FI97472C - Menetelmä terapeuttisesti käyttökelpoisten rapamysiinijohdannaisten valmistamiseksi anti-inflammatorisina ja antifungaalisina aineina - Google Patents

Description

97472

Menetelmä terapeuttisesti käyttökelpoisten rapamysiinijohdannaisten valmistamiseksi anti-inflammatorisina ja anti-fungaalisina aineina 5 Tämä keksintö koskee menetelmää terapeuttisesti

käyttökelpoisten rapamysiinijohdannaisten valmistamiseksi, joilla on kaava I

, cc

Qv X^O 0 ΜβΟ„Ζ (!)

15 HO^JIS 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 I

OMe jossa X, Y ja Z ovat ryhmiä -CO- tai -CHOH- ja ainakin 2 toisen ryhmistä X ja Z on oltava -CHOH-, ja kun Y on 3 -CHOH-, silloin X on -CHOH-, tai niiden farmaseuttisesti 4 hyväksyttävien suolojen valmistamiseksi.

5 Nämä rapamysiinistä saatavat kaavan I mukaiset yh- 6 disteet, joissa funktionaalinen ketoniryhmä tai -ryhmät 7 asemassa 15 tai 33, asemissa 15 ja 27, asemissa 15 ja 33 8 tai asemissa 15, 27 ja 33 on korvattu hydroksyyliryhmällä 9 tai -ryhmillä, ovat käyttökelpoisia kudossiirrännäisten 10 hylkimisen, autoimmuunisairauksien (so. lupuksen, nivel- 11 reuman, diabetes mellituksen, multippeliskleroosin), Can 12 dida albicans -infektioiden ja tulehdussairauksien hoidos- 13 sa.

14

Rapamysiini on makrosyklinen trieeniantibiootti, 15 jota tuottaa Streptomyces hygroscopicus ja jolla on todet- 16 tu olevan sientenvastaista aktiivisuutta, erityisesti vai- 2 97472 kutusta Candida albicansia vastaan, sekä in vitro että in vivo [C. Vezina et ai., J. Antibiot. 28 (1975) 721, S. N. Seghal et ai., J. Antibiot. 28 (1975) 727, H. A. Baker et ai., J. Antibiot. 31 (1978) 539, US-patenttijulkaisu 5 3 929 992 ja US-patenttijulkaisu 3 993 749],

Rapamysiinillä on osoitettu olevan yksinään (US-patentti julkaisu 4 885 171) tai pisibaniilin kanssa yhdistettynä (US-patenttijulkaisu 4 401 653) kasvaintenvastais-ta aktiivisuutta. R. Martel et ai. [Can. J. Physiol.

10 Pharmacol. 55 (1977) 48] paljastivat, että rapamysiini on tehokas kokeellisessa allergiaenkefalomyeliittimallissa, joka on multippeliskleroosille kehitetty malli, ja adju-vanttiartriittimallissa, joka on nivelreumalle kehitetty malli, ja esti tehokkaasti IgE:n kaltaisten vasta-aineiden 15 muodostumista.

Rapamysiinin immunosuppressiiviset vaikutukset on esitetty julkaisussa FASEB 3 (1989) 3411. Rapamysiinin on osoitettu olevan tehokas kudossiirrännäisten hylkimisen ehkäisemisessä (US-patenttijulkaisu 5 100 899). Myös mui-20 den makrosyklisten molekyylien, syklosporiini A:n ja FK- 506:n, on osoitettu olevan tehokkaita immunosuppressiivi-sina aineina ja siten käyttökelpoisia kudossiirrännäisten hylkimisen estossa [FASEB 3 (1989) 3411, FASEB 3 (1989) 5256 ja R. Y. Calne et ai., Lancet 1978, 1183].

25 Rapamysiinin mono- ja diasyloitujen johdannaisten (esteröityminen tapahtunut 28- ja 43-asemissa) on osoitettu olevan käyttökelpoisia antifungaalisina aineina (US-patentti julkaisu 4 316 885), ja niitä on käytetty rapamysiinin vesiliukoisten esiasteiden valmistamiseen (US-pa-30 tenttijulkaisu 4 650 803). Rapamysiinin numerointikäytän- töä on hiljattain muutettu; siksi Chemicals Abstractsin käyttämän nimeämistavan mukaan edellä kuvatut esteriryhmät sijaitsisivat 31- ja 42-asemissa.

Rapamysiinin ja demetoksirapamysiinin rakennetta on 35 tarkastettu julkaisuissa Canadian Journal of Chemistry 56 (1978) 2491 ja ibid. 60 (1982) 2046.

3 97472 Tämän keksinnön mukaisesti saatavat rapamysiinijohdannaiset ovat käyttökelpoisia immunosuppressiivisina, anti-inflammatorisina, antifungaalisina ja kasvaintenvas-taisina aineina, joten niitä voidaan käyttää kudossiirrän-5 näisten hylkimisen, autoimmuunisairauksien, Candida albicans -infektioiden ja tulehdussairauksien hoidossa.

Kaavan I piiriin kuuluvat myös farmaseuttisesti hyväksyttävät suolat, joita voidaan muodostaa epäorgaanisista kationeista, kuten esimerkiksi natriumista, kaliumista 10 ja vastaavista.

Keksinnön mukaiselle menetelmälle kaavan 1 mukaisten rapamysiinijohdannaisten valmistamiseksi on tunnusomaista, että rapamysini pelkistetään sopivalla pelkisti-mellä.

15 Di-isobutyylialumiinihydridi (DIBAL) tai muu saman kaltainen reagenssi pelkistää reaktio-olosuhteista riippuen rapamysiinin funktionaalisen ketoniryhmän, joka sijaitsee 15-asemassa, tai funktionaaliset ketoniryhmät, jotka sijaitsevat 15- ja 27-asemassa. Rapamysiinin 33-20 asemassa sijaitseva funktionaalinen ketoniryhmä pelkiste tään selektiivisesti natriumtriasetoksiboorihydridillä, reagenssilla, jonka on raportoitu pelkistävän selektiivisesti β-hydroksiketoneja pääasiallisesti anti-isomeeria tuottavalla tavalla [D. A. Evans, K. T. Chapman ja E. M.

. 25 Carreira, J. Amer. Chem. Soc. 110 (1988) 3560 - 3578].

<

Rapamysiinin pelkistys natriumtriasetoksiboorihydridillä tetrahydrofuraanissa (THF) tuottaa tulokseksi vastaavan 33-hydroksiyhdisteen eli 33-deokso-33-hydroksirapamysii-nin, joka on esitetty yhdisteenä II kaaviossa A. Päätuot-30 teenä syntyvä R-isomeeri saadaan erottamalla reaktiotuotteet kromatografisesti.

4 97472

Kaavio A: Rapamysiinin pelkistys 33-asemassa •'ΐ''

Il X _*0H

A>oh -"V*

5 s,l/° NaBH(0Ac>3 0"''"X°H

O' 33 f III I I

V> ^

II

Rapamysiini 33-deokso-33(R)- 10 hydroksirapamysiini

Rapamysiini voidaan pilkkoa hiilien C31 ja C32 välistä emäksellä, joka hajoaminen perustuu käänteiseen al-dolireaktioon. 33-asemassa sijaitsevan funktionaalisen 15 ketoniryhmän pelkistys eliminoi tämän hajoamistien.

Rapamysiinin pelkistys DIBALrllä THF:ssa -78 eC:ssa johtaa siihen, että 15-asemassa sijaitseva ketoniryhmä pelkistyy seuraavassa reaktiokaaviossa esitetyllä tavalla: 20 Kaavio B: Rapamysiinin pelkistys 15-asemassa or cr *.J f OMe oinrv

\An ° DIB AL HO^ X O

hoA --- T^O

-78°C H 0^1

Annettaessa reaktion jatkua -20 °C:ssa, sen jälkeen 35 kun DIBAL on lisätty -78 °C:ssa, 15- ja 27-asemassa si- 5 97472 jaitsevat ketoryhmät pelkistyvät ja saadaan 15,27-dioli, kuten kaaviossa C on esitetty.

Kaavio C: Rapamysiinin pelkistys 15- ja 27-asemas- 5 sa ...a: “ aVr·^ ojncv V^O ° DIB AL HO 1 o -20°C Hojf'3 is ¥

Kaaviossa C saatavat diastereomeerit erotetaan kromatografisin menetelmin, so. preparatiivisen HPLC-kromatografian avulla.

20 Rapamysiinin kahden karbomyyliryhmän X ja Z sekä kolmen karbomyyliryhmän X, Y ja Z pelkistys voidaan toteuttaa peräkkäisten pelkistysvaiheiden avulla. Lisäksi voidaan käyttää muita ammattimiehille tuttuja pelkistimiä selektiivisen pelkistyksen toteuttamiseksi näissä asemis-25 sa.

Immunosuppressiivista vaikutusta tutkittiin tavanomaisella farmakologisella in vitro -testausmenetelmällä lymfotyyttien proliferaation määrittämiseksi ja kahdella tavanomaisella farmakologisella in vivo -testausmenetel-30 mällä. Ensimmäinen in vivo -menetelmä oli PLN-testausmene-, telmä (PLN = polvitaipeen imusolmuke), jolla mitattiin 4 tämän keksinnön mukaisesti saatavien yhdisteiden vaikutusta sekalymfosyyttireaktioon, ja toisellä in vivo -menetelmällä tutkittiin pihti-ihosiirteen elinaikaa.

35 Tyypillisten esimerkkiyhdisteiden immunosuppressii- visten vaikutusten in vitro -mittaustapana käytettiin ko- 6 97472 mitogeenilla indusoiduun tymosyyttien proliferaatioon perustuvaa menetelmää (LAF). Lyhyesti kuvattuna normaalien BALB/c-hiirien kateenkorvasta saatuja soluja viljellään 72 tuntia PHA:n ja Il-l:n kanssa ja viimeisten 6 tunnin aika-5 na niissä synnytetään pulsseja tritiumilla leimatulla ty-midiinillä. Soluja viljellään rapamysiinin, syklosporiini A:n tai testiyhdisteen ollessa läsnä erilaisina pitoisuuksina ja ilman niiden läsnäoloa. Solut kerätään ja yhdistetään, ja määritetään radioaktiivisuus. Lymfosyyttien pro-10 liferaation inhibitio määritetään minuuttipulssimäärän prosentuaalisena muutoksena suhteessa lääkeaineella käsittelemättömiin vertailusoluihin. Tulokset ilmaistaan seu-raavan suhdeluvun avulla tai pitoisuuden 1 pmol/l aikaansaamana lymfosyyttien proliferaation prosentuaalisena in-15 hibitiona: H-vertailukateenkorvasolut - rapamysiinilla käsitellyt ^H-kateenkorvasolut 3 -a H-vertailukateenkorvasolut - testiyhdisteellä käsitellyt H-kateenkorvasolut 20

Sekalymfosyyttireaktio (MLR) tapahtuu, kun kudos-viljelmässä on yhdistetty geneettisesti erilaisista eläimistä peräisin olevia imusoluja. Kukin stimuloi toistaan emosolujen transformaatioon, josta on seurauksena kasvanut 25 DNA-tuotanto, jonka suuruus voidaan määrittää sisällyttä mällä mukaan tritiumilla leimattua tymidiiniä. Koska MLR:n stimulaatio on tärkeimpien kudosyhteensopivuusantigeenien erilaisuuden funktio, PLN-testi in vivo korreloi tarkasti isännän ja siirteen välisen hylkimisen kanssa. Lyhyesti 30 kuvattuna C3H-vastaanottajahiirien oikeaan takakäpälään injektoidaan BALB/c-luovuttajilta peräisin olevia säteily-tettyjä pernasoluja. Lääkeainetta annetaan päivittäin (p.o.) päivästä 0 päivään 4. Päivinä 3 ja 4 annetaan tritiumilla käsiteltyä tymidiiniä (i.p., b.i.d.). Päivänä 5 35 takakäpälän polvitaipeen imusolmukkeet poistetaan ja liuo tetaan ja niistä mitataan radioaktiivisuus. Vastaavat vasemman käpälän PLN:t toimivat vertailukohtana injektion 7 97472 kohteena olleen takakäpälän PLN:ille. Prosentuaalinen sup-pressio lasketaan käyttämällä allogeenisena vertailukohtana lääkeaineella käsittelemättömiä eläimiä. Rapamysiini sai annoksena 6 mg/kg (p.o.) aikaan 86-%:isen eston, kun 5 sen sijaan syklosporiini A sai aikaan samansuuruisena annoksena 43-%:isen eston. Tulokset ilmaistaan seuraavan suhdeluvun avulla: C3H-vertailuhilrien ^H-PLN-solut - rapamysiinilltt käsiteltyjen C3H-hlirien ^H-PLN-solut 10 - C3H-vertailuhlirien ^H-PLN-solut - testlyhdlsteellä käsiteltyjen c3H-hilrien ^H-PLN-solut

Toinen in vivo -testausmenetelmä on tarkoitettu urospuolisilta DBA/2-luovuttajilta urospuolisille BALB/c-15 vastaanottajille siirretyn pihti-ihosiirteen elinajan määrittämiseen. Menetelmä on esitetty julkaisussa R. E. Billingham ja P. B. Medawar, J. Exp. Biol. 28 (1951) 385 -402. Lyhyesti kuvattuna luovuttajalta peräisin oleva pih-ti-ihosiirre siirretään homograftiksi vastaanottajan sel-20 kään, ja samalla alueella käytetään vertailukohtana auto-graftia. Vastaanottajia käsitellään intraperitoneaalisesti erilaisilla pitoisuuksilla joko syklosporiini Aita, joka toimii vertailutestiyhdisteenä, tai varsinaista testiyh-distettä. Hylkimisen vertailukohtana toimivat käsittele-25 mättömät vastaanottajat. Siirrettä tarkkaillaan päivittäin ja havainnot rekisteröidään, kunnes siirre muuttuu kuivaksi ja muodostaa mustuneen ruven. Tämä katsotaan hyl-kimispäiväksi. Siirteen keskimääräistä elinaikaa (vuoro-kausimäärä ± standardipoikkeama) lääkeaineella käsitellys-30 sä ryhmässä verrataan vertailuryhmään.

Seuraavassa taulukossa on esitetty yhteenveto keksinnön mukaisesti saatavilla yhdisteillä näissä standardi-• testeissä saavutetuista tuloksista.

• · 8 97472

Taulukko I

Yhdiste LAF1 PLN2 Ihosiirre3

Esimerkki 1 0,58 -2,47 (p.o.), -0,07 (i.p.)9,8 ± 1,0

Esimerkki 2 0,67 - 9,2+0,41 5 Esimerkki 3 0,84 0,92 i.p. 9,5±5,5

Esimerkki 4 4,7 0,59 10,0

Rapamysiini 3,3 1 12,5 1 IC50 (nmol/1) 10 2 Aktiivisuus suhteessa rapamysiiniin 3 Keskimääräinen elinaika (vrk) Näiden farmakologisten standarditestien tulokset havainnollistavat keksinnön mukaisesti saatavien yhdistei-15 den immunosuppressiivista vaikutusta sekä in vitro että in vivo. Positiiviset suhdeluvut LAF- ja PLN-testissä ovat osoitus T-solujen proliferaation estämisestä. Koska siirrettyjen pihti-ihosiirteiden tapauksessa ilmenee tyypillisesti hylkimistä 6-7 vuorokauden kuluessa, ellei käytetä 20 immunosuppresiivista ainetta, ihosiirteen pidentynyt elin aika, kun eläimiä hoidetaan tämän keksinnön mukaisilla yhdisteillä, on lisäosoitus niiden käyttökelpoisuudesta immunosuppressiivisina aineina.

Keksinnön mukaisesti saatavien yhdisteiden vaikutus 25 sieniä vastaan määritettiin viidellä Candida albicans -kannalla käyttäen inhibition mittaamiseen maljatestausme-netelmää. Seuraava kuvaa tyypillistä käytettyä menetette-lytapaa. Testattava yhdiste sijoitettiin pyöreille 0,6 cm:n kiekoille, jotka oli steriloitu ja kuivattu, ja 30 sen annettiin kuivua. Agarmaljoihin inokuloitiin sieniä ja niiden annettiin jähmettyä. Impregnoidut kiekot sijoitet-tiin siirrostetun agarin pinnalle ja maljoja inkuboitiin tietynlaisen viljelmän saavuttamisen vaatima aika. Tulokset ilmaistaan kasvua inhiboivana MIC:nä (pg/ml). Tämän 35 testin tulokset osoittivat keksinnön mukaisesti saatavilla yhdisteillä olevan sientenvastaista aktiivisuutta.

« » 9 97472

Esimerkkien 1 ja 4 mukaisten yhdisteiden pienimmät inhibitoriset pitoisuudet (50 %) viittä Candida albicans -kantaa vastaan olivat seuraavat:

5 Taulukko II

Aktiivisuus Candida-sukua vastaan (pg/ml)*

Yhdiste ATCC10231 ATCC38246 ATCC38247 ATCC38248 3669

Esimerkki 1 0,025 0,2 0,025 0,05 0,2

Rapamysiini 0,003 0,025 0,003 0,006 0,025 10

Esimerkki 4 0,05 >0,4 0,03 0,006 0,25

Rapamysiini 0,03 0,75 0,1 0,2 0,4

Pienin inhibitorinen pitoisuus (50 %), vertailukohtana 15 testiyhdisteelle käytettiin rapamysiiniä.

Näiden farmakologisten standarditestien tulosten perusteella keksinnön mukaisesti saatavat yhdisteet ovat käyttökelpoisia kudossiirrännäisten hylkimisen, kuten esi-20 merkiksi sydän-, munuais-, maksa-, selkäydin- ja ihosiir-rännäisten hylkimisen, autoimmuunisairauksien, kuten esimerkiksi lupuksen, nivelreuman, diabetes mellituksen, lihasheikkouden ja multippeliskleroosin, tulehdussairauksien, kuten esimerkiksi psoriasiksen, ihitulehduksen, roh-25 tuman, seborrean ja inflammatorisen suolistosairauden, 4 sekä sieni-infektioiden hoidossa.

Keksinnön mukaisesti saatavia yhdisteitä voidaan antaa niiden tarpeessa olevalle nisäkkäälle pelkältään tai yhdessä farmaseuttisen kantaja-aineen kanssa. Farmaseutti-30 nen kantaja-aine voi olla kiinteä tai nestemäinen ja vaikuttavan yhdisteen määrän pitää olla terapeuttisesti vaikuttava määrä.

Farmaseuttinen koostumus on edullisesti annostus-yksikkömuodossa, esimerkiksi tabletteina tai kapseleina.

35 Sellaisessa muodossa koostumus voidaan jakaa yksikköannok- - « 10 97472 siin, jotka sisältävät sopivia määriä vaikuttavaa aineosaa; annostusyksikkömuodot voivat olla pakattuja koostumuksia, esimerkiksi pakattuja pulvereita, pieniä lääkepul-loja, ampulleja, esitäytettyjä ruiskuja tai nestettä si-5 sältäviä annospusseja. Annostusyksikkömuoto voi olla esimerkiksi kapseli tai tabletti itsessään, tai se voi koostua sopivasta määrästä pakatussa muodossa olevaa sellaista koostumusta. Hoitavan lääkäri täytyy määrätä hoidossa käytettävä annostus subjektiivisesti.

10 Tämän keksinnön mukaisesti saatavia yhdisteitä voi daan lisäksi käyttää liuoksen, voiteen tai lotionin muodossa sekoittamalla farmaseuttisesti hyväksyttävien väliaineiden kanssa, joka liuos, voide tai lotion sisältää 0,1 - 0,5 %, edullisesti 2 %, vaikuttavaa yhdistettä ja 15 joka voidaan antaa sienen infektoimalle alueelle.

Seuraavat esimerkit valaisevat tämän keksinnön mukaista yhdisteiden valmistusta:

Esimerkki 1 15-deokso-15-hydroksirapamysi ini 20 Liuokseen, joka sisälsi rapamysiiniä (750 mg, 821 ymol) kuivassa THF:ssa (15 ml), lisättiin -78 °C:ssa pisaroittain DIBAL:n heksaaniliuosta (1,0 M, 3,6 ml, 3,6 mmol). Tunnin kuluttua reaktioseokseen lisättiin 1,0 N HCl:a alumiinisuolojen liuottamiseksi. Vesiliuos uutettiin 25 kolmesti etyyliasetaatilla, ja yhdistetyt orgaaniset ker- i rokset pestiin kylläisellä natriumkloridiliuoksella, kuivattiin natriumsulfaatilla ja haihdutettiin alipaineessa, jolloin saatiin väritöntä läpikuultavaa kiinteätä ainetta. Jäännös kiteytettiin uudelleen di-isopropyylieetterin ja 30 heksaanin seoksesta, jolloin saatiin suodatuksen jälkeen 275 mg (37 %) 15-deokso-15-hydroksirapamysiiniä, sp. 118 -122 °C.

Spektritiedot olivat seuraavat: :H-NMR (CDC13, 400 MHz): δ 4,42 (d, 1 H, -OH), 4,17 (leveä s, 1 H, ano-35 meerinen OH), 3,40 (s, 3 H, 0CH3), 3,39 (s, 3 H, 0CH3),

II

11 97472 3,14 (s, 3 H, OCH3), 1,75 (s, 3 H, CH3C=C), 1,60 (s, 3 H, CH3C=C). 13C-NMR (CDC13, 100 MHz): δ 216,0, 209,0, 174,5, 169,9. IR (KBr): 3440, 2940, 2860, 1740, 1720, 1630, 1450, 1380, 1195, 1090 cm'1. MS (-FAB): 914 (M - H), 592, 339, 5 184, 168 (100).

Yhdisteen C51H81N013 analyysi:

Laskettu: C 66,86; H 8,91; N 1,53 Todettu: C 66,46; H 9,03; N 1,36 Esimerkki 2 10 15,27-dideokso-15,27-dihydroksirapamysiini

Liuokseen, joka sisälsi rapamysiiniä (1,43 g, 1,56 mmol) kuivassa THF:ssa (20 ml), lisättiin -78 °C:ssa pisaroittain DIBAL:n tolueeniliuosta (1,0 M, 6,87 ml, 6,87 mmol). Reaktioseos lämmitettiin 4 tunnin aikana hi-15 taasti -20 °C:seen, ja reaktio tukahdutettiin sitten sekoittamalla sitä 1,0 N HCl:n päällä 20 minuuttia. Reaktio-seos uutettiin kolmesti etyyliasetaatilla, ja orgaaniset kerrokset yhdistettiin, pestiin kylläisellä natriumklori-diliuoksella, kuivattiin natriumsulfaatilla, suodatettiin 20 ja haihdutettiin alipaineessa, jolloin saatiin vaahtomais-ta kiinteätä ainetta. Jäännös puhdistettiin HPLC-kromato-grafian avulla (5 cm:n Dynamax-silikageelipylväs, 100-%:inen etyyliasetaatti, 35 ml/min), jolloin saatiin 90 mg (6 %) 15,27-dideokso-15,27-dihydroksirapamysiiniä. 25 Spektritiedot olivat seuraavat: 1H-NMR (CDC13, 400 MHz): 6 4,35 (m, 1 H, -OH), 4,17 (leveä s, 1 H, anomeerinen OH), 3,39 (s, 3 H, 0CH3), 3,33 (s, 3 H, 0CH3), 3,12 (s, 3 H, 0CH3), 1,71 (s, 3 H, CH3C=C), 1,58 (s, 3 H, CH3OC). IR (KBr): 3435, 2930, 2870, 1740, 1720, 1640, 1450, 1380, 30 1195, 1090 cm'1. MS (-FAB): 917 (M').

Yhdisteen C51H83N013♦ 2H20 analyysi:

Laskettu: C 64,19; H 9,19; N 1,47 Todettu: C 64,07; H 8,28; N 1,62 12 97472

Esimerkki 3 15,27-dideokso-15,27-dihydroksirapamysiini Edellä kuvatussa proseduurissa kerättiin talteen myös toinen jae, 60 mg (4 %) 15,27-dideokso-15,27-dihyd-5 roksirapamysiiniä.

Spektritiedot olivat seuraavat: ’n-NMR (CDC13, 400 MHz): δ 4,39 (m, 1 H, -OH), 4,21 (m, 1 H, anomeerinen OH), 3,41 (s, 3 H, OCH3), 3,40 (s, 3 H, 0CH3), 3,15 (s, 3 H, OCH3), 1,73 (s, 3 H, CH3C=C), 1,60 (s, 3 H, CH3C=C). 10 IR (KBr): 3440, 2930, 2880, 1740, 1720, 1640, 1450, 1380, 1190, 1090 cm'1. MS (-FAB): 917 (M'), 359, 168 (100). Yhdisteen C51H83N013 · 1,5H20 analyysi:

Laskettu: C 64,80; H 9,17; N 1,48 Todettu: C 64,69; H 8,86; N 1,59 15 Esimerkki 4 33-deokso-33-hydroksirapamysiini

Liuokseen, joka sisälsi rapamysiiniä (1,05 g, 1,15 mmol) tetrahydrofuraanissa (40 ml), lisättiin jauhettua natriumtriasetoksiboorihydridiä (0,52 g, 2,46 mmol) ja 20 seosta sekoitettiin typen alla huoneen lämpötilassa 2 tuntia. Sen jälkeen reaktioseosta säilytettiin -20 °C:ssa 7 vuorokautta. TLC osoitti reagointiasteeksi noin 70 %, joten reaktioseokselle tehtiin partitio dietyylieetterin (50 ml) ja 1 N HCl:n (50 ml) kesken. Orgaaninen kerros 25 pestiin kylläisellä natriumkloridiliuoksella (50 ml) ja se kuivattiin (MgS04), väkevöitiin ja käsiteltiin kromatogra-fisesti silikageelillä (3,9 x 15 cm, etyyliasetaatti). Reagoimatonta rapamysiiniä sisältävät tuotejakeet yhdistettiin ja puhdistettiin preparatiivisen HPLC:n avulla 30 [silikageeli (8 pm), 4,1 mm x 30 cm, THF-heksaaniseos (1:1)]. Puhtaat jakeet yhdistettiin ja liuotettiin vesi-metanoliseokseen. Seos väkevöitiin kiteytymisen aikaansaamiseksi ja jauhe erotettiin suodattamalla, jolloin saatiin 200 mg R-isomeeriä. Spektritiedot olivat seuraavat: IR 35 (KBr): 1680, 1730, 2920, 3430 cm'1. 1H-NMR (CDC13): δ 1,28

II

13 97472 (t, 3 H, J = 7,14 Hz), 1,65 (s, 3 H), 1,74 (s, 3 H), 3,14 (s, 3 H), 3,34 (s, 3 H), 3,41 (s, 3 H), 4,20 (g, 2 H, J « 7,14 Hz), 4,30 (dd, 2 H). MS (-FAB, m/z): 999 (94 %), 590 (15 %), 407 (16 %), 379 (4 %), 253 (6 %), 167 (100 %).

5 Yhdisteen C55H85N015*0, 5H20 analyysi:

Laskettu: C 65,45; H 8,59; N 1,39 Todettu: C 65,29; H 8,64; N 1,60

Esimerkki 5 15,27,33-trideokso-15,27,33-trihydroksirapamysiini 10 Otsikon mukainen yhdiste saatiin esimerkeissä 2 ja 3 valmistetusta 15,27-dideokso-15,27-dihydroksirapamysii-nistä esimerkin 4 mukaisia pelkistysmenettelytapoja noudattaen.

Esimerkki 6 15 15,33-dideokso-15,33-dihydroksirapamysiini

Otsikon mukainen yhdiste saatiin esimerkissä 1 valmistetusta 15-deokso-15-hydroksirapamysiinistä esimerkin 4 mukaisia pelkistysmenettelytapoja noudattaen.

Claims (7)

14 97472

1. Menetelmä terapeuttisesti käyttökelpoisten rapa-mysiini johdannaisten valmistamiseksi, joilla on kaava I CT

10 CV "" VoH HOXl·0 ° OMe VN jossa X, Y ja Z ovat kukin -CO- tai -CHOH- ja ainakin toisen ryhmistä X ja Z on oltava -CHOH-, ja kun Y on -CHOH-, silloin X on -CHOH-, tai niiden farmaseuttisesti hyväksyt- 20 tävien suolojen valmistamiseksi, tunnettu siitä, että rapamysiini pelkistetään sopivalla pelkistimellä.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä 15-deokso-15-hydroksirapamysiinin tai sen farmaseuttisesti hyväksyttävän suolan valmistamiseksi, tunnettu 25 siitä, että rapamysiini pelkistetään di-isobutyylialumii-nihydridillä.

3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä 15,27-dideokso-15,27-dihydroksirapamysiinin tai sen farmaseuttisesti hyväksyttävän suolan valmistamiseksi, tunnet- 30. u siitä, että rapamysiini pelkistetään di-isobutyyli-alumiinihydridillä.

4. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä 33-deokso-33-hydroksirapamysiinin tai sen farmaseuttisesti hyväksyttävän suolan valmistamiseksi, tunnettu 35 siitä, että rapamysiini pelkistetään natriumtriasetoksi-boorihydridillä- 15 97472

5. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä 33-deokso-33(R)-hydroksirapamysiinin tai sen farmaseuttisesti hyväksyttävän suolan valmistamiseksi, tunnettu siitä, että rapamysiini pelkistetään natriumtriasetoksi- 5 boorihydridillä.

6. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä 15,33- dideokso-15,33-dihydroksirapamysiinin tai sen farmaseuttisesti hyväksyttävän suolan valmistamiseksi, tunnet-t u siitä, että rapamysiini pelkistetään ensin di-isobu- 10 tyylialumiinihydridillä ja sitten natriumtriasetoksiboori- hydridillä.

7. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, 15,27,33-trideokso-15,27,33-trihydroksirapamysiinin tai sen farmaseuttisesti hyväksyttävän suolan valmistamiseksi, 15 tunnettu siitä, että rapamysiini pelkistetään en sin di-isobutyylialumiinihydridillä ja sitten natriumtri-asetoksiboorihydridillä. m « 97472 16