FI91753B - Menetelmä terapeuttisesti käyttökelpoisen telluuripitoisen kompleksin valmistamiseksi - Google Patents

Description

91753

Menetelmä terapeuttisesti käyttökelpoisen telluuripitoisen kompleksin valmistamiseksi US-patenttihakemuksessa, jonka sarjanumero on 5 782 129 ja joka on jätetty 30.9.1985, ja joka liitetään tähän viitteellä, kuvataan tiettyjä orgaanisia telluuri-ja seleeniyhdisteitä, jotka ovat aktiivisia in vitro ja in vivosytokiinien tuotannossa. Nämä yhdisteet ovat myös käyttökelpoisia joissakin sarjanumeron 782 129 patenttiha-10 kemuksessa esitetyissä sairauksissa. Eräs näiden telluuri-ja seleeniyhdisteiden ominaisuus on se, että ne ovat suhteellisen liukenemattomia vesipitoiseen väliaineeseen, mikä aiheuttaa hankaluuksia valmistettaessa ruoansulatuskanavan ulkopuolelle annettavia farmaseuttisia koostumuk-15 siä. Patentinhakijat ovat todenneet, että tietyt polykar-boksyylihapot muodostavat stabiilin kompleksin tiettyjen orgaanisten telluuri- ja seleeniyhdisteiden kanssa.

Siten tämän keksinnön avulla saadaan ensisijaisesti uusia komplekseja, jotka muodostuvat tietyistä orgaanisis-20 ta telluuriyhdisteistä sekä myrkyttömistä kompleksin muodostavista aineista, joilla on suuri liukenevuus veteen.

Keksintö koskee menetelmää terapeuttisesti käyttökelpoisen telluuripitoisen kompleksin valmistamiseksi, joka muodostuu farmaseuttisesti hyväksyttävästä kompleksin ·.; 25 muodostavasta aineesta ja yhdisteestä, jonka kaava on 0-ch2 C^Te^ NH4+ (A) 30 \ o-ch2 Nämä yhdisteet pystyvät indusoimaan IL-2:n muodos-35 tumisen kuin myös IL-2-tuottajasolujen lisääntymisen sekä IL-2-reseptorikohtien aktivoimisen.

2 91753

Keksinnölle on tunnusomaista, että kaavan A mukainen yhdiste saatetaan reagoimaan sitraatti- tai tartraat-tipuskurin kanssa, joka muodostaa veteen liukenevan kompleksin mainitun telluuriyhdisteen kanssa.

5 Sopivia kompleksin muodostavia aineita ovat hydrok- sipolykarboksyylihapot, polykarboksyylihapot tai polyhyd-roksipolykarboksyylihapot. Tavallisesti on edullista valmistaa keksinnön mukaiset kompleksit saattamalla kaavojen A-E mukainen yhdiste reagoimaan sellaisen puskurisysteemin 10 kanssa, joka sisältää joko sitruuna- tai viinihappoa sekä sen vastaavaa alkalimetallisuolaa, kuten natrium- tai ka-liumsuolaa.

Yleensä voidaan yhdistää ekvimolaariset määrät happoja ja vastaavia alkalimetallisuoloja, jotka ovat vesi-15 liuoksissa, kaavan A mukaisen yhdisteen kanssa, jolloin muodostuu keksinnön mukainen kompleksi; 0,05 M - 0,5 M konsentraatiot puskuria ovat edullisia, mutta voidaan käyttää suurempia tai alhaisempia määriä, edellyttäen, että konsentraatio on riittävä tietyn kaavan A mukaisen 20 yhdisteen liuottamiseksi. Voidaan käyttää suurempia mooli-määriä, jolloin saadaan konsentraatioita, jotka voidaan laimentaa ennen suonensisäisesti antamista, tai ennen muiden lääkemuotojen valmistamista. Kaavan A mukaisen yhdisteen määrä riippuu tuotteen lopullisesta käytöstä. On to-•t 25 dettu, että sitraatin tapauksessa ammoniumtrikloori-(diok-soetyleeni-0,0')-telluraatin konsentraatioita, jotka ovat 5 mg/ml ja suurempia, voidaan liuottaa esillä olevan keksinnön mukaisesti. Fosfaattipuskurin (PBS) tapauksessa on päinvastoin, ja siitä voidaan liuottaa ainoastaan 200 pg/-30 ml ammoniumtrikloori-(dioksoetyleeni-0,0')-telluraattia.

On edullista käyttää kompleksin vdsiliuosta suoraan otta- • · matta talteen ja uudelleen liuottamalla kompleksia. Kompleksi on stabiili jäätyneenä, jääkaappilämpötilassa, huoneenlämpötilassa tai kohotetuissa lämpötilassa tai kohote-35 tuissa lämpötiloissa. Keksinnönmukaiset yhdisteet voidaan antaa nisäkkäille hoidettaessa syöpää, immuunipuutoksia, I: 91753 3 sairauksia, joissa tapahtuu imunoituminen omaa kudosta vastaan, sekä infektiosairauksissa, käyttäen kullekin tilalle tehokkaita määriä. Hoidolla lievitetään näiden sairauksien oireita siten, että nisäkkään keho saadaan tuot-5 tamaan suurempia määriä lymfokiinejä. Keksintöön sisältyy myös sytokiinien, kuten lymfokiinien ja/tai niiden reseptorien, lisääntynyt tuotantomäärä in vitro, sekä näiden aineiden käyttö terapeuttisina aineina, jotka annetaan nisäkkäille syövän, immuunipuutostilojen ja infektiosai-10 rauksien lievittämiseen. On mahdollista, että keksinnön mukaista koostumusta voidaan käyttää yhdessä muiden syö-vänvastaisten kemoterapeuttisten aineiden, kuten syklofos-famidin kanssa.

Termillä "syöpä" tarkoitetaan leukemiaa ja kiintei-15 tä kasvaimia, jotka syntyvät spontaanisti, ovat karsinogeenisen aineen, säteilytyksen tai onkoviruksien aiheuttamia. Nämä tilat ovat asiantuntijoiden tietämiä, ja sellaisia ovat munuaiskasvaimet, luukasvaimet, ruoansulatuskanavan kasvaimet, aivokasvaimet, rintakasvaimet, ihokas-20 vaimet, keuhkokasvaimet, munasarjakasvaimet, virtsa-sukuelin- ja vastaavat kasvaimet. Merckin käsikirjan 13. painoksessa, Merck & Co. (1977), kuvataan monia tällaisia tiloja. Julkaisun sivut 647-650; 828-831; 917-920; 966; 970-974; 1273, 1277, 1271-1376; 1436-1441; 1563; 1612-1615 .· 25 liitetään tähän viitteellä.

Termillä "immuunipuutossairaudet" kuvataan erilaisia tilaryhmiä, kuten hankittua immuunikato-oireyhtymää (AIDS), jolle on pääasiallisesti tunnusomaista lisääntynyt alttius erilaisille infektioille, joista sesuraa vakava 30 akuutti, uusiutuva tai krooninen sairaus, joka johtuu yhdestä tai useammasta häiriöstä spesifisessä tai ei-spesi-fisessä immuunijärjestelmässä. Merckin käsikirjan 13. painoksessa sivuilla 205-220 kuvataan monia näistä tiloista, ja sivut liitetään tähän viitteellä.

35 Termi "sairaudet, joissa tapahtuu immunoituminen omaa kudosta vastaan" käsittää häiriöt, joissa immuunijär- 4 91753 jestelmä tuottaa omavasta-aineita endogeeniselle antigeenille, minkä seurauksena kudokset vaurioituvat. Sivuilla 241-243 Merckin käsikirjan 13. painoksessa kuvataan tällaisia tiloja, ja ne liitetään tähän viitteellä.

5 Termillä "infektiotaudit" tarkoitetaan sellaisia patologisia tiloja, jotka ovat bakteeri-, virus- tai sie-niorganismien aiheuttamia, mainittujen organismien tunkeutuessa nisäkkään kehoon ja sekoittaessa kehon normaalitoiminnan. Merckin käsikirjan 13. painoksessa sivuilla 3-149 10 kuvataan tällaisia tiloja ja ne liitetään tähän viitteellä.

Yhdisteet voidaan antaa suun kautta, ruoansulatuskanavan ulkopuolelle, ihon läpi, paikallisesti tai limakalvoille. Yhdisteet voidaan antaa suun kautta kovissa tai 15 pehmeissä nestemäisissä geelikapseleissa, liuoksissa tai suspensiokapseleissa, tai tableteissa, jotka voidaan valmistaa käyttäen tunnettuja apuaineita, sideaineita, hajoi-tus-ja vastaavia aineita. Ruoansulatuskanavan ulkopuolelle annettaessa lääke voidaan antaa lihakseen, suoneen, ihoon, 20 käyttäen pitkitetysti vapautuvaa kantaja-ainetta, tai ihon alle. Yhdisteiden, jotka ovat yhdistelminä farmaseuttisen kantaja-aineen kanssa, konsentraatio ei ole kriittisen tarkka ja se voidaan valita. Julkaisussa Remington's Practise of Pharmacy, 9., 15. tai 16. painoksessa kuvataan ·. 25 erilaisia farmaseuttisia kantaja-aineita, ja ne liitetään tähän viitteellä.

On todettu, että jotkut telluuriyhdisteet, jotka ovat käyttökelpoisia keksintöä toteutettaessa, hydrolysoituvat vedessä. Nämä hydrolysoituvat koostumukset ovat ak-30 tiivisia in vivo ja in vitro, vaikka hydrolysoituneet koostumukset lopulta hajoavat ja menettävät kykynsä ai- • · kaansaada lymfokiinien erittyminen. Tästä syystä koostumukset tulee valmistaa juuri ennen käyttöä. Jos yhdisteet annetaan suun kautta kuivassa muodossa, ne indusoivat te-35 hokkaasti lymfokiinien tuotannon. Yhdisteet tulisi edul- 5 91 753 lisesti pitää vedettömissä olosuhteissa käyttöhetkeen asti.

On todettu, että tietyt yhdisteet, kuten Te02, yksistään indusoivat lymfokiinien tuotantoa tuottaja-T-solu-5 lymfosyyteissä in vitro ja in vivo, mutta ne eivät saa aikaan lymfokiinien lisääntymistä tuottajasoluissa, kuten IL-2-tuottajasoluissa, eivätkä ne aktivoi reseptorikohtia vsataaja-T-solulymfosyyteissä. Siten keksinnön avulla on lisäksi mahdollista käyttää yksistään Te02- ja telluuriyh-10 disteitä, jotka ovat aktiivisia lymfokiini-indusoijina.

Kun liuoksia, joissa oli esimerkin 1 mukaista sit-raattikompleksia, oli säilytetty eri lämpötiloissa noin kaksi ja puoli kuukautta, niistä valmistettiin laimennokset, ja hiiren pernakoe suoritettiin seuraavasti: 15 Pernat poistettiin Balb-c uroshiiristä, jotka oli vat 6-8 viikon ikäisiä. Pernasolut työnnettiin ruostumattomasta teräksestä valmistettujen, 60-seulakokoisten (US-standardi) verkkojen läpi, ja verkot olivat petrimaljois-sa, jotka sisälsivät PBS solujen erottamiseksi. Solut ke-20 rättiin sitten sentrifugiputkiin ja niitä pyöritettiin nopeudella 1000 kierrosta/min 10 minuutin ajan. Sakan yllä oleva neste poistettiin ja soluja käsiteltiin 5 ml:11a hypotonista puskuria (0,15M, NH4C1; 0,01M KHC03 liuotettuna kahdesti tislattuun veteen, pH 7,2) täsmälleen kahden • 25 minuutin ajan. Sen jälkeen soluihin lisättiin PBS:ä1 ja koeputkia sentrifugoitiin 10 minuutin ajan nopeudella 1000 kierrosta/min. Solut huuhdeltiin kahdesti ja laskettiin hemosytometrillä, käyttäen trypaanisinistä elinkykyisyyden testaamiseksi. Solujen konsentraatio saatettiin arvoon 107 30 elävää solua/ml.

6 91753 *NaCl 8,0 g KC1 200 mg

Na2HP04 1150 mg KH2P04 2 00 mg

5 CaCl2 ei kirkas) 100 mg/L

MgCl26H20 100 mg/L

HzO riittävästi, jotta koko naistilavuudeksi saadaan 1 litra 10

Solut saatettiin yhteen PMA:n, jota oli 25 mg/ml, sekä vedessä olevan kompleksin, jota oli vaihtelevia määriä, kanssa. Sen jälkeen soluja inkuboitiin 37°C:ssa, 7,5 % C02:ssa 96 tuntia. Sakan yllä oleva neste otettiin talteen 15 ja sen lL-2-aktiivisuus tutkittiin käyttäen tritioitua tymidiiniä (3H-TdR). Tulokset kokeista, jotka suoritettiin 25 % ja 12,5 % sakan yllä olevalle nesteelle, esitetään täysinä lukuina miljoonassa (cpm) beta-tuikelaskimessa, ja ne esitetään taulukossa 1. Taulukossa 1 esitetään IL-2-20 vaikutuksen induktio, joka saadaan eri kompleksimäärillä. 1 « • · 7 91753

Taulukko 1

Ammoniumtri- Sakan yllä oleva neste (%) kloori-(dioksi-5 eteeni-0,0')- telluraatti yUg/ml _______ug/ml__25%_12 ,5 %_ 0,05 0.5 76133 99350 10 sitraatti

0.1 91022 6 5 51 S

0,05 5450 1723

0,1 0,5 65632 5077S

15 sitraatti 0,1 55127 27562 0 105 3432 1597 vertailu- 0,5 43333 35270 20 liuos, jos- . 9P-.T' sa PBS 0il 4^/c 2^-“ ++ 0,05 3/62 1565

Mg Ca * plasebo 1:10 -0- 5157 2373 1: 40 -0- 4 0S5 4172 25 1: 100 -0- 3320 21 92 91753 δ Nämä kokeet osoittavat että sitraattikompleksi on yhtä tehokas kuin ei-kompleksoitu vertailuyhdiste.

Esimerkin 2 mukaisen kompleksin tehokkuus stimuloida IL-2-tuotantoa määritettiin hiiren pernakokeella. Tu-5 lokset esitetään taulukossa 2.

Taulukko 2

Ammonium- Sakan yllä oleva neste trikloori- . .

(deoksietee- (cpm) 10 ni-0,0')- telluraatti (^ug/ml) _ n g /r, 1___25%_12,5%__ 0,0 2M G, 5 64563 58015 15 tartraatti- 11258 5722 puskuri ! 0.05 1152 887 f 0,04M 0rE 1513 610 tartraatti- „ , 0-,n - r c ,· C.l 2 o 10 1 d 9 8 puskuri ’ 20 Q f 05 1423 665 vertailu- 0,5 43233 35270 liuos, jos- - ^3-c 2SCr = sa PBS ^i1 - - j /c

Mg++& Ca++ C>C5 3762 1255 • 25

Vertailuesimerkki

Ammoniumtrikloori-(dioksoetyleeni-O,O’ )-telluraatin sitraatti- ja tartraattikompleksien stimulointivaikutusta tutkitaan ihmisen yksitumaisille soluille.

30 Laskimokokoverta (jossa on mukana hepariinia; Evans ;; 10 IU/ml verta) laimennetaan RPMIillä suhteessa 1:1. Lai mennettu veri asetetaan varovasti Lymphoprepille (Nylgard & Co., Oslo, Norja, tiheys 1,077 g/ml), kaksi osaa laimennettua verta yhdelle osalle Lymphoprepiä. Kussakin put-35 kessa on 3 ml Lymphoprepiä ja 6-7 ml laimennettua verta.

i 91753 9

Putkia sentrifugoidaan 30 minuuttia nopeudella 1600 kier-rosta/min. huoneenlämpötilassa. Sentrifugoinnin jälkeen yksitumaiset solut kerätään talteen faasien välisestä fraktiosta ja ne pestään RPMI:llä kolme kertaa. Solut sus-5 pensoidaan uudelleen RPMI:hin, ne lasketaan hemosytomet-rissä käyttäen trypaanisinistä elinkykyisyyden testaamiseen, ja sitten niiden konsentraatio saatetaan arvoon 1 x 10-6 solua/ml rikstetussa RPMI:ssä. Taulukossa 3 esitetyt konsentraatiot lisättiin tilavuutena, jossa oli 10 % solu-10 seosta. 0,2 ml:n tasamäärät kustakin näytteestä laitettiin mikrolevyjen (NUNC) koloihin (triplikaatit). Mikrolevyjä inkuboidaan 72 tuntia 37°C:ssa, minkä jälkeen viljelmiin lisätään 3H-metyylitymidiiniä, 1U Ci/kolo (Nuclear Research Center, Israel). Soluja inkuboitiin vielä yön yli, ja 15 ne kerättiin talteen solujen keräyslaitteella. Lisääntyminen mitattiin beta-tuikelaskimella ja tulokset esitetään taulukossa 3.

Taulukko 3

Ammoniumtrikloori- PMA 1,5 ng/ml 0,5 ng/ml 20 (deoksieteeni-0,0')- soluja soluja pg/ml 0,02M 0,5 1418 1680 25 iSSSr1- 0,1 0,05 22883 12800 0,04 0,5 2762 527 tartraatti- 20713 12990 puskuri i 30 0,005 15327 16782 • « 0,05 0,5 1822 745 sitraatti 49402 8713 0,05 3937 5298 35 vertailu- 0,5 3287 2945 : PBS°S 0,1 42857 19810

Mg+ & Ca++ °<05 12923 6553 10 91753

Paikallisesti annettavat koostumukset voidaan valmistaa dispergoimalla yhdisteet hydrofiiliseen tai hydrofobiseen kosmeettiseen perusaineeseen. Paikallisesti annettavia koostumuksia ovat nesteet, voiteet, emulsiovoi-5 teet, liuokset, geelit ja pastat. Voidaan käyttää vaseliinia tai kaupallisia valmisteita, kuten Oil of Olay'ta. Konsentraatio voi olla 0,0001 - 10 paino-%.

Annokset keksinnön mukaisia yhdisteitä joita käytetään stimuloimaan lymfokiinituotantoa tai joilla hoide-10 taan tiettyjä tässä kuvattuja sairaustiloja, voivat vaihdella riippuen tietystä sairaudesta ja sairauden vaiheesta. Yleisesti annettava yhdistemäärä on 0,05 x 10‘3 - 1 x 10'3 g/kg, ja edullisesti se on 0,1 x 10'3 - 0,5 x 10"3 g/kg ruumiinpainoa kohti. Esimerkiksi annostus, joka on 1-3 15 mg/päivä 75 kiloiselle nisäkkäälle, on mahdollinen riittävä määrä lymfokiinituotannon aikaansaamiseksi, mutta annostus voidaan sovittaa yksittäisen vastareaktion ja tietyn hoidettavan tilan mukaan. Hoidettaessa AIDSia, voidaan antaa 1,0-9,0 mg/m2 suonensisäisesti kolme kertaa vii-20 kossa. Lisäksi keksinnön mukainen yhdiste voidaan antaa samanaikaisesti aineiden, kuten 9-(1,3-dihydroksi-2-prop-oksimetyyli)guaniinin (DHPG) ja/tai AZT:n kanssa.

Sen lisäksi, että yhdisteitä voidaan käyttää tässä edellä kuvattujen nisäkkäiden häiriöiden hoitoon, niitä 25 voidaan käyttää eläinlääkinnässä hoidettaessa virus- ja immuunisairauksia hevosissa, sorkkaeläimissä ja siipikarjassa. Näitä häiriöitä voidaan hoitaa siten, että käytetään samoja määriä yhdisteitä kuin hoidettaessa tässä edellä kuvattuja nisäkkäiden häiriöitä.

30 Käytettäessä in vitro, solut voidaan stimuloida tuottamaan lymfokiinejä, käyttämällä 1 x 10‘8 - 1 x 10"4, edullisesti 1 x 10~7 - 1 x 10‘5 g yhdistettä solumäärää 106 solua/ml kohti.

Alustavissa hiirillä tehdyissä myrkyllisyyskokeis-35 sa on saatu LD50-arvoksi 300 pg/25 g ruumiinpainoa kohti 91753 11 kuusiviikkoisissa hiirissä, testattaessa esimerkin 1 yhdistettä. Yhdisteitä voidaan käyttää antibakteerisina ja virusvastaisina aineina kasveissa ja eläimissä. Virusinfektiot, kuten Länsi-Niilin virusinfektiot hiirissä ovat 5 herkkiä esimerkin 1 yhdisteelle annoksella, joka on 10 pg/päivä/hiiri. Kasvien bakteeri-infektioita, kuten äkä-mäbakterioosia, jonka aiheuttaa Agrobacterium tumefaciens, voidaan hoitaa tai ennaltaehkäistä levittämällä 0,1 % liuosta, jossa on keksinnön mukaisia yhdisteitä.

10 Esimerkki 1

Valmistetaan kaksi sitraattipuskuriliuosta yhdistämällä 0,05 M natriumsitraatin vesiliuos ja 0,05 M sitruunahappo, tai 0,01 M natriumsitraatti ja 0,1 M sitruunahappo. pH on noin 4, riippuen lisättävän yhdisteen A 15 määrästä. Näihin liuoksiin lisätään korkeintaan 5 mg/ml ammoniumtrikloori-(dioksoetyleeni-O,O')-telluraattia.

Esimerkki 2 Käyttäen esimerkin 1 menetelmää valmistetaan 0,02 M tatraattipuskuri 0,02 M viinihaposta ja 0,02 M kaliumtart-20 raatista, ja mainittuja aineita on suhteessa 1:4. Samaa menetelmää käyttäen valmistetaan myös 0,04 M tartraatti-puskuri. Kompleksi muodostetaan lisäämällä ammoniumtrikloori- (dioksoetyleeni-O, 0' )-telluraattiatartraattipusku-rin vesiliuokseen.

• ·

Claims (3)

12 91753

1. Menetelmä terapeuttisesti käyttökelpoisen kompleksin valmistamiseksi ammoniumtrikloori-(dioksoetyleeni- 5 0,0')-telluraatista, jonka kaava on o-ch2 Cl3Te/ NH4+ (A) 10. o-ch2 ^ sekä myrkyttömästä farmaseuttisesti hyväksyttävästä kompleksin muodostavasta aineesta, tunnettu siitä, 15 että kaavan A mukainen yhdiste saatetaan reagoimaan sit-raatti- tai tartraattipuskurin kanssa, joka muodostaa veteen liukenevan kompleksin mainitun telluuriyhdisteen kanssa.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, t u n-20 n e t t u siitä, että kompleksi sisältää sitraatti-ionin.

3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että kompleksi sisältää tartraatti-ionin. 1 «. 91753 13