme moyen d'identifier et déterminer quantita-

tivement une série de protéines ayant des structures simi-

lairespour lesquelles on s'attend à des fonctions indépen-

dantes, on a envisagé jusqu'à présent ce qui suit.

(1) une méthcdepour identifier indirectement la protéine en reconnaissant sa séquence d'ADN au moyen d'une sonde à ADN (2) une méthode pour reconnaltre la protéine par une "réaction antigène-anticorps" par récolte d'un anticorps monoclonal (désigné parfois ci-après sous le nom de "Mb"); La méthode utilisant le Mb est considérée comme étant unmoyen analytique idéal, car le Mb est capable de se lier directement avec une protéine exprimée, et chacun

peut reconnaître le seul déterminant antigénique.

Dans la famille 36K, le Mb contre la Calpactine 1

était connu Nol. Cell. Biol., 6, 2745-2751 (1986)]. Cepen-

dant, par cette méthode, l'immunisation était effectuée en utilisant une protéine brute,de telle sorte qu'on ne savait pas quel site de la protéine le Mb reconnaissait,et par 5.

conséquent,la protéine brute ne convenait pas comme anti-

corps pour examiner une fonction spécifique.

En outre, le Mb pour la lipomoduline de lapin

était également connu [J. Immunol., 132, 1286-1293 (1984)].

Cependant, son site de reconnaissance dans la protéine

n'était pas clair lui non plus, comme il a été décrit ci-

dessus, et un problème similaire se posait.

Problèmes à résoudre par l'invention,: L'examen de séquences de gènes de la Calpactine 1 et de la Calpactine 2 révèle que des séquences d'aminoacides

de ces protéines contiennent un motif répétitif de 4 domainessimilai-

res et diffèrent l'une de l'autre sur des domaines définis partant de leur extrémité N-terminale (extrémité ayant un groupe amino) (désignés sous le nom de "domaine N-terminal"

dans la description).

La phosphorylase spécifique de la tyrosine, un si-

te de phosphorylation par la C-kinase, un site dans lequel

la modification des lipides est attendue, un site hydrolysa-

ble par la protéase etc. sont concentrés dans le domaine N-

terminal.

De ce qui précède, on pourrait aisément déduire que dans une série de protéines appartenant à la famille 36K, le domaine N-terminal remplit une fonction caractéristique

pour chaque protéine.

Ainsi, si l'on peut obtenir un Mb capable de re-

connaitre spécifiquement le domaine N-terminal, (1) le mécanisme d'action de la protéine appartenant à la famille 36K sur la

maladie pourrait être expliqué et (2) l'identification pour-

rait être effectuée en interdisant les possibilités de réac-

tion croisée entre des protéines appartenant à la famille 36K. Dans ces conditions, la demanderesse a effectué des études poussées pour obtenir un Mb capable de reconnaître spécifiquement le domaine N-terminal décrit ci-dessus,et

elle a finalement abouti à la présente invention.

6. Moyens pour résoudre les problèmes: Dans la présente invention, le peptide optimum

est préparé par synthèse chimique, eu égard à l'antigénici-

té sur le site fonctionnel en dehors du domaine N-terminal.

Pour cette raison, l'antigénicité est attendue

au moyen d'une analyse par calculateur par examen d'homo-

logie etc., en utilisant la séquence d'aminoacidesattendue d'une séquence d'ADN de la famille 36K et divers peptides

sont préparés par synthèse chimique.

Le peptide utilisé ici pour l'immunisation peut

également être purifié à partir de la protéine de la famil-

le 36K purifiée dans le cas o un site de clivage par une enzyme de décomposition (protéase) appropriée est présent.

Dans la présente invention, le peptide ainsi ac-

quis peut être immobilisé par liaison avec un support appro-

prié, par eemple l'hémocyanine du gastéropode en trou de serrure (keyhole limpet), etc. En outre, suivant le but recherché, une séquence de gène du domaine N-terminal de la protéine de la famille

36K est liée au plasmide de E. ccli, par exemple une par-

tie de la 3-galactosidase pour l'exprimer sous forme de pro-

téine condensée; la protéine condensée peut être utilisée

après purification.

Pour la liaison du peptide à un support, on peut

utiliser un réactif chimique approprié, par exemple le glu-

taraldéhyde, le carbodiimide, le MBS (m-maléimidobenzoyl-N-

hydroxysuccinimide ester), etc. On décrira ci-après un procédé de préparation du Mb conforme à la présente invention en utilisant la protéine

ainsi obtenue comme antigène.

On expliquera tout d'abord la préparation de

cellules immunisées.

Les cellules immunisées peuvent être obtenues en administrant l'antigène dans le corps de l'animal et en 7.

recueillant des cellules provenant de l'animal.

Comme animal, on peut utiliser des animaux tels

que la souris etc. habituellement utilisés pour les expé-

riences. Il est avantageux d'administrer l'antigène par voie intrapéritonéale, etc., et de l'administrer sous for- me de mélange avec de l'adjuvant complet de Freund de la

manière classique,mais dans la présente invention, on pré-

fère répéter l'administration plusieurs fois à des inter-

valles de plusieurs semaines. Il suffit que l'intervalle de temps entre l'administration soit de 2 semaines, et le

nombre d'administrations est de préférence de 2 à 4.

Ensuite, on sacrifie l'animal et on prélève des organes,par exemple la rate, etc. pour obtenir des cellules

de la manière classique.

On décrira ci-après la fusion cellulaire à des

cellules de myélome en vue de conférer aux cellules immuni-

sées unpouvoir de prolifération.

Les cellules de myélome utilisées ici peuvent être obtenues en cultivant par exemple une souche SP2/O-Agl4 etc. dans un milieu contenant par exemple du FCS (sérum de foetus de bovin). On utilise de préférence des cellules

dans la phase de croissance exponentielle.

Pour la fusion cellulaire, les cellules immunisées sont mélangées avec des cellules de myélome dans un rapport numérique allant de 1: 1 à 10: 1, puis la fusion est

effectuée en utilisant un agent de fusion tel que le po-

lyéthylèneglycol, etc. ou une stimulation électrique, etc. Après fusion, les cellules sont cultivées dans le

milieu "HAT" complété avec de l'hypoxanthine, de l'aminopté-

rine et de la thymidine immédiatement ou après pré-incuba-

tion dans un milieu ordinaire, grâce à quoi on peut choisir uniquement les cellules ayant subi la fusion en une combinaison de cellules immunisées et de cellules de myélome. Dans la présente invention, les cellules produisant 8. l'anticorps peuvent être choisies tout en confirmant le titre de l'anticorps, par exemple par dosage immunologique lié à l'utilisation d'une enzyme (ELISA), etc.

Les cellules dans lesquelles le titre de l'anti-

corps a pu être confirmé sont cultivées de manière répé- tée dans une plaque à réservoirs ou dans une boite de

Pétri,d'une manière classique, par exemple par la métho-

de de dilution limitante, la méthode à la gélose molle, etc., au cours de laquelle la productivité d'anticorps, l'essai immunochimique de l'anticorps produit, l'essai de spécificité pour l'antigène etc. sont effectués, ce qui permet d'effectuer une sélection. Enoutre, une sélection peut également être effectuée en utilisant

un micromanipulateur ou un classeur de cellules.

Les cellules conformes à la présente invention

peuvent produire du Mb en continu conformément à la présen-

te invention. En conséquence, dans le cas de l'utilisa-

tion de Mb conformément à la présente invention, le liqui-

de surnageant de la solution de culture conforme à la pré-

sente invention peut être utilisé directement tel quel

comme solution de Mb conforme à la présente invention.

En outre, le Mb conforme à la présente invention peut également être produit en administrant des cellules produisant de l'anticorps dans l'organisme d'un animal tel que souris, etc. habituellement utilisé pour l'essai (par exemple par voie intrapéritonéale) et en recueillant un fluide corporel de l'animal, par exemple, des ascites, etc. Pour purifier et recueillir le Mb conforme à la présente invention à partir de la solution de culture des cellules conforme à la présente invention ou d'ascites, on peut récolter le Mb par exemple par précipitation par le sulfate d'ammonium, par chromatographie d'échange d'ions, etc. Le Mb ainsi recueilli peut être stocké sous 9.

forme d'une substance stable, en ajoutant par exemple di-

verses solutions tampons, et si nécessaire, un sel et un azide, etc., ou par lyophilisation etc.

L'identification de chaque classe d'immunoglo-

buline de ces anticorps peut être effectuée par ELISA

en utilisant l'anticorps spécifique contre cette classe.

En ce qui concerne le Mb ainsi obtenu, capable de reconna3tre chaque domaine N-terminal de la famille 36K,

on peut confirmer que le Mb se lie spécifiquement à cha-

cune des protéines appartenant à la famille 36K par les

moyens immunobiochimiques suivants.

Une technique d'identification utilisant du Mb conforme à la présente invention, en le soumettant à une analyse par la technique du western blot,est expliquée

ci-dessous.

Cette technique peut être appliquée à l'identi-

fication et à la détermination quantitative d'un peptide dans un échantillon provenant d'un organisme vivant. Dans celle-ci, un échantillon provenant d'un organisme vivant

est fractionné par une électrophorse sur gel de SDS polyacryla-

mide d'une manière classique, suivie d'un "buvardage"

sur une membrane de nylon ou sur une membrane de nitrocellu-

lose. Le peptide transféré sur la membrane est lié au Mb, qui est ensuite lié à la protéine A marquée avec du 35S ou du 125I. Dans ce cas,un excès de Mb et de protéine A est

éliminé à chaque fois par un lavage soigné.

En opérant ainsi, du 35S ou du 125I est théorique-

ment présent en proportion de la quantité de Mb à la position

du peptide, en correspondance avec la spécificité du Mb uti-

lisé. Le 35S ou le 125I présent sur la membrane est détec-

té au moyen d'un dtecteur radio-immunologique (RI scanner) ou par autoradiographie, grâce à quoi on peut effectuer

l'identification et la détermination quantitatives du pep-

tide. On décrira ensuite ci-dessous une technique pour 10.

l'identification du peptide, caractériséeen ce qu'on utili-

se un moyen de RIP (radio-immunoprécipitation).

Dans la RIP, un échantillon de cellule est culti-

Vé dans une solution de culture contenant de la méthionine marquée par exemple par du 35S, etc., incorporant ainsi le traceur dans l'échantillon de cellule. On y ajoute une solution tampon pour la solubilisation et on recueille le lysat. On ajoute au lysat du Mb conforme à la présente

invention. En mélangeant, on réalise une réaction antigène-

anticorps.

Puis, on ajoute de la manière classique une protéine A-Sépharose, etc. Par des centrifugations et des lavages au tampon répétés, les impuretés autres que

le peptide conforme à la présente invention sont élimi-

nées. On effectue ensuite l'électrophorèse d'une manière classique pour détecter le radio-isotope. Dons le cas o le peptide est présent dans les cellules de l'échantillon, des bandes correspondant à la spécificité du Mb utilisé apparaissent. On expliquera ensuite ci-dessous une technique pour

détecter les peptides dans un organisme vivant,caracté-

riséeen ce qu'on utilise l'immunocytochimie.

Dans le cas de cellules cultivées, les cellules sont immobilisées avec une solution de fixage appropriée, telle qu'une solution formaldéhyde- sérum physiologique

tamponné au phosphate (PBS), etc., après quoi on effec-

tue un traitement par le Triton pour fournir des échantil-

lons. Du Mb conforme à la présente invention est ajouté à ces échantillons pour achever une réaction antigène

anticorps, après quoi on lave soigneusement avec un tam-

pon phosphate. Après avoir fait réagir de l'anti-immuno-

globuline liée à la biotine comme anticorps secondaire, on effectue un lavage soigné. De l'avidine marquée par

fluorescence est mise à réagir avec le complexe peptide-

Mb-anticorps secondaire lié à la biotine. Sa fluorescence 11. est observée au moyen d'un microscope à fluorescence pour

détecter le peptide dans des cellules.

Dans le cas d'un tissu pathologique, le tissu

est fixé avec du formol ou une autre solution de fixa-

tion apprpriée, pour faire une tranche, ou bien une tranche lyophilisee est ensuite fixée avec du formaldéhyde, etc., si nécessaire, traitée ensuite par un agent tensio-actif;

le tissu ainsi obtenu est utilisé comme échantillon.

L'échantillon est traité d'une manière similaire pour ef-

o10 fectuer l'immunocytochimie.

Conformément à la présente invention, il est pos-

sible d'obtenir un Mb capable de reconnaître spécifique-

ment le domaine N-terminal de chaque protéine de la famil-

le 36K. En appliquant des techniques immunobiochimiques telles que le "western blotting", l'immunocytochimie, etc.,

décritesen détail ci-dessus,chacune des protéines apparte-

nant à la famille 36K peut être identifiée même si elle

est présente à l'état de trace. Ceci signifie qu'on dispo-

se désormais d'une méthode qui fait date pour établir la fonction de chacune des protéines étudiées,leur rapport de présence dans chaque tissu, leur état de répartition (traitement, phosphorylation), etc.

Enoutre, ce Mb est capable de reconnaltre spéci-

fiquement le domaine N-terminal de chacune des protéines de la famille 36K et il est par conséquent possible d'incorporer le système d'inhibition de la phosphorylation, du sucre, de la modification des lipides, de la liaison à la protéine 10K dans la Calpactine 1, etc. couplé à un

anticorps approprié. Par conséquent, ces phénomènes peu-

vent être des matières utiles pour étudier la façon dont ces phénomènes participent à l'expression de la fonction

de chaque protéine de la famille 36K.

Il résulte de ce qui précède que le Mb de la pré-

sente invention est utile pour la clarification du mécanisme de transfert de l'information in vivo dans des maladies 12. telles que transformation, maladies immunes, inflammation, etc. et est considéré comme essentiel pour établir

le traitement de ces maladies.

(EXEMPLES)

L'invention sera décrite ci-après de manière plus détaillée en se référant aux exemples ci-dessous, mais ces exemples sont destinés simplement à illustrer les modes de réalisation de la présente invention qui ne

doit pas être considéréecomme limitéeà ceux-ci.

EXEMPLE 1 -

Préparation du Mb pour le domaine N-terminal de la Calpactine 1 (l) Préparation de l'antigène Dans la séquence d'aminoacidesattendue à partir de la séquence de gnes, 28 aminoacides depuis le premier (méthionine) jusqu' au 28ème (lysine)ont été préparés

par synthèse chimique d'une manière classique.

Une solution de 10 mg de ce peptide dans 2 ml

d'eau distillée purifiée a été mélangée avec 4 mg/ml de solu-

tion de sérumalbumine de bovin (Fraction V fabriquée par la société Sigma Inc.) et un carbodiimide soluble dans l'eau (fabriqué par la Protein Study Promotion Association)

a été ajouté au mélange comme agent de couplage, à une con-

centration finale de 0,2 M. Tout en maintenant le pH à 6,0, on a effectué

la réaction de couplage pendant 30 minutes à une heure jus-

qu'à ce qu'on n'observe plus de modification du pH. Puis on a effectué une dialyse à 4 C avec du PBS (-) et on a éliminé les matières n'ayant pas réagi à travers une colonne de filtration sur gel. On a obtenu ainsi 12 mg de complexe

peptide-sérumalbumine de bovin.

La séquence d'aminoacides(28 aminoacides du pre-

mier au 28ème) correspondant au domaine N-terminal de la Calpactine 1 est connue et est la suivante:

Met-Ser-Thr-Val-His-Glu-Ile-Leu-Cys-Lys-Leu-Ser-

26 2 5 1 0 1

13.

Leu-Glu-Gly-Asp-His-Ser-Thr-Pro-Pro-Ser-Ala-Tyr-Gly-Ser-Val-

Lys. (2) Production de cellules immunisées Un mélange de O,1 ml d'une solution contenant 100 wg de la substance obtenue en (1) et 0,1 ml d'adjuvant complet de Freund (fabriqué par la société DIFCO, Ltd.) a été administré par voie intrapéritonéale à des

souris femelles BALB/c âgées de 10 semaines. Puis, un mé-

lange en solution de: la solution décrite ci-dessus et d'adjuvant incomplet (fabriqué par DIFCO, Ltd.) a été

administré deux fois par voie intrapéritonéale à 2 semai-

nes d'intervalle. La souris a ensuite été sacrifiée par

dislocation cervicale et la rate a été prélevée aseptique-

ment. Sur un sélecteur (fabriqué par la société BELCO,

Ltd.), on a placé environ 1 g de la rate décrite ci-des-

sus et on l'a fait passer à travers untamis d'environ 10 w tout en apportant du milieu MEM (D-MEM) modifié de Dulbecco, ce qui donne des cellules de rate à l'état de suspension dans le D-MEM. La suspension a été centrifugée à lOOG pendant 5 minutes pour recueillir les cellules de rate. Les cellules décrites ci-dessus ont été ajoutées à 1 ml d'une solution obtenue en ajoutant du tampon HEPES

20 mM (pH 7,4) à 0,84 % de la solution de chlorure d'ammo-

nium pour provoquer une hémolyse. Les cellules ont été ob-

tenues par centrifugation sous 1 OOOG pendant 5 minutes.

Les cellules ont été remises en suspension dans du D-MEM.

* (3) Production de cellules de myélome On cultive une souche SP2/0-Agl4 de la lignée cellulaire de myélome de souris du type résistant à la 8azaguanine et ne secrétant pas d'immunoglobuline dans un milieu D-MEM contenant 20 % de sérum de foetus de bovin (FCS) dans un incubateur à 37 C sous C02 à 10 X. On recueille les cellules dans la phase de croissance 14. exponentielle et on les utilise pour l'opération suivante. Par centrifugation à 1 OOOG pendant 5 minutes, on recueille seulement les cellules et on les remet en suspension dans du milieu D-MEM. On compte les cellules avec un hémacytomètre. Après une nouvelle centrifugation

à 100OG pendant 5 minutes, on remet les cellules en suspen-

sion dans du milieu D-MEM.

(4) Fusion cellulaire On mélange le milieu D-MEM contenant 10 à 3 x

108 cellules, obtenues en (2) avec le milieu D-MEM con-

tenant 108 cellules de myélome obtenue en (3). Après

homogénéisation, on centrifuge le mélange sous 1 000G pen-

dant 5 minutes. On élimine le liquide surnageant, on recueil-

le leprécipité et on ajoute goutte à goutte 1 ml d'une solu-

tion contenant 25 % (P/V) de polyéthylèneglycol 1500 (PEG 1500, fabriqué par la société Boehringer, Ltd.) et 37,5 mM de HEPES sur une durée d'une minute. Puis on dilue progressivement le mélange avec du milieu D-MEM pour amener

le tout à 10 ml.

On y ajoute 10 ml de milieu D-MEM contenant 20 %

de FCS, après quoi on centrifuge à 1 OOOG pendant 5 minu-

tes. On ajoute aux cellules obtenues du D-MEM contenant % de FCS dans 106 cellules/ml. On répartit le mélange dans une plaque de culture à 24 réservoirs,fabriquée par

la société Corning Glass Inc., à raison de 1 ml par réser-

voir après quoi on les cultive à 37 C pendant 24 heures

sous C02 à 10 % dans un incubateur.

Puis on ajoute une solution de HAT pour éliminer les cellules autres que les cellules ayant fusionné. On

continue l'incubation pendant 2 semaines supplémentaires.

(5) Mesure du titre en anticorps par ELISA

Chacun des réservoirs de la plaque de micro-

titrage (N 001-010-2101 fabriquée par la société Dinatec Laboratories, Ltd.) est revêtu de 1 wg/ml du peptide 15. obtenu en (1). Le liquide surnageant, 150 wl, contenant l'anticorps comme substance à analyser,est placé dans le réservoir, on le laisse séjourner à 37 C pendant 2 heures dans l'incubateur, puis on le lave avec du PBS (tampon phosphate-solution saline). On y ajoute un anticorps anti-souris de chèvre complet lié à de la peroxydase et on le laisse séjourner à 37C pendant une heure dans l'incubateur. Après lavage avec du PBS, on ajoute un colorant (ABTS), pour former une couleur pendant 15

minutes. On ajoute une solution d'arrêt (citrate 0,1 M-

azide de sodium 0,02 %) pour arrêter la réaction. Puis

on mesure l'absorbance du réservoir avec un multiscanner fa-

briqué par la société Titertec, Ltd. (6) Choix des cellules produisant l'anticorps Les cellules présentes dans le réservoir qui ont été confirmées par ELISA sont inoculées sur du milieu à la gélose molle dans une boite de Pétri de 60 mm de diamètre. L'incubation est effectuée à 37 C, sous C02 à 10 % pendant 2 semaines dans un incubateur pour former

une colonie.

La colonie formée est prélevée et placée dans

une plaque de culture à 24 réservoirs. L'activité de l'anti-

corps est à nouveau confirméepar ELISA. Les cellules présentes dans le réservoir qui ont été confirmées par l'activité d'anticorps sont inoculées sur un milieu à

la gélose molle dans une boite de Pétri de 60 mm de diamè-

tre. L'incubation est effectuée à 37 C sous C02 à 10 %

pendant 2 semaines dans un incubateur pour former une colo-

nie. La colonie formée est retirée et placée sur une plaque de culture à 24 réservoirs. L'activité deanticorps

est à nouveau confirmée par ELISA pour choisir des cel-

lules utilisables. (7) Collection de l'anticorps (1) Les cellules produisant de l'anticorps

obtenues en (6) sont capables de produire toujours l'anticorps de la 16. présente invention. En conséquence, le liquide surnageant

de la solution de culture dans laquelle les cellules pro-

duisant de l'anticorps ont été cultivées peut être utili-

sé directement comme solution de l'anticorps de la présen-

te invention. (2) Du sulfate d'ammonium est ajouté à la solution

de culture des cellules produisant de l'anticorps obtenues -

en (6) à une concentration finale de 30 %. Après centrifuga-

tion, le précipité est recueilli et on leur ajou-

te 20 m4 de tampon phosphate présentant un pH de 7,4. Une

dialyse est effectuée en utilisant le même tampon phospha-

te (contenant 0,02 % d'azide de sodium) pour éliminer le

sulfate d'ammonium. Après dialyse, la solution est lyo-

philisée pour donner une poudre blanche.

(3) Du Pristane, 0,5 mg, est injecté par voie intrapéritonéale à des souris mâles BALB/C et les souris

sont élevées pendant 2 semaines. Les cellules produi-

sant de l'anticorps obtenues en (6) sont injectées à la souris à raison de 106 à 3 x 106 cellules/souris après quoi on les élève pendant 10' jours. On recueille au moyen d'une seringue environ 10 ml des ascites présentes

dans la cavité péritonéale.

Du sulfate d'ammonium est ajouté aux ascites à une concentration finale de 30 %. Puis on leur ajoute

20 mM d'un tampon phosphate présentant un pH de 7,4.

Une dialyse est effectuée en utilisant le même tampon

phosphate (contenant 0,02 % d'azide de sodium) pour éli-

miner le sulfate d'ammonium. Après dialyse, la solution

est lyophilisée pour donner une poudre blanche.

(8) Identification de chaque classe d'immunoglobuline

L'identification de chaque classe d'immunoglobu-

line est effectuée de la manière suivante. Des anticorps spécifiques des classes (comme IgA, IgCl, IgG2a, IgG2b, IgG3 et IgM, on a utilisé ceux fabriqués par la société Biorad Ltd.), sont ajoutés,après quoi on fait réagir 17. à 37 0C pendant 2 heures. Puis on lave soigneusement le système avec du PBS. On y ajoute de l'anticorps complet anti-souris de chèvre lié à de la peroxydase. On laisse

reposer le mélange à 37 C pendant une heure dans un incu-

bateur. Après lavage avec du PBS,-on ajoute un colorant

(ABTS) pour former une coloration pendant 15 minutes, grâ-

ce à quoi on identifie chacune des classes. Les résultats

sont donnés en partie dans le Tableau 1.

TABLEAU 1

N de référence Lignée cellulaire Sous-classe 1 3,1OH G2b 2 3,11A G2b 3 4, 5 E G2a ; 4 4,7 G G2b 4,9 H G2b 6 5,2 A G2a 7 5,2 C G2b 8 5,10E G2b 9 6,4 C G2b

6,7 C G3

11 6,9 F G1

12 9,2 E G2b

13 10,9 B G3

14 10,11A G2b 11,2 F G2b

EXEMPLE 2

Préparation du Mb pour le domaine N-ternilal de la Calpac-

tine 2 La séquence d'aminoacides(23 aminoacides du 13ème au 35ème) correspondant au domaine N-terminal de la

Calpactine 2 était connue et elle est la suivante.

Phe-Ile-Glu-Asn-Glu-Glu-Gln-Glu-Tyr-Val-Gln-Thr-

Val-Lys-Ser-Ser-Lys-Gly-Gly-Pro-Gly-Ser-Ala. Un peptide dont la séquence d'aminoacideétait Un peptide dont la séquence d'aminoacidesétait

2 6 2 5 1 0 1

18. composée des 23 aminoacides a été obtenu par synthèse chimique. On a ensuite opéré d'une manière similaire

l'Exemple 1 pour obtenir le Mb recherché.

L'identification de chaque classe d'immunoglobu- ine a été effectuée d'une manière similaire à l'Exemple 1

pour donner les résultats donnés dans le Tableau 2.

TABLEAU 2

N de référence Lignée cellulaire Sous-classe 1 ij 1,5 A G2b

2 2,5 C G1

3 2,10D G2a 4 5,3 B G2a

5 5,5 E G3

6 5,8 A G2b 7 7,1 B Gi 8 7,5 D G2a 9 10,5 A G2b 2O

10 10,1OA M

EXEMPLE 3

Production de Mb pour le domaine N-terminal de 1'IBC La séquence d'aminoacides(22 aminoacides du premier au 22ème) correspondant au domaine N-terminal de 1'IBC était connue et elle est la suivante:

Met-Ala-Gln-Val-Leu-Arg-Gly-Thr-Val-Thr-Asp-Phe-

Pro-Gly-Phe-Asp-Glu-Arg-Ala-Asp-Ala-Glu Un peptide ayant une séquence d'aminoacidescomposée

des 22 aminoacides a été obtenu par synthèse chimique.

On a ensuite opéré d'une manière similaire à

l'Exemple 1 pour obtenir le.Mb recherché.

L'identification de chaque classe d'immunoglobu-

line a été effectuée d'une manière similaire à l'Exemple 1,

pour donner les résultats figurant dans le Tableau 3.

19.

TABLEAU 3

N de référence Lignée cellulaire Sous-classe

1 1,4 B G3

i 2 2,2 B G2a 3 2,50A G2a 4 5,2 B G2b 5,5 D G2a 6 5,7 A G2a 7 6,1 B G2b

8 7,8 D G3

9 11,5 A G2a 12,30B G2a La présente invention n'est pas limitée aux exemples de réalisation qui viennent d'être décrits, elle

est au contraire susceptible de modifications et de varian-

tes qui apparaltront à l'homme de l'art.

20.

Claims (4)

REVENDICATIONS

1 - Anticorps monoclonal capable de reconnai-

tre spécifiquement une protéine appartenant à la famil-

le 36K.

2 - Procédé de préparation d'un anticorps monoclonal capable de reconnaitre spécifiquement une protéine appartenant à la famille 36K,qui comprend la

synthèse chimique d'un peptide correspondant à une séquen-

ce d!aminoacidE dans la région N-terminale d'une protéine appartenant à la famille 36K et la collecte d'un anticorps, en

utilisant ce peptide comme antigène.

3 - Procédé d'identification ou de détermination quantitative d'une protéine appartenant à la famille 36K

en utilisant un anticorps monoclonal capable de reconnai-

tre spécifiquement une protéine appartenant à la famille 36K.

4 - Procédé selon la revendication 2, caractérisé

en ce que ledit peptide est lié à un support.