FI92463C - Menetelmä sterolirakkuloiden valmistamiseksi ja yhdisteen sulkemiseksi niiden sisään - Google Patents

Description

4 99/1.·«

Menetelmå sterolirakkuloiden valmistamiseksi ja yhdisteen sulkemiseksi niiden sisåån

Keksinto koskee menetelmiå, joilla voidaan sulkea yhdisteitå liposomeihin, jotka ovat syntyneet sterolien ja orgaanisten happojen muodostamien johdannaisten suolamuodoista, jotka puolestaan kykenevåt muodostamaan kaksoiskerroksia.

Steroleja, kuten kolesterolia ja muita lipidejå, joihin on liittynyt hydrofiilinen osa, kuten orgaanisen hapon suola-muoto, voidaan kåyttåå monilamellisten tai yksilamellisten rakkuloiden suspensioiden valmistukseen. Keksinnon kohteena olevat steroliliposomit voidaan valmistaa orgaanisia liuot-timia kåyttåmållå tai ilman niitå. Nåmå rakkulat voivat sulkea sisåånså vesiliukoisia yhdisteitå, osittf.in vesiliukoi-sia yhdisteitå ja veteen liukenemattomia yhdisteitå.

Tåsså kuvatut sterolirakkulat soveltuvat erittåin hyvin biologisesti aktiivisten yhdisteiden tai farmaseuttisten yhdis-teiden sisåånsulkemiseen, jotka yhdisteet voidaan antaa in vivo. Vaihtoehtoisesti voidaan keksinnon mukaisesti valmis-tettuja steroliliposomeja kåyttåå in vitro. Tåsså selostet-tuja kolesterolihemisukkinaattiliposomeja voidaan kåyttåå in vitro esim. kahdenarvoisista kationeista riippuvaisissa måå-ritysmenetelmisså.

Liposomit

Liposomit ovat tåysin sulkeutuneita kaksoiskerroskalvoja ja sisåltåvåt sulkeumassaan vesifaasin. Liposomit voivat olla monilamellisia rakkuloita (sipulimaisia rakenteita, joille ovat tunnusomaisia samankeskiset kaksoiskerroskalvot, joita kutakin kalvoa erottaa toisistaan vesikerros), tai yksila-mellisia rakkuloita (sisåltåvåt yhden ainoan kaksikerroskal-von) .

2 92463

Liposoraivalmisteissa on kaksi parametria rakkulakoon ja lipidipitoisuuden funktioina: (1) Sulkutilavuus, joka maaritellaan tietyn lipidimåårån sulkemaksi tilavuudek- si ja ilmoitetaan litroina suljettua ainetta per mooli -1 kokonaislipidia (1 mol ). Sulkutilavuus riippuu lipo-somien såteestå, joka puolestaan riippuu rakkuloiden li-pidikoostumuksesta ja valiaineen ionikoostumuksesta. (2) Kapselointitehokkuus maaritellaan kaksoiskerroksen eris-tåmån vesiosaston osuutena ja ilmoitetaan prosentteina. Kapselointitehokkuus on suoraan verrannollinen lipidi-pitoisuuteen; kun enemmån lipidiå on lasnå, liposomien sisåån voidaan eriståå liuotettavaa ainetta enemman.

(Ks. Deamer ja Uster, 1983, Liposome Preparation: Methods and Mechanisms, teoksessa Liposomes, toim. M. Ostro,

Marcel Dekker, Inc., NY, ss. 27-51.)

Alkuperåisesså liposomienvalmistusmenetelmåsså (Bangham et al., 1965, J. Mol. Biol. _L3: 238-252) suspendoitiin fosfolipidit orgaaniseen liuottimeen, joka sen jålkeen haihdutettiin kuiviin niin, ettå reaktioastian pohjaan jåi vahamainen fosfolipidikerros. Sitten lisåttiin tar-vittava måårå vesifaasia, seoksen annettiin "turvota" ja syntyneet liposomit, jotka olivat monilamellisia rakkuloi-ta (kåytetåån tåstå låhtien nimitystå MLV, multilamellar vesicle), dispergoitiin mekaanisesti. Nåin syntyneen kak-sikerroskalvon rakenne on sellainen, ettå lipidin hydro-fobiset (ei-polaariset) "hånnåt" ovat suuntautuneet kaksoiskerroksen keskustaa kohti, kun taas hydrofiiliset (polaariset) "pååt" ovat suuntautuneet vesifaasia kohti. Tåmå tekniikka tarjosi perustan pienten, sonikoitujen yksilamellisten rakkuloiden (kåytetåån tåstå låhtien nimitystå SUV, small unilamellar vesicle) kehittåmiselle, joita Papahadjopoulos ja Miller ovat kuvanneet julkaisus-sa Biochim. Biophys. Acta, 135 (1967), 624-638. Sekå MLV:t ettå SUV:t ovat kuitenkin ominaisuuksiltaan rajoi-tettuja mallisysteemeinå kåytettåviksi.

II

o O Λ S -7

3 > .·ί -i' O O

Haluttaessa lisatå sulkutilavuutta tai kapselointitehok-kuutta on kehitetty lukuisia menetelmia fosfolipidikak-soiskerroksista koostuvien liposomien valmis-tamiseksi, mutta kaikissa menetelmisså joudutaan kaytta-maan orgaanisia liuottimia. Seuraavassa selostetaan eraita naista raenetelmista lyhyesti.

Yritettaessa kohottaa kapselointitehokkuutta muodostettiin ensin liposomiprekursoreja tai misellejå, jotka ovat rafeku-iGita?. - joissa vesifaasi on yhden lipidimolekyylikerroksen ymparoima niin, etta paissa olevat polaariset ryhmat ovat suuntautuneet vesifaasiin pain. Liposomiprekursorit muo-dostetaan lisaamalla kapseloitava vesiliuos liuokseen, jossa polaarinen lipidi on orgaanisessa liuottimessa, ja suorittamalla sen jalkeen sonikointi. Sen jalkeen liposomiprekursorit emulgoidaan toisessa vesifaasissa lipidi-ylimaaran lasnaollessa ja haihdutetaan. Nain saadut li-posomit, joissa vesifaasi on lipidikaksoiskerroksen kap-seloima, dispergoidaan vesifaasiin (ks. USA:n pa tentti julkaisu no. 4 224 179, julkaistu 23. syyskuuta, 1980 (M. Schneider)).

Toisessa kapselointitehokkuuden maksimointiyrityksessa (Papahadjopoulos, USA:n patentti julkaisu no. 4 235 871 , julkaistu 25. marraskuuta, 1980) selostetaan "kåanteis-faasihaihdutusmenetelmaa" muutamia lamelleja sisaltavien lipidirakkuloiden valmistamiseksi, jotka tunnetaan myos kaanteisfaasihaihdutusrakkuloina (kaytetaan tasta lahtien nimitysta REV, reverse-phase evaporation vesicles). Tuos-sa menetelmassa lisåtaan kapseloitava vesipitoinen materi-aali polaarisen lipidin ja orgaanisen liuottimen seokseen. Sitten muodostetaan homogeeninen vesi-oljyssS-tyyppinen emulsio ja orgaanista liuotinta haihdutetaan niin, etta muodostuu geeli. Sitten geelista tehdaan suspensio dis-pergoimalla geelimainen seos vesivaliaineeseen. Nain saadut REV-tyyppia edustavat rakkulat ovat paaosin yksi- 4 ^ ί 4 o 3 lamellisia rakkuloita (suuria yksilamellisia rakkuloita, large unilamellar vesicles, LUV) ja jossain måarin muuta-malamellisia rakkuloita, joissa suuri sisåinen vesitila on vain muutaman samankeskisen kaksoiskerroksen ymparoi-ma.

On kirjoitettu paljon mahdollisuudesta kayttaå liposo-meja lååkkeidenantosysteemeissa. Ks. esimerkiksi USA:n patenttijulkaisu no. 3 993 754, julkaistu 23. marraskuu-ta, 1976 (Yeuh-Erh Rahman ja Elizabeth A. Cerny) ja USA:n patenttijulkaisu no. 4 145 410, julkaistu 20. maaliskuuta, 1979 (Barry D. Sears). Kun laaketta annetaan liposomis-sa, se suljetaan liposomien sisåån liposomeja valmistet-taessa ja annetaan sen jalkeen hoidon kohteena olevalle potilaalle. Laåke voi olla veteen tai ei-polaariseen liuottimeen liukeneva. Tata koskevia tyypillisia selos-tuksia loytyy mm. USA:n patenttijulkaisusta no. 4 235 871, julkaistu 25. marraskuuta, 1980 (Papahadjopoulos ja Szoka) ja USA:n patenttijulkaisusta no. 4 224 179, julkaistu 23. syyskuuta, 1980 (M. Schneider). Kun liposomeja valmiste-taan in vivo-kayttoa vårten, olisi edullista (1) eliminoi-da orgaanisten liuottimien kayttotarve ja (2) maksimoi-da kapselointitehokkuus ja sulkutilavuus, jotta yhden an-noksen myota voidaan antaa suurempi måarå sulkeumissa ole- - vaa materiaalia suurempana pitoisuutena.

Vesiliukoiset sterolit

Kosmeettisiin, farmaseuttisiin ja diagnostisiin tarkoituk-siin on kaytetty monenlaisia steroleja ja niiden vesi-liukoisia johdannaisia. Vesiliukoisista steroleista on kosmeettisissa valmisteissa kaytetty esimerkiksi haara-ketjuisten rasvahappojen kolesteroliestereita, steroidi-estereita ja PEG-fytosteroleja (eurooppalainen patenttiha-kemusjulkaisu no. 28 456; USA:n patenttijulkaisu no.

4 393 044; ja Schrader, Drug and Cosmetic Industry, Sep- Q 9 A s ->

5 ' - 'OJ

tember 1983, s. 33 ja October 1983, s. 46). Thakkar ja Kuehn selostavat julkaisussa J. Pharm. Sci 57(7) (1969): 850-852 steroidihormonien liuottamista kåyttamållå steroidisten, ei-ionisten pinta-aktiivisten aineiden, erityisesti etoksyloidun kolesterolin (so. PEG-koleste-rolin) 1-5 %:sia vesiliuoksia. Kuitenkaan nain liuo-tettujen steroidihormonien tehokkuutta ja kayttokelpoi-suutta in vivo ei osoitettu. On valmistettu lukuisia vesiliukoisia kolesterolej a, joita on kaytetty vesiliu-koisina standardeina biologisten nesteiden kolesteroli-tason maarityksessa (USA:n patenttijulkaisu no. 3 859 047; USA:n patenttijulkaisu no. 4 040 784; USA:n patenttijul-kaisu no. 4 042 330; USA:n patenttijulkaisu no. 4 183 847; USA:n patenttijulkaisu no. 4 189 400 ja USA:n patentti-julkaisu no. 4 224 229). Shinitzky et al. (1979, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76:5313-5316) inkuboivat kasvainso-luja kudosviljelyalustassa, joka sisalsi pienina pitoi-suuksina kolesterolia ja kolesterolihemisukkinaattia Kolesterolin ja kolesterolihemisukkinaatin sisallyt-tåminen solukalvoon alensi kalvon valuvuutta (fluidicity) ja lisasi kalvolipidin mikroviskositeettia.

Kolesterolia ja muita steroleja on myos sisallytetty fos-folipidiliposomikalvoihin, kun tarkoituksena on ollut muuntaa lipidikaksoiskerrosten fysikaalisia ominaisuuk-sia. Esimerkiksi askeisessa tiivistelmassaan Ellens et al. ( 1984, Biophys. J. 45: 70a) selostavat H+-ionien vaikutusta lipidirakkuloihin, jotka koostuvat fosfati-dyylietanoliamiinista ja kolesteryylihemisukkinaatista.

Itse asiassa Brockerhoff ja Ramsammy ovat julkaisussa Biochim. Biophys. Acta. 691 (1982): 227-232 maininneet, etta voidaan rakentaa pelkasta kolesterolista koostu-via kaksoiskerroksia, jos mukana on stabiloiva hydrofiili-nen ankkuri. Monilamellisia ja yksilamellisia koleste-roliliposomeja valmistettiin tavalliseen tapaan, kuten edella on selostettu, haihduttamalla kuiviin koleste- 6 00/!<7 ^ -- ‘ s O o rolijohdannaisen (so. kolesteroli-fosfokoliinin, kolestero-li-polyetyleeniglykolin tax kolesteroli-S04:n) orgaaniseen liuottimeen tehty dispersio niin, ettå reaktioastian pohjaan jåi lipidikalvo. Lipidikalvo sonikoitiin veden (2 ml) alla kåyttåmållå ultraåånihomogenaattoria, joka oli varustettu mikrokårjellå. Muutamalamellisten rakkuloiden muodostaminen vaati 10 minuutin sonikaation, kun taas pienten yksilamel-listen rakkuloiden muodostuminen vaati 4 tunnin sonikaation. Saadut muutamalamellisten liposomien suspensiot olivat mai-tomaisia, kun taas yksilamellisten liposomien suspensiot olivat låpinåkyviå.

Tåhån mennesså ei kuitenkaan ole tutkittu mahdollisuutta sulkea bioaktiivisia aineita tehokkaasti sterolirakkuloihin, jolloin anto voisi tapahtua in vivo ja vesiliukoisia aineita voitaisiin antaa suurempina annoksina ja veteenliukenematto-mien aineiden anto helpottuisi.

Nyt esillå oleva keksinto koskee menetelmiå, joiden avulla erilaisia yhdisteitå voidaan sulkea liposomien sisåån, joiden kaksoiskerrokset koostuvat sterolien ja orgaanisten hap-pojen muodostamien johdannaisten suolamuodoista. Tåsså tar-koitetaan yhdisteen sisåånsulkemisella vesiliukoisen yhdis-teen kapselointia liposomin vesiosaan tai veteenliukenemat-toman yhdisteen sulkemista sterolikaksoiskerrokseen. Rakkuloiden kaksoiskerrosten aineeksi sopivat erityisen hyvin sterolien ja orgaanisten happojen muodostamien johdannaisten tris(hydroksimetyyli)aminometaanisuolamuodot (eli tris-suo-lamuodot).

Keksinnon oleelliset tunnusmerkit on esitetty oheisissa pa-tenttivaatimuksissa.

Sterolirakkuloiden valmistusmenetelmåsså lisåtåån vesi-puskuriin suljettuja kaksoiskerroksia muodostamaan ky-kenevåå sterolin ja orgaanisen hapon muodostaman johdan-naisen suolamuotoa måårå, joka riittåå saamaan aikaan li r. η /s /"7 7 ... ** ο ο tåysin sulkeutuneita kaksoiskerroksia, joisen sisåsså on vesiosasto. Monilamellisten rakkuloiden suspensio saa-daan seosta sekoittamalla. Rakkuloiden muodostuminen hel-pottuu, jos vesipuskuri sisaltaa myos liuoksen suolan vastaionia. Lisåksi, jos sterolin ja orgaanisen hapon muodostaman johdannaisen dissosioitunut suolamuoto on nega-tiivisesti varattu neutraalissa pH:ssa, pitaisi vesipus-kurin olla oleellisesti ottaen vapaa kahdenarvoisista ja monenarvoisista kationeista. Samoin, kun sterolin ja orgaanisen hapon muodostaman johdannaisen dissosioitunut suolamuoto on positiivisesti varattu neutraalissa pH:ssa, pitaisi vesipuskurin olla oleellisesti ottaen vapaa monenarvoisista anioneista. Energian tuonti suspensioon, esimerkiksi sonikaatio tai rakkuloiden ekstruusio ranska-laisen painekennon låpi (French Press) tai huokoskooltaan sopivan huokoisen suodattimen lapi, muuntaa monilamelli-set sterolirakkulat yksilamellisiksi rakkuloiksi.

On olemassa lukuisia tapoja, joita kayttamalla vesiliukoi-nen yhdiste, osittain vesiliukoinen yhdiste tai veteen-liukenematon yhdiste voidaan sulkea tamån keksinnon mu-kaisten sterolirakkuloiden sisåån. Yhdisteitå, jotka asettuvat sterolikaksoiskerroksiin (esim. veteen- liukenemattomat yhdisteet), tai vesiliukoisia yhdisteita voidaan lisata vesifaasiin ennen rakkuloidenmuodostusta, jotta aine saadaan suljetuksi rakkuloiden sisaan niitå muodostettaessa. Vaihtoehtoisesti voidaan veteenliuke-nemattomat tai lipidiliukoiset yhdisteet lisata steroli-rakkulasuspensioon rakkuloidenmuodostuksen jalkeen, jos-sa tapauksessa yhdiste asettuu sterolikaksoiskerroksiin. Vielå erååsså toteutustavassa voidaan veteenliukenematon yhdiste ja sterolin ja orgaanisen hapon muodostaman johdannaisen suolamuoto lisata orgaaniseen liuottimeen niin, ettå kumpikin liukenee (yhteisliukeneminen). Sitten or-gaaninen liuotin voidaan haihduttaa niin, ettå jåljelle jåå kalvo, jossa veteenliukenematon yhdiste ja steroli- 8

Q O A C 7 '' “·**<' O \J

johdannainen ovat homogeenisesti jakautuneina. Kun kal-voon lisåtåån vesipuskuria ja ravistellaan, saadaan sterol iliposome ja, jotka ovat sulkeneet sisåånså veteen liukenemattoman yhdisteen.

Tåmån keksinnon mukaisesti valmistetut steroliliposomit sopivat erittåin hyvin veteen liukenemattomien bioaktii-visten aineiden ja våhåisesså måårin veteen liukenevien aineiden sisåånsulkemiseen. Tåmå mahdollistaa veteen liukenemattomien lååkkeiden antamisen in vivo ja lisåksi tåmå mahdollistaa veteen liukenemattomien yhdisteiden antamisen suurina pitoisuuksina in vivo, koska nyt on mahdollista sååtåå suhdetta annos:tilavuus. Tåmån keksinnon mukaisesti valmistetut sterolirakkulat tarjoavat vastaavanlaisia etuja myos vesiliukoisten bioaktiivisten aineiden sisåånsulkemiseen kåytettåesså. Lisåksi voidaan tåmån keksinnon mukaisesti valmistettuja sterolirakku-loita kåyttåå diagnostisissa in vitro -måårityksisså.

Tåmå keksinto tarjoaa lukuisia etuja, joista mainitta-koon, ettå sterolirakkulat (1) voidaan muodostaa helposti ja nopeasti; (2) niillå on suuri kapselointitehokkuus, kun verrataan fosfolipidi-MLV-tyypppisiin; (3) niiden valmistuksessa ei tarvita orgaanisia liuot- • timia (tåmån keksinnon mukaiset sterolirakkulat voidaan kyllå myos valmistaa orgaanisia liuottimia kåyttåmållå); ja (4) ne voivat sulkea sisåånså bioaktiivisen tai farma-seuttisen aineen, joka sen jålkeen voidaan antaa in vivo ja joka nåin annettuna vapautuu ja metaboloi-tuu. In vivo annetun, rakkuloissa olevan aineen kohtalo riippuu antotavasta.

Edelleen tåmå keksinto koskee menetelmåå seoksen valmis-tamiseksi, joka seos sisåltåå kolesteryylihemisukkinaa-tin tris(hydroksimetyyli)aminometaanisuolaa ja sienilåå-kettå, joka sienilååke voi olla erityisesti mikonatsoli, li 9 η ° λ < 7 ^ <- ο ϋ terkonatsoli tax ekonatsoli, isokonatsoli, tiokonatsoli, bifonatsoli, klotrimatsoli, ketokonatsoli, butakonatso-li, itrakonatsoli, oksikonatsoli, fentikonatsoli, nysta-iini, naftifiini, amfoterisiini B, tsinokonatsoli tai siklopiroksolamiini. Seoksilla voidaan hoitaa sieni-in-fektioita ja ne voidaan antaa paikallisesti, suun kautta ja emåttimen sisåån tapahtuva anto mukaanlukien.

Keksinnon mukaisella menetelmållå voidaan myds valmistaa seosta, jossa on kolesteryylihemisukkinaatin tris(hydr-oksimetyyli)aminometaanisuolaa ja peptidiå, erityisesti hydrofobista peptidiå, ihmisen kasvuhormonia, naudan kasvuhormonia, sian kasvuhormonia tai insuliinia. Seosta voidaan antaa haluttaessa lisåtå maidontuotantoa tai saattaa nisåkkåån kasvu alulle.

Kuva 1 on graafinen esitys kåånteisestå verr-umollisuu-desta, joka on sisåån suljetun liuotettavan aineen (kro-mi) ja monilamellisten liposomien valmistuksessa kåyte-tyn kolesterolihemisukkinaatin pitoisuuden vålillå.

Kuva 2 esittåå rontgendiffraktiokåyriå, jotka on saatu neljålle erilaiselle CHS-MLV-valmisteelle (CHS = koles-terolihemisukkinaatti, MLV = monilamellinen rakkula).

Kuva 3 esittåå elektronispinniresonanssituloksia, jotka on saatu CHS-monilamellirakkuloille ja EPC-monilamelli-rakkuloille (EPC = munan fosfatidyylikoliini).

Kuva 4 on graafinen esitys kolesterolihemisukkinaattili-posomien ja munan fosfatidyylikoliliniliposomien turpoa-misprofiileista vesipuskureissa, joilla on eri ionivå-kevyydet.

Kuva 5 on graafinen esitys kolesterolihemisukkinaattili-posomeihin suljetun indometasiinin kyvystå våhentåå ni-velten turvotusta intramuskulaarisesti annettuna.

10

' I vj J

Kuva 6 esittåå 14C-diatsepaamin jakautumista elimiin, kun anto on tapahtunut hiirille laskimonsisåisesti joko ilman kapselointia (vapaassa muodossa) tai CHS-SUV-rakkuloihin suljettuna (SUV = pieni yksilamellirakkula).

Kuvat 7A, B ja C esittåvåt 51kromin jakaantumista elimiin, kun anto on tapahtunut hiirille joko CHS-MLV-rakkuloihin suljettuna (kuva 7A) tai EPC-SPLV-rakkuloihin suljettuna (kuva 7B) tai kapseloimattomana (kuva 7C). (SPLV = stable plurilamellar vesicle, stabiili plurilamellirakkula.) Tåmå keksinto koskee menetelmiå, joita kåyttåmållå voidaan sulkea vesiliukoisia, osittain vesiliukoisia ja veteen liu-kenemattomia yhdisteitå liposomeihin, joiden kaksoiskerrok-set ovat syntyneet sterolien ja orgaanisten happojen muodos-tamien johdannaisten suoloista, jotka kykenevåt saamaan ai-kaan sulkeutuneita kaksoiskerroksia. Nåin olien tåmån kek-sinnon mukaisesti steroliliposomit voidaan valmistaa niin, ettå ne (l) sulkevat vesiliukoisen yhdisteen sisåånså ve-siosastoon tai (2) ne sulkevat veteen liukenemattoman yhdisteen niin, ettå se asettuu sterolikaksoisker·* oksiin, tai (3) ne sulkevat vesiliukoisen yhdisteen ja veteen liukenematto-man yhdisteen samaan liposomivalmisteeseen.

Tåmån keksinnon kåytånnon toteutuksessa voidaan kåyttåå mitå tahansa sterolin ja orgaanisen hapon muodostaman johdannai-sen suolamuotoa, joka kykenee saamaan aikaan tåysin sulkeutuneita kaksoiskerroksia vesiliuoksissa (eli liposomeja). Jonkin tietyn sterolin ja orgaanisen hapon muodostaman joh-dannaisen suolamuodon sopivuus riippuu sen kyvystå sulkea sisåånså vesiliukoinen yhdiste niin, ettei yhdiste ole yh-teydesså ulkopuolella olevan ympåristdn kanssa.

Seuraavat kriteerit on kehitetty sitå vårten, ettå voitai-siin måårittåå luotettavasti, onko sulkeutuminen liposomin vesiosastoon tapahtunut (ks. Sessa ja Weissmann, 1970, J.

II

I -i Ο ο /1 r *? II ··' - S Ο Ο

Biol. Chem. 245: 3295): (a) Geelisuodatuksella tapahtuvas- sa maarityksessa pitaa saada aikaan selva erottuminen va-paan ja sulkeumissa olevan yhdisteen valille. (b) Rakku-lan kaksoiskerroksen uloimman kerroksen ja suljetun yhdisteen valilla ei saa esiintya rnitaan hydrofobista tai varaustenvalista vuorovaikutusta, koska sellaisten esiinty-minen saattaisi estaa vapaan yhdisteen ja liposomien tay-dellisen erottumisen toisistaan molekyyliseulonnassa, mi-ka naennaisesti viittaisi siihen, etta kapselointitehok-kuus olisi kasvanut. Taman mahdollisuuden eliminoimisek-si pitaa voida osoittaa, ettei aikaisemmin muodostettujen liposomien suspensioon lisatty vesiliukoinen yhdiste elu-oidu nåiden ennen muodostettujen liposomien mukana. (c)

Kun geelisuodatettavat liposomit rikotaan pinta-aktiivisen aineen tai muun kalvonrikkoja-aineen avulla, pitaa sulkeu-mamolekyylien geelisuodatuskayraån syntya siirtyma liposo-mipiikin kohdalta siihen kohtaan, joka osoittaa vapaan molekyylin eluoitumista.

Taman keksinnon kaytånnon toteutuksessa voidaan kayttaa yleensa ottaen mita tahansa sterolia, johon on liitetta-vissa orgaaninen happo. Tallaisia steroleja ovat mm. ko-lesteroli, D-vitamiini, fytosterolit (mm. sitosteroli, kampesteroli, stigmasteroli tms.), streoidihormonit tms.

Sopivia orgaanisia happoja, joista voidaan muodostaa ste-lien johdannaisia, ovat mm. karboksyylihapot, dikarboksyyli-hapot, polykarboksyylihapot, hydroksihapot ja polyaminoha-pot. Koska suolamuodot lisaavat orgaanisten happojen ve-siliukoisuutta, voidaan sterolien johdannaisten muodostami-seen kayttaa mita tahansa orgaanista happoa, mutta saatta olla edullista, jos orgaanisen hapon muodostama osa itses-saan jo on vesiliukoinen. Tallaisia vesiliukoisia orgaanisia happoja ovat mm. vesiliukoiset alifaattiset karboksyy lihapot, kuten etikkahappo, propionihappo, voihappo, valeriaanahappo tms. (huomautus: korkeintaan nelja hiili- 12 C O / .<

S i— 1 O O

atomia sisaltavåt hapot ovat vesiliukoisia, viisi hii-liatomia sisaltava vapaa happo on osittain vesiliukoinen ja pitempiketjuiset vapaat hapot ovat kaytannollisesti katsoen veteenliukenemattomia); vesiliukoiset alifaatti-set dikarboksyylihapot, kuten malonihappo, meripihkahappo, glutaarihappo, adipiinihappo, pimeliinihappo, maleiinihap-po tms. (huomautus: lyhempiketjuiset hapot ovat helpommin veteen liukenevia; vesiliukoisuusraja on kohdassa Cg-C^); ja veteenliukenemattomat aromaattiset dikarboksyylihapot, kuten hemimellitiinihappo, trimesiinihappo, sukkinimidi tras.; polykarboksyylihapot; vesiliukoiset hydroksihapot, kuten glykolihappo, maitohappo, mantelihappo, glyseriini-happo, omenahappo, viinihappo, sitruunahappo tms. (huomautus: α-hydroksihapot , joissa on haarautunut ketju kiinnittyneenå karbonyyliryhmån a-hiileen, ovat vahemman alttiita hydrolyysille ja nain olien edullisia taman kek-sinnon kaytannon toteutuksen kannalta); ja mitka tahansa aminohapot ja polyaminohapot.

Orgaaninen happo voidaan littåå sterolin hydroksyyliryhmaan esteri- tai eetterisidoksella kayttamalla tavanomaisia me-netelmia (ks. esimerkiksi USA:n patenttijulkaisut no.

3 859 047, 4 040 784, 4 042 330, 4 183 847 ja 4 189 400). Sterolijohdannaisten suolamuodot voidaan valmistaa liuot-tamalla seka sterolin ja orgaanisen hapon muodostama joh-dannainen etta suolan vastaioni (esimerkiksi suolan vapaa emas) sopivaan haihtuvaan liuottimeen ja sen jalkeen poistamalla liuotin haihduttamalla tai muulla sopivalla tavalla niin, etta jaannokseksi jaa sterolin ja orgaanisen hapon muodostaman johdannaisen suolamuoto. Sopivia vastaioneja ovat mm. tris, 2-amino-2-metyyli-1,3-propaani-dioli, 2-aminoetanoli, bis-tris-propaani, trietanoliamiini tms., jotka saavat aikaan vastaavan suolan. Itse asiassa voidaan vastaionina kayttaa ionisoituvan bioaktiivisen ai-neen vapaata emasta, kuten mikonatsolin vapaata emåsta tms. Nain olien voidaan bioaktiivista ainetta kayttaa

II

Q0 0fZ

13 y . o o vastaionina.

Taman kéksinnon mukaisesti steroliliposomeja voidaan valmis-taa lisååmållå vesifaasiin sterolin ja orgaanisen hapon muodostaman johdannaisen suolamuotoa, joka kykenee saa-maan aikaan kaksoiskerroksia niin, ettå sterolijohdannaisen maara riittåa muodostamaan rakkuloita (so. tåy-sin sulkeutuneita kaksoiskerroksia, joissa vesiosasto on sulkeumassa). Sitten valmistetta ravistellaan, kunnes muodostuu maitomainen, monilamellisten sterolirakkuloiden suspensio. Edullisessa toteutustavassa pitaisi vesifaasin sisåltåå suola liuenneena, jotta rakkulanmuodostus helpot-tuisi. Lisaksi, jos sterolin ja orgaanisen hapon muodostaman johdannainen dissosioitunut suolamuoto on negatiivi-sesti varattu neutraalissa pH:ssa, pitaisi vesipuskurin olla oleellisesti ottaen vapaa monenarvoisista kationeis-ta. Vastaavasti, kun orgaanisen hapon johdannaisen dissosioitunut suolamuoto on positiivisesti varattu neutraalissa pH:ssa, pitaisi vesipuskurin olla oleellisesti ottaen vapaa monenarvoisista anioneista.

Taysin toisin kuin enneståån tunnetuissa monilamellisten rakkuloiden valmistusmenetelmissa (esim. fosfolipidirak-kulat tai kolesteroliliposomit, joita Brockenhoff ja Ram-• sammy ovat selostaneet julkaisussa Biochim. Biophys. Acta. 691 (1982), 227-232) ei tåman kéksinnon mukaisessa monilamellisten sterolirakkuloiden valmistusmenetelmassa tarvitse kayttaa orgaanisia liuotimia. Myoskaan, toisin kuin edellamainitussa Brockenhoffin ja Ramsammyn menetelmassa, ei monilamellisten sterolirakkuloiden val-mistuksessa tarvita sonikaatiota. Itse asiassa voidaan maitomainen monilamellisten sterolirakkuloiden suspensio muuntaa kirkkaaksi yksilamellisten sterolirakkuloiden suspensioksi suorittamalla monilamellisten rakkuloiden suspensiolle sonikaatio tai kayttamalla ranskalais-ta puristinta (SLM-Aminco, Urbana, 111.) ja suorittamalla 14 g o /i < 7; - 1 Dj sen jålkeen sonikaatio. Vastaavasti voidaan yksilamelli-sia sterolirakkuloita saada aikaan puristamalla monila-melliset sterolirakkulat kohtalaisella paineella suoti-men lapi, jonka huokoshalkaisija on < 100 nm. Taraa ekstruusiotekniikka on selostettu yksityiskohtaisesti patenttihakemusjulkaisussa, joka on jåtetty virastoon 20. heinakuuta, 1984, numerolla 622 690 (Cullis et al.), ja jonka nimitys on ""Extrusion Technique for Producing Unilamellar Vesicles", ja joka liitetaan tahan viitteeksi.

Kuten jo edella mainittiin, voidaan rninka tahansa sterolin ja orgaanisen hapon rauodostaman johdannaisen tris-suola-muotoa kayttaa edullisesti taman keksinnon kaytannon to-teutuksessa. Esimerkiksi steroli-hemidikarboksyylihapon, kuten sterolihemisukkinaatin tai sterolihemisukkinaatti-seoksen, tris-suolarauoto on erityisen kayttokelpoinen in vivo annettaviksi tarkoitettujen steroidiliposomien kaksoiskerrosrakkuloiden muodostukseen. Rakkuloiden muo-dostusta vårten voidaan esimerkiksi kolesterolihemisukki-naattia kaytettaessa lisata 2,5 - 700 ymol tris-suolamuo-toa 2,0 ml:aan vesipuskuria, joka sisaltaå Tris-HCl:aa (tirs(hydroksimetyyli)aminometaanihydrokloridia); tassa tapauksessa pitaisi vesipuskurin olla oleellisesti ot-taen vapaa kahdenarvoisista tai monenarvoisista katio-neista.

Taman keksinnon mukaisesti voidaan vesiliukoiset yhdis-teet, veteenliukeneraattomat yhdisteet tai vain våhaises-sa raaarin vesiliukoiset yhdisteet sulkea useita eri tapoja kayttåen liposomeihin, jotka ovat syntyneet sterolien ja orgaanisen happojen muodostamien johdan-naisten suolamuodosta. Naitå menetelmia ovat seuraa-vat: (1) Veteenliukenematon yhdiste lisåtaan steroliliposomi-suspensioon (joko monilamellisia sterolirakkuloita tai

II

15 C; A s ^ S £- ^ Ο ϋ yksilamellisia sterolirakkuloita), joka on valmistettu edella kuvatulla tavalla sterolin ja orgaanisen hapon muodostaman johdannaisen suolamuodosta. Yhdiste sulkeu-tuu liposomien sisåan, koska se asettuu sterolikaksois-kerroksiin. Tama valmistus voidaan edullisesti toteut-taa seuraavalla tavalla: Veteenliukenematon yhdiste liuotetaan sopivaan orgaaniseen liuottimeen, joka sen jalkeen haihdutetaan niin, et-,a jaljelle jaa yhdiste kalvona tai jaannoksena. Kun jaannokseen lisataan aiem-min muodostettu steroliliposomien vesisuspensio, jaannds joutuu steroliliposomien kaksoiskerroksiin.

(2) Veteenliukenematon yhdiste ja sterolin ja orgaanisen hapon muodostaman johdannaisen suolamuoto liuotetaan yh-dessa orgaaniseen liuottimeen ja sen jalkeen haihdutetaan niin, etta muodostuu kaVo, johon veteenliukenematon yhdiste ja sterolijohdannainen ovat tasaisesti jakautuneina. Kun kalvolle lisataan vesifaasi ja ravistellaan saadaan : suspensio, joka sisåltåå monilamellisia sterolirakkuloi ta, joissa on sisållå kyseista yhdistetta. Monilamelli-set rakkulat voidaan muuntaa yksilamellisiksi rakkuloiksi edella kuvatulla tavalla.

(3) Vesiliukoinen yhdiste tai veteenliukenematon yhdiste voidaan sulkea steroliliposomeihin lisaamalla yhdiste vesifaasiin, jota kaytetaan sterolirakkuloiden valmistuk-seee, eli yhdiste voidaan lisata vesifaasiin ennen tai samanaikaisesti sterolin ja orgaanisen hapon muodostaman johdannaisen suolamuodon kanssa. Tassa tapauksessa veteenliukenematon yhdiste asettuu kaksoiskerroksiin rakkuloidenmuodostuksen aikana, kun taas vesiliukoinen yhdiste asettuu sterolirakkuloiden vesiosastoon rakkuloidenmuodostuksen aikana. Kummassakin tapauksessa voidaan monilamelliset rakkulat muuntaa yksilamellisik-si rakkuloiksi edellakuvatulla tavalla.

16 ?. O / /- -v > ,·' C‘. f-1 ·", ·— L/ o (4) Jos bioaktiivinen aine on ionisoutuva, voidaan sen vapaata emastå kåyttåå vastaionina valmistettaessa stero-lin ja orgaanisen hapon muodostaman johdannaisen suola-muotoa. Steroliliposomit voidaan valmistaa millå tahansa edellåkuvatulla menetelraållå kåyttåmållå sterolin ja orgaanisen hapon muodostaman johdannaisen bioaktii-vista suolamuotoa. Tåsså keksinnon toteutustavassa voidaan suolajohdannaisten valmistukseen kåyttaa esimerkiksi sienilååkkeenå' toimivan mikonatsolin vapaata emåstå.

Edellå kuvattuja menetelmiå kåyttåen voidaan sekå vesi-liukoinen ettå veteenliukenematon yhdiste sulkea yhteen ja samaan steroliliposomivalmisteeseen.

Edellå selostettujen menetelmien mukaisesti, jotka koske-vat veteenliukenemattomien yhdisteiden sisåånsulkemista tåmån keksinnon mukaisia sterolirakkuloita kåyttåmållå, ei vaadita rakkuloiden pysymistå ehjinå sen jålkeen, kun veteenliukenematon yhdiste on erottunut kaksoiskerrok-siin. Itse asiassa on ajateltavissa, ettå yhdisteen erotuttua kaksoiskerrosten sisåån rakkuloita håiritaån tai ne rikotaan niin, ettå vesiosastoon suljetut yhdisteet vuotavat tai vapautuvat.

Tåmån keksinnon eråån toteutustavan mukaan valmistetaan steroliliposomit seuraavalla tavalla kåyttåmållå koles-terolihemisukkinaatin tris-suolaa: 4,5 - 200 mg koleste- rolihemisukkinaatin tris-suolamuotoa lisåtåån 1 ml:aan vesipuskuria, jossa on 0,01 M Tris-HCl ja 0,14 M NaCl.

Seosta ravistellaan, jolloin muodostuu maitomainen, moni-lamellisten kolesterolihemisukkinaattirakk.uloiden suspen-sio. Rakkulat voidaan pelletoida sentrifugoimalla ja pes-tå useaan kertaan vesipuskurilla. Monilamellisten koles-terolihemisukkinaattirakkuloiden (CHS-MLV) suspensio voidaan sonikoida (esim. kylpy-tyyppisesså sonikaattorissa) niin, ettå saadaan pieniå yksilamellisia kolesterolihemi-

II

17 9 9 Δ .< ν: sukkinaattirakkuloita (CHS-SUV). Vaihtoehtoisesti voidaan CHS-MLV:t laskea ranskalaisen painekennon (French Press) lapi 280 000 kPa:n (40 000 psi) paineella tai CHS-MLV:t voidaan laskea kahden 100 nm:n Nucleopore (TM) suodat-timen lapi 300 - 400 Pa:n paineessa niin, etta saadaa CHS-SUV-rakkuloita. Kolesterolihemisukkinaattirakkulat (seka MLV-rauoto etta SUV-muoto) ovat pysymattomia kahden-arvoisten kationien lasnaollessa eli joutuessaan alttiiksi kahdenarvoisille kationeille suljettu vesiosasto ja vesi-liukoiset yhdisteet vapautuvat. Nain olien pitåisi rakku-loiden valmistuksessa ja varastoinnissa kåytetyn vesiva-liaineen olla oleellisesti ottaen vapaa kahdenarvoisista kationeista.

Tamån keksinnon mukaisilla menetelmilla sisaansuljettuja yhdisteitå voidaan kayttaa eri tavoin. Esimerkiksi, jos yhdiste on bioaktiivinen aine, voidaan se steroliliposo-meihin suljettuna antaa in vivo. Tama helpottaa bioak-tiivisten aineiden antamista in vivo, sillå ne ovat yleen-sa liukenemattomia tai vahaisessa maarin liukoisia vesi-liuoksiin. Kun tallaiset liukenemattomat yhdisteet sulje-taan sterolin ja orgaanisen hapon muodostaman johdannai-sen suolamuodon aikaansaamiin liposomeihin, niita voidaan helpommin antaa suurempia annos-tilavuussuhteita kayttaen. Itse asiassa on tåman keksinnon mukaisia sterolirakkuloi-ta erityisen edullista kayttaa in vivo, koska rakkuloi-hin voidaan sulkea yksi tai useampia bioaktiivisia aineita in vivo-antoa vårten. Lisaksi taman keksinnon mukaiset rakkulat tarjoavat usein edun tavallisiin lipidirakku-loihin tai -liposomeihin verrattuina in vivo kåytettyinå siina, etta ne voidaan valmistaa orgaanisia liuottimia kayttamatta. Sisaansuljetun aineen kohtalo in vivo-annet-tuna riippuu antotavasta. Esimerkiksi laskimonsisaisesti annetun, steroliliposomiin suljettu aine kulkee elimis-tdsså eri tieta kuin ilman sulkemista tai tavallisiin fos-folipidiliposomeihin (so. MLV, SUV, REV, LUV) suljettu ai- 18

C o /! S V - - O J

ne. Toisaalta steroliliposomeihin suljetun aineen antaminen lihaksensisåisesti johtaa aineen pitkitettyyn vaikutukseen in vivo.

Kåytånn611isesti katsoen mikå tahansa bioaktiivinen aine voidaan sulkea tåmån keksinnon mukaisesti valmistettujen steroliliposomien sisåån. Tållaisia aineita ovat mm. baktee-rientorjunta-aineet, virustentorjunta-aineet, siententorjun-ta-aineet, loistentorjunta-aineet, kasvainlååkkeet, antime-taboliitit, polypeptidit, peptidit, proteiinit, toksiinit, entsyymit, hormonit, hermojen vålittåjåaineet, glykoprote-iinit, lipoproteiinit, immunoglobuliinit, immunomodulaatto-rit, vasodilatoivat aineet, våriaineet, radioaktiiviset lei-mausaineet, radiolåpikuultamattomuusaineet, fluoresoivat aineet, reseptoreihin sitoutuvat aineet, tulehduslååkkeet, viherkaihilååkkeet, mydriaasilååkkeet, paikallispuudutus-lååkkeet, narkoottiset aineet, vitamiinit, nukleiinihapot, polynukleotidit, jne. Kahden tai useamman yhdisteen sisåån-sulkeminen samanaikaisesti voi olla erityisen toivottavaa, jos tållaisten yhdisteiden vaikutukset ovat toisiaan tåyden-tåviå tai synergistisiå.

Steroliliposomeihin suljettu aine voidaan antaa in vivo mil-lå tahansa sopivalla tavalla, kuten mm. ruiskeina (esim. intravenoosinen, intraperitoneaalinen, intramuskulaarinen, subkutaani, intra-auraalinen, intra-artikulaarinen, intra-mammaarinen tms.), paikallisesti (esim. silmiin, iholle, korviin tai vammoihin, kuten haavoihin tai palaneisiin koh-tiin) tai adsorptiolla epiteelien tai limakalvojen låpi (esim. nenån, suun, emåttimen, peråsuolen tai ruuansulatus-kanavan limakalvon tms. låpi).

Muista kåyttoesimerkeistå voidaan mainita steroliliposomeihin suljetun yhdisteen sisållyttåminen mitå erilaisimpiin materiaaleihin, kuten muihin lipipidirakkuloihin eli li-posomeihin, geeleihin, åljyihin, emulsioihin tms. Esimerkik-si suspensio, jossa on sisåånsuljettua yhdistettå sisåltåviå 11 19 C": ·'> /! S’ s ώ. o ϋ steroliliposomeja, voidaan lisåtå vesifaasiin aineosaksi minkå tahansa tyyppiseen liposomivalmisteeseen (esim. fosfo-lipideistå muodostetut MLV:t, SUV:t, LUV:t, REV:t tms.).

Tåmå mahdollistaa yhdisteen sulkemisen fosfolipidiliposomien sisåån.

Alan ammatti-ihmisille tulee mieleen muita kåyttotapoja riippuen kyseisen valmisteen erityisominaisuuksista. Esimer-kiksi, koska tåmån keksinnon mukaisesti valmistetut koleste-rolihemisukkinaattiliposomit ovat herkkiå kahdenarvoisille kationeille, voidaan niiden sisåån sulkea indikaattorivåri-aineita, jotka ovat herkkiå kahdenarvoisille kationeille, kolorimetrisisså diagnostisissa in vitro -måårityksisså kåy-tettåviksi.

CHS-tris -sienilååkeformulaatiot

Kolesteryylihemisukkinaatin tris(hydroksimetyyli)aminome-taanisuola ("CHS-tris") muodostaa puolikiinteån geelin, kun se liuotetaan suureen våkevyyteen (esimerkiksi noin 100 mg/ml tai enemmån) kuumaan orgaaniseen liuottimeen, kuten etanoliin, ja annetaan jååhtyå noin 25°C:een. Saatu geeli on ulkonådltåån tasalaatuisempi, jos alkuperåistå CHS-tris-liu-osta sonikoidaan lyhyesti kylpysonikaattorissa. Geelin sisål tåmå liuotin voidaan poistaa haihduttamalla ilmassa tai vakuumissa. Kun geeliin lisåtåån vettå (joko ennen liuotti-men poistoa tai sen jålkeen), se dispergoituu pieniksi rak-kuloiksi.

Geeliin voidaan ennen geelinmuodostusta sisållyttåå bioak-tiivisia aineita, kuten sienilååkkeitå, ja sen jålkeen geeli voidaan applikoida emåttimensisåisesti, peråsuolen-sisåisesti, paikallisesti tai suun kautta. Sienilååkkeitå, joita voidaan sisållyttåå tåmån keksinnon mukaisiin formu-laatioihin, ovat mm. mikonatsoli, terkonatsoli, ekonatsoli, C O A C 7

20 s t- " Ϊ O O

isokonatsoli, tiokonatsoli, bifonatsoli, butakonatsoli, itrakonatsoli, oksikonatsoli, fentikonatsoli, nystatii-ni, naftifiini, ketokonatsoli, siklopiroks olamiini, klo-trimatsoli, tsinokonatsoli, amfoterisiini B tms. On sel-vaa, etta sientenvastaisten yhdisteiden vapaat emakset ja farmaseuttisesti hyvåksyttåvåt suolat kuuluvat tåmån kek-sinnon kattamaan alueeseen. Farmaseuttisesti hyvaksyttåvå suola on sellainen, joka ei saa aikaan myrkkyvaikutuksia eika ei-tcivottuja sivuvaikutuksia. Yleenså ottaen voidaan kayttaa mita tahansa sientenvastaista ainetta, joka sopii yhteen kyseisen formulaation kanssa. Etanoliliuokseen voidaan ennen geelinmuodostusta lisata muita aineosia anta-maan lopulliselle tuotteelle erilaisia fysikaalisia omi-naisuuksia, kuten pehmeytta, liukkautta, stabiilisuutta, tuoksua, makua tms. Sopivia lisaaineita ovat mm. vahat, kasvisvoit, kuten kasvirasvoista johdetun lauriinihapon kovat triglyseridit tai kaakaovoi, ja fosfolipidit, kuten munan fosfokoliini. Orgaanisia karboksyylihappoja, jot-ka ovat heikkoja tai kohtalaisen happamia, kuten maito-happoa, voidaan lisata alentamaan pH:ta ja/tai lisaamaån emaksisten laakkeiden liukoisuutta. Orgaanisessa hapossa on mielellaån korkeintaan 12 hiiliatomia, mieluummin korkeintaan 6 hiiliatomia. Sientenvastaisten emaksisten, polaaristen aineiden liukoisuus, esimerkiksi terkonatsolin - liukoisuus CHS-trisiin, paranee, jos noin 5-15 paino-% orgaanista karboksyylihappoa, kuten maitohappoa, on låsna formulaatiossa. Eråiden yhdisteiden, kuten maitohapon låsnåolo, saattaa olla toivottavaa myos siksi, ettå ne kykenevåt pidåttåmåån vettå ja siten "pehmentåmåån" formulaatiota. Muiden kåytettyjen lisåaineiden tai laimen-nusaineiden pitåisi olla stabiileja, farmaseuttisesti hy-våksyttåviå eli myrkkyvaikutuksettomia, ne eivåt saisi vai-kuttaa bioaktiivisen aineen tehoon ja turvallisuuteen hai-tallisesti ja niiden pitåisi sopia yhteen kyseisen antota-van, kuten emåttimensisåisen antotavan, kanssa.

II

21 ^ O o

Peråpuikot

Geeli voidaan muodostaa missa tahansa sopivassa astiassa. Perapuikkoja vårten voidaan muodostaa sopivankokoisissa ja -muotoisissa muoteissa ja antaa emåttimensisaisinå perå-puikkoina, jotka "dispergoituvat" hitaasti mudostaen liposome ja in vivo. Geeliin voidaan myos lisata vettå ennen kåyttoa niin, etta saadaan voide tai suspensio, joka voidaan antaa paikallisesti tai emåttimensisaisesti. Vesi-geelien eli hydratoitujen geelien on rontgendiffraktioana-lyysilla osoitettu muodostuvan liposomeille tyypillisistå monilamellirakenteista. Vaihtoehtoisesti voidaan geelista muodostaa voide tai suspensio muilla alan ammatti-ihmisten tuntemilla menetelmillå.

Perapuikkoja valmistettaessa ovat CHS-tris-geelit yleensa vaikeita muovata muotteihin, koska geelihiukkaset eivat tartu toisiinsa. Tasta syysta voidaan mukaan sisallyttåa vahaa, kasvisvoita, fosfolipidia tai muuta muovausainetta. Kovia rasvoja, kuten Wecobee M, kaytettaessa on CGS-trisin ja kovan rasvan valinen painosuhde noin 0,15:1 - 4:1. Teoksessa Remington's Pharmaceutical Sciences, 16. painos, Mack Publishing Co., Easton, PA, 1980, ss. 1530 - 1533, selostetaan perapuikkoformulaatioita ja se liitetaan tåhan viitteeksi.

Kaytettaessa fosfolipidejå, kuten munan fosfokoliinia, on CHS-trisin ja fosfolipidin valinen painosuhde noin 10:1 - 1:1. Kun kaytetaan fosfolipidia, kuten munan fosfo-koliinia, voidaan lisata orgaanista karboksyylihappoa, jos-sa on esimerkiksi 1-6 hiiliatomia, kuten maitohappoa, tar-vittaessa kohottamaan sientenvastaisen aineen liukoisuutta. Lisatyn maitohappomaaran suhde sientenvastaisen aineen, kuten mikonatsolin tai terkonatsolin, maaraan on mielellaan ekvimolaarinen tai pienempi.

22 /2 46θ

Valitaan sellaisia vahoja, kiinteita kasvirasvoja tms., jotka sopivat yhteen CHS-trissienilaakeformulaation kans-sa, ovat kiinteita huoneenlampotilassa ja sulavat ruumiin-låmpotilassa. Valitaan sellaisia fosfolipideja, jotka sopivat yhteen CHS-trissienilaakeformulaation kanssa ja dis-pergoituvat emåttimen limakalvoon. Myos muita alalla tun-nettuja kantaja-aineita voidaan kayttaa emattimensisåises-ti annettaviksi tarkoitetuissa taman keksinnon mukaisissa formulaatioissa

Voiteet Tåmån keksinnon mukaisesti CHS-trisvoideformulaatiot valmis-tetaan liuottamalla CHS-tris orgaaniseen liuottimeen, mie-lellaan noin 50 - 100 mg CHS-tris per ml liuotinta. Taval-lisia liuottimia ovat mm. alkoholit, kuten metanoli, eta-noli ja isopropanoli, ja sellaiset, joihin sielilaåkeaine tai muu bioaktiivinen aine liukenee. CHS-tris lisåtaan kiehuvaan liuottimeen, joka sen jalkeen siirretaan pois låmmonlåhteelta. Sitten lisataan bioaktiivinen aine varo-vaisesti sekoittaen. Saatu liuos kaadetaan laajaan asti-aan, jossa on suuri haihtumispinta liuottimen haihtumiselle.

Liuosta sonikoidaan lyhyesti noin 30- 180 sekuntia, jotta geeliytyminen alkaa. Termeilla "geeli" ja "geeliytyminen" tarkoitetaan viskoosista seosta, joka rakenteeltaan muis-tuttaa hyyteloa tai liivatetta. Viskoosisen seoksen kol-loidiominaisuuksia ei tunneta. Såilio peitetaan tiiviis-ti ja geeliytymisen annetaan tapahtua taydellisesti noin 20 -30°C:ssa, mielellaan 25°C:ssa, noin 4 tunnissa. Kansi poistetaan ja liuottimen annetaan haihtua. Liuotin voidaan myos poistaa vakuumissa.

Il c, ·*> /i .<:: .X , o 23

Syntynyt kuiva geeli on kiinteå ja se voidaan leikata osiin ja jauhaa sekoittimessa jåådytetyn hiilidioksidin kanssa niin, ettå saadaan hienojakoinen, rakeinen jauhe. Vettå ja jauhetta sekoitetaan keskenåån, kunnes saadaan homogeeni-nen, tilavuudeltaan haluttu voide. Voiteen konsistenssi riippuu lisåtystå vesimååråstå. Yleenså, jos CHS-trisin lopullinen pitoisuus on alle noin 200 mg/ml, on saatu for-mulaatio nestemåinen ja annettavissa suihkeena. Vaihtoeh-toisesti voidaan voide valmistaa lisååmållå vahoja tms., jotka lisååvåt formulaation viskositeettia. Jos våkevyys on noin 200 - 400 mg/ml, voidaan saatu formulaatio antaa voi-teena. Jos våkevyys on yli noin 400 mg/ml, on saatu seos puolikiinteå tai kiinteå geeli, joka voidaan antaa peråpui-kon muodossa.

Kåytto Tåmån keksinnon mukaisia CHS-tris-formulaatioita, jotka si-såltåvåt sientenvastaisia aineita, kuten mikonatsolia, ter-konatsolia tms., voidaan kåyttåå emåtininfektioiden, kuten Candidan, esimerkiksi Candida albicansin, aiheuttamien in-fektioiden hoidossa nisåkkåillå, ihminen mukaanlukien. Myos muissa kehon osissa olevia infektioita, kuten sammastautia, voidaan hoitaa tåmån keksinnon mukaisesti valmistetuilla formulaatioilla. Nåmå formulaatiot on edullista antaa emåt-timensisåisesti suihkeina, voiteina tai peråpuikkoina. Suih-keen, voiteen tai peråpuikon sisåltåmå sientenvastaisen ai-neen annos riippuu useista tekijoistå, kuten lååkkeen voi-makkuudesta, lååkkeen aiheuttamasta årsytyksestå, siitå, kuinka nopeasti normaalit emåttimen eritteet pesevåt lååkkeen pois, jne., mutta se voi olla noin 10 - 1500 mg. Esimerkiksi noin 50 mg - 1,2 g mikonatsolia tai noin 20 mg -480 mg terkanatsolia ovat kåyttokelpoisia annoksia. Tåmå lååkemåårå voidaan sisållyttåå peråpuikkoon, jonka tilavuus on yleenså noin 5 ml tai våhemmån. Yleenså on mukavuussyistå C Ί c ? i- ‘'f J 24 ja potilaan kannalta edullista kåyttåå våkevåmpåå formulaa-tiota, jonka tilavuus on vastaavasti pienempi.

Usein sellaisen emåtininfektion parantamiseen, johon kysei-nen sientenvastainen aine tehoaa, riittåå keksinnån mukaisen formulaation antaminen vain yhden kerran. Enneståån tunnet -tuja formulaatioita kåytettåesså on yleenså tarvittu 3-6 tai jopa 14 antokertaa.

CHS-tris-peptidiformulaatioita Tåmån keksinnån mukaisesti valmistettuihin formulaatioihin voidaan sisållyttåå proteiineja ja muita peptidejå, joista erityisesti hydrofobisia peptidejå, kuten kasvuhormoneja, insuliinia, low density lipoproteiineja tms., jotta ne saa-taisiin liuotetuiksi, niiden vapautumista såådellyksi tai vaikutus ohjatuksi haluttuun kohteeseen. Peptidit annetaan tavallisesti parenteraalisesti, kuten intravenoosisesti, intramuskulaarisesti tai intraperitoneaalisesti. Kåytettå-viksi sopivia kasvuhormoneja ovat mm. ihmisen kasvuhormoni, naudan kasvuhormoni ja sian kasvuhormoni. Esimerkiksi nau-dan kasvuhormoni voidaan liuottaa vesipuskuriin kåyttåmållå CHS-trisiå. CHS-trisin avulla voidaan liuottaa noin 5 - 170 mg tai enemmån, mielellåån 150 - 170 mg naudan kasvuhormo-nia per ml vesipuskuria, kun CHS-tris-måårå on mielellåån noin 5 - 300 mg, mieluummin noin 25 - 50 mg per ml vesipuskuria .

Erås menetelmå proteiinien ja muiden peptidien liuottami-seksi CH-trisiå kåyttåmållå on valmistaa monilamellisia liposomeja (MLV) vesipuskuriin. MLV-liposomit voidaan kåyttåå sellaisinaan tai sonikoinnin jålkeen SUV-muodos-sa. Peptidi suspendoidaan vesipuskurin ja liposomien seokseen, jossa se asettuu liposomikaksoiskerroksiin ja nåin siis liukenee. Vaihtoehtoisesti voidaan liuotet-tua peptidiå kåyttåå vesifaasina valmistettaessa SPLV-

II

25 s 6- lOO

liposomeja (SPLV = stable plurilamellar vesicles).

Nåin saatualiuotettua peptidia sisaltåvS formulaatiota voidaan antaa nisakkåille, ihminen mukaanlukien.

Kasvuhormoneja voidaan kayttaå maidontuotannon lisåami-seen tai kasvun lisaåmiseen tai alkuunsaattamiseen. Kun maitoa tuottaville lehmille annetaan intramuskulaarisesti kasvuhormonia maidontuotannon lisaamistarkoituksessa, tar-vitaan yleensa noin 10 mg vuorokaudessa. Jos halutaan kayttåa taman keksinnon mukaista annosmuotoa, josta vapau-tuminen tapahtuu saadellysti 30 vuorokauden kuluessa, annetaan yhtena annoksena noin 300 - 1200 mg kasvuhormonia.

Kun peptidien antomuoto on sellainen, etta vapautuminen tapahtuu saadellysti, pitaS elainlaåkårin tai laakarin maa-ritella annettavan måaran suuruus. Annosmuodon vapautumis-ominaisuudet, peptidimaåra, jonka keho pystyy kayttamaan, toksikologiset nakokohdat, tms. vaikuttavat annoksen suu-ruuden arvioinnissa.

Keksintoå valaistaan, mutta ei rajoiteta, seuraavilla esi-merkeilla.

Esimerkki: Kolesterolihemisukkinaattiliposomit, jotka : · sulkevat sisaansa vesiliukoisia yhdisteita

Seuraavissa taman esimerkin osissa selostetaan kolesteroli-hemisukkinaattirakkuloiden valmistusta, jotka sulkevat sisaansa arsenatso III:n, inuliinin tai kromin. Kapselointi-tehokkuus ja sulkutilavuus mitataan ja kolesterolirakkuloi-den epastabiilisuus kalsiumin lasnaollessa osoitetaan. Kolesterolihemisukkinaattirakkuloille suoritettua jaadytys-sybvytyselektronimikroskopiaa (freeze-etch electron microscopy) , rontgendiffraktiota ja elektronispinnianalyysia selostetaan myos.

26 η ;'"i β r y > .. 0 0 1. Kolesterolihemisukkinaatin eri suolamuotoja kåyttåmål-la valmistetut liposomit

Seuraavassa selostetaan CHS-liposomien valmistusta kaytta-mallå kolesterolihemisukkinaatin eri suolamuotoja.

Kaikissa esimerkeisså, joissa kaytetaån kolesterolihemisukkinaatin tris-suolamuotoa (kaytetaan tSsta lahtien nimi-tysta CHS-trissuola), on CHS-trissuola joko ostettu Sigma Biochemicals-firmasta, St. Louis, MO, ja kaytetty ilman puhdistusta tai syntetisoitu seuraavalla tavalla: 30 ml

Tris-emaksen 3,3 M liuosta lisattiin 1,5 litraan 67 M ko-lesterolivetysukkinaattiliuosta (ICN, Cleveland, Ohio), jotka oli tehty eetteriin. Saatu liuos haihdutettiin kier-tohaihduttimessa maraksi jaannokseksi ja sen jalkeen lyofi-lisoitiin 12 tuntia. Saatu CHS-trissuola uudelleenkitey-tettiin kolmeen kertaan etyyliasetaatista. Etyyliasetaat-tijaåmå poist.ettiin kuumentamalla 56°C:ssa vakuumissa (0,1 mm Hg).

1.1. Kolesterolihemisukkinaatin trissuolasta muodostetut monilamelliset rakkulat (MLVj CHS-trissuola (54 mg) lisattiin 1 ml:aan liuosta, jossa oli arsenatso Ill:a (lopullinen pitoisuus 4,5 mM), 0,01 M Tris-HCl (pH 7,3) ja 0,14 M NaCl. Mekaanisella raviste-lulla muodostettiin maitomainen CHS-MLV-suspensio. CHS-MLV:t pelletoitiin sentrifugoimalla 15 minuuttia nopeudella 10 000 g ja saatu pelletti pestiin kolme kertaa kåyttamalla kullakin pesukerralla 10 ml liuosta, jossa oli 0,01 M Tris-HCl (pH 7,3) ja 0,14 M NaCl. Saatu pelletti oli variltaan punainen, mika osoitti arsenatso III:n sisaansulkeutumista.

1.2. Kolesterolihemisukkinaatin 2-amino-2-metyyli-1,3-propaanidiolisuolasta muodostetut MLV:t

II

27 C ° /1 < 4

.> l-iOJ

Kolesterolihemisukkinaatin 2-amino-2-metyyli-1, 3-propaani-diolisuola (50 mg) lisattiin 1 ml:aan liuosta, jossa oli arsenatso III:a (4,5 mM, lopullinen vakevyys), 0,01 M

2-amino-2-metyyli-1,3-propaanidioli-HCl (pH 7,3), 0,07 M KC1 ja 0,07 M NaCl. CHS-MLV-suspensio muodostettiin se-osta lasihelmien kanssa pyorittelemalla. CHS-MLV:t pelletoitiin sentrifugoimalla 15 minuuttia nopeudella 10 000 x g ja saatu pelletti pestiin kolmeen kertaan koh-dassa 1.1. kuvatulla tavalla. Saatu pelletti oli variltaan punainen, mika osoitti arsenatso III:n sisaansulkeutumista.

1.3. Kolesterolihemisukkinaatin 2-aminoetanolisuolasta muodostetut MLV:t

Kolesterolihemisukkinaatin 2-aminoetanolisuola (50 mg) lisattiin 1 ml:aan liuosta, jossa oli arsenatso III:a (4,5 mM, lopullinen vakevyys), 0,01 M 2-aminoetanoli-HCl (pH 7,3), 0,07 KC1 ja 0,07 M NaCl. CHS-MLV-suspensio tehtiin lasihelmien kanssa pyorittelemalla. CHS-MLV:t pelletoitiin sentrifugoimalla 15 minuuttia nopeudella 10 000 x g ja saatu pelletti pestiin kolmeen kertaan kohdassa 1.1. kuvatulla tavalla. Saatu pelletti oli variltaan punainen, mika osoitti arsenatso III:n sisaansulkeutumista.

1.4. Kolesterolihemisukkinaatin bis-tris-propaanisuolas-ta muodostetut MLV:t

Kolesterolihemisukkinaatin bis-tris-propaanisuola (50 mg) lisattiin 1 ml:aan liuosta, jossa oli arsenatso III (4,5 mM, lopullinen vakevyys), 0,01 M bis-tris-propaani-HCl (pH 7,3), 0,07 M KJ 1 ja 0,07 M NaCl. CHS-MLV-suspensio muodostettiin pyorittelemalla seosta lasihelmien kanssa. CHS-MLV:t pelletoitiin sentrifugoimalla 15 minuuttia nopeudella 10 000 g ja saatu pelletti pestiin kohdassa 1.1. kuvatulla tavalla kolmeen kertaan. Saatu pelletti oli variltaan punainen, mika osoitti arsentaso III:n sisaan- 28 ,- n A r sulkeutumista.

1.5. Kolesterolihemisukkinaatin trietanoliamiinista muo-dostetut MLV:t

Kolesterolihemisukkinaatin trietanolisuola (50 mg) lisat-tiin 1 ml:aan liuosta, jossa oli arsenatso III:a (4,5 mM, lopullinen våkevyys), 0,01 M trietanoliamiini-HCl (pH 7,3), 0,07 M KCl ja 0,07 M NaCl. CHS-MLV-suspensio muodostettiin pyorittelemalla seosta lasihelmien kanssa. CHS-MLV:t pel-letoitiin sentrifugoimalla 15 minuuttia nopeudella 10 000 g ja saatu pelletti pestiin kohdan 1.1. mukaisesti kolmeen kertaan. Saatu pelletti oli våriltaan punainen, mika osoitti arsenatso III:n sisaansulkeutumista.

1.6. Kolesterolihemisukkinaatin mikonatsolisuolasta muo-dostetut MLV:t

Mikonatsolin vapaa emas muodostettiin seuraavalla tavalla: NaOH:n vesiliuos titrattiin mikonatsolinitraatin eetteri-suspensioon. Eetterifaasi otettiin talteen ja eetteri haihdutettiin niin, etta jaljelle jai mikonatsolin vapaa emas oljyna. Saatu 51jy lisattiin kolesterolivetysukki-naattia sisaltavaån etanoliin. Kun etanoli haihdutettiin, jai jaljelle kolesterolihemisukkinaatin mikonatsolisuola kalvon muodossa. Sitten kalvoon lisattiin natriumkloridi-liuosta. Kun suoritettiin perusteellinen sekoittaminen pyo-rittamalla, voitiin liuoksessa havaita muodostuneita rak-kuloita.

1.7. Sonikaatiolla muodostetut kolesterolihemisukkinaatin pienet yksilamelliset rakkulat (SUV) CHS-MLV:t valmistettiin kohtien 1.1., 1.2., 1.3., 1.4 ja 1.5. mukaisesti, mutta arsenatso III jåtettiin pois. Ku-kin lopullinen rakkulapelletti suspendoitiin 2 ml:aan sa-

II

92463 29 maa puskuria, jossa se oli valmistettu,; ja sonikoitiin kylpysonikaattorissa niin pitkaån, ettå maitomainen sus-pensio muuttui kirkkaaksi, mika merkitsi CHS-MLV-tyypin muuttumista CHS-SUV-tyypiksi.

1.8. Ekstruusiotekniikalla valmistetut kolesterolihemi-sukkinaatti-SUV:t CHS dispergoitiin pitoisuuteen 100 mg/ml liuokseen, jossa oli 10 mM HEPES ja 150 mM NaCl (pH 7,5). Saatu dispersio puristettiin 10 kertaa 30 nm Nucleopore polykarbonaatti-suodattimen lapi, jolloin tuloksena oli CHS-SUV-suspensio.

1.9. Mikonatsoli-CHS-trisvoide

Kolesterolihemisukkinaatin tris(hydroksimetyyli)aminome-taanisuola ("CHS-tris") (20,64 g), jota on saatavissa Sigma Chemical Co:sta, St. Louis, Missouri, liuotettiin 206 mlraan kiehuvaa etanolia. Kun etanoli-CHS-tris-liuos oli kirkas, lammitys poistettiin ja seos, jossa oli 5,16 g mikonatsoliemastå 103 ml:ssa etanolia, lisattiin varo-vaisesti sekoittaen. Saatu kirkas liuos kaadettiin suureen, matalaan astiaan (243 x 243 x 18 mm) ja sonikoitiin hetken ajan suuressa kylpysonikaattorissa, jotta geelinmuodostus alkoi. Sitten astia peitettiin tiiviisti ja annettiin geeliytya taydellisesti 25°C:ssa 4 tunnin aikana. Peite poistettiin ja etanolin annettiin haihtua. Sen jalkeen kuiva geeli leikattiin osiin, sijoitettiin sekoittimeen hiilidioksidijaan kanssa ja jauhettiin hienoksi, rakei-seksi jauheeksi. Saatuun jauheeseen sekoitettiin sterii-lia, tislattua vetta, kunnes saatiin homogeeninen voi-de, jonka lopullinen tilavuus oli 51,6 ml ja mikonatsoli-pitoisuus 100 mg/ml.

Kun toimenpide toistettiin kayttamalla 10,32 g mikonatso-lia, saatiin void e, jonka mikonatsolipitoisuus oli 200 mg/ml.

_ c o A < 7λ

30 /L-OJ

Lisaå mikonatsoli-CHS-trisformulaatioita valmistettiin edellakuvatulla tavalla kåyttåmållå seuraavia ainesuh-teita:

Mikonatsoli (mg) CHS-tris (mg) Vesi (mg) 50 100 850 100 200 700 100 400 400 200 400 500 1.10. Terkonatsoli-CHS-trisvoide CHS-tris (2,0 g) liuotettiin 20 ml:aan kiehuvaa etanolia.

Kun etanoli-CHS-trisliuos oli kirkas, lammitys poistet-tiin ja lisattiin varovaisesti sekoittaen 1,9 g terkon-atsolia (50 ml:ssa etanolia) ja 83 mg L(+)-maitohappoa (2 ml:ssa etanolia). Kirkas liuos kaadettiin suureen dekantterilasiin ja sonikoitiin, kunnes "geelinmuodostus" alkoi. Dekantterilasi peitettiin tiiviisti ja geeliyty-misen annettiin tapahtua taydellisesti huoneenlampotilas-sa 4 tunnin kuluessa. Peite poistettiin ja etanolin annettiin haihtua ilmassa 25°C:ssa. Kuiva geeli leikattiin osiin ja sijoitettiin sekoittimeen hiilidioksidijaan kans-sa ja jauhettiin hienoksi, rakeiseksi jauheeksi. Tahan jauheeseen sekoitettiin 10 ml vetta, jossa oli 6,3 g sonikoituja CHS-trisrakkuloita. Saatuun suspensioon sekoitettiin tislattua, steriilia vetta niin, etta saa-tiin homogeeninen voide, jonka lopullinen tilavuus oli 20,8 ml, ja joka sisalsi terkonatsolia 48 mg voidemilli-litraa kohti.

1.11. Mikonatsoli-CHS-trisperapuikko CHS-tris (400 mg) liuotettiin 4 ml:aan kiehuvaa etanolia. Mukaan sekoitettiin 100 mg mikonatsoliemasta 1 mlrssa

II

31 C / s’ S t-ko Ό etanolia ja 1,2 g kasvurasvoista johdettua ko- vaa maitohappotriglyseridia sulana (Wecobee M, PVO Internation, Bontoon, New Jersey). Saatu kirkas liuos jaettiin 1,5;ml:n polypropyleenimikrofuugiputkiin, soni-koitiin lyhyesti (noin 60 sekuntia) niin, etta CHS-tris "geeliytyi" ja jatettiin huoneenlåmpotilaan 4 tunniksi kiinteytymåan tåysin. Polypropyleenimuotti poistettiin ja puolikiinteat geelit sijoitettiin vakuumieksikaattoriin yon ajaksi, jotta etanolijaannos poistui.

Seuraavassa on lueteltu muita CHS-trisperåpuikkoformulaa-tioita, jotka on valmistettu edellåkuvatulla tavalla.

Mikonatsoli CHS-tris Weoobee M Maito- liunan (mg) (mg) (mg) happo fosfokoliini (mg) (mg) 3.4 6,8 80,3 3.4 13,6 20,5 6.9 13,8 80,3 6.9 27,6 44,0 10,3 20,6 80,3 20,0 41,0 12,0 20.6 41,2 : 20,6 41,2 2,2 10,3 20.6 41,2 79,4 1.12. In vivo-aktiivisuus emattimen Candida-infektioi-den hoidossa

Rotille, joilta oli poistettu munasarjat (Charles River Breeding Laboratories), annettiin viikottain beeta-estra-diolivaleraattia, jotta saatiin indusoiduksi jatkuva kiimatila (ja taipumus saada emattimeen Candica-infektio). Rottiin siirrostettiin emattimen sisaan 5 x 10° CFU:ta Candida albicansia. Tartutetuille rotille annettiin emattimensisaisesti 2 %:sta (paino/tilavuus) mikonatsoli- 32

·*> ϊ S

yη ο ο nitraattivoidetta kahdesti vuorokaudessa kolmen vuoro-kauden ajan alkaen kolmannesta tartutuksenjalkeisestå vuorokaudesta, 12 %:sta mikonatsolinitraattivoidetta kerran kolmantena tartutuksenjalkeisena. vuorokautena tai kerran yksi taman keksinnon mukainen CHS-tris-peråpuikko tai taman keksinnon mukaista voidevalmistet-ta kolmantena tartutuksenjalkeisena vuorokautena. Joil-lekin rotille ei annettu lainkaan hoitoa. Kuudentena tai kymmenentena tartutuksenjalkeisena vuorokautena rottien emattimet tutkittiin ottamalla Candica albicans-naytteet. Ne rotat, joilla oli alle 25 CFU/vanutuppo-nåyte, katsottiin parantuneiksi.

2. Inuliinin sulkeminen kolesterolihemisukkinaatti-MLV-valmisteen sisaan

Monilamellisia kolesterolihemisukkinaattirakkuloita (CHS- 3 MLV), joiden sisaan oli suljettuna H-inuliinia, valmis- 3 tettiin seuraavalla tavalla: H-inuliini (1,0 mCi/ml,

New England Nuclear, Boston, MA) liuotettiin 2 ml:aan liuosta, jossa oli 0,01 M Tris-HCl (pH 7,3) ja 0,14 M NaCl. Sitten liuokseen lisattiin 40 mg CHS-trissuolaa ja saatu seos dispergoitiin mekaanisesti ravistelemalla. Muodostunut maitomainen suspensio oli merkki siita, ettå syntyi monilamellisia rakkuloita. Suspension annettiin seisoa hairitsematta 2 tuntia, jonka jalkeen se laimen-nettiin 10 ml:n kokonaistilavuuteen liuoksella, jossa oli 0,01 M Tris-HCl (pH 7,3) ja 0,14 M NaCl. 10 yl:n eran radioaktiivisuudeksi saatiin 24 625 cpm/10 yl, kun era lisattiin 10 ml:aan tuikelaskentanestetta (40 g Omnifluor (New England Nuclear, Boston, MA), 6 1 tolueenia ja 4 1 etyleeniglykolimonoetyylieetteria) ja mitattiin radioak-tiivisuus kayttamalla Beckmann L6800 nestetuikelaskuria, jonka ikkunat oli saadetty kohtaan 0,400. Radioaktiivi-suussykaykset per minuutti (cpm) muunnettiin hajoamisiin per minuutti (dpm) kayttamalla sammutuskorjauksen H#-

II

33 924 63 menetelmaa (H# method of quench correction) (Horrock, D.L. The Number Concept, Beckamn Instruments, 1977). Sitten CHS-MLV:t pelletoitiin sntrifugoimalla 15 minuuttia nopeu-della 10 000 x g. Saatu pelletti pestiin kolmeen kertaan suspendoimalla se kullakin pesukerralla 10 ml:aan liuo-ta, jossa oli 0,01 M Tris-HCl (pH 7,3) ja 0,14 M NaCl, ja uudelleenpelletoimalla 15 minuuttia nopeudella 10 000 x g. Pesty rakkulapelletti uudelleensuspensoidiin liuok-seen, jossa oli 0,01 M Tris-HCl (pH 7,3) ja 0,14 M NaCl, lopulliseen tilavuuteen 10 ml ja 10 ul:n eran radioaktii-visuudeksi saatiin 3 442 cpm/10 μΐ. Nain olien kaikkiaan 3 noin 14 % alkuperaisesti H-inuliinimSarasta oli joutu-nut CHS-MLV:n sisaan.

2.1. Inuliinin kapseloitumistehokkuus kolesterolihemisuk-kinaatti-MLV-tyyppiin ja munan fosfatidyylikoliini-MLV-tyyppiin

Inuliinin kapseloitumistehokkuutta monilamellisiin rakku-loihin (MLV), jotka oli valmistettu kSyttamallå erilai-sia kolesterolihemisukkinaattipitoisuuksia, ja inuliinin kapseloitumistehokkuutta monilamellisiin rakkuloihin (MLV), jotka oli valmistettu kayttamållå erilaisia munan fosfa-tidyylikoliinin pitoisuuksia, verrattiin toisiinsa. (Huom: : Minka tahansa liposomin kapselointitehokkuus maaritellaan kaksoiskerrosten sisaansa sulkeman vesiosaston osuutena ja ilmoitetaan prosentteina, ks. kaannoksen s. 2).

Munan fosfatidyylikoliinista (EPC) tai CHS-trissuolasta valmistetut mon ilamelliset rakkulat valmistettiin samalla tavalla, jotta niiden kapselointitehokkuuksia voitiin verrata keskenåån. Nåin olien liuos, jossa oli CHS-tris-suolaa 40, 80, 160, 320 tai 400 mg 2,0 mlrssa puskuria, jossa oli 0,01 M Tris-HCl (pH 7,3), 0,14 M NaCl ja 5 μΐ 3 H-inuliinia (217,0 mCi/mg), sekoitettiin pyorittelemalla ja sen jålkeen annettiin seisoa 2 tuntia, jolloin saatiin 3 34 C O A C'7 ' <- ·> C o CHS-MLV-suspensio, ]Ossa H-inuliini oli sisåånsulkeutu-neena yhdisteena. Suspensioon lisattiin viela 3 ml pusku-ria, jossa oli 0,01 M Tris-HCl (pH 7,3) ja 0,14 M NaCl, ja saatu suspensio jatettiin huoneenlåmpotilaan yon ajaksi. Sitten lisattiin noin 3,0 ml puskuria, jossa oli 0,01 M Tris-HCl (pH 7,3) ja 0,14 M NaCl, jotta kokonaistilavuu-deksi tuli 10 ml.

Munan fosfatidyylikoliinista valmistetut monilamelliset rakkulat (EPC-MLV) (Avanti, Birmingham, AL) valmistettiin seuraavalla tavalla: 40, 80, 160, 320 tai 400 mg/ml EPC: ta suspendoitiin sellaiseen maaraan kloroformia, joka riitti liuottimaan fosfolipidin tåysin. Kloroformi haih-dutettiin kuiviin niin, etta koeputken pohjaan jai vaha-mainen jåannos. Sen jalkeen lisattiin 2,0 ml liuosta, jossa oli 0,01 M Tris-HCl (pH 7,3), 0,14 M NaCl ja 5 yl 3 H-inuliinia (217,0 mCi/mg), ja saadun seoksen annettiin "turvota" ja saadut EPC-MLV:t dispergoitiin sekoittamalla voimakkaasti pyorittåen. Saatuun suspensioon lisattiin viela 3 ml puskuria, jossa oli 0,01 M Tris-HCl (pH 7,3) ja 0,14 M NaCl, ja sen jalkeen jatettiin huoneenlåmpotilaan yon ajaksi. Sitten seoksen tilavuudeksi saadettiin 10 ml lisaamalla puskuria, jossa oli 0,01 M Tris-HCl (pH 7,3) ja 0,14 M NaCl.

CHS-MLV-tyypin ja EPC-MLV-tyypin kapselointitehokkuus maå-ritettiin seuraavalla tavalla: 20 yl:sta kutakin alkupe- raista aineseosta maaritettiin radioaktiivisuus tuikelas-kennalla edellakuvatulla tavalla. Liposomienmuodostuksen jalkeen liposomit pelletoitiin sentrifugoimalla suspensi-ota 10-20 minuuttia nopeudella 10 000 x g ja jokainen pelletti pestiin neljaan kertaan kayttamalla kullakin pesu-kerralla 10 ml liuosta, jossa oli 0,01 M Tris-HCl (pH 7,3) ja 0,14 M NaCl, ja uudelleensuspendoitiin lopulliseen ti-lavuuteen 10 ml puskuriin, jossa oli 0,01 M Tris-HCl (pH 7,3) ja 0,14 M NaCl. Naistå lopullisista naytteista otet-

II

C ·>1 r ? 35 tiin 20 yl:n erat, joista mååritettiin radioaktiivisuus.

Se osuus alkuperaisestå radioaktiivisuudesta, joka loy-tyi lopullisesta naytteestå, edusti lipidirakkuloihin , 3 suljettua H-inuliinia.

Taulukosta I voidaan havaita, etta kapselointitehokkuuden kasvu on verrannollinen CHS-pitoisuuden kasvuun, mutta, mika tarkeampaa, CHS-MLV:t, jotka on valmistettu kaytta-målla 20 - 200 mg/ml CHS:åå, ovat kapselointitehokkuudel-taan parempia inuliinille kuin EPC-MLV:t, jotka on valmis-tettu vastaavaa fosfolipidipitoisuutta kayttåmalla.

Taulukko I

Fosfolipidirakkuloiden ja kolesterolihemisukkinaattirakkuloiden kapselointitehokkuuden vertailu inuliinin kapseloinnissa_

Lipidipitoisuus Sulkeutuneen 3H-inuliinin (mg/ml) osuus (%) ,

_ EPC-MLv CHS-ML\T

20 2 10 40 4 14 80 5 29 160 8 38 200 11 60 a Monilamelliset munan fosfatidyylikoliinirakkulat b Monilamelliset kolesterolihemisykkinaattirakkulat

Jotta saataisiin osoitetuksi, vaikuttaako CHS-MLV-tyypin kapselointitehokkuuteen aika, jonka CHS on kosketuksessa 3 vapaan H-inuliinin kanssa vesipuskurissa, CHS-MLV:t valmistettiin seuraavalla tavalla: Joko 80 tai 300 mg CHS- trissuolaa sekoitettiin pyorittelemalla 20 ml:aan puskuria, jossa oli 0,01 M Tris-HCl, 0,14 M NaCl ja 10 yl 3H-inulii-nia (217 mCi/mg, ominaisradioaktiivisuus), jolloin saatiin pitoisuuksia 40 ja 150 mg CHS/ml vastaava CHS-MLV-tyyppi.

36

C O / < V

s — *1 o o

Kustakin kahdesta lipidipitoisuudesta valmistettiin viisi naytetta ja CHS-MLV-suspensioiden annettiin seisoa huoneen-

lampotilassa 2,0 ral:ssa puskuria, joka sisalsi 0,01 M

Tris-HCl (pH 7,3) ja 0,14 M NaCl. Aikavalein 0, 15, 30, 60 ja 120 minuuttia naytteiden tilavuudet såadettiin 10 ml: ksi samalla puskurilla. Kustakin naytteesta otettiin aluksi 10 pl:n era tuikelaskentaa vårten edellakuvatulla tavalla. Sitten naytteita sentrifugoitiin 10 minuuttia 10 000 x g nopeudella ja kukin pelletti pestiin neljaan kertaan 10 ml:11a puskuria. Lopullinen pelletti suspen- doitiin 10 ml:n lopulliseen tilavuuteen ja jokaisesta lo- pullisesta naytteesta otettiin 10 Pl:n era, jonka radioak- tiivisuutta verrattiin kunkin ajankohdan alkunaytteen ra- dioaktiivisuuteen. Tulokset eivat osoittaneet mitaån merkitsevaå kapselointitehokkuuden eroa kummankaan pitoi- suuden eika eri kontaktiaikojen valilla. Tama osoittaa sen, etta noin 12 - 20 % seokseen alun perin lisatysta 3 H-inuliinista sulkeutui rakkuloiden sisaan kontaktiajas-ta riippumatta, kun CHS-pitoisuus oli 40 tai 150 mg/ml.

Tama merkitsee, etta CHS-MLV-tyypin valmistuksessa ei tarvita "turpoamisaikaa", mita sita vastoin tarvitaan munan fosfatidyylikoliini-MLV-tyyppia valmistettaessa.

3. Inuliinin sulkeminen kolesterolihemisukkinaatti-SUV-tyyppiin

Pienet yksilamelliset kolesterolihemisukkinaattirakkulat 3 (CHS-SUV), joissa oli H-inuliini sisaansuljettuna ainee-na, valmistettiin seuraavalla tavalla. 100 yl 3H-inulii-nia (1,0 mCi/ml; New England Nuclear, Boston, MA) liuo-tettiin 2,5 ml:aan puskuria, jossa oli 0,01 M Tris-HCl (pH 7,3) ja 0,14 M NaCl, ja saatuun liuokseen lisattiin joko 100 tai 200 mg CHS-tris-suolaa. Sen jalkeen seosta py5ri-tettiin lasihelmien kanssa, minkå jalkeen se imettiin hel-mistå erilleen pipetilia ja sonikoitiin kirkkaaksi noin 2 tunnissa. Suspension kirkastuminen merkitsee sita, etta

II

CHS-MLV:t muuttuvat pieniksi yksilamellisiksi rakkuloiksi.

CHS:n lopulliset pitoisuudet CHS-SUV-suspensioissa oli- vat 40 mg/ml ja 80 mg/ml vastaavasti.

O o &

s O O

37

Jotta saataisiin osoitetuksi inuliinin sisåånsulkeutuminen (ks. edellå), CHS-SUV:t erotettiin sisåånsulkeutumattomas-ta inuliinista geelisuodatuksella seuraavalla tavalla: Ku- kin liposomisuspensio sijoitettiin erikseen Bio-Gel A-15m, 100-200 mesh:in agaroosipylvaaseen (Bio-Rad Laboratories, Richmond, CA), jonka toiminta-alue oli 40 000 - 15 000 000 daltonia (molekyylipaino), ja joka oli tasapainotettu ja kaliboitu puskurilla, jossa oli 0,01 M Tris-HCl (pH 7,3) ja 0,14 M NaCl. Sitten pylvåasta eluoituvat 1 ml:n jakeet otettiin talteen ja kustakin jakeesta otettiin 10 Ul:n era, jonka radioaktiivisuus mitattiin edellakuvatulla tavalla. Sisaansulkeutuneen ja vapaan inuliinin valille saatiin tarkka erottuminen geelisuodatuksella, mika osoit-taa inuliinin sulkeutumista pienten yksilamellisten CHS-rakkuloiden sisaan. Tama analyysi osoitti, etta noin 1 % inuliinista oli sulkeutunut pienten yksilamellisten CHS-rakkuloiden (CHS-SUV) sisaan.

4. Kromin sulkeutuminen kolesterolihemisukkinaatti-MLV-tyypin sisaan

Monilamelliset kolesterolihemisukkinaattirakkulat, joissa 51 oli kromi sisaånsuljettuna aineena, valmistettiin seuraavalla tavalla. 15,0, 40,0, 65,8, 100,0, 175,0, 263,2, 526,4 tai 658,0 ymol CHS-trissuolaa lisattiin 5 ml:aan puskuria, jossa oli 0,01 M Tris-HCl, 0,14 M NaCl (pH 7,3) ja hiven 51 kromia (New England Nuclear, Bsoton, MA), ja saadun seoksen annettiin seisoa huoneenlampotilassa 2tuntia, jolloin 51 syntyi CHS-MLV-suspensio, jossa oli kromi sisaånsuljettuna .

C · 1 /1 ^ 38 /ί.";ΰΟ 4.1. Kromin kapseloitumistehokkuus kolesterolihemisuk-kinaatti-MLV-tyyppiin

Jotta saataisiin måaritetyksi kohdassa 4 valmistettujen monilamellisten CHS-rakkuloiden (CHS-MLV) kapselointite-hokkuus, pipetoitiin kutakin valmistetta omaan dialyysi-pussiinsa (Thomas Scientific, luettelon no. 3787-D22, mokelyylipainon leikkauskohta 12 000 daltonin kohdalla), jotka oli sitå ennen keitetty tislatussa vedessa kolmeen tertaan. Dialyysipussien sisåltamMt nåytteet mitattiin aluksi gammalaskimella (TmAnalytic, malli no. 1191). Sit-ten naytteita dialysoitiin 20 tuntia samaa puskuria (0,01 M Tris-HCl, 0,14 M NaCl pH 7,3) vasten retentaatti:dialy-saatisuhteen ollessa yli 1:150 vastaavasti, ja dialysaatti vaihdettiin kahden tunnin valein ensimmaisten 6 tunnin ai-kana. Kapselointitehokkuus maaritettiin laskemalla pussien sisaån pidåttyneen materiaalin sykaysten osuus alkuperai-sesta sykaysmaarasta prosentteina.

Taulukossa II esitetyista tuloksista voidaan havaita, ettå kapselointitehokkuus kasvaa CHS-pitoisuuden kasvaessa.

Taulukko II

Kromin kapseloitumistehokkuus kolesterolihemisukkinaatti-rakkuloihin CHS-pitoisuus (^umoolia) Sisaansulkeutunut ____ ^ ^kromi (%)_ 15.0 14,79 40.0 15,20 65,8 15,09 100,0 16,10 165.0 20,13 263,2 27,90 526,4 40,74 658.0 48,03 ii c '» /. .<';

39 Si— . o J

4.2. Monilamellisten kolesterolihemisukkinaattirakkuloi-den (CHS-MLV) sulkutilavuus: kromin sisåånsulkeutuminen ja kolesterolihemisukkinaattipitoisuus

Kohdassa 4.1. valmistettujen CHS-rakkuloiden sulkutilavuus mååritettiin jokaiselle kolesterolihemisukkinaattipitoi-suudelle laskemalla sisaan suljettu liuotetun aineen maa-ra seuraavasta yhtalosta:

kapselointitehokkuus-% x alkuperainen veden tilavuus ymol CHS

Kuvasta 1 voidaan havaita, etta vahemman kromia lipidimoo-lia kohti sulkeutuu sisaan, kun CHS-trissuolapitoisuus kasvaa. Nain olien, vaikka kapselointitehokkuus kasvaa lipidipitoisuuden kasvaessa, sisåansuljettu liuoteraååra laskee lipidipitoisuuden kasvaessa. Kussakin kohdassa suoritettujen kokeiden maara on ilmoitettu vieressa suluis-sa.

5. Kolesterolihemisukkinaattiliposomien ultrarakenne

Jaådytyssydvytyselektronikiroskopiaa (jaadytyssyovytysme-netelmaa on selostettu julkaisussa Pfeffinger et al., J.

Cell Biol. 6j> (1975), 15-28) vårten valmistettiin CHS-MLV-naytteet ja CHS-SUV-naytteet kohdassa 1. kuvatulla ta-valla paitsi, etta inuliini jatettiin pois.

Jaådytyssyovytetyn CHS-MLV-valmisteen elektronimikroskoop-pinen tarkastelu osoitti erillisia yksikoita, jotka rajoit-tuivat vahintaan yhteen lamelliin, eli liposomeja tai lipidirakkuloita. Monilamellisten CHS-rakkuloiden (MLV-CHS) koko vaihteli suuresti, vaihtelualueen ollessa 800 -10 000 nm (halkaisija).

Suuremmat rakkulat voitiin luokitella useisiin luokkiin, o '"i fis-? 40 joista mainittakoon mm. ne, joissa oli yksi tai muutama ulompi lamelli, ja ne, joissa oli monta lamellia. Useim-missa suurimmista rakkuloista oli sisallå huomattavia alueita, jotka nåyttivåt rakeisilta, mikå mahdollisesti johtui vesikammioista. Usein voitiin havaita suurempien rakkuloiden sisållå pieniå rakkuloita tai pienten rakku-loiden ryhmiå, jotka joskus olivat neljån tai viiden ker-roksen syvyydesså. Tåmå ilmeinen "pesånmuodostus" havai-taan yleisesti tavallisissa liposomeissa, jotka on valmis-tettu negatiivisesti varatusta fosfolipidistå.

Silloin tålloin voitiin nåhdå låheisesti vierekkåin sijait-sevien lamellien muodostamia vyohykkeitå. Nåmå vaikutti-vat kaikissa suhteissa samanlaisilta kuin tavallisten monilamellisten fosfolipidirakkuloiden lamellit.

Tutkitut sonikoidut nåytteet sisålsivåt myos monia pieniå pallosia, joiden halkaisija oli vålillå 50 - 500 nm. Nåmå rakkulat ovat luultavasti samanlaisia kuin monilamellisis-ta fosfolipidirakkuloista tehdyt pienet yksilamelliset rakkulat. Koska pienemmåt CHS-rakkulat eivåt lohjenneet, oli mahdotonta erottaa niiden sisåosien tai lamellikomponent-tien rakenne.

30 nm:n suotimen låpi puristettujen (10 kertaa) CHS-rakku-loiden halkaisija oli noin 65 nm. Sitåvastoin ranska-laisella puristimella valmistetut CHS-rakkulat olivat erit-tåin pieniå (keskimååråinen halkaisija 25 nm tai pienempi).

6. Kolesterolihemisukkinaattiliposomien rontgendiffraktio-: analyysi

Erilaisten CHS-MLV-liposomivalmisteiden rontgendiffraktio-analyysi suoritettiin kåyttåmallå 2-ulotteista rongenså-teenilmaisinta, jossa oli kuvanvahvistin, ja jota on se-lostettu muualla (Gruner, S.M., 1977, Våitoskirja, Prince-

II

41 C r'; S Z'

S S- C/ O

ton University, Princeton NJ 09540 USA; Reynolds, Geo T., Milch, J.R. ja Gruner, S.M., Rev. Sci. Instr. 49 (1978), 1241-1249; Tilcock, C.P.T., Bally, M.B., Farren, S.B., Cullis, P.R. ja Gruner, S.M., Biochem. 23 (1984), 2696 -2703). Rontgensåteiden toistovålimatkat ovat - 0,5 Å. CHS-dispersioita pidettiin 1,5 mm:n lasisissa rontgenka-pillaareissa, jotka oli suljettu epoksitulpilla. Nåyt-teet hydratoitiin joko varovasti tai sekoittaen voimak-kaasti. Varovaista hydratointia vårten puskuri lisattiin ruiskulla kerrokseksi kuivan CHS:n paalle, joka oli rongen-sadekapillaasin pohjassa. Sen jalkeen kapillaaria sentri-fugoitiin hetki poydalla olevalla sentrifugilla, jotta lipidi-vesipastasta saatiin poistetuiksi vesikuplat. Sit-ten kapillaarit suljettiin tiiviisti ja annettiin tasapai-nottua våhintåån 4 tuntia 5°C:ssa. Voimakas hydratointi suoritettiin pyorittamålla kuivaa CHS:aa puskurin ja kah-den lasihelmen kanssa koeputkessa. Osa saadusta seok-sesta siirrettiin sen jalkeen rontgensadekapillaariin.

Rontgendiffraktio osoitti, etta hydratoitu CHS muodostaa monilamellisia rakenteita. Kuvista 2a ja 2b ilmenee pieni-kulmainen diffraktio, joka aiheutui varovaisesti hydra-toiduista nåytteistå, joissa oli vastaavasti 68,9 paino-% ja 59,1 paino-% CHS:aa. Havaittavissa on korkeintaan nelja tasavalista diffraktiokertalukua, jotka koostuivat toistuvista monilamellisista ryhmitelraista, joiden koot olivat 68,1 Å ja 79,8 Å vastaavasti. Kertaluvut olivat teravia ja hyvin erottuneita, mika osoittaa, etta hilois-sa oli hyvin vahån epajarjestysta. Nama vakevat CHS-nayt-teet olivat ulkonaoltaan tasaisen pastamaisia eika niissa nakynyt ylimaaraista puskuria, mika piti yhta sen seikan kanssa, etta toistovålimatkat kasvoivat vesipitoisuuden kasvaessa. Hyvin korkeissa vesipitoisuuksissa oli varovaisesti hydratoiduissa CHS-nåytteisså selvåsti nåkyvå ylimååråisen puskuriliuoksen lammikko hydratoituneen lipi-din påållå. Tållaisen nåytteen (20,2 % CHS kokonaispai- 42 C '"> A C λ ✓ .·_ Η' ϋ Ο nosta) on esitetty kuvassa 2c. Suuremman kulman diffrak-tiohuippujen leveneminen osoittaa huomattavaa hilojen epa-jarjestysta. Hilan epajarjestys teki mahdottomaksi tar-kan hilamaarityksen, mutta, jos tehtiin lamellien sovitus, kuten kuvasta 2c ilmenee, toisto oli noin 86 Å, mika viit-taa siihen, ettå lipidikaksoiskerrosten valeissa oli suu-ria vesitiloja.

Jos varovaisen hydratoinnin sijasta valmistettiin nayte, jossa oli 20,7 paino-% CHS:aa, sekoittamalla kuivaa lipi-dia puskurin kanssa pyorittaen, saatiin aikaan tasalaatui-nen maitomainen ulkonakd. Kuvasta 2d ilmenee, etta tal-loin syntyi levea sirontavyohyke, joka osoitta vahån merk-keja teravarajaisesta hilasta. Vastaavanlainen diffrak-tiokayttaytyminen on odotettavissa monilamelliselle sys-teemille, jonka lamellienvalisten vesikerrosten paksuu-det vaihtelevat suuresti. Laimeiden CHS-dispersioiden rontgendiffraktio selittyy johdonmukaisimmin sillå, ettå aiheuttajana on monilamellinen systeemi, jossa lamellien-våliset voimat ovat heikkoja. Muiden lipidisysteemien, kuten laimeiden munan fosfatidyylikoliinidispersioiden, rontgendiffraktiokaavio viittaa siihen, ettå niisså on teråvåreunainen lamellihila, joka on painon perusteella suurimmaksi osaksi lipidiå (Rand, Annu. Rev. Biophys.

Bioneng., 10 (1981), 277-314). Tåmå selvarajainen hila-toisto johtuu hilapotentiaalin suhteellisen teråvåstå mi-nimistå lipidikerrosten vålimatkan funktiona. Jos poten-tiaali-vålimatkakåyråsså on vain matala kuoppa, ovat lamellien våliset voimat oletettavasti heikkoja ja hilassa esiintyy huomattavaa epåjårjestystå. Kuvan 2d nåytteellå on noin 86 Å:n toisto verrattuna kuvan 2a 68,1 Å:n toistoon. Tåmå osoittaa, ettå puskuriylimåårån låsnåollessa on CHS-liposomeilla suuri vesi-lipidisuhde. Myos muille vara-tuista lipideista muodostetuille systeemeille on saatu vas-taavanlaisia tuloksia (Rand, 1981, supra).

II

7. Kolesterolihemisukkinaattiliposomien elektronispinr.i- resonanssianalyysi 43 C O β r 7 y “i o o

Munan fosfatidyylikoliinista (EPC) valmistetut monilamel-liset liposomit (Avanti Polar Lipids, Birmingham, AL) spin-leimattiin ja niita verrattiin vastaavasti leimattuihin monilamellisiin CHS “trissuolarakkuloihin (CHS-MLV), jot-ka valmistettiin oleellisesti ottaen samoin kuin edella on selostettu. EPC MLV-tyypin tapauksessa lisattiin 1 mooli-% joko 5-, 7-, 9-, 10-, 12- tai 16-doksyylistearaat-tia (Molecular Probes, Juntion City, OR) 40 mg:aan lipi-dia kloroformissa ja saatu liuos kuivattiin ohueksi ker-rokseksi kiertohaihduttimessa. Sitten tama kalvo hydra-toitiin lisaåmalla 2 ml Tris-HCl-puskuria ja pyorittele-malla, kunnes kalvo oli kokonaan suspendoitunut. Nain saatu EPC-MLV-valmiste pestiin kahdesti ennen spektroskoop-pista analyysia.

CHS-MLV:n tapauksessa 1 mooli-% tarvittavan spinnileiman etanoliliuosta kuivattiin ohueksi kalvoksi koeputken reu-nassa ja sen jalkeen kalvoon lisattiin 40 mg CHS-tris-suolajauhetta ja 2 ml Tris-HCl-puskuria. Saatua suspen-siota sekoitettiin pyoritellen ja saadut liposomit pestiin kahdesti. Kaikki elektronispinniresonanssikokeet suoritettiin IBM Instruments ER100D ESR-spektrometrilla.

JSrj-estysparametri (S) laskettiin muualla kuvatulla ta-valla (Griffith ja Jist teoksessa Spin Labelling, Berliner, L.J. (toim,), Academic Press, N.Y. 1976). Kuvassa 3 on esitetty CHS-MLV:n ja EPC-MLV:n jarjestysparametripro-fiilit, kun valmisteet on spinnileimattu joko 5-, 6-, 7-, 9-, 10-, 12- tai 16-doksyylistearaatilla. EPC-kak-soiskerroksilla jarjestysparametri laskee kaksoiskerrok-sen hiililuvun kasvaessa, kuten ennestaan tiedetaån. CHS:n supramolekylaarinen rakenne on merkittavasti erilainen, silla kaksoiskerros on huomattavasti jaykempi kuin EPC-kaksoiskerros, mutta CHS-systeemit osoittavat jarjestyk- 44 sen kohoamista viidennestakymmenennesta hiilesta yhdek-sånteenkymmenenteen hiileen, mikS merkitsee taysin aiem-mista tiedoista poikkeavaa kaksoiskerrosten fysikaalista ja kemiallista rakennetta.

8. Kolesteroliheraisukkinaattiliposomien isotooninen tur-poaminen

Seuraavassa koesarjassa verrattiin toisiinsa monilamellis-ten kolesterolihemisukkinaattirakkuloiden ja monilamellis-ten fosfolipidirakkuloiden isotoonista turpoamiskayttayty-mista.

(1) CHS-MLV:t valmistetiin kohdassa 1. kuvatulla tavalla kayttamalla 40 mg CHS-trissuolaa 2,0 ml:ssa puskuria, jos-sa oli 0,01 M Tris-HCl ja 0,1 M KCl.

(2) EPC-MLV:t valmistettiin kohdassa 2.1. kuvatulla tavalla kayttamalla 51,8 mg EPC:ta 2,0 mlssa puskuria, jossa oli 0,01 M Tris-HCl ja 0,1 M KCl.

(3) Monilamelliset rakkulat, joiden lipidikaksoiskerros sisalsi EPC:ta ja munan fosfatidihappoa (EPA', valmistettiin kohdassa 2.1. kuvatulla monilamellisten EPC-rakkuloi-den (EPC-MLV) valmistusmenetelmalla kayttamalla 41,1 mg EPCrta ja 9,79 mg EPA:ta 2,0 ml:ssa puskuria, jossa oli 0,01 M Tris-HCl ja 0,1 M KCl. Nåin syntyneisså monilamel-lisissa rakkuloissa (EPC:EPA-MLV) oli EPC:EPA-moolisuhde 8:2 vastaavasti.

Pyorittamalla tapahtuneen sekoittamisen jålkeen annettiin kunkin MLV-suspension (so., CHS-MLV, EPC-MLV ja EPCtEPA-MLV) seisoa huoneenlampotilassa 2 tuntia valmistuspusku-rissa. 20 yl:n era kutakin liposomivalmistetta li- sattiin 1,0 mlraan puskureita, jotka muodostivat sarjan, jossa oli 0,01 M Tris-HCl ja 0,055 - 0,5 M KCl. Sitten

II

45 9*'^ι ✓ åmm i Kj annettiin tasapainottua 1 tunti ja valon hajonta mååri-tettiin mittaamalla nåytteiden absorbanssi aallonpituu-della 550 nm.

Saadut tulokset on esitetty graafisesti kuvassa 4, jossa absorbanssi on piirretty niiden liuoksien KCl-pitoisuuk-sien kaanteisarvon funktiona, joiden vaikutukselle rakku-lat joutuvat. Kuvista B ja D ilmenee, etta fosfolipidi-MLV:t (so. EPC-MLV ja EPC:EPA-MLV) toimivat odotetusti ideaalisina osmometreina. Mutta kuvasta C ilmenee, etta vaikka CHS-MLV:t kayttaytyvat kuten suljetut rakkularaken-teet, ne osoittavat ei-ideaalista kåyttåytymistå hypo- ja hypertoonisissa valiaineissa. Tama kayttaytyminen, joka on esitetty kuvassa 4, on aivan erilainen kuin Brocken-hoffin ja Ramsammyn kolesteroliliposomeilla havaittu (Biochim. Biophys. Acta. 691 (1982) , 227-232) .

Esimerkki: Kolesterolihemisukkinaattiliposomit, jotka sulkevat sisåanså heikostiliukenevia yhdisteita

Heikosti veteen liukenevien yhdisteiden sulkeutuminen CHS-liposomeihin on osoitettu naudan kasvuhormonilla, insu-liinilla ja tylosiinilla.

1. Naudan kasvuhormonin sulkeminen kolesterolihemisukki-naatti-SUV-tyypin sisaån

Naudan kasvuhormoni (bovine growth hormone, BGH) on yksin-kertainen, yhdesta ketjusta koostuva proteiini, joka sisal-tåå noin 191 aminohappoa ja on osittain vesiliukoinen. Nor-maali liukoisuus on 1 - 1,5 mg/ml, kun pH on 8,0. Naudan kasvuhormoni saostuu orgaanisissa liuottimissa, kuten klo-roformissa.

CHS-MLV:t valmistettiin ensimmaisen esimerkin kohdassa 2. kuvatulla tavalla kåyttamålla 25 mg CHS-trissuolaa 1,0 46

G O /1 /- ~r ' i. "i O O

ml:ssa puskuria, jossa oli 0,01 M Tris-HCl (pH 7,4) ja 0,14 M NaCl-puskuria. CHS-MLV-valmiste sonikoitiin kirk-kaaksi niin, etta saatiin sonikoituja pienia yksilamel-lisia CHS-rakkuloita (CHS-SUV), ja suspensioista otettui-hin naytteisiin lisattiin 5, 10, 15, 25, 30 tai 166 mg naudan kasvuhormonia (Eli Lilly & Co., Indianapolis, IN). Suspensiot sekoitettiin pyorittåmållå perusteellisesti, jolloin proteiini asettui pienten yksilamellisten CHS-rakkuloiden kaksoiskerrosten sisaan. Sonikoituja CHS-SUV-suspensioita tarkasteltiin visuaalisesti 1, 2 ja 21 vuorokauden kuluttua, jotta havaittaisiin mahdollisen sakan lasnaolo. Mitaan sakkaa ei havaittu, mikå osoitti, etta naudan kasvuhormoni pysyi CHS-liposomien sisalla kai-kissa tutkituissa pitoisuuksissa 21 vuorokauden ajan huo-neenlampotilassa.

2. Insuliinin sulkeminen kolesterolihemisukkinaatti-SUV-tyypin sisaan

Sinkki-insuliini, joka on polypeptidihormoni, liukenee helposti laimeaan happoon tai alkaliin, mutta on kaytan-nollisesti katsoen liukenematon vesifaaseihin pH-alueella 4,5 - 7,0. Itse asiassa insuliiniliuosten taipumus muo-dostaa makroaggregaatteja on haitta haluttaessa kehittaa pitkalle aikavalille ulottuvia insuliininantosysteemeja.

CHS-MLV:t valmistettiin ensimmaisen esimerkin kohdassa 2. kuvatulla tavalla kayttaen 25 mg CHS-trissuolaa 1,0 ml: ssa puskuria, jossa oli 0,01 M Tris-HCl (pH 7,4) ja 0,14 M NaCl. CHS-MLV-valmiste sonikoitiin kirkkaaksi niin, etta saatiin sonikoituja pienia yksilamellisia CHS-rakkuloita (CHS-SUV), ja saatuun suspensioon lisattiin korkeintaan 47 mg sinkki-insuliinijauhetta (Boving Pancreatic Insulin, Sigma Chemical Co, St. Louis, MO). Suspensio sekoitettiin pyorittamallå perusteellisesti, jolloin insuliini asettui CHS-SUV-kaksoiskerroksiin. Sonikoituja CHS-SUV-suspensioi-

II

Π Λ s y k, Ο i) 47 ta tarkasteltiin visuaalisesti 1, 2 ja 21 vuorokauden ku-luttua, jotta havaittaisiin mahdollisen sakan låsnåolo. Mitåan sakkaa ei havaittu, mikå osoitti, etta insuliini pysyy sisaansuljettuna pitoisuudessa 5 mg/ml våhintaån 21 vuorokautta huoneenlampotilassa. Insuliinin sisåansulkeu-tuminen tapahtuu nopeammin 37°C:ssa.

3. Tylosiinin sulkeminen kolesterolihemisukkinaatti-SUV-tyypin sisaan

Tylosiini on antibiootti, jonka vesiliukoisuus 25°C:ssa on 5 mg/ml ja se liukenee myos alempiin alkoholeihin, es-tereihin ja ketoneihin, kloorattuihin hiilivetyihin, bent-seeniin ja eetteriin.

Pienet yksilamelliset rakkulat valmistettiin seuraavasti: 100 mg tylosiiniemastå (Eli Lilly & Co., Indianapolis, IN) ja 200 mg CHS-trissuolaa sekoitettiin pyorittSmalla 4 ml: ssa fosfaatilla puskuroitua natriumkloridiliuosta (pH 7,4). Saatia maitomaista CHS-MLV-suspensiota sonikoitiin karki-sonikaattorilla 15 minuuttia.(Varovaisuussyista koeputken ymparille sijoitettiin koeputki, jotta seoksen lampotila saatiin pidetyksi alhaalla.) Sitten seos sijoitettiin kylpysonikaattoriin 1 tunniksi 45 minuutiksi.

Tåman kahden tunnin sonikointijakson jalkeen pieniin yk-silamellisiin CHS-rakkuloihin sulkeutunut tylosiini ero-tettiin suspensiosta sentrifugoimalla suspensiota 10 minuuttia nopeudella 10 000 x g, jolloin muodostui pieni pelletti ja opaloiva emaliuos. Emaliuoksen sisaltamia sonikoituja yksilamellisia CHS-rakkuloita verrattiin visuaalisesti suspensioon, jossa oli 100 mg tylosiiniemasta (Eli Lilly & Co.m Indiananpolis, IN) samaan vesitilavuuteen lisattyna. Tylosiiniemassuspensioon muodostui sakka, mutta CHS-SUV-tylosiinivalmisteeseen ei muodostunut mitaan sakkaa. Nain olien tylosiini nåytti pysyvån sisåansulkeutuneena va- 48 c ° /i s y hintaån 48 tuntia.

Esimerkki: Kolesterolihemisukkinaattiliposomien kaytto lipidiliukoisten yhdisteiden sisaansulkemiseen

Lipidiliukoisten bioaktiivisten aineiden sisaansulkeminen osoitetaan indometasiinilla ja diatsepaamilla.

1. Indometasiinin sulkeminen kolesterolihemisukkinaatti-MLV-tyypin sisaån

In cbmetasiini, joka on prostaglandiinin inhibiittori, on kåytannollisesti katsoen veteenliukenematon. Vapaana hap-pona indometasiini liukenee etanoliin, eetteriin, asetoniin ja risiinioljyyn.

CHS-MLV:t, jotka sisaltavat eri måaria indometasiinia bio- aktiivisena aineena, valmistettiin seuraavalla tavalla.

Pyoreapohjaiseen kolviin laitettiin 25 mg CHS-trissuolaa, 1 4 1 - 5 mg indometasiinia ja 10 Ul C-indometasiinia (22,0 mCi/mmol, New England Nuclear, Boston, MA). Lisattiin riit-tåvasti metanolia liuottamaan kaikki komponentit. Sitten seos haihdutettiin kiertohaihduttimessa niin, etta saatiin ohut kalvo astian pohjaile, kuivattiin vakuumieksikkaatto-rissa yon yli, jotta saatiin varmistetuksi kaiken metanolin poistuminen. Sen jalkeen muodostettiin CHS-MLV:t lisaåmal-la kuhunkin kolviin 1,0 ml puskuria, jossa oli 0,01 M Tris-HCl (pH 7,3) ja 0,14 M NaCl. Suspensioita sekoitettiin pyorittamalla lasihelmien kanssa ja sen jalkeen annettiin seisoa rauhassa 2 tuntia.

Tuon 2 tunnin kuluttua maaritettiin monilamellisiin CHS-rakkuloihin (MLV-CHS) sulkeutuneen indometasiinin osuus seuraavalla tavalla. Jokaiseen naytteeseen lisattiin 9,0 ml puskuria, jossa oli 0,01 M Tris-HCl (pH 7,3) ja 0,14 M NaCl-puskuria, ja saatua seosta sentrifugoitiin 10 -

II

G ° Λ < s . _ y c— “v v 49 20 minuuttia nopeudella 10 000 x g. Saatu pelletti pestiin kolmeen kertaan kåyttamallå kussakin pesussa 10 ml pusku-ria, jossa oli 0,01 M Tris-HCl (pH 7,3) ja 0,14 M NaCl, ja suspendoitiin 1,0 ml:n lopulliseen tilavuuteen pusku-riin, jossa oli 0,01 M Tris-HCl (pH 7,3) ja 0,14 M NaCl. "Standardi" valmistetiin samalla tavalla kuin naytteet, mutta alkuperaiseen seokseen lisattiin vain radioaktiivi-sesti leimattua indometasiinia (so. kyseinen 1 - 5 mg indometasiinia jatettiin pois CHS-MLV-standardivalmistees-ta). Suodatettujen 20 pl:n nayte-erien radioaktiivisuus laskettiin 10 mltssa tuikelaskentanestetta. Kun "standar-dia" verrattiin nåytteisiin, jotka sisalsivat eri maaria indometasiinia, voitiin måarittåa sisaansulkeutuneen indo-metasiinin prosentuaalinen osuus. Saadut tulokset on esi-tetty taulukossa III.

Taulukko III

Indometasiinin sulkeminen monilamellisten CHS-rakkuloi-den sisåan

Indometasiinipitoisuus CHS-MLV-valmisteen , , sisaan sulkeutunut (rag/ma) 14 ___ C-indometasiini (%) 1 78 2 70 3 37 4 28 5 34 : Tuloksista ilmenee, etta jopa 78 % indometasiinista voi sulkeutua monilamellisten CHS-rakkuloiden sisaan.

1.2. Indometasiinia sisaltavien kolesterolihemisukkinaat-tirakkuloiden ultrarakenne

C: r'> A C

50 Ss-t'iOO

Jotta saataisiin selville, oliko sisåånsulkeutunut indo-metasiini muuttanut kalvorakkuloita, kåsiteltiin indo-metasiinin låsnaollessa valmistetut CHS-MLV:t (ks. edellinen kohta) jåådytyssyovytyselektorinimikroskopia-analyy- siå vårten. Jåådytyssyovytysmikroskooppisessa tarkaste-lussa pienellå suurennuksella ei "tyhjiå" monilamellisia CHS-rakkuloita voitu erottaa niistå, jotka sisålsivåt in-dometasiinia. Ei siis ollut olemassa mitaan selvåå seik-kaa, jonka voitaisiin katsoa olevan ominainen jommalle kummalle. Sen sijaan suurella suurennuksella olivat monilamellisten CHS-rakkuloiden indometasiinia sisaltavat "kaksoiskerrokset" selvasti omaleimaisia. Koska indo-metasiini on veteenliukenematon laake, mutta liukenee sen sijaan etanoliin, eetteriin, asetoniin ja muihin ei-polaa-risiin liuottimiin, on odotettavissa, ettå indometasiini lipidien lasnaollessa asettuu erilleen vedestå. Kun kak-soiskerroksia tutkittiin elektronimikroskoopilla, havait-tiin, ettå kaksoiskerrosten paksuudet vaihtelevat poikki-murtumissa. Tåmå viittasi siihen, ettå indometasiini oli todella asettunut kaksoiskerrosten lipidiosaan niin, ettå se nåytti lisååvån kaksoiskerrosten paksuutta ja saavan aikaan hyvin epayhtenåisen konfiguraation, eli paksuus vaihteli, kun yhtå kaksoiskerrosta seurattiin murtumalin-jaa pitkin. Tåmå vaikutus on luultavasti ominainen sel-laisille lååkkeille, jotka liukoisuutensa vuoksi erot-tuvat kaksoiskerrosten lipidiosaan.

2. Kolesterolihemisukkinaatti-SUV-tyyppiin suljettu diat-sepaami

Diatsepaami, joka on rauhoittava lååke (so. Valium), liukenee kloroformiin, dimetyyliformamidiin, bentseeniin, asetoniin ja alkoholiin, mutta vain våhåisesså måårin veteen.

CHS-SUV:t, jotka sisålsivåt diatsepaamia, valmistettiin

II

Γ, ·' i' r 51 seuraavalla tavalla. 2, 3, 4 tai 5 mg diatsepaamia li- 3 såttiin koeputkeen, jossa oli 5 yl H-diatsepaamia (76,7 Ci/mmol, New England Nuclear, Boston, MA). Jokaiseen putkeen lisåttiin riittåvåsti metanolia liuottamaan laa-ke (korkeintaan 2 ml metanolia). Sitten seos haihdutet-tiin kiertohaihduttimessa ohueksi kalvoksi ja kuivattiin yon yli eksikkaattorissa, jotta kaikki etanoli varmasti poistui. Kuivattu kalvo uudelleensuspendoitiin 1 mlraan sonikoitujen yksilamellisten CHS-rakkuloiden suspensiota (valmistettu alla kuvatulla tavalla kayttamalla 50, 100 tai 200 mg/ml CHS), sekoitettiin pyorittamålla lasihelmien kanssa ja suodatettiin kayttamalla 0,22 pm Millipore-suo-dattimia (Millipore Corp., New York, NY).

CHS-SUV:t valmistettiin seuraavalla tavalla: 50, 100 tai 200 mg CHS-trissuolaa sekoitettiin pyorittamålla 1,0 ml:n kanssa puskuria, jossa oli 0,01 M Tris-HCl (pH 7,3) ja 0,14 M NaCl. Nåytesonikaattoria kayttamalla nåyte sonikoitiin noin 0,40 optiseen tiheyteen, kun mittaus suoritettiin aallonpituudella 550 nm (so. "kirkas" liuos), ja sen jålkeen sentrifugoitiin nopeudella 1 000 x g, jotta sonikaattorin kårjestå mahdollisesti irronnut titaani saa-tiin poistetuksi. Sen jålkeen CHS-SUV-suspensio dekantoi-tiin putkesta.

Suhteellinen diatsepaamimåårå, jonka sonikoidut CHS-SUV:t kykenevåt sulkemaan sisåånså, mååritettiin vertaamalla nåytteitå "standardivalmisteeseen". "Standardivalmiste" valmistettiin samoin kuin nåytteet, mutta vain radioak-tiivisesti leimattua diatsepaamia lisattiin (so. ky-seinen 2 - 5 mg diatsepaamia jåtettiin pois CHS-SUV-stan-dardivalmisteesta). Kummassakin tapauksessa mååritettiin 10 yl:n suodatetuista suspensioiden nåyte-eristå radioaktiivisuus 10 ml:ssa tuikelaskentanestettå. Saadut tulokset on esitetty taulukossa IV.

f , ,- ·» /» / —/

52 5 Λ. Η Ο J

Taulukko IV

Diatsepaamin sulkeminen sonikoitujen CHS-rakkuloiden sisåån

Diatsepaamipitoisuus Sisåånsulkeutunut 3 _(mg/m£)_ H-diatsopaami (%) CHS-pitoisuus (mg/m£) 50 100 200 2 86 100 100 3 79 95 89 4 58 100 100 5 53 100 100

Tuloksista ilmenee, ettå seka 100 etta 200 mg CHS/ml sul-kevat sisaansa 100 % suurimmasta kaytetysta diatsepaami-pitoisuudesta (5 mg/ml). Koska seka 100 etta 200 mg CHS/ml riittåvat sulkemaan sisaansa diatsepaamin, on 100 mg/ml edullisempi CHS-pitoisuus diatsepaamin sisaansulkemiseen.

Esimerkki: Kolesterolihemisukkinaattiliposomien kaytto seerumin aminoglykosidipitoisuuden maarittamiseen

Havaittiin, etta suhteellisen matala CHS-rakkulakonsentraa- tio (alle 1 yg CHS/ml) agglutinoi punaisia verisoluja voimakkaasti (red blood cells, RBC) suspensioista, joka oli tehty fos-faatilla puskuroituun natriumkloridiliuokseen (phosphate buffered saline, PBS). Koska Ca++ ja muut kationit, ku-ten aminoglykosidinatibiootit, saostavat CHS-rakkuloita, voidaan CHS-rakkuloita kayttaa aminoglykosidiantibiottien pitoisuuden maarittamiseen seerumeista siten, etta (a) maaritetaan se antibiottia sisaltåvan seerumin lai-mennus, jossa tietty CHS-rakkulamaara saostuu; ja (b) maaritetaan hemagglutinaatiotitrauksella se jaljelle jaaneiden vapaiden rakkuloiden pitoisuus, jotka eivat

II

O 9 /κ < 7.

^ Λ. i u' J

ole saostuneet antibioottipitoisen seerumin lisaåmisen jalkeen.

Kummassakin tapauksessa voidaan tarkka antibioottimaåra saada selville kåyttamålla vertailukåyråå, joka on mi-tattu tunnettujen antibioottipitoisuuksien avulla. Pe-ruskokeet olivat seuraavat: 24 yl gentamysiinisulfaatin PBS-liuosta (1 mg/ml) sarja-lairaennettiin seerumiin (so. 25 yl:n seerumieråt). Sen jalkeen valmistettiin 24 yl:n era yksilamellisia CHS-rak-kuloita sonikoimalla CHS-trissuola pitoisuudessa 25 mg/ml puskurissa, jossa oli 0,01 M Tris-HCl (pH 7,3) ja 0,14 M NaCl, pH:ssa 7,4, ja lisåttiin kuhunkin naytteeseen.

Kun seoksia oli pidetty noin 10 minuuttia huoneenlåmpo-tilassa, niiden kunkin sameus mitattiin. Vain ne seok-set, joissa oli 50 yg tai sita enemman gentamysiiniå, osoittivat nakyvaa saostumista, mikå osoitti sita, etta CHS-rakkulat olivat vuorovaikutuksessa gentamysiinin kanssa.

Sitten saostunut materiaali pelletoitiin ja emaliuoksesta maaritettiin CHS-SUV-pitoisuus suorittamalla kanan punais-ten verisolujen hemagglutinaatio. Hemagglutinaatiomååri-tys suoritettiin 96 U:n muotoista koloa sisaltavilla mikro-titrauslevyilla sarjalaimentamalla rakkulasuspensiot 50 yl: aan PBS-liuosta ja lisååmållå sen jalkeen kuhunkin koloon 40 yl PBS-liuosta, jossa oli 0,5 % punaisia verisoluja.

Kun levya oli pidetty 60 minuuttia 4°C:ssa, hemagglutinaatio havaittiin kaannetylla peililla. Verrokki (punaiset verisolut ilman CHS-rakkuloiden lasnaoloa) ei osoittanut hemagglutinaatiota. Kaikki CHS-pitoiset naytteet hemagglu-tinoivat punaisia verisoluja voimakkaasti, lukuunottamatta niita, jotka edellisessS kokeessa olivat sameita. Tama tu-los osoitti, etta CHS-rakkulat vuorovaikuttivat gentamysii- 54 r- · ,« ^ ' :>... o o nin kanssa niin, ettå suhteellisen våhån rakkuloita oli tarjolla hemagglutinoitumiseen verrattuna vain CHStåå si-såltåvåån kontrollisuspensioon.

Esimerkki: Kolesterolihemisukkinaattiliposomien antaminen in vivo

Seuraavassa selostetaan menetelmiå ja seoksia, joiden avulla bioaktiivisia aineita voidaan antaa in vivo tåmån keksinnon mukaisesti valmistettuja kolesterolihemisuk-kinaattiliposomeja kåyttåen. Sisåånsuljetun biaktiivisen aineen kliininen teho mååritetåån ja lååkkeen jakautuminen valittuihin elimiin jåljitetåån, mikåli mahdollista.

1. Nivelartriitin hoito kåyttåmållå kolesterj-ihemisukki-naatti-MLV-tyyppiin suljettua indometasiinia

Koiraspuoliset valkoiset Uuden-Seelannin kanit (2 - 2,5 kg) immunisoitiin antamalla intradermaalisesti kahden vii-kon vålein (yhteenså kaksi kertaa) l ml liuosta, joka sisålsi 20 mg naudan seerumialbumiinia (BSA) (Miles Laboratories, Elkhart, IN) ml:aan tåydellistå Freundin adjuvant-tia emugloituna. Kolmannella viikolla kanit saivat nive-lensisåisesti injektoituna 10 mg naudan seerumialbumiinia 1,0 ml:ssa suolaliuosta oikeaan polviniveleen nivelartrii-tin alkuunsaattamiseksi. Vasemmat polvinivelet toimivat verrokkeina. Polvinivelten halkaisijat mitattiin kåyttåmållå Fowlerin kiekkokaulainta, jonka tarkkuus on 0,01 mm.

BSA-injektion saaneet nivelet turpoavat ja ovat yleenså 3-4 mm suurempia kuin verrokkinivelet. Neljånnellå viikolla kaneille annettiin vielå nivelensisåinen suola-liuokseen tehty BSA-ruiske, jotta niveltulehdus saatiin alulle.

CHS-MLV:t valmistettiin kolmannen esimerkin kohdassa 1. kuvatulla menetelmållå kåyttåmållå 270,0 mg CHS:åå ja

II

55 C ·~ A C 7.

S i- O \J

10 mg indometasiinia niin, ettå lopulliseksi indometasiini-pitoisuudeksi tuli 1,0 mg/ml. Kolmen vuorokauden kuluttua tulehduksen indusoinnista annettiin BSA-injektion saaneille elaimille intramuskulaarisena injektiona indometasiinia 1 mg/ml CHS-rakkuloihin suljettuna (kokonaisannos 1 mg per elåin). Nivelturvotus mitattiin tata seuraavien kym-menen vuorokauden ajan.

Saadut tulokset on esitetty graafisesti kuvassa 5 ja niista ilmenee, etta monilamellisiin CHS-rakkuloihin suljettu in-dometasiini sai intramuskulaarisesti annettuna aikaan ni-velturvotuksen vahenemisen.

2. Diatsepaamin antaminen kolesterolihemisukkinaatti-SUV-tyyppiin suljettuna in vivo

Hiirille annettiin intravenoosisesti tai intramuskulaarisesti 500 yg painokiloa kohti pieniin yksilamellisiin CHS-rakkuloihin (CHS-SUV) suljettua diatsepaamia (valmistus selostettu kolmannen esimerkin kohdassa 2.). Diatsepaa-milla oli sedatiivinen vaikutus hiiriin (hiiret nukahti-vat saatuaan valmistetta), mika osoitti, etta sisaansulkeu-tunut laake oli sailyttanyt aktiivisuutensa.

2.1. Låakkeen jakautuminen elimiin intravenoosisen anta-misen jalkeen

Sisaån suljettua diatsepaamia sisaltavat CHS-SUV:t valmis- tettiin kolmannen esimerkin kohdan 2 mukaisesti. Kun oli suoritettu sonikaatio kylpysonikaattorissa, oli suspension absorbanssi 0,370 aallonpituudella 550 nm mitattuna. Sit- ten 44,2 yl:n era CHS-SUV-suspensiota lisattiin lasiseen koeputkeen, johon sita ennen oli kuivattu typen alla 40 1 4 yCi C-diatsepaamia (ominaisaktiivisuus 181 yCi/mg ja se on saatavissa liuoksena, jossa on 100 yCi per ml eta-nolia). Viisi minuuttia pyorittamalla sekoitettuun liuok- C '> Λ r -ϊ 56 -'.•-"tøj seen lisåttiin 1,282 ml puskuria, jossa oli 0,01 M Tris-HCl (pH 7,3) ja 0,14 M NaCl, jolloin suspensio laimeni kolmikymmenkertaisesti ja hiirille annettava hoitoannos oli nain olien 0,167 mg diatsepaamia per ul.

1 4 0,1 ml:n era CHS-SUV- C-diatsepaamisuspensiota mjektoi- tiin valveilla olevien, pidåteltyjen, 35 g painavien Swiss-

Webster-hiirten hantålaskimoon. Verrokkihiirille annettiin samalla tavalla ekvivalenttiset annokset sisåånsulkematonta 1 4 C-diatsepaamia. 1, 2 tai 5 tunnin kuluttua ruiskeen an-tamisesta hiiret surmattiin katkaisemalla kaula ja sisaeli-met (munuaiset, keuhkot, perna, maksa, suoli, aivot, sydan, haima ja rasva) poistettiin sekå otettiin verinåyte. Eli-met punnittiin ja jokaisesta otettu pieni nåyte (20 - 40 ug) digeroitiin ja niista poistettiin vari menetelmållå Mahim and Kohberg, Analytical. Biochem. J_6 (1966), 500. Sitten nåytteita sopeutettiin pimeaan viiden vuorokauden ajan, jotta kemiluminesenssi vaistyi, ja sen jalkeen mitattiin radioaktiivisuus.

Taman kokeen tulokset on esitetty kuvassa 6. Hiirilla, joille on annettu pieniin yksilamellisiin CHS-rakkuloi-hin suljettua diatsepaamia, ei låake kerry pernaan, mika osoittaa, ettei pieniin yksilamellisiin CHS-rakkuloihin suljettu diatsepaami kayttaydy kuin kuten fosfolipidili-posomeihin suljettu laake intravenoosisesti in vivo annet-tuna.

3. Kromin antaminen kolesterolihemisukkinaatti-MLV-tyyp-piin suljettuna in vivo

Jotta saataisiin selville, pysyvåtko CHS-rakkulat ehjina, kun ne annetaan in vivo, maåritettiin vapaan merkin vesi- liuoksen ia CHS-rakkuloihin suljetun merkin vesiliuoksen jakautuminen kudoksiin, kun anto tapahtui intravenoosisina injektioina hiirille. Tåta vårten verrattiin keskenaan sisaansulke-

II

57 C / 'r 51 51 mattoman kromin ( Cr), monilamellisiin CHS-rakkuloi-51 hin suljetun kromin ja fosfolipidirakkuloihin suljetun 51 kromin jakautuminen eri kudoksiin. Toimenpiteet suori-tettiin seuraavalla tavalla: 51 51 (a) Kapseloimaton Cr. Kromia on saatavissa muodos- 51 2- sa CrO„ steriilisså, 0,9 %:sessa suolaliuoksessa (New ^ 51

England Nuclear, Newton, MA). Injektoitava vapaa Cr val- 51 mistettiin laimentamalla 100 yl Cr-liuosta, joka oli tehty 0,9 %:seen suolaliuokseen, 1,5 ml:n kokonaistilavuu-teen puskuriin, jossa oli 0+01 M Tris-HCl pH 7,3, 0,14 M NaCl ja 5 % destroosia. Kuudelletoista 40 g painoiselle, koiraspuoliselle Swiss Webster-hiirelle annettiin hantåval-timoon injektoituna 0,1 ml tata liuosta (noin 700 000 cpm).

(b) CHS-MLV:t, joiden sisåan oli suljettu 5^Cr, valmistet-tiin liuottamalla kuiva CHS-trissuolajauhe puskuriin, jossa oli 0,01 M Tris-HCl, pH 7,3, 0,14 M NaCl, 5 % dekstroo- 51 2™ sia ja hiven kromia (3 Cr02 steriilisså, 0,9 %:sessa suolaliuoksessa). Seos sekoitettiin pyorittåmålla ja sen jalkeen sonikoitiin 30 minuuttia. Sen jalkeen pelletoitiin ja pestiin kolmeen kertaan, kuten edella on kuvattu, ja lo-pullinen pelletti uudelleensuspensoitiin lopulliseen pitoi-suuteen 10 mg CHS/ml ja luokiteltiin 1 mikronin halkaisija-luokkaan suorittamalla Nicompin kvasielastinen valonhajon-ta-analyysi. Kahdelletoista 40 g painoiselle, koiraspuoliselle Swiss Webster-hiirelle annettiin kullekin ruiskeena hantålaskimon kautta 0,1 ml (noin 120 000 cpm) tata sus-pensiota.

51 (c) EPC-SPLV:t, joissa oli sisalla kromia, valmistettiin menetelmålla, jota on yksityiskohtaisesti selostettu pa-tenttihakemusjulkaisussa no. 476 496, joka on jatetty vi-rastoon 24. maaliskuuta, 1983 (Lenk et al.), ja jonka nimitys on "Stable Plurilamellar Vesicles, Their Preparation and Use”, ja joka liitetaan tahan yhteyteen viit- 58 92^^" <S C— t teeksi. Tåtå tarkoitusta vårten valmistettiin 5 ml:n eråt liuottamalla 65 mg munan fosfatidyylikoliinia (EPC) kloroformiin ja kuivaamalla niin, ettå saatiin EPC-kalvo.

Kalvo uudelleensuspendoitiin 10 ml:aan eetteriå ja lisat-512- tiin 0,3 ml Cr02 “liuosta, joka oli tehty 0,9 %: seen suolaliuokseen (pH 8). Sen jålkeen kalvo emulgoitiin so-nikaatiolla, jolloin eetteri haihdutettiin samanaikaises-ti ^-kaasun alia. Nåin saadut stabiilit plurilamelli-rakkulat (stable plurilamellar vesicles, SPLV) uudelleensuspendoitiin 5 ml:aan puskuria, jossa oli 0,01 M Tris-HC1, pH 7,3, 0,14 M NaCl ja 5 % destroosia, ja pelletoi- tiin sentrifugoimalla. Pelletti pestiin kolmeen kertaan, 51 jotta sisåånsulkeutumaton kromi saatiin poistetuksi ja lopullinen pelletti uudelleensuspendoitiin 5 ml:aan puskuria, jossa on 0,01 M Tris-HCl pH 7,3, 0,14 M NaCl ja 5 % dekstroosia. Lopullinen EPV-pitoisuus oli 13 mg/ml. Kah-delletoista 40 g painoiselle, koiraspuoliselle Swiss Webs-ter-hiirelle injektoitiin håntålaskimoon 0,1 ml (noin 100 000 cpm) tåtå suspensiota.

1, 2, 5 ja 24 tunnin kuluttua 3 hiirtå kustakin lipo- somivalmisteella kåsitellystå ryhmåstå ja 4 hiirtå kapse-51 loimattomalla kromilla kåsitellystå ryhmåstå surmattiin katkaisemalla kaula. Elimet poistettiin, huuhdeltiin 0,9 %:sella suolaliuoksella, punnittiin ja mååritettiin radioaktiivisuus, jotta saatiin selville % annoksesta ja % annoksesta/gramma, joka oli jåljellå tutkitussa eli-messå.

Tuloksista, jotka on esitetty kuvassa 7, ilmenee, ettå kapseloimaton kloroformi (kuva 7C) erittyy nopeasti ei-kå rikastu mininkåån tutkituista elimistå. EPC:hen ja ja CHS:åån kapseloitu kromi pysyy mitattavalla tasolla 24 tuntia ruiskeen antamisesta lukien, mikå osoittaa, ettå CHS-rakkulat ja 3>C-SPLV:t pysyvåt ehjinå in vivo. Lisåksi EPC-SPLV-tyypin (13 mg/ml) keskimååråinen halkai- li C- *’> / c.

59 / i. *\ J

sija on 0,5 - 1,0 mikronia ja ne kertyvat maksaan, keuh-koihin ja pernaan (kuva 7B) , so. tyypillinen liposomien jakautumiskayttaytyminen. Ekvimolaariset CHS-rakkulat kertyvat paaasiassa maksaan ja paljon pienemmassa måårin keuhkoihin ja pernaan (kuva 7A). Tama osoittaa sita, ettM kyseisilla kahdella liposomivalmisteella on erilainen jakautumiskayttaytyminen in vivo.

4. Ihmisen kasvuhormonin antaminen kolesterolihemisukki-naatti-MLV-tyyppiin suljettuna in vivo

Monilamelliset CHS-rakkulat, joiden sisaan oli suljettu 12 5 I-ihmisen kasvuhormonia (human growth hormone, HGH,

New England Nuclear, Boston, MA), valmistettiin seuraa-valla tavalla: CHS-trissuolaa lisattiin puskuriin, jossa 011 0,01 M Tris-HCl, 0,14 M NaCl (pH 7,4) ja 1 ygCi/ml 125 I-HGH:ta (New England Nuclear, Boston, MA), niin, etta lopulliseksi CHS-trissuolapitoisuudeksi tuli 25 mg/ml. Suspensio sekoitettiin pyorittamalla lasihelmien kanssa. Saadut CHS-MLV:t olivat sulkeneet sisaansa 10 % ^^I-HGH: sta, kun verrattiin alkuperåiseen radioaktiivisuuteen.

12 naaraspuoliselle Swiss Webster-hiirelle annettiin intra- muskulaarisena ruiskeena takaraajaan 0,5 ml CHS-MLV-sus- 125 pensiota, jossa oli I-HGH sisaansuljettuna. 12 hiiren 125 vertauluryhmalle annettiin 0,5 ml vapaata I-HGH:ta puskurissa, jossa oli 0,01 M Tris-HCl ja 0,14 M NaCl-pus- kuria. Kummankin ryhmån jokainen elain sai noin 35 000 cpm. Tiettyinå ajankohtina ruiskeen antamisen jalkeen hiiret surmattiin, takaraaja leikattiin irti ja jaljelle jåånyt prosentuaalinen osuus kokonaisradioaktiivisuu- desta maåritettiin. Taulukossa V esitetyt tulokset osoit- 1 25 tavat huomattavaa I-HGH:n pidattymisen kasvua, kun hromoni on sisallytetty monilamellisiin CHS-rakkuloihin. Niinpa CHS-liposomeihin suljettu, intramuskulaarisesti an-nettu låake vapautuu pitkitetyllå tavalla.

C- ·'> A C 7 60 ' ^ ~ ^ u

Taulukko V

1 25

Monilamellisiin rakkuloihin (MLV) suljetun I-ihmisen kasvuhormonin pidåttyminen

Ruiske Raajassa jåljella oleva radioaktii- visuus (%)__

Aika (tuntia) (N = 12 elainta) 3 24 72 168

Verrokkia 5 0,7 0,2 0,3 125

I-HGH

125I-HGH CgS- 56 37 29 22 rakkuloissa 125 a Elaimet saivat 0,5 ml I-ihmisen kasvuhormonia puskurissa, jossa oli 0,01 M Tris-HCl ja 0,14 M NaCl.

b Elaimet saivat 0,5 ml CHS-rakkulasuspensiota, jossa 125 oli I-ihmisen kasvuhormoni sisaansuljettuna, (25 mg (CHS/ml) puskurissa, jossa oli 0,01 M Tris-HCl ja 0,14 M NaCl.

Claims (19)

61 ί ; /1 /' *ν > C J

1. Forfarande for framstållning av sterolblåsor, kånnetecknat av att till vattenfasen tillsåtts en saltform av ett derivat som bildats av en organisk syra och en sterol, som fårmår bilda slutna dubbellager, i en mångd som råcker får att bilda helt slutna dubbellager och av att blandningen skakas tilis en mjålkaktig suspension av multilamellåra blåsor bildas.

1. Menetelmå sterolirakkuloiden valmistamiseksi, tunnettu siitå, ettå vesifaasiin lisåtåån sterolin ja orgaanisen ha-pon muodostaman johdannaisen suolamuotoa, joka kykenee muo-dostamaan sulkeutuneita kaksoiskerroksia, måårå, joka riit-tåå tåysin sulkeutuneiden kaksoiskerrosten muodostumiseen, ja saatua seosta ravistellaan, kunnes on muodostunut maito-mainen, monilamellisten rakkuloiden suspensio,

2. Fårfarande enligt patentkrav l, kånnetecknat av att den mjålkaktiga suspensionen sonikeras så att det bildas en suspension av unilamellåra blåsor. 64 c f- s v y , ·-. O O

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmå, tunnettu siitå, ettå maitomainen suspensio sonikoidaan niin, ettå syntyy yksilamellisten rakkuloiden suspensio.

3. Fdrfarande enligt patentkrav 1, kånnetecknat av att dub-bellagren omfattar en tris(hydroximetyl)aminometan saltform av ett derivat som bildats av en organisk syra och en sterol.

3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmå, tunnettu siitå, ettå kaksoiskerrokset koostuvat sterolin ja orgaanisen hapon muodostaman johdannaisen tris(hydroksimetyyli)amino-metaanisuolamuodosta.

4. F6rfarande enligt patentkrav 1, kånnetecknat av att dubbellagren omfattar en 2-amino-2-metyl-l,3-propandiol, en 2-aminoetanol, en bis-tris-propan, eller en trietanolamin-saltform av ett derivat som bildats av en organisk syra och en sterol.

4. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmå, tunnettu siitå, ettå kaksoiskerrokset koostuvat sterolin ja orgaanisen hapon muodostaman johdannaisen 2-amino-2-metyyli-l,3-pro-paanidioli-, 2-amino-etanoli-, bis-tris-propaani- tai tri-etanoliamiinisuolamuodosta.

5. Forfarande enligt patentkrav 1, kånnetecknat av att dubbellagret omfattar en saltform av ett derivat som bildats av en organisk syra och en sterol, i vilken som saltformningsforening år ett fungicidiskt låkemedel.

5. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmå, tunnettu siitå, ettå kaksoiskerros koostuu sterolin ja orgaanisen hapon muodostaman johdannaisen suolamuodosta, jossa suolanmuodos-tajana on sienilååke.

6. Forfarande enligt patentkrav 5, kånnetecknat av att det derivat som bildats med den organiska syran år ett suckinat.

6. Patenttivaatimuksen 5 mukainen menetelmå, tunnettu siitå, ettå orgaanisen hapon kanssa muodostunut johdannainen on sukkinaatti.

7. Forfarande enligt patentkrav 6, kånnetecknat av att sterolen år en kolesterol.

7. Patenttivaatimuksen 6 mukainen menetelmå, tunnettu siitå, ettå steroli on kolesterol!. 62 / .-, · ^ -* . ·. ::: J

8. Forfarande enligt patentkrav 1, kånnetecknat av att dubbellagren omfattar en mikonazolsaltform av ett derivat som bildats av en organisk syra och av en sterol. % 9. Forfarande enligt patentkrav 8, kånnetecknat av att det derivat som bildats med den organiska syran år ett suckinat.

8. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmå, tunnettu siitå, ettå kaksoiskerrokset koostuvat sterolin ja orgaanisen hapon muodostaman johdannaisen mikonatsolisuolamuodosta.

9. Patenttivaatimuksen 8 mukainen menetelmå, tunnettu sii-tå, ettå orgaanisen hapon kanssa muodostunut johdannainen on sukkinaatti.

10. Forfarande enligt patentkrav 9, kånnetecknat av att sterolen år kolesterol.

10. Patenttivaatimuksen 9 mukainen menetelmå, tunnettu sii-tå, ettå steroli on kolesteroli.

11. Fdrfarande enligt patenktrav l, kånnetecknat av att det derivat som bildats av den organiska syran år suckinat.

11. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmå, tunnettu sii-tå, ettå orgaanisen hapon kanssa muodostunut johdannainen on sukkinaatti.

12. Forfarande enligt patentkrav l, kånnetecknat av att dubbellagren omfattar en saltform av ett derivat som bildats av en organisk syra och en kolesterol.

12. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmå, tunnettu sii-tå, ettå kaksoiskerrokset koostuvat kolesterolin ja orgaanisen hapon muodostaman johdannaisen suolamuodosta.

13. Forfarande enligt patentkrav 1, kånnetecknat av att II 65 92463 dubbellagren omfattar tris(hydroximetyl)aminometansaltformen av ett hemisuckinatderivat av kolesterol.

13. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmå, tunnettu sii-tå, ettå kaksoiskerrokset koostuvat kolesterolin hemisukki-naattijohdannaisen tris(hydroksimetyyli)aminometaanisuola-muodosta.

14. Forfarande enligt patentkrav 13, kånnetecknat av att vattenfasen år våsentligt fri från divalenta katjoner.

14. Patenttivaatimuksen 13 mukainen menetelmå, tunnettu siitå, ettå vesifaasi on oleellisesti ottaen vapaa kahden-arvoisista kationeista.

15. Forfarande enligt patentkrav 13, kånnetecknat av att saltformen av kolesterolhemisuckinatderivatet år nårvarande i en mångd av c. 4,5 mg-200 mg får varje ml av vattenfasen.

15. Patenttivaatimuksen 13 mukainen menetelmå, tunnettu siitå, ettå kolesterolihemisukkinaattijohdannaisen suolamuo-toa on låsnå noin 4,5 - noin 200 mg vesifaasin millilitraa kohti.

16. Forfarande enligt patentkrav 13, kånnetecknat av att tris-salt tillsåtts i vattenfasen.

16. Patenttivaatimuksen 13 mukainen menetelmå, tunnettu siitå, ettå tris-suola lisåtåån vesifaasiin.

17. Fårfarande får inneslutning av en vattenoloslig får-ening i sterolblåsor, kånnetecknat av att a) den vattenolåsliga foreningen och saltformen av det organiska syraderivatet av sterolen, som formår bilda slutna dubbellager, loses i ett organiskt låsningsmedel; b) det organiska låsningsmediet avlågsnas, och kvar biir en torr produkt, som omfattar den vattenolåsliga fåreningen, och sterolderivatet; och c) en vattenlåsning tillsåtts får bildning av multilamellåra eller unilamellåra sterolblåsor.

17. Menetelmå veteen liukenemattoman yhdisteen sulkemiseksi sterolirakkuloiden sisåån, tunnettu siitå, ettå li 63 v ;j 53 (a) liuotetaan orgaaniseen liuottimeen veteen liukenematon yhdiste ja sterolin orgaanisen happojohdannaisen suolamuoto, joka kykenee muodostamaan suljettuja kaksoiskerroksia; (b) orgaaninen liuotin poistetaan, jolloin jåljelle jåå kui-va valmiste, joka kåsittåå veteen liukenemattoman yhdisteen ja sterolijohdannaisen; ja (c) lisåtåån vesiliuos monilamellisten tai yksilamellisten sterolirakkuloiden muodostamiseksi.

18. Fårfarande får inneslutning av en vattenolåslig får-ening i sterolblåsor, kånnetecknat av att det omfattar: a) samtidig upplåsning i ett organiskt låsningsmedel av den vattenlåsliga fåreningen och en saltform av ett derivat, som bildats av en organisk syra och en sterol som fårmår forma dubbellager i en vattenfas; b) evaporering av det organiska låsningsmediet så att det biir kvar en film omfattande fåreningen och saltformen av derivatet av en organisk syra och en sterol; c) tillsåttning av en vattenfas till filmen och omskakning så att en mjålkaktig suspension av helt slutna multilamellåra blåsor bildas.

18. Menetelmå veteen liukenemattoman yhdisteen sulkemiseksi sterolirakkuloiden sisåån, tunnettu siitå, ettå (a) orgaaniseen liuottimeen liuotetaan samanaikaisesti veteen liukenematon yhdiste ja vesifaasissa kaksoiskerroksia muodostamaan kykenevå sterolin ja orgaanisen hapon muodosta-man johdannaisen suolamuoto; (b) orgaaninen liuotin haihdutetaan niin, ettå jåljelle jåå kalvo, joka koostuu yhdisteestå ja sterolin ja orgaanisen hapon muodostaman johdannaisen suolamuodosta; (c) kalvoon lisåtåån vesifaasi ja ravistellaan niin, ettå muodostuu tåysin sulkeutuneiden monilamellisten rakkuloiden maitomainen suspensio.

19. Patenttivaatimuksen 18 mukainen menetelmå, tunnettu siitå, ettå maitomainen suspensio sonikoidaan niin, ettå saadaan yksilamellisia rakkuloita.

19. Fårfarande enligt patentkrav 18, kånnetecknat av att den mjolkaktiga suspensionen sonikeras så att det bildas unilamellåra blåsor.