FI95576B

FI95576B - Uusi menetelmä ksyloosin valmistamiseksi

Info

Publication number: FI95576B
Application number: FI903009A
Authority: FI
Inventors: Pierrick Duflot; Jean-Bernard Leleu; Jean-Jacques Caboche
Original assignee: Roquette Freres
Priority date: 1989-06-16
Filing date: 1990-06-15
Publication date: 1995-11-15
Also published as: KR910001067A; CA2019036C; DK0403392T3; US5238826A; BR9002828A; IE902172L; FR2648474B1; RU1838418C; JP2981257B2; DE69010999D1; FI903009A0; EP0403392B1; KR0157304B1; IE64306B1; ATE109209T1; EP0403392A3; EP0403392A2; IE902172A1; FI95576C; FR2648474A1

Description

95576

Uusi menetelmä ksyloosin valmistamiseksi Nytt förfarande för framställning av xylos 5

Keksintö kohdistuu menetelmään ksyloosin valmistamiseksi.

Alalla tunnetaan D-ksyloosin valmistaminen sellaisista raaka-aineista kuten koivupuusta, maissintähkistä, jyvien kuorista tai manteleista lähtien.

10

Kun nämä raaka-aineet alistetaan happamaan hydrolyysiin erittäin rajuissa lämpötila- ja paineolosuhteissa, niin ksylaanit, jotka ovat D-ksyloosin polymeerejä, saadaan hajoamaan ksyloosiksi, jonka olennainen käyttömuoto on ksylitolin valmistaminen hydraamalla.

15 Tähän menetelmään liittyy kuitenkin lukuisia haittoja, joista merkittävimpinä voidaan mainita seuraavat: - raaka-aineen pieni ksylaanipitoisuus, joka johtaa pieneen ksyloosisaantoon (8- 20 15 % käytetyn raaka-aineen painosta laskien) sekä sivutuotteiden huomattavi en määrien muodostumiseen, joiden sivutuotteiden hyödyntäminen on vaikeata tai mahdotonta, ja joiden hävittäminen jätteenä on osoittautunut ympäristöä voimakkaasti saastuttavaksi, - ksyloosin ohella myös muiden sokereiden, eli glukoosista, mannoosista, 25 galaktoosista ja arabinoosista koostuvaan ryhmään kuuluvien sokereiden läsnäolo raaka-aineiden hydrolysaateissa, joiden muiden sokereiden fysikaaliset ominaisuudet ovat lähellä D-ksyloosin vastaavia ominaisuuksia (ja näiden sokereiden hydrautuneiden muotojen fysikaaliset ominaisuudet ovat lähellä ksylitolin ominaisuuksia), minkä seurauksena D-ksyloosin (tai mahdollisesti 30 ksylitolin) erottaminen on hyvin vaikeata; samoin galaktitolin, jota esiintyy tavallisesti hydratuissa puuhydrolysaateissa, ja joka kiteytyy yhtäaikaa ksylitolin kanssa siirappeja väkevöitäessä, läsnäolo on epätoivottavaa, mikäli ksylitoli on tarkoitettu elintarvikkeisiin, koska mainittu galaktitoli saa aikaan harmaakaihia.

95576 2

Ranskalaisessa patenttijulkaisussa FR 2 099 311, jossa kuvataan menetelmä D-arabitolin valmistamiseksi etenkin glukoosia fermentoimalla, mainitaan, että D-arabitoli on tärkeä lähtöaine D-ksyloosin valmistamiseksi D-ksyluloosin kautta; tässä julkaisussa ei esitetä kuitenkaan lainkaan niitä menettelytapoja, joilla D-5 ksyluloosi voitaisiin muuntaa D-ksyloosiksi, joka on ainoa pentoosi (optisen isomeerinsa I^ksyloosin ohella), joka tuottaa 100-prosenttisesti ksylitolia sitä hydrattaessa.

D-ksyluloosin osittainen kemiallinen isomerointi D-ksyloosiksi on tosin mahdol-10 lista, mutta siihen liittyy haittana vaarallisten liuottimien välttämätön käyttö.

Entsymaattinen isomerointi vaikuttaa näin ollen edullisemmalta. Edelleen, Hochster ja Watson (National Research Council no. 3105 Ottawa, Kanada) ovat esimerkiksi toteuttaneet D-ksyluloosin isomeroinnin D-ksyloosiksi käyttäen 15 entsyymejä, jotka kykenevät muuntamaan D-ksyloosin D-ksyluloosiksi ja päinvas toin, mutta tässä menetetelmässä ei olla kuitenkaan eristetty D-ksyloosia erittäin puhtaassa muodossa, ja se on toteutettu sellaisissa lämpötila- ja etenkin pi-toisuusolosuhteissa, jotka tekevät menetelmän täysin sopimattomaksi teolliseen käyttöön.

20

Lisäksi näillä entsyymeillä toteutettu konversio on vain osittainen samoin kuin kemiallinen isomerointi; näillä isomeroinneilla saadaan D-ksyloosia saantona, joka on korkeintaan 75 %, ja näin ollen 25 % D-ksyluloosista menetetään väistämättä, koska se se muunnu D-ksyloosiksi.

25

Ranskalaisessa patenttijulkaisussa FR 2 177 588 ehdotetaan, että D-ksyloosin erottamiseksi D-ksyluloosista näitä kahta sokeria sisältävä siirappi käsitellään kromatografisesti bisulfiittimuotoisella anionihartsilla. Sokereiden erottuminen on hyvä näissä olosuhteissa; tähän tekniikkan liittyy kuitenkin se haitta, että osa 30 D-ksyloosista liittyy irroittamattomasti hartsiin, ja että viittä useamman peräkkäisen erotusvaiheen toteuttaminen on vaikeata ilman suorituskyvyn huomattavaa heikkenemistä [S.P. Olivier ja PJ. du Toit, Biotechnology and Bioengineering, voi. XXVIII, sivut 684-699 (1986)].

· · au i aitu hi ia : .

3 95576

Samoin vuonna 1972 japanilaisessa patenttijulkaisussa JP 47-13707 on ehdotettu, että ksylitolia valmistettaisiin käyttämättä välivaiheena ksyloosia hydraamalla suoraan D-ksyluloosia, jota on saatu glukoosia lähtöaineena käyttäneestä, kaksinkertaisesta aerobisesta fermentoinnista. Tämän menetelmän haittana on 5 se, että mainittu hydraus tuottaa vain 50 % ksylitolia sekä samalla 50 % D-arabitolia, jonka arabitolin erottaminen ksylitolista on vaikeata, koska sitä on läsnä näin suurina määrinä.

Näin ollen tähän saakka käytettävissä ei ole ollut sellaista menetelmää, jolla olisi 10 kyetty tuottamaan teollisessa mitassa D-ksyloosia tai ksylitolia riittävän puhtaana tai riittävän suurina saantoina ksyluloosista lähtien, jota ksyluloosia itseään ei saada kuin vain pieninä, noin 40 %:n saantoina D-glukoosista lähtien ja käyttäen välivaiheena D-arabitolia.

15 Keksinnön tavoitteena on siis erityisesti saada aikaan menetelmä D-ksyloosin valmistamiseksi D-ksyluloosista, jota on puolestaan saatu D-glukoosista lähtien, joka menetelmä tuottaa D-ksyloosia niin suurina saantoina ja niin puhtaana, että tätä monivaiheista, D-glukoosista lopullista tuotetta tuottavaa menetelmää voitaisiin soveltaa teollisesti.

20

Oheisessa keksinnössä onnistuttiin löytämään ratkaisu tähän yli 20 vuotta esillä olleeseen ongelmaan tekemällä se havainto, että erittäin puhdasta D-ksyloosia saatiin eristetyksi D-ksyloosin ja D-ksyluloosin välisestä seoksesta käyttämällä kationisilla zeoliittihartseilla toteutettua kromatografista käsittelyä, näiden 25 kationihartsien ollessa edullisia ja niiden ollessa erityisesti niitä hartseja, joita käytetään glukoosin ja fruktoosin kromatografiseen erottamiseen.

Näin ollen keksinnön mukainen menetelmä D-ksyloosin valmistamiseksi on tunnettu siitä, että 30 - ensimmäisessä vaiheessa D-ksyluloosisiirappi isomeroidaan entsymaattisesti, jolloin saadaan D-ksyloosin ja D-ksyluloosin seos; - toisessa vaiheessa tämä seos käsitellään kromatografisesti, jolloin saadaan vähintään kaksi fraktiota, joista yksi sisältää runsaasti D-ksyloosia (fraktio 95576 4 ja toinen sisältää runsaasti D-ksyluloosia (fraktio X2), • kolmannessa vaiheessa fraktio X2 kierrätetään takaisin isomerointivaiheeseen, ja D-ksyloosi otetaan talteen fraktiosta X1? joka voidaan kuitenkin johtaa myös 5 suoraan hydrausvaiheeseen.

D-ksyluloosia voidaan saada sinänsä tunnetulla tavalla, erityisesti hapettamalla mikrobiologisesti D-arabitolia, mikä onkin D-ksyluloosin edullinen valmistusmenetelmä, jota D-arabitolia saadaan D-glukoosin aerobisella fermentoinnilla.

10

Eräässä edullisessa suoritusmuodossa keksinnön mukainen menetelmä D-ksyloosin valmistamiseksi on tunnettu siitä, että lähtöaineena toimiva D-ksyluloo-si valmistetaan seuraavilla peräkkäisillä vaiheilla, joissa: 15 - D-glukoosisiirappia fermentoidaan aerobisesti Pichia-lajin osmofiilisella mikro-organismilla, joka muuntaa D-glukoosin D-arabitoliksi, - D-arabitolisiirappia fermentoidaan aerobisesti Acetobacter-. Gluconobakter-tai Klebsiella-lajin mikro-organismilla, joka tuottaa alkoholidehydrogenaasia, joka kykenee muuntamaan D-arabitolin D-ksyluloosiksi, 20 - D-ksyluloosisiirappiisomeroidaanglukoosi-isomeraasillataiksyloosi-isomeraa- silla, jolloin saadaan runsaasti D-ksyloosia sisältävää siirappia.

Glukoosin aerobinen fermentaatio voidaan korvata muunnoksella, jossa glukoosi muunnetaan hapettamalla glukonihapoksi, joka voidaan dekarboksyloida kal-25 siumsuolanaan niinkutsutulla RUFF:in menetelmällä, jolloin saadaan D-ara-binoosia (vrt. amerikkalainen patenttijulkaisu 3 755 294). Sitten D-arabinoosi hydrataan sinänsä tunnetulla tavalla D-arabitolin aikaansaamiseksi.

Ilmeisestä monimutkaisuudestaan huolimatta keksinnön mukaisella menetelmäl-30 lä, sen vaiheiden erityisellä yhdistelmällä, saadaan D-ksyloosia saantoina, jotka ovat yli 30 % lähtöaineena käytetystä D-glukoosista laskien, joka D-glukoosi on puolestaan yleisesti esiintyvä ja kohtuuhintainen raaka-aine.

Tekniikan nykytason mukaisiin menetelmiin verrattuna •I Mfc ! i * m 5 95576 - käytetyt lähtöainemäärät ja - läsnäolevien epäpuhtauksien määrä sekä D-ksyloosin ja näin ollen ksylitolin valmistuksessa syntyneiden sivutuotteiden tilavuus 5 on saatu selvästi pienemmiksi.

Muista eduista voidaan mainita - ettei raaka-aineen eli D-glukoosin saanto-ongelmia ole; 10 - että tätä raaka-ainetta voidaan käsitellä tavanomaisilla laitteistoilla, joiden ei täydy kestää erittäin suuria lämpötiloja, tai paineita eikä syövyttäviä väliaineita; - ettei saatu D-ksyloosi sisällä galaktoosia, jolloin hydraamalla saatu ksylitoli ei myöskään sisällä galaktitolia, ja jolloin sitä voidaan käyttää elintarvikkeissa.

15

Keksintö on ymmärrettävissä paremmin seuraavan kuvauksen, keksintöä rajoittamattomien esimerkkien sekä liitteenä olevan piirustuksen avulla, mainitun kuvauksen, piirustuksen ja mainittujen esimerkkien, jotka täydentävät toisiaan, liittyessä edullisiin suoritusmuotoihin.

20

Mainitussa piirustuksessa kuvio 1 esittää kaavamaisesti keksinnön mukaisen menetelmän toteuttamista; 25 kuviot 2-4 esittävät kaavamaisesti sellaisen laitteiston osia, jolla laitteistolla mainittu menetelmä voidaan toteuttaa.

Liitteenä olevan piirustuksen kuvio 1 esittää kaavamaisesti mainitun menetelmän toteuttamista vaihe vaiheelta siten, että 30 - vaiheessa M-, D-glukoosi muunnetaan D-arabitoliksi; - vaiheessa M2 D-arabitoli muunnetaan D-ksyluloosiksi; - vaiheessa M3 D-ksyluloosi isomeroidaan; - vaiheessa M4 isomeroitu siirappi käsitellään kromatografisesti; 95576 6 - runsaasti D-ksyloosia sisältävä siirappi (N,) ja runsaasti D-ksyluloosia sisältävä siirappi (N2) otetaan talteen; - runsaasti D-ksyluloosia sisältävä siirappi N2 kierrätetään takaisin vaiheeseen M3 linjaa P pitkin.

5

Glukoosin fermentoimiseen voidaan käyttää viljelyalustaa, jolla on seuraava koostumus: - dekstroosi 150-200 g/1 10 - orgaaninen typpi 2-4 g/1 (Nx6,25) (maissin liotuslientä tai hiivauutetta) - KH2P04 1-3 g/1 - MgS04.7H20 1-2 g/1 15 ja joka laitetaan fermentoriin, steriloidaan ja siihen siirrostetaan noin 10 % viljelmää, joka on saatu kasvattamalla 24 tunnin ajan Pichia-lajin mikro-organismia, esimerkiksi Pichia Ohmeri-kantaa no. 20209, joka on talletettu kantakokoel-maan ATCC (tai Pichia farinosa-kantaal. käyttämällä kasvatukseen esimerkiksi sellaista elatusalustaa, jolla on seuraava koostumus: 20 - glukoosi 50 g/1 - hiivauute 10 g/1 : - KH2P04 3 g/1 - MgS04.7H20 1 g/1.

25

Fermentoiminen toteutetaan noin 30 eC:n lämpötilassa 80-100 tunnin ajan ilmastaen alustaa nopeudella, joka vastaa 1-1,5 tilavuutta ilmaa viljelmän • tilavuutta kohden minuutissa, pH-arvon ollessa alueella 4-6, edullisesti noin 4,5, säilyttäen se edullisesti ammoniakin avulla, jolloin arabitolipitoisuudeksi saadaan 30 yleensä 65-90 g/1, tämän arabitolin muodostaessa 70-85 % viljelyalustassa läsnäolevista sokereista tämän fermentoinnin päättyessä.

Arabitolisaanto käytetystä glukoosista laskien on noin 40-50 %.

> I Ui t ft Iti | H4 7 95576

Sitten fermentorin koko sisältö (runsaasti arabitolia sisältävä fermentointiliemi) steriloidaan mikro-organismien tuhoamiseksi; tämän jälkeen D-arabitolin fermentoimiseksi alustaan lisätään jälleen (noin 10 %) siirrosteeksi Acetobacter suboxydans-viljelmää. joka on saatu viljelemällä tätä mikro-organismia noin 20 5 tunnin ajan alustassa, jonka koostumus on seuraava: - arabitoli 50 g/1 - sorbitoli 2 g/1 - hiivauute 2 g/1 10 - KH2P04 0,2 g/1 - MgS04.7H20 0,2 g/1

- CaC03 5 g/L

Runsaasti arabitolia sisältävä fermentointialusta puhdistetaan edullisesti sentrifu-15 goimalla tai suodattamalla ennen asetobakteerin siirrostamista siihen.

D-arabitolin fermentointi toteutetaan muita ravinteita lisäämättä alueella 20-40 °C olevassa lämpötilassa ilmastaen nopeudella, joka vastaa 1-1,5 tilavuutta ilmaa viljelmän tilavuutta kohden minuutissa, pH-arvon ollessa alueella 4,0-6,0 20 yleensä sellaisen ajanjakson ajan, jonka pituus on 24-48 tuntia, ja jonka päättyessä saadaan runsaasti D-ksyluloosia sisältävä fermentointiliemi, tämän D-ksyluloo-sin muodostaessa 70-85 % liemessä läsnäolevista sokereista tämän toisen * fermentoinnin päätyttyä.

25 Tässä vaiheessa läsnäolevat sokeriepäpuhtaudet koostuvat pääasiassa D-arabito- lista, jota asetobakteerit eivät onnistuneet hapettamaan, sekä ksylitolista, jota muodostui rinnan arabitolin kanssa ensimmäisen fermentoinnin aikana. Epäpuhtauksina on myös läsnä esimerkiksi sellaisia sokereita kuten lyksoosia sekä pieni määrä glukoosia tai muita erilaisia sakkarideja, joita oli läsnä epäpuhtauksina 30 lähtöaineena toimineessa dekstroosissa.

Fermentointiliemen, joka saadaan D-arabitolin fermentoinnin jälkeen, sokeri- koostumus on seuraava: 95576 8 - ksyluloosi 70-85 % - arabitoli 5-15 % - ksylitoli 1- 5 % - erilaiset sakkaridit 5-10 %.

5 Tämä fermentointiliemi voidaan puhdistaa sinänsä tunnetulla tavalla (suodattamalla, poistamalla väri aktiivihiilellä ja poistamalla suolat), minkä jälkeen se väkevöidään ennen isomerointivaihetta.

10 Mainittu puhdistaminen saattaa olla välttämätöntä, mikäli isomerointi toteutetaan jatkuvana immobilisoidun entsyymin avulla tulppavirtareaktorissa; tämä puhdistaminen on tarpeetonta silloin, kun isomerointi toteutetaan epäjatkuvana panosoperaationa vapaata entsyymiä käyttäen.

15 Isomerointivaiheessa voidaan käyttää sellaista kaupallisesti saatavaa ksyloosi-isomeraasia, jota käytetään runsaasti fruktoosia sisältävien maissisiirappien valmistamiseen, ja joista voidaan mainita - yhtiön Suomen Sokeri nimellä SPEZYME markkinoima entsyymi; 20 - oheisen hakijan valmistama, nimellä LYSASE G1 2000 tunnettu entsyymi (ranskalainen patentti FR 2 353 562).

Käytetty entsyymimäärä on edullisesti sellainen, että reaktion tasapaino saavutetaan 4-48 tunnissa; entsyymiä suojaavan aineen, esimerkiksi natriumbisulfiitin 25 ja/tai magnesiumsuolan läsnäolo on toivottavaa.

Isomerointi toteutetaan alueella 40-80 °C olevassa lämpötilassa ja alueella 6,0- 8,5 olevassa pH-arvossa.

30 Yleensä isomerointivaiheen parametrit valitaan siten, että isomeroinnista saadaan yli 53 % D-ksyloosia sisältävää siirappia.

Isomerointivaiheen päätyttyä saadun isomeroidun siirapin sokerikoostumus on yleensä seuraava: 9 95576 - ksyloosi 53-64 % - ksyluloosi 17-22 % - arabitoli 5-15 % - ksylitoli 1- 5 % 5 - erilaiset sakkaridit 5-10 %.

Yllättäen ollaan todettu, että glukoosin fermentoinnissa samanaikaisesti arabito-lin kanssa muodostuneen ja D-arabitolin fermentoinnissa muuntumatta jääneen ksylitolin läsnäolo ei häiritse ksyloosi-isomeraasin toimintaa, mikä nähdään siitä, 10 että ksyloosin suurimmat määrät ovat yhtäsuuria (noin 75 %) kuin ne määrät, jotka saatiin aikaisemmin puhtaan ksyloosin isomeroinnista.

Tämä havainto on sitäkin odottamattomampi otettaessa huomioon se, että julkaisussa Izumori ja Tuzaki, J. Ferment. Technol., voi. 66, no. 1, 33-36 (1988), 15 on kuvattu jo vuonna 1988, että ksylitoli on ksyloosi-isomeraasin kilpaileva inhibiittori; tämän julkaisun mukaan sen pelkkä läsnäolo isomeroitavissa siirapeissa häiritsee selvästi isomerointireaktiota, minkä seurauksena keksinnön mukaisen menetelmän toteuttaminen olisi mahdollista.

20 Isomeroinnin jälkeen saatu, runsaasti ksyloosia sisältävä siirappi voidaan puhdistaa poistamalla siitä suolat, minkä jälkeen se fraktioidaan kromatografisesti.

Tämä kromatografinen fraktiointi voidaan toteuttaa sinänsä tunnetulla tavalla, epäjatkuvana tai jatkuvana operaationa (simuloitu liikkuva peti), käyttäen 25 adsorboivina aineita vahvasti happamia kationihartseja, joihin on edullisesti sidottu alkali- tai maa-alkali-ioneja, tai kationisia zeoliitteja, joihin on sidottu NH4+-, Na+-, K+- ja Ca2+-, Ba2+- ja muita ioneja.

Esimerkkejä tällaisista kromatografisista erotusmenetelmistä on esitetty seuraa-30 vissa patenttijulkaisuissa: US 3 044 904, US 3 416 961, US 3 692 582, FR 2 391 754, FR 2 099 336, US 2 985 589, US 4 024 331, US 4 226 977, US 4 293 346, US 4 157 267, US 4 182 633, US 4 332 623, US 4 405 445, US 4 412 866 ja US 4 422 881.

95576 10

Erään edullisen suoritusmuodon mukaisesti kromatografinen erotusvaihe toteutetaan käyttäen menetelmää ja laitteistoa, jotka on kuvattu patenttijulkaisussa US 4 422 8S1 ja vastaavassa, oheiselle hakijalle myönnetyssä ranskalaisessa patenttihakemuksessa FR 2 454 830.

5

Olipa käytetty kromatografinen erotusmenetelmä mikä tahansa, adsorbanttina käytetään kationista materiaalia, edullisesti vahvaa kationihartsia, jota käytetään vieläkin edullisemmin kalsiumionimuodossa, ja jossa hartsissa divinyylibentseenin osuus on noin 4-10 %.

10

Esimerkeissä selitetään ja havainnollistetaan kromatografiavaiheen parametrien valintaa, joista parametreista voidaan mainita erityisesti: - eluointinopeus, 15 - isomeroidun siirapin syöttönopeus, - runsaasti ksyloosia sisältävän fraktion ulostulonopeus, - desorboivan vyöhykkeen, adsorboivan vyöhykkeen ja rikastavan vyöhykkeen koostumus.

20 Parametrit valitaan siten, että fraktio X, saadaan sisältämään D-ksyloosia 60-95 %, edullisesti 75-90 %, ja edelleen edullisemmin 80-85 %, D-ksyluloosin pitoisuuden ollessa alle 25 %, edullisesti alle 15 %, mainittujen prosentuaalisten osuuksien ollessa painoprosentteja kuiva-aineesta.

25 Kun kromatografiavaihe toteutetaan käyttämällä patenttijulkaisussa US

4 422 811 kuvattua menetelmää ja laitteistoa ja kun käytetty adsorbantti on kationihartsia, jonka hiukkaskoko on pieni, johon on muodostettu ristisidoksia sisällyttämällä siihen 6 % divinyylibentseeniä, ja jota käytetään kalsiummuotoi-sena, niin näihin tuloksiin pääsemiseksi mainitut parametrit valitaan seuraavalla 30 tavalla: - eluoitumisnopeus 125-500 1/h/m3 adsorbenttia; - isomeroidun siirapin syöttönopeus 15-60 1/h/m3 adsorbenttia; - runsaasti ksyloosia sisältävän fraktion ulostulonopeus 30-120 1/h/m3.

· »H.1 Kili hlllt ' i 11 95576

Kromatografiavaihe johtaa lisäksi samalla erittäin runsaasti ksyluloosia sisältävän fraktion X2 muodostumiseen sekä sellaisen fraktion X3 muodostumiseen, joka X3 sisältää kationisen materiaalin hyvin voimakkaasti adsorboimat tuotteet tai 5 päinvastoin, sen hylkimät tuotteet.

Kationisen materiaalin voimakkaasti adsorboimista tuotteista voidaan mainita erityisesti ksylitoli ja arabitoli, ja sen voimakkaasti hylkimistä tuotteista erilaiset sakkaridit.

10

Erittäin runsaasti D-ksyluloosia sisältävällä fraktiolla X2 on edullisesti seuraava koostumus, mainittujen prosentuaalisten osuuksien ollessa painoprosentteja kuiva-aineesta: 15 - 50-80 % ksyluloosia, - 20-50 % ksyloosia, - 0- 5 % arabitolia ja ksylitolia.

Keksinnön mukaisesti tämä erittäin runsaasti D-ksyluloosia sisältävä fraktio 20 kierrätetään takaisin entsymaattiseen isomerointivaiheeseen.

Kromatografisen erotusvaiheen ja kierrätysvaiheen toteuttaminen keksinnön mukaisesti on tehnyt mahdolliseksi D-ksyluloosin muuntamisen D-ksyloosiksi erittäin hyvinä saantoina, saadun D-ksyloosin ollessa erittäin puhdasta, minkä 25 ansiosta D-ksyloosin valmistus D-glukoosista lähtien, D-ksyluloosin toimiessa välituotteena, on saatu taloudellisesti kannattavaksi.

Fraktio X3, johon ovat rikastuneet ne tuotteet, joita hartsi adsorboi erittäin voimakkaasti, tai päinvastoin, joita hartsi hylkii erittäin voimakkaasti, poistetaan 30 järjestelmästä.

D-ksyloosi otetaan talteen hyvin runsaasti D-ksyloosia sisältävästä fraktiosta Xv Fraktio X, voidaan yhtä hyvin hydrata suoraan, erityisesti katalyytin avulla.

95576 12 D-ksyloosin talteenotto fraktiosta X1 voidaan toteuttaa joko: - väkevöimällä siirappi kemiallisesti puhtaan D-ksyloosin erottamiseksi kiteyttämällä, jolloin muodostuneet emävedet voidaan edullisesti kierrättää takaisin 5 kromatografiavaiheeseen, tai - poistamalla vesi täydellisesti siirapista teknistä laatua olevan D-ksyloosin saamiseksi.

Mikäli fraktio X, päätetään hydrata suoraan, niin tällöin toimitaan alalla jo 10 tunnetuissa olosuhteissa, käyttäen katalyyttinä erityisesti ruteniumia tai Raney-nikkeliä; tällainen suora hydraus toteutetaan edullisesti silloin, kun tavoitteena on ksylitolin valmistus; hydraaminen voidaan toteuttaa käyttämällä katalyyttinä Raney-nikkeliä, alueella 20-80 kg/cm2 olevassa vetypaineessa ja noin alueella 80-130 "C olevassa lämpötilassa.

15

Saadulla ksylitolisiirapilla on seuraava koostumus: - ksylitoli 87-97 % - arabitoli 3-13 %.

20

Erittäin suuri ksylitolipitoisuus tekee mahdolliseksi ksylitolin erottamisen kiteytyksellä suoraan ksylitolin vesiliuoksesta siten, että ksylitolin saanto ja puhtaus ovat erittäin suuret, ja että kiteytyksen emävedet saadaan käytännöllisesti katsoen ksylitolivapaiksi toteuttamalla useita peräkkäisiä kiteytyksiä, kuten 25 esimerkiksi ranskalaisessa patenttijulkaisussa FR 2 202 069 on kuvattu.

Esimerkki D-glukoosin aerobinen fermentointivaihe 30

Fermentoriin, jonka kokonaiskapasiteetti on 10 m3, laitettiin: - 1200 kg kiteistä dekstroosi-monohydraattia, - 16 kg hiivauutetta, 13 95576 8 kg yhdistettä KH2P04, 8 kg yhdistettä MgS04*7H20.

Sen jälkeen, kun viljelyalusta oli steriloitu ja jäähdytetty 30 eC:n lämpötilaan, 5 fermentoriin siirrostettiin 8001 edeltäkäsin viljelemällä saatua, 24 tunnin ikäistä Pichia Ohmeri-viljelmää (ATCC 20209), joka on esimerkiksi kuvattu ranskalaisessa patenttijulkaisussa FR 2 009 331.

Viljelyalustaa ilmastettiin koko sen ajanjakson ajan, jolloin glukoosia muunnet-10 tiin arabitoliksi, eli 90 tunnin ajan nopeudella 130 Nm3 tunnissa, säätäen pH arvoon 4,5 ammoniakkia lisäämällä.

D-arabitolin aerobinen fermentointivaihe 15 Sen jälkeen, kun tämä ensimmäinen vaihe oli toteutettu, fermentorin sisältö steriloitiin; sitten fermentointialustaan siirrostettiin, siihen muita ravinteita lisäämättä ja 30 °C:n lämpötilaan jäähdyttämisen jälkeen, 800 1 edeltäkäsin viljelemällä saatua, 24 tunnin ikäistä Acetobacter suboxydans-viljelmää. joka oli saatu viljelemällä alustassa, jonka koostumus oli seuraava: 20 - arabitoli 50 g/1 - sorbitoli 2 g/1 - hiivauute 2 g/1 - KH2P04 0,2 g/1 25 - MgS04.7H20 0,2 g/1.

Fermentoinnin päätyttyä viljelyalusta suodatettiin, siitä poistettiin väri aktiivihiilellä ja suolat ioninvaihtohartseilla.

30 Tämän puhdistetun siirapin sokerikoostumus todettiin seuraavaksi: - ksyluloosi 80,7 % - arabitoli 6,5 % - ksylitoli 3,8 % 95576 14 - erilaiset sakkaridit 9 %.

Tämän saadun siirapin saanto oli 48 % raaka-aineena käytetystä glukoosista laskien, mikä vastaa puhtaan ksyluloosin 40 %:sta saantoa käytetystä glukoosista 5 laskien.

Isomerointivaihe D-arabitolin aerobisen fermentointivaiheen jälkeen saatu puhdistettu siirappi 10 väkevöitiin siten, että sen kiintoainepitoisuus oli 45 %, minkä jälkeen se siirrettiin yhtiön Suomen Sokeri nimellä SPEZYME markkinoimaa glukoosi-isomeraa-sia sisältävään astiaan, jonka lämpötila pidettiin arvossa 55 °C. Käytetty entsyy-mimäärä oli 2 kg entsyymiä/2 m3 astiassa ollutta siirappia. Siirapin pH säädettiin arvoon 7,0, ja siinä oli läsnä lisäksi myös 0,7 ml 30 % NaHS03-liuosta sekä 1 g/1 15 MgS04»7H20, minkä jälkeen isomerointireaktion annettiin edetä 24 tunnin ajan.

Tämän vaiheen päätyttyä saadun siirapin koostumus oli seuraava: - ksyloosi 60 % 20 - ksyluloosi 20 % - arabitoli 6,5 % - ksylitoli 3,8 % - muut sakkaridit 9,7 %.

25 Näin ollen ksyluloosin ja ksyloosin välinen suhde tässä siirapissa on 25 %, joka on entsyymin normaali tasapainoarvo, kun isomerointi toteutetaan lähtien puhtaasta kiteisestä ksyloosista.

Näin ollen todetaan, kuten edellä jo mainittiin, ettei ksylitoli toimi isomeroivasta 30 entsyymistä kilpailevana inhibiittorina.

Kromatografinen fraktiointivaihe Tämän jälkeen toteutetaan runsaasti ksyloosia sisältävän isomeroidun siirapin 15 95576 fraktiointi jatkuvatoimisessa kromatografisessa erotuslaitteistossa, jonka rakenne ja toiminta on kuvattu yksityiskohtaisesti patenttijulkaisussa US 4 422 881 sekä vastaavassa ranskalaisessa patenttijulkaisussa FR 2 454 830. Näitä yksityiskohtia ei olla toistettu ohessa kuin siinä määrin, joka on tarpeen kuvauksen ymmärtä-5 miseksi.

Kuten mainitun amerikkalaisen patenttijulkaisun kuviosta 2 (liitetty oheen kuvioksi 2, jonka yksityiskohtaisen kuvauksen suhteen viitataan mainittuun amerikkalaiseen patenttijulkaisuun) nähdään, tämä laitteisto käsittää kahdeksan 10 kolonnia tai vaihetta C,-C8, joiden kunkin tilavuus on 200 litraa, ja jotka kukin sisältävät adsorboivana aineena kalsiummuotoista vahvaa C204-2078 Duolite-tyyppistä kationihartsia, jonka hiukkaskoko on pieni (0,2-0,4 mm).

Sopivasti sijoitettujen sähköventtiilien avulla tähän laitteistoon saadaan aikaan 15 kaksivaiheinen desorptiovyöhyke I, kolmivaiheinen adsorptiovyöhyke Π ja kolmivaiheinen vyöhyke ΠΙ heikosti adsorboituneen ksyloosin ja voimakkaasti adsorboituneen ksylitolin ja arabitolin rikastamiseksi ja erottamiseksi, kuten kuviosta 3 nähdään. Kuvio 3 esittää kaavamaisesti kuvion 2 mukaista laitteistoa, josta on esitetty vain: 20 - kolonnit Q-Q, - suljinlaite, tässä tapauksessa sähköventtiili 106, - linjat isomeroidun, runsaasti ksyloosia sisältävän, fraktioitavan siirapin ja veden syöttämiseksi, jotka linjat on vastaavasti merkitty numeroilla 14 ja 128, 25 sekä - toisaalta linja 148 runsaasti ksyluloosia sisältävän siirapin (fraktio X2) ulosjoh-tamiseksi ja toisaalta linja 146 ksylitoli-arabitolin (fraktio X3), muiden sakkaridien (fraktio X3) ja ksyloosin (fraktio X^ peräkkäiseksi ulosjohtami-seksi.

30

Suljinlaitteen 106 (erityisesti sähköventtiilin) avulla toisaalta vyöhyke III, joka on rikastusvyöhyke, ja jonka päästä saadaan peräkkäin talteen voimakkaasti adsorboitunut ksylitoli-arabitoli-jäännös, muut erilaiset sakkaridit ja sitten runsaasti ksyloosia sisältävä fraktio, ja toisaalta vyöhyke I, jossa ksyluloosi desorboidaan, 95576 16 ja jonka huipusta laitteistoon johdetaan desorptiovettä, pidetään täysin erillään toisistaan.

Tällä suljinlaitteella huolehditaan nestemäisen faasin kulkusuunnasta selektiivi-5 sen adsorbentin läpi.

Arvoon 26’30" asetetulla ajastimella huolehditaan jäljempänä mainittuihin virtaamiin pääsemiseksi veden syöttämisestä ensimmäiseen vaiheeseen tai desorptiovyöhykkeen I ensimmäiseen kolonniin määränä, joka riittää ksyluloosin 10 täydelliseen desorptioon, sekä isomeroidun, runsaasti ksyloosia sisältävän siirapin sellaisen tilavuuden syöttämisestä, joka tilavuus sopii yhteen adsorboivan aineen tilavuuden ja sen adsorptiokapasiteetin kanssa siten, että ksyloosi saadaan poistumaan vähintään 60-prosenttisesti isomeroidussa siirapissa läsnäolleesta ksyloosista laskien, poisteen ksyloosipitoisuuden ollessa vähintään 60 %.

15

Edellä mainittu suhteellinen poistuma ja puhtaus saadaan pidetyiksi vakiona säätämällä adsorboitunutta ksyluloosia poistavan pumpun, jota ei olla esitetty, läpivirtaamaa. Fraktioiden "arabitoli-ksylitoli-muut sakkaridit" (fraktio X3) ja sitten "rikastuneen ksyloosin" (fraktio X,) ulostulo tapahtuu ilmakehän paineessa 20 ja niiden vakiona pysyvä virtaama johtuu syöttövirtaaman ja poistevirtaaman välisestä erosta.

Isomeroidun, runsaasti ksyloosia sisältävän siirapin, jota johdetaan laitteistoon rikastavan ja erottavan vyöhykkeen III huipusta, kuiva-ainepitoisuus on 50 %, 25 kuten edellä on esitetty. Erottavien kolonnien sisällä vallitseva lämpötila pidetään noin arvossa 70 eC.

Kuvio 4 esittää kaavamaisesti kuvioiden 2 ja 3 mukaista laitteistoa, jota on merkitty numerolla 204, samojen viitenumeroiden tarkoittaessa samoja, kuvion 30 1 kanssa yhteisten osien elementtejä. Tämä kromatografialaitteisto 204 käsittää linjan 306b, jota pitkin poistetaan huomattavan osan arabitoli-ksylitolista sisältävät vesiylimäärät sekä muista sakkarideista muodostunut fraktio (fraktio X3). Näiden poisteiden kuiva-ainepitoisuus on pieni ja ne poistuvat linjaa 306b! pitkin.

95576 17

Veden syöttäminen tapahtuu linjaa 401 pitkin.

Linjojen yläpuolelle piirretyt nuolet osoittavat virtaussuunnan.

5 Tämä kromatografialaitteisto 204 toimii seuraavasti: - isomeroitua, runsaasti ksyloosia sisältävää siirappia, jonka kuiva-ainepitoisuus on 50 %, ja joka on tarkoitus jakaa fraktioihin kromatografisesti, kuljetetaan linjaa 401 pitkin nopeudella 52 litraa tunnissa, 10 - rikastunutta ksyloosia (fraktio X,) otetaan talteen linjaa 306b2 pitkin no peudella 88,5 litraa tunnissa, sen kuiva-ainepitoisuuden ollessa keskimäärin 23,3 %, - muualta laitteistosta poistuvien nesteiden kokonaismäärä on 344,5 litraa tunnissa, ja nämä nesteet käsittävät 15 - toisaalta * vesiylimäärästä muodostuvan, linjaa 306b, poistuvan fraktion, joka sisältää pienenä pitoisuutena erittäin puhdasta ksylitoli-arabitolia sekä pienenä pitoisuutena mutta rikastuneempana muita sakkarideja (fraktio X3), näiden poistuvien fraktioiden kokonaismäärän ollessa 265,5 litraa tunnissa ja kui 20 va-ainepitoisuuden ollessa 2,5 %; näitä fraktioita saadaan jakson ensimmäis ten 20 minuutin aikana, * erittäin rikastuneen ksyloosifraktion (fraktio X,), joka muodostaa mainituista nesteistä 88,5 litraa tunnissa, ja joka kulkee linjaa 306b2 pitkin puhdistus-laitteistoa (ei esitetty) kohden, tämän fraktion kuiva-ainepitoisuuden oi 25 lessa 23,3 %; tämä fraktio vastaa jakson viimeistä osaa eli ajanjaksoa 6’30", - ja toisaalta fraktion, johon ksyluloosi on rikastunut erittäin voimakkaasti, ja josta ksyloosi on saatu poistumaan hyvin (farktio X2), ja jota poistuu nopeudella 79 litraa tunnissa (kuvio 4) linjaa 306a pitkin, joka linja 306a vastaa 30 kuviossa 3 esitettyä linjaa 148.

Alla oleviin taulukoihin 1 ja 2 on koottu ne olosuhteet, jotka ovat tunnusomaisia kromatografisesti fraktioivan laitteen toiminnalle.

95576 18 TAULUKKO 1

Kromatografia- Runsaasti ksyloosia laitteen syötöt sisältävä siirappi Vesi Yhteensä 5____

Virtaama 521/h 381 1/h 433 1/h

Tiheys 1,25

Kuiva-ainepit. 50 %

Massavirtaama 32 kg/h 10 Ksyloosipit. 60 %

Ksyloosin massavirtaama 19,2 kg/h

Ksyluloosin massavirtaama 6,4 kg/h 15 Taulukossa 2 on kuvattu laitteiston poisteet.

TAULUKKO 2

Runsaasti Runsaasti Arabitoli + 20 ksyloosia ksyluloosia ksylitoli+

Kromatografia- sis. frak- sis. frak- muut sakka- laitteen poisteet . tio (X.,) tio (X2) ridit (X3) Yhteensä

Virtaama 88,51/h 791/h 265,5 1/h 433 1/h 25 Tiheys 1,08 1,02 1,01

Kuiva-ainepitoisuus 23,3 % 5,9 % 2,5 %

Massavirtaama 20,7 kg/h 4,7 kg/h 6,6 kg/h 32 kg/h

Ksyloosipitoisuus 84 % 32 % 5 %

Ksyloosin massavirtaama 17,4 kg/h 1,5 kg/h 0,3 kg/h 19,2 kg/h 30 Ksyluloosipitoisuus 15 % 68 % 0 %

Ksyluloosin massa- 3,2 kg/h 3,2 kg/h 0 6,4 kg/h virtaama 35 Tämän tuloksen perusteella voidaan todeta, että ksyloosin saanto painomäärinä laskien on 20,7/32 = 65 % siirappina, jonka ksyloosipitoisuus on 84 %, ksy- 95576 19 loosisaannon ollessa tällöin 17,4/19,2 = 90,6 %, ja ksyluloosin saanto painomää-rinä laskien on 4,7/32 = 15 % siirappina, jonka ksyluloosipitoisuus on 68 %, ksyluloosisaannon ollessa 3,2/6,4 = 50 %.

5 Huomautettakoon, että tällä tavalla toimittaessa esimerkiksi ksyluloosisaantoa voitaisiin nostaa huomattavasti suurentamalla esimerkiksi fraktion (X2) poistevir-taamaa, mikä johtaisi fraktioiden (X,) ja (X3) ulostulovirtaamien pienenemiseen. Vastaavasti voitaisiin saada vieläkin enemmän ksyloosia sisältävä fraktio (ΧΊ), jolloin kuitenkin ksyloosin saanto olisi pienempi. Sitä vastoin fraktio (X2) 10 sisältäisi tällöin hieman vähemmän ksyluloosia.

Runsaasti ksyloosia sisältävästä siirapista muodostuvan fraktion (X,) analyysistä saadaan seuraavat tulokset: 15 - ksylitoli-arabitoli hyvin pieniä määriä - ksyluloosi 15 % - ksyloosi 84 % - muut sakkaridit 1 %.

20 Runsaasti ksyluloosia sisältävästä siirapista muodostuvan fraktion (X2) analyysistä saadaan seuraavat tulokset: - ksylitoli-arabitoli hyvin pieniä määriä - ksyluloosi 68 % 25 - ksyloosi 32 %.

Runsaasti ksyloosia sisältävä fraktio voidaan kiteyttää sinänsä tunnetulla tavalla sen jälkeen, kun se on puhdistettu ja väkevöity. Tällä tavalla saatu kiteinen ksyloosi voidaan hydrata ksylitolin saamiseksi.

30 Tässä tapauksessa, sen jälkeen, kun ksyloosi on saatu poistetuksi emävedestä, emävedet kierrätetään edullisesti takaisin kromatografiseen erotusvaiheeseen, jotta ksyloosi saataisiin siitä käytännöllisesti katsoen täydellisesti talteen. Niinpä tämä fraktio väkevöitiin tyhjössä siten, että sen kuiva-ainepitoisuudeksi saatiin 95576 20 75 %, D-ksyloosikiteiden läsnäollessa, sen jälkeen, kun fraktio oli jäähdytetty 20 *C:n lämpötilaan sitä samalla 24 tunnin ajan sekoittaen. Kiteytynyt massa lingottiin ja pestiin, jolloin yhdellä kiteytyksellä ksyloosia saatiin 50 %:n saannolla. Tämän ksyloosin puhtaus oli 98 %. Emävesien ksyloosipitoisuus oli noin 5 68 %, joten ne kierrätettiin edullisesti takaisin kromatografiavaiheeseen, jotta ksyloosi saataisiin niistä jokseenkin täydellisesti talteen.

Runsaasti ksyloosia sisältävä fraktio voidaan myös hydrata suoraan, jolloin saadaan runsaasti ksylitolia sisältävää siirappia.

10 Tässä tapauksessa fraktio hydrattiin käyttäen katalyyttina Raney-nikkeliä, 45 baarin vetypaineessa ja 120 *C:n lämpötilassa, jolloin saatiin siirappia, jonka ksylitolipitoisuus oli 91 %.

15 Kromatografiavaiheesta saatu fraktio X2 johdettiin takaisinkierrättämällä uudestaan entsymaattiseen isomerointivaiheeseen, joka toteutettiin samoissa, runsaasti ksyluloosia sisältävän fermentointiliemen isomeroinnin yhteydessä kuvatuissa olosuhteissa.

20 Tällöin saatiin isomeroitu siirappi, jolla oh seuraava koostumus: - ksylitoli-arabitoli hyvin pieniä määriä - ksyluloosi 26 % - ksyloosi 74 %.

25 Tämä siirappi sekoitettiin uudestaan runsaasti ksyloosia sisältävään siirappiin ja johdettiin uudestaan kromatografiseen fraktiointiin.

Tässä esimerkissä esitettyjen numeroarvojen perusteella voidaan päätellä, että 30 keksinnön mukaisella menetelmällä D-arabitolin fermentointivaiheesta saadusta 131,5 kg:sta sokerikuiva-ainetta saadaan 100 kg kuiva-ainetta siirappina, joka sisältää 84 % ksyloosia, ja kun muistetaan, että glukoosi saadaan muuntumaan ksyluloosiksi 48 %:n saannolla, niin todetaan, että tähän päästään lähtemällä 274 kg:sta glukoosia.

95576 21 Näin ollen keksinnön mukaisella menetelmällä saadaan D-ksyloosia hyvin väkevänä siirappina, saannon ollessa 36 % käytetystä glukoosista laskien.

Claims

95576

1. Menetelmä D-ksyloosin valmistamiseksi, tunnettu siitä, että 5. ensimmäisessä vaiheessa väkevä D-ksyluloosisiirappi isomeroidaan entsy maattisesti, pH-arvossa 6,0-8,5 ja lämpötilassa 40-80°C, jolloin saadaan D-ksyloosin ja D-ksyluloosin seos; toisessa vaiheessa tämä seos käsitellään kromatografisesti, jolloin saadaan vähintään kaksi fraktiota, joista yksi sisältää runsaasti D-ksyloosia (fraktio 10 Xj) ja toinen sisältää runsaasti D-ksyluloosia (fraktio X2), jolloin mainittu kromatografiakäsittely suoritetaan käyttämällä kationisia hartseja, jotka on ladattu alkaali- tai maa-alkaali-ioneilla tai käyttämällä kationisia zeoliitteja, jotka on ladattu NH4+-, Na+-, K+-, Ca2+-ja Ba2+-ioneilla, kolmannessa vaiheessa fraktio X2 kierrätetään takaisin isomerointivaihee-15 seen, ja D-ksyloosi otetaan talteen fraktiosta X], joka voidaan kuitenkin johtaa myös suoraan hydrausvaiheeseen.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että lähtöai neena toimiva D-ksyluloosi valmistetaan seuraavilla peräkkäisillä vaiheilla, joissa: • D-glukoosisiirappia fermentoidaan aerobisesti Pichia-lajin osmofiilisella mikro-organismilla, joka muuntaa D-glukoosin D-arabitoliksi,

25. D-arabitolisiirappia fermentoidaan aerobisesti Acetobacter-, Gluconobakter- tai Klebsiella-lajin mikro-organismilla, joka tuottaa alkoholidehydrogenaasia, : joka kykenee muuntamaan D-arabitolin D-ksyluloosiksi, D-ksyluloosisiirappi isomeroidaan glukoosi-isomeraasilla tai ksyloosi-isomeraasilla, jolloin saadaan runsaasti D-ksyloosia sisältävää siirappia.

3. Jomman kumman patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että käytetty entsyymi on glukoosi-isomeraasi. 30 95576

4. Jonkin patenttivaatimuksen 1-3 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että entsymaattisen isomerointivaiheen parametrit valitaan siten, että siitä saadaan yli 53 % D-ksyloosia sisältävää siirappia.

5. Jonkin patenttivaatimuksen 1-4 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että kromatografisen fraktiointivaiheen parametrit valitaan siten, että siitä saatavan, runsaasti ksyloosia sisältävän fraktion ksyloosipitoisuus on 60-95 %, 10. edullisesti 75-90 % ja vieläkin edullisemmin 80-85 %, laskien nämä prosentuaaliset osuudet kuiva-aineen painosta, ja D-ksyluloosin pitoisuuden ollessa alle 25 %, edullisesti alle 15 %.

6. Jonkin patenttivaatimuksen 1-5 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että ksyloosin kiteytyksestä saatavat emävedet kierrätetään takaisin kromatografiseen fraktiointivaiheeseen. 95576