FR2521133A1 - Nouvel heptadecapeptide a effet de liberation d'hormone de croissance et medicament le contenant - Google Patents

Abstract

LE NOUVEAU PEPTIDE SELON L'INVENTION EST UN HEPTADECAPEPTIDE REPONDANT A LA FORMULE: (CF DESSIN DANS BOPI) DANS LAQUELLE GLX EST GLU OU GLN, ET AYANT LES PROPRIETES PHYSIQUES SUIVANTES: 1SPECTRE D'ABSORPTION UV: L 280NM; 2REACTION DE EHRLICH, REACTION DE SAKAGUCHI ET REACTION DE PAULY: POSITIVES; 3CARACTERE BASIQUE; 4SOLUBLE DANS L'EAU, LE METHANOL ET L'ACIDE ACETIQUE, LEGEREMENT SOLUBLE DANS L'ACETATE D'ETHYLE, L'ACETATE DE BUTYLE, L'ETHER ETHYLIQUE, L'HEXANE, L'ETHER DE PETROLE, LE BENZENE ET LE CHLOROFORME; ET 5ETAT PHYSIQUE: POUDRE BLANCHE. IL POSSEDE UN EFFET SPECIFIQUE DE LIBERATION DE L'HORMONE DE CROISSANCE ET PAS DE SPECIFICITE A L'ESPECE. APPLICATIONS: EN MEDECINE HUMAINE POUR LA THERAPIE DU NANISME ET LA REPARATION DES BLESSURES, MAIS EGALEMENT EN MEDECINE VETERINAIRE POUR LA STIMULATION DE LA CROISSANCE DES ANIMAUX DOMESTIQUES.

Description

La présente invention concerne un nouveau peptide et ses sels ayant un

effet de libération d'hormone de croissance (ci-après dénommée "GH") et un agent hormonal contenant ledit peptide

comme ingrédient actif.

La GH est une des hormones hypophysaire capable de provoquer la croissance, ayant un effet direct ou indirect sur les cellules somatiques pour stimuler la synthèse globale des protéines dans un organisme animal et stimulant la libération des acides gras libres pour augmenter l'énergie disponible Bien que la GH ait été appliquée pour la thérapie du nanisme, on peut fortement s'attendre d'après l'effet de la GH ci-dessus mentionnée que la GH soit encore appliquée pour la réparation des blessures nécessitant l'activation

des cellules somatiques.

A la différence de l'insuline, cependant, la GH ayant des spécificités à l'espèce élevées ne peut pas être appliquée à l'organisme humain si elle est extraite de glandes hypophyses bovine ou porcine De plus, la GH humaine étant un polypeptide unique consistant en 191 aminoacides ayant un poids moléculaire élevé (environ 22 000) ne peut pas être synthétisée par une synthèse organique La GH a donc été extraite des glandes hypophyses de la même espèce d'animaux, mais on en est très à

court pour la thérapie du nanisme.

La GH ainsi que l'hormone thyréostimulante (ci-

après dénommée "TS-H'% l'hormone lutéinisante ou gonadostimuline

(ci-après dénommée "LH"), etc sont sous le contrôle de l'hypotha-

lamus On a trouve que la sécrétion de chaque hormone hypophysaire

est stimulée spécifiquement par l'hormone de libération correspon-

dante (ci-après dénommée "RH") sécrétée par l'hypothalamus.

Par exemple, l'hormone de libération de la thyrotropine (ci-après dénommée 'ITRH") stimulant la sécrétion de TSH et l'hormone de libération de la gonadostimuline (ci-après dénommée "LH-RH") stimulant la sécrétion de la LH ont été isolées

et identifiées.

En ce qui concerne l'hormone libérant l'hormone de croissance (ci-après dénommée "GH-RH") stimulant la sécrétion de

GH, bien que l'on ait suggéré que la GH-RH était un peptide consis-

tant en 10 aminoacides et isolé des tissus de l'hypothalamus de porc par Shary en 1971, les resultats d'une étude ultérieure ont confirme que le peptide ci-dessus est étranger & la GH-RH Jusqu'à prisent,

la GH-RH n'a éte trouvée encore chez aucun animal.

Par contre, il a été trouvé qu'il y a libération d'un peu de GH de manière spécifique par l'utilisation de certaines substances telles qu'arginine, glucagone et TRH En outre, bien que

l'on dise que la prostaglandine E, la theophylline, l'acide cyclo-

adénylique, etc, aient un effet de libération de GH, le mécanisme

de l'effet n'est apparemment pas spécifique à la lumière des prin-

cipes En outre, bien que l'on considère que certains peptides neurotransmetteurs aient un certain effet de libération de GH, le mode d'action semble n'être pas spécifique D'autre part, il a été confirmé que la RH dans l'hypothalamus n'a pas de spécificité &

l'espèce conformément à l'étude de ia TRH ou de la LH-RH.

A la suite de recherches poussées sur les pro-

blèmes ci-dessus, la demanderesse a maintenant trouvé qu'un nouveau' peptide dérivé de l'hypothalamus peut être isolé d'un extrait de glandes hypophyses du saumon et que le peptide ainsi obtenu a un

effet de libération de GH spécifique sur des espèces animales etran-

gères. Selon la présente invention, on peut proposer un peptide ou ses sels répondant & la formule dans laquelle suivantes:

H-Asp-Thr-Met-Arg-Cys-Met-Val-Gly-Arg-

Val-Tyr-Arg-Pro-Cs-Trp-Glx-Val-OH ( 1) Glx est Glu ou Gln, et ayant les propriétés physiques ( 1) Spectre d'absorption UV: Xmax 280 nm; ( 2) Réaction de Ehrlich, réaction de Sakaguchi et réaction de Pauly: positives; ( 3) Caractère hasique; ( 4) Soluble dans l'eau, le méthanol et l'acide acétique, légèrement soluble dans l'acétate d'éthyle, l'acétate de butyle, l'éther éthylique, l'hexane, l'éther de pétrole, le benzène et le chloroforme; et

( 5) Etat physique: poudre blanche.

On peut également proposer selon l'invention un agent hormonal contenant comme ingrédient actif le peptide ci-dessus

ou un de ses sels.

L'invention sera mieux comprise à la lecture de la

description qui va suivre en référence aux dessins annexes dans

lesquels: la figure 1 représente un chromatogramme obtenu par chromatographie sur colonne de filtration sur gel à l'exemple 1; la figure 2 représente un chromatogramme obtenu par chromatographie d'échange d'ions à l'exemple 1;

la figure 3 représente une courbe d'élution obte-

nue par chromatographie liquide haute pression à phase inversée (ci-

après dénommée "HPLC") à l'exemple 1; la figure 4 représente un spectre d'absorption UV du peptide selon l'invention;

la figure 5 et la figure 6 représentent respec-

tivement les courbes d'élution obtenues par HPLC dans les exemples analytiques 7 et 8; la figure 7 représente une courbe d'élution obtenue par HPLC à l'exemple 2; la figure 8 est un diagramme représentant la variation au cours du temps de l'activité in vivo de libération de GH de la GH-RH obtenue dans l'exemple d'essai pharmacologique 2 at la figure 9 est un diagramme représentant la variation au cours du temps de l'activité in vivo de libération de

GH de la lGln 163-G Hi-RH obtenue à l'exemple d'essai pharmacologique 3.

Dans la présente description, les abréviations

suivantes représentent respectivement les aminoacides suivants: Asp: acide aspartique Thr: thréonine Met: méthionine Arg: arginine Cys: 1/2 cystine Val: valine Tyr: tyrosine Pro: proline Trp:Tryptophane Gln: glutamine Glu:acide glutamique Asx:acide aspartique ou asparagine Glx:acide glutamique ou glutamine Des exemples de sels du peptide de l'invention

sont par exemple les sels d'addition d'acides avec l'acide chlor-

hydrique, l'acide sulfurique, l'acide acétique, l'acide lactique, l'acide citrique, l'acide oxalique, l'acide fumarique, l'acide maléique, etc. Le peptide de l'invention peut être obtenu par extraction des hypophyses de saumon L'hypothalamus de saumon seul ne peut pas être totalement isolé parce que l'hypothalamus de saumon

pénètre dans l'hypophyse, à la différence de celui des mammifères.

Donc, l'extraction doit être effectuée à partir d'un mélange isolé' à la fois de l'hypophyse et du l'hypothalamus En conséquence, dans

la présente description, on entend par "hypophyse de saumon" l'hypo-

physe contenant de l'hypothalamus.

Le peptide de l'invention peut être obtenu par

extraction d'hypophyses de saumon franchement lyophilisées par BC 1-

acétone, relargage des extraits, isolement du peptide désiré par chromatographie de filtration sur gel et chromatographie d'échange d'ions et ensuite purification par HPLC Dans ce cas, le peptide ainsi obtenu est une GR-RH ayant la formule (I) dans laquelle Glx est Glu Le peptide obtenu peut être facilement transformé en sel d'addition d'acide par'lyophilisation ou cristallisation après

traitement avec un acide inorganique tel que l'acide chlorhydrique.

D'autre part, à la suite de travaux poussés sur la synthèse de ce type de peptide, on a maintenant trouvé que le peptide de l'invention peut être synthétisé par une technique de

synthèse des peptides.

Selon l'invention, le peptide de la présente inven-

tion peut être synthétisé sur la base de la structure de la GB-RH ci-

dessus obtenue à partir des hypophyses de saumon Dans ce cas, on peut synthétiser la lGln J-GB-RH lorsque l'on utilise Gln comme Glx, tandis que l'on peut synthétiser lGlu 1-GR-RH en utilisant Glu comme Glx En ce qui concerne la technique opératoire pour la synthèse ci-dessus, on peut consulter Haruaki Yajima et Syunpei Sakakibara (Tanpakushitsu no Kagaku (Protein Chemistry), SEIKAGAKU JIKKEN KOZA (Experimental Biochemistry) (I) , 4, p 208-495 ( 1977) édité par Japanese Biochemical Son et publié par Kabushiki Kaisha Tokyo Kagaku Dohjin) et Nobuo Izumiya et col (PEPTIDE GORSEI

(SYNTHESIS) ( 1975) publié par Maruzen Kabushiki Kaisha).

Le peptide selon l'invention est une GH-RH ayant un effet spécifique de libération de GH et pas de spécificité de l'espèce Donc, l'agent à activité de GH-RH contenant le peptide selon l'invention comme ingrédient actif peut être utilisé non seulement pour la thérapie du nanisme humain et la réparation des

blessures mais aussi pour stimuler la croissance des animaux domes-

tiques. Le peptide selon l'invention comme d'autres peptides doues d'activité physiologique, possède dans l'organisme des récepteurs spécifiques et provoque des réactions spécifiques par action spécifique sur les récepteurs La GH-RH peut libérer la GH dans l'hypphyàe ayant des récepteurs spécifiques, mais n'a

pas d'effet sur les autres tissus n'ayant pas de récepteursspéci-

fiques. En outre, le peptide selon l'invention consistant

en L-aminoacides seuls est successivement digéré par diverses pro-

téases et son effet ne peut pas être maintenu.

D'autre part, le peptide ayant ce poids moléculaire (environ 2000) n'a pas d'antigénicité et ne provoque ni production

d'anticorps ni choc anaphylactique, même si l'on répète l'adminis-

tration Le peptide n'est pas toxique.

Le peptide selon l'invention présente son effet à une dose extrêmement faible de l'ordre du ng/kg, qui est inférieure

à celle de la GH elle-même, sur la base de la quantité de l'ingré-

dient actif L'effet est accru en proportion de la dose, et la dose peut être augmentée jusqu'à l'ordre du mg/kg La dose préférée est

ordinairement de 1 ng/kg à 10 mg/kg.

Le peptide selon l'invention est administre de préférence par injection, par exemple injection intraveineuse,

injection intramusculaire, injection sous-cutanée, etc, ordinaire-

ment utilisées pour les peptides Dans le cas de l'administration de l'invention par voie orale, le peptide est digéré dans les organes

de digestion et transformé en une forme inactive Dans ce cas, ce-

pendant, il peut être utilisé sous certaines formes de préparation telles que des microcapsules enrobées dans le liposome, non digérées dans les organes En outre, le peptide de l'invention est également

administre à partir des muqueuses autres que les organes de diges-

tion, comme le rectum, le dessous de la langue, le nez, etc Dans ce Cas, on peut l'utiliser sous diverses formes de préparation telles

que suppositoires, pastilles sublinguales, pulvérisations rhinolo-

giques Des exemples d'excipients sont ceux avec lesquels le peptide

de l'invention n'est pas digéré.

Les exemples suivants illustrent l'invention sans

toutefois en limiter la portée.

EXEMPLE 1

On extrait environ 100 g d'hypophyse fratche pré-

levée sur des saumons blancs femelles (Oncorhynchus keta) par 400 ml de mélange acide chlorhydrique à 35 %-acetone dans le rapport 1:28 et ensuite 2 080 ml d'acétone à 80 % On combine chaque extrait et

on l'ajoute & 10 1 d'acétone en agitant pour obtenir 3,0 g de pré-

cipité dans l'acétone acide On ajoute le précipité obtenu à 90 ml d'eau, on ajuste à p H 3 et, si nécessaire, on ajuste à nouveau par l'hydroxyde de sodium O,l N ou l'acide chlorhydrique O,l N On ajoute

ensuite 10 ml de solution saturée de Na Cl pour relarguer le produit.

Après centrifugation du précipité obtenu, on chromatographie le liquide surnageant résultant sur une colonne ( 5,5 x 68 cm) de "Sephadex G 25 (M) " On effectue l'élution par l'acide acétique OIN (volume de fraction: 10 ml par fraction) Le chromatogramme obtenu est représenté à la figure 1 La fraction III représentée à la figure 1 ayant un volume de 320 ml est désalinisée avec un filtre à membrane "UM-2 "(fabriqué par la sociéteé Amicon Co) et ensuite

lyophilisée pour donner 139 mg de poudre blanche La poudre résul-

tante est encore chromatographiée sur une colonne échangeuse d'ions ( 1,6 x 63,0 cm) de "CM-cellulose" On effectue l'êlution avec un gradient obtenu en utilisant 500 ml de solution tampon d'acétate

d'ammontum 0,01 M, p H 4,6, et en ajoutant goutte à goutte une solu-

tion tampon d'acetate d'ammonium 0,1 M, p H 7,0 Le chromatogramme résultant est représente & la figure 2 La fraction ( 8) indiquée à la figure 2 ayant un volume de 110 ml est lyophilisée pour

donner 1,5 mg de GH-RH brute.

La GH-RH brute obtenue est encore chromatographiee par HPLC sur une colonne ( 0,4 x 2,5 cm) de "fine packcyl C 18 " fabriquée par Nippon Bunko Kogyo Kabushiki Kaisha, équilibrée par

l'acétate d'ammonium 0,01 M à p H 5,0.

On effectue l'elution avec un gradient linéaire d'isopropanol (concentration de 15 % à 45 %) dans un dispositif à niveau constant à un debit de 1 ml/min et la colonne étant à la température ambiante et l'effluent recueilli par fractions de 1 ml La courbe d'élution résultante est représentée à la figure 3 La fraction A représentée à la figure 3 ayant un volume de 13,3 ml est lyophilisee pour donner O > 51 mg de peptide de l'invention ayant

une pureté élevée de 99 % ou davantage.

Les propriétés physiques du peptide basique obtenu sont les suivantes: Aspect: poudre blanche

Poids moléculaire: 500 à 3000 (déterminé par filtra-

tion sur gel) Réactions colorées: réaction de Ehrlich (+), réaction de Sakaguchi (+), réaction de Pauly (+) Solubilité: soluble dans l'eau, le méthanol et l'acide acétique; légèrement soluble dans l'acétate d'éthyle, l'acétate de butyle, l'éther de pétrole, l'éther éthylique, l'hexane, le benzène et le chloroforme Spectre d'absorption UV (dans l'acide acétique O,l N, concentration 0,166 m M): le spectre est

représente à la figure 4.

Dans 5 ml d'eau distillée,on dissout 500 pg du peptide ci-dessus, on le transforme en le sel d'addition d'acide avec quelques gouttes d'acide chlorhydrique 0,1 N et on lyophilise pour

obtenir 500 pg du chlorhydrate du peptide de l'invention.

La composition en aminoacides et les enchaînements d'aminoacides du peptide obtenu à l'exemple 1 sont déterminés selon

les exemples analytiques 1 à 8 suivants.

EXEMPLE ANALYTIQUE 1

(Composition en aminoacides, déterminée après hydrolyse acide)

On effectue l'analyse des aminoacides sur un auto-

analyseur d'aminoacides "LXB 4400 W(fabriqué par la societé LKB Biochrom Co., Ltd), après hydrolyse du peptide obtenu à l'exemple 1 dans HC 1 6 N à 110 C pendant 18 h. Les résultats obtenus sont les suivants: Aminoacides Trouvé (moles) Calculé (moles) Asp 1,0 1 Thr 1,0 1 Glx 1,1 1 Pro 1,2 1 Gly 1,1 1 Cys 1,9 2 Val 3,0 3 Met 2,0 2 Tyr 0,8 1 Arg 2,5 3 Trp 1, 2 i La valeur trouvée de Cys est déterminée par oxydation

à l'acide performique.

EXEMPLE ANALYTIQUE 2

(Aminoacide N-terminal) L'aminoacide N-terminal du peptide obtenu A l'exemple 1

est déterminé selon la méthode Dansyl (voir Gray et col, Biochemica.

J., 89 page 379 ( 1963)) qui montre qu'il consiste en Asx.

EXEMPLE ANALYTIQUE 3

(Aminoacide C-terminal) L'aminoacide C-terminal du peptide obtenu à l'exemple 1 est déterminé selon une méthode d'hydrazinolyse, voir Akabori et col, Bulletin Chemical Soc Japan 25, page 214 ( 1952) et l'on trouve qu'il

consiste en Val.

On trouve d'après les exemples analytiques 1 à 3 que le peptide selon l'invention est un heptadécapeptide consistant en onze types différents de 17 aminoacides ayant un poids moléculaire calculé de 2211 sous forme de trichlorhydrate et contenant Asx comme

aminoacide N-terminal et Val comme aminoacide C-terminal.

EXEMPLE ANALYTIQUE 4

(Suite d'aminoacides ( 1))

En utilisant 66 g (environ 30 nmol) du peptide carboxy-

méthyle obtenu à l'exemple 1, on détermine la suite d'aminoacides a partir du résidu N-terminal selon la méthode Edman-Dansyl, voir Hartley et col, Biochimica, Biophysica Acta 21, page 58 ( 1956) Les résultats sont les suivants:

H-Asx-Thr-Met-Arg-Cys-Met-Val-Gly-Arg-

Val-Tyr-Arg-Pro-Cys-(Trp)-Glx-Val-OH

EXEMPLE ANALYTIQUE 5

(Suite d'aminoacides C))

En utilisant 88 /lg (environ 40 nmol) du peptide carboxy-

méthylé obtenu à l'exemple 1, on détermine la séquence d'aminoacides & partir du résidu N-terminal par la méthode fluorescéine-isocyanate, voir Muramoto et col Agricultural and Biological Chemistry, 44, pages 1559 à 1563 ( 1978) Les résultats obtenus sont les suivants:

H-Asp-Thr-Met-Arg-Cys-Met-Val-Gly-Arg-

l Val-Tyr-Arg-Pro-Cys-Trp-Glx-Val-OH La méthode fluorescéine-isocyanate ci-dessus de Muramoto et col est une méthode particulièrement fiable pour

déterminer une suite d'aminoacides avec des échantillons assez petits.

EXEMPLE ANALYTIQUE 6

(Digestion par la carboxypeptidase Y) A un tampon à l'acetate de Néthylmorpholine 0,2 M à p H 8,0, contenant de la carboxypeptidase Y, on ajoute 10 nmol du peptide obtenu à l'exemple 1 et on fait incuber le mélange de réaction

d 37 O C Le rapport carboxypeptidase Y/substrat est de 1:60 en poids.

On détermine la composition en aminoacides des produits de digestion obtenu en 1 h et en 5 h On trouve que deux d'entre eux sont comme suit: Aminoacides 1 h (moles) 5 h (moles) Val 1,0 1,0 Glu 0,2 O 05 D'après ces résultats, conjointement avec l'exemple analytique 3, il est prouvé que l'enchatnement C-terminal est -Glu-Val-OH. D'après les exemples analytiques 1 à 6, on élucide que la suite d'aminoacides complète du peptide de l'invention est comme suit:

H-Asp-Thr-Met-Arg-Cys-Met-Val-Gly-Arg-

Val-Tyr-Arg-Pro-Cys-Trp-Glu-Val-OH (I)

En outre, on fait digérer le peptide de l'inven-

tion avec la chymotrypsine ou la trypsine, et on étudie ensuite la

composition en aminoacides, l'aminoacide N-terminal et l'enchaine-

ment d'aminoacides du produit digéré obtenu selon les exemples analytiques 7 et 8 afin de confirmer l'enchatnement complet

d ' aminoacides.

EXEMPLE ANALYTIQUE 7

(Digestion par la chymotrypsine) On a)oute 110 pg du peptide obtenu à l'exemple 1

à du tampon acétate d'ammonium 0,2 M à p Hi 8,0 contenant de la chymo-

trypsine et on fait incuber le mélange de réaction pendant 1 h à 37 e C Le rapport chymotrypsine/substrat est de 1:250 en poids Le produit digéré obtenu est ensuite analysé par HPLC de la même manière qu'à l'exemple % sauf que l'élution est effectuée par l'isopropanol

a 5-50 % La courbed'élution résultante est indiquée dans la figure 1.

Les fractions (C-2), (C-4) et (C-13), respectivement, indiquees à la figure 5 sont analysées de la même manière que dans les exemples analytiques 1 et 2 et on détermine les compositions en aminoacides et les aminoacides N-terminaux de ces fractions Les résultats obtenus sont les suivants: Fraction (C-2) Aminoacide Trouvé (moles) Calcule (moles) Asx 1, 0 1 Thr 1,0 1 Met 1,0 1 Arg 0,6 1 aminoacide N-terminal: Asx Fraction (C4) Aminoacide Gly Val Tyr Arg aminoacide N-terminal: Fraction (C-13) Aminoacide Glx Pro Cys Val Me t Arg Trp Trouvé (moles) Calcule (moles)

1,0 1

2,2 2

0,9 1

0,8 1

: Val Trouvé (moles) Calcule (moles)

1,0 1

1,2 1

1,8 2

1,0 1

0,9 i

1,3 1

+ (décelé et confirmé par le réactif d'Ehrlich) aminoacide N-terminal: Arg Les fractions ( 0-2), (C-4) et (C-13) sont ensuite analysées, respectivement, de la même manière qu'à l'exemple analytique 4 pour déterminer les enchaînements d'aminoacides Dans ce cas, les fractions (C2) et (C-4) sont analysées telles quelles

et la fraction (C-13) est analysée après carboxymethylation L'iden-

tification de Trp est effectuée par la méthode Edman-Dansyl dans laquelle on détermine Trp sous la forme de DNS-Trp par hydrolyse avec l'acide thioglycolique Cys est déterminée sous la forme de DNS-Cm-Cys de la même manière que ci-dessus Les résultats sont

indiques ci-après.

Fraction (C-2) H-Asx-Thr-Met-Arg-OH Fraction (C-4) H-Val-Gly-Arg-Val-TyrOH Fraction (C-13) H-Arg-Pro-Cys-Trp-Glx-Val-OH i R-Cys-Met-OH

EXEMPLE ANALYTIQUE 8

(Digestion par la trypsine)

A une solution de tampon à l'acétate d'ammo-

nium 0,2 M, p H 8,0, contenant de la trypsine, on ajoute 88 pg (environ 30 nmol) du peptide obtenu à l'exemple 1 et on fait incuber

le mélange de réaction pendant 4 h à 37 C Le rapport trypsine/subs-

trat est de 1:50 en poids Le produit de digestion est ensuite analyse par HPLC de la même manière qu'a l'exemplel, sauf que l'elution est effectuée par l'isopropanol à 5-50 % La courbe d'élution résultante est représentése à la figure 6 Les fractions (T-6), (T-8), (T-26) et (T-28) indiquées à la figure 6 sont analysées, respectivement, de la même manière qu'aux exemples analytiques 1 et

2 et on détermine leurs compositions en aminoacides et leurs amino-

acides N-terminaux Les résultats obtenus sont les suivants.

Fraction (T-6) Amihoacide Trouvé (moles) Calcule (moles) Asx 1,0 1 Thr 0, 9 1 Met 1,0 1 Arg 1,0 1 aminoacide N-terminal: Asx Fraction (T-8) Aminoacide Trouvé (moles) Calculé (moles) Val 1,3 1 Tyr 1,0 1 Arg 1,0 1 aminoacide N-terminal: Val Fraction (T-26) Aminoacide Trouvé (moles) Calcule (moles) Glx 0,9 1 Pro 1 X 3 1 Gly 1,0 1 Cys 1, 6 2 Val 1,9 2 Met 1,0 1 Arg 0,9 1 Trp + (décelé et le réactif aminoacide N-terminal: Val Fraction (T-28) Aminoacide Trouvé (D Glx 1,1 1, Pro 1,3 Gly 1,3 Cys 1,6 Val 2,7 Met 1,1 Tyr 0,8 Arg 2,0 Trp confirmé par d'Ehrlich) moles) Calculé (moles) + (décelé et confirmé par le réactif d'Ehrlich) aminoacide N-terminal: Val Les fractions (T-6), (T-8), (T-26) et (T-28) sont ensuite analysées, respectivement, de la même manière qu'à

l'exemple analytique 4 pour déterminer leurs enchaînements d'amino-

acides Dans ce cas, les fractions (-6), (T-8) et (T-26) sont analysées

telles quelles et la fraction (T-28) est analysée après carboxy-

méthylation Les résultats obtenus sont les suivants.

Fraction (T-6) H-Asx-Thr-Met-Arg-OH Frattion (T-8) H-Val-Tyr-Arg-OH Fraction (T-26) H-C s-Met-Val-Gly-Arg-OH H-Pro-Cys-Trp-Glx-Val-OH Fraction (T-28) H-Cys-Met-Val-Gly-Arg-OH | H-Val-Tyr-Arg-Pro-Cys-Trp-Glx- Val-OH

Les résultats obtenus aux exemples analy-

tiques 7 et 8 sont totalement en accord avec ceux des exemples ana-

lytiques 1 & 6, et il est clair que l'enchatnement d'aminoacides

déterminé doit 4 tre exact.

MEXEPLE 2.

(Synthèse de la lGln 16 J-GH-RH)

Dans l'exemple 2, on utilise pour la chromato-

graphie sur couche mince les solvants de développement suivants Rf 1:(CRU 3: CH 3 OH: R 20 -8:3:1) Rf (CE Ci 3: CH 3 OH: CH 3 COOH 9: 1 O > 5) Rf 3 1 Cii 3: CH 30 H = 9: O > 5) R *(CH Cl f 4 3 Rf 5 4 9 OH CH 3 COOC 2 H, 5CH 3 C (-HR:: OO:HO 20 1: 1: iz 1 et on effectue l'hydrolyse dans 1101 6 N avec du phénol à 110 'C

pendant 24 h, sauf indication contraire.

On synthétise la LlGln 1 J -GMî-RH par une méthode en phase liquide sur la base de la structure de la GR-RH obtenue à l'exemple 1 Le schéma des étapes de synthèse est le suivant Bo.c-Asp(O Bzl) -O Np Z(O Me)-Thr-OH 11Met-OM Me T_ C Z(O Me)-Arg(mts)-o Hi ( 1-8) Boc-Cys(Mzl)-OH 1 H-Me-O Me Boc-Val-OH R-Gly-O Bzl-1 H/d * Z ( 01 e) -Arg(Mts)-O Boc-Val-OH B R-Tyr-O Et

( 9-13) Z(ome)-Arg(Mts)-OH-

H-Pro-O Bzl-l H 2 P

Boc-Cys (M Bzl) -O Np-

A Boc-Trp-O Np ( 14-17) Boc-Gln-O Np

H-Val-O Bzlj-i-

Boc: groupe tertiobutyloxycarbonyle O Bzl: groupa O-benzyle O Np: 0-pnitrophénol O Me: groupe O-methyle Z(O Me): groupe pméthoxybenzyloxycarbonyle Mts: groupe mésitylène-2-sulfonyle M Bzl: groupe p'méthoxybenzyle O Et: groupe O-éthyle (A) Synthèse de Boc-Cys(M Bzl)-Trp-Gln-Val-O Bzl (positions 14-17),

PM = 845,00

(A-i) Synthèse de Boc-Gln-Val-O Bz (positions 16-17), PM = 435,508.

A 300 ml de solution dans le dioxanne contenant 16,4 g de Boc-Gln-O Np et H-Val-O Bzl préparé à partir de 17,5 g de p-toluènesulfonate et 6,45 ml de triéthylamine (ci-après denommée "Et 3 N"), on ajoute 6,45 ml de Et 3 N On maintient le mélange de réaction obtenu à la température ambiante pendant 24 h, et ensuite on.concentre On dissout le résidu dans l'acétate d'éthyle (ci-après dénommé "Ac O Et"), on lave par l'acide citrique à 5 % 7, Na 2 CO 3 à 5 % et Na Cl aqueux, et ensuite on sèche sur Na 2 SO 4 Après avoir chassa Ac O Et par distillation, on ajoute au résidu de l'éther de pétrole pour le faire cristalliser La recristallisation dans Ac O Et-éther

donne 16,45 g ( 79 % de la théorie) du compose recherché.

Rfl = 0,60, Rf 2 = O > 43 Analyse élémantaire pour C 22 H 33 N 306 Calculé %: C 60,67 H 7,64 N 9,> 65 Trouvé %: C 60,60 H 7,54 N 9,60 (A-ii) Synthèse de Boc-Trp-Gln-Val-O Bzl (positions 15-17), Pl = 621,714

A 7,94 ml d'anisole, on ajoute 8,00 g de Boc-Gln-

Val-O Bzl On traite le mélange de réactionaec 30 ml d'acide tri-

fluoroacetique (ci-après dénommé "TFA") pendant 60 min en refroidis-

sant par la glace> et ensuite on distille le TFA à la température ambiante On ajoute le résidu à du n-hexane, on lave par décantation et ensuite on sèche sur KOH Après avoir dissous le produit huileux obtenu dans 80 ml de diméthylformamide (ci-après dénommé "DMF") et

neutralisé avec 2,57 ml de Et 3 N, on ajoute 8,60 g de Boc-Trp-O Np.

On maintient le mélange de réaction à la température ambiante pendant 24 h pour provoquer la réaction Après avoir chassé le solvant par distillation à 300 C, on dissout le résidu dans Ac O Et, on lave par Na 2 CO 3 à 5 %, par l'acide citrique à 5 % et par Na Cl aqueux, et ensuite on sèche sur Na 2 SO 4 Après avoir distillé Ac O Et,

on ajoute le résidu à de l'éther pour la cristallisation La recris-

tallisation dans Ac O Et-éther donne 11,0 g ( 96 % de la quantité

théorique) du compose recherche.

À* Rf 1 = 0,52, Rf 2 = 0,40 Analyse élementaire pour C 33 H 43 N 507 Calcule %: C 63,75 H 6,97 N 11,28 Trouve %: C 63,47 H 7,00 N 10,98 (A-iii) Synthèse de Boc-Cys(M Bzl)-Trp-Gln-Val-O Bzl (positions 14-17)

PM = 845,00

A 9,54 g de Boc-Trp-Gln-Val-O Bzl, on ajoute 16,56 ml d'éthanedithitanisole à 2 % On traite le mélange de réaction par ml de TFA sous azote pendant 120 min en refroidissant par la glace Après avoir distillé le TFA à 30 C, on ajoute le résidu & de l'éther pour obtenir une poudre que l'on sèche sur KOH La poudre blanche obtenue est dissoute dans 50 ml de D Me et ensuite on ajoute 2,36 ml de Et 3 N et 7,09 g de Boc-Cys(M Bzl)-O Np On maintient le mélange de réaction à la température ambiante pendant 18 h pour provoquer la réaction et on neutralise par l'acide acétique Apres avoir distillé le solvant, on dissout le résidu dans Ac O Et, on lave par Na 2 C 03 à 5 %, par l'acide acétique à 5 % et par Na Cl aqueux et on sèche sur Na 2 SO 4 Après avoir distillé Ac O Et, on triture dans l'éther le produit gélatineux obtenu La précipitation par le mélange méthanol-éther est repétée deux fois pour donner 10,76 g ( 83 % de la

quantité théorique) du composé recherché.

R 1: 0,57

Analyse élementaire pour C 44 H 56 N 6095 Calculé %: C 62,54 H 6,68 N 9, 95 Trouve %: C 62,38 R 6,74 N 9,81 (B) Synthèse de Z(O Fe)-Arg(Mts)-ValTyr-Arg(Mts)Pro-OH (position

9-13),PM: 707,824

(B-i) Synthèse de Z(O Me)-Arg(Mts)-Pro-O Bzl (positions 12-13) Dans 200 ml de Ac O Et, on met en suspension 9,30 g de Z(O Me)-Arg(Mts)-OH, CHA(cyclohexylamine) et 3,63 g de H Cl,H-Pro-O Bzl en refroidissant par la glace, et ensuite on ajoute 3,71 g de dicyclo-

hexylcarbodiimide (ci-après denommé')CC") en refroidissant par un mélange réfrigérant On maintient le mélange de réaction pendant 24 h dans les conditions ci-dessus pour provoquer la réaction Apres avoir séparé par filtration la dicyclohexyluree précipitee, on lave le filtrat par l'acide citrique à 5 %, par Na 2 CO 3 à 5 7 et par Na Cl aqueux et ensuite on sèche sur Na 2 SO 4 Après avoir chassé 2 4 Ac O Et par distillation, on ajoute au résidu du n-hexane pour le faire cristalliser La recristallisation dans le mélange Ac O Et-éther de pétrole donne 7,80 g ( 73 % de la quantité théorique) du compose recherché. Rf 1 = 0,80 (B-ii) Synthèse de Boc-Val-Tyr-O Et (position 10-11), PM: 408,482) Dans 200 ml de Ac O Et, on dissout 10,86 g de Boc-Val-OH et 11-Tyr-O Et préparé à partir de 12,29 g du chlorhydrate de H-Tyr-C t et 7 ml de Et 3 N, et on ajoute ensuite 11,35 g de DCC en refroidissant avec un mélange réfrigérant On maintient le mélange de réaction pendant 24 h dans les conditions ci-dessus pour provoquer la réaction Après avoir sépare par filtration la dicyclohexyluree, on lave le filtrat par Na 2 CO 3 à 5 %, par l'acide citrique à 5 % et par Na Cl aqueux et on sèche sur Na 2 SO 4 Apres

avoir distillé Ac O Et, on ajoute du n-hexane au residu pour la cris-

tallisation.

Rendement: 20,05 g ( 99 X de la quantité theorique).

Rf 1 = 0,68 Analyse élementaire pour CG 19 H 28 N 205 Calculé 7 %: C 62, 62 H 7,74 N 7,69 Trouvé o: C 62,80 H 8,02 N 7,65 (B-iii) Synthèse de Z(O Me)-Arg(Mts)-Val-Tyr-O Et (positions 9-11)

PM: 810,944

A 6,13 g de Boc-Val-Tyr-O Et, on ajoute 8,1 ml d'anisole On traite le mélange de réaction par 32, ml de TFA pendant 60 min en refroidissant par la glace Après avoir distillé le TFA à la température ambiante, on lave le résidu par le n-hexane par décantation et on sèche sur KOR Après avoir dissous le résidu huileux obtenu dans 30 ml de DMP, on ajoute 2,1 mi de Et 3 N à la solution en refroidissant par la glace On ajoute au mélange de reaction obtenu dans 35 ml de têtrahydrofuranne le Z(O Me)-Arg(Mts)-OH prépare à partir de 10,23 g du sel de cyclohexylamine et 17 ml d'acide chlorhydrique 1 N et de l'anhydride mixte préparé à partir de 2,31 ml de Et 3 N et 2,36 ml de chloroformiate d'isobutyle en conditions anhydres On maintient le mélange de réaction à -15 C pendant 2 h et ensuite à O C pendant 4 h Apres avoir distille ' le solvant, on dissout le résidu dans Ac O Et, on lave par l'acide citrique à 5 %, par Na 2 CO 3 à 5 % O et par Na Cl aqueux et on sèche sur

Na 2804 Après avoir distillé Ac O Et, on ajoute de l'éther isopropy-

lique au résidu pour le faire cristalliser Ensuite, on dissout le produit cristallin obtenu dans une faible quantité de chloroforme et on chromatographie sur une colonne X x 5 cm) de gel de silice en éluant par le mélange chloroforme-méthanol 100:1 pour obtenir le composé brut ayant un Rf 2 de 0,74 Après distillation du solvant, on lave le composé par l'éther de pétrole pour obtenir 9,80 g

( 81 % de la quantité théorique) du composé recherché.

Rf 1 = 0,90, Rf 0,74 Rf 3 = 0,47

2 '> 3

(B-iv) Synthèse de Z(O Me)-Arg(Mts)-Val-Tyr-N 2 _ 3 (positions 9-11).

PM: 796 924

On dissout 5,0 g de Z(O Me)-Arg(Mts)-Val-Tyr-O-Et dans 100 ml de méthanol et on ajoute 3,6 ml d'hydrazine aqueuse & 80 % On laisse reposer le mélange de réaction à la température ambiante pendant une nuit On triture dans l'éther éthylique le produit gélatineux précipité Après filtration, recristallisation dans le mélange chaud méthanol-éther éthylique et dans l'éthanol,

on obtient 4,1 g ( 83 % de la quantité théorique) du composé recherché.

Rf 1 = 0,58

(B-v) Synthèse de Z(Ole)-Arg(Mts)-Val-Tyr-Arg(Mts)-Pro-OH (posi-

tions 9-13) On dissout 4,7 g de Z(O Me)-Arg(Mlts)-Pro-O Bzl

dans 80 ml de méthanol et on ajoute quelques gouttes d'acide acétique.

* On réduit catalytiquement le mélange de réaction par une quantité efficace de charbon palladié à 10 % On distille le solvant après filtration Si l'élimination de Z(O Me) n'est pas terminée, on ajoute au résidu 2,9 ml d'anisole et on traite le mélange de réaction par 12 ml de TFA pendant 30 min en refroidissant par la glace Apres avoir distillé le TPA à la température ambiante, on lave le résidu par le n-hexane par décantation et on sèche sur KOH On dissout le résidu dans 20 ml de DMF et on ajoute 0,93 ml de Et 3 N en refroidissant parla glace On mélange le mélange résultant à -10 C avec une solution de Z(O Me)-Arg(Mts)-Val-Tyr- N 3 dans le DMF, préparee à partir de 5,26 g de son hydrazide, 0,87 ml de nitrite d'isoamyle et 0,92 ml de Et 3 N et on ajoute 0,93 ml de Et 3 N On maintient le mélange de réaction obtenu à -10 C pendant 24 h pour provoquer la réaction et on neutralise par deux ou trois gouttes d'acide acétique Après avoir distillé le solvant, on dissout le résidu dans Na HCO 3 à 5 %, on lave à l'éther éthylique, on transforme en acide par l'acide citrique et on extrait par Ac O Et La phase Ac O Et résultante est lavée par l'acide citrique à 5 %, par Na HCO 3 à 5 7 % et par Na Cl aqueux et ensuite séchée sur Na 2 SO 4 Apres distillation de Ac O Et, on ajoute de l'éther de pétrole au résidu pour le faire cristalliser.

La recristallisation dans le mélange méthanol-

ether donne 5,40 g ( 67 % de la quantité théorique) du composé recherché, Rf 1 = 0,75 Composition en aminoacides

___ _________________- __ ___

Aminoacide Trouve (moles) Calcule (moles) Pro 0,96 1 Val 1,10 1 Tyr 1,00 1 Arg 2,12 2 rendement moyen: 87 % (C) Synthèse de Boc-Asp(O Bzl)-Thr-MetArg(Mts)-Cys(M Bzl)-}et-Val Gly-OH (positions 1-8), PM: 1404,718 (C-i) Synthèse de Boc-Val-Gly-O Bzl (positions 7-8), PM: 364,43 A une solution dans Ac O Et contenant 6,55 g de

Boc-Val-OH et H-Val-O Bzl préparé à partir de 10,12 g de son p-toluène-

sulfonate et 4,2 ml de Et 3 N, on ajoute 7,42 g de DCC en refroidissant par un mélange réfrigérant On maintient le mélange résultant à la température ambiante pendant 24 h pour provoquer la réaction Apres filtration de la dicyclohexyluree, on lave le filtrat par l'acide citrique à 5 % par Na 2 CO 3 & 5 % et par Na Cl aqueux et ensuite on sèche sur Na 2 SO 4 Apres avoir distillé Ac O Et, on ajoute du n-hexane au résidu pour la cristallisation La recristallisatiun dans le mélange mêthanol-ether de pétrole donne 9,0 g ( 82 % de la quantité

théorique) du composé recherché.

Rf 1 = 0,90, Rf 4 = 0,38 Analyse élémentaire pour C 19 H 28 N 205 Calculé %: C 62,62 H 7,74 N 7,69 Trouve 7: C 62,80 H 8,02 N 7,65 (C-ii) Synthèse de Z(O Me)-Cys(M Bzl)-Met-O Me (positions 5-6)

PM: 486,636

A 250 ml de solution dans Ac O Et contenant 17,07 g de Boc-Cys(M Bzl)-OH et H-Met-O Me préparé à partir de 9,99 g de son chlorhydrate et 7 ml de Et 3 N, on ajoute 11,35 g de DCC en refroidissant au moyen d'un mélange réfrigérant On maintient le

mélange résultant à la température ambiante pendant 24 h pour pro-

voquer la réaction Après filtration de la dicyclohexyluree, on lave le filtrat par l'acide citrique à 5 %, par Na 2 CO 3 à 5 % et par Na Cl aqueux et ensuite on sèche sur Na 2 SO 4 Apres distillation de Ac O Et,

on ajoute du n-hexane au résidu pour la cristallisation.

La recristallisation dans Ac O Et-éther donne

,7 g ( 65 % de la quantité théorique) du composé désire.

Rf = O 233 Rf 0,89.

Analyse elémentaire pour C 22 H 34 N 20652 Calculé %: C 54,30 H 7,04 N 5, 76 Trouvé %: C 541,29 H 7,09 N 5,76 (C-iii) Synthèse de Z(O Me)-Thr-Met-O Me (positions 2-3) PM 428,494 Dans 200 ml de dioxanne, on dissout 10,0 g de

Z(O Me)-Thr-OH;DCHA (sel de dicyclohexylamine) et 4,29 g de H Cl,H-

Met-O Me et on ajoute 4,89 g de DCC en refroidissant avec un mélange réfrigérant On maintient le mélange résultant à température ambiante

pendant 18 h pour provoquer la réaction Après avoir séparé la dicyclo-

hexyluree par filtration et distillé le solvant, on dissout le résidu dans Ac O Et, on lave par l'acide citrique à 5 %, par Na 2 CO 3 à 5 % et par Na Cl aqueux et ensuite on sèche sur Na 2504 Apres avoir distillé Ac O Et, on ajoute de l'éther au résidu pour la cristallisation pour

donner 8,50 g ( 92 % de la quantité theorique) du composé recherche.

Rf 1 = 0,60 Analyse élémentaire pour C 19 128 N 2075 Calculé %: C 53,25 H 6,59 N 6,54 Trouvé %: C 53,23 H 6,85 N 6,68 (C-iv) Synthèse de Z(O Me)Thr-Met-N H 3 (positions 2-3), PM: 428,50 ' Dans 100 ml de méthanol, on dissout 4,3 g de

Z( O Me)-Thr-Met-O Me et on ajoute 5,7 ml d'hydrazine aqueuse à 80 %.

On laisse reposer le mélange résultant à la température ambiante pendant une nuit Apres avoir distillé le solvant, on ajoute de l'éthanol au résidu pour la cristallisation pour donner 4,10 g

( 96 % de la quantité théorique) du composé recherché.

Rf 1 = 0,56 Analyse élémentaire pour C 18 H 28 N 406 Calculé: C 50,45 H 6, 59 N 13,08 Trouve %: C 50,49 H 6,67 N 13,02 Conp 2 osition en aminoacides Aminoacide Trouvé (moles) Calculé (moles) Thr 1,06 1 Met 1,00 1

rendement moyen: 87 7.

(C-v) Synthèse de Z(O Me)-Arg(Mts)-Cys(Olzl)-'Iet-O O Me (positions 4-6).

PM: 889,098

A 4,84 g de Boc-Cys-(M Bzl)-Met-O Me, on ajoute ,4 ml d'anisole On traite le mélange résultant par 20 ml de TFA pendant 60 min en refroidissant par la glace On ajoute la solution obtenue à du n-hexane et on lave par décantation On sèche le

produit huileux résultant sur KOH et on le dissout dans 30 ml de DEF.

On ajoute à la solution résultante 1,4 ml de Et 3 N en refroidissant

par la glace et ensuite l'anhydride mixte prépare à partir de Z(O Me)-

Arg(Mts)-OH, préparé à partir de 6,20 g de son sel de cyclohexyl-

amine et 10 ml de HC 1 1 N, 1,54 ml de Et 3 N et 1,58 ml de chloroformiate d'isobutyle dans 50 ml de THF en conditions anhydres On maintient le mélange de réaction obtenu à -10 C pendant 3 h pour provoquer la réaction Après avoir distillé le solvant, on dissout le résidu dans Ac O Et, on lave par l'acide citrique à 5 % par Na HICO 3 à 5 % et par Na Cl aqueux et ensuite on sèche sur Na 2 SO 4 La cristallisation dans l'éther, après distillation de Ac O Et et reprécipitation dans le mélange méthanol-ether répétée deux fois, donne 6, 2 g ( 70 % de la

quantité théorique) du composé recherché.

Rf 1 = 0,61 (C-vi) Synthèse de Z (O Mle)-Arg(Mts)-Cys(M Bzl)-Met-N 2,' (positions 4-6)

PM: 889,104

Dans 50 ml de méthanol, on dissout 4,4 g de Z(O Me)-Arg(Mts)-Cys(M Bzl)Met-O Me et on ajoute 3 ml d'hydrazine

aqueuse à 80 % On laisse reposer le mélange résultant à la tempé-

rature ambiante pendant une nuit pour donner un produit gélatineux.

On triture le produit résultant dans l'éther on filtre La repré-

cipitation dans le mélange DIF-éthanol donne 3,0 g ( 68 % de la

quantité théorique) du composé recherché.

Rf 1 = 0,46 Analyse élémentaire pour C 4 I 56 N 8 053,,05 H 20 Calcule %: C 53,49 H 6,40 N 12,48 Trouvé 7 %: C 53,47 H 6,34 N 12,55 (C-vii) Synthèse de Z(O Me)-Arg(Mts)-Cys(}Bzl)-Nlet-Val-Gly-OH (positions 4-8), PM: 1031,254 Dans 50 ml de méthanol, on dissout 1,3 g de

Boc-Val-Gly-O Bzl et on ajoute quelques gouttes d'acide acétique.

On réduit catalytiquement le mélange résultant avec une quantité efficace de charbon palladié à 10 % pendant 3 h Après filtration, on distille le solvant On triture le résidu avec du n-hexane On obtient environ 1,06 g de poudre blanche à laquelle on ajoute 2,09 iml

d'anisole et on traite par 10 ml de TFA pendant 45 min en refroidis-

sant par la glace Après distillation du TFA à la température ambiante, on sèche le résidu sur KOH, on le dissout dans 2 ml de diméthylsulfoxyde (ciaprès dénommé "DMSO")-10 ml de DMF et on ajoute 1,1 ml de Et 3 N en refroidissant par la glace On ajoute au

mélange résultant une solution dans le DMF de Z(O Me)-Arg(Mts)-Val-

Tyr-N 3 préparé à partir de 3,8 g de Z(O Me)-Arg(Mts)-Val-Tyr-N 2 H 3, 0, 62 ml de nitrite d'isoamyle et 1,32 ml de Et 3 N et on ajoute 0,6 ml

de Et 3 N pour provoquer la réaction à -10 C pendant 36 h Après neu-

tralisation du mélange obtenu avec quelques gouttes d'acide acétique et distillation du solvant, on ajoute de l'acide citrique au résidu et on laisse reposer pendant quelque temps On triture le précipité résultant par l'acide citrique à 5 % et par l'eau et ensuite on sèche On répète deux fois la précipitation dao DKF-Ac O Et pour

obtenir 2,8 g ( 69 7 de la quantité théorique) du composé recherché.

Analyse élémentaire pour C 47 H 66 N 80 253,H 20 47 66 8 1283 l 20 Calculé %: C 53,80 H 6,53 N 10,68 Trouvé %: C 53,74 H 6,52 N 10,54 Comnossition en aminoacides Aminoacide Trouvé (moles) Calculé (moles) Gly 1,00 1 Cys 0,79 1 Val 1,00 1 Met 0,90 1 Arg 0,98 1 rendement moyen: 87 % (C-viii) Synthèse de Z(O Me)-Thr-Met-Arg(Mts)-Cys(M Bzl)-Met-Val-Gly-OH 1 S (positions 2-8), PM: 1263:552

A 480 mg de Z(O Me)-Arg(Mts)-Cys(M Bzl)-Met-

Val-Gly-OH,on ajoute 0,6 ml d'anisole On traite le mélange résu I-

tant par 3 ml de TFA pendant 45 min en refroidissant par la glace, on ajoute du n-hexane, on lave par décantation et on ajoute ensuite O 20 de l'éther pour obtenir une poudre blanche On sèche la poudre obtenue sur KOH, on la dissout dans 5 ml de TMF et ensuite on ajoute 0,055 ml de Et 3 N en refroidissant par la glace, On mélange le mélange

obtenu avec 15 ml de solution dans le DMIF contenant le Z(O Me)-Thr-

Met-N 3 préparé à partir de 254 mg de 2 ( O Me)-Thr-Met-N 2 H 3, 0,094 ml de nitrite d'isoamyle et 0,18 ml de Et 3 N et on ajoute 0,055 ml de

Et 3 N pour provoquer la réaction à -100 C pendant 24 h Après neutra-

lisation par quelques gouttes d'acide acétique et distillation du solvant, on ajoute au résidu de l'acide citrique à 5 % On triture le précipité obtenu et on le lave par l'acide citrique & 5 % et par l'eau et ensuite on sèche La précipitation dans DIF-Ac OET; puis dans DMF-méthanol, donne 430 mg ( 90 % de la quantité théorique)

du composé recherché.

Rf 1 = 0,41 Analyse élémentaire pour C 56 H 82 N 1001554 Calculé %: C 53, 23 H 6,54 N 11,O 9 Trouvé %: C 53,34 H 6,64 N 10,79

(C-ix) Synthèse de Boc-Asp(C Bzl)-Thr-Met-Arg(Mts)-Cys(M Bzl)-Met-Val-

Gly-OH (positions 1-8) PM: 1404,718

A 348 mg de Z(O Me)-Thr-Met-Arg(Mts)-Cys(M Bzl)-

Met-Val-Gly-OH, on ajoute 0,3 ml d'anisole et on traite par 1,5 ml de TFA pendant 45 min en refroidissant par la glace On ajoute du n-hexane au mélange de réaction, on lave par décantation et ensuite on traite par l'éther pour obtenir une poudre blanche On sèche la poudre obtenue sur KOHR, on la dissout dans 3 ml de DMSO et 3 ml de DMF et on ajoute ensuite 0,077 ml de Et 3 N et Boc-Asp(O Bzl) en refroidissant par la glace On maintient le mélange de réaction à la température ambiante pendant 24 h pour provoquer la réaction et on neutralise par quelques gouttes d'acide acétique Après distillation du solvant, on ajoute au résidu de l'acide citrique & 5 % pour provoquer la précipitation, on triture et on lave par l'acide citfique & 5 % et par H 20 et ensuite on sèche On ajoute de l'éthanol au produit résultant et on agite pendant 24 h tandis que la majeure partie du dérive de succinimide passe dans l'ethanol,

pour donner 300 mg' ( 78 % de la quantité théorique) du compose désire.

Analyse élémentaire pour C 63 H 93 N 101754 Calculé %: C 53,86 H 6,67 N 10,97 Trouvé %: C 53,46 H 6,67 N 10,78 (D) Condensation des fragments

(D-i) Synthèse de Z(O Me)-Arg(Mts)-Val-Tyr-Arg(Mts)-Pro-Cys(}Bzl)-

Trp-Gln-Val-O Bzl((positions 9-17), PM:1945,298 A 0,85 g de Boc-Cys(M Bzl) -Trp-Gln-Val-O Bzl, on ajoute 1,08 ml d'éthanedithiol-anisole à 2 % et on traite par ,00 ml de TFA a -50 C pendant 60 min dans un courant d'azote On

ajoute du n-hexane an mélange de réaction et on lave par décantation.

On ajoute de l'éther au résidu résultant pour obtenir une poudre blanche que l'on triture par Na HCO 3 & 5 % pour donner la composition d'amine libre et ensuite on lave par l'eau et par l'éther On sèche le produit resultant sur KOH et on dissout dans 10 ml de DMF On

ajoute à la solution obtenue 1,22 g de Z(O Me)-Arg(Mts)-Val-Tyr-Arg(Mts)-

Pro-OH et O,153 g de N-hydroxybenzotriazole (ci-après dénommé "HO Bt") et ensuite on ajoute 0,25 g de DCC en refroidissant à un mélange réfrigérant pourprovoquer la réaction à la température ambiante pendant 24 h Après avoir éliminé la dicyclohexylurée par filtration, on distille le solvant en maintenant la température au-dessous de C Apres addition de Ac O Et et de Na HCO 3 à 5 % au résidu, on

sépare le précipité résultant par filtration, on le lave en agi-

tant dans l'acide citrique à 5 % et l'eau et on sèche La repreci-

pitation dans DMF-Ac O Et et dans DMF-Ac O Et + éthanol donne 1,1 g

( 56 % de la quantité théorique) du compose désiré.

Rf 1 0,52, Rf 2 = 0,42 Analyse élémentaire pour C 97 H 125 N 1702053 Calcule %: C 59,89 H 6,48 N 12,24 Trouvé 7: C 60,10 H 6,72 N 11,96 Compaositions en aminoacides Aminoacide Trouvé (moles) Calcule (moles) Glx 1,00 1 Pro 0,82 1 Cys i Val 2,17 2 Tyr 1,01 1 Arg 2,00 2 Trp 1 rendement moyen: 80 % On analyse le Trp avec le méthanesulfonate 4 M.

On analyse Cysaprès oxydation par l'acide performique.

(D-ii) Synthèse de Boc-Asp(O Bzl)-Thr-Met-Arg(Nlts)-Cys(M Bzl)-Met-

Val-Gly-Arg(Mts)-Val-Tyr-Arg(Mts)-Pro-Cys(N Bzl)-Trp-Gln-Val-o Bzl

( (Gln 16 l-GH-RH protégée en positions 1-17), PM:-3167,846.

A 230 mg du compose obtenu en (D-i), on ajoute 0,254 ml d'éthanedithioanisole à 2 % et on traite par 1,00 m de TFA à -50 C dans un courant d'azote On ajoute du n-hexane au résidu résultant, on lave par décantation et on traite par l'éther pour

obtenir une poudre blanche.

On lave encore la poudre obtenue par Na HCO 3 à %, l'eau et l'éther, on sèche sur KOH et on dissout ensuite dans ml de DMF On ajoute à la solution résultante 166 mg de Boc-Asp(O Bzl)- Thr-Met-Arg(Myts)-Cys(M Bzl) -Met-Val-Gly-OH et 21,7 mg de HO Bt Apres

agitation, on ajoute au mélange de réaction 26,8 mg de DCC en re-

froidissant par un mélange réfrigérant pour provoquer la réaction pendant 48 h En outre, on ajoute au mélange de réaction 11 mg de HO Bt et 14 mg de DCC pour provoquer la réaction pendant 48 h. Après élimination de la dicyclohexylurée par filtration, on distille le solvant en maintenant la température en dessous de 30 C On ajoute de l'eau au résidu pour la précipitation, on triture et on lave à racide citrique à 5 % et à l'eau et ensuite on sèche Après avoir répété deux fois la précipitation dans le mélange DMF-méthanol,

on dissout les 275 mg de produit brut obtenu dans une faible quan-

tite de DM 14 F et on chromatographie ensuite sur une colonne ( 3 x 75 cm volume: 530 ml) de "Sephadex LHI-20 " On effectue l'élution par le DMF et on recueille la fraction principale Après distillation du DM 1 en maintenant la température au-dessous de 30 C, on traite le résidu par l'eau pour obtenir 220 mg ( 59 % 7 de la quantité théorique)

du composé recherché sous forme d'une poudre blanche.

Rf 1 0,60, Rf 2 = 0,55 co 22 osition en aminoacides Aminoacide Trouvé (moles) Calculé (moles) Asp 1,16 1 Thr 1,12 1 Glx 0,90 1 Pro 0, 78 1 Gly 1,28 1 Cys 2 Val 3,01 3 Met 1,66 2 Tyr 0,88 1 Arg 3,00 3 Trp 1 rendement moyen: 78 % (E) Elimination des groupements protecteurs ("déprotection") et purification A 120 mg de Boc-(positions 1-17)-O Bzl, on ajoute 0,33 ml de m-crésol et 0,11 ml d'éthanediol et on ajoute 3,02 ml de solution de trifluorométhanesulfonate-thioanisole 1 M dans TFA en refroidissant par la glace On traite le mélange de

réaction à O C pendant 3 h pour éliminer tous les groupements pro-

tecteurs Après avoir distille le solvant avec une pompe à vide, on ajoute de l'éther au résidu pour obtenir une poudre blanche On sépare la poudre par filtration et on dissout immédiatement le résidu dans une faible quantité d'eau qui a été dégazee par l'azote et on sépare le produit insoluble par filtration On dilue le filtrat obtenu par 400 ml d'acétate d'ammonium 0,01 A, p Hl 7,0, pour obtenir une concentration de 0,1) mol/l et on maintient à la température ambiante pendant 3 jours dans une pièce sombre pour l'oxydation par l'air Lorsque le test "Erumane" confirme que l'absorption à 412 nm a eété réduite de 0,27 a 0,12 et maintenue constante, on ajuste le filtrat dilué à p H 5,0 par l'acide acétique à 5 % et on lyophilise

pour obtenir environ 40 mg de la lGln 16 l-GH-RP brute.

16 ' On met en suspension la lGln 6 l-GH-RH dans une

faible quantité d'acide acétique 1 N et on centrifuge On chromato-

graphie le liquide surnageant obtenu sur une colonne ( 3 x 95 cm, volume: 672 ml) de "Sephadex G-25 " en éluant par l'acide acétique 1 N et on recueille l'effluent de la colonne (éluat) par fractions de 4 ml pour la purification Le composé filtré sur gel obtenu est

lyophilisé, dissous dans l'acide acetique O,LN et ensuite centri-

fugé pour séparer les matières insolubles Le liquide surnageant résultant est chromatographie sur une colonne HPLC ("p Bondapak TM/C 18 ") On effectue l'élution au moyen d'un gradient linéaire obtenu par l'acetonitrile à 10 % et 50 % dans TFA à 0,1 % dans un dispositif à niveau constant à un débit de 2 ml/min ( 4 ml/min pour

le fractionnement).

La courbed'élution résultante est représentee

à la figure 7.

D'après la figure 7, le peptide purifie présente un pic unique en HPLC et son temps de rétention est sensiblement en

accord avec celui de la GH-RH obtenue à partir du saumon.

Les propriétés physiques du peptide sont les suivantes: Rf = 0,44 (support: "Kiesel gel 60 F 2544 " fabriqué par

la société E Merck G A, solvant de dévelop-

pement: n-butanol-Ac O Et-acide acétique-eau

1:1:1:1)

l"lD 14,4 (ó O 1, e 20) Co 2 mposition en aminoacides mm m m mmmmmmmm Aminoacide Trouvé (moles) Calculé (moles) Asp 1,08 1 Thr 1,00 1 Gix 1,00 1 Gly 1,14 1 Cys 2 Val 3,03 3 Met 1,93 2 Tyr 1,00 1 Arg 3,00 3 Trp -* 1 Pro 1,01 Cys et Pro ne peuventlas être décelés dans le cas de l'hydrolyse dans H Cl 6 N.

EXEMPLE ANALYTIQUE 9

(Digestion par la carboxypeptidase P) Dans l'analyse des aminoacides effectuée après l'hydrolyse dans HC 1 6 N, on ne peut pas déterminer si on décèle Glu ou Gin Pour cette raison, on effectue l'analyse de l'aminoacide

C-terminal par la carboxypeptidase.

Dans 150 /ul de pyridine-acétate 0,1 N, à pli 5,5, on dissout-environ 4,4 pg (environ 2 nmol) de lGln 16 l-GH-RH obtenue à l'exemple 2 ou de la GHRH{ de saumon obtenue à l'exemple 1 et on ajoute environ 2 /u 11 de solution de carboxypeptidase P (société Protein Research Foundation) à 1 mg/ml d'eau On fait incuber le mélange à 37 C pendant 3 h. Apres élimination du solvant, on dissout le résidu

dans 300 1 ul de HC 1 0,02 N et on analyse sur un autoanalyseur d'amino-

acides "Hitachi 835-50 " de la société Hitachi Ltd Les résultats obtenus sont indiqués dans le tableau I ci-après La carboxypeptidase P est une exopeptidase qui attaque la liaison du peptide C-terminal

pour libérer des aminoacides simples.

Il apparaît d'après le tableau I que Gln est en seconde position à partir du C-terminal dans la lGln 16-GH-RH tandis

Z 2521133

que Glu est dam la même position que ci-dessus dans la GH-RH obtenue

à partir du saumon.

On obtient les mêmes résultats dans le cas o on utilise la carboxypeptidase A (société Sigma Chemical Company) quilibère facilement Gln,mais libère peu Glu La réaction est effectuée dans les mêmes conditions qu'avec la carboxypeptidase P, sauf qu'on utilise un tampon pyridine-acetate, p H 7,8,au lieu de pyridine-acétate, p H 5,5 Les résultats obtenus sont indiques dans

le tableau II ci-après.

D'après le tableau II, Gin est décelée avec Val dans la lGln 16 l-GH-R, tandis que Glu est relativement peu décelee par rapport à Val dans la GHRH obtenue à partir du saumon Il va sans dire que Gln n'est pas décelée dans la GH-RH obtenue à-partir

du saumon.

Pour la raison ci-dessus, il est prouvé que la

position 16 de la GH-RH synthétisee est Gln.

EXEMPLE 3

(Synthèse de la lGlu 6 l-GH-RH) On répète le mode opératoire de l'exemple 2 sauf

que l'on utilise Glu comme produit de départ au lieu de Gln.

LalGlu 16 l-GH-RH a sensiblement les mêmes propriétés physiques et la même activité pharmacologique que la GH-RH obtenue

à partir du saumon et la lGln 16-GH-RH.

EXEMPLE DE FORMULE

(Solution injectable) Dans 5 ml d'eau distillée et stérilisee, on dissout 0,1 mg du peptide de l'invention et 50 mg de glycine et on divise ensuite la solution obtenue en 10 fioles et on lyophilise pour le stockage On ajoute au mélange lyophilise la quantité appropriée de sérum physiologique stérile pour préparer une solution injectable

au moment de l'emploi.

EXEMPLE D'ESSAI PHARMACOLOGIQUE 1

On place de petits morceaux d'hypophyses antérieures prelevees sur des rats Wistar mâles-au sommet d'une colonne, qui est un cylindre à injection ayant un diamètre de 1 m garnie avec 0,3 à 0,5 ml de "Sephadex G 25 " équilibrée avec une solution tampon de

Xrebs-Ringer contenant 0,1 % de sérum de veau à un débit de 0,5 ml/min.

On chromatographie sur la colonne 1 ml d'une solution témoin (solution tampon de Krebs-Ringer), 1 ml de solution de TRH à 2 pg/ml et 1 ml de solution à 2 -pg/ml de la GH-RH obtenue à l'exemple l,dans cet ordre On recueille i'effluent de la colonne en fractions de 1 ml et on analyse chaque fraction par un dosage radio-immunologique avec un anticorps antiGH de rat (étalon NIH) pour déterminer la quantité de GR de rat libérée dans le dosage Les résultats obtenus

sont indiqués dans le tableau III ci-après.

Comme on le voit dans le tableau III, lorsqu'on utilise le peptide selon l'invention, la quantité de GH libérée est environ 5 fois celle observée dans le témoin et la même qu'avec la

TRH ayant un effet non spécifique de GH-RH.

Le mode de libération, cependant, est spécifique, c'est-i-dire que le mode de libération de l'invention est pointu,

tandis que celui de la TRH est large (allure du pic).

EXEMPLE D'ESSAI PHARMACOLOGIQUE 2

(Activité de libération de GH in vivo de la GR-RH) On utilise des rats Wistar miles tagés de semaines Les rats sont anesthésiés au pentobarbital administré

par voie intrapéritonéale (i p) à une dose de 50 mg/kg et attachés.

On place du c té du coeur de la veine jugulaire droite du rat une canule de 3,5 cm en tube "Silastic" (diamètre intérieur 0,020, diamètre extérieur 0,037, société Dow Corning) Chez le rat avec la canule de 'veine placée en permanence, onreprend l'autre extrémité de la canule de 3 cm de l'arrière du cou et on la fixe sur la couche

extérieure de la peau.

On injecte par la canule 0,5 ml d'héparine à unités/ml et ensuite on bouche la canule avec un bouchon en fil d'acier inoxydable On injecte la GH-RH au rat et on recueille

le sang du rat anesthésie le jour suivant On administre du chlor-

hydrate de Chlorpromazine par voie i p 4 h avant l'injection à une dose de 2 mg/kg Quatre rats reçoivent par la canule une injection de 440 p g/kg de GH-RH de saumon obtenue à l'exemple 1 D'autre part,

trois rats témoins reçoivent du sérum physiologique.

Pour chaque rat, on recueille 0,5 ml de sang

min avant l'injection et 15, 30, 60, 120 et 180 min après l'injec tion. Le sang recueilli est centrifugé à 2000 g pendant min Pour mesurer

l'activité de libération de GR, on dose le liquide surnageant (plasma) par un dosage radio-immunologique (ci-après dénommé

"RIA") selon une méthode du double anticorps (voir C A Birge et col.

Endocrinology 81, page 195 ( 1967)) On effectue le RIA de la GR de rat en utilisant un nécessaire NIR Les résultats obtenus sont indiqués dans le tableau IV et la figure 8 o les symboles A à G du

tableau IV ci-après correspondent à ceux décrits à la figure 8.

D'après la figure 8, une augmentation évidente de la concentration en GR dans le plasma est observée 60 min après l'injection chez le groupe recevant la GB-RH, par rapport à celle

observée dans le groupe témoin, bien que l'on observe une diffé-

rence individuelle entre les rats.

En comparaison avec l'activité de libération de CH du facteur de libération de GH isolé sur le cancer du pancréas humain (ci-après dénommé "hp GRP"), le hp GRF présente une augmentation de GB 5 min après l'injection (voir R Guillemin et col, Science, 21, page 585 ( 1982) tandis que la GB-RH obtenue chez le saumon présente une augmentation de GH 1 h après l'injection Les résultats ci-dessus confirment que l'effet de libération de GB de la GH-RH obtenue à partir du saumon n'a pas d'effet directement sur l'hypophyse

mais d'une manière différente.

EXEMPLE D 'ESSAI PHARMACOLOGIQUE 3

(Activité de libération de GH in vivo de la lGln 6 l-GB-RH) On répète le mode opératoire de l'exemple d'essai pharmacologique 2 sauf que l'on utilise six rats dans le groupé recevant la lGln l-GH-RH et dans le groupe recevant le sérum physiologique, respectivement,et on recueille le sang 15 min avant

l'injection et 15, 30, 60, 120, 180, 240 et 300 min après l'injection.

Les résultats obtenus sont indiqués dans le tableau V ci-après et la figure 9 o les symboles G à L décrits dans le tableau V correspondent à ceux décrits à la figure 9 Dans la figure 9, les données du groupe témoin sont décrites seulement par

la valeur moyenne.

D'après la figure 9, une augmentation évidente de la concentration en GR dans le plasma est observée entre 30 et 60 min

après l'injection chez le groupe recevant la lGln lGH-RH, en compa-

raison avec celle observée dans le groupe témoin, bien que l'on observe des différences individuelles entre les rats Bien que l'effet de libération de GH de lalGln 6 l-GR-RH tendeà apparaître plus t Ot que celui de la GR-RH obtenue à partir du saumon, il est

clair que la Gln 16 -GH-RH a un effet de libération de GR.

A partir des résultats ci-dessus obtenus dans les exemples d'essai pharmacologiques 1 à 3, il est clair que les peptides selon l'invention ont un effet de libération de GR sur les

espèces animales étrangères.

Il est entendu que l'invention n'est pas limitée

aux modes de réalisation préférés décrits ci-dessus à titre d'illus-

tration et que l'homme de l'art peut y apporter diverses modifica-

tions et divers changements sans toutefois s'écarter du cadre et de

l'esprit de l'invention.

TA B LEAU I

lGin 1-GII-RH Aminoacide Temps de rétention Fraction molaire Fraction molaire (min) Gin 19,98 0,84 Glu 23,42 * Val 41,88 1,02 GH-RH de saumon Aminoacide Aminoacide Temps de rétention (min) Fraction molaire Gln 19,98 Glu 23,92 0,73 Val 41,88 0,89 non décelé t t r 1 j ui ruj -à TAB LEAU Il lGln 16 l -M-RH Aminoacide Temps de rétention Fraction molaire (min) Gin 19,88 0,45

Glu 23,40 -

Val 41,88 0,79 GR-RH de saumon Aminoacide Temps de rétention ( Fraction molaire (min) Gin 19,88 Glu 23,40 0, 08 Val 41,88 0,67 ti ru r, w Oú UTO Mj 00 ic mu osú uo Tque Aull uoles aplidea (lin/su) apiqqil lui op Ho op qjjuvn Z) UOIIII Uvqoa M v- r- cm Ln Cu w m M a y Zia VI 9 CO 9 61'ú 81 9 t, oz e O 6 081 SúLi Zú GPG'16 Os Iggz pplzs L 8 '8 81 CúT ozi LOZ 419 8 pz, 58 101 oi 8168 61 L LI 094 L 09 09 T &Es OZL, os 9 ú 9 6 P 6; 9 il 61 P 84 L oc 118 ', z E is, oi 8698 TO &L 16 L ES 8 si LWO 801,8

9 L 4

91 FI oz 6 60 L el 01 quimu) si z 8 t, î: 85 I 1 o I (:ului) uolloaçu Tl vuuaxox (l M/'úlin/) Ho ua Uo T Ualua DUOD 9 )xda a;>,xn(j (Tm/ain/) Hg ue uoiquaqueauoo zs 1, OT 69 4 LI 081 ses E o Ip T 08 e 6 81 t 9 z ozi 061 8 066 ' L-1 LS'8 L 6 Sc zs csi os ú?-Z 48 ozoloz ú 19 IL ZO L 9 z,úú oc O 59 8 ú 96 ' l is 6 8 li's ZPCLZ si ILú 9 0891 vi 49 6 4 e le LL 9 ú 9 8 ú 19 O COP-L D (Ulm) auuçdo K cm/ai r() ulome:l np Ho ue uorqua:lueoua D u OTIOB uî,l eqade aeana ulom?:i np ilo ue uo T:zvx:lueouco pn M q- CM Ln cm % O ci Ai il y a 1 il y 1

TABLEAU V

Concentration en GH du tèmoin Durée après l'in Concentration en GH du temoin (p IU/ml) (/u IU/ml)Moyenne + jection (min) A B C D E F 14120 + 298 -1 S (avant 1660 24,43 1310 9775 723 Il injection)

21,22 + 3,40 15 33,60 25; 98 13,23 17,03 24795 12,55

16,33 + 1,99 30 24 > 25 18,25 13,95 16733 15,63 9755

,96 + 2,57 60 8,63 17,08 17,50 20,63

,98 + 1 > 54 120 19,10 17,35 19 > 23 900 15,95 15,25

19,79 + 2,64 180 26740 23760 11,38 24; 95 19,95 12,48

14,57 + 2,00 240 12748 11,13 13153 24,30 14725 11,75

Concentration en GH (p IU/ml) Duree après Concentration en GH (/u IU/ml) l'injection (min) Moyenne + Or G H I J K L 8149 + 0,62 -15 (avant 10,52 9, 36 8,56 6,32 7,20 8,96 l'injection)

9,04 + 0,68 15 10,04 9,76 7,20 11,52 7,64 8,08

24,87 + 8,19 30 9,80 7,72 34 84 8,36 30,68 57,80

58,11 + 12,84 60 56,52 47,00 63,40 115,36 21,48 44,88

19,70 + 2,75 120 22 > 48 29,32 23,56 18,08 13,24 11,52

9,71 + 0,34 180 10,08 9,72 10,56 10,24 9,48 8,20

,00 + 5,04 240 25,84 8 '36 30,00 36,48 7,80 11,52

12)52 + 0,92 300 12 36 12,08 10,32 16; 64 12,96 10,76

ta -J- ul r%) r'> -à

Claims (5)

REVENDICATIONS -R E V E N D I C A T I 0 N S

1 Nouvel heptadécapeptide caractérise en ce qu'il répond & la formule: HAsp-Thr-I Met-Arg-Cys-}let-Val-Gly-Arg Val-Tyr-Arg-Pro-Cys-Trp-Glx-Val-OH (I) dans laquelle Glx est Glu ou Gin, et ayant les propriétés physiques suivantes: ( 1) Spectre d'absorption UV: max 280 nm; ( 2) Réaction de Ehrlich, réaction de Sakaguchi et réaction de Pauly: positives; ( 3) Caractère basique; ( 4) Soluble dans l'eau, le méthanol et l'acide acétique, légèrement soluble dans l'acétate

d'ethyle, l'acétate de butyle, l'éther éthy-

lique, l'hexane, l'éther de pétrole, le benzène et le chloroforme; et ( 5) Etat physique: poudre blanche;

et ses sels.

2 Peptide selon la revendication 1, caractérisé

en ce que Glx est Glu.

3 Peptide selon la revendication 1, caractérise

en ce que Glx est Gln.

4 Nouveau médicament hormonal utle notamment pour, la libération de l'hormone de croissance, caracterisé en ce qu'il contient commea ingrédient actif un heptadécapeptide de formule I

selon la revendication i ou un de ses sels.

Médicament selon la revendication 4, caractérise

en ce que Glx est Glu.

6 Médicament selon la revendication 4, caractérisé

en ce que Glx est Gln.