FI94928B - Menetelmä lääkeaineena käytettävän liuoksen valmistamiseksi - Google Patents

Description

94928

Menetelmä lääkeaineena käytettävän liuoksen valmistamiseksi Förfarande för framställning av en lösning som kan användas son läkemedel 5

Keksinnön kohteena on menetelmä lääkeaineena käytettävän liuoksen valmistamiseksi, joka sisältää tehokkaan pitoisuuden seuraavan kaavan 10 mukaista pinta-aktiivista kopolymeeria:

H0(C2H*0)b(C3H60)a(C2H40)bH

missä a on sellainen kokonaisluku, että hydrofobisen osan (C3H60) mole-15 kyylipaino on arviolta 1750 ja missä b on sellainen kokonaisluku, että hydrofiilinen osa (C2H*0) muodostaa arviolta 50-90 paino-% yhdisteestä, koko yhdisteen molekyylipainon ollessa arviolta 8400.

Keksinnössä valmistetaan lääkeaineena käytettävä fibrinolyyttinen val-20 miste, joka käsittää fibrinolyyttistä entsyymiä sekä pinta-aktiivista kopolymeeria, mainitun pinta-aktiivisen kopolymeerin ollessa edellä mainitun kaavan mukainen.

Oheinen keksintö liittyy valmisteeseen ja menetelmään fibriinihyytymien 25 hajottamiseksi, tukosten liuottamiseksi sekä perfuusion aikaansaamiseksi ja ylläpitämiseksi verettömässä kudoksessa. Oheinen keksintö kohdistuu erityisemmin valmisteeseen, joka käsittää tiettyjä, etyleenioksi-dista ja propyleenioksidistä muodostuneita kondensaatiotuotteita, jotka ovat pinta-aktiivisia kopolymeerejä, yhdistettynä fibrinolyyttisiin 30 entsyymeihin.

Käsite "fibrinolyyttinen entsyymi" tarkoittaa mitä tahansa sellaista entsyymiä, joka kykenee pilkkomaan fibriiniä. Entsyymeistä, jotka kykenevät pilkkomaan fibriiniä, voidaan mainita streptokinaasi, 35 urokinaasi, soluviljelmien tuottama kudoksen plasminogeeniaktivaattori (t-PA), yhdistelmä-DNA-tekniikana tuotettu kudoksen plasminogeeniaktivaattori (rt-PA) sekä prourokinaasin tuottama kudoksen plasminogeeniaktivaattori (k-PA), näihin kuitenkaan rajoittumatta. Käsitteet "isotoninen liuos" tai "iso-osmoottinen liuos" määritellään liuoksiksi, 40 joiden osmoottinen paine on sama tai samankaltainen kuin verellä.

94928 2 Käsitteitä "hyytymä", "fibriinihyytymä” ja "tukos" käytetään toistensa ^ synonyyme inä.

Joka vuosi noin 550 000 amerikkalaista kuolee sydänkohtaukseen. Vieläkin useampi henkilö * lähes 700 000 - saa sydänkohtauksen, 5 mutta jää eloon. Vaikka sydänkohtauksen uhri voikin jäädä eloon, niin kuitenkin osa hänen sydämestään kuolee jokseenkin varmasti. Sydänlihaksen (myocardium) kuolema, eli sen infarkti, johtuu sepelvaltimoiden tukkeutumisesta 70-90 prosentissa tapauksista. Kun tukos, tai verihyytymä, sulkee sydämen jonkin valtimon, niin veren ^ virtaaminen ympäröivään lihakseen vaikeutuu. Lihas jää tällöin ilman happea ja muita ravinteita. Menneisyydessä mitään ei voitu tehdä tämän prosessin estämiseksi. Teho-osastoilla olevat korkean teknologia mukaiset laitteet auttoivat potilasta korkeintaan siten, että hän pysyi elossa, vaikka osa hänen sydämestään kuoli.

15

Samanlaisia tilanteita esiintyy monissa muissa kudoksissa, kun tukos tai tulppa vaikeuttaa kudoksen verensaantia. Esimerkkeinä voidaan mainita aivoveritulppa, syvälaskimoiden tukos ja keuhkoveritulppa.

20

Toinen alue, jossa fibrinogeeni ja fibriini ovat vaikuttavia tekijöitä, ovat kasvaimet. Vakuuttavaa osoitusta ollaan saatu siitä, että kiinteissä kasvaimissa on läsnä fibrinogeenin kaltaisia proteiineja. Fibriinin anatominen jakautuminen kasvaimissa vaihtelee kasvaintyypistä riippuen. Karsinoomien tapauksessa fibriiniä on 25 kerääntynyt kasvaimen peruskudokseen (stroma) sekä kasvainpesäk-keiden ympärille, ja sitä voi esiintyä erityisen runsaasti kasvaimen äärialueita lähestyttäessä sekä kasvaimen ja sen isännän välisellä rajapinnalla. Tätä vastoin fibriiniä on usein läsnä vähemmän kasvaimien vanhassa, keskeisessä peruskudoksessa, jonka tunnusomaisena 30 piirteenä ovat kovettuneet (skleroottiset) kollageenikerääntymät. Fibriiniä voidaan myös todeta erillisten kasvainsolujen välissä. Eräissä tällaisissa tapauksissa, ei kuitenkaan kaikissa, epiteelien väliset fibriinikerääntymät liittyvät kasvaimen nekroosivyöhykkeisiin; kasvaimen nekroosivyöhykkeet eivät ole kuitenkaan välttämättä fibrii- 35 nikerääntymien sijaintipaikkoja. Fibriinikerääntymien esiintymistä sarkoomissa on tutkittu vähemmän kuin niiden esiintymistä karsinoo- missä. Imukudoskasvaimissa (lymphoma) fibriinikerääntyrniä voidaan * · e ia.i «iti n t ai 3 94928 todeta erillisten pahanlaatuisten kasvainsolujen välissä sekä niiden ^ vieressä sijaitsevien, ilmeisesti reaktiivisten, hyvänlaatuisten imukudoselementtien välissä. Alalla on esitetty, että fibriiniä esiintyy kasvainkovettumien vyöhykkeissä, kuten Hodgkin:in taudissa. Tutkimus on osoittanut, että fibriinikerääntymän ulkomuoto ja laajuus 5 ovat tunnusomaisia tietylle kasvaimelle. (Katso Hemostasis and Thrombosis, Basic Principles and Clinical Practice, "Abnormalities of Hemostasis in Malignancy", sivut 1145-1157, toimittanut R.W.

Lippincott Company, 1987).

Kasvaimiin johtavan yhdenmukaisen verisuoniston puuttuminen voi estää diagnostisia ja hoitavia toimenpiteitä. Esimerkiksi kasvaimet, joissa happipitoisuus on pieni, reagoivat huonommin useille lääkkeille ja säteilylle. Perinteiset lääkkeet ja uudet lääkkeet, kuten mono- klonaalisten vasta-aineiden konjugaatit, eivät ole tehokkaita, ellei-15 vät ne tunkeudu kasvainsoluihin saakka. Eräitä kasvaintyyppejä ympäröivät fibriinikerääntymät estävät lääkkeiden pääsyn kasvaimeen saakka. Myös muut tekijät vaikeuttavat edelleen kasvaimien verensaan-tia. Kasvaimien verisuonet ovat usein pieniä ja kiemurtelevia. Tällaisten kanavien hydrodynaaminen vastus vaikeuttaa edelleen veren 20 virtaamista kasvaimeen.

Samankaltainen tilanne esiintyy, tosin eri syistä, sirppisoluanemian kriisiaikoina. Vääntyneet punaiset verisolut tukkivat osittain pieniä suonia, mikä johtaa paikalliseen happivajsukseen ja happomyrkytykseen.

25 Tämä indusoi edelleen muiden punaisten verisolujen vääristymistä.

Tuloksena on noidankehä, eli "kriisi”. Hoitona käytetään virtauksen parantamista sairaissa alueissa ja niiden happikäsittelyä. Toinen hoitomuoto käsittää kalsiumkanavien salpaajien yhdistelmiä. Fibriinin muodostuminen vaikeuttaa usein sirppisoluanemiaan liittyvää kriisiä.

30

Ollaan todettu, että tietyt entsyymit kykenevät vaikuttamaan fib-riinikerääntymiin siten, että tukkeutuneet valtimot avautuvat. Entsyymeistä, joita ollaan käytetty menestyksellisesti, mainittakoon streptokinaasi, urokinaasi, prourokinaasi, soluviljelmien tuottama 35 kudoksen plasminogeeniaktivaattori sekä yhdistelmä-DNA- tekniikan avulla tuotettu kudoksen plasminogeeniaktivaattori. Nämä entsyymit ovat hyödyllisimmillään, mikäli niitä annetaan mahdollisimman nopeasti 94928 4 verisuonien CukkeenCumisen jälkeen, ennen kuin sydänlihas on vahin-1 goittunut korjautumattomasti. Eräässä tutkimuksessa, jossa 11 806 potilasta käsiteltiin antamalla streptokinaasia suonen sisäisesti tai sepelvaltimon sisäisesti, eloonjäämisasteen osoitettiin paranevan 18 %. Mikäli käsittely aloitettiin yhden tuimin kuluessa siitä, kun 5 sydänkohtauksen ensimmäinen kipu oli havaittu, niin kuolleisuus sairaalassa väheni 45 %. (Katso The Lancet, Voi. 8478, sivut 397-401, 22. helmikuuta 1986.) Osoitettiin, että tukoksen varhainen hajottaminen johti sydänkudoksen osan pelastumiseen, joka osa olisi kuollut muussa tapauksessa. Tutkimuksissa, joissa käytettiin anglo-grafiaa verisuonien avonaisuuden määrittämiseksi, todettiin, että kudoksen plasminogeeniaktivaaattori kykeni avaamaan verisuonet täydellisesti 61 prosentissa potilaista, joita oli 129, verrattuna 29 prosenttiin vertailupotilaita, joita ei oltu käsitelty tällä entsyymillä. (Katso Verstraete, et ai. , The Lancet, Voi. 8462, sivut 965-10 969, 2. marraskuuta 1985.) Kudoksen plasminogeeniaktivaattori edellyt tää, että yhteen litraan liuosta lisätään arviolta 100 jul tuotetta Tween 80 entsyymin dispergoitumisen parantamiseksi. [Katso Kominger et ai., Thrombos. Haemostas, (Stuttgart), Voi. 46(2), sivut 561-565 (1981)].

20

Entsyymit, joita käytetään verisuonissa esiintyvien tukosten hajottamiseen, toimivat fibrinolyysiä aktivoiden. Fibriini on proteiini, jota muodostuu fibrinogeenin polymeroituessa. Se muodostaa geelin, joka pitää hyytymää koossa. Hyytymän muodostaviin fibril- 25 nimolekyyleihin syntyy vähitellen ristisidoksia, jolloin saadaan pysyvämpi hyytymä. Kaikki neljä entsyymiä, prourokinaasi, uroki-naasl, streptokinaasi ja kudoksen plasminogeeniaktivaattori, vaikuttavat samankaltaisesti fibriiniin; niiden toksisuudet eroavat kuitenkin toisistaan. Mikäli fibrinolyysin mekanismi aktivoituu 30 hyytymän läheisyydessä, hyytymä hajoaa. Mikäli toisaalta nämä mekanismit aktivoidaan systeemisesti koko verenkierrossa, niin elimistön kyky lopettaa verenvuoto heikkenee huomattavasti. Streptokinaasi ja urokinaasi pyrkivät aktivoimaan systeemistä fibrinolyysiä. Näin ollen, ne ovat tehokkaimmillaan, kun niitä injektoidaan suoraan 35 sairaaseen verisuoneen. Sitä vastoin kudoksen plasminogeeniaktivaattori muuttuu tehokkaaksi ainoastaan silloin, kun se on todella kiinnittynyt fibriiniin. Tämä tarkoittaa sitä, että sen aktiivisuus on 5 94928 paikallistunut suureksi osaksi hyytymän välittömään läheisyyteen, ja ^ se ei saa aikaan systeemistä fibrinolyysiä. Mikäli käsittelyyn käytetään suuria annoksia hyytymän hajoamisnopeuden suurentamiseksi tai reagoimattomien hyytymien hajottamiseksi, niin tällöin systeemisen fibrinolyysin voimakkuus ja verenvuodon vaara muuttuvat merkittäviksi. 5 Sitä voidaan injektoida suonen sisäisesti yleiseen verenkiertoon. Se kulkee harmittomana verenkierrossa niin kauan, kunnes se joutuu kosketukseen verihyytymässä läsnäolevan fibriinin kanssa, jolloin se aktivoituu ja hajottaa hyytymän. Kudoksen plasminogeeniaktivaattori kykenee hajottamaan hyytymän, jossa on runsaasti ristisidoksia. Tämä tarkoittaa sitä, että useiden tuntien ajan olemassa olleet hyytymät saadaan hajoamaan. Kudoksen plasminogeeniaktivaattoria käytettäessä verenvuodon vaara on pienempi muihin entsyymeihin verrattuna. Alalla kehitetään parhaillaan trombolyyttisiä lääkkeitä, jotka perustuvat vieläkin tehokkaampiin entsyymeihin.

15

Vaikka nämä uudet, entsyymeihin perustuvat hoitomuodot ovatkin huomiota herättäviä, niin kuitenkin niihin liittyy vakavia komplikaatioita ja ne eivät ole tehokkaita kaikissa potilaissa. Vasemman sepelvaltimon etummaisessa laskevassa haarassa esiintyvät hyytymät 20 saadaan hajotetuiksi paljon helpommin kuin muiden valtimoiden hyytymät. Mikäli entsyymi ei kulkeudu verivirran mukana suoraan tukokseen, se on tehoton. Eri syistä johtuen enemmän verta kulkee tai tihkuu vasemmassa etummaisessa laskevassa sepelvaltimossa olevien tukosten ohi kuin muissa suurissa valtimoissa sijaitsevien tukosten tapauk- 25 sessa. Tämän lisäksi sivuvirtauksen, joka muodostuu suurien valtimoiden vaikeutuneen verivirtauksen seurauksena, läsnäolo vaikuttaa haitallisesti tukkeutuneiden suurien valtimoiden uudelleen avautumisen tai kanavoitumisen nopeuteen. Oletetaan, että monien sivusuonien, joiden ansiosta veri pystyy ohittamaan hyytymän, läsnäolo pienentää 30 paine-eroa hyytymän molemmin puolin. Tämä puolestaan vähentää veren virtaamista hyytymään mahdollisesti jääneiden pienien aukkojen läpi, vaikeuttaa entsyymien kulkeutumista hyytymään ja estää sen hajoamisen.

Hyytymän hajoamisen jälkeen tukoksen muodostumiseen johtaneet tekijät 35 ovat kuitenkin edelleen olemassa. Tämän seurauksena uudet tukkeumat ‘ ja lisäinfarktit ovat hyvin todennäköisiä hyytymän hajottamista seuraavien tuntien ja vuorokausien aikana. Uusia tukkeutumia ollaan 94928 6 todettu 3-30 prosentissa tapauksista, joissa ensimmäinen käsittely 1 johti onnistuneesti hyytymän hajoamiseen. Hyytymistä estäviä aineita käytetään nykyään uusien tukosten muodostumisen välttämiseksi, mutta ne pyrkivät indusoimaan verenvuotoa. Hyytymistä estävän aineen määrän, joka on välttämätön verisuonien uudelleen tukkeutumisen estämiseksi, 5 sekä määrän, joka tuottaa vakavaa verenvuotoa, välillä vallitsee herkkä tasapaino.

Lopuksi, hyytymän liuottamisella sen jälkeen, kun korjautumatonta vahinkoa on tapahtunut, on hyvin vähän merkitystä. Korjautumatonta 10 vahinkoa voi esiintyä joko sydänlihaksessa tai kudosten, joista kyseinen verisuoni huolehtii, verisuonialustassa. Tämän uuden, entsyymiin perustuvan hoitomenetelmän laajaan käyttöönottoon liittyväni ongelmana on löytää keino sairauden tunnistamiseksi ja käsittelemiseksi aikaisemmin potilaissa, sekä löytää keino, jolla hoidon tehok-kuus saataisiin säilymään pitempien ajanjaksojen ajan tukkeuman muodostumisen jälkeen.

Eläinkokeiden ansiosta alalla ymmärretään paremmin niitä tapahtumia, jotka säätelevät veren virtaamista ja kudoksen kuolemista sepelval- ^0 timon tukkeentumisen jälkeen. Sydän käsittää lukuisia verisuonia, joten suuri osa tästä lihaksesta saa verta useammasta kuin yhdestä suonesta. Tästä ja muista syistä johtuen sepelvaltimon tukkeutumisen aiheuttamat kudosmuutokset jakautuvat erillisiksi vyöhykkeiksi.

Kudoksen keskeinen vyöhyke muuttuu lähes täysin nekroottiseksi. Sitä oe ympäröivä alue kärsii vakavasta verenvähyydestä. Tämän vyöhykkeen ulkopuolella on verenvähyydestä vähemmän kärsivä alue, jota nimitetään marginaalivyöhykkeeksi. Lopuksi, tämän koko alueen ympärillä on vaarassa oleva vyöhyke. Paviaaneilla toteutetuissa kokeissa verisuonen kanavoiminen uudestaan useiden tuntien jälkeen ei vaikuttanut keskei-30 seen nekroottiseen alueeseen. Muiden vyöhykkeiden, jotka eivät olleet vahingoittuneet niin vakavasti verettömän ajanjakson aikana, käsittämä lihas kyettiin kuitenkin pelastamaan. Yllättävä havainto oli se, ettei tukkeuman hajottaminen siten, että saatiin täydellinen arte- riografi, riittänyt palauttamaan normaalia virtausta suurimmassa 35 osassa eläimiä. (Katso Flameng et ai., J. Clin. Invest., Voi. 75, • sivut 84-90, 1985.) • e 7 94928

Eräitä muita virtausta häiritseviä tekijöitä oli kehittynyt kyseisen ^ verisuonen huolehtimaan alueeseen sinä aikana, kun tämä verisuoni oli tukossa. Muissa tutkimuksissa osoitettiin, että välittömästi sen jälkeen, kun verisuonen tukos oli poistettu, virtaus vahingoittuneen kudoksen läpi käynnistyi suurella nopeudella. Veren virtaaminen 5 verettömyydestä kärsivän vyöhykkeen läpi pieneni kuitenkin lyhyen ajan kuluessa ja kudos kuoli. Näin ollen sydänlihaksen pelastuminen voidaan ennustaa huonosti välittömästi uuden perfuusion käynnistymisen jälkeen todettavan alueellisen verivirtauksen perusteella. Mikäli verivirta vaurioituneen kudoksen läpi pysyttelee normaalien tasojen ^ lähettyvillä, niin mahdollisuus kudoksen pelastumiseen on paljon suurempi. Verenvuotoa esiintyi lähes yksinomaan vakavasti verettömyydestä kärsivässä vyöhykkeessä, minkä perusteella voidaan päätellä, että pienet verisuonet ovat vahingoittuneet. Verenvuoto rajoittui kuitenkin vakavasti verettömään kudokseen, ja se ei aiheuttanut -te 10 infarktin jatkumista tai muita vakavia komplikaatioita. Hoitomuotojen, jotka kykenivät ylläpitämään perfuusion uuden käynnistymisen jälkeen veren virtaamista pienien, pääasiallisesta tukosalueesta kaukana sijaitsevien verisuonien läpi, voitiin odottaa parantavan huomattavasti sydänlihaksen pelastumista.

20

Sydänlihassolujen vahingoittuminen tukoksen hajottamisen jälkeen johtuu muista tekijöistä sekä verettömyydestä. Tuoreen veren joutuminen kosketukseen vahingoittuneiden tai kuolleiden solujen kanssa : indusoi sydänlihassoluja tappavien neutrofiilien, tai märkäsolujen, 25 virtaamista paikalle, jotka sydänlihassolut olisivat muussa tapauksessa toipuneet. Suuren osan neutrofiilien aiheuttamasta vahingosta katsotaan johtuvan superoksidi-ioneista. Superoksidianioni voi vahingoittaa kudosta usealla tavalla. Superoksidianionin ja vetyperoksidin välinen vuorovaikutus johtaa hydroksyyliradikaalien muodostumiseen, 30 jotka radikaalit ovat voimakkaasti toksisia ja jotka reagoivat nopeasti useimpien orgaanisten molekyylien kanssa. Mannitol! toimii puhdistavana aineena reagoimalla helposti ja selektiivisesti hydroksyyliradikaalien kanssa. Eräs entsyymi, eli superoksidi-dismutaasi, katalysoi superoksidianionin hajoamista. Entsyymit, kuten superoksidi- dismutaasi, vapaiden radikaalien kanssa helposti reagoivat aineet tai aineet, jotka estävät neurofiilien virtaamisen paikalle, kykenevät suurentamaan sydänlihassolujen pelastiimistä.

35 94928 8

Kopolymeerien pienet pitoisuudet vaikuttavat hyvin vähän plasman ^ proteiineihin. Suuremmat, kriittisen misellipitoisuuden yläpuolella olevat pitoisuudet aktivoivat komplementtia vaihtoehtoisen reitin mukaan. Tämä johtaa lisäetuun sydänkohtauksia käsiteltäessä, koska komplementin systeeminen aktivoituminen saa aikaan sen, että neutro-5 fiilit eivät reagoi komplementin kemialliseen vetovoimaan. Tämä estää niiden kulkeutumisen sydänkudokseen.

Hoitoa tarvitaan jatkuvasti senkin jälkeen, kun veren virtaaminen on saatu palautetuksi ja vaurioitunut kudos pelastetuksi. Alkuperäisen ^ sydänkohtauksen aiheuttanut valtimoiden kovetustauti jää jäljelle.

Amerikkalaiset ja eurooppalaiset tutkijat ovat todenneet, että vai· timoiden kovetustauti kaventaa edelleen valtimoita 70-80 prosentissa potilaista, joiden hyytymät hajotettiin trombolyyttisellä hoidolla.

Monet lääkärit ovat sitä mieltä, että tällainen tukkeuma on avattava 15 pitkäaikaisten etujen saavuttamiseksi. Verisuonien muodostaminen uudestaan kirurgisesti (angioplastia) ilmapalloa hyväksi käyttäen on toimenpide, jossa ahtautuneeseen valtimoon viedään pienen ilmapallon käsittävä katetri. Ilmapallo täytetään ilmalla, jolloin se puristaa valtimoiden haurastumiseen ja kovettumiseen johtaneen kerääntymän 20 suonen seinämää vasten valtimoa tällä tavalla laajentaen. Tämän toimenpiteen tehokkuutta rajoittavat ilmapallon aiheuttaman verettö-myyden vaikutukset, kauempana sijaitsevissa suonissa läsnäolevan haurastuneen materiaalin tulppautuminen sekä suurempi taipumus välit-• töinään tai viivästyneeseen tukkeutumiseen ilmapallon vahingoittamassa alueessa. Ilmapallo repii kudosta paljastaen kudoksen alla sijaitsevan kollageenin ja lipidiaineet, jotka indusoivat tukkeuman muodostumista. Tukkeuma voi sulkea suonen välittömästi tai se voi käynnistää tapahtumaketjun, joka johtaa suonen tukeutumiseen useita vuorokausia tai viikkoja myöhemmin. Se, mitä tarvittaisiin, on menetelmä laajen- 30 nettujen suonien pinnan tekemiseksi vähemmän trombogeeniseksi, mikä parantaisi veren virtaamista etäisen kudoksen läpi Ja hajottaisi tulppautuneen materiaalin pienemmiksi kappaleiksi, jotka aiheuttavat vähemmän todennäköisesti tulpasta johtuvia vahinkoja.

35

Lopuksi, haurastuneen ja kovettuneen seinämän pinnalla oleva lipi-| dimateriaali vaikuttaa valtimon keskionteloa (lumen) kaventavan ja erittäin trombogeenisen pinnan aikaansaavan kerääntymän tilavuuteen.

9 94928

Se, mitä tarvittaisiin, on menetelmä peittävien lipidien uuttamiseksi ^ haurastuneista ja kovettuneista kerääntymistä, jolloin niiden pinnat saataisiin vähemmän trombogeenisiksi, ja jolloin niiden tilavuus saataisiin pienemmäksi.

5 Alalla ollaan kuvattu etyleenioksidia ja propyleenioksidia konden-soimalla valmistettujen kopolymeerien käyttö tulpan tai tukkeuman käsittelemiseen (katso US-patenttijulkaisu 3 641 240). Vaikutus rajoittui kuitenkin vähän aikaa sitten muodostuneisiin, pieniin (mielellään mikroskooppisiin) tukkeumiin ja tulppiin, jotka koos-tuvat pääasiallisesti verihiutaleista. Etyleenioksidin ja propy-leenioksidin välisellä kopolymeerillä on vain vähäistä vaikutusta, mikäli lainkaan, hyytymään, jota kantavassa potilaassa on jo esiintynyt voimakas sepelvaltimon infarkti. Näissä potilaissa muodostuvat hyytymät ovat suuria ja kestäviä. Kestävät hyytymät ovat niitä, joissa fibrinogeenista muodostuneessa fibriinissä on tapahtunut ristisitoutumista. Etyleenioksidin ja propyleenioksidin välisten kopolymeerien läsnäolo ei vaikuta ffbriiniin, jossa on tapahtunut ristisitoutumista. Nämä kopolymeerit vaikuttavat ainoastaan uusiin hyytymiin, joissa juuri muodostunut fibriini ei ole ristisitoutunut.

20 Näin ollen tarvitaan valmiste, joka kykenee hajottamaan hyytymän, ja joka samanaikaisesti estää toisen hyytymän muodostumisen sen jälkeen, kun alkuperäisestä hyytymästä on päästy eroon. Ideaalitapauksessa tällainen valmiste pienentää myös mahdollisimman paljon sitä vahinkoa, 25 joka aiheutuu kudokselle veren saannin estyessä. Näin ollen tällainen valmiste suojaisi potilasta uuden hyytymän muodostumisesta mahdollisesti aiheutuvilta vaurioilta. Tämän lisäksi tällaista valmistetta voitaisiin käyttää hyytymien poistamiseen kiinteistä kasvaimista, mikä parantaisi virtausta mutkittelevien kanavien läpi, ja mikä ^ täten tekisi mahdolliseksi hoitavien lääkkeiden kulkeutumisen kasvaimeen.

Oheisen keksinnön mukaisesti aikaan saadaan valmiste, joka liuottaa tehokkaasti verihyytymiä ja joka palauttaa verivirtauksen ja ylläpitää 35 sitä tukkeu tune i s s a sepelvaltimoissa tai muissa verisuonissa. Oheisen v keksinnön mukainen fibrinolyyttinen valmiste käsittää entsyymiä, kuten streptokinaasia, urokinaasia, prourokinaasia, kudoksen plasmi- 94928 10 nogeeniaktivaattoria tai muuta fibrinolyyttistä entsyymiä, sekä ^ pinta-aktiivista kopolymeeria. Pinta-aktiivinen kopolymeeri voi olla etyleenioksidin ja propyleenioksidin välinen kondensaatiotuote, jolla on seuraava yleinen kaava:

5 H0(C2H40)b(C3H60)a(C2H40)bH

missä a on sellainen kokonaisluku, että hydrofobisen ryhmän (CjHgO) molekyyllpaino on arviolta 950-4000, mielellään noin 1750- 3500, ja b on sellainen kokonais luku, että hydrofiilinen osa (C2H40) muodostaa noin 50-90 paino-% yhdisteestä.

Oheisen keksinnön mukaista fibrinolyyttistä valmistetta annetaan potilaalle tavallisesti suonen sisäisesti injektoimalla.

15

Oheisessa keksinnössä saadaan aikaan valmiste, jota voidaan antaa verisuonen sulkevaa verihyytymää kantaville potilaille. Fibrino-lyyttisen entsyymin ja pinta-aktiivisen kopolymeerin yhdistäminen oheisen keksinnön mukaisesti parantaa veren virtausta hyytymän ympärillä, hajottaa hyytymän nopeasti, sekä suojaa potilasta edelleen 20 estämällä uuden hyytymän muodostumisen ja vähentämällä uuden perfuu-sion aiheuttamia vaurioita.

Oheisen keksinnön toisessa suoritusmuodossa yhdistetään pinta-aktii- • vinen kopolymeeri ja happiradikaalien poistajat, kuten superoksidi- 25 dismutaasi ja mannitoli. Oheinen keksintö käsittää pinta-aktiivisen kopolymeerin, hyytymää hajottavan entsyymin sekä vapaan radikaalin poistajan yhdistämisen, sekä vain pinta-aktiivisen kopolymeerin ja vapaan radikaalin poistajan yhdistämisen.

30

Koska oheisen keksinnön mukainen fibrinolyyttinen valmiste stabiloi potilasta enemmän kuin alalla aikaisemmin käytetyt hoitotavat, niin syvemmälle tunkeutuvien toimenpiteiden, kuten ilmapalloon perustuvan angioplastian, käyttöä voidaan lykätä niin, että tällaisen tunkeutumiseen perustuvan toimenpiteen olosuhteet voidaan valita potilaalle 35 mahdollisimman edullisiksi.

Keksinnön eräs toinen suoritusmuoto käsittä pinta-aktiivisen ko- 11 94928 polymeerin käytön sirppisolutaudin hoitamiseksi. Edelleen, keksinnön ^ eräs muu suoritusmuoto käsittää pinta-aktiivisen kopolymeerin käytön elimien säilyttämiseksi elinsiirtoja varten.

Näin ollen oheisen keksinnön tavoitteena on' saada aikaan fibrino-® lyyttisten entsyymien ja pinta-aktiivisen kopolymeerin yhdistelmä synergistisen vaikutuksen tuottamiseksi verihyytymiä hajotettaessa. Tämä yhdistelmä voidaan valmistaa käyttämällä joko tavanomaisia entsyymiannoksia hyytymän hajoamisnopeuden tai sen hajoamisen todennäköisyyden suurentamiseksi, tai pienempiä entsyymiannoksia sivuvai-^ kutusten vähentämiseksi hyytymiä hajottava vaikutus tällöin kuitenkin säilyttäen.

Oheisen keksinnön muuna tavoitteena on saada aikaan valmiste, joka vähentää hyytymistä estävän aineen tarvetta sydänhoidossa, jolloin 15 verenvuotojen vaara pienenee.

Keksinnön muuna tavoitteena on saada aikaan valmiste, joka nopeuttaa hyytymien liukenemista vapauttamalla kasautuneita verihiutaleita ja estämällä uusien verihiutaleiden kasautumisen hyytymään.

20

Oheisen keksinnön tavoitteena on edelleen saada aikaan valmiste, joka kykenee pienentämään hyytymän hajottamiseen tarvittavaa ent-syymiannosta, jolloin komplikaatioiden esiintyminen vähenee.

25

Oheisen keksinnön muuna tavoitteena on saada aikaan valmiste, joka sisältää pinta-aktiivista kopolymeeria ja vapaiden radikaalien tai hapen poistajaa, kuten superoksidi-dismutaasia tai mannitolia.

Oheisen keksinnön tavoitteena on edelleen saada aikaan valmiste, • 30 joka kykenee parantamaan veren virtaamista verettömän tilan vaurioittamassa kudoksessa olevien hyvin pienien verisuonien läpi, sekä vähentämään sitä kudosmäärää, joka muuttuu nekroottiseksi.

Oheisen keksinnön tavoitteena on lisäksi saada aikaan valmiste, joka 35 pienentää merkittävästi uusien tukkeutumien vaaraa fibrinolyyttisillä . entsyymeillä käsittelemisen jälkeen.

94928 12

Oheisen keksinnön tavoitteena on lisäksi saada aikaan valmiste, joka ^ edistää lipidien poistumista verisuonien haurastuneilta ja kovettu* neilta seinämiltä, millä tällä tavalla vähennetään uusien tukkeutumien esiintymistä.

® Oheisen keksinnön tavoitteena on edelleen saada aikaan parannettu fibrinolyyttinen valmiste, joka kykenee hajottamaan kasvaimien yhteydessä esiintyviä fibriinikerääntyrniä.

Oheisen keksinnön muuna tavoitteena on saada aikaan valmiste, joka parantaa veren virtausta kasvaimissa ja sirppisolusairauden kriisitilanteen aikana esiintyvien kiemurtelevien kanavien läpi.

Oheisen keksinnön muuna tavoitteena on saada aikaan parannettu valmiste ja menetelmä elimien säilyttämiseksi ex vivo.

15

Oheisen keksinnön tavoitteena on lisäksi saada aikaan valmiste, joka vähentää uusien tukkeumien vaaraa, ja jonka avulla voidaan näin ollen lykätä ilmapalloon perustuvan angioplastian tai muiden tunkeutuvien toimenpiteiden soveltamista ahtautuneiden verisuonien käsit- 20 telemiseksi.

Oheisen keksinnön mutina tavoitteena on saada aikaan valmiste, joka vähentää tukkeutumien muodostumisen vaaraa välittömästi tai jonkin : ajan kuluessa tunkeutuvien toimenpiteiden, kuten ilmapalloon perus- 25 tuvan angioplastian, käytön jälkeen, jotka toimenpiteet vahingoittavat verisuonien endoteelisoluja.

Oheisen keksinnön tavoitteena on edelleen saada aikaan valmiste, joka estää verihiutaleiden kasaantumisen tukkeumaan nähden etäisissä • 30 verisuonissa, ja joka näin ollen rajoittaa kudosvaurioiden laajuutta.

Keksinnön muuna tavoitteena on saada aikaan valmiste, joka parantaa veren virtaamista sydänlihas solujen tai muiden solujen huomattavaa ^ nekroosia käsittävän kudoksen läpi ja ympäri, mikä viivästyttää muun sydänlihaskudoksen nekroosia.

• >

Oheisen keksinnön tavoitteena on lisäksi saada aikaan valmiste, joka 13 94928 vähentää neutrofiilien kulkeutumista vahingoittuneeseen kudokseen, ja joka näin ollen vähentää neutrofiilien toksisista tuotteista johtuvien vammojen laaj uutta.

5 Oheisen keksinnön tavoitteena on edelleen saada aikaan valmiste, joka vähentää tukoksen seurauksena veren virtaamisen estymisestä johtuvan verettömyyden suuruutta.

Oheisen keksinnön tavoitteena on edelleen saada aikaan trombolyyttisen 10 entsyymin, ilmapalloon perustuvan angioplastian tai muun kirurgisen toimenpiteen, sekä pinta-aktiivisen kopolymeerin yhdistelmä, jonka avulla voidaan toteuttaa parannettu menetelmä tukoksen tai trombogeeni-sen sulkeuman poistamiseksi sekä uuden tukkeuman muodostumista edistävien salpaavien olosuhteiden lieventämiseksi.

15

Oheisen keksinnön muuna tavoitteena on saada aikaan valmiste ja menetelmä sirppisolusairauteen liittyvän kriisin hoitamiseksi.

Keksinnön mukainen menetelmä on tunnettu siitä, että menetelmässä muo-20 dostetaan etyleenioksidin ja propyleenioksidin kondensaatiotuote korotetussa lämpötilassa ja paineessa emäksisen katalyytin läsnäolessa.

Oheisen keksinnön nämä ja muut tavoitteet, piirteet ja edut ovat ilmeisiä seuraavan yksityiskohtaisen, erääseen julkaistuun suoritusmuotoon 25 kohdistuvan kuvauksen ja liitteenä olevien patenttivaatimusten perusteella .

Oheinen keksintö kohdistuu valmisteeseen, joka vaikuttaa synergis-tisesti verihyytyrniä hajottaen ja verivirtauksen palauttaen ja 30 ylläpitäen tukkeutuneessa sepelsuonessa tai muussa verisuonessa.

i #

Oheisen keksinnön mukainen fibrinolyyttinen valmiste on liuos, joka sisältää tehokkaan pitoisuuden fibrinolyyttistä entsyymiä sekä tehokkaan pitoisuuden pinta-aktiivista polymeeriä. Näiden kahden komponentin yhdistelmä liuottaa tehokkaasti verisuonia tukkivia verihyyty-35 miä. Tämän lisäksi oheisen keksinnön mukainen fibrinolyyttinen valmiste estää tehokkaasti verihyytymien muodostumisen uudestaan, ja se yllä- 94928 14 pitää tehokkaasti verlvirtausta verisuonen ja vahingoittuneen veret-^ tömän kudoksen läpi.

Oheisen keksinnön mukainen fibrinolyyttinen valmiste parantaa veri-virtausta hyytymien ympärillä olevien kapeiden kanavien läpi ja se 5 lisää fibrinolyyttisen entsyymin saatavuutta hyytymässä. Lisäksi oheinen keksintö nopeuttaa entsyymin avulla hyytymän liukenemisnope-utta sekä suurentaa hajonneiden hyytymien osuutta parantamalla entsyymin saatavuutta hyytymissä, joihin ei muussa tapauksessa kohdistuisi riittävästi entsyymin vaikutusta niiden liuottamiseksi. Tämän ^ lisäksi oheisen keksinnön mukainen fibrinolyyttinen valmiste vähentää tietyissä sovellutuksissa tarvittavaa entsyymimäärää, ja näin ollen se vähentää näiden entsyymien aiheuttamista sivuvaikutuksista johtuvien komplikaatioiden esiintymistä.

15

Oheisen keksinnön mukainen fibrinolyyttinen valmiste vähentää sitä vaaraa, että tukkeuma muodostuisi välittömästi uudestaan, koska se nopeuttaa hyytymien liukenemista, vapauttaa kasaantuneita verihiutaleita ja estää muiden verihiutaleiden kasaantumisen hyytymäksi tai hyytymän kohdalla. Koska oheisen keksinnön mukainen fibrinolyyttinen 20 valmiste vähentää välittömästi uudestaan muodostuvien tukkeutumien vaaraa, niin sen avulla voidaan lykätä ilmapalloon perustuvan angio-plastian tai muiden tunkeutuvien toimenpiteiden käyttämistä tukkeutuneiden, toiminnaltaan vajavaisten suonien hoitamiseen. Tämä lykkääminen tekee mahdolliseksi sen, että tunkeutuvan toimenpiteen olosuh- 25 teet voidaan valita potilaalle mahdollisimman edullisiksi.

Niistä liuoksista, joita voidaan käyttää oheisen keksinnön mukaisen fibrinolyyttisen valmisteen tekemiseen, mainittakoon suolaliuos (natriumkloridin liuos, joka sisältää 8,5-9,5 g natriumkloridia 1000 30 millilitrassa puhdasta vettä), Ringer:in liuos, laktaattia sisältävä Ringer:in liuos, Krebs-Ringer:in liuos sekä erilaiset sokeriliuokset, näihin kuitenkaan rajoittumatta. Kalkki nämä liuokset ovat tuttuja alan asiantuntijalle. Huomautettakoon kuitenkin, että oheisen keksinnön mukaista flbrinolyyttistä valmistetta voidaan myös antaa liuok-sena, Joka ei ole isotonista.

* · · * ·

Pinta-aktiivinen kopolymeeri on mielellään etyleenioksidin ja propy- 15 94928 leenioksldln kondensaatiotuote, jolla on seuraava yleinen kaava:

H0(C2H40)b(C3H60)a(C2H40)bH

missä a on sellainen kokonaisluku, että hydrofobisen ryhmän (C3H5O) 5 molekyylipaino on arviolta 950-4000, mielellään 1750-3500, ja b on sellainen kokonaisluku, että hydrofiilinen osa (C2H40) muodostaa noin 50-90 paino-% tästä yhdisteestä. Näitä kopolymeerejä myydään yleisenä tavaramerkkinä Pluronic "polyolit, ja niitä on saatavana yhtiöstä BASF Corporation (Parsippany, NJ).

10

Oheisen keksinnön mukaiset pinta-aktiiviset kopolymeerit eivät osallistu aineenvaihduntaan elimistössä, ja ne poistuvat verestä nopeasti. Tämän kopolymeerin puoliintumisaika veressä on arviolta kaksi tuntia. Huomautettakoon, ettei oheisen keksinnön mukaisen parannetun fibrino-lyyttisen valmisteen käsittämä pinta-aktiivinen kopolymeeri ole sitoutunut kovalenttisesti mihinkään muuhun tässä valmisteessa läsnäolevaan komponenttiin.

Polymeerilohkot muodostetaan kondensoimalla etyleenioksidi ja propy- 20 leenioksidi korotetussa lämpötilassa ja paineessa emäksisen katalyytin läsnäollessa. Monomeeriyksiköiden, jotka yhdistyvät kussakin kopoly-meerissa polymeeriketjun muodostaen, lukumäärässä esiintyy jonkin verran tilastollista vaihtelua. Esitetyt molekyylipainot ovat kussakin valmistuksessa saadun kopolymeerimolekyylin keskimääräisen painon 25 arvioita. On selvää, ettei propyleenioksidi- ja etyleenioksidilohkojen tarvitse olla puhtaita. Pieniä määriä muita materiaaleja voi olla sekoittuneina niihin, kunhan vain yleiset fysikaaliset ja kemialliset ominaisuudet eivät muutu olennaisesti. Näiden tuotteiden valmistusta tarkastellaan yksityiskohtaisemmin US-patenttijulkaisussa 2 674 619, 30 joka liitetään oheen tällä viittauksella.

Esimerkkeinä etyleenioksidin ja propyleenioksidin välisistä konden- saatiotuotteista, joita voidaan käyttää oheisen keksinnön mukaisen fibrinolyyttisen valmisteen tuottamiseen, voidaan mainita seuraavat 35 kopolymeerit, niihin kuitenkaan rajoittumatta: • · • · 1. Polyoli, jonka keskimääräinen molekyylipaino on 4700, ja joka 94928 16 ^ sisältää arviolta 80 paino-% etyleenioksidia; 2. Polyoli, jonka keskimääräinen molekyylipaino on 3400, ja joka sisältää arviolta 50 paino-% etyleenioksidia; ® 3. Polyoli, jonka keskimääräinen molekyylipaino on 7700, ja joka sisältää arviolta 70 paino-% etyleenioksidia; 4. Polyoli, jonka keskimääräinen molekyylipaino on 14 600, ja joka sisältää arviolta 80 paino-% etyleenioksidia; 10 5. Polyoli, jonka keskimääräinen molekyylipaino on 12 600, ja joka sisältää arviolta 70 paino-% etyleenioksidia; 6. Polyoli, jonka keskimääräinen molekyylipaino on 9500, ja joka 15 sisältää arviolta 90 paino-% etyleenioksidia.

Oheisen keksinnön mukaisessa fibrinolyyttisessä valmisteessa käyttöä ajatellen edullinen, etyleenioksidin ja propyleerioksidin välinen kopolymeeri on kopolymeeri, jolla on seuraava kaava: 20

H0(C2H40)b(C3H60)a(C2H40)bH

missä hydrofobisen osan (C3HgO) molekyylipaino on arviolta 1750, ja . missä koko yhdisteen molekyylipaino on arviolta 8400.

25

Kopolymeerin pitoisuus oheisen keksinnön mukaisessa, hyytymiä liuottavassa valmisteessa voi vaihdella riippuen liuoksen siitä kokonaistilavuudesta, joka tarvitaan kyseisissä olosuhteissa. Oheisessa keksinnössä käytettävän möhkäle-kopolymeerin kokonaismäärä vaihtelee 30 samoin riippuen tukkeuman tai tulpan koosta ja tyypistä, käytettävästä erityisestä kopolymeerlstä, käytettävästä erityisestä flbrinolyytti-sestä entsyymistä, sekä potilaan koosta ja painosta.

Kopolymeeriä voidaan käyttää laajalla alueella vaihtelevina pltoi- 35 suuksina ilman haitallisia sivuvaikutuksia. Kopolymeeri erittyy ·· nopeasti kokonaisena; jopa 90 % annetusta kopolymeerlstä erittyy niinkin nopeasti kuin kolmen tunnin kuluessa. Koska kopolymeerin : a ti < anti lit ti 17 94928 toksisuus on pieni ja koska se poistuu nopeasti elimistöstä, niin ^ sitä voidaan antaa pitkien ajanjaksojen ajan.

Oheisen keksinnön mukaista fibrinolyyttistä valmistetta voidaan käyttää sekoittamalla sitä vereen millä tahansa tavanomaisella taval-5 la. Liuokset injektoidaan kuitenkin mielellään suonen sisäisesti verivirtaan joko yhtenä suurena annoksena tai vähitellen tai molemmilla tavoilla. Nämä liuokset sekoitetaan yleensä vereen siten, että suonipaine pysyy olennaisesti muuttumattomana.

on selvää, että keksintö kattaa pinta-aktiivista kopolymeeria sisältävän liuoksen ja fibrinolyyttlsen entsyymin erillisen antamisen. Esimerkiksi, pinta-aktiivista kopolymeeria sisältävä liuos ja fibrinolyyttistä entsyymiä sisältävä liuos voitaisiin valmistaa toisistaan erillään, ja niitä voitaisiin antaa samanaikaisesti tai peräkkäin 10 potilaalle, joka kärsii sepelvaltimon sulkevasta tukkeumasta. Oheisen keksinnön mukaiseen fibrinolyyttiseen valmisteeseen kuuluvan kahden komponentin (kopolymeeri ja fibrinolyyttinen entsyymi) samanaikainen tai peräkkäinen antaminen vaikuttavat samalla tavalla kuin näiden komponenttien antaminen yhdessä, joten oheinen keksintö kattaa molem- 20 mat antotavat.

Oheisen keksinnön mukaisessa fibrinolyyttisessä valmisteessa käyttökelpoisia fibrinolyyttisiä entsyymejä ovat esimerkiksi strepto- kinaasi (saatavana yhtiöstä Hoechst-Roussel tavaramerkkinä 25

Streptase ', urokinaasi (saatavana yhtiöstä Abbot Laboratories, North Chicago, IL tavaramerkkinä Abbokinase 7 sekä kudoksen plasminogeeni-aktivaattori (Biopool AB, Umeä, Ruotsi), näihin kuitenkaan rajoittumatta. Kudoksen plasminogeeniaktivaattori voi olla peräisin eukari-oottisista soluista, kuten ihmisen melanomasoluista, tai se on voitu 30 valmistaa geneettiseen manipulointiin perustuvilla menetelmillä, kuten yhdistelmä-DNA:n avulla. Eräät näistä fibrinolyyttisistä entsyymeistä ovat ainoastaan niukkaliukoisia veteen, jote ne on emulgoi-tava pinta-aktiivisen kopolymeerin kanssa ennen niiden antamista potilaalle.

35 ·*· Ideaalitapauksessa potilaaseen injektoidaan suuri annos kopolymeeri- liuosta ilman entsyymiä ennen oheisen keksinnön mukaisen valmisten 94928 18 antamista. Potilaaseen injektoidaan esimerkiksi kopolymeerin 3-pro-^ senttistä liuosta, joka on tehty 5 % isotoniseen dekstroosiin, kahden minuutin aikana siten, että kopolymeerin pitoisuus veressä on arviolta 0,6 mg/ml. Tämän lisäksi saattaa olla edullista antaa kopolymeerin liuosta hitaasti suonen sisäisesti, suurin piirtein nopeudella 25 mg ® ruumiin yhtä painokiloa kohden tunnissa, jolloin kopolymeerin pitoisuudeksi veressä saadaan arviolta 0,6 mg/ml, ja tätä antamista jatketaan neljän vuorokauden tai sitä pitemmän ajan oheisen keksinnön mukaisen fibrinolyyttisen valmisteen antamisen jälkeen. Tämä käsittely estää osaltaan hyytymän muodostumisen uudestaan.

10

Vaikka kuvaus kohdistuukin suurimmaksi osaksi sydänsairauksiin, niin kuitenkin on selvää, että oheisen keksinnön mukaista fibrinolyyttistä valmistetta voidaan käyttää yhtä hyvin elimistön muissa osissa, kuten aivoissa, säärissä, keuhkoissa tai ruuansulatuskanavassa, 15 esiintyvien tukkeumien hoitamiseen.

Oheinen keksintö kohdistuu myös menetelmään verisuonissa esiintyvien hyytymien liuottamiseksi, jonka menetelmän käsittämissä vaiheissa elimistöön injektoidaan liuosta, jossa on läsnä tehokkaana pitoisuu- 20

tena seuraavan kaavan mukaista pinta-aktiivista kopolymeeria: H0(C2H40)b(C3H60)a(C2H40)bH

• missä a on sellainen kokonaisluku, että hydrofobisen ryhmän (CoHgO) 25 molekyylipaino on 950-4000, mielellään 1750-4000, ja missä b on sellainen kokonaisluku, että hydrofiilinen osa (C2H40) muodostaa arviolta 50-90 paino-% tästä yhdisteestä. Pinta-aktiivisen kopolymeerin pitoisuus veressä on arviolta 0,1-6 mg/ml, mielellään 0,5-2 mg/ml. Tämän jälkeen elimistöön injektoidaan liuosta, jossa on 30 läsnä tehokas pitoisuus fibrinolyyttistä entsyymiä ja tehokas määrä pinta-aktiivista kopolymeeria. Hyytymän liukenemisen tai hajoamisen jälkeen elimistöön injektoidaan liuosta, jossa pinta-aktiivista kopolymeeria on läsnä tehokkaana pitoisuutena. Kopolymeerin pitoisuus pidetään arviolta alueella 0,4-2 mg/ml verta noin 4-144 tunnin ajan.

35 ** Oheinen keksintö kohdistuu myös menetelmään fibriinin poistamiseksi kasvaimesta, jonka menetelmään kuuluvassa vaiheessa elimistöön injek- ii m i imi i i ! *t · i 19 94928 toidaan hyytymää liuottavaa valmistetta sisältäviä liuosta, mainitun ^ valmisteen käsittäessä tehokkaan määrän fibrinolyyttistä entsyymiä sekä tehokkaan määrän seuraavan kaavan mukaista pinta-aktilvista kopolymeeria:

5 H0(C2H40)b(C3H60)a(C2H40)bH

missä a on sellainen kokonaisluku, että hydrofobisen ryhmän (C3HgO) molekyylipaino on arviolta 950-400, mielellään 1750-4000, ja missä b on sellainen kokonaisluku, että hydrofiilinen osa (C2H40) muodostaa ^ arviolta 50-90 paino-% yhdisteestä. Oheisen keksinnön mukaista fibrinolyyttistä valmistetta voidaan laittaa suoraan kasvaimeen.

Fibriinin poistaminen kasvaimesta parantaa diagnostisten reagenssien kulkeutumista kasvaimeen. Menetelmä parantaa myös kemoterapiassa 15 käytettävien lääkkeiden kulkeutumista kasvaimeen sekä kasvaimen herkkyyttä tälle hoitomuodolle.

Oheinen keksintö kohdistuu lisäksi menetelmään, joka parantaa veren virtaamista ja hapen saantia kasvaimessa, jonka menetelmän käsittä en mässä vaiheessa elimistöön injektoidaan liuosta, joka sisältää tehokkaan pitoisuuden seuraavan kaavan mukaista pinta-aktiivista kopolymeeria:

\ H0(C2H40)b(C3H60)a(C2H4O)bH

25 missä a on sellainen kokonaisluku, että hydrofobisen ryhmän (C3HgO) molekyylipaino on arviolta 950-4000, mielellään 1750-4000, ja missä b on sellainen kokonaisluku, että hydrofiilinen osa (C2H40) muodostaa arviolta 50-90 paino-% yhdisteestä.

30

Oheinen keksintö kohdistuu myös parannettuiin kudosten ex vivo perfuu-siovalmisteeseen, joka käsittää verta, tehokkaan määrän hyytymistä estävää ainetta sisältävää liuosta sekä tehokkaan määrän seuraavan kaavan mukaista pinta-aktiivista kopolymeeriä: 35

*.*: H0(C2H40)b(C3H60)a(C2H40)bH

94928 20 missä a on sellainen kokonaisluku, että hydrofobisen ryhmän (CjHgO) ^ molekyylipaino on arviolta 950-4000, mielellään 1750-4000, ja missä b on sellainen kokonaisluku, että hydrofiilinen osa (C2H40) muodostaa arviolta 50-90 paino-% yhdisteestä. Tätä kudosten ex vivo perfuusio-valmlstetta voidaan laimentaa kolloidiliuokSella tai suolaliuoksella. 5 Hyytymistä estävänä aineena käytetään mielellään hepariinia. Oheisen keksinnön tätä suoritusmuotoa voidaan käyttää ihmisestä tai eläimestä saatujen siirrettävien elimien eliniän pidentämiseen.

Oheinen keksintö kohdistuu samoin menetelmään sirppisolusairauksien 10 käsittelemiseksi, jonka menetelmän käsittämässä vaiheessa elimistöön injektoidaan fibrinolyyttistä valmistetta sisältävää liuosta. Tämä valmiste käsittää tehokkaan pitoisuuden fibrinolyyttistä entsyymiä sekä tehokkaan määrän seuraavan kaavan mukaista pinta-aktiivista kopolymeeriä: 15

HO (C2H40)b (C3H60) a(C2H40)bH

missä a on sellainen kokonaisluku, että hydrofobisen ryhmän (C3H5O) molekyylipaino on arviolta 950-4000, mielellään 1750-4000, ja missä 20 b on sellainen kokonaisluku, että hydrofiilinen osa (C2H40) muodostaa arviolta 50-90 paino-% yhdisteestä.

Oheinen keksintö kohdistuu myös menetelmään sirppisolusairauksien > käsittelemiseksi, jonka menetelmän käsittämässä vaiheessa elimistöön 25 injektoidaan liuosta, joka sisältää tehokkaan pitoisuuden seuraavan kaavan mukaista pinta-aktiivista kopolymeeriä:

H0(C2H40)b(C3H60)a(C2H40)bH

30 missä a on sellainen kokonaisluku, että hydrofobisen ryhmän (C3HgO) molekyylipaino on arviolta 950-4000, mielellään 1750-4000, ja missä b on sellainen kokonaisluku, että hydrofiilinen osa (C2H40) muodostaa arviolta 50-90 paino-% yhdisteestä.

35

Seuraavat spesifiset esimerkit havainnollistavat keksinnön sovelta-*· mistä erityisesti verisuonissa esiintyvien hyytymien liuottamiseen sekä hyytymien uuden muodostumisen estämiseen. On selvää, että muut 94928 21 esimerkit ovat ilmeisiä alan asiantuntijalle, ja ettei keksintö ^ rajoitu näihin spesifisiin havainnollistaviin esimerkkeihin.

Esimerkki I

5 Kopolymeerin lisääminen hyytymiä liuottavaan entsyymiin johtaa syner-gistiseen vaikutukseen, joka kohdistuu entsyymin hyytymiä liuottavaan aktiivisuuteen, kuten tässä esimerkissä osoitetaan.

Steriileihin, 1 millilitran tuberkuliiniruiskuihin laitetaan 0,6 ml lasihelmiä, joiden koko on 500-750 mikronia (Polyscience, Inc., Warington, PA). Ruiskujen kärkiin liitetään Nytex-suodatin sekä muovinen yksitiehana. Tuoreseen pakastettuun, verihiutaleita niukasti käsittävään, sitraattia sisältävään plasmaan lisätään 15 pCi/ml -merkittyä ihmisen fibrinogeeniä (Sigma Chemical Co., St. Louis, 15 HO). Radioaktiivinen plasma laimennetaan 1:2 normaalilla suolaliuoksella, ja sen kalsiumpitoisuus nostetaan uudestaan kalsiumilla (American Dade, Aquada, Puerto Rico) käyttäen 1 tilavuutta kalsiumia laimennetun plasman 4 tilavuutta kohden.

20

Radioaktiivinen fibrinogeeni sidotaan lasihelmistä muodostuviin pylväisiin seuraavasti: yhtä suuret tilavuudet radioaktiivisesti merkittyä, uudelleen kalsifioitua plasmaa lisätään rinnakkaisiin lasihelmipylväisiin, ja niiden annetaan valua helmien läpi niin, ; ettei helmien päälle jää ylimääräistä plasmaa. Kaikki "helmihyyty- 25 miin" liittyvät toimenpiteet ja manipuloinnit toteutetaan 37 1C:n lämpötilassa. Helmistä ja plasmasta muodostuvia hyytymiä inkuboidaan 30 minuuttia, ja niitä pestään sitten 30 minuuttia normaalilla suolaliuoksella. Virtausnopeuksia seurataan suolaliuoksella toteutetun pesun viimeisten 5 minuutin aikana, ja pylväät, joissa virtausnopeus 30 on epätavallisen suuri tai pieni, suljetaan kokeen ulkopuolelle. Normaalit virtausnopeudet ovat keskimäärin 0,2 ml minuutissa.

Tässä esimerkissä käytettävällä kopolymeerillä on seuraava kaava:

35 H0(CH40)b(C3H60)a(C2H40)bH

e · e missä hydrofobisen ryhmän (CjHgO) molekyylipaino on arviolta 1750, 94928 22 jolloin koko yhdisteen molekyylipaino on arviolta 8400. Kopolymeeristä ^ on valmistettu varastoliuos, joka sisältää 1 paino-% kopolymeeria normaalissa suolaliuoksessa.

Verta, joka sisältää kudoksen plasminogeeniaktivaattoria (t-PA), ® johdetaan yhdessä kopolymeerin kanssa tai ilman sitä pylväiden läpi seuraavasti: 10 ml heparinoitua kokoverta imetään tuoreena ja sekoitetaan yhdisteeseen t-PA (10 pg 1 millilitrassa normaalia suolaliuosta; yksi ketju, Sigma Chemical Co., St. Louis, HO). 5,5 millilitran tilavuus verta sekoitetaan joko 0,5 millilitraan normaalia suolaliu-^ osta tai 0,5 millilitraan kopolymeerin varastoliuosta. Kunkin pylvään läpi johdetaan yksi näyte, joka on saatu kokoveren preparratista tai normaalilla suolaliuoksella suhteessa 1:3 laimennetusta kokoverestä. Kolme millilitraa kumpaakin venpreparaattia laitetaan kuhunkin pylvääseen liitettyyn säiliöön. Fraktioita kerätään joka minuutti, 15 kunnes virtaus on täysin pysähtynyt. Tilavuus kussakin putkessa määritetään ja radioaktiivisuus lasketaan Tracor Analytic-gammalas-kurilla (TmAnalytic, Inc., Elk Grove Village, IL). Radioaktiivisuuden läsnäolo keräilyputkissa osoittaa hyytymän hajoamisen.

20

Tulokset esitetään taulukossa A ja kuviossa 1. Kuviossa 1 pylväistä vapautunut ^-^I-fibrinogeeni (laskuriyksikköä minuutissa) esitetään kumulatiivisesti ajan funktiona.

25 30 1 35 • · 94928 23

1 TAULUKKO A

Perfusaatti* Aika Talteen- Lasku- Lasku- Lasku- (minuu- otettu yksikköä yksikköä yksikköä tissa) tilavuus minuutissa minuutissa minuutissa 5 (tilavuus) (ml) (kumula tiivinen)

Veri, t-PA, 1 0,3 2031 6770 2031 kopolymeeri 2 0,25 3042 12168 5073 3 0,3 13051 43503 18124 4 0,2 40190 200950 58314 10 5 0,25 40260 161040 98574 6 0,25 40009 160036 138583

Veri, t-PA 1 0,15 885 5900 885 2 0,2 1330 6650 2215 3 0,2 3681 18405 5896 4 0,3 16333 54443 22229 15 5 0,4 24932 62330 47161 6 0,45 30545 67878 77706 7 0,6 40365 67275 118071

Veri, 2 0,8 340 425 340 kopolymeeri 3 0,7 351 501 691 4 0,6 270 450 961 on 5 0.6 226 377 1187 6 0,5 204 408 1391 7 0,4 178 445 1569 * Hyytymää jäljittelevä tukkeuma, joka sisältää ^25j.£^ri£n£Ä> ·' 25 valmistetaan tekstissä kuvatulla tavalla. Testattavien preparaattien kyky liuottaa fibriiniä määritetään mittaamalla pylväästä eluoituneen radioaktiivisuuden määrä. Kopolymeeri ei ole entsyymi ja siinä ei ole reaktiivisia ryhmiä, joten se ei kykene hajottamaan ristisidoksia käsittävää fibriiniä, mutta se parantaa t-PA:n fibrinolyyttistä 2q aktiivisuutta tässä mallissa, jolla pyritään jäljittelemään sepelval-timotukoksen rakennetta ja siinä vallitsevia virtausolosuhteita.

Kuten taulukosta A ja kuviosta 1 voidaan nähdä, radioaktiivisen hyytymän käsitteleminen pinta-aktiivisella kopolymeerilla vapauttaa vain vähän radioaktiivisuutta, mikä osoittaa, ettei hyytymä hajoa. Hyytymän käsitteleminen t-PA:11a aiheuttaa radioaktiivisuuden vapautumista, mikä osoittaa pylvään käsittämän hyytymän hajoamisen. Kui- 94928 24 tenkin, kun liuokseen lisätään pinta-aktiivista kopolymeeria, niin ^ pylvään käsittämän hyytymän hajoamisnopeus suurenee dramaattisesti. Näin ollen pinta-aktiivisen polymeerin ja t-PA:n yhdistelmä hajotti hyytymää pylväässä merkittävästi nopeammin kuin pelkkä t-PA.

5 Muissa kokeissa tätä mallia muunnetaan muuttamalla helmien kokoa, hyytymän aikaansaamiseen käytettävän plasman pitoisuutta, veren laimennossuhdetta tai entsyymin tai kopolymeerin pitoisuutta. Monissa tapauksissa saadaan pylväitä, joissa kokoveri ei kykene virtaamaan lainkaan, kun taas kopolymeeria sisältävä veri virtaa noin nopeudella 0,05 ml/minuutti. Veressä läsnäoleva t-PA ei kykene liuottamaan lainkaan tällaisten hyytymien fibriiniä 1^1-merkkiaineen vapautumisen perusteella määritettäessä, koska verta ei virtaa lainkaan hyytymän läpi. Kopolymeerin käyttö tällaisissa tilanteissa veren ja t-PA:n kanssa johtaa hyytymän nopeaan hajoamiseen.

15

Esimerkki- II

Fibrinolyyttinen valmiste testattiin ex vivo menetelmällä käyttäen rotan sydäntä. Järjestelmä on kuvattu yksityiskohtaisesti toisaalla on (katso Paulson et ai., Basic Res. Cardiol., Voi. 81, sivut 180-187, 1986, joka julkaisu liitetään oheen tällä viittauksella). Tässä menetelmässä mitataan eristetyn sydämen kyky toipua 30-90 minuutin pituisesta verettömästä jaksosta, jonka aikana ravinteiden virta on pienentynyt 1 prosenttiin normaalista tai on pysähtynyt täydellisesti, • 25 minkä jälkeen seuraa 10 minuutin pituinen uusi per f uusio. Kolme parametriä määritetään: (1) sydämen teho (CO); (2) vasemmassa kammiossa vallitseva systolinen paine (LVSP); sekä (3) vasemman kammion supistuminen (dp/dt). Sydämen toipumisen ja vaurion suuruuden määrittämistä tarkastellaan julkaisuusa Paulson, D.J. et ai., Basic Res.

on ÖU Cardiol., Voi. 79, sivut 551-561, 1984.

Tässä kokeessa sydämien läpi johdetaan ihmisen pestyä kokoverta, johon ei olla lisätty hepariinia. Virtaus pysäytetään täydellisesti 30 minuutiksi, minkä jälkeen sydämien läpi johdetaan jälleen 10 mi- 35 nuutin ajan ihmisen pestyä kokoverta, joka ei sisällä hepariinia, mutta johon on lisätty taulukossa B mainittua ainetta tai aineita. Tässä esimerkissä käytettävällä kopolymeerillä on seuraava kaava: > »tl l »lii I I I St 94928 25

H0(C2H40)b(C3H60)a(C2H40)bH

missä hydrofobisen ryhmän (CjHgO) molekyylipaino on arviolta 1750, ja koko yhdisteen molekyylipaino on arviolta 8400. Kopolymeerista valmistetaan varas toi iuos, joka sisältää 1 paino-% kopolymeeria ® normaalissa suolaliuoksessa.

Kokeesta saatiin seuraavat tulokset. Tässä esimerkissä käytetyn pinta·aktiivisen kopolymeerin lopullinen pitoisuus on 0,68 mg/ml. Tässä esimerkissä käytetty streptokinaasi voidaan hankkia yhtiöstä Sigma Chemical Company, St. Louis, HO. Streptokinaasia käytetään pitoisuutena 100 yksikköä/sydön. Tulokset esitetään taulukossa B.

TAULUKKO B

Sydämen toipuminen prosentteina (arvot ovat keskiarvoja)_

Lisätyt aineet CO LVSP dp/dt

Kokoveri 5 24 10 sisältäen kopolymeeria 38 82 65 20 sisältäen streptokinaasia 33 75 60 sisältäen kopolymeeria ja 58* 88 78 streptokinaasia * 25 * p < 0,05 sydämen tehoissa (CO) todettujen erojen tapauksessa verrattaessa toisiinsa kopolymeerin ja streptokinaasin yhdistelmää sekä (a) kokoverellä käsiteltyä veretöntä vertailuryhmää, (b) pelkkää kopolymeeria, sekä (c) pelkkää streptokinaasia. Student:in testiä käytettiin erillisten keskiarvojen välisten erojen määrittämiseen.

30

Tulos katsottiin merkittäväksi, jos p < 0,05.

Kuten taulukosta B voidaan nähdä, kopolymeerin ja streptokinaasin yhdistelmä suojasi sydäntä selvästi paremmin kuin pelkkä kopolymeeri tai pelkkä streptokinaasi.

e e < 35

Esimerkki III

94928 26

Noin 180 paunaa painavan potilaan, joka kärsii keuhkoveritulpasta, hoitamista varten 500 mg urokinaasla (Abboklnase, Abbot Laboratories, North Chicago, IL) sekoitetaan 105 millilitraan steriiliä vettä.

5 Tähän urokinaasiliuokseen lisätään 90 ml 0,9 % natriumkloridiltuosta, joka sisältää 6 g seuraavan kaavan mukaista etyleenioksidin ja pro-pyleenioksidin välistä kopolymeeria:

H0(C2H40)b(C3H60)a(C2H40)bH

10 missä hydrofobisen osan (C3Hg0) molekyylipaino on arviolta 1750, ja missä koko yhdisteen molekyylipaino on arviolta 8400. Urokinaasi ja kopolymeeri sekoitetaan huolellisesti homogeenisen liuoksen saamiseksi. Liuoksen lopullinen tilavuus on 195 ml.

15 Tätä keksinnön mukaista fibrinolyyttistä valmistetta annetaan jatkuvatoimisen infuusiopumpun avulla, joka pumppu pystyy annostelemaan yhteensä 195 millilitran suuruisen tilavuuden nestettä. Esikäsittelevä annos oheisen keksinnön mukaista fibrinolyyttistä valmistetta annetaan 20 nopeudella 90 ml/tunti 10 minuutin aikana. Tätä seuraa oheisen keksinnön mukaisen valmisteen jatkuva infuusio nopeudella 15 ml/tunti 12 tunnin ajan. Koska keksinnön mukaista fibrinolyyttistä valmistetta jää letkuihin infuusiojakson loppuessa, niin letkuihin jäävä liuos huuhdotaan ulos letkuista johtamalla järjestelmän läpi 0,9 % natrium-25 kloridiliuosta nopeudella 15 ml/tunti.

Esimerkki IV

Sydänvaltimon tukkeumasta kärsivän potilaan hoitamista varten 75 mg 30 urokinaasia (Abbokinase, Abbot Laboratories, North Chicago, IL) sekoitetaan 15,6 millilitraan steriiliä vettä. Tähän urokinaasiliuokseen lisätään 300 ml 5 % dekstroosiliuosta, joka sisältää 15 g etyleenioksidin ja propyleenioksidin välistä kopolymeeria, jolla on kaava:

H0(C2H40)b(C3H60)a(C2H40)bH

35 94928 27 missä hydrofobisen osan (CjHgO) molekyylipaino on arviolta 1750, ja ^ missä koko yhdisteen molekyylipaino on arviolta 8400. Urokinaasi ja kopolymeeri sekoitetaan huolellisesti homogeenisen liuoksen saamiseksi. Sitten tämä liuos laimennetaan 5 % dekstroosilla siten, että lopputilavuudeksi saadaan 500 ml.

5

Oheisen keksinnön mukaista valmistetta käsittävää liuosta johdetaan infuusiona tukkeutuneeseen valtimoon nopeudella 4 ml minuutissa jopa 2 tunnin ajan. Reaktio oheisen keksinnön mukaisesta valmisteesta tehdylle liuokselle määritetään säännöllisin väliajoin toteutetulla ^ angiografiällä.

Esimerkki V

Noin 180 paunaa painavan potilaan, joka kärsii keuhkoveritulpasta, 15 hoitamista varten 500 mg urokinaasia (Abbokinase, Abbot Laboratories,

North Chicago, IL) liuotetaan 105 millilitraan steriiliä vettä.

Tähän urokinaasiliuokseen lisätään 90 ml 0,9-prosenttista natrium-kloridiliuosta, joka sisältää 6,0 g etyleenioksidin ja propyleeniok-sidin välistä kopolymeeria, jolla on seuraava kaava: 20

H0(C2H40)b(C3H60)a(C2H40)bH

missä hydrofobisen osan (ΟβΗςΟ) molekyylipaino on arviolta 1750, ja missä koko yhdisteen molekyylipaino on noin 8400. Urokinaasi ja 25 kopolymeeri sekoitetaan huolellisesti homogeenisen liuoksen saamiseksi. Sitten tämä liuos laimennetaan 0,9-prosenttisella natriumklo-ridilla siten, että lopulliseksi tilavuudeksi saadaan 195 ml.

Potilaalle annetaan 2 minuutin aikana 137 ml 5-prosenttista iso- 30 tonista dekstroosiliuosta, johon on hajotettu 3 paino-%/tilavuus etyleenioksidin ja propyleenioksidin välistä kopolymeeria. Tällöin kopolymeerin pitoisuudeksi veressä saadaan arviolta 0,6 mg/ml (olettaen, että ruumiin painosta 8 % on verta).

35 Tämän jälkeen potilaalle annetaan välittömästi oheisen keksinnön .· mukaista fibrinolyyttistä valmistetta jatkuvatoimisen infuusiopumpun avulla, joka pumppu kykenee siirtämään yhteensä 195 millilltraa 94928 28 nestettä. Oheisen keksinnön mukainen esikäsittelevä annos annetaan ^ 10 minuutin aikana nopeudella 90 ml/tunti. Tämän jälkeen oheisen keksinnön mukaista valmistetta annetaan jatkuvana infuusiona nopeudella 15 ml/tunti 12 tunnin ajan. Koska oheisen keksinnön mukaista liuosta jää letkuihin infuusiojakson loppuessa, niin tämä letkuihin ® jäävä liuos huuhdotaan ulos johtamalla järjestelmän läpi nopeudella 15 ml/tunti 0,9-prosenttista natriumkloridiliuosta, joka sisältää 3,0 % kopolymeeria.

Sen jälkeen, kun hyytymä on hajonnut, potilaalle annetaan hitaasti 10 suonen sisäisesti kopolymeeriä sisältävää liuosta noin nopeudella 25 mg ruumiin painokiloa kohden tunnissa, jolloin kopolymeerin pitoisuus veressä saadaan säilymään noin arvossa 0,6 mg/ml. Kopolymeeriä sisältävän liuoksen antamista jatketaan neljä vuorokautta oheisen keksinnön mukaisen fibrinolyyttisen valmisteen antamisen jälkeen.

15

Esimerkki VI

Elinten säilyttämiseksi ex vivo elinsiirtoja varten 1000 yksikköä hepariinia (Sigma Chemical Company, St. Louis, MO) liuotetaan 20 200 millilitraan normaalia (0,9 %) natriumkloridiliuosta, johon lisätään 1,36 g oheisen keksinnön mukaista kopolymeeria. Tähän sus-pendoidaan uudestaan ihmisen pestyä kokoverta perfuusioliuoksen saamiseksi. Kopolymeerilla on seuraava kaava:

25 H0(C2H40)b(C3H60)a(C2H40)bH

missä hydrofobisen osan (C3HgO) molekyylipaino on arviolta 1750, koko yhdisteen molekyylipainon ollessa 8400.

30

Nukutetuista Sprague-Dawley-rotista irrotettujen sydänten läpi johdettiin 10 minuutin ajan (a) verta ja hepariinia, tai (b) verta, hepariinia ja kopolymeeria 90 minuuttia kestäneen vähävirtauksisen verettömyyden jälkeen. Sydämen teho (CO), vasemmassa kammion systolinen paine (LVSP) Ja vasemman kammion supistuminen (dp/dt) määritet- 35 tiin, ja ne ilmoitetaan prosentuaalisena palautumisena normaaleihin sydämiin verrattuna. Palautuminen todettiin huonoksi verettömissä eläinsydämissä, joiden läpi johdettiin hepariinia sisältävää verta: > äH'? *1*3 I: , *i ~a* · · ♦ · 94928 29 12 % CO; 44 ft LVSP; ja 34 % dp/dt. Palautuminen todettiin erinomai-1 seksi sydämissä, joiden läpi johdettiin verta, hepariinia ja kopoly-meeria: 90 % CO; 92 % LVSP; ja 84 % dp/dt. Hepariinia ja kopolymeeria saaneessa ryhmässä kaikki kolme parametriä olivat tilastollisesti erilaisia (p < 0,01) verrattuna verettömään vertailuryhmään (ainoas-5 taan hepariinia). Erillisten keskiarvojen väliset erot määritettiin Student;in testillä.

Esimerkki VII

10 Tässä esimerkissä toteutetulla kokeella osoitetaan superoksidi-dismu-taas in ja sopivan kopolymeerin yhdistelmän kyky suojata paremmin veretöntä sydänlihasta uuden perfuusion aiheuttamalta, happiradikaa-leista ja muista tekijöistä johtuvalta vahingoittumiselta, kuin pelkkä superoksidi-dismutaasi.

15

Eläimet nukutetaan täydellisesti (natriumtiopentaali, 25 mg/kg), niihin laitetaan kurkkuputki, ja ventiloiminen toteutetaan 70 % hapella nopeudella 12 hengenvetoa minuutissa. Tyydyttävä aneste-siataso pidetään yllä antamalla eläimille ajoittain, tarvittaessa, 20 w uusi annos pentotaalia. Iho preparoidaan, minkä jälkeen rintaontelo avataan edestä, eläimen vasemmalta puolelta, sydänpussi (perikardium) viilletään auki ja sydän paljastetaan. Vasen etummainen laskeva sepelvaltimo paikallistetaan, eristetään ja silmukoidaan 1 sentti-:' metrin etäisyydeltä sen alkukohdasta. Tämän vasemman etummaisen 25 laskevan sepelvaltimon tilapäinen sulkeuma saadaan aikaan tiukentamalla silmukka 90 minuutin ajaksi. Tämän toimenpiteen aikana sydämen nopeutta ja verenpainetta seurataan käyttäen yhtiön Hewlett-Packard 8-kanavaista piirturia 7758B. Valtimon verenpainetta seurataan oikeaan reisivaltimoon sijoitetun katetrin, jonka koko on 18 gauge, läpi 30 yhtiön Hewlett-Packard kvartsianturilla mittaamalla. Sydänlihaksen etuväliseinän verettömyyttä seurataan myös elektrokardiografisesti.

90 minuutin pituisen verettömyyden jälkeen suljetun verisuonen per-fuusio aloitetaan uudestaan löysentämällä silmukkaa vähitellen verentungokseen johtavan reaktion estämiseksi. Huoneessa on käytettävissä 35 värinän poistin sekä kaikkia mahdollisesti välttämättömiä kardioto-* nisiä lääkkeitä siltä varalta, että vasemman etummaisen laskevan sepelvaltimon sitominen johtaa sydänvärinään tai verenkierron romah- 94928 30 dukseen. Lääkitseviä aineita annetaan infuusiona perfuusion uudestaan ^ aloittamisen yhteydessä seuraavasti: naudan superoksidi-dismutaasia, jonka aktiivisuus on arviolta 3000 yksikköä/mg määritettynä menetelmällä, joka esitetään julkaisussa McCord, J. Biol. Chem., Voi. 244, sivu 6049 (1969), saadaan yhtiöstä Sigma Chemical Company, St. Louis, 5 MO. Se liuotetaan 100 millilitraan normaalia suolaliuosta ja sitä annetaan suonen sisäisenä infuusiona 90 minuutin ajan aloittaen 15 minuuttia ennen perfuusion palauttamista. Tällä jäljitellään niitä ilmiöitä, joita tavataan sepelvaltimotukoksen hajoamisen aikana.

^0 Kopolymeerista valmistetaan suolaliuokseen liuos, jonka pitoisuus on 2 paino-%/tilavuus. Sitä annetaan suonen sisäisesti riittävän suurena annoksena 2 minuutin ajan siten, että pitoisuudeksi veressä saadaan 0,6 mg/ml, minkä jälkeen liuosta annetaan jatkuvana infuusiona arviolta nopeudella 25 mg/kg tunnissa, jotta pitoisuus veressä saataisiin säilymään suunnilleen arvossa 0,6 mg/ml kokeen loppuajan.

Etyleenioksidin ja propyleenioksidin välisellä kopolymeerilla on seuraava yleinen kaava:

20 H0(C2H40)b(C3H60)a(C2H40)bH

missä hydrofobisen osan (C3Hg0) molekyylipaino on arviolta 1750, koko yhdisteen molekyylipainon ollessa 8400.

: Tämän yhdistelmän synergistinen vaikutus osoitetaan vertaamalla 25 koirilla, joiden käsittelemiseen oli käytetty sekä kopolymeeria että superoksidi-dismutaasia, saatuja tuloksia niihin tuloksiin, jotka saatiin koirilla, joita oli käsitelty yksin jommella kummalla materiaalilla, tai joita ei oltu käsitelty lainkaan.

30

Näitä aineita annetaan suonen sisäisellä infuusiolla käyttäen IVAC

560-infuusiopumppua. Infuusio aloitetaan 15 minuuttia ennen silmukan avaamista, ja sitä jatketaan niin kauan, kunnes kunkin ryhmän koko annos on annettu. Rintakehä suljetaan kerroksittain. Rintaputkea käytetään ilmarinnan tyhjentämiseen, ja se poistetaan spontaanin 35 hengityksen käynnistyessä. Nesteitä (laktaattia sisältävää Ringer:in liuosta) annetaan suonen sisäisesti kirurgista toimenpidettä edeltäneen, 24 tunnin pituisen NPO-jakson kompensoimiseksi, 3:l-suhteen · iti i liiti I I | Ifl 94928 31 lisäksi menetetyn veren kompensoimiseksi. Tämän jälkeen eläimistä ^ huolehditaan ja niitä seurataan tarkoin seuraavan 24 tunnin ajan.

Sitten eläimet viedään takaisin leikkausosastolle, ne nukutetaan ja aikaisempi viilto avataan uudestaan. Eläimet tapetaan barbituraatin yliannoksella. Sydämet ja 4 cm sydämen läheisyydessä sijaitsevaa 5 nousevaa aortaa leikataan irti varmistuen siitä, että sepelvaltimoiden alkukohdat saadaan mukaan.

Kaikki ryhmät käsitellään samalla tavalla sydänlihaksen sen alueen, jossa infarktin vaara on suuri, sekä todella infarktin kokeneen alueen tunnistamiseksi.

Tämä tekniikka käsittää vasemman etummaisen, laskevan sepelvaltimon perfuusion 2,3,5-trifenyylitetratsoliumkloridilla, joka värjää vahingoittumattoman sydänlihaksen punaiseksi infarktin kokeneen sydänli-15 haksen pysyessä värjäytymättömänä. Vaaran alaisen sydänlihasalueen rajat määritetään johtamalla sepelvaltimojärjestelmän loppuosan läpi, aorttakannan kautta, Evans Blue-väriainetta. Vaaran alainen alue määritetään Evans Blue-värjäytymisen puuttumisena.

20

Luonnollisestikin on selvää, että edellä esitetty kohdistuu ainoastaan oheisen keksinnön edulliseen suoritusmuotoon, ja että siihen voidaan tehdä lukuisia muutoksia ja muunnoksia tällöin kuitenkaan liitteenä olevissa patenttivaatimuksissa määritellyn keksinnön hen- gestä ja tavoitteista poikkeamatta.

25 30 35 • e

Claims (14)

94928

1. Menetelmä lääkeaineena käytettävän liuoksen valmistamiseksi, joka sisältää tehokkaan pitoisuuden seuraavan kaavan mukaista pinta-aktii- 5 vista kopolymeeria: H0(C2H*0)b(C3H60).(C2H*0)bH missä a on sellainen kokonaisluku, että hydrofobisen osan (C3H60) mole-10 kyylipaino on arviolta 1750 ja missä b on sellainen kokonaisluku, että hydrofiilinen osa (C2H*0) muodostaa arviolta 50-90 paino-% yhdisteestä, koko yhdisteen molekyylipainon ollessa arviolta 8400, tunnettu siitä, että menetelmässä muodostetaan etyleenioksidin ja propyleeniok-sidin kondensaatiotuote korotetussa lämpötilassa ja paineessa emäksisen 15 katalyytin läsnäollessa.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunne ttu siitä, että mainittu liuos sisältää toista hyytymistä estävää ja/tai liuottavaa ainetta. 20

3. Patenttivaatimuksen 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että hyytymistä estävä ja/tai liuottava aine on fibrinolyyttinen entsyymi.

4. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mainittu fibrinolyyttinen entsyymi valitaan kudoksen plasmino-geeniaktivaattorin, streptokinaasin, prourokinaasin ja urokinaasin joukosta.

5. Jonkin patenttivaatimuksen 1-4 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että liuokseen lisätään lisäksi kemoterapeuttista ainetta.

6. Jonkin patenttivaatimuksen 1-5 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että liuokseen lisätään lisäksi diagnostista reagenssia kasvat-35 men ilmaisemiseksi. 94928

7. Patenttivaatimuksen 6 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mainittu diagnostinen reagenssi on kasvaimelle spesifinen, radio-aktiivisesti merkitty monoklonaalinen vasta-aine.

8. Patenttivaatimuksen 5 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että kemoterapeuttinen aine on happiradikaaleja poistava aine.

9. Patenttivaatimuksen 8 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mainittu happiradikaaleja poistava aine valitaan superoksididismu- 10 taasin ja mannitolin joukosta.

10. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä Ex vivo kudosten per-fuusiovalmisteen valmistamiseksi kudosten ja elinten perfuusiota varten, tunnettu siitä, että yhdistetään 15. verta; - tehokkaan määrän hyytymistä estävää ainetta tai sitä sisältävää liuosta; sekä - tehokkaan määrän patenttivaatimuksen 1 mukaisella tavalla valmistettua liuosta tai siihen sisältyvää kopolymeeriä. 20

11. Patenttivaatimuksen 10 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mainittu veri on kokoverta.

12. Patenttivaatimuksen 10 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, 25 että mainittu veri on laimennettu kolloidiliuoksella.

13. Patenttivaatimuksen 10 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mainittu veri on laimennettu kolloidi- tai suolaliuoksella.

14. Patenttivaatimuksen 10 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mainittu hyytymistä estävä aine on hepariini. 94928