FR2560213A1 - Procede de production de la s-adenosyl-l-homocysteine - Google Patents

Abstract

PROCEDE DE PRODUCTION DE LA S-ADENOSYL-L-HOMOCYSTEINE DANS LEQUEL ON MET DE L'ADENOSINE EN CONTACT AVEC LA D-HOMOCYSTEINE DANS UN MILIEU AQUEUX EN PRESENCE DE CELLULES, TRAITEES OU NON TRAITEES, D'UN MICROORGANISME DU GENRE PSEUDOMONAS AYANT LA CAPACITE DE RACEMISER LA D-HOMOCYSTEINE EN DL-HOMOCYSTEINE, ET EN PRESENCE DE S-ADENOSYL-L-HOMOCYSTEINE HYDROLASE, CE QUI SYNTHETISE LA S-ADENOSYL-L-HOMOCYSTEINE, PUIS ON RECUEILLE CETTE SUBSTANCE.

Description

La présente invention concerne un procédé

de synthèse enzymatique efficace de la S-adénosyl-L-homo-

cystéine à partir d'adénosine et d'homocystéine avec des cellules, traitées ou non traitées, d'un microorganisme comme source d'enzyme, et de récupération du produit ainsi formé. La S-adénosyl-L-homocystéine (qui sera désignée ci-après par l'abréviation SAH) est une substance douée d'activité biologique importante qui se forme in vivo par une réaction de donation d'un groupe méthyle à laquelle

participe la S-adénosyl-méthionine (ci-après SAM par abré-

viation), et il a été récemment trouvé que la SAH était efficace comme sédatif et somnifère, ce qui fait souhaiter

sa production à une grande échelle.

Les méthodes courantes de production de la

SAH comprennent par exemple une extraction à partir de le-

vures du genre Saccharomyces ou Candida (voir par exemple

Arch. Biochem. Biophys., 69, 575 (1962)], une déméthy-

lation enzymatique de la SAM (voir par exemple J. Biol.

Chem., 240, 2112 (1965) Y, et une déméthylation chimique de la SAM (voir par exemple le brevet US n 3 642 772), mais ces méthodes très coûteuses ne sont pas possibles

à une échelle industrielle.

On connaît également une méthode de syn-

tlhêse enzymatique de la SAH à partir d'adénosine et d'ho-

mocystéine en présence de S-adénosyl-L-homocystéine hydro-

lase (EC 3.3.1.1; en abréviation SAHase), mais on sait cependant que seule la L-homocystéine peut être employée dans cette méthode dans laquelle la D-homocystéine ne réagit pas úvoir par exemple J. Bacteriology, 112, 569

(1972)7.

Etant donné ce qui précède, la présente demanderesse a entrepris des recherches étendues sur la synthèse enzymatique de la SAH, et elle a ainsi trouvé que cette substance peut être efficacement synthétisée à partir de la D-homocystêine si l'on emploi, conjointement avec la

SAHase, un microorganisme spécifique.

Cette invention apporte ainsi un procédé de production de la S-adénosyl-Lhomocystéine dans lequel on met l'adénosine en contact avec la Dhomocystéine dans un milieu aqueux en présence de cellules traitées ou non traitées d'un microorganisme du genre Pseudomonas ayant

la capacité de racémiser la D-homocystéine en DL-homocys-

téine, et en présence de S-adénosyl-L-homocystéine hydro-

lase, puis on recueille la S-adénosyl-L-homocystéine ainsi synthétisée.

Le microorganisme qui racémise la D-homo-

cystéine en DL-homocystéine peut être un microorganisme du genre Pseudomonas, qui, sous forme de cellules, traitées

ou non traitées, racémise la D-homocystéine en DL-homocys-

téine mais ne peut racémiser la SAH en S-adénosyl-DL-homo-

cystéine. Des exemples particuliers de tels microorganis-

mes comprennent Pseudomonas putida (IFO 12996 et IFO 3738),

Pseudomonas aeruginosa (IFO 3445), et Pseudomonas malto-

philia (IFO 12020), et on peut également employer ici des mutants naturels ou artificiels de ces microorganismes

s'ils ont les propriétés que l'on a indiquées.

La méthode selon cette invention de syn-

thèse de la SAH met à profit l'action d'une enzyme capable de racémiser la D-homocystéine en DL-homocystéine (enzyme désignée par l'abréviation racémase), et qui se trouve dans les cellules, traitées ou non, du microorganisme. On peut préparer cette racémase en cultivant le microorganisme

par une méthode courante, dans un milieu de culture ordi-

naire contenant des sources de carbone et d'azote, des sels minéraux et de petites quantités de sources de substances

nutritives organiques, suivant le type du microorganisme.

Cette culture se fait généralement dans un milieu liquide mais elle peut aussi se faire sur une surface solide. Les conditions de la culture peuvent être convenablement choisies d'après le type du microorganisme, les températures pouvant être de 15 à 80 C et le pH de 4 à 12, mais en général on cultive à une température de 20 à 45 C et à un pH de 4 à 9

pendant une durée de 10 à 96 heures. On peut activer la-

multiplication du microorganisme en aérant et en agitant

le milieu au cours de la culture.

La SAHase qui est employée selon cette

invention peut être de toute origine si elle possède l'ac-

tivité enzymatique nécessaire à la synthèse de la SAH à partir d'adénosine et de L-homocystéine, et on peut par exemple convenablement choisir des hydrolases d'origine animale ou végétale ou provenant de microorganismes. Mais

pour une pratique industrielle il est très avantageux d'u-

tiliser la SAHase sous la forme de cellules, traitées ou

non traitées, contenant cette enzyme.

Des exemples particuliers de microorganismes

contenant la SAHase sont ceux des genres Alcaligenes, Saccha-

romyces, Gibberella, Micropolyspora, Shizophyllum, etc..., et on peut prendre plus spécialement tous les microorganismes qui sont décrits dans la demande de brevet US no 578 769 ou dans la demande de brevet français n 8 401 990 qui ont

été antérieurement déposées par la présente demanderesse.

Ces microorganismes peuvent être cultivés dans des milieux

ordinaires, dans les conditions de culture courantes.

La réaction de synthèse de la SAH selon la présente invention est effectuée en présence conjointe de

SAHase et des cellules traitées ou non traitées du micro-

organisme que l'on cultive comme il a été dit plus haut et qui contiennent la racémase. Par exemple, un simple mélange du bouillon de culture contenant les cellules qui ont la racémase, avec le bouillon de culture contenant les cellules qui ont la SAHase, entraîne la réaction de synthèse de la SAH. Toutefois, si les composants des bouillons de culture sont nuisibles ou bien si l'on souhaite employer de grandes

quantités des cellules, il sera préférable de séparer celles-

ci du bouillon de culture et de les utiliser sous la forme de cellules quiescentes. Pour des raisons de commnodité de conservation ou de manipulation on peut prendre, au lieu des cellules vivantes, des cellules sèches, par exemple qui ont été séchées à l'air ou lyophilisées, ou des cellules qui ont été traitées à l'acétone, ou encore des cellules traitées, par exemple broyées, ou des extraits sans cellules. Ces cellules ou cellules traitées peuvent être employées à

l'état immobilisé.

La réaction de synthèse de la SAH selon cette invention se fait par mise en contact de l'adénosine avec la D-homoaystéine en présence des cellules traitées ou non contenant la racémase, et en présence de SAHase,

dans un milieu aqueux. Il n'est pas nécessaire que la D-

homocystéine soit tout à fait pure, et l'on peut prendre aussi un mélange de la forme D avec la forme L, par exemple la forme DL. L'utilisation d'homocystéine sous la forme DL que l'on peut obtenir à un faible coût par synthèse chimique est très avantageuse dans l'industrie du fait que dans le système réactionnel la L-homocystéine est transformée en SAH par l'action de la SAHase, tandis que la D-homocystéine est ensuite racémisée en DL-homocystéine, et ainsi toute

la DL-homocystéine peut être transformée en SAH.

On peut convenablement choisir les condi-

tions de la réaction. Par exenple, la concentration de l'adénosine peut être d'au moins 1 mM, de préférence de 10 à 500 mM, et celle de la Dhomocystéine également d'au moins

1 mM, de préférence de 10 à 500 mM.

Il est à noter que dans la présente inven-

tion, le terme "homocystéine" comprend aussi des substances qui donnent l'homocystéine dans le système réactionnel,

comme l'homocystine et l'homocystéine-thiolactone.

Le pH du milieu réactionnel peut être de 4 à 12, de préférence de 6 à 10, l'ajustement du pH pouvant se faire de la manière courante, par exemple avec un tampon de phosphate de potassium, un tampon-de Tris, un tampon de

chlorure d'ammonium ou un tampon de glycocolle.

La température de réaction peut être toute température à laquelle la réaction se fait bien et qui n'affecte pas l'activité enzymatique ni les substrats et le produit formé. Cette température est ordinairement de à 60 C, de préférence de 20 à 50 C. Le temps de réaction doit être suffisant pour avoir un haut degré de conversion des substrats en SAH, et dans le procédé discontinu, ce temps est ordinairement de 0,1 à 48 heures, de préférence de 0,5 à 36 heures. Suivant les nécessités on peut ajouter au milieu aqueux des solvants organiques comme l'acétone et l'éthanol, ainsi que divers agents surfactifs, et l'on peut également ajouter un réactif pour protéger le groupe SH, par exemple le 2-mercaptoéthanol ou le dithiothréitol,

afin d'éviter que l'homocystéine se transforme en homocys-

tine. La réaction peut aussi être effectuée dans une at-

mosphère d'azote.

La SAH formée peut être récupérée du mélange réactionnel par les méthodes connues. On peut par exemple la séparer en mettant sa solution en contact avec une résine échangeuse de cations du type acide fort pour adsorber la SAH, puis en éluant la résine avec de l'acide sulfurique et en ajoutant de l'acide phosphotungstique à l'éluat pour

précipiter la SAH; ou bien on peut mettre la solution con-

tenant la SAH en contact avec du charbon actif pour l'ad-

sorber, puis on élue le charbon actif avec un mélange :50:1 d'éthanol, d'eau et d'ammoniac aqueux concentré, on concentre l'éluat sous pression réduite, on ajuste ensuite le pH du concentré à 7 avec l'acide acétique et

enfin on cristallise la SAH à O C.

Les exemples qui suivent illustrent plus particulièrement la présente invention, mais dont ilsne

limitent aucunement la portée.

Dans ces exemples la SAH est dosée quantita-

tivement par la méthode suivante.

Dès la fin de la réaction on refroidit le

mélange entre O et 5 C, on lui ajoute de l'acide perchlo-

rique pour arrêter la réaction et on sépare par centrifu-

gation les matières insolubles. On ajoute au liquide sur-

nageant un tampon de phosphate de potassium à pH 7,0, on élimine par centrifugation le perchlorate de potassium

formé, et on prélèveune quantité déterminée du liquide sur-

nageant dans lequel on dose la quantité de SAH qu'il con-

tient par chromatographie en phase liquide à haute effica-

cité (appareil modèle 638-30 de Hitachi Limited; colonne

de Cosmocil 5C18; détecteur UV à 260 nm).

EXEMPLE 1

On cultive pendant 24 heures à 28 C le contenu d'un oeillet de platine de Pseudomonas putida IFO 12996 ou Alcaligenes faecalis IFO 12669 dans un milieu de gélose incliné à- pH 7,0 formé de 1 g/dl de glucose, 1,5 g/dl de peptone, 0,3 g/dl d'extrait de levure, 0,3 g/dl de K2HPO4, 0,2 g/dl de NaCl, 0,02 g/dl de MgS04.7H20 et 2 g/dl

de gélose, qu'on inocule à 500 ml d'un milieu liquide sté-

rilisé à la chaleur et ajusté à pH 7,0, formé de 1 g/dl de glucose, 15 g/dl de peptone, 0,3 g/dl d'extrait de levure,

0,3 g/dl de K2HPO4, 0,2 g/dl de NaCl et 0,02 g/dl de MgSO4.

7H20, et on cultive en secouant à 28 C pendant 40 heures.

On sépare ensuite les cellules par centrifugation, on les lave avec un tampon de phosphate de potassium O,1M à pH 8,0

et on centrifuge de nouveau pour obtenir les cellu]oe humides.

On met ensuite ces cellules humides, de Pseudomonas putida IFO 12996 ou d'Alcaligenes faecalis IFO 12669, dans les proportions qui sont indiquées au tableau 1 ci-après, en suspension dans 1 ml d'une solution de substrat formée de mM d'adénosine, 10 mM de D-homocystéine et 100 mM de tampon de phosphate de potassium à pH 8,0, et on secoue le mélange à 30 C pendant 2 heures pour faire réagir ces

composants. Les résultats obtenus sont donnés au tableau 1.

TABLEAU 1

Essai Poids des cellules humides( Quantité no - de SAH Pseudomonas Alcaligenes obtenue putida faecalis (pimole/ml)

IFO 12996 IFO 12669

1-1 10 300 3,01

1-2 30 270 6,53

1-3 50 250 7,08

EXEMPLE 2

On met 50 mg de cellules humides de chacun

des microorganismes du genre Pseudomonas du tableau 2 ci-

après, cellules qui ont été obtenues de la même manière que dans l'exemple 1 précédent, avec 250 mg de cellules humides d'Alcaligenes faecalis IFO 12669, en suspension

dans 1 ml d'une solution de substrat formée de 10 mM d'a-

dénosine, 10 mM de D-homocystéine et 100 mM de tampon au phosphate de potassium à pH 8,0, et on secoue le mélange

à 30 C pendant 2 heures pour faire réagir ces composants.

Les résultats obtenus sont donnés au tableau 2.

TABLEAU 2

Essai Microorganisme Quantité n de SAH obtenue (I m01 eg/ml) Pseudomonas 2-1 maltophilia 0,93

IFO 12020

Pseudomonas 2-2 putida 1,87

IFO 3738

Pseudomonas 2-3 aeruqinosa 2,40

IFO 3445

EXEMPLE 3

On cultive à 28 C pendant 48 heures le con-

tenu d'un oeillet de platine de Saccharomyces cerevisiae IFO 1805 dans un milieu de gélose incliné à pH 6,0, formé

de 5 g/dl de glucose, 0,5 g/dl de peptone, 0,1 g/dl d'ex-

trait de levure, 0,2 g/dl de KH2PO4, 0,1 g/dl de K2HPO4, 0,02 g de MgSO4. 7H20 et 2 g/dl de gélose, que l'on inocule à 500 ml d'un milieu liquide stérilisé a la chaleur et ajusté à pH 6,5, formé de 5 g/dl de glucose, 0, 5 g/dl de peptone, 0,1 g/dl d'extrait de levure, 0,2 g/dl de KH2PO4, 0,1 g/dl de K2HPO4 et 0,02 g/dl de MgSO4.7H20, et on cultive en secouant pendant 40 heures à 280C. On sépare ensuite les

cellules par centrifugation, on les lave avec un tampon de -

phosphate de potassium 0,1M à pH 8,0 et on centrifuge de nouveau pour obtenir les cellules humides. On met ensuite 300 mg des cellules humides, avec 50 mg de cellules humides de Pseudomonas putida IFO 12996 qui ont été obtenues comme dans

l'exemple 1 précédent, en suspension dans 1 ml d'une solu-

tion de substrat formée de 10 mM d'adénosine, 10 mM de D-homocystéine et 100 mM de tampon au phosphate de potassium à pH 8,0, et on secoue le mélange à 37 C pendant 4 heures pour faire réagir les composants, ce qui forme la SAH à

une concentration de 2,11 pmoles/ml.

Si l'on procède à la réaction ci-dessus sans les cellules humides de Pseudomonas putida IFO 129906,

on n'observe aucune formation de SAH.

EXEMPLE 4

On effectue la même réaction que dans l'exemple 3 mais avec l'organisme Gibberella fujikuroi IFO 6605, et on recueille par filtration les cellules formées. On obtient ainsi 3,06 pmoles/ml de SAH. A titre comparatif, si l'on répète le procédé ci-dessus sans les cellules humides de Pseudomonas putida IFO 12996, il ne se

forme pas de SAH.

EXEMPLE 5

On cultive à 28 C pendant 48 heures un oeillet de platine de Micropolyspora angiospora IFO 13155 dans un milieu d'agar incliné à pH 7, 2, formé de 0,2 g/dl d'extrait de levure, 1 g/dl d'amidon soluble et 2 g/dl de

gélose, qu'on inocule à 500 ml d'un milieu liquide stéri-

lisé à la chaleur et ajusté à pH 7,1, formé de 1 g/dl de peptone, 0,5 g/dl d'extrait de viande, 0,1 g/dl d'extrait de levure et 0,5 g/dl de NaCl, et on cultive en secouant à 28 C pendant 48 heures. Avec les cellules humides ainsi obtenues on opère la même réaction que dans l'exemple 3,

ce qui donne 1,78.mole /ml de SAH.

Si l'on répète le procédé ci-dessus sans les cellules humides de Pseudomonas putida IFO 12996, il ne

se forme pas de SAH.

EXEMPLE 6

On cultive à 28 C pendant 96 heures un oeillet de platine de Shizophyllum commune IFO 6504 dans un milieu de gélose incliné à pH 5,0, formé de 2 g/dl de glucose, 0,3 g/dl d'extrait de levure, 0,3 g/dl de peptone, 0,1 g/dl de XH2P04, 0,05 g/dl de MgSO4.7H20 et 2 g/dl de

gélose, qu'on inocule à 500- ml d'un milieu liquide stêri-

lisé à chaud et ajusté à pH 5,0, formé de 2 g/dl de glucose, 0,3 g/dl d'extrait de levure, 0,3 g/dl de peptone, 0,1 g/dl de KH2PO4 et 0,05 g/dl de MgSO4.7H20, et on cultive à 280C

pendant 90 heures en secouant, puis on recueille par filtra-

tion les cellules formées. Avec les cellules humides ainsi obtenues on procède à la même réaction que dans l'exemple 3,

ce qui donne 0,49 Vmole/ml de SAH.

Si l'on répète la réaction ci-dessus sans les cellules humides Pseudomonas putida IFO 12996, il ne se

forme pas de SAH.

EXEMPLE 7

On sèche à la température ordinaire pendant environ 15 heures, tout en faisant passer un courant d'air, les deux sortes de cellules humides qui ont été obtenues par la méthode de l'exemple 1, et on poursuit leur séchage dans un desiLcateur à vide sur du pentoxyde de phosphore, pendant 1 journée à 5 C. On broie ensuite les cellules séchées dans un mortier pour en former une poudre, que

l'on sèche de nouveau dans le dessicateur à vide pour obte-

nir des cellules séchées. On ajoute 5 mg des cellules sé-

chées de Pseudomonas putida IFO 12996 et 40 mg des cellules

séchées d'Alcaligenes faecalis IFO 12669 à 1 ml d'une solu-

tion de substrat contenant 10 mM d'adénosine, 10 mM de D-

homocystéine et 50 mM de tampon au phosphate de potassium à pH 8,0, et on secoue le mélange pendant 1 heure à 370C pour faire réagir les composants, ce qui donne 5,90 Vmoles/ml

de SAH.

- EXEMPLE 8

On ajoute 10 mg de cellules humides de Pseudomonas putida IFO 12996 qui ont été obtenues par la méthode de l'exemple 1 et 500 U (l'activité enzymatique pour former 1 picomole de SAH par heure à un pH de 7,0 et 1 1 à 37 C est définie comme étant de 1 U) de SAHase de lapin (produit de Sigma Co.) à 1 ml d'une solution de substrat formée de 1 mM d'adénosine, 1 mM de D-homocystéine et 100 mM d'un tampon au phosphate de potassium à pH 8,0, et on secoue le mélange à 37 C pendant 4 heures pour faire réagir

les composants, ce qui donne 0,031 pmole/ml de SAH.

Si l'on répète cette réaction en l'absence

des cellules humides de Pseudomonas putida IFO 12996, on n'ob-

serve aucune formation de SAH.

EXEMPLE 9

On ajoute 0,5 g de cellules humides de Pseudomonas putida IFO 12996 obtenues par la méthode de l'exemple 1 et 3 g de cellules humides d'Alcaligenes

faecalis IFO 12669 à 10 ml d'une solution de substrat for-

mée de 50 mM d'adénosine, 50 mM de D-homocystéine et 100 mM de tampon au phosphate de potassium à pH 8,0, et on fait réagir à 37 C pendant 10 heures dans une atmosphère d'azote,

ce qui forme 334 pmoles (128 mg) de SAH.

On ajoute ensuite, tout en refroidissant avec de la glace, 0,4 ml d'une solution aqueuse à 30 % d'acide perchlorique pour arrêter la réaction, on sépare

par centrifugation les matières insolubles telles que rési-

dus de cellules, on ajoute-une solution aqueuse-1M de KHCO3 au liquide surnageant pour ajuster son pH à 6,0 et on sépare

par centrifugation le précipité formé de perchlorate de po-

tassium. On fait ensuite passer le liquide surnageant sur une colonne (colonne type H +) d'une résine échangeuse de cations du type acide fort (Dowex 50x8), puis on lave la colonne avec une solution aqueuse à 0,025 % de thiodiglycol et de l'acide sulfurique binormal à 0,025 % de thiodiglycol,

et on recueille les fractions éluées avec de l'acide sulfu-

rique 6N à 0,025 % de thiodiglycol. On ajoute à ces frac-

tions une solution aqueuse à 20 % d'acide phosphotungstique, on sépare par centrifugation le précipité formé qu'on lave à l'eau froide puis que l'on dissout dans 5 fois son volume d'un mélange 50/50 en volumes d'acétone et d'eau. On extrait cette solution avec un mélange 1/1 en volumes d'alcool isoamylique et d'éther, on ajoute du carbonate de baryum

à la couche aqueuse pour ajuster son pH à 3,9 puis on sé-

pare le sulfate de baryum par filtration et en lyophilisant le liquide surnageant on obtient 74 mg d'une matière solide

blanche que l'on identifie comme étant la SAH par chromato-

graphie en couche mince sur gel de silice, chromatographie en phase liquide à haute efficacité, chromatographie sur

papier, spectroscopie infrarouge et mesure du pouvoir rota-

toire.

2 5 6 0 2 13

Claims (8)

REVENDICATIONS

1. Un procédé de production de la S-adéno-

syl-L-homocystéine dans lequel on met de l'adénosine en contact avec la Dhomocystéine dans un milieu aqueux en

présence de cellules, traitées ou non traitées, d'un micro-

organisme du genre Pseudomonas ayant la capacité de racé-

miser la D-homocystéine en DL-homocystéine, et en présence de S-adénosylL-homocystéine hydrolase, ce qui synthétise

la S-adénosyl-L-homocystéine, puis on recueille cette subs-

tance.

2. Procédé selon la revendication 1 dans lequel les cellules du microorganisme se trouvent dans le bouillon

de culture ou bien ce sont des cellules quiescentes ou des -

cellules sèches.

3. Procédé selon la revendication 1 dans lequel les cellules traitées sont des cellules broyées ou

bien on utilise un extrait sans cellules.

4. Procédé selon la revendication 1 dans lequel on emploie conime Sadénosyl-L-homocystéine hydrolase descellules traitées ou non d'un microorganisme contenant

cette enzyme.

5. Procédé selon la revendication 4 dans

lequel le microorganisme contenant la S-adénosyl-L-homo-

cystéine hydrolase est sous forme de cellules qui sont dans le bouillon de culture, ou bien de cellules quiescentes ou de

cellules sèches.

6. Procédé selon la revendication 4 dans lequel les cellules traitées du microorganisme contenant la S-adénosyl-L-homocystéine hydrolase sont des cellules

broyées ou bien on utilise un extrait sans cellules.

7. Procédé selon la revendication 4 dans

lequel le microorganisme contenant la S-adénosyl-L-homo-

cystéine hydrolase appartient au genre Alcaligenes, Saccha-

romyces, Gibberella, Micropolyspora ou Shizophyllum.

8. Procédé selon la revendication 1 dans le-

quel l'adénosine est mise en contact avec la D-homocystéine

à une température de 15 à 60 C pendant une durée de 0,1 à 48 heures.