FI95133C - Menetelmä uusien terapeuttisesti käyttökelpoisten di-imidatsopyrimidiini- ja imidatsopyratsolopyrimidiinijohdannaisten valmistamiseksi - Google Patents

Description

1 95133

Menetelmä uusien terapeuttisesti käyttökelpoisten di-imid-atsopyrimidiini- ja imidatsopyratsolopyrimidiinijohdannaisten valmistamiseksi 5 Keksintö koskee uusien kaavan I mukaisten di- imidatsopyrimidiini- ja imidatsopyratsolopyrimidiinijohdannaisten ja niiden farmaseuttisesti hyväksyttävien suolojen valmistusta,

M

10 \ ch2 HC —vN (I) * η X, 15 ^ }L '* n Ί Rl jossa kaavassa Rj on vety, fenyyli tai β-D-ribofuranosyyli; 20 R2 on vety tai propoksi; Y on N tai CH; Z on N tai CH, sillä edellytyksellä, että Y ja Z eivät ole identtisiä; L on vety tai fenyyli; ja M on fenyyli, paitsi silloin kun L on fenyyli, jossa tapauksessa M on vety.

Nämä yhdisteet ovat adenosiinin analogeja ja ne 25 toimivat selektiivisesti adenosiinin reseptoreilla.

Adenosiinin voimakas verenpainetta alentava, rauhoittava, kouristuksenvastainen ja verisuonia laajentava vaikutus todettiin ensimmäisen kerran yli 50 vuotta sitten. Sen jälkeen on adenosiinille ehdotettujen biologisten 30 tehtävien lukumäärä suurentunut huomattavasti. Adenosiinin : reseptorit näyttävät monissa soluissa liittyvän yhteen adenylaattisyklaasin kanssa. Monia erilaisia adenosiinin analogeja on esitetty viime vuosina näiden reseptorien toimintojen tutkimista varten. Alkyyliksantiinit, kuten - 95133 2 * esimerkiksi kofeiinin ja teofylliini, ovat adenosiinin reseptorien parhaiten tunnetut antagonistit.

Adenosiini edustaa ehkä yleistä säännöstelij Mainetta, koska mikään erityinen solutyyppi tai kudos ei näytä 5 olevan erikoisesti vastuussa sen muodostumisesta. Tässä suhteessa adenosiini on erilainen kuin monet umpieritys-hormonit. Ei myöskään ole mitään todisteita adenosiinin varastoinnista ja vapautumisesta hermo- tai muista soluista. Adenosiini on siten erilainen kuin monenlaiset neuro-10 transmitteriaineet.

Adenosiinia voitaisiin verrata fysiologisena säännöstelij änä prostaglandiineihin. Kummassakin tapauksessa aineenvaihdunnassa muodostumiseen liittyvät entsyymit ovat kaikkialla läsnä olevia ja näyttävät olevan herkkiä solun 15 fysiologisen tilan muutoksille. Adenosiinin reseptorit ovat prostaglandiinien reseptorien tavoin osoittautumassa hyvin yleisiksi. Lopuksi sekä prostaglandiinit että adenosiini näyttävät liittyvän sellaisten toimintojen säännöstelyyn, joihin liittyy kalsiumioneja. Prostaglandiinit 20 ovat luonnollisesti peräisin kalvoedeltäjistä, kun taas adenosiini on peräisin sytosoliedeltäjistä.

Vaikka adenosiini voi vaikuttaa moniin erilaisiin fysiologisiin toimintoihin, on erityistä huomiota kiinnitetty vuosien aikana vaikutuksiin, jotka saattaisivat joh-25 taa kliinisiin sovellutuksiin. Huomattavimpia ovat olleet adenosiinin kardiovaskulaariset vaikutukset, jotka johta vat verisuonten laajenemiseen ja matalaan verenpaineeseen, mutta jotka myös johtavat sydämen sykinnän hidastumiseen. Adenosiinin rasvan hajoitusta vastustava, veritulppia vas-30 tustava ja kouristuksenvastainen vaikutus ovat myös saaneet osakseen jonkin verran huomiota. Adenosiini stimuloi steroidien syntyä lisämunuaissoluissa, jälleen luultavasti adenylaattisyklaasin aktivoinnin kautta. Adenosiinilla on estäviä vaikutuksia neurotransmissioon ja keskushermosolu-35 jen spontaaniin aktiivisuuteen. Lopuksi adenosiinin bron- 3 95133 kokonstriktorivaikutus ja ksantiinien sitä vastustava vaikutus edustaa tärkeää tutkimusaluetta.

Nyt on todettu, että adenosiinin vaikutukseen ei liity yksi vaan vähintään kaksi solun ulkopuolisten resep-5 torien luokkaa. Toisella näistä on suuri affiniteetti ade-nosiinia kohtaan ja se kytkeytyy ainakin joissakin soluissa adenylaattisyklaasiin estävällä tavalla. Nämä ovat jotkut nimittäneet A-1-reseptoreiksi. Toisella reseptorien luokalla on vähäisempi affiniteetti adenosilnia kohtaan ja 10 se kytkeytyy monissa solutyypeissä adenylaattisyklaasiin stimuloivalla tavalla. Nämä on nimitetty A-2-reseptoreik-si.

Nyt on ollut mahdollista karakterisoida adenosiinin reseptoreita monien erilaisten rakenneanalogien avulla. On 15 tullut saataviksi adenosiinin analogeja, jotka vastustavat metaboloitumista tai talteenottomekanismeja. Nämä ovat erityisen arvokkaita, koska niiden näennäistehokkuuteen vaikuttaa vähemmän aineenvaihdunnallisen poistamisen vaikuttaja järjestelmästä. Adenosiinin analogit osoittavat 20 suuruusjärjestykseltään eroavia tehokkuuksia A-l- ja A-2-adenosiinin reseptoreilla, mikä tarjoaa yksinkertaisen menetelmän luokitella fysiologinen vastaus adenosiinin reseptorin luonteen suhteen. Adenosiinin reseptorien tukkiminen (antagonismi) tarjoaa toisen menetelmän luokitella 25 vastaus adenosiinin reseptorien osallistumisen osalta. On huomion arvoista, että A-l- tai A-2- adenosiinin reseptoreille spesifisten antagonistien kehittäminen merkitsisi ratkaisevaa edistysaskelta tällä tutkimusalalla ja sellaisten adenosiinin reseptorien suhteen selektiivisten 30 farmakologisten vaikuttaja-aineiden valmistuksessa, joilla : olisi spesifisiä fysiologisia vaikutuksia eläimissä.

US-patenttijulkaisuista 3 830 795, 3 830 796, 3 931 401 ja 4 007 268 sekä DE-hakemusjulkaisuista 2 350 606 ja 2 365 720 tunnetaan yhdisteitä, jotka raken-35 teeltaan ovat samantyyppisiä kuin nyt kuvatut kaavan I mukaiset yhdisteet. Mainituissa julkaisuissa ei kuitenkaan 4 95133 4 mainita mitään kyseisten tunnettujen yhdisteiden mahdollisesta adenosiiniselektiivisyydestä.

Nyt on yllättäen havaittu, että uudet kaavan I mu- I

kaiset yhdisteet ovat selektiivisiä adenosiinireseptori-5 aineita, jolloin selektiivisyys perustuu yhdisteiden ste-reospesifisyyteen adenoreseptorin suhteen.

Kaavan I mukaisia yhdisteitä ja niiden farmaseuttisesti hyväksyttäviä suoloja voidaan valmistaa siten, että a) kaavan I mukaisten yhdisteiden valmistamiseksi, 10 joissa Rz on vety, yhdiste, jonka kaava on

Cl ,1¾1

15 N

Rl jossa Rlr Y ja Z tarkoittavat samaa kuin edellä, ja R2 on vety, saatetaan reagoimaan yhdisteen kanssa, jonka kaava on J® (iii) HO h2n 25 1-24 tunnin ajan lämpötilassa 25 eC - 140 °C, ja saatu yhdiste, jonka kaava on J@ : /CH2 (IV)

H0 HN

ifc-

Rl 11 5 - 95133 jossa R}, Y ja Z tarkoittavat samaa kuin edellä ja R2 on vety, eristetään, minkä jälkeen kaavan IV mukaista yhdistettä käsitellään sopivalla kloorausaineella, kuten tio-nyylikloridilla, 1-24 tunnin ajan lämpötilassa 25 °C -5 140 eC, tai b) kaavan I mukaisten yhdisteiden valmistamiseksi, joissa R2 on propoksi, yhdiste, jonka kaava on

Cl 10 <v> «A-iQ· N |

Ri 15 jossa Rx, Y ja Z tarkoittavat samaa kuin edellä, saatetaan reagoimaan kaavan III mukaisen yhdisteen kanssa 1-24 tunnin ajan lämpötilassa, 25 eC - 140 eC, ja saatu yhdiste, jonka kaava on /oi ch2 H0 HN (VI)

a-4. V

Cl V, N

N |

Rl 30 jossa Rx, Y ja Z tarkoittavat samaa kuin edellä, eriste-• tään, minkä jälkeen kaavan VI mukaista yhdistettä käsitel lään sopivalla kloorausaineella, kuten tionyylikloridilla, jolloin saadaan yhdiste, jonka kaava on 35 6 95133 5 CH2 (VII) \

HC — N

JUO·

10 Cl^N N

Ri jossa Rw V ja Z tarkoittavat samaa kuin edellä, ja saatua kaavan VII mukaista yhdistettä käsitellään propanolil-15 la, tai c) kaavan I mukaisten yhdisteiden valmistamiseksi, joissa L on fenyyli, yhdiste, jonka kaava on

Cl 20 γ (VIII) I N z *2 H f

Rl 25 jossa Rlr Y ja Z tarkoittavat samaa kuin edellä ja R'2 on vety tai kloori, saatetaan reagoimaan yhdisteen kanssa, jonka kaava on 30 (( ))-C-C-CH3 (IX) jolloin saadaan yhdiste, jonka kaava on 35 11 7 95133

HO-C-H

H-C-CH., I 3 (X)

c NH

1¾

R 2 N N

Rl 10 jossa Rlr Y, Z ja R*2 tarkoittavat samaa kuin edellä, ja kaavan X mukainen yhdiste saatetaan reagoimaan kloo-rausaineen, kuten tionyylikloridin kanssa ja, kun R'2 on kloori, propanolin kanssa; 15 ja haluttaessa saatu kaavan I mukainen yhdiste muutetaan farmaseuttisesti hyväksyttäväksi suolaksi.

Kysymyksessä olevilla yhdisteillä on stereo isomeria mahdollista ja yllä esitetyn kemiallisen rakenteen tarkoitetaan käsittävän kaikki mahdolliset stereoisomeerit ja 20 sellaisten stereoisomeerien raseemiset seokset.

Tämän keksinnön mukaisista yhdisteistä ovat esimerkkejä seuraavat: 1. (R)-2,7-dihydro-7-fenyyli-2-(fenyylimetyyli)-5-propoksi-3H-imidatso[1,2-c]pyratsolo[4,3-e]pyrimidiini , 25 2. (S)-2,7-dihydro-7-fenyyli-2-(fenyylimetyyli)-5- propoksi-3H-imidatso[l,2-c]pyratsolo[4,3-e]pyrimidiini 3. (R)-2,7-dihydro-7-fenyyli-2-(fenyylimetyyli)-3H-imidatso[l,2-c]pyratsolo[4,3-e]pyrimidiini 4. (S)-2,7-dihydro-7-fenyyli-2-(fenyylimetyyli)- 30 3H-imidatso[l,2-c]pyratsolo[4,3-e]pyrimidiini : 5. (S)-7,8-dihydro-3-fenyyli-8-(fenyylimetyyli)- 3H-di-imidatso[l,2-c:4',5'-e]pyrimidiini 6. (R)-7,8-dihydro-3-fenyyli-8-(fenyylimetyyli)3H-di-imidatso[l,2-c:4',5'-e]pyrimidiini I · · 8 95133 7. (2R-trans )-2,7-dihydro-2-metyyli-3,7-difenyyli-5-propoksi-3H-imidatso[1,2-c]pyratsolo[4,3-e]pyriraidiini 8. (2S-trans)-2,7-dihydro-2-metyyli-3,7-difenyyli-5-propoksi-3H-imidatso[l,2-c]pyratsolo[4,3-e]pyrimidiini 5 9.(R)-7,8-dihydro-8-(fenyylimetyyli)-lH-di-imidat- so-[l,2-c:4',5’-e]pyrimidiini 10. (S)-7,8-dihydro-8-(fenyyllmetyyll)-lH-di-imi-datso-[1,2-c:4',5'-e]pyrlmldllnl 11. (R)-7,8-dihydro-3-fenyyli-8-(fenyylimetyyli)- 10 5-propoksi-3H-di-imidatso[l,2-c:4',5'-e]pyrimidiini 12. (S)-7,8-dihydro-3-fenyyli-8-(fenyylimetyyli)-5-propoksi-3H-di-imidatso[l,2-c:4',5'-e]pyrimidiini 13. (S)-7,8-dihydro-3-(8-D-ribofuranosyyli)-8-(fenyylimetyyli )-3H-di-imidatso[l, 2-c: 4 ' ,5'-e]pyrimidiini 15 14. (R)-7,8-dihydro-3-(8-D-ribofuranosyyli)-8-(fe nyylimetyyli )-3H-di-imidatso[1,2-c:4’, 5'-e]pyrimidiini 15. (R)-2,7-dihydro-2-(fenyylimetyyli)-7-(β-D-ribo-f uranosyyli) -3H-imidatso[ 1,2-c]pyratsolo[4,3-e] pyrimidiini 16. (S)-2,7-dihydro-2-(fenyylimetyyli)-7-(β-D-ribo- 20 f uranosyyli) -3H-imidatso [ 1,2-c] pyratsolo [ 4,3-e] pyrimidiini 17. (R)-2,7-dihydro-7-(B-D-ribofuranosyyli)-2-(fenyylimetyyli )-5-propoksi-3H-imidatso[l,2-c]pyratsolo-[4,3-e]pyrimidiini 18. (S)-2,7-dihydro-7-(β-D-ribofuranosyyli)-2-(fe-25 nyylimetyyli )-5-propoksi-3H-imidatso[l, 2-c]pyratsolo- [4,3-e]pyrimidiini » 9 95133

Selektiivisten adenosiinin reseptori-aineiden terapeuttinen hyödyllisyys

Alla olevassa taulukossa on esitetty yksityiskohtaisemmin kaavan I mukaisten selektiivisten adenosiinin 5 reseptori-aineiden terapeuttinen hyödyllisyys:

Alue Vaikutus Reseptorikorrelaatti kardiovasku- 10 laarinen sydänlääke A-1-antagonismi kardiovasku- hillitsevät laarinen takykardiaa A-l-agonismi 15 kardiovasku- lisäävät sepelval- laarinen timoverenvirtauksia A-2-agonismi kardiovasku- vasodilataatio A-2 (poikkeukseni- laarinen nen) -agonismi 20 keuhkot bronkodilataatio A-l-antagonismi keuhkot umpieritteen va- uudenlainen vuoro- pautumisen syöttö- vaikutus adenosii- 25 soluista, basofii- nin reseptorin kans- leistä välittäminen sa solun pinnalla keuhkot stimuloivat hengi- Ado-antagonismi tystä; hoitavat para-30 doksaalista ventilaa- : tioreaktiota (pikku lapsilla) munuaiset estävät reniinin va- 35 pautumista A-l-agonismi • 4 Λ 10 95133

Alue Vaikutus Reseptorikorrelaatti keskushermosto auttavat oopiumi- Ado-agonismi lääkkestä luopumisessa 5 keskushermosto kipuja lievittävä A-l-agonismi keskushermosto kouristusta vastus- A-l-agonismi tava 10 keskushermosto masennusta vastus- A-l-agonismi tava keskushermosto psykoosia vastustava Ado-agonismi 15 keskushermosto tuskaa lievittävä agonismi

Keskushermosto Itsensävahingoitta- Ado-agonismi miskäyttäytyrnisen 20 estäminen (Lesch-

Nyhan-oireyhtymä) keskushermosto rauhoittava A-2-agonismi 25

Kardiovaskulaarisissa, keuhko- ja munuaiskohteissa voidaan suunniteltuja yhdisteitä, jotka identifioidaan reseptoriinisitoutumistutkimusten avulla, arvioida funktionaalisissa in vivo -testeissä, jotka osoittavat suoraan 30 ihmisen fysiologisen vastauksen. Hyvän kuvauksen puriinien reseptorien farmakologiasta ja funktionaalisesta merkityksestä on esittänyt M. Williams julkaisussa Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol., 27, 31 (1987), joka sisällytetään tähän viitteenä. Kappaleessa, joka on otsikoitu "Adenosii-35 nin reseptorien modulaattorien terapeuttinen kohdistaminen", mainitaan, että "adenosiiniagonistit voivat olla 11 95133 tehokkaita verenpainetta alentavina aineina, oopiumlääk-keistä luopumisen hoidossa, immuunikompetenssln ja renii-nin vapautumisen modulaattoreina, psykoosilääkkeinä ja unilääkkeinä. Sitä vastoin antagonistit voivat olla hyö-5 dyllisiä keskeisinä kiihokeaineina (central stimulants), lihassupistukseen vaikuttavina aineina, sydänlääkkeinä, stressinvastustusaineina, astmalääkkeinä ja hengityshäiriöiden hoidossa". Adenosiinin reseptoreihin vaikuttavien aineiden osoittamien vaikutusten valikoima tähdentää 10 niiden suurta potentiaalista hyödyllisyyttä hoitokäytössä ja keskeisten vaikuttaja-aineiden tarvetta.

Adenoslini aikaansaa erilaiset biologiset vaikutuksensa vaikuttamalla solun pinnan reseptoreihin. Nämä adenosiinin reseptorit ovat kahta tyyppiä: A-l ja A-2.

15 A-l-reseptorit määritellään toiminnallisesti niiksi resep toreiksi, joilla useat N6-substituoidut adenosiinin analogit, kuten esimerkiksi R-fenyyli-isopropyyliadenosiini (R-PIA) ja sykloadenosiini (CHA), ovat tehokkaampia kuin 2-klooriadenosiini ja N-5'-etyyllkarboksiamidoadenosiini 20 (NECA). A-2-reseptoreilla tehokkuusjärjestys on sen sijaan NECA > 2-klooriadenosiini > R-PIA > CHA.

Kuten yllä olevassa taulukossa on esitetty, adenosiinin reseptorien kaksi pääluokkaa on jo määritelty. Nämä ovat A-l -adenosiinin reseptori, joka on adenylaattisyk-25 laasia inhiboiva, ja A-2 -adenosiinin reseptori, joka on adenylaattisyklaasia stimuloiva. A-l-reseptorin affiniteetti adenosiinia ja adenosiinin analogeja kohtaan on suurempi kuin A-2-reseptorin. Adenosiinin ja adenosiinin analogien fysiologisia vaikutuksia mutkistaa se seikka, 30 että ei-selektiiviset adenosiinin reseptoreihin vaikutta-: vat aineet sitovat ensin jokseenkin kaikkialla läsnä ole vat alhaisen affiniteetin omaavat A-2-reseptorit, sitten annosta suurennettaessa suuren affiniteetin omaavat A-2 -reseptorit sidotaan ja lopuksi, paljon suuremmilla annok-35 silla, hyvin suuren affiniteetin omaavat A-l -adenosiinin reseptorit sidotaan, (katso J.W. Daly et ai., "Subclasses 12 95133 of Adenosine Receptors in the Central Nervous System: Interaction with Caffeine and Related Methylxanthines", Cellular and Molecular Neurobiology, 3(1), 69 - 80 (1983), joka sisällytetään tähän viitteenä).

5 Yleensä adenosiinin fysiologiset vaikutukset tapah tuvat joko adenylaattisyklaasin stimuloinnin tai sen inhi-boinnin välityksellä. Adenylaattisyklaasin aktivointi suurentaa solun sisäistä syklisen AMP:n konsentraatiota, joka syklinen AMP tunnetaan yleisesti solun sisäisenä toisena 10 lähettinä. Adenosiinin analogien vaikutuksia voidaan sen vuoksi mitata käyttämällä hyväksi joko niiden kykyä suurentaa syklisen AMP:n määrää tai niiden kykyä vastustaa syklisen AMP:n määrän suurenemista viljellyissä solulin-joissa. Kaksi tässä suhteessa tärkeää solulinjaa ovat 15 VA 13 (WI-38 VA 13 2RA), SV-40:llä transformoidut WI 38 -ihmisen sikiökautisen keuhkon fibroblastit, joissa tiedetään olevan adenosiinin reseptorin A-2-alatyyppiä, ja rasvasolut, joissa tiedetään olevan adenosiinin reseptorin A-l-alatyyppiä. (Katso R.F. Bruns, "Adenosine Antagonism 20 by Purines, Pteridines and Benzopteridines in Human Fibroblasts", Biochemical Pharmacology, 30, 325 - 333 (1981) joka sisällytetään tähän viitteenä).

In vitro -tutkimuksista tiedetään, että 8-fenyyli-1,3-dipropyyliksantiinin karboksyylihappojohdannainen 25 (XCC) on adenosiinin reseptorien suhteen ei-selektiivinen ja sillä on aivojen kalvoissa olevilla A-l -reseptoreilla Ki 58 ± 3 nM ja aivoviipalekokeen A-2 -reseptoreilla Ki 34 ± 13 nM. 8-fenyyli-l,3-dipropyyliksantiinin amino-johdannaisella (XAC) on toisaalta 40 kertaa suurempi affi-30 niteetti A-l -adenosiinin reseptoreita kohtaan ja sillä on tällöin Ki 1,2 ± 0,5 nM, verrattuna aivoviipalekokeen A-2 -reseptoreilla saatuun Ki-arvoon 49 ± 17 nM. Lisäksi XAC on paljon tehokkaampi vastustamaan adenosiinin analogien vaikutuksia sydämen sykintänopeuteen kuin verenpai-35 neeseen. Koska on yleisesti tunnettua, että adenosiinin analogien aiheuttamat vaikutukset sydämeen näyttävät ta- 13 95133 pahtuvan A-l -reseptorien välityksellä ja vaikutukset verenpaineeseen A-2 -reseptorien välityksellä, XAX:n selek-tiivisyys in vivo -olosuhteissa viittaa siihen, että aktiivisuus adenosiinin reseptoria kohtaan in vitro korre-5 loi aktiivisuuden adenosiinin reseptoria kohtaan in vivo kanssa ja että tämän selektiivisyyden johdosta voidaan erottaa spesifisiä fysiologisia vaikutuksia. (Katso B.B. Fredholm, K.A. Jacobsen, B. Jonzon, K.L. Kirk, Y.O. Li ja J.W. Daly, "Evidence That a Novel 8-Phenyl-Substituted 10 Xanthine Derivative is a Cardioselective Adenosine

Receptor Antagonist In Vivo", Journal of Cardiovascular Pharmacology, 9, 396 - 400 (1987), joka sisällytetään tähän viitteenä, ja myös K.A. Jacobsen, K.L. Kirk, J.W. Daly, B. Johnzon, Y.O. Li ja B.B. Fredholm, "Novel 8-15 fenyl-substituted Xanthine Derivative Is Selective

Antagonist At Adenosine Receptors In Vivo", Acta Physiol. Scand.. 341 - 342 (1985), joka sisällytetään tähän viitteenä ).

On myös tunnettua, että adenosiini aikaansaa veren-20 paineen selvän alenemisen. Tämä verenpaineen aleneminen riippuu luultavasti A-2 -reseptorin välittämästä periferi-sen vastustuksen vähenemisestä. Adenosiinin analogit kykenevät myös pienentämään sydämen sykintänopeutta. Tämän vaikutuksen välittävät luultavasti A-l -alatyyppiä olevat 25 adenosiinin reseptorit.

On siten selvää, että tässä esiteltyjen adenosiinin reseptorin suhteen selektiivisten adenosiinin analogien farmakologinen antaminen johtaa selektiiviseen sitoutumiseen joko A-2- tai A-l-reseptoriin, mikä vuorostaan johtaa 30 selektiivisesti esimerkiksi joko verenpaineen alenemiseen tai sydämen sykintänopeuden pienenemiseen, kytkien siten nämä fysiologiset vaikutukset irti toisistaan in vivo. Sellaisten adenosiinin reseptorin suhteen selektiivisten aineiden valinta voidaan ratkaista* jäljempänä yksityiskoh-35 taisemmin kuvattujen menetelmien avulla.

• 14 95133

Affiniteettia aivojen adenosiinin A-2-reseptoreita kohtaan määrittävä koe

Alla kuvattua koetta käytettiin tarkoituksena määrittää koeyhdisteiden kyky kilpailla ligandin [3H]5'-N-5 etyylikarboksiamidoadenosiini (NECA) kanssa adenosiinin A-2-reseptoreista, jotka on valmistettu eläimen aivojen kalvoista. (Katso myös R.R. Bruns, G.H. Lu ja T.A. Pugsley, "Characterization of the A-2 Adenosine Receptor Labeled by [3H]NECA in Rat Striatal Membranes", Mol. 10 Pharmacol., 29, 331 - 346 (1986), joka sisällytetään tähän viitteenä). Nuoria urospuolisia rottia (C-D-kantaa), jotka on hankittu Charles Riveriltä, tapetaan katkaisemalla kaula ja aivot poistetaan. Eristetään kalvoja ligandin sitoutumista varten rottien aivojuoviosta. Kudos homoge-15 noidaan 20 tilavuudessa jääkylmää 50 mM Tris-HCl-puskuri-liuosta (pH 7,7) käyttäen Polytron-laitetta (asetus 6 20 sekuntia varten). Homogenaattia sentrifugoidaan nopeudella 50 000 x g 10 minuutin ajan 4 °C:ssa. Pelletti homogenoidaan jälleen polytron-laitteessa 20 tilavuudessa puskuri-20 liuosta ja sentrifugoidaan kuten aikaisemmin. Pelletti uudelleensuspendoidaan lopuksi 40 tilavuuteen 50 mM Tris-HCl (pH 7,7) grammaa kohden kudoksen alkuperäistä märkää painoa.

Inkubointiputkiin, joita on kulloinkin kolme rin-25 nakkaista, pannaan 10 μΐ [3H]-NECA:a (94 nM määrityksessä), 100 μΐ 1 μΜ sykloheksyyliadenosiinia (CHA), 100 μΐ 100 mM MgCl2, 100 μΐ liuosta, jossa on 1 IU/ml adenosiini-deaminaasia, 100 μΐ koeyhdisteitä erilaisina konsentraa-tioina väliltä 10'10 M - 10"4 M laimennettuna koepuskurilla 30 (50 mM Tris-HCl, pH 7,7) ja 0,2 μΐ kalvosuspensiota (5 mg märkää painoa) lopulliseen tilavuuteen 1 ml, joka säädetään 50 mM Tris-HCl:11a pH 7,7. Inkubointeja suoritetaan 25 °C:ssa 60 minuutin ajan. Kunkin putken sisältö suodatetaan GF/B-lasikuitusuodattimen lävitse käyttäen tyhjöä. 35 Suodattimet huuhdotaan kaksi kertaa 5 ml:11a jääkylmää puskuriliuosta. Suodattimilla olevat kalvot siirretään 95133 15 tuikepulloihin, joihin lisätään 8 ml Omnifluoria, jossa on 5 % Protosolia. Suodattimille suoritetaan laskeminen nes-tetuikespektrometrian avulla.

[3H]NECA:n spesifinen sitoutuminen mitataan määrä-5 nä, joka ylittää nollakokeet, jotka on suoritettu 100 μΜ 2-klooriadenosiinin läsnä ollessa. Kalvoihin sitoutuneen radioaktiivisuuden kokonaismäärä on noin 2,5 % koeputkiin lisätystä määrästä. Koska tämä asiaintila rajoittaa koko-naissitoutumisen alle 10 %:ksi radioaktiivisuudesta, ei 10 vapaan ligandin konsentraatio muutu olennaisesti sitoutu-miskokeen aikana. Spesifinen sitoutuminen kalvoihin on noin 50 % kokonaissitoutumisesta. Kalvosuspension proteiinipitoisuus määritetään käyttäen menetelmää, jonka ovat julkaisseet O.H. Lowry, N.J. Rosebrough, A.l. Farr ja 15 R.J. Randall, "Protein Measurements With Folin Phenol Reagent", J. Biol. Chem.. 193, 265 - 275 (1951) (liitetään tähän viitteenä).

15 %:n tai suuremman määrän [3H]NECA:n sitoutumisesta syrjäytyminen koeyhdisteen vaikutuksesta osoittaa 20 affiniteettia adenosiinin A-2-kohtaan. Se yhdisteen molaa-rinen konsentraatio, joka aiheuttaa ligandin sitoutumisen 50 % inhibition, on IC50. Väliltä 100 - 1 000 nM oleva arvo osoittaisi yhdisteen olevan erittäin tehokkaan.

Affiniteettia aivojen adenosiinin A-l-reseptorisi-25 toutumiskohtiin määrittävä koe

Alla kuvattua koetta käytetään tarkoituksena määrittää koeyhdisteiden kyky kilpailla ligandin [3H]syklo-adenosiinin kanssa adenosiinin A-1-reseptorista, joka on valmistettu rotan aivojen kalvoista. Urospuolisia Sprague-30 Dawley-rottia tapetaan katkaisemalla kaula ja eristetään kalvot eläinten koko aivoista. (Katso R. Goodman, M. Cooper, M. Gavish ja S. Synder, "Guanine Nucleotide and Cation Regulation of the Bindning of [3H]Diethylphenyl-xanthine to Adenosine A-l Receptors in Brain Membrane", 35 Molecular Pharmacology, 21, 329 - 335 (1982), joka liitetään tähän viitteenä).

95133 16 #

Kalvot homogenoidaan (käyttäen polytron-laitteen asetusta 7 10 sekuntia varten) 25 tilavuudessa jääkylmää 50 mM Tris-HCl-puskuriliuosta, pH 7,7. Homogenaattia sent-rifugoidaan nopeudella 19 000 kierrosta minuutissa 10 mi-5 nuutin ajan 4 eC:ssa. Pelletti pestään uudelleensuspendoi-malla 25 tilavuuteen puskuriliuosta, jossa on 2 IU adeno-siinideaminaasia ml:a kohden, ja inkuboidaan 30 minuutin ajan 37 °C:ssa. Homogenaatti sentrifugoidaan jälleen. Lopullinen pelletti uudelleensuspendoidaan 25 tilavuuteen 10 j ääkylmää puskuri1iuosta.

Inkubointiputkiin, joita on kulloinkin kolme rinnakkaista, pannaan 10 μΐ [3H]sykloheksyyliadenosiinia, 0,8 nM määrityksessä, 200 μΐ koeyhdisteitä erilaisina konsent-raatioina väliltä 10'10 M - 10*6 M laimennettuna 50 mM Tris-15 HCl-puskuriliuoksella (pH 7,7), 0,2 ml kalvosuspensiota (8 mg märkää painoa) lopulliseen tilavuuteen 2 ml, joka säädetään Tris-puskuriliuoksella. Inkubointeja suoritetaan 25 °C:ssa 2 tunnin ajan ja kukin niistä päästetään 10 sekunnin aikana suodattamalla GF/B-lasikuitusuodattimen lä-20 vitse käyttäen tyhjöä. Suodattimilla oleva kalvot siirretään tuikepulloihin. Suodattimille suoritetaan laskeminen nestetuikespektrometrian avulla 8 ml:ssa Omnifluoria, joka sisältää 5 % Protosolia.

[3H]sykloadenosiinin spesifinen sitoutuminen mita-25 taan määränä, joka ylittää nollakokeet, jotka on suoritettu 10*5 M 2-klooriadenosiinin läsnä ollessa. Kalvoon sitoutuneen radioaktiivisuuden kokonaismäärä on noin 5 % koeputkiin lisätystä määrästä. Spesifinen sitoutuminen kalvoihin on noin 90 % kaikkiaan sitoutuneesta määrästä. Kal-30 vosuspension proteiinipitoisuus määritetään käyttäen ; Lowryn et ai. menetelmää Id, 265.

15 %:n tai suuremman määrän [3H]sykloheksyyliadeno-siinin sitoutumisesta syrjäytyminen koeyhdisteen vaikutuksesta osoittaa affiniteettia adenosiinin sitoutumiskoh-35 taan.

m 17 95133

Adenosiinin reseptoreihin sitoutumisen affiniteet-tiarvoja, jotka on saatu käyttäen yllä kuvattuja koemenetelmiä

Seuraavassa taulukossa on esitetty aikaisemmin 5 identifioitujen yhdisteiden (katso yhdiste-esimerkeistä sivuilla 7-8 yhdisteiden nimet) adenosiinin reseptoreihin sitoutumisen affiniteetit tämän keksinnön puitteissa:

Yhdiste A-l- A-2- 10 reseptori-Ki reseptori-Ki A-2-Ki/A-l-Ki 1. 1,24 x 10'6 >6,99 x 10’6 2. 2,68 x 10'6 5,08 x 10‘7 0,18 3. 1,90 x 10'6 2,50 x 10‘5 13,20 15 4. 1,00 x 10‘5 >1,99 x 10-4 5. 4,46 x ΙΟ’5 >1,99 x 10'4 6. 8,40 x 10-6 1,00 x 10‘4 16,40 7. 1,21 x ΙΟ-5 1,42 x 10’5 1,17 8. 2,64 x 10-5 2,85 x 10-5 1,07 20 9. 1,99 x 10‘4 >1,99 x 10-4 10. 1,99 x 10'4 >1,99 x 10-4

11. N/A N/A

12. 9,00 x 10-6 1,60 x 10-6 0,18 13. 4,50 x 10-6 1,06 x 10’5 1,70 25 14. 6,50 x 10-5 4,68 x 10*5 5,50

Nukleotidin guanosiinitrifosfaatti (GTP) on osoitettu vaikuttavan erottaen agonistien ja antagonistien sitoutumiseen moniin erilaisiin neurotransmitterien resep-30 toreihin. Yleensä guaniininukleotidit vähentävät agonis tien affiniteettia reseptoreihin ilman että antagonistien affiniteetti vähenee samanaikaisesti. Sen mukaisesti GTP:n on osoitettu vähentävän agonistien mutta ei antagonistien tehokkuutta adenosiinin antagonistin [3H]3-dietyyli-8-fe-35 nyyliksantiini sitoutumisen inhibiittoreina. Yleensä GTP suuresti vähentää puriiniagonistien, mutta ei antagonis- « 18 95133 tien, tehokkuutta [3H]fenyyli-isopropyyliadenosiinin sitoutumisen inhibiittoreina ja on sen vuoksi tehokas aine agonistien ja antagonistien erottamiseksi. (Katso L.P. Davies, S.C. Chow, J.H. Skerritt, D.J. Brown ja G.A.R.

5 Johnston, "Pyrazolo[3,4-d]Pyrimidines as Adenosine

Antagonists”, Life Sciences, 34, 2117 - 2128 (1984), joka liitetään tähän viitteenä). Yleensä on selvää, että adeno-siinin analogit toimivat agonisteina, jos 6-D-ribofurano-syyli on läsnä molekyylissä ^-asemassa, ja antagonisteina, 10 jos Rx on vety tai fenyyli.

Adenosiinin reseptorin suhteen selektiivisten ade-nosiiniaineiden farmaseuttisia valmisteita Käytettävä yhdisteen tai yhdisteiden tarkka määrä, toisin sanoen kysymyksessä olevan yhdisteen tai yhdistei-15 den määrä, joka on riittävä halutun vaikutuksen aikaansaamiseksi, riippuu erilaisista tekijöistä, kuten esimerkiksi käytettävästä yhdisteestä; antomuodosta; eläimen koosta, iästä ja lajista; antamisreitistä, -ajasta ja -kertojen tiheydestä; ja toivotusta fysiologisesta vaikutuksesta.

20 Erityisissä tapauksissa annettava määrä voidaan varmistaa tavanomaisten määränlöytämistekniikkojen avulla.

Yhdisteet annetaan edullisesti sellaisen valmisteen muodossa, joka sisältää yhdistettä seoksessa farmaseuttisesti hyväksyttävän kantaja-aineen kanssa, toisin sanoen 25 sellaisen kantaja-aineen kanssa, joka on kemiallisesti inertti aktiivisen yhdisteen suhteen ja jolla ei ole haitallisia sivuvaikutuksia tai joka ei ole myrkyllinen käytön olosuhteissa. Sellaiset valmisteet voivat sisältää määrästä noin 0,1 pg tai vähemmän määrään 50 mg aktiivista 30 yhdistettä ml:a kohden kantaja-ainetta pitoisuuteen noin 99 paino-% saakka aktiivista yhdistettä yhdessä farmaseuttisesti hyväksyttävän kantaja-aineen kanssa.

Valmisteet voivat olla kiinteissä muodoissa, kuten esimerkiksi tabletteja, kapseleita, granulaatteja, rehuse-35 koitteita, rehun lisäaineita ja tiivisteitä, jauheita, rakeita tai vastaavia; samoin kuin myös nestemäisissä muo- 19 95133 doissa, kuten esimerkiksi steriilejä ruiskutettavia suspensioita, suun kautta annettavia suspensioita tai liuoksia. Farmaseuttisesti hvyäksyttävät kantaja-aineet voivat käsittää sellaisia täyteaineita kuin esimerkiksi pinta-5 aktiivisia dispergoimisaineita, suspendoimisaineita, tab-letointisideaineita, liukastavia aineita, mausteita ja väriaineita. Sopivia täyteaineita on esitetty esimerkiksi sellaisissa teksteissä kuin Remington's Pharmaceutical Manufacturing, 13. painos. Mack Publishing Co., Easton, 10 Pennsylvania (1965).

Seuraavat esimerkit on esitetty tämän keksinnön valaisemiseksi, mutta niitä ei tulisi tulkita millään tavalla rajoittaviksi.

Esimerkki 1 15 Ensin 2,81 g l-fenyyli-4,6-diklooripyratsolo[3,4- d]pyrimidiiniä suspendoitiin 60 ml:aan etanolia. Sitten 3,2 g R-(+)-2-amino-3-fenyyli-l-propanolia lisättiin sekoittaen. 48 tunnin kuluttua liuotin poistettiin tyhjössä ja öljy "flash"-kromatografoitiin (2 - 5 - 7 % MeOH/CHCl3) 20 jolloin saatiin 3,80 g tuotetta (R)-8-[(l-fenyyli-6-kloo-ri-lH-pyratsolo[3,4-d]pyrimidin-4-yyli) amino] bentseenipro-panoli (95 %).

Seuraavaksi 1,234 g (R)-8-[(l-fenyyli-6-kloori-lH-pyratsolo [ 3,4-d] pyrimidin-4-yyli) amino] bentseenipropanolia 25 liuotettiin 50 ml:aan CHC13 ja 1,69 ml S0C12 lisättiin sekoittaen. 6 tunnin kuluttua seos sijoitettiin jäädyttimeen -28 °C:een yön ajaksi. Se suodatettiin sitten ja valkea sakka huuhdottiin 50 ml:11a kylmää CHC13. Valkea kiinteä aine koottiin ja sitä kuivattiin tyhjöuunissa 70 °C:ssa 24 30 tunnin ajan, jolloin saatiin 650 mg tuotetta (R)-2,7-di- • hydro-7-fenyyli-2-(fenyylimetyyli)-5-kloori-3H-imidat- so[l,2-c]pyratsolo[4,5-e]pyrimidiini.

50 mg: n natriumia annettiin reagoida 20 ml:ssa n-propanolia. Seuraavaksi 650 mg (R)-2,7-dihydro-7-fenyy-35 li-2-(fenyylimetyyli)-5-kloori-3H-imidatso[l,2-c]pyratso- lo[4,5-c]pyrimidiiniä lisättiin sekoittaen typpi-ilmake- 20 95133 hässä. Kun oli pidetty 1,5 tuntia huoneen lämpötilassa, samea valkea reaktioseos kaadettiin 100 ml:aan kyllästettyä NaCl-liuosta ja uutettiin 200 ml:11a CHC13. Orgaaninen kerros kuivattiin MgS04:n avulla, suodatettiin ja konsent-5 roitiin, jolloin saatiin öljy, joka puhdistettiin säteit-täisen kromatografiän avulla (10 - 20 - 30 % isopropyyli-alkoholi/heksaani, 4 mm:n levy), jolloin saatiin 200 mg tuotetta. Ohutkerroskromatografia kahdessa eri järjestelmässä osoitti tuotteen olevan puhtaan. Uudelleenkiteyttä-10 mällä yllä oleva tuote saatiin 132 mg (R)-2,7-dihydro-7-fenyyli-2-(fenyylimetyyli)-5-propoksi-3H-imidatso[l,2-c]-pyratsolo[4,5-e]pyrimidiiniä valkeana aineena (s.p. 45 - 48 eC).

Esimerkki 2 15 Ensin 5,0 g 6-klooripuriiniribosidia suspendoitiin 100 ml:aan kuivaa CH2C12, minkä jälkeen lisättiin 8,02 ml trietyyliamiinia. Reaktioseos jäähdytettiin 0 ”C:een, minkä jälkeen lisättiin 6,68 ml bentsoyylikloridia tipoit-tain. Kloridin lisäämisen jälkeen reaktioseoksen annettiin 20 lämmetä huoneen lämpötilaan ja sekoitettiin 24 tunnin ajan. Liuotin poistettiin tyhjössä ja jäännös liuotettiin 500 ml:aan etyylialkoholia. Orgaaninen kerros huuhdottiin 300 ml:11a vettä, 300 ml:11a kyllästettyä NaHC03-liuosta, 3 kertaa, 300 ml:11a kyllästettyä NaCl-liuosta, kuivattiin 25 MgS04:n avulla, suodatettiin ja konsentroitiin, jolloin saatiin ruskea öljy. Tämä puhdistettiin "flash”-kromatograf iän avulla (10 - 30 - 60 % etyylialkoholi/heksaani), jolloin saatiin 10,3 g 6-kloori-9-B-D-ribofuranosyyli- 2.3.5- tribentsoaatti-9H-puriinia.

30 Seuraavaksi 4,0 g 6-kloori-9-B-D-ribofuranosyyli- 2.3.5- tribentsoaatti-9H-puriinia yhdistettiin 1,01 g:n kanssa (R)-(+)-2-amino-3-fenyyli-l-propanolia, 0,92 ml:n kanssa Et3N ja 100 ml:n kanssa absoluuttista etanolia ja kuumennettiin palautusjäähdyttäen'4 tunnin ajan. Liuotin 35 poistettiin sitten tyhjössä ja jäännös puhdistettiin "flash”-kromatografiän avulla (5 - 10 - 20 % metano- ♦ „ 95133 21 li/CHCl3), jolloin saatiin noin 3,5 g tuotetta epäpuhtaana aineena. Tämä kromatografoltiin jälleen (5 - 10 % metano-11/CHC13), jolloin saatiin 3,35 g tuotetta. Tämä kromato-grafoitiin jälleen, jolloin saatiin 1,78 g puhdasta tuo-5 tetta (R)-B-[(9-B-D-ribofuranosyyli-2,3,5-tribentsoaatti-9H-purin-6-yyli)amino]bentseenipropanoli ja 1,26 epäpuhdasta materiaalia.

Seuraavaksi 1,78 g yllä olevaa puhdasta tuotetta (R)-B- [(9-B-D-ribofuranosyyli-2,3,5-tribentsoaatti-9H-10 purin-6-yyli)amino]bentseenipropanoli liuotettiin 60 ml:aan kuivaa CHC13 ja käsiteltiin 1,3 ml:11a S0C12. Seosta kuumennettiin sitten palautusjäähdyttäen 4 tunnin ajan ja se jäähdytettiin sitten huoneen lämpötilaan yön ajaksi. Liuotin poistettiin sitten tyhjössä, jolloin saatiin 1,94 15 g tuotetta. Tämä puhdistettiin "flash"-kromatografiän avulla (5 % MeOH/CHCl3), jolloin saatiin 200 mg ensimmäistä tuotetta ja 1 200 mg toista tuotetta. Toinen tuote säteit-täiskromatografoitiin (2 - 4 - 6 % Me0H/CHCl3, 2 mm:n levy) kaksi kertaa, jolloin saatiin 1,10 g vaahtotuotetta R-7,8-20 dihydro-3-(B-D-ribofuranosyyli-2,3,5-tribentsoaatti)-8- (fenyylimetyyli) -3H-di-imidatso [1,2-c:4',5'-e] pyrimidiini.

Sen jälkeen 580 mg vaahtotuotetta R-7,8-dihydro-3-(B-D-ribofuranosyyli-2,3,5-tribentsoaatti )-8-( fenyylime-tyyli)-3H-di-imidatso[1,2-c:4',5'-e]pyrimidiini liuotet-25 tiin 20 ml:aan metanolia ja käsiteltiin katalyyttisellä määrällä NaOMe. Kahden tunnin kuluttua ohutkerroskromato-grafia osoitti reaktion tapahtuneen loppuun. Liuotin poistettiin ja jäännös puhdistettiin säteittäisen kromatogra-fian avulla (20 % - 50 % MeOH/CHCl3, 1 mm:n levy), jolloin 30 saatiin noin 300 mg vaahtoa. Tämä uudelleenkiteytettiin noin 30 % isopropyylialkoholi/heksaanista, jolloin saatiin, sen jälkeen kun oli kuivattu tyhjössä 39 °C:ssa 144 tunnin ajan, 168 mg R-7,8-dihydro-3-(B-D-ribofuranosyyli)- 8-(f enyylimetyyli )-3H-di-imidatso[ 1,2-c: 4', 5' -e] pyrimidii-35 niä (s.p. 140 - 143 eC).

« 22 9 5 1 33 *

Esimerkki 3

Ensin 1,13 g lähtöainetta 4-kloori-l-fenyylipyrat-solo[3,4-d]pyrimidiini yhdistettiin 0,67 ml:n kanssa Et3N, 0,74 g:n kanssa (R)-(+)-2-amino-3-fenyyli-l-propanolia 60 5 ml:ssa absoluuttista etanolia ja kuumennettiin höyryhau-teessa neljän tunnin ajan. Liuotin poistettiin sitten tyhjössä ja jäännös puhdistettiin "flash”-kromatografiän avulla (10 - 20 % isopropyylialkoholi/heksaani), jolloin saatiin 1,24 g (R)-B-[l-fenyyli-lH-pyratsolo[3,4-d]pyrimi-10 din-4-yyli)amino]bentseenipropanolia (74 % saanto).

Seuraavaksi 1,24 g (R)-B-[1-fenyyli-lH-pyrat-solo [ 3,4-d] pyrimidin-4-yyli ) amino] bentseenipropanolia liuotettiin 60 ml:aan kuivaa CHC13, 1,82 ml S0C12 lisättiin ja reaktioseosta kuumennettiin palautusjäähdyttäen 4 tun-15 nin ajan. Jäähdyttämisen jälkeen liuotin poistettiin ja saostuma otettiin butanoniin. Valkea suspensio suodatettiin, jolloin saatiin valkea jauhe, joka uudelleekiteytet-tiin noin 5 % MeOH/butanonista, jolloin saatiin, sen jälkeen kun oli kuivattu tyhjöuunissa 85 *C:ssa 4 tunnin 20 ajan, 229,4 mg pitkiä, litteitä, kirkkaita kiteitä (R)- 2,7-dihydro-7-fenyyli-2-(fenyylimetyyli)-3H-imidatso[l,2-c]pyratsolo[4,3-e]pyrimidiiniä (s.p. 270 eC).

Esimerkki 4

Ensin 2,0 g 6-kloori-9-fenyylipuriinia yhdistettiin : 25 1,38 g:n kanssa (S)-(-)-2-amino-3-fenyyli-l-propanolia, 1,27 ml:n kanssa Et3N, 50 ml:n kanssa absoluuttista etanolia ja kuumennettiin palautusjäähdyttäen 5 tunnin ajan. Liuotin poistettiin avulla (2,5 - 5 % Me0H/CHCl3), jolloin saatiin 2,27 g tuotetta (76 % saanto). Tämä uudelleenki-30 teytettiin isopropyylialkoholi/heksaanista, joka oli noin 10 %, saaden sen jälkeen kun oli kuivattu tyhjössä 90 °C:ssa 30 päivän ajan 0,87 g valkeaa kiinteää ainetta (R)-B-[ (9-fenyyli-9H-purin-6-yyli) amino] bentseenipropanoli (s.p. 130 - 132 *C).

35 Seuraavaksi 1,13 g (R)-B[(9-fenyyli-9H-purin-6- yyli)amino]bentseenipropanolia liuotettiin 50 ml:aan CH2C12 - · 0 23 35133 1,7 ml:n kanssa S0C12 ja kuumennettiin palautusjäähdyttäen 6 tunnin ajan. Liuotin poistettiin sitten tyhjössä, jäännös otettiin butanoniin ja suodatettiin. Valkea saostuma uudelleenkiteytettiin noin 5 % MeOH/butanonista, jolloin 5 saatiin, sen jälkeen kun oli kuivattu tyhjössä 39 eC:ssa 2 päivän ajan, 530 mg (S)-7,8-dihydro-3-fenyyli-8-(fenyyli-metyyli)-3H-di-imidatso[l,2-c:4',5'-e]pyrimidiiniä (s.p. 270 eC).

Esimerkki 5 10 Ensin 5,0 g 6-klooripuriiniribosidia suspendoitiin 100 ml:aan kuivaa CH2C12, minkä jälkeen lisättiin 8,02 ml trietyyliamiinia. Reaktioseos jäähdytettiin 0 °C:een, minkä jälkeen lisättiin 6,68 ml bentsoyylikloridia tipoittaan. Kloridin lisäämisen jälkeen reaktioseoksen annettiin 15 lämmetä huoneen lämpötilaan ja sekoitettiin 24 tunnin ajan. Liuotin poistetaan tyhjössä ja jäännös liuotettiin 500 ml:aan etyylialkoholia. Orgaaninen kerros huhdottiin 300 ml:11a vettä, 300 ml:11a kyllästettyä NaHC03-liuosta, 3 kertaa, 300 ml:11a kyllästettyä NaCl-liuosta, kuivattiin 20 MgS04:n avulla, suodatettiin ja konsentroitiin, jolloin saatiin ruskea öljy. Tämä puhdistettiin "flash"-kromato-grafian avulla (10 - 30 - 60 % etyylialkoholi/heksaani), jolloin saatiin 10,3 g 6-kloori-9-B-D-ribofuranosyyli- 2.3.5- tribentsoaatti-9H-puriinia.

25 Seuraavaksi 4,0 g 6-kloori-9-B-D-ribo£uranosyyli- 2.3.5- tribentsoaatti-9H-puriinia yhdistettiin 1,01 g:n kanssa (S)-(-)-2-amino-3-fenyyli-l-propanolia ja 0,92 ml:n kanssa Et3N absoluuttisessa etanolissa (100 ml) ja kuumennettiin palautusjäähdyttäen 4 tunnin ajan. Liuotin pois- 30 tettiin sitten tyhjössä ja jäännös puhdistettiin "flash"-• kromatografian avulla (5 % MeOH/CHCl3), jolloin saatiin 2,36 g (S)-B-[(9-B-D-ribofuranosyyli-2,3,5-tribentsoaatti-9H-purin-6-yyli)amino]bentseenipropanolia ja 1,73 g epäpuhdasta materiaalia.

35 Seuraavaksi 2,36 g (S)-β-[(9-6-D-ribofuranosyyli- 2.3.5- tribentsoaatti-9H-purin-6-yyli) amino] bentseenipropa- 24 9 5 1 33 nolla liuotettiin 80 ml:aan kuivaa CH2C12 ja käsiteltiin 1,7 ml :11a S0C12. Reaktioseosta kuumennettiin palautus jäähdyttäen 4 tunnin ajan, se jäähdytettiin huoneen lämpötilaan, sekoitettiin yön ajan ja liuotin poistettiin tyhjös-5 sä. Jäännös puhdistettiin "flash"-kromatografiän avulla (5 % MeOH/CHCl3), jolloin saatiin 1,77 g S-7,8-dihydro-3-(B-D-ribof uranosyyli-2,3,5-tribentsoaatti )-8-( fenyylimetyy-li)-3H-di-imidatso[l,2-c:4',5'-e]pyrimidiiniä (77 % saanto) .

10 1,77 g S-7,8-dihydro-3-(β-D-ribofuranosyyli-2,3,5- tribentsoaatti)-8-( fenyylimetyyli)-3H-di-imidatso[l,2-c:4',5'-e]pyrimidiiniä liuotettiin 60 ml:aan metanolia ja käsiteltiin katalyyttisellä määrällä NaOMe. 24 tunnin kuluttua liuotin poistettiin tyhjössä ja jäännös puhdistet-15 tiin "flash"-kromatografiän avulla (10 - 20 - 50 %

MeOH/CHClj, 2 mm:n levy), jolloin saatiin 700 mg tuotetta. Tämä hierrettiin eetteri/heksaanin (noin 5 %) kanssa, kuivattiin tyhjössä 39 *C:ssa 6 päivän ajan, jolloin saatiin 470 mg S-7,8-dihydro-3-(β-D-ribofuranosyyli)-8-( fenyylime-20 tyyli)-3H-di-imidatso[l,2-c:4',5'-e]pyrimidiiniä.

Esimerkki 6 2,5 g lähtöainetta l-fenyyli-4,6-diklooripyrat-solo[3,4-d]pyrimidiini suspendoitiin 60 ml:aan etanolia. Seuraavaksi 4,28 g (S)-(-)-2-amino-3-fenyyli-1-propanolia 25 lisättiin ja reaktioseosta sekoitettiin 24 tunnin ajan. Liuotin poistettiin sitten tyhjössä ja raaka öljy puhdistettiin "flash"-kromatografiän avulla (10 - 15 - 20 % iso-propyyli-alkoholi/heksaani), jolloin saatiin 3,5 g (S)-B-t (l-fenyyli-6-kloori-lH-pyratsolo[3,4-d]pyrimidin-4-yyli )-30 amino]bentseenipropanolia (97 %).

1,037 g yllä olevaa tuotetta (S)-β-[(l-fenyyli-6-kloori-lH-pyratsolo[3,4-d]pyrimidin-4-yyli)amino]bentsee-nipropanoli liuotettiin sitten 25 ml:aan CHC13. Seuraavaksi 1,38 ml tionyylikloridia lisättiin ja reaktioseosta sekoi-35 tettiin yön ajan. Se sijoitettiin sitten jäädyttimeen -28 °C:een. 5 tunnin kuluttua saostuma suodatettiin ja

II

25 95133 koottiin pesten kylmällä CHCl3:lla. Valkeaa kiinteää ainetta kuivattiin tyhjöuunissa 70 °C:ssa 24 tunnin ajan, jolloin saatiin 550 mg (S)-2,7-dihydro-7-fenyyli-2-(fenyyli-metyyli)-5-kloori-3H-imidatso[1,2-c]pyratsolo[4,3-e]pyri-5 midiiniä (56 %).

Sitten 20 mg: n natriumia annettiin reagoida 3 ml:ssa n-propanolia. Liuos jäähdytettiin jäähauteen avulla ja 209 mg yllä olevaa tuotetta (S)-2,7-dihydro-7-fenyyli- 2- (fenyylimetyyli) -5-kloori-3H-imidatso[ 1,2-c] pyratsolo-10 [4,3-e]pyrimidiini lisättiin sekoittaen. Yhden tunnin ku luttua reaktioseos kaadettiin 100 ml:aan kyllästettyä NaCl-liuosta ja uutettiin 200 ml:11a CMC13. Orgaaninen kerros kuivattiin MgS04:n avulla, suodatettiin ja konsentroitiin, jolloin saatiin öljy, joka puhdistettiin säteittäi-15 sen kromatografian avulla (5 - 10 % Me0H/CHCl3, 2 mm:n levy), jolloin saatiin 168 mg (S)-2,7-dihydro-7-fenyyli-2-( fenyylimetyyli )-5-propoksi-3H-imidatso[l, 2-c]pyratsolo-[4,3-e]pyrimidiiniä (75 %).

Esimerkki 7 20 Ensin 2 g lähtöainetta l-fenyyli-4,6-diklooripyrat- solo[3,4-d]pyrimidiini suspendoitiin 50 ml:aan etanolia, minkä jälkeen lisättiin 5,6 g IS,2R-norefedriiniä. Sen jälkeen kun oli sekoitettu 24 tunnin ajan, liuotin poistettiin tyhjössä ja raaka materiaali puhdistettiin 25 "flash"-kromatografian avulla (10 % isopropyylialkoho- li/heksaani), jolloin saatiin 1,90 g [R-(S*,R*)]-a-[l-[(l-fenyyli-6-kloori-lH-pyratsolo[3,4-d]pyrimidin-4-yyli)amino] etyyli]bentseenimetanolia.

Seuraavaksi 1,9 g yllä olevaa tuotetta [R-(S*,R*)]-30 a-[1-[(l-fenyyli-6-kloori-lH-pyratsolo[3,4-d]pyrimidin-4- yyli)amino]etyyli]bentseenimetanoli yhdistettiin 2,2 ml:n kanssa S0C12 150 ml:ssa CH3CN sekoittaen. 20 tunnin kuluttua liuotin poistettiin tyhjössä ja ruskea jäännös otettiin 250 ml:aan CHC13. orgaanista liuosta huuhdottiin 200 35 ml:11a H20, 200 ml:11a kyllästettyä NaCl-liuosta, kuivat tiin MgS04:n avulla, suodatettiin ja konsentroitiin, joi- 95133 26 loin saatiin ruskea öljy, joka puhdistettiin "flash"-kro-matografian avulla (50 % etanoli/heksaani), jolloin saatiin 850 mg kirkasta paksua öljyä (2R-trans)-2,7-dihydro-2-metyyli-3,7-difenyyli-5-kloori-3H-imidatso[1,2-c]pyrat-5 solo[4,3-e]pyrimidiini.

51 mg natriumia liuotettiin 5 ml:aan n-propanolia. 670 mg yllä olevaa tuotetta (2R-trans)-2,7-dihydro-2-me-tyyli-3,7-difenyyli-5-kloori-3H-imidatso[l,2-c]pyratsolo-[4,3-e]pyrimidiini, joka oli liuotettu 15 ml:aan n-propa- 10 nolla, lisättiin propoksidiliuokseen sekoittaen, yhden tunnin kuluttua reaktioseos kaadettiin 200 ml:aan kylläs tettyä NaCl-liuosta ja uuteet kuivattiin MgS04:n avulla, suodatettiin ja konsentroitiin, jolloin saatiin öljy, joka puhdistettiin säteittäisen kromatografian avulla 15 (30 - 50 - 70 - 90 % etanoli/heksaani, 2 mm:n levy), jol loin saatiin 600 mg (2R-trans)-2,7-dihydro-2-metyyli-3,7-dif enyyli-5-propoksi-3H-imidatso [ 1,2-c] pyratsolo [ 4,3-e] py-rimidiiniä.

Esimerkki 8 20 Ensin 2,0 g 6-kloori-9-fenyylipuriinia yhdistettiin 1,38 g: n kanssa (R)-( + )-2-amino-3-fenyyli-l-propanolia, 1,27 ml:n kanssa Et3N, 50 ml:n kanssa absoluuttista etanolia ja kuumennettiin palautusjäähdyttäen 5 tunnin ajan. Sitten poistettiin liuotin ja jäännös puhdistettiin j 25 "flash"-kromatografian avulla (5 % MeOH/CHCl3), mitä seurasi toinen puhdistaminen (2,5 - 5 % MeOH/CHCl3), jolloin saatiin 2,66 g valkeaa vaahtoa (88 % saanto). Tämä uudel-leenkiteytettiin 10 % isopropyylialkoholi/heksaanista ja kuivattiin tyhjössä 90 °C:ssa 4 päivän ajan, jolloin saa-30 tiin 1,28 g valkeaa kiinteää ainetta (R)-B-[(9-fenyyli-9H-purin-6-yyli)amino)bentseenipropanoli (s.p. 130 -132 °C).

Seuraavaksi 1,0 g yllä olevaa tuotetta (R)-B-[(9-fenyyli-9H-purin-6-yyli)amino]bentseenipropanoli liuotet-35 tiin 50 ml:aan CH2C12 1,5 ml:n kanssa S0C12 ja kuumennettiin palautusjäähdyttäen 6 tunnin ajan. Liuotin poistettiin tyhjössä, jäännös otettiin butanoniin ja suodatettiin.

»

II

27 95133

Valkea saostuma uudelleenkiteytettiin noin 5 % metano-li/butanonista, jolloin saatiin, sen jälkeen kun oli kuivattu tyhjössä 3 päivän ajan, 430 mg (R)-7,8-dihydro-3-fenyyli-8-(fenyylimetyyli)-3H-di-imidatso[l,2-c:4’,5'-e]-5 pyrimidiiniä.

Esimerkki 9

Ensin 2,5 g 6-klooripuriinia liuotettiin 60 ml:aan absoluuttista etanolia, minkä jälkeen lisättiin 2,25 ml Et3N ja 2,45 g R-( + )-2-amino-3-fenyyli-l-propanolia sekoit-10 taen. Reaktioseosta haihdutettiin tyhjössä ja jäännös puhdistettiin "flash"-kromatografiän avulla (10 - 15 %

MeOH/CHCl3), jolloin saatiin 3,35 g tuotetta. Tämä uudelleenkiteytettiin noin 40 % isopropyylialkoholi/heksaanis-ta, jolloin saatiin 2,23 g R-8-[(lH-purin-6-yyli)amino]-15 benteenipropanolia sen jälkeen kun oli kuivattu tyhjössä 80 °C:ssa 48 tunnin ajan.

Tämän jälkeen 1,5 g yllä olevaa tuotetta R-8-[(lH-purin-6-yyli)amino]bentseenipropanoli suspendoitiin 60 ml:aan kuivaa CH2C12, minkä jälkeen lisättiin 2,85 ml S0C12. 20 Reaktioseosta kuumennettiin palautusjäähdyttäen 4 tunnin ajan sen annettiin sitten jäähtyä huoneen lämpötilaan yön ajaksi. Liuotin poistettiin tyhjössä ja jäännös otettiin 100 ml:aan butanonia. Tämä suodatettiin, jolloin saatiin 1670 mg keltaista kiinteää ainetta. Tämä uudelleenkitey-25 tettiin 10 % MeOH/butanonista, jolloin saatiin tyhjöuunis-sa 85 °C:ssa kuivaamisen jälkeen 690 mg tuotetta. Vapaa emäs valmistettiin käsittelemällä NaHC03:lla ja jäännös puhdistettiin säteittäisen kromatografiän avulla (10 - 20 % MeOH/CHCl3, 2 mm:n levy), jolloin saatiin, sen jälkeen 30 kun oli kuivattu suurtyhjössä 39 °C:ssa 6 päivän ajan, 97,0 mg (R)-7,8-dihydro-8-(fenyylimetyyli)-lH-di-imidatso- » [1,2-c:4',5'-e]pyrimidiiniä (s.p. 140 eC).

Esimerkki 10

Ensin 1 g lähtöainetta 4-kloori-l-fenyylipyratsolo-35 [3,4-d]pyrimidiini yhdistettiin 651 mg:n kanssa (S)-(-)-2-amino-3-fenyyli-l-propanolia ja 0,6 ml:n kanssa Et3N 60 28 95133 ml:ssa absoluuttista etanolia ja kuumennettiin palautus-jäähdyttäen 5 tunnin ajan. Sitten poistettiin liuotin tyhjössä ja jäännös puhdistettiin "flash"-kromatografiän avulla (10 - 15 - 20 % isopropyylialkoholi/heksaani), jol-5 loin saatiin valkea kiinteä aine, joka uudelleenkiteytet-tiin noin 20 % isopropyylialkoholi/heksaanista, jolloin saatiin, sen jälkeen kun oli kuivattu tyhjöuunissa, 1,06 g (S)—β—[(l-fenyyli-lH-pyratsolo[3,4-d]pyrimidin-4-yyli)-amino]bentseenipropanolia (s.p. 114 - 117 *C).

10 Seuraavaksi 300 mg yllä olevaa tuotetta (S)-S-[(l- fenyyli-lH-pyratsolo[3,4-d]pyrimidin-4-yyli)amino]bentsee-nipropanoli liuotettiin 15 ml:aan CH2C12, minkä jälkeen lisättiin 0,44 ml S0C12. Reaktioseosta kuumennettiin palautus jäähdyttäen 3,5 tunnin ajan. Liuotin poistettiin sitten 15 typpivirran alla. Valkea kiinteä aine uudelleenkiteytet- tiin noin 30 % isopropyylialkoholi/heksaanista, mitä seurasi toinen uudelleenkiteyttäminen noin 5 % MeOH/butano-nista, jolloin saatiin 45 mg (S)-2,7-dihydro-7-fenyyli-2-( fenyylimetyyli)-3H-imidatso[1,2-c]pyratsolo-(4,3-e]pyri-20 midiiniä sen jälkeen kun oli kuivattu tyhjössä 39 eC:ssa 5 päivän ajan (s.p. 255 eC).

Esimerkki 11

Aluksi 2,5 g 6-klooripuriinia suspendoitiin 60 ml:aan etanolia. Seuraavaksi 2,45 g (S)-(-)-2-amino-3-fe-: 25 nyyli-l-propanolia ja 2,25 ml Et3N lisättiin ja reaktio- t seosta sekoitettiin 16 tunnin ajan huoneen lämpötilassa. Ohutkerroskromatografia ei osoittanut muutosta. Seosta kuumennettiin sitten palautusjäändyttäen 20 tunnin ajan. Liuotin poistettiin sitten tyhjössä ja jäännös puhdistet-30 tiin "flash"-kromatografiän avulla (10 % MeOH/CHCl3), jolloin saatiin noin 3 g tuotetta. Tämä uudelleenkiteytettiin 2 kertaa käyttäen noin 40 % isopropyylialkoholi/heksaania, jolloin saatiin, sen jälkeen kun oli kuivattu tyhjöuunissa 80 eC:ssa 72 tunnin ajan, 2,13 g valkeaa kiinteää ainetta 35 S-β-[(lH-purin-6-yyli)amino]bentseenipropanoli (s.p. 207 - 209 °C).

29 95133

Seuraavaksi 300 mg yllä olevaa tuotetta S-B-[(1H-purln-6-yy1i)-amino]bentseenipropanoliuudelleensuspendoi-tiin 20 ml:aan CH2C12. Sitten 0,57 ml S0C12 lisättiin ja reaktioseosta kuumennettiin palautusjäähdyttäen 4 tunnin 5 ajan. Liuotin poistettiin sitten tyhjössä ja valkea kiinteä aine otettiin butanoniin. Suspensio suodatettiin ja valkea saostuma uudelleenkiteytettiin 5 % MeOH/butanonis-ta, jolloin saatiin 116,9 mg lievästi keltaisia kiteitä. Näitä kuivattiin tyhjössä 80 *C:ssa 24 tunnin ajan, jol-10 loin saatiin 88 mg (S)-7,8-dihydro-8-(fenyylimetyyli)-lH-di-imidatso[l,2-c:4',5'-e]pyrimidiiniä (s.p. 268 - 270 eC).

Esimerkki 12

Ensin 1,5 g lähtöainetta l-fenyyli-4,6-diklooripy-15 ratsolo[3,4-d]pyrimidiinisuspendoitiin 40 ml:aan etanolia. Sitten 2,6 g 1R,2S-(-)-norefedriiniä lisättiin ja reaktio-seosta sekoitettiin 48 tunnin ajan. Liuotin poistettiin ja öljy "flash"-kromatografoltiin (50 - 70 % Et20/heksaani), jolloin saatiin 2,1 g [S-(R*,S*)]-a-[l-[(l-fenyyli-6-kloo-20 ri-lH-pyratsolo[3,4-d]pyrimidin-4-yyli)amino]etyyli]bent- seenimetanolia.

Seuraavaksi 700 mg yllä olevaa tuotetta [S-(R*,S*)]-a-[1-[(1-fenyyli-6-kloori-lH-pyratsolo[3,4-d]py-rimidin-4-yyli)amino]etyyli]bentseenimetanoli liuotettiin 25 50 ml:aan CH3CN, minkä jälkeen lisättiin 0,26 ml S0C12 se- 1 koittaen. Reaktioseosta sekoitettiin 24 tunnin ajan. Sit ten poistettiin liuotin ja jäännös "flash”-kromatografoltiin (2-4-8-10% MeOH/CHCl3), jolloin saatiin 840 mg tuotteen ja lähtöaineen seosta. Tätä puhdistettiin jälleen 30 säteittäisen kromatografiän avulla (20 - 30 - 50 % etano-li/heksaani, 4 mm:n levy), jolloin saatiin 210 mg (2S- • trans)-2,7-dihydro-2-metyyli-3,7-difenyyli-5-kloori-3H-imidatso(1,2-c]pyratsolo[4,3-e]pyrimidiiniä.

Sen jälkeen noin 16 mg natriumia liuotettiin 1 35 ml:aan n-propanolia, minkä jälkeen lisättiin 210 mg yllä olevaa tuotetta (2S-trans)-2,7-dihydro-2-metyyli-3,7-dife- • 4 30 55133 * nyyli-S-kloori-3H-imidatso [ 1,2-c] pyratsolo [ 4,3-e]pyrimi -diini 4 mlrssa n-propanolia sekoittaen, jolloin muodostui valkea saostuma (NaCl). Kolmen tunnin kuluttua reaktioseos kaadettiin 100 ml:aan kyllästettyä NaCl-liuosta ja uutet-5 tiin CHCl3:lla (2 kertaa, 100 ml). Yhdistetyt orgaaniset uutteet konsentroitiin tyhjössä, jolloin saatiin öljy, joka puhdistettiin säteittäisen kromatografian avulla (2 % MeOH/CHClj, 2 mm:n levy), jolloin saatiin 217 mg valkeaa vaahtoa. Tätä kuivattiin 8 päivän ajan käyttäen P203:a tyh-10 jössä, jolloin saatiin noin 180 mg (2S-trans)-2,7-dihydro-2-metyyli-3,7-difenyyli-5-propoksi-3H-imidatso[l, 2-c] pyratsolo [4,3-e]pyrimidiiniä.

Esimerkki 13 100 g violuriinihappoa lisättiin 1 litraan vettä 15 sekoittaen voimakkaasti lakisekoittimen avulla ja kuumennettiin 70 eC:een. 200 g natriumvetysulfiittia lisättiin annoksittain 15 minuutin aikana. 2,5 tunnin kuluttua reaktioseos suodatettiin ja saostuma huuhdottiin vedellä. Kiinteää ainetta kuivattiin tyhjössä 98 eC:ssa 3 tunnin 20 ajan, jolloin saatiin 75 g 5-amino-2,4,6-trihydroksipyri-midiiniä.

75 g 5-amino-2,4, 6-trihydroksipyrimidiiniä liuotettiin 1,5 - 5 % natriumhydroksidiliuokseen sekoittaen voimakkaasti lakisekoittimen avulla, jolloin muodostui vio-25 letti liuos. Reaktioseos kuumennettiin 60 °C:een ja 63 ml fenyyli-isotiosyanaattia lisättiin tipoittain 1,5 tunnin aikana. Reaktioseos muuttui vaalean keltaiseksi. Reaktio-seosta sekoitettiin vielä 2 tunnin ajan 60 *C:ssa, se jäähdytettiin ja tehtiin happamaksi jääetikan avulla, jol-30 loin muodostui vaalean keltainen saostuma. Tämä suodatettiin, jolloin saatiin noin 75 g N-(2,4,6-trihydroksi-5-pyrimidyyli)-N'-fenyylitioureaa.

Noin 75 g N-(2,4,6-trihydroksi-5-pyrimidyyli)-N'-fenyylitioureaa yhdistettiin 600 ml:n kassa väkevää kloo-35 rivetyhappoa ja kuumennettiin palautusjäähdyttäen 5 tunnin ajan (esiintyi huomattavasti vaahtoamista). Seos laimen- 3i 95133 nettiin sitten 2 litralla vettä ja suodatettiin välittömästi ja pestiin vedellä. Tätä kuivattiin tyhjössä 80 °C:ssa 2 päivän ajan, jolloin saatiin 50,08 g tuotetta (34 % saanto violuriinihaposta). Pientä näytettä hierret-5 tiin kuuman jääetikan kanssa, jolloin saatiin välituote 2.6- dihydroksi-9-fenyyli-8-puriinitioli.

10 g 2,6-dihydroksi-9-fenyyli-8-puriinitiolia liuotettiin noin 100 ml:aan 1 N natriumhydroksidia, minkä jälkeen lisättiin noin 30 g Raney-nikkeliä. Esiintyi lievää 10 vaahtoamista. Reaktioseos kuumennettiin hitaasti jäähdy-tyspalautuslämpötilaan (öljyhaude noin 120 eC). 1,5 tunnin kuluttua reatioseos suodatettiin. Suodos jäähdytettiin noin 4 °C:een ja suodatettiin. Valkea kiinteä aine liuotettiin kuumaan veteen, käsiteltiin hiilellä, suodatettiin 15 ja käsiteltiin väkevällä kloorivetyhapolla, jolloin muodostui valkea saostuma. Tämä suodatettiin, kuivattiin tyhjössä 80 eC:ssa kolmen tunnin ajan, jolloin saatiin 3,3 g 2.6- dihydroksi-9-fenyylipuriinia (38 % saanto).

3,3 g 2,6-dihydroksi-9-fenyylipuriinia lisättiin 20 sekoitettuun suspensioon, jossa oli 17 g PC15 83 ml:ssa P0C13. Reaktioseosta kuumennettiin palautusjäähdyttäen 26 tunnin ajan (öljyhaude 120 °C). Jäähdyttämisen jälkeen liuotin poistettiin tyhjössä, jäännös sammutettiin varovaisesti jäävedessä ja vesiliuosta uutettiin Et20:llä (3 25 kertaa, 200 ml). Yhdistetyt orgaaniset uutteet kuivattiin MgS04:n avulla, suodatettiin ja konsentroitiin, jolloin saatiin 3,52 g tuotetta. Sen jälkeen kun oli uudelleenki-teytetty etanoli/vedestä, tätä kuivattiin tyhjössä 80 eC:ssa 3 päivän ajan, jolloin saatiin 1,40 g 2,6-di-30 kloori-9-fenyylipuriinia.

1,24 g 2,6-dikloori-9-fenyylipuriinia yhdistettiin 50 ml:n kanssa absoluuttista etanolia, 0,7 ml:n kanssa trietyyliamiinia, 0,71 g:n kanssa R-( + )-2-amino-3-fenyyli-1-propanolia ja kuumennettiin palautusjäähdyttäen 5 tunnin 35 ajan. Liuotin poistettiin sitten tyhjössä ja jäännös puhdistettiin "flash"-kromatografiän avulla (5 % metano- 32 95133 li/trikloorimetaani), jolloin saatiin 1,47 g (R)-B-[(9-fenyyli-2-kloori-lH-purin-6-yyli) amino] bentseenipropano-lia.

340 mg natriumia liuotettiin 40 ml:aan n-propano-5 lia. 1,4 g (R)-B-[(9-fenyyli-2-kloori-lH-purin-6-yyli)-amino]bentseenipropanolia lisättiin ja reaktioseosta kuumennettiin palautusjäähdyttäen 4 tunnin ajan. Jäähdyttämisen jälkeen reatioseos kaadettiin noin 200 ml:aan 95 % kyllästettyä natriumkloridiliuosta ja uutettiin trikloori-10 metaanilla (3 kertaa, 200 ml). Yhdistetyt orgaaniset uutteet kuivattiin MgS04:n avulla, suodatettiin ja konsentroitiin. Jäännös puhdistettiin "flash"-kromatografiän avulla (2 % metanoli/trikloorimetaani), jolloin saatiin 1,41 g tuotetta. Tämä uudelleenkiteytettiin noin 5 % isopropyyli-15 alkoholi/heksaanista, jolloin saatiin 1,05 g epäpuhdasta tuotetta. 300 mg uudelleenkiteytettiin jälleen 5 % isopro-pyylialkoholi/heksaanista, jolloin saatiin, sen jälkeen kun oli kuivattu tyhjössä 80 °C:ssa 168 tunnin ajan, 211 mg (R)-B-[(2-propoksi-9-fenyyli-lH-purin-6-yyli)amino]- 20 bentseenipropanolia (s.p. 127 - 128 *C).

750 mg (R)-B-[(2-propoksi-9-fenyyli-lH-purin-6-yyli)amino]bentseenipropanolia liuotettiin 40 ml:aan kuivaa dikloorimetaania, käsiteltiin 0,95 ml:11a S0C12 ja kuumennettiin palautusjäähdyttäen 3 tunnin ajan. Liuotin 25 poistettiin sitten tyhjössä ja jäännös puhdistettiin sä-teittäisen kromatografiän avulla (5 % metanoli/trikloorimetaani ).

Tuote uudelleenkiteytettiin sitten noin 20 % iso-propyylialkoholi/heksaanista, jolloin saatiin 180 mg tuo-30 tetta. Tämä puhdistettiin jälleen säteittäisen kromatogra-. fian avulla (3 - 6 % metanoli/trikloorimetaani, 2 mm:n levy), jolloin saatiin jäännös, jota hierrettiin eetterin kanssa. Kiinteä aine koottiin ja sitä kuivattiin tyhjössä 39 °C:ssa 168 tunnin ajan, jolloin saatiin 114,2 mg tuo-35 tetta vaalean ruskeana kiinteänä aineena. Tämä puhdistettiin säteittäisen kromatografiän avulla (3 - 6 % metano-

II

33 95133 li/trikloorimetaani), jolloin saatiin 60 mg (R)-7,8-dihyd-ro-3-fenyyli-8-(fenyylimetyyli)-5-propoksi-3H-di-imidat-so[l,2-c:4',5'-e]pyrimidiiniä.

Esimerkki 14 5 100 g violuriinihappoa lisättiin 1 litraan vettä sekoittaen voimakkaasti lakisekoittimen avulla ja kuumennettiin 70 eC:een. 200 g natriumvetysulfiittia lisättiin annoksittain 15 minuutin aikana. 2,5 tunnin kuluttua reak-tioseos suodatettiin ja saostuma huuhdottiin vedellä. 10 Kiinteää ainetta kuivattiin tyhjössä 98 9C:ssa 3 tunnin ajan, jolloin saatiin 75 g 5-amino-2,4,6-trihydroksipyri-midiiniä.

75 g 5-amino-2,4,6-trihydroksipyrimidiiniä liuotettiin 1,5 - 5 % natriumhydroksidiliuokseen sekoittaen voi-15 makkaasti lakisekoittimen avulla, jolloin saatiin violetti liuos. Reaktioseos kuumennettiin 60 °C:een ja 63 ml fenyy-li-isotiosyanaattia lisättiin tipoittain 1,5 tunnin aikana. Reaktioseos muuttui vaalean keltaiseksi. Reaktioseosta sekoitettiin vielä 2 tunnin ajan 60 °C:ssa, jäähdytettiin 20 ja tehtiin happamaksi jääetikalla, jolloin muodostui vaalean keltainen saostuma. Tämä suodatettiin, jolloin saatiin noin 75 g N-(2,4,6-trihydroksi-5-pyrimidyyli)-N'-fe-nyylitioureaa.

Noin 75 g N-(2,4,6-trihydroksi-5-pyrimidyyli)-N*-25 fenyylitioureaa yhdistettiin 600 ml:n kanssa väkevää kloo-rivetyhappoa ja kuumennettiin palautusjäähdyttäen 5 tunnin ajan (esiintyi huomattavaa vaahtoamista). Seos laimennettiin sitten 2 litralla vettä ja suodatettiin välittömästi ja pestiin vedellä. Tätä kuivattiin tyhjössä 80 9C:ssa 2 30 päivän ajan, jolloin saatiin 50,08 g tuotetta (34 % saanto violuriinihaposta). Pientä näytettä hierrettiin kuuman jääetikan kanssa, jolloin saatiin 2,6-dihydroksi-9-fenyy-li-8-puriinitiolia.

2,5 g 2,6-dihydroksi-9-fenyyli-8-puriinitiolia 35 liuotettiin 250 ml:aan 1 N natriumhydroksidia ja käsiteltiin 75 g:11a Raney-nikkeliä. Seosta kuumennettiin selli- 34 95133 tin lävitse kuumana. Suodos jäähdytettiin noin 2 °C:een, valkea saostuma koottiin, liuotettiin kuumaan veteen, käsiteltiin hiilellä, suodatettiin, jäähdytettiin jäähau-teessa ja tehtiin happamaksi väkevällä kloorivetyhapolla.

5 Valkea tuote koottiin ja sitä kuivattiin tyhjössä 70 eC:ssa 2 päivän ajan, jolloin saatiin 11,3 g 2,6-dihyd-roksi-9-fenyy1ipuriinia.

11,2 g 2,6-dihydroksi-9-fenyylipuriinia yhdistettiin 280 ml:n kanssa P0C13 ja 57 g:n kanssa PC15 ja kuumen-10 nettiin palautusjäähdyttäen (öljyhaude, 120 °C) 24 tunnin ajan. Liuotin poistettiin sitten tyhjössä ja jäännös sammutettiin jäissä. Vesiliuosta uutettiin eetterillä (4 kertaa 500 ml), yhdistetyt orgaaniset uutteet kuivattiin MgS04:n avulla, suodatettiin ja konsentroitiin, jolloin 15 saatiin noin 4 g tuotetta keltaisena kiinteänä aineena.

Tämä uudelleenkiteytettiin etanoli/vedestä, jolloin saatiin 2,39 g 2,6-dikloori-9-fenyylipuriinia sen jälkeen kun oli kuivattu tyhjössä 80 °C:ssa 48 tunnin ajan.

2,0 g 2,6-dikloori-9-fenyylipuriinia yhdistettiin 20 1,15 g:n kanssa S-(+)-2-amino-3-fenyyli-l-propanolia, 1,13 ml:n kanssa trietyyliamiinia ja 70 ml:n kanssa absoluuttista etanolia. Reaktioseosta kuumennettiin sitten palautus jäähdyttäen 4 tunnin ajan. Liuotin poistettiin sitten tyhjössä ja jäännös puhdistettiin "flash"-kromatografiän 25 avulla (3 - 5 % metanoli/trikloorimetaani), jolloin saatiin 2,77 g (S)-B-[(9-fenyyli-2-kloori-lH-purin-6-yyli)-amino]bentseenipropanolia.

836 mg natriumia liuotetiin 60 ml:aan n-propanolia.

2,76 g (S)-B-[(9-fenyyli-2-kloori-lH-purin-6-yyli)amino]-30 bentseenipropanolia, joka oli 20 ml:ssa n-propanolia, li-. sättiin reaktioseokseen ja kuumennettiin palautusjäähdyt täen 5 tunnin ajan. Jäähdyttämisen jälkeen se kaadettiin 200 ml:aan 95 % natriumkloridiliuosta ja uutettiin tri-kloorimetaanilla (3 kertaa, 200 ml). Yhdistetyt orgaaniset 35 uutteet kuivattiin MgS04:n avulla, suodatettiin ja konsentroitiin, jolloin saatiin jäännös, joka puhdistettiin 35 95133 "flash"-kromatografiän avulla. Tällöin saatiin 2,15 g tuotetta. Tämä uudelleenkiteytettiin 5 % isopropyylialkoho-li/heksaanista, jolloin saatiin, sen jälkeen kun oli kuivattu tyhjössä 70 °C:ssa 24 tunnin ajan, 1,78 g (S)—β—[(2— 5 propoksi-9-fenyyli-lH-purin-6-yyli)amino]bentseenipropano- lia (s.p. 126 - 128 eC).

1,2 g (S)-8-[(2-propoksi-9-fenyyli-lH-purin-6-yyli)amino]bentseenipropanolia liuotettiin 60 ml:aan kuivaa dikloorimetaania ja käsiteltiin 1,53 ml:11a S0C12. 10 Reaktioseosta kuumennettiin palautusjäähdyttäen N2:n alla 4 tunnin ajan. Liuotin poistettiin sitten tyhjössä ja jäännös puhdistettiin "flash”-kromatografiän avulla (5 % metanoli/trikloorimetaani), jolloin saatiin 0,99 g tuotetta. Tätä kuivattiin suurtyhjössä 39 °C:ssa 7 päivän ajan, 15 jolloin saatiin 437,8 mg (S)-7,8-dihydro-3-fenyyli-8-(fe- nyylimetyyli)-5-propoksi-3H-di-imidatso[l,2-c:4',5'-e]py-rimidiiniä (s.p. 74 - 80 *C).

«

Claims (16)

95133

1. Menetelmä uusien terapeuttisesti käyttökelpoisten kaavan I mukaisten di-imidatsopyrimidiini- ja imidat-5 sopyratsolopyrimidiinijohannaisten ja niiden farmaseuttisesti hyväksyttävien suolojen valmistamiseksi, M \ CH2

10 HC—(I> R2 N »f i5 i Rl jossa kaavassa Rx on vety, fenyyli tai B-D-ribofuranosyyli; R2 on vety tai propoksi; Y on N tai CH; Z on N tai CH, sil-20 lä edellytyksellä, että Y ja Z eivät ole identtisiä; L on vety tai fenyyli; ja M on fenyyli, paitsi silloin kun L on fenyyli, jossa tapauksessa M on vety, tunnettu siitä, että a) kaavan I mukaisten yhdisteiden valmistamiseksi, 25 joissa R2 on vety, yhdiste, jonka kaava on Cl 30 Λ'S' • * : Rl jossa Rj, Y ja Z tarkoittavat samaa kuin edellä, ja R2 on vety, saatetaan reagoimaan yhdisteen kanssa, jonka kaava 35 on i 11 95133 4 4 β 5 /-(-' Η0 η2ν 1-24 tunnin ajan lämpötilassa 25 °C - 140 °C, ja saatu yhdiste, jonka kaava on _CU2 (IV) 15 JL y I Xz *2 N »

20 Rl jossa R1# Y ja Z tarkoittavat samaa kuin edellä ja R2 on vety, eristetään, minkä jälkeen kaavan IV mukaista yhdistettä käsitellään sopivalla kloorausaineella, kuten tio-nyylikloridilla, 1-24 tunnin ajan lämpötilassa 25 eC - 25 140 °C, tai b) kaavan I mukaisten yhdisteiden valmistamiseksi, joissa R2 on propoksi, yhdiste, jonka kaava on Cl “ “Λό- Ri 35 jossa Rlf Y ja Z tarkoittavat samaa kuin edellä, saatetaan • · 95133 reagoimaan kaavan III mukaisen yhdisteen kanssa 1-24 tunnin ajan lämpötilassa, 25 *C - 140 eC, ja saatu yhdiste, jonka kaava on CH2 H0 hn (VI) 10 ,Α. * Rl 15 jossa Rx, Y ja Z tarkoittavat samaa kuin edellä, eristetään, minkä jälkeen kaavan VI mukaista yhdistettä käsitellään sopivalla kloorausaineella, kuten tionyylikloridillä, jolloin saadaan yhdiste, jonka kaava on 20 ch2 V-» ivin c v . juo· CV H N Rl 30 jossa Rx, Y ja Z tarkoittavat samaa kuin edellä, ja saatua kaavan VII mukaista yhdistettä käsitellään propanolil-la, tai c) kaavan I mukaisten yhdisteiden valmistamiseksi, 35 joissa L on fenyyli, yhdiste, jonka kaava on • · 39 9 5 1 33 Cl X Y (VIII) R2 N Rl jossa R1# Y ja Z tarkoittavat samaa kuin edellä ja R’z on vety tai kloori, saatetaan reagoimaan yhdisteen kanssa, 10 jonka kaava on (( ))-C-C-CHj (IX) \^/ aii 15 jolloin saadaan yhdiste, jonka kaava on

20 HO-C-H H-C-CH, (X) I 3 NH r'2 N Rl jossa Rx, Y, Z ja R'2 tarkoittavat samaa kuin edellä, ja kaavan X mukainen yhdiste saatetaan reagoimaan kloo- 30 rausaineen, kuten tionyylikloridin kanssa ja, kun R'2 on kloori, propanolin kanssa; ja haluttaessa saatu kaavan I mukainen yhdiste muutetaan farmaseuttisesti hyväksyttäväksi suolaksi.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, t u n-35 n e t t u siitä, että valmistetaan yhdiste, jonka kaava on • · « 95133 f ύ £x)‘

10 I Rl jossa Rx on vety, fenyyli tai B-D-ribofuranosyyli; R2 on vety tai propoksi; Y on N tai CH; ja Z on N tai CH, sillä edellytyksellä, että Y ja Z eivät ole identtisiä.

3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tun nettu siitä, että valmistetaan yhdiste, jonka kaava on ύ 20 )— N Ov;. „ R2 H N Rl jossa R2 on vety, fenyyli tai B-D-ribofuranosyyli; ja R2 on vety tai propoksi.

4. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tun nettu siitä, että valmistetaan yhdiste, jonka kaava • < on • ' Il ' 35 II 41 95133 «JL> ν' No N N

10 Ri jossa Ri on vety, fenyyli tai B-D-ribofuranosyyli.

5. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että valmistetaan yhdiste, jonka kaava on p \— N ώθ· R2 N ^ N Rl 25 jossa R2 on vety tai propoksi; ja R2 on vety, fenyyli tai B-D-ribofuranosyyli.

6. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että valmistetaan yhdiste, jonka kaava on o \— N ν' \o N n Rl 95133 jossa Rx on vety, fenyyli tai β-D-ribofuranosyyli.

7. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että valmistetaan yhdiste, jonka kaava on

5 CH3 \-N (QJ LjO" 10 «, f Rl jossa Rx on vety, fenyyli tai β-D-ribofuranosyyli; ja R2 on vety tai propoksi.

8. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että valmistetaan yhdiste, jonka kaava on CH3 \-N

20 A

3. Rl 25 jossa Rx on vety, fenyyli tai β-ribofuranosyyli. II 43 9 5 1 33