CN118078755A - 一种单链双亲小分子/维生素d3甾醇脂质体及其制备方法和应用 - Google Patents
一种单链双亲小分子/维生素d3甾醇脂质体及其制备方法和应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种单链双亲小分子/维生素D3甾醇脂质体及其制备方法和应用，属于医药技术领域。本发明以单链双亲小分子为骨架，与高含量甾醇分子维生素D3自组装成稳定的液相有序态双分子层结构，自组装成不含磷脂的双层膜结构——单链双亲小分子/维生素D3甾醇脂质体。该甾醇脂质体可以在骨缺损处直接给药，甾醇脂质体可直接被细胞高效摄取，不经过肝肾代谢的维生素D3便可起到促进骨再生的功能，诱导干细胞分化，促进骨再生，达到骨缺损愈合的效果。
Description
技术领域
本发明属于医药技术领域，具体涉及一种单链双亲小分子/维生素D3甾醇脂质体及其制备方法和应用。
背景技术
骨组织作为人体的坚硬组织，在日常生活中可以支持人的各种活动并保护各种器官。此外，骨组织具有维持体内钙磷平衡的作用。然而，骨组织容易受到外界因素的损伤，小面积的骨折可以通过机体自身功能修复，大面积的骨缺损通常难以依靠自身修复，必须通过治疗促进骨缺损的修复。自体骨移植仍是临床中修复骨缺损的金标准，然而来源有限，供区损伤等因素极大的制约了其临床应用。
传统磷脂脂质体作为载体，是所有载体中最早被批准应用于临床使用的剂型。但是，磷脂脂质体中的磷脂分子易被氧化，水解，酶解等，导致磷脂脂质体稳定性较差，并且磷脂的分离提取纯化相对复杂，昂贵，不利于大规模的推广和使用。
发明内容
针对上述不足，本发明提供一种单链双亲小分子/维生素D3甾醇脂质体及其制备方法和应用，该甾醇脂质体的稳定性强，成分来源广泛，成本低廉，利于大规模的推广和使用。
本发明第一方面保护一种单链双亲小分子/维生素D3甾醇脂质体，是由单链双亲小分子化合物和维生素D3通过自组装而成的双分子层结构。
进一步地，所述单链双亲小分子化合物包括棕榈酸、十八胺、氯化十六烷基吡啶、1-磷酸鞘氨醇或十八烷基甲基亚砜中的一种。
优选的，所述单链双亲小分子化合物为棕榈酸。
本发明选择的除棕榈酸外的其他单链双亲小分子与棕榈酸的结构相似，依据实施例的方法，可以将棕榈酸替换成十八胺、氯化十六烷基吡啶、1-磷酸鞘氨醇或十八烷基甲基亚砜中的任一种，获得甾醇脂质体。
进一步地，所述单链双亲小分子化合物为棕榈酸时，组装成的棕榈酸/维生素D3甾醇脂质体的水合粒径为113.98±13.78nm；棕榈酸/维生素D3甾醇脂质体的多分散系数为0.10±0.04；棕榈酸/维生素D3甾醇脂质体的剪切面电位为-31.91±1.86mV。
本发明的单链双亲小分子/维生素D3甾醇脂质体中含有的维生素D3能作为药物，直接作用于骨缺损或骨折部位，甾醇脂质体直接被细胞吸收，不经过代谢的维生素D3便可起到促进骨再生的功能，诱导干细胞分化，有效促进骨缺损或骨折的愈合。
本发明中棕榈酸/维生素D3甾醇脂质体的水合粒径为113.98±13.78nm，该尺寸的脂质体既不会引起免疫系统的反应，也不会被肾脏所代谢，可以最大限度地发挥治疗效果。另外，通过多分散系数和剪切面电位可以看出本发明中的棕榈酸/维生素D3甾醇脂质体大小均一、电荷稳定。
进一步地，所述单链双亲小分子/维生素D3甾醇脂质体还包载了药物，所述药物为亲水性药物或疏水性药物中的至少一种。
所述亲水性药物包括二甲双胍；所述疏水性药物包括布洛芬。
进一步地，所述单链双亲小分子/维生素D3甾醇脂质体对药物的包封率为86%以上；所述单链双亲小分子/维生素D3甾醇脂质体对药物的载药量为9%以上。
进一步地，棕榈酸/维生素D3甾醇脂质体对二甲双胍有高达84.53±1.75%的包封率和7.92±1.26%的载药量；对布洛芬有高达83.93±4.01%的包封率和13.91±1.51%的载药量。
本发明的甾醇脂质体可以作为优良载体，与负载的药物共同作用于骨缺损或骨折部位，起到协同促进骨愈合和抗炎等功效。
本发明第二方面保护一种单链双亲小分子/维生素D3甾醇脂质体的制备方法，包括如下步骤：
调节有单链双亲小分子化合物和维生素D3的混合物的缓冲液的pH值至7.0~7.6，得到第一悬浊液；再将所述第一悬浊液进行水合反应，制得单链双亲小分子/维生素D3甾醇脂质体。
所述缓冲液优选为Tris-buffer缓冲液。
本发明的制备方法简易，成本低，利于大规模的推广和应用。
进一步地，所述单链双亲小分子化合物和所述维生素D3的摩尔比为（2~4）：（6~8）。此摩尔比下的单链双亲小分子化合物能与维生素D3形成的甾醇脂质体稳定性高，便于贮存。
进一步地，所述水合反应具体包括如下步骤：
S1、使用液氮冰冻所述第一悬浊液得到冰冻体；
S2、将所述冰冻体放入65℃~70℃的环境中解冻；
S3、重复步骤S1~S2在5次以上，即得。
本发明使用液氮能对第一悬浊液快速冰冻形成冰冻体，然后在65℃~70℃下解冻，能够形成水合制剂的单链双亲小分子/维生素D3甾醇脂质体。
进一步地，单链双亲小分子化合物和维生素D3的混合物的制备方法，包括如下步骤：
将单链双亲小分子化合物加入到混合溶剂形成第一母液，将所述维生素D3加入到混合溶剂形成第二母液，所述混合溶剂由苯和甲醇的混合形成；
混合所述第一母液和所述第二母液形成母液混合液，将所述母液混合液通过液氮冷冻成固体后，对所述固体冻干得到单链双亲小分子化合物和所述维生素D3的混合粉末。
本发明苯和甲醇作为混合溶剂，能够较好的溶解单链双亲小分子化合物和维生素D3，进而将单链双亲小分子化合物和维生素D3充分分散。通过对母液混合液液氮冷冻和冻干，能够快速和充分的去处溶剂，进一步形成混合充分、均匀的单链双亲小分子化合物和维生素D3混合粉末。
进一步地，所述苯和所述甲醇的体积比为（8~9）：（2~1）。此体积比下的混合溶剂能够有效溶解单链双亲小分子化合物和维生素D3。
进一步地，包载药物的单链双亲小分子/维生素D3甾醇脂质体的制备方法，包括如下步骤：
当所述药物为疏水性药物时，将单链双亲小分子化合物加入到混合溶剂形成第一母液，将所述维生素D3加入到混合溶剂形成第二母液，所述混合溶剂由苯和甲醇的混合形成。
混合所述第一母液和所述第二母液形成母液混合液，向所述母液混合液中加入所述疏水性药物，冻干。
将得到的冻干粉用缓冲液溶解后，调pH值至中性得到第一悬浊液，再将所述第一悬浊液进行水合反应，制得包载了疏水性药物的单链双亲小分子/维生素D3甾醇脂质体。
当所述药物为亲水性药物时，将单链双亲小分子化合物加入到混合溶剂形成第一母液，将所述维生素D3加入到混合溶剂形成第二母液，所述混合溶剂由苯和甲醇的混合形成。
混合所述第一母液和所述第二母液形成母液混合液，冻干。
将亲水性药物溶解在水中，得到第三母液。
将得到的第三母液与冻干粉共同用缓冲液溶解后，调pH值至中性得到第一悬浊液，再将所述第一悬浊液进行水合反应，制得包载了亲水性药物的单链双亲小分子/维生素D3甾醇脂质体。
进一步地，所述亲水性药物或者疏水性药物与所述单链双亲小分子/维生素D3甾醇脂质体的质量比为0.08~0.1：1。
本发明第三方面保护上述的单链双亲小分子/维生素D3甾醇脂质体在制备骨缺损或骨折药物中的应用。
有益效果：
本发明以单链双亲小分子（优选为棕榈酸）为骨架，与高含量甾醇分子维生素D3自组装成稳定的液相有序态双分子层结构，形成不含磷脂的双层膜结构——单链双亲小分子/维生素D3甾醇脂质体。该甾醇脂质体的稳定性高，在14天室温环境的动态监测下，该甾醇脂质体的水合粒径、多分散系数及剪切面电位等数值基本保持不变，对保存环境具有高包容度，便于长期运输、贮存和多场景应用。本发明中的甾醇脂质体中含有维生素D3，维生素D3能作为药物，有效促进骨缺损的愈合。因此，单链双亲小分子/维生素D3甾醇脂质体既能作为药物的载体，同时还能作为促进骨缺损愈合的药物，在治疗骨缺损时能起到事半功倍的效果。
本发明突破了现有技术临床中维生素D3只有口服和肌注两种剂型的限制，避免了维生素D3在体内需要经过肝、肾两个器官的代谢，生成1,25-二羟维生素D3才能发挥促进钙磷吸收的功能。本发明甾醇脂质体可以在骨缺损处直接给药，甾醇脂质体直接被细胞吸收，不经过代谢的维生素D3便可起到促进骨再生的功能，诱导干细胞分化，促进骨再生。本发明的甾醇脂质体吸收效率高，骨缺损愈合效果好。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
其中：
图1为本发明实施例1制备的棕榈酸/维生素D3甾醇脂质体的红外光谱图。
图2为本发明实施例2中棕榈酸/维生素D3甾醇脂质体的动态光散射实验结果图；其中，A为棕榈酸/维生素D3甾醇脂质体的组装原理；B为甾醇脂质体的水合粒径；C为甾醇脂质体的多分散系数；D为甾醇脂质体的剪切面电位。
图3为本发明实施例2中棕榈酸/维生素D3甾醇脂质体装载布洛芬或二甲双胍后的情况；其中，A为包封率；B为载药量。
图4为本发明实施例6中二维平板培养时棕榈酸/维生素D3甾醇脂质体的体外成骨实验；其中，A为碱性磷酸酶染色图片；B为茜素红染色图片；C为碱性磷酸酶染色定量结果；D为茜素红染色定量结果；E为Ruxn2、Opn及Ocn基因的表达情况；F为Ruxn2、Opn及Ocn基因的表达定量结果。
图5为本发明实施例6中三维水凝胶培养时棕榈酸/维生素D3甾醇脂质体的体外成骨实验；其中，A为碱性磷酸酶染色图片；B为茜素红染色图片；C为碱性磷酸酶染色定量结果；D为茜素红染色定量结果；E为Ruxn2、Opn及Ocn基因的表达情况；F为Ruxn2、Opn及Ocn基因的表达定量结果。
图6为本发明实施例7中棕榈酸/维生素D3甾醇脂质体对小鼠颅骨不可自愈合模型治疗后的显微计算机断层扫描图和定量图；其中，A为显微计算机断层扫描图；B为新骨覆盖面积；C为骨小梁相对体积；D为骨小梁厚度；E为骨小梁数量；F为骨小梁分离度。
图7为本发明实施例7中棕榈酸/维生素D3甾醇脂质体对小鼠颅骨不可自愈合模型治疗后的组织学颜色图；其中，A为苏木精-伊红染色结果；B为马松三色染色结果。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
（1）称取棕榈酸（C16H32O2）粉末，溶解于液相色谱级的苯/甲醇（苯：甲醇=9：1，v/v）溶液中，记作第一母液；称取维生素D3（C27H44O）粉末溶于液相色谱级的苯/甲醇（苯：甲醇=9：1，v/v）溶液中，记作第二母液。其中，第一母液中的棕榈酸与第二母液中的维生素D3的摩尔比为3：7。
（2）混合第一母液和第二母液形成母液混合液，将母液混合液置于玻璃管中并涡旋混合，立即进行下一步或用液氮快速冰冻成固体后贮存在-80℃环境中保存待用。
（3）将母液混合液用液氮快速冷冻成固体，然后通过冷冻干燥机将其冻干；或者直接取步骤（2）得到的固体进行冷冻干燥。冻干时间为16小时以上，以完全去除溶液中的有机溶剂（苯与甲醇）。彻底冻干后，玻璃瓶内呈现出蓬松的淡黄色的棕榈酸和维生素D3的混合粉末。
（4）将棕榈酸和维生素D3的混合粉末用Tris-buffer缓冲液（50mM三羟甲基氨基甲烷与140mM 氯化钠）溶解完全，因棕榈酸的存在，此时溶解液会呈现出弱酸性，使用氢氧化钠将溶液的pH值调整至7.4后，对该悬浊液做水合处理，即先用液氮快速冰冻，再将其从液氮转移至70°C环境中，反复循环5次，然后使用100nm孔径的聚碳酸酯膜机械反复挤出使之均一化，最终得到棕榈酸/维生素D3（PA/VD3）甾醇脂质体。
本实施例制备的棕榈酸/维生素D3甾醇脂质体的红外光谱如图1所示，利用傅里叶红外光谱仪对PA/VD3甾醇脂质体进行检测，光谱结果显示，与标准单品棕榈酸和标准单品维生素D3相比，PA/VD3甾醇脂质体在波长3310cm-1处的羟基吸收峰因形成氢键而变宽，在波长1700cm-1处出现棕榈酸特有的吸收峰，这证实了PA/VD3甾醇脂质体中棕榈酸和维生素D3的结合。
实施例2
对实施例1制备的棕榈酸/维生素D3甾醇脂质体进行动态散射光实验，结果如图2所示，结果表明，实施例1制备的甾醇脂质体的水合粒径为113.98±13.78nm，该尺寸的脂质体既不会引起免疫系统的反应，也不会被肾脏所代谢，可以最大限度地发挥治疗效果；其多分散系数为0.10±0.04，这证明了本发明制备的脂质体大小均一；剪切面电位为-31.91±1.86mV，也提示该脂质体处于电荷稳定状态。
在为期14天室温环境的动态监测下，该甾醇脂质体的水合粒径、多分散系数及剪切面电位等数值基本保持稳定，这也证实了棕榈酸/维生素D3甾醇脂质体具有良好的稳定性，对保存环境具有高包容度，便于长期运输、贮存和多场景应用。
实施例3
本实施例研究了实施例1制备的棕榈酸/维生素D3甾醇脂质体对布洛芬和二甲双胍的包封率和载药量。
（1）称取一定质量冻干好的棕榈酸和维生素D3混合粉末，溶解于液相色谱级的苯/甲醇（苯：甲醇=9：1，v/v）溶液中，记作母液A；称取一定质量的布洛芬粉末，溶解于液相色谱级的苯/甲醇（苯：甲醇=9：1，v/v）溶液中，记作母液B。
按照棕榈酸-维生素D3混合粉末：布洛芬=10：1，w/w的料药比例，使用手动移液器分别从母液A和母液B中吸取相应量的棕榈酸-维生素D3溶液和布洛芬溶液置于玻璃管中并涡旋混合。将上述棕榈酸-维生素D3与布洛芬的共混溶液用液氮快速冷冻成固体后，通过冷冻干燥机将其冻干，冻干时间不低于16小时，以确保祛除玻璃管中的有机溶剂。然后称取对应的粉末，用Tris-buffer溶液溶解，并调整体系的pH值至7.4，进行水合处理，即先用液氮快速冰冻，再将其从液氮转移至70°C环境中，反复循环5次，然后使用100nm孔径的聚碳酸酯膜机械反复挤出使之均一化，得到布洛芬-PA/VD3甾醇脂质体。
（2）分别称取棕榈酸粉末和维生素D3粉末，溶解于液相色谱级的苯/甲醇（苯：甲醇=9：1，v/v）溶液中，按照棕榈酸与维生素D3的摩尔比为3：7混合，将混合液置于玻璃管中并涡旋混合，用液氮快速冰冻成固体粉末后备用。将二甲双胍溶于水中备用。
按照棕榈酸-维生素D3混合粉末：二甲双胍=10：1，w/w的料药比例，取相应量的棕榈酸-维生素D3混合粉末和二甲双胍溶液置于玻璃管中并涡旋混合。用Tris-buffer溶液溶解，并调整体系的pH值至7.4，进行水合处理，即先用液氮快速冰冻，再将其从液氮转移至70°C环境中，反复循环5次，然后使用100nm孔径的聚碳酸酯膜机械反复挤出使之均一化，得到二甲双胍-PA/VD3甾醇脂质体。
（3）通过液相色谱仪检测挤出前棕榈酸-维生素D3-布洛芬水合溶液和挤出后的布洛芬-PA/VD3甾醇脂质体中布洛芬的含量，进而算出PA/VD3甾醇脂质体对布洛芬的包封率和载药量。
（4）利用葡聚糖柱（Sephadex G50）去除二甲双胍-PA/VD3甾醇脂质体溶液中游离的二甲双胍。
（5）通过液相色谱仪检测过柱前棕榈酸-维生素D3-二甲双胍水合溶液和过柱后的二甲双胍-PA/VD3甾醇脂质体中二甲双胍的含量，算出PA/VD3甾醇脂质体对二甲双胍的包封率和载药量。
结果如图3所示，棕榈酸/维生素D3甾醇脂质体对二甲双胍有高达84.53±1.75%的包封率和7.92±1.26%的载药量；对布洛芬有高达83.93±4.01%的包封率和13.91±1.51%的载药量。通过包载布洛芬可以有效止疼，包载二甲双胍可以协同治疗骨缺损，加强疗效。
实施例4
本实施例研究了实施例1制备的棕榈酸/维生素D3甾醇脂质体担载布洛芬或二甲双胍后的稳定性进行监测，担载布洛芬或二甲双胍的甾体脂质体的制备方法同实施例3。
（1）在室温环境下，用动态散射光连续14天监测布洛芬-PA/VD3甾醇脂质体和二甲双胍-PA/VD3甾醇脂质体的水合粒径，多分散系数及剪切面电位等数据。
（2）选择不同的时间点对布洛芬-PA/VD3甾醇脂质体做离心处理，因为布洛芬本身不溶于水环境，从PA/VD3甾醇脂质体中释放出的布洛芬必然游离在溶液中，通过离心的方式即可实现分离，并保存留样。
（3）利用过葡聚糖柱的方式，在不同时间点分离二甲双胍-PA/VD3甾醇脂质体中释放的二甲双胍，并保存留样。
（4）通过液相色谱仪检测（2）和（3）留样的布洛芬-PA/VD3甾醇脂质体和二甲双胍-PA/VD3甾醇脂质体，最终计算出布洛芬-PA/VD3甾醇脂质体和二甲双胍-PA/VD3甾醇脂质体的药物释放行为。对PA/VD3甾醇脂质体的药物释放行为进行了为期两周的监测，观察到PA/VD3甾醇脂质体包裹的布洛芬或二甲双胍在14天内稳定释放，分别释放了药物总量的39.48±0.82%与46.29±0.38%。以上实验结果说明PA/VD3甾醇脂质体具有优异的载药功能及药物缓释效果。
实施例5
以单链双亲小分子十八胺（Octadecylamine）为例，将十八胺与维生素D3按摩尔比4：6的比例溶解于由苯和甲醇组成的混合液中，通过冷冻干燥机抽空溶剂，使十八胺与维生素D3充分混合均匀。用Tris-buffer缓冲液溶解十八胺-维生素D3粉末，将混合溶液的pH值调整至7.4后做水合处理，先用液氮快速冰冻，再转移至70℃的环境中，加快分子热运动，然后涡旋振荡混匀，液氮-70℃-涡旋振荡的步骤反复循环5次，使用100nm孔径的聚碳酸酯膜机械反复挤出使之均一化，最终得到十八胺/维生素D3甾醇脂质体。该甾醇脂质体的粒径约为120nm，PDI＜0.3，Zeta电位约为40mV。
实施例6
分别采用二维平板培养和三维水凝胶培养的方法，培养小鼠成骨前体细胞（MC3T3-E1）。然后将实施例1制备的棕榈酸/维生素D3甾醇脂质体与MC3T3-E1细胞进行体外共培养，利用碱性磷酸酶染色、茜素红染色、相应的指数量化以及成骨标志物的表达情况评价甾醇脂质体的促成骨效果。具体包括：
1、二维平板培养
（1）碱性磷酸酶染色和茜素红染色实验
向24孔细胞培养板的每个孔加入1.5×104个小鼠成骨前体细胞（MC3T3-E1）铺板，在37°C，5%CO2的细胞培养箱中静置24小时。
待MC3T3-E1贴壁后更换培养基，加入用Alpha-MEM成骨诱导培养基配置的不同浓度的PA/VD3甾醇脂质体（0、0.2、0.5、1及2μg/mL），每两日更换一次条件培养基。分别在成骨诱导培养的第7天进行碱性磷酸酶染色及活性定量检测，第14天通过茜素红染色定量细胞外基质的钙盐沉积情况。
（2）实时荧光定量PCR检测
在24孔细胞培养板的每孔加入1.5×104个MC3T3-E1铺板，在37°C，5%CO2的细胞培养箱中等待后续处理。待MC3T3-E1贴壁后加入不同浓度的PA/VD3甾醇脂质体（0、0.2、0.5、1及2μg/mL），每两日更换一次条件培养基。然后用试剂盒法提取细胞样品总RNA，RNA逆转录后，采用试剂盒法进行实时荧光定量PCR检测，选择Gapdh作为内参基因，所得数据采用2-ΔΔCt进行计算分析基因表达相对水平。
（3）蛋白免疫印迹实验
在24孔细胞培养板的每孔加入1.5×104个MC3T3-E1铺板，在37°C，5%CO2的细胞培养箱中等待后续处理。待MC3T3-E1贴壁后加入不同浓度的PA/VD3甾醇脂质体（0、0.2、0.5、1及2μg/mL），每两日更换一次条件培养基。提取细胞中的蛋白，以5wt%的牛血清白蛋白溶液稀释抗体为一抗，以HRP标记的山羊抗小鼠或山羊抗兔为二抗，进行蛋白免疫印迹实验。
结果如图4所示，在二维培养板环境中，PA/VD3甾醇脂质体可以加速细胞成骨分化，各类成骨标志物的表达情况优于对照组，表现出显著的促进成骨分化效果。
3、三维水凝胶培养
（1）三维ALP染色、ALP定量与茜素红染色及定量
按2×106个/mL MC3T3-E1、10%GelMA水凝胶、不同浓度（0、0.5、1、2、3、4μg/mL）的PA/VD3甾醇脂质体制备成水凝胶-细胞培养体系，向每孔加入600μL的Alpha-MEM成骨诱导培养基，做成骨诱导处理。
每两天更换一次成骨诱导培养基，在培养过程中进行ALP染色、茜素红染色及相对的定量检测。
（2）实时荧光定量PCR检测
Trizol法提取成骨诱导培养后细胞的总RNA，RNA逆转录后，采用试剂盒法进行实时荧光定量PCR检测，选择Gapdh作为内参基因，所得数据采用2-ΔΔCt进行计算分析基因表达相对水平。
（3）蛋白免疫印迹实验
提取成骨诱导培养后细胞中的蛋白，以5wt%的牛血清白蛋白溶液稀释抗体为一抗，以HRP标记的山羊抗小鼠或山羊抗兔为二抗，进行蛋白免疫印迹实验。
结果如图5所示，在三维水凝胶培养体系中，PA/VD3甾醇脂质体可以加速细胞成骨分化，各类成骨标志物的表达情况也优于对照组。这证实了PA/VD3甾醇脂质体的体外促成骨性能。
实验结果表明，棕榈酸/维生素D3甾醇脂质体能够有效地促进MC3T3-E1的成骨分化进程。
实施例7
通过小鼠颅骨不可自愈合模型来验证实施例1制备的棕榈酸/维生素D3甾醇脂质体在体内治疗临界性骨缺损的效果，并选择甲基丙烯酸酐化明胶水凝胶作为生物支架。构建小鼠颅骨不可自愈合模型方法为：首先使用阿佛丁麻醉6周龄的雄性C57BL/6小鼠，然后在单侧顶骨上钻取全层颅骨缺损（直径3mm），缺损处加入20μL含有不同浓度的PA/VD3甾醇脂质体（0、100、200、400及600μg/mL）的甲基丙烯酸酐化明胶水凝胶，并在创口处用蓝光固化灯照射90秒促进凝胶，整个过程注意屏蔽自然光，以免影响到固化效果。手术6周后，断颈处死小鼠并取材颅骨，利用显微计算机断层扫描和组织学染色（苏木精-伊红染色和马松三色染色）评估PA/VD3甾醇脂质体体内治疗临界性骨缺损的效果。
结果表明，在造模6周后取材，Micro-CT量化后发现，棕榈酸/维生素D3甾醇脂质体组的新骨覆盖面积、骨小梁相对体积、骨小梁厚度和骨小梁数量比对照组（不含PA/VD3甾醇脂质体）明显升高，且骨小梁分离度下降（图6）；苏木精-伊红染色和马松三色染色显示棕榈酸/维生素D3甾醇脂质体处理组的骨缺损边缘间距变窄，附近有较多的新骨生成（图7）。说明本发明的棕榈酸/维生素D3甾醇脂质体可以用于临界性骨缺损的治疗。
以上所揭露的仅为本发明较佳实施例而已，当然不能以此来限定本发明之权利范围，因此依本发明权利要求所作的等同变化，仍属本发明所涵盖的范围。
Claims (9)
1.一种单链双亲小分子/维生素D3甾醇脂质体，其特征在于，是由单链双亲小分子化合物和维生素D3通过自组装而成的双分子层结构。
2.根据权利要求1所述的单链双亲小分子/维生素D3甾醇脂质体，其特征在于，所述单链双亲小分子化合物包括棕榈酸、十八胺、氯化十六烷基吡啶、1-磷酸鞘氨醇或十八烷基甲基亚砜中的一种。
3.根据权利要求1所述的单链双亲小分子/维生素D3甾醇脂质体，其特征在于，所述单链双亲小分子化合物为棕榈酸时，组装成的棕榈酸/维生素D3甾醇脂质体的水合粒径为113.98±13.78nm；棕榈酸/维生素D3甾醇脂质体的多分散系数为0.10±0.04；棕榈酸/维生素D3甾醇脂质体的剪切面电位为-31.91±1.86mV。
4.根据权利要求1所述的单链双亲小分子/维生素D3甾醇脂质体，其特征在于，所述单链双亲小分子/维生素D3甾醇脂质体还具有包载药物的功能，所述药物为亲水性药物或疏水性药物中的至少一种。
5.根据权利要求4所述的单链双亲小分子/维生素D3甾醇脂质体，其特征在于，所述单链双亲小分子/维生素D3甾醇脂质体对药物的包封率为86%以上；所述单链双亲小分子/维生素D3甾醇脂质体对药物的载药量为9%以上。
6.一种权利要求1~5任意一项所述的单链双亲小分子/维生素D3甾醇脂质体的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
调节有单链双亲小分子化合物和维生素D3的混合物的缓冲液的pH值至7.0~7.6，得到第一悬浊液；再将所述第一悬浊液进行水合反应，制得单链双亲小分子/维生素D3甾醇脂质体。
7.根据权利要求6所述的单链双亲小分子/维生素D3甾醇脂质体的制备方法，其特征在于，所述单链双亲小分子化合物和所述维生素D3的摩尔比为（2~4）：（6~8）。
8.根据权利要求6所述的单链双亲小分子/维生素D3甾醇脂质体的制备方法，其特征在于，所述水合反应具体包括如下步骤：
S1、使用液氮冰冻所述第一悬浊液得到冰冻体；
S2、将所述冰冻体放入65℃~70℃的环境中解冻；
S3、重复步骤S1~S2在5次以上，即得。
9.一种如权利要求1~5任意一项所述的单链双亲小分子/维生素D3甾醇脂质体或如权利要求6~8任意一项所述的制备方法制备的单链双亲小分子/维生素D3甾醇脂质体在制备骨缺损或骨折药物中的应用。
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| CN118078755A true CN118078755A (zh) | 2024-05-28 |
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|---|---|---|---|
| CN202410472102.7A Pending CN118078755A (zh) | 2024-04-19 | 2024-04-19 | 一种单链双亲小分子/维生素d3甾醇脂质体及其制备方法和应用 |
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| Country | Link |
|---|---|
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Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101116668A (zh) * | 2006-08-04 | 2008-02-06 | 许正 | 亲细胞非均质分子脂质,其制备方法及其制药用途 |
| CN101491499A (zh) * | 2009-02-19 | 2009-07-29 | 陶灵刚 | 注射用12种复合维生素脂质体及其制备方法 |
| EP2638896A1 (en) * | 2012-03-14 | 2013-09-18 | Bioneer A/S | Cationic liposomal drug delivery system for specific targeting of human cd14+ monocytes in whole blood |
-
2024
- 2024-04-19 CN CN202410472102.7A patent/CN118078755A/zh active Pending
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101116668A (zh) * | 2006-08-04 | 2008-02-06 | 许正 | 亲细胞非均质分子脂质,其制备方法及其制药用途 |
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| EP2638896A1 (en) * | 2012-03-14 | 2013-09-18 | Bioneer A/S | Cationic liposomal drug delivery system for specific targeting of human cd14+ monocytes in whole blood |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 程若昱, 崔文国: "基于氢键力学增强型维生素D3脂质体复合水凝胶的构建及骨修复研究", 高分子学报, vol. 10, 31 October 2018 (2018-10-31), pages 1315 - 1327 * |
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