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ANTICORPS MONOCLONAL, PROCEDE POUR SA PREPARATION ET POUR SON UTILISATION.
La présente invention concerne un nouvel anticorps monoclonal, et plus particulièrement un anticorps monoclonal extremement utile comme médicament en ce sens qu'il reconnait un site particulier de la protéine du cyto-squelette de la membrane qui est présent autour de la membrane cellulaire et qui est considéré comme participant au système de transfert de 1'information.
Ces dernières années, il a été établi, grâce au développement remarquable des techniques de la biologie moleclaire, que le Systeme de transfert de l'information et le système de cyto-squelette, qui étaient considérés comme jouant des roles très différents, étaient étroitement liés l'un à l'autre.
11 a été établi par de nombreuses études qu'entre autres une série de protéines nommées protéines du cyto-squelette de la membrane faisaient office de premiers véhicules pour transférer l'information dans les cellules,
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après qu'une stimulation physiologique provenant d'une source extérieure aux cellules ait été transformée en une information chimique précise par un récepteur sur la surface de la cellule.
Parmi ces protéines du cyto-squelette de la membrane, une série de protéines ayant une masse moléculaire d'environ 36 000 ont reçu le nom de groupe de protéines 36K (lequel est désigné par"famille 36K"dans la description) et sont connues pour être des protéines particulières qui remplissent de multiples fonctions pour prendre part au : transfert d'informationstellesque transformation, inflammation, immunité, etc.
Les protéines désignées collectivement sous le nom de famille 36K sont considérées comme étant la cause de l'interaction associée aux lipides et au calcium, en même temps que des protéines telles que l'actine, la fodrine, etc. présentes autour d'elles.
Diverses études ont été effectuées sur la famille 36K ; la présence de Calpactine 1 (également désignée sous le nom de lipocortine 2), de Calpactine 2 (également désignée sous le nom de lipocortine 1), etc. et leurs structures
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primaires ont été établies. [Cell, 46, 201-212 (1986), Cell, 46, 191-199 (1986)].
De plus, en ce qui concerne la protéine désignée sous le nom de IBC (inhibiteur de la coagulation du sang), sa structure primaire a été établie LJ, Biochem. (Tokyo), 102, 1261-1273 (1987) ].
En outre, en ce qui concerne d'autres protéines appartenant à la famille 36K, leur présence est suggérée et on s'attend à ce que le role cytophysiologique de la famille 36K dans le fonctionnement et la participation à diverses maladies soit établi,
On a déjà signalé des relations entre la famille 36K et la transformation fProc. atl. jcad. Sci., 76 5212-5216 (1973) ], à partir desquelles il a été établi que dans des
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cellules de culture transformées par un virus portant un gène cancérigène, l'introduction de la phosphorylation dans leurs radicaux tyrosine augmentait fortement.
On pense que la Calpactine 1 décrite ci-dessus a été observée dans cette étude, mais on ne sait toujours pas comment l'augmentation de la phosphorylation dans la transformation entraine une prolifération indéfinie des cellules, etc.
Les relations entre l'importance physiologique de l'inflammation et la famille 36K ont également été étudiées.
La prostaglandine, le leukotriène, le PAF, etc. qui sont des substances chimiques transférant l'inflammation in vivo sont libérées de la membrane cellulaire par la phospholipase A2 au site inflammatoire. 11 a été établi que des protéines anti-inflammatoires, désignées jusqu'à présent sous les noms de lipomoduline, macrocortine, rénocortine, sont des membres de la famille 36K et il a été confirme que leur activité anti-inflammatoire se manifestait en inhibant la phospholipase A2 précitée.
Cette activité d'Inhibition de la phospholipase A2 est une propriété que possedent toutes les protéines connues jusqu'à présent appartenant à la famille 36K. 11 est également connu que cette activité est perdue par phosphorylation.
Les relations entre le mécanisme physiologique de 1'immunité et la famille 36K ont également été étudises.
11 a été établi que le facteur d'inhibition de la glycosylation (GIF) produit par les lymphocytes suppresseurs, les macrophages, etc. est un membre de la famille 36K [Proc. Natl. Acad. Sei., 83, 160-164 (1986) ], ce qui conduit à un objet d'étude futur portant sur la relation avec des maladies immunes telles que l'allergie, les rhumatismes, etc.
On estime également que les protéines intra-
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cellulaires nommées calelectrine, chromobindine, calcimédine, endonexine, annexine, etc. appartiendraient à la famille 36K et on suppose qu'elles prennent part au transfert de diverses informations physiologiques.
Comme il a été indique ci-dessus, une série de protéines cellulaires collectivement désignées sous le nom de famille 36K sont des substances qui ont une grande importance du point de vue physiologique. Leur identification et leur détermination quantitative posaient un problème extremement important à étudier, pouvant conduire directement à la mise au point d'excellents médicaments.
Comme il a été indiqué ci-dessus, il est extremement important, pour la mise au point de médicaments, de mettre au point un moyen pour identifier et determiner quantitativement les protéines appartenant à la famille 36K.
Comme moyen d'identifier et déterminer quantitativement une série de protéines ayant des structures similairespour lesquelles on s'attend a des fonctions indépendantes, on a envisagé jusqu'a présent ce qui suit.
(1) une méthode pour identifier indirectement la
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protéine en reconnaissant sa séquence d'ADN au moyen d'une sonde à ADN (2) une méthode pour reconnaitre la protéine par une "réaction antigène-anticorps" par récolte d'un anticorps monoclonal (désigné parfois ci-après sous le nom de"Mb") ?
La méthode utilisant le Mb est considérée comme étant un moyen analytique idéal, car le Mb est capable de se lier directement avec une protéine exprimée, et chacun peut reconnaitre le seul déterminant antignique.
Dans la famille 36K, le Mb contre la Calpactine 1 était connu [Mol. Cell. Biol., 6, 2745-2751 (1986)]. Cependant, par cette méthode, l'immunisation était effectuée en utilisant une protéine brute, de telle orte qu'on ne savait pas quel site de la protéine le Mb reconnaissait, et par
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consequent, la proteine brute ne convenait pas comme anticorps pour examiner une fonction spécifique.
En outre, le Mb pour la lipomoduline de lapin était également connu IJ. Immunol., 132, 1286-1293 (1984)].
Cependant, son site de reconnaissance dans la protéine n'était pas clair lui non plus, comme i1 a été decrit cidessus, et un probleme similaire se posait.
Problees a resoudre par l'invention. : L'examen de sequences de gènes de la Calpactine 1 et de la Calpactine 2 révèle que des sequences d'aminoacides de ces protéines contiennent un notif répétitif de 4 domaines similaires et different l'une de l'autre sur des domaines définis partant de leur extrémité N-terminale (extrémité ayant un groupe amino) (désignés sous le nom de"oomaine N-terminal" dans la cescription).
La phosphorylase spécifique de la tyrosine, un site de phosphorylation par la C-kinase, un site dans lequel la modification des lipides est attendue, un site hydrolysable par la protéase etc. sont concentrés dans le domaine Nterminal.
De ce qui précède, on pourrait aisément deduire que dans une serie de protéines appartenant a la famille 36K le domaine N-terminal remplit une fonction caractéristique pour chaque proteine, Ainsi, si l'on peut obtenir un Mb capable de reconnaitre spécifiquement ledamine-terrninal, (l) lenscanisne d'action de la protéine appartenant à la famille 36K sur la maladie pourrait etre explique et (2) l'identification pourrait etre effectuee en interdisant les possibilités de réaction croisée entre des protéines appartenant à la famille 36K.
Dans ces conditions, la demanderesse a effectué des études poussées pour obtenir un Mb capable de reconnaitre spécifiquement le domaine N-terminal décrit ci-dessus. et elle a finalement abouti à la présente invention.
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Moyens pour résoudre les problemes :
Dans la présente invention, le peptide optimum est prepare par synthèse chimique, eu égard à l'antigenici- té sur le site fonctionnel en dehors du domaine N-terminal.
Pour cette raison, l'antigenicite est attendue au moyen d'une analyse par calculateur par examen d'homologie etc., en utilisant la séquence d'aminoacidesattendue d'une séquence d'ADN de la famille 36K et divers peptides sont préparés par synthèse chimique.
Le peptide utilisé ici pour l'immunisation peut également etre purifié à partir de la protéine de la famille 36K purifiée dans le cas où un site de clivage par une enzyme de décomposition (protéase) appropriée est present.
Dans la presente invention, le peptide ainsi acquis peut etre immobilisé par liaison avec un support approprié, par exemple l'hémocyanine du gastéropode en trou de serrure (keyhole limpet), etc.
En outre, suivant le but recherché, une séquence de gene du domaine N-terminal de la protéine de la famille 36K est liée au plasmide de E. coli, par exemple une partie de la ss-galactosidase pour l'exprimer sous forme de proteine condensée ; la protéine condensée peut etre utilisée après purification.
Pour la liaison du peptide à un support, on peut utiliser un reactif chimique approprié, par exemple le glu-
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tara1déhyde, le carbodiimide, le MBS (m-maléimidobenzoyl-N- hydroxysuccinimide ester), etc.
On décrira ci-après un procédé de préparation du Mb conforme à la presente invention en utilisant la protéine ainsi obtenue comme antigène.
On expliquera tout d'abord 1a préparation de cellules immunisées.
Les cellules immunisées peuvent etre obtenues en administrant l'antigene dans le corps de l'animal et en
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recueillant des cellules provenant de l'animal.
Comme animal, on peut utiliser des animaux tels que la souris etc. habituellement utilisés pour les expé- riences. 11 est avantageux d'administrer l'antigène par voie intraperitoneale, etc., et de l'administrer sous forme de mélange avec de l'adjuvant complet de Freund de la manière classique, mais dans la présente invention, on préfère répéter l'administration plusieurs fois à des intervalles de plusieurs semaines. 11 suffit que l'Intervalle de temps entre 1'administration soit de 2 semaines, et le nombre d'administrations est de préférence de 2 à 4.
Ensuite, on sacrifie l'animal et on prélève des organes, par exemple la rate, etc. pour obtenir des cellules
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de la maniere classique.
On décrira ci-après la fusion cellulaire à des cellules de myélome en vue de conférer aux cellules immunisees unpouvoir de prolifération.
Les cellules de myélome utilisées ici peuvent etre obtenues en cultivant par exemple une souche SP2/0-Agl4 etc. dans un milieu contenant par exemple du FCS (sérum de foetus de bovin). On utilise de preference des cellules dans la phase de croissance exponentielle.
Pour la fusion cellulaire, les cellules immunisées sont mélangées avec des cellules de myélome dans un rapport numérique allant de 1 : 1 à 10 : 1, puis la fusion est effectuée en utilisant un agent de fusion tel que le po- lyethyleneglycol, etc. ou une stimulation électrique, etc.
Après fusion, les cellules sont cultivées dans le milieu "HAT" complété aVeC de 1'hypoxanthine, de 1'aminoptérine et de la thymidine immédiatement ou après pré-incubation dans un milieu ordinaire, grâce à quoi on peut choisir uniquement les cellules ayant subi la fusion en une combinaison de cellules immunisees et de cellules de myélome.
Dans la présente invention, les cellules produisant
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l'anticorps peuvent etre choisies tout en confirmant le titre de l'anticorps, par exemple par dosage immunologique
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lié A l'utilisation d'une enzylne (ELISA), etc.
Les cellules dans lesquelles le titre de l'anticorps a pu etre confirme sont cultivées de maniere ripétee dans une plaque a réservoirs ou dans une bolte de Pétri, d'une manière classique, par exemple par la méthode de dilution limitante, la méthode à la gélose molle, etc., au cours de laquelle la productivité d'anticorps, l'essai immunochimique de l'anticorps produit, l'essai de spécificité pour l'antigene etc. sont effectués, ce qui permet d'effectuer une sélection. Enoutre, une sélection peut également etre effectuée en utilisant un micromanipulateur ou un classeur de cellules.
Les cellules conformes à la présente invention peuvent produire du Mb en continu conformément a la présente invention. En conséquence, dans le cas de l'utilisation de Mb conformément à la présente invention, le liquide surnageant de la solution de culture conforme à la presente invention peut etre utilisé directement tel quel comme solution de Mb conforme à la présente invention.
En outre, le Mb conforme à la présente invention peut également etre produit en administrant des cellules produisant de l'anticorps dans l'organisme d'un animal tel que souris, etc. habituellement utilise pour l'essai (par exemple par voie intraperitoneale) et en recueillant un fluide corporel de l'animal, par exemple, des ascites, etc.
Pour purifier et recueillir le Mb conforme à la présente invention à partir de la solution de culture des cellules conforme à la présente invention ou d'ascites, on peut récolter le Mb par exemple par précipitation par le sulfate d'ammonium, par chromatographie d'échange d'ions, etc.
Le Mb ainsi recueilli peut être stocké sous
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forme d'une substance stable, en ajoutant par exemple diverses solutions tampons, et si nécessaire, un sel et un azide, etc., ou par lyophilisation etc.
L'identification de chaque classe d'immunoglobuline de ces anticorps peut etre effectuée par ELISA en utilisant l'anticorps spécifique contre cette classe.
En ce qui concerne le Mb ainsi obtenu, capable de reconnaitre chaque domaine N-terminal de la famille 36K, on peut confirmer que le Mb se lie spécifiquement à chacune des protéines appartenant à la famille 36K par les moyens immunobiochimiques suivants.
Une technique d'identification utilisant du Mb conforme à la présente invention, en le soumettant à une analyse par la technique du western blot, est expliquée ci-dessous.
Cette technique peut etre appliquée à l'identification et à la détermination quantitative d'un peptide dans un échantillon provenant d'un organisme vivant. Dans celle-ci, un échantillon provenant d'un organisme vivant est fractionné par une électrophorèse sur gel de SDS polyacryla- mide d'une maniere classique, suivie d'un"buvardage" sur une membrane de nylon ou sur une membrane de nitrocellulose. Le peptide transféré sur la membrane est lié au Mb,
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qui est ensuite lie à la protéine A marquée avec du S ou 125 du I.
Dans ce cas, un exces de Mb et de proteine A est éliminé à chaque fois par un lavage soigne-
En operant ainsi, du S ou du 1 est theorique- ment présent en proportion de la quantité de Mb ci la position du peptide, en correspondance avec la spécificité du Mb uti- lisé . Le 35S ou le l present sur la membrane est detec- té au moyen d'un détecteur radio-immunologique (RI scanner) ou par autoradiographie, grâce à quoi on peut effectuer l'identification et la détermination quantitatives du peptide.
On décrira ensuite ci-dessous une technique pour
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l'identification du peptide, caractériséeen ce qu'on utilise un moyen de RIP (radio-immunoprecipitation).
Dans la RIP, un échantillon de cellule est culti-
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Ve dans une solution de culture contenant de la méthionine marquee par exemple par du S, etc., incorporant ainsi le traceur dans l'échantillon de cellule. On y ajoute une solution tampon pour la solubilisation et on recueille le lysat. On ajoute au lysat du Mb conforme à la présente invention. En mélangeant, on réalise une réaction antigeneanticorps-
Puis, on ajoute de la manière classique une protéine A-Sepharose, etc. Par des centrifugations et des lavages au tampon répétés, les impuretés autres que le peptide conforme à la présente invention sont élimainées. On effectue ensuite l'électrophorèse d'une manière classique pour détecter le radio-isotope.
Dons le cas où le peptide est présent dans les cellules de l'échantillon, des bandes correspondant à la spécificité du Mb utilisé apparaissent.
On expliquera ensuite ci-dessous une technique pour détecter les peptides dans un organisme vivant, caractériséeen ce qu'on utilise l'immunocytochimie.
Dans le cas de cellules cultivées, les cellules sont immobilisées avec une solution de fixage appropriée, telle qu'une solution formaldehyde-serum physiologique tamponne au phosphate (PBS), etc., apres quoi on effectue un traitement par le Triton pour fournir des échantillons. Du Mb conforme à la présente invention est ajouté à ces échantillons pour achever une réaction antigène anticorps, après quoi on lave soigneusement avec un tampon phosphate. Après avoir fait réagir de l'anti-immuno- globuline liée à la biotine comme anticorps secondaire, on effectue un lavage soigné. De l'avidine marquée par fluorescence est mise à réagir avec le complexe peptideMb-anticorps secondaire lié a la biotine.
Sa fluorescence
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est observée au moyen d'un microscope à fluorescence pour détecter le peptide dans des cellules.
Dans le cas d'un tissu pathologique, le tissu est fixé avec du formol ou une autre solution de fixa- tion appropriée, pour faire une tranche, ou bien une tranche lyophilisee est ensuite fixée avec du formaldehyde, etc., si nécessaire, traitée ensuite par un agent tensio-actif ; le tissu ainsi obtenu est utilise comme échantillon.
L'échantillon est traité d'une manière similaire pour ef- fectuer l'immunocytochimie.
Conformément à la présente invention, il est possible d'obtenir un Mb capable de reconnaitre spécifiquement le domaine N-terminal de chaque protéine de la famille 36K. En appliquant des techniques immunobiochimiques telles que le "western blotting", l'immunocytochimie, etc., décrites en détail ci-dessus ,chacune des protéines appartenant à la famille 36K peut etre identifiée même si elle est présente à l'état de trace. Ceci signifie qu'on dispose désormais d'une méthode qui fait date pour établit la fonction de. chacune des protéines étudiées, leur rapport de présence dans chaque tissu, leur état de répartition (traitement,phosphorylation),etc.
Encutre, ce Mb est capable de reconnaitre specifiquement le domaine N-terminal de chacune des protéines de la famille 36K et il est par conséquent possible d'incorporer le système d'inhibition de la phosphorylation, du sucre, de la modification des lipides, de la liaison à la protéine lOK dans la Calpactine 1, etc. couplé. à un anticorps approprié. Par conséquent. ces phénomènes peuvent etre des matières utiles pour étudier la façon dont ces phénomènes participent à l'expression de la fonction de chaque protéine de la famille 36K.
Il résulte de ce qui précède que le Mb de la présente invention est utile pour la clarification du mécanisme de transfert de l'information in vivo dans des maladies
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telles que transformation, maladies immunes, inflammation, etc. et est considéré comme essentiel pour établir le traitement de ces maladies.
(EXEMPLES)
L'invention sera décrite ci-après de manière plus détaillée en se référant aux exemples ci-dessous, mais ces exemples sont destinés simplement à illustrer les modes de réalisation de la présente invention qui ne doit pas être considereecomme limitéeà ceux-ci.
EXEMPLE 1
Préparation du Mb pour le domaine N-terminal de la
Calpactine 1 (1) Préparation de l'antigene
Dans la séquence d'aminoacidesattendue à partir de la séquence de gènes, 28 aminoacides depuis le premier (méthionine))jusqu'. au 28ème tLysine) ont été préparés par synthèse chimique d'une manière classique.
Une solution de 10 mg de ce peptide dans 2 ml d'eau distillée purifiée a été mélangés avec 4 mg/ml de solution de sérumalbumine de bovin (Fraction V fabriquée par la société Sigma Inc. ) et un carbodiimide soluble dans l'eau (fabrique par la Protein Study Promotion Association) a été ajoute au mélange comme agent de couplage, à une concentration finale de 0,2 M.
Tout en maintenant le pH à 6, 0, on a effectué la réaction de couplage pendant 30 minutes à une heure jusqu'à ce qu'on n'observe plus de modification du pH. Puis on a effectué une dialyse à 40C avec du PBS (-) et on a éliminé les matières n'ayant pas réagi à travers une colonne de filtration sur gel. On a obtenu ainsi 12 mg de complexe peptide-sérumalbumine de bovin.
La sequence d'aminoacides (28 aminoacides du premier au 28ème) correspondant au domaine N-terminal de la Calpactine 1 est connue et est la suivante :
Met-Ser-Thr-Val-His-Glu-Ile-Leu-Cys-Lys-Leu-Ser-
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Leu-Glu-Gly-Asp-His-Ser-Thr-Pro-Pro-Ser-Ala-Tyr-Gly-Ser-Val- Lys.
(2) Production de cellules immunisées
Un mélange de 0, 1 ml d'une solution oontenant 100 pg de la substance obtenue en (1) et 0, 1 ml d'adjuvant complet de Freund (fabriqué par la société DIFCO, Ltd. ) a été administré par voie intraperitoneale à des souris femelles BALB/c âgées de 10 semaines. Puis, un melange en solution de : la solution décrite ci-dessus et d'adjuvant incomplet (fabriqué par DIFCO, Ltd.) a été administre deux fois par voie intraperitoneale à 2 semaines d'intervalle. La souris a ensuite été sacrifiée par dislocation cervicale et la rate a été prélevée aseptiquement.
Sur un selecteur (fabriqué par la société BELCO, Ltd.), on a placé environ 1 g de la rate décrite ci-des-
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sus et on l'a fait passer a travers untamis d'environ 10 u tout en apportant du milieu MEM (D-MEM) modifié de Dulbecco, ce qui donne des cellules de rate a l'état de suspension dans le D-MEM. La suspension a été centrifugée à 100G pendant 5 minutes pour recueillir les cellules de rate.
Les cellules décrites ci-dessus ont été ajoutées à 1 ml d'une solution obtenue en ajoutant du tampon HEPES
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20 mM (pH 7, 4) à 0, 84 % de la solution de chlorure d'ammo- nium pour provoquer une hémolyse. Les cellules ont été obtenues par centrifugation sous 1 OOOG pendant 5 minutes.
Les cellules ont été remises en suspension dans du D-MEM.
(3) Production de cellules de myélome
On cultive une souche SP2/0-Ag14 de la lignée cellulaire de myélome de souris du type résistant à la 8-azaguanine et ne secrétant pas d'immunoglobuline dans un milieu D-MEM contenant 20 % de sérum de foetus de
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bovin (FCS) dans un incubateur à 370C sous C02 à 10 X.
On recueille les cellules dans la phase de croissance
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exponentielle et on les utilise pour l'Operation suivante.
Par centrifugation à 1 OOOG pendant 5 minutes, on recueille seulement les cellules et on les remet en suspension dans du milieu D-MEM. On compte les cellules avec un hemacytometre. Après une nouvelle centrifugation à 1000G pendant 5 minutes, on remet les cellules en suspension dans du milieu D-MEM.
(4) Fusion cellulaire
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0 On melange le milieu D-MEM contenant 10 à 3 x 0 108 cellules, obtenues en (2) avec le milieu D-MEM conQ tenant 108 cellules de myélome obtenue en (3). Après homogénéisation, on centrifuge le melange sous 1 OOOG pendant 5 minutes. On élimine le liquide surnageant, on recueil-
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le leprecipité et on ajoute goutte a goutte 1 ml d'une solu- tion contenant 25 % (P/V) de po1yéthylèneglycol 1500 (PEG 1500, fabriqué par la société Boehringer, Ltd. ) et 37, 5 mM de HEPES sur une durée d'une minute. Puis on dilue progressivement le mélange avec du milieu D-MEM pour amener
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le touta 10 ml.
On y ajoute 10 ml de milieu D-MEM contenant 20 % de FCS, après quoi on centrifuge à 1 OOOG pendant 5 minutes. On ajoute aux cellules obtenues du D-MEM contenant 20 % de FCS dans 10 cellules/ml. On répartit le melange dans une plaque de culture à 24 réservoirs, fabriquée par la société Corning Glass Inc., à raison de 1 ml par réservoir après quoi on les cultive à 37 C pendant 24 heures sous C02 à 10 % dans un incubateur.
Puis on ajoute une solution de HAT pour éliminer les cellules autres que les cellules ayant fusionné. On continue l'incubation pendant 2 semaines supplémentaires .
(5) Mesure du titre en anticorps par ELISA
Chacun des réservoirs de la plaque de microtitrage (NO 001-010-2101 fabriquée par la soucié té Dinatec Laboratories, Ltd.) est revetu de 1 pg/ml du peptide
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obtenu en (1). Le liquide surnageant, 150 wi, contenant l'anticorps comme substance à analyser, est place dans le réservoir, on le laisse séjourner à 370C pendant 2 heures dans l'incubateur, puis on le lave avec du PBS (tampon phosphate-solution saline). On y ajoute un anticorps anti-souris de chèvre complet lié à de la peroxydase et on le laisse séjourner à 370C pendant une heure dans l'incubateur.
Après lavage avec du PBS, on ajoute un colorant (ABTS), pour former une couleur pendant 15 minutes. On ajoute une solution d'arret (citrate 0, 1 Mazide de sodium 0, 02 %) pour arreter la réaction. Puis on mesure l'absorbance du reservoir avec un multiscanner fabriqué par la société Titertec, Ltd.
(6) Choix des cellules produisant l'anticorps
Les cellules présentes dans le réservoir qui ont été confirmées par ELISA sont inoculées sur du milieu à la gélose molle dans une boite de Pétri de 60 mm de
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diamètre. L'incubation est effectuée à 37 C, sous C02 2 à 10 % pendant 2 semaines dans un incubateur pour former une colonie.
La colonie formé est prélevée et placée dans une plaque de culture à 24 reservoirs. L'activité de l'anticorps est a nouveau confirmeepar ELISA. Les cellules présentes dans le réservoir qui ont été confirmées par l'activité d'anticorps sont inoculées sur un milieu à la gélose molle dans une bolte de Pétri de 60 mm de diamè-
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tre. L'incubation est effectuée à 370C sous CO2 à 10 % pendant 2 semaines dans un incubateur pour former une colonie. La colonie formée est retirée et placée sur une plaque de culture a 24 reservoirs. L'activité d'. anticorps est à nouveau confirmée par ELISA pour choisir des cellules utilisables.
(7) Collection de l'anticorps (l) Les cellules produisant de l'anticorps obtenues en (6) sont capables de produire toujours l'anticorps de la
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présente invention. En conséquence, le liquide surnageant de la solution de culture dans laquelle les cellules produisant de l'anticorps ont été cultivées peut être utilise directement comme solution de l'anticorps de la présente invention.
(2) Du sulfate d'ammonium est ajouté à la solution de culture des cellules produisant de l'anticorps obtenues en (6) à une concentration finale de 30 %. Après centrifugation, le précipité est recueilli et on leur ajoute 20 mM de tampon phosphate présentant un pH de 7,4. Une dialyse est effectuée en utilisant le meme tampon phosphate (contenant 0, 02 % d'azide de sodium) pour éliminer le sulfate d'ammonium. Après dialyse, la solution est lyophilisée pour donner une poudre blanche.
(3) Du Pristane, 0, 5 mg, est injecté par voie intraperitoneale a des souris mâles BALB/C et les souris sont élevées pendant 2 semaines. Les cellules produisant de l'anticorps obtenues en (6) sont injectées à la souris à raison de 106 à 3 x 106 cellules/souris après quoi on les élève pendant 10 jours. On recueille au moyen d'une seringue environ 10 ml des ascites présentes dans la cavité péritonéale.
Du sulfate d'ammonium est ajoute aux ascites à une concentration finale de 30 %. Puis on leur ajoute 20 mM d'un tampon phosphate présentant un pH de 7,4.
Une dialyse est effectuée en utilisant le meme tampon phosphate (contenant 0, 02 % d'azide de sodium) pour heli- miner le sulfate d'ammonium. Après dialyse, la solution est lyophilisée pour donner une poudre blanche.
(8) Identification de chaque classe d'immunoglobuline
L'identification de chaque classe d'immunoglobuline est effectuée de la manière suivante. Des anticorps spécifiques des classes (comme IgA, IgCl, IgG2a, IgG2b, IgG3 et IgM, on a utilise ceux fabriqués par la société Biorad Ltd. ), sont ajoutés, après quoi on fait réagir
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à 370C pendant 2 heures. Puis on lave soigneusement le système avec du PBS. On y ajoute de l'anticorps complet anti-souris de chèvre lié à de la peroxydase. On laisse reposer le mélange à 370C pendant une heure dans un incubateur. Après lavage avec du PBS, on ajoute un colorant (ABTS) pour former une coloration pendant 15 minutes, grâ- ce à quoi on identifie chacune des classes.
Les resultats sont donnés en partie dans le Tableau 1.
TABLEAU 1
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<tb>
<tb> I <SEP> de <SEP> référence <SEP> Lignée <SEP> cellulaire <SEP> Sous-classe
<tb> 3, <SEP> 10H <SEP> G2b
<tb> 2 <SEP> 3, <SEP> 11A <SEP> G2b
<tb> 3 <SEP> 4,5 <SEP> E <SEP> G2a
<tb> 4 <SEP> 4,7 <SEP> G <SEP> G2b
<tb> 5 <SEP> 4, <SEP> 9 <SEP> H <SEP> G2b
<tb> 6 <SEP> 5,2 <SEP> A <SEP> G2a
<tb> 7 <SEP> 5,2 <SEP> C <SEP> G2b
<tb> 8 <SEP> 5, <SEP> 10E <SEP> G2b
<tb> 9 <SEP> 6, <SEP> 4 <SEP> C <SEP> G2b
<tb> 10 <SEP> 6,7 <SEP> C <SEP> G3
<tb> 11 <SEP> 6,9 <SEP> F <SEP> GI
<tb> 12 <SEP> 9, <SEP> 2 <SEP> E <SEP> G2b
<tb> 13 <SEP> 10, <SEP> 9 <SEP> B <SEP> G3
<tb> 14 <SEP> 10, <SEP> 11A <SEP> G2b
<tb> 15 <SEP> 11, <SEP> 2 <SEP> F <SEP> G2b
<tb>
EXEMPLE 2 Préparation du Mb pour le domaine N-terminal de la Calpactine 2
La séquence d'aminoacides (23 aminoacides du 13ème au 35ème)
correspondant au domaine N-terminal de la Calpactine 2 était connue et elle est la suivante.
EMI17.2
Phe-Ile-Glu-Asn-Glu-Glu-Gln-Glu-Tyr-Val-Gln-ThrVal-Lys-Ser-Ser-Lys-Gly-Gly-Pro-Gly-Ser-Ala.
Un peptide dont la séquence d'aminoacidesétait
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composée des 23 aminoacides a été obtenu par synthèse chimique.
On a ensuite opéré d'une manière similaire l'Exemple 1 pour obtenir le Mb recherché.
L'identification de chaque classe d'immunoglobuine a été effectuee d'une manière similaire à l'Exemple 1 pour donner les résultats donnes dans le Tableau 2.
TABLEAU 2
EMI18.1
<tb>
<tb> N <SEP> de <SEP> référence <SEP> Lignée <SEP> cellulaire <SEP> Sous-classe
<tb> I
<tb> 1 <SEP> 1, <SEP> 5 <SEP> A <SEP> G2b
<tb> 2 <SEP> 2,5 <SEP> C <SEP> Gl
<tb> 3 <SEP> 2, <SEP> lOD <SEP> G2a
<tb> 4 <SEP> 5,3 <SEP> B <SEP> G2a
<tb> 5 <SEP> 5, <SEP> 5 <SEP> E <SEP> G3
<tb> 6 <SEP> 5,8 <SEP> A <SEP> G2b
<tb> 7 <SEP> 7, <SEP> 1 <SEP> B <SEP> Gl
<tb> 8 <SEP> 7,5 <SEP> D <SEP> G2a
<tb> 9 <SEP> 10, <SEP> 5 <SEP> A <SEP> G2b
<tb> 10 <SEP> 10,10A <SEP> M
<tb>
EXEMPLE 3 Production de Mb pour le domaine N-terminal de l'IBC
La séquence d'aminoacides (22 aminoacides du premier au 22ème) correspondant au domaine N-terminal de l'IBC était connue et elle est la suivante :
Met-Ala-Gln-Val-Leu-Arg-Gly-Thr-Val-Thr-Asp-Phe- Pro-Gly-Phe-Asp-Glu-Arg-Ala-Asp-Ala-Glu
Un peptide ayant une séquence d'aminoacidescomposée des 22 aminoacides a été obtenu par synthèse chimique.
On a ensuite opéré d'une manière similaire à l'Exemple 1 pour obtenir le Mb recherché.
L'identification de chaque classe d'immunoglobu- line a été effectuée d'une manière similaire à l'Exemple 1, pour donner les résultats figurant dans le Tableau 3.
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EMI19.1
TABLEAU 3
EMI19.2
<tb>
<tb> N <SEP> de <SEP> référence <SEP> Lignée <SEP> cellulaire <SEP> Sous-classe
<tb> 1 <SEP> 1,4 <SEP> B <SEP> G3
<tb> 2 <SEP> 2,2 <SEP> B <SEP> G2a
<tb> 3 <SEP> 2,50A <SEP> G2a
<tb> 4 <SEP> 5,2 <SEP> B <SEP> G2b
<tb> 5 <SEP> 5, <SEP> 5 <SEP> D <SEP> G2a
<tb> 6 <SEP> 5,7 <SEP> A <SEP> G2a
<tb> 7 <SEP> 6, <SEP> 1 <SEP> B <SEP> G2b
<tb> 8 <SEP> 7,8 <SEP> D <SEP> G3
<tb> 9 <SEP> 11,5 <SEP> A <SEP> G2a
<tb> 10 <SEP> 12, <SEP> 30B <SEP> G2a
<tb>
La présente invention n'est pas limitée aux exemples de réalisation qui viennent d'être décrits,
elle est au contraire susceptible de modifications et de variantes qui apparaitront à l'homme de l'art.