FI91645C - Vetyperoksidia (H202) muodostava sarkosinoksidaasi, sen valmistaminen ja käyttö - Google Patents
Vetyperoksidia (H202) muodostava sarkosinoksidaasi, sen valmistaminen ja käyttö Download PDFInfo
- Publication number
- FI91645C FI91645C FI862258A FI862258A FI91645C FI 91645 C FI91645 C FI 91645C FI 862258 A FI862258 A FI 862258A FI 862258 A FI862258 A FI 862258A FI 91645 C FI91645 C FI 91645C
- Authority
- FI
- Finland
- Prior art keywords
- sarcosine
- sarcosine oxidase
- enzyme
- creatinine
- phosphate
- Prior art date
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
- C12N9/0012—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7)
- C12N9/0026—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7) acting on CH-NH groups of donors (1.5)
- C12N9/0032—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7) acting on CH-NH groups of donors (1.5) with oxygen as acceptor (1.5.3)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/26—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving oxidoreductase
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
- Y10S435/8215—Microorganisms
- Y10S435/822—Microorganisms using bacteria or actinomycetales
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
- Y10S435/8215—Microorganisms
- Y10S435/822—Microorganisms using bacteria or actinomycetales
- Y10S435/841—Chainia
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
- Y10S435/8215—Microorganisms
- Y10S435/822—Microorganisms using bacteria or actinomycetales
- Y10S435/886—Streptomyces
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
- Y10S435/8215—Microorganisms
- Y10S435/822—Microorganisms using bacteria or actinomycetales
- Y10S435/908—Streptovirticillium
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Detergent Compositions (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Cosmetics (AREA)
Description
1 91645
Vetyperoksidia (H2C>2) muodostava sarkosinoksidaasi, sen valmistaminen ja kåytto
Tama keksinto kohdistuu uuteen sarkosinoksidaasiin, jonka stabiilisuus (såilyvyys) on parempi tunnettuihin sarkosii-nia hapettaviin entsyymeihin verrattuna, erityisesti pinta-aktiivisia aineita sisaltåvissa analyysireagensseissa.
Sarkosinoksidaaseja (E.C. 1.5.3.1) voidaan kayttaå muun muassa sarkosiinin, kreatiinin ja kreatiniinin entsymaat-tiseen måårittåmiseen. Erityisesti seerumin, plasman tai virtsan sisaltamån kreatiniinin entsymaattisen maårityksen merkitys kasvaa kliinisessa diagnostiikassa. Yhdistamalla entsyymien kreatiniiniamidohydrolaasi (E.C. 3.5.2.10), kreatiiniamidinohydrolaasi (E.C. 3.5.3.3) ja sarkosinoksidaasi katalysoimat reaktiot kreatiniinista saadaan lopulta muodostumaan vetyperoksidia H202 stokiometrisessa suhteessa 1:1, joka H202 voidaan maarittaa yksinkertaisella tavalla kolorimetrisesti; lukuisat kromogeeniset jarjestelmat, esi-merkiksi "Trinder-tyyppiset" jarjestelmat (katso Bergmeyer, "Methoden der enzymatischen Analyse", 4. painos, nide 1 (1983) sivu 197) ovat osoittautuneet erityisen sopiviksi nåi-hin kolorimetrisiin maarityksiin, joissa 4-aminoantipyrii-nista ja fenolisesta tai aniliinisesta kytkijasta saadaan aikaan peroksidaasin lasnaollessa variaine vetyperoksidin H202 avulla hapettaen, ja taman variaineen maara (tai inten-siteetti) riippuu lineaarisesti muodostuneesta H202-maarasta.
Tallaisella sarkosinoksidaasin reaktioon perustuvalla kreatiniinin maaritysmenetelmalla on tunnettuihin entsymaatti-siin kreatiniinikokeisiin (Bergmeyer, "Methoden der enzymatischen Analyse", 3. painos, nide II (1974) sivu 1834; Tanganelli et al. Clin. Chem. 2%^ (1983) sivu 1461) verrattuna se etu - kulloinkin kaytetyn varikytkijan tyvpin mu-kaan - etta maarityksen herkkyys on selvasti parempi, mika 2 91645 on erittain merkityksellistå analyysin tarkkuudelle juuri siita syystå, etta seerumin sisaltaman kreatiniinin pitoi-suus on alhainen diagnoosin tekoa ajatellen mielenkiintoi-sella alueella (44 - 97 ^umol/1). Taman lisaksi naiden kro-mogeenisten aineiden sailyvyys kaytetyissa neutraaleissa, vesipitoisissa valiaineissa on myos parempi kuin UV-maari-tyksissa kaytetyn NADH-indikaattorin sailyvyys. Kreatiniinin maarittamiseen vielå nykyaankin tavallisimmin kaytetta-vaan Jaffén rutiinimenetelmaan (Hoppe Seyler's Z. Physiol. Chem. _1_0 (1886) 391 ) verrattuna taman menetelman spesifi- syys on lisaksi olennaisesti suurempi, ja nain olien sen diagnostinen merkitsevyys on parempi; ja lopuksi, sita kay-tettaessa våltytaan syovyttavien, vahvasti alkalisten reagenssien kasittelylta.
Sarkosinoksidaasin kaytto esimerkiksi kreatiniinin maarittamiseen edellyttaa kuitenkin sita, etta sen varastointista-biilisuus kayttovalmiissa reagenssissa on riittava vahin-taan useampien vuorokausien ajan 0-25°C:n lampotilassa, ja ettei sen aktiivisuus pienene merkittavasti silloinkaan, kun mittaus toteutetaan korotetuissa lampotiloissa (30-37°C) valttamattomia vahimmaisreaktioaikoja kayttåen. Koska kliini-sessa kemiassa kaytettyna naytemateriaalina on usein sameita, triglyserideja runsaasti sisaltavia seerumeita, niin entsy-maattiset analyysireagenssit sisaltavat mieluiten myos lisaksi niinkutsuttuja kirkastusjarjestelmia, jotka useimmi-ten kasittavat lipaasien ja ionittomien pinta-aktiivisten aineiden (polyoksietyloitujen alkyyli- tai aralkyylialkoho-lien) yhdistelmia seka liukenemisen valittajina sappihappo-jen suoloja, kuten Na-kolaattia, jotka kirkastusjarjestel-• mat mahdollistavat jopa voimakkaastikin lipeemisten (rasva- pitoisten) naytteiden hairiottoman optisen mittaamisen.
Nain olien, jotta esimerkiksi kreatiniinin maarittaminen voitaisiin toteuttaa myos tallaisista sameista naytteista, on valttamatonta, etta sarkosinoksidaasi kykenee edella mai-nituissa varastointi- ja reaktio-olosuhteissa riittavassa ll 91645 3 maårin vastustamaan pinta-aktiivisten aineiden aikaansaamaa denaturoitumista tax inaktivoiturnista.
Edelleen on toivottavaa, ettå sarkosinoksidaasilla on sopi-vat entsymaattiset ominaisuudet, kuten esimerkiksi sarkosii-nin kohdalla alhainen Michaelis-vakio seka suuri suurin mah-dollinen reaktiivisuus, silla myos nåmå ominaisuudet vaikut-tavat olennaisesti reaktioaikaan sarkosiinin, kreatiinin ja kreatiniinin entsymaattisissa maarityksissa. Koska esimerkiksi kreatiniinin entsymaattinen maaritys tulisi voida to-teuttaa myos korkeissa lampotiloissa (37°C) ja pinta-aktiivisten aineiden seka liukenemisen valittajien låsnåollessa, niin sopivat entsymaattiset ominaisuudet ovat juuri naiden epåedullisten ymparistoolosuhteiden tapauksessa merkityksel-liset.
Vastaavat tutkimukset osoittavat, ettei tunnetuilla sarko-sinoksidaaseilla ole tallaisissa pinta-aktiivisia aineita sisaltavissa analyysireagensseissa naiden vaatimusten edel-lyttamaa riittavaa varastointistabiilisuutta ja/tai saily-vyytta korotetuissa reaktiolampotiloissa.
Nain olien olemassa on tarve saada aikaan sarkosinoksidaasi, jolla on edella mainitut ominaisuudet, ja joka erityisesti tayttaa stabiilisuudelle asetetut vaatimukset.
Tama tehtava ratkaistaan keksinnon mukaisesti kayttamålla Streptomycetaceae-organismista saatua sarkosinoksidaasia. Taman vetyperoksidia ^2^2 muo<^os^avan entsyymin aktiivisuus sen jalkeen, kun sita on seisotettu kaksi vuorokautta 25uC:n lampotilassa, pitoisuudeltaan 0,15 mol/1 olevassa K-fosfaat-tiliuoksessa, pH 7,9, pinta-aktiivisten aineiden lasnaollessa on viela vahintaan 40 % alkuperaisesta aktiivisuudesta. 37°C:n lampdtilassa, pinta-aktiivisia aineita sisaltavassa valiaineessa taman entsyymin K^-arvo sarkosiinin kohdalla on 2-4 mmol/1. Tunnettujen ja tahan maaritykseen riittavan 91645 4 stabiilien sarkosinoksidaasien K^-arvot ovat sita vastoin naissa olosuhteissa suurin piirtein alueella 16-20 mmol/1.
Keksinnon mukaista entsyymiå on 15ydettåvissa kaikista suvun Streptomycetaceae lajeista (The Prokaryotes, Vol. II (1981), 2028), esimerkiksi lajeista Chainia purpurogena DSM 43 156, Chainia ochraceae DSM 43 155, Streptomyces flocculus DSM 40 327, Streptoverticillium sp. DSM 40 237 ja Kitasatoa purpurea DSM 43 362.
Keksinnon mukainen entsyymi koostuu neljastå erilaisesta alayksikosta. Sen molekyylipaino on noin 170 kD.
Entsyymi on stabiili pH-alueella 6-9 seka lampotiloissa, jotka ovat alle 40°C. Se inaktivoituu 15 minuutin kuluessa 50°C:n lampotilassa. Sen reaktion optimilampotila on noin 37°C, ja pH-optimi on suurin piirtein pH-arvossa 8,0. Hyva substraattispesifisyys nahdaan siita, etta ainoastaan pieni måårå substraattianalogeja reagoi; taten entsyymin reaktii-visuus esimerkiksi N,N-dimetyyliglysiinin kanssa on vain 1 % sarkosiinille spesifisesta reaktiivisuudesta.
Sarkosiinin kohdalla 25°C:n lampotilassa ja erilaisissa epa- edullisissa reagensseissa mitatut K^-arvot (fosfaattipuskuri; TES-puskuri) ovat suurin piirtein alueella 2-3 mmol/1.
V -arvo on noin 6 U/mg proteiinia. Seuraavassa taulu- kossa I esitetaan keksinnon mukaisen entsyymin erilaisilla preparaateilla saadut, seka 25 etta 37°C:n lampotilassa
mitatut K.-arvot sarkosiinin kohdalla. Taulukossa esitetaan M
vertailun vuoksi vastaavat, tunnetulla Bacillus-entsyymilla saadut arvot.
li 5 91645
Taulukko I
Sarkosinoksidaasin T (°C) Puskuri %-arvo (mmol/1) sarko-alkupera siinin tapauksessa, maa- ritetty epaedullisesta _reagenssista a_
Chainia purpurogena (DSM 43156)
Puhdas entsvymi 25 fosfaatti 2 " 37 3,5 " 25 TES 2,8 " 37 " 3
Chainia purpurogena Supernatantti raaka- uutteesta 37 Fosfaatti 3 " 37 TES 3
Chainia ochraceae (DSM 43 155)
Supernatantti raaka- uutteesta 37 Fosfaatti 3,5 " 37 TES 3,6
Streptomyces flocculus (DSM 40327)
Supernatantti raaka- uutteesta 37 TES 3,5
Bacillus sp.
25 Fosfaatti 16 • " 25 TES 20 " 37 Fosfaatti 18 " 37 TES 20 * 6 91645
Epaedullinen reagenssi a( /1): 0,15 mol K-fosfaattia tai 0,1 mol TES/KOH, pH 7,9; 8,6 mmol 2,4,6“tribromi-3-hydroksibentsoehappoa, 0,8 mmol 4-aminoanti-pyriinia, 10 ^umol yhdistetta K^(Fe(CN)g), 5 mmol Na-kolaat-tia, 0,5 % tuotetta Lutensol ON 50, 0,2 % yhdistetta NaN^, 0,5 mmol tuotetta Titriplex III, 2000 U lipaasia, 2000 U per-oksidaasia, 10 000 U askorbaattioksidaasia.
Taman keksinnon mukaisen entsyvmin tunnusomaisena piirteena on aikaisempiin entsyymeihin verrattuna ylivoimainen stabii-lisuus pinta-aktiivisia aineita sisaltåvasså valiaineessa 37°C:n låmpotilassa, ja tama stabiilisuus on todettavissa seka raakauutteen supernatantista etta myoskin puhtaalla entsyymilla. Seuraavasta taulukosta II nahdaan keksinnon mukaisen entsyymin stabiilisuus tunnettuihin sarkosinoksi-daaseihin verrattuna.
Taulukko II
Sarkosinoksidaasin Jaannosaktiivisuus prosentteina sen alkupera jalkeen, kun entsyymia on inkuboitu eripituisia ajanjaksoja epåedullises-_sa reagenssissa b 37°C:n lampotilassa 15 min 30 min 45 min 60 min
Pseudomonas maltophilia 7320
Corynebacterium sp.
U 96 6210
Bacillus sp. 87 84 78 75
Arthrobacter sp. 7100
Cy1indrocarpon didymum M-1 0 0 0 0
Chainia purpurogena
Puhdas entsyvmi 90 87 83 77
Chainia purpurogena Supernatantti raaka- uutteesta 90 87 82 75
Streptomyces flocculus Supernatantti raaka- . . uutteesta 97 97 96 94 7 91645
Epaedullinen reagenssi b ( /1) : 0,15 mol K-fosfaattia, pH 7,9; 8,6 mmol 2,4,6-tribromi-3-hydroksibentsoehappoa, 0,8 mmol 4-aminoantipyriinia, 10 ^umol yhdistetta K4(Fe(CN)g), 5 mmol Na-kolaattia, 0,5 % tuotetta Lutensol ON 50, 0,2 % yhdistetta NaN^, 0,5 mmol tuotetta Titriplex III, 2000 U lipaasia, 2000 U peroksidaasia, 10 000 U askorbaattioksidaasia, 25 000 U kreatininaasia, 12 000 U kreatinaasia, yli 100 U sarkosinoksidaasia.
Edella esitetyista arvoista nahdåan, etta pelkastaan Bacillus-bakteerista saadun entsyymin stabiilisuus on samankaltainen, kun taas kaikkien muiden entsyymien stabiilisuus on taysin riittamaton kaytannon sovellutuksiin.
Seuraavassa taulukossa III esitetaan keksinnon mukaisen entsyymin ja Bacillus sp.-bakteereista saadun entsyymin pitka-aikainen stabiilisuus 25°C:n lampotilassa.
Taulukko III
Sarkosinoksidaasin Puskuri Jaannosaktiivisuus prosent-alkupera teina sen jalkeen, kun ent- syymia on inkuboitu 2 vuoro-kautta epaedullisessa rea-genssissa c, 25°C:n lampo- _tilassa_
Chainia purp. Fosfaatti 83
Puhdas entsyymi TES 80
Chainia purp. Fosfaatti 86
Raakauute TES 88
Chainia ochr. Fosfaatti 75 : Raakauute TES 75
Streptomyces flocc. Fosfaatti 44
Raakauute TES 35
Bac. sp. Fosfaatti 15 TES 15
Puhdas entsyymi 8 91645
Epaedullinen reagenssi c:
Koostumus sama kuin epaedullisessa reagenssissa b, kuitenkin ilman kromogeenisen varijarjestelmån lisaystå. K-fosfaatin, pH 7,9, 0,15 moolin ohella kåytettiin myos 0,1 mol TES/KOH.
Edella esitetyista arvoista nahdaan, etta keksinnon mukainen entsyymi on pitkaaikaisen stabiilisuuden suhteen ylivoimainen toistaiseksi tunnettuun parhaaseen sarkosinoksidaasientsyy-miin verrattuna. Tama on erityisen tarkeåtå varastoitavuu-delle, joka korreloi pitkaaikaisen stabiilisuuden kanssa.
Nain olien keksinnon mukainen entsyymi mahdollistaa alhaisesta Michaelis-vakiostaan johtuen sarkosiinin, kreatiinin ja krea-tiniinin entsymaattisen maarityksen nopeamman suorittamisen, se on useimpiin tunnettuihin sarkosinoksidaaseihin verrattuna huomattavasti paremmin varastoitava 0-25°C:n lampotilassa, ja se on useimpiin muihin tunnettuihin sarkosinoksidaaseihin verrattuna olennaisesti stabiilimpi inkubointiajanjakson ajan sarkosiinin, kreatiinin ja kreatiniinin måårityksisså 37°C:n lampotilassa.
Seuraavat esimerkit havainnollistavat edelleen tata keksintoå. Esimerkki 1
Chainia purpurogena-organismin, DSM 43156, kasvatus
Tata organismia viljeltiin ravistelupullossa koostumukseltaan seuraavanlaisessa kompleksisessa alustassa: 5 g hiivauutetta, 3 g peptonia (tryptisesti hajotettu), 2 g NaCl, 0,24 g MgSO^ x 7 H^O, 0,014 g CaC^ x 7 H2O, 2 g glukoosia, 10 g sarkosiinia, 1 1 H2O, pH 7,0. 28°C:n lampotilassa kasvatet-tujen viljelmien aktiivisuus 30 tunnin kuluttua oli noin 400 U/l.
91645 9
Esimerkki 2
Sarkosinoksidaasin, E.C. 1.5.3.1, eristaminen Chainia-organismista 2,9 kg Chainia purpurogena-organismin, DMS 43156 rnarkaa mas-saa (saatu 95 litrasta viljelmaa) suspendoitiin 15 litraan 20 mmol/1 fosfaattipuskuria, pH 8,0, ja hajotettiin 4 gram-malla lysotsyymia 25°C:n lampotilassa. Hajotussuspensioon lisattiin niin paljon 10-prosenttista polyetyleeni-imiinin (PolyminG-20; BASF) liuosta, etta seurauksena oli nukleiini-happojen ja vieraan proteiinin lahes taydellinen erottuminen. Sarkosinoksidaasi (on supernatantissa) sidottiin heikosti emaksiseen anioninvaihtajaan (DEAE-Sephadex), ja eluoitiin tamån jalkeen suurenevien suolagradienttien avulla. Eluaat-tiin lisattiin ammoniumsulfaattia pitoisuudeksi 0,6 mol/1, entsyvmi sidottiin fenyyli-Sepharose-geeliin ja kromatogra-foitiin pienenevien ammoniumsulfaattigradienttien (edellå mainittu fosfaattipuskuri) avulla. Eluaattiin, joka sisalsi proteiinia yli 4 U/g, lisattiin kiinteata ammoniumsulfaattia aina pitoisuudeksi 2,4 mol/1. Saostuma sekoitettiin fos-faattipuskuriin, jonka pitoisuus oli 0,1 mol/1, ja sarkosinoksidaasi puhdistettiin johtamalla se molekyylisiivilan (Sephacryl-S-200, Pharmacia) lapi.
Puhdistetun entsyymin spesifinen aktiivisuus on 5,5 U/mg proteiinia.
Esimerkki 3
Sarkosinoksidaasin kaytto kreatiniinin maarityksessa a) Reagenssi I (navtteen nollareagenssi) : K-fosfaatti (pH 7,9) 150 mmol/1 (tai 0,1 mol/1 TES/KOH, pH 7,9) 4-aminoantipyriini 0,8 mmol/1 2,4 ,6-tribromi-3-hydroksi- bentsoehappo 8,6 mmol/1 10 9Ί645 K (Fe(CN)r) 10 .umol/1
Na-kolaatti 5 mmol/1
Lutenso]® ON 50 0,5 % (w/v)
Kreatiiniamidinohydrolaasi 12 U/ml
Sarkosinoksidaasi esimerkistå 2 6,5 U/ml
Peroksidaasi 2 U/ml
Lipaasi 2 U/ml
Askorbaattioksidaasi 10 U/ml b) Reagenssi II (naytereagenssi) :
Reagenssi I + kreatiiniamido- hydrolaasi 25 U/ml c) Kokeen suorittaminen/Måårityksen aloittaminen
Aallonpituus 546 nm; T = 25°C (tai 37°C);
Kerroksen paksuus = 1 cm Mittaus ilmaa vastaan © © © ©
Reagenssi I Naytteen Reagenssi II Naytteen nolla-arvo nolla-arvo nolla-arvo arvo
Reagenssi I 1,00 ml 1,00 ml - -
Reagenssi II - - 1,00 ml 1,00 ml H20 0,05 ml - 0,05 ml Nåyte - 0,05 ml - 0,05 ml
Inkuboidaan 20 minuuttia 25 tai 37°C:n lampotilassa, sitten mitataan ekstinktiot .
E ‘ E®) '
Kreatiinin pitoisuuden laskeminen naytteesta:
Laskeminen tapahtuu samanaikaisesti maaritetyn vesipitoisen standardin (2 mg/dl) avulla. Maaritysta aloitettaessa stan-dardia on kasiteltåva naytteen tavoin.
II
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE3519218 | 1985-05-29 | ||
| DE19853519218 DE3519218A1 (de) | 1985-05-29 | 1985-05-29 | H(pfeil abwaerts)2(pfeil abwaerts)o(pfeil abwaerts)2(pfeil abwaerts)-bildende sarcosinoxidase, ihre herstellung und verwendung |
Publications (4)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| FI862258A0 FI862258A0 (fi) | 1986-05-28 |
| FI862258A FI862258A (fi) | 1986-11-30 |
| FI91645B FI91645B (fi) | 1994-04-15 |
| FI91645C true FI91645C (fi) | 1994-07-25 |
Family
ID=6271899
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| FI862258A FI91645C (fi) | 1985-05-29 | 1986-05-28 | Vetyperoksidia (H202) muodostava sarkosinoksidaasi, sen valmistaminen ja käyttö |
Country Status (12)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US4743549A (fi) |
| EP (1) | EP0205967B1 (fi) |
| JP (1) | JPS61280271A (fi) |
| KR (1) | KR890004091B1 (fi) |
| AT (1) | ATE63944T1 (fi) |
| AU (1) | AU561098B2 (fi) |
| CA (1) | CA1277269C (fi) |
| DE (2) | DE3519218A1 (fi) |
| ES (1) | ES8800345A1 (fi) |
| FI (1) | FI91645C (fi) |
| SU (1) | SU1582993A3 (fi) |
| ZA (1) | ZA863143B (fi) |
Families Citing this family (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE3519218A1 (de) * | 1985-05-29 | 1986-12-04 | Boehringer Mannheim Gmbh, 6800 Mannheim | H(pfeil abwaerts)2(pfeil abwaerts)o(pfeil abwaerts)2(pfeil abwaerts)-bildende sarcosinoxidase, ihre herstellung und verwendung |
| DE3774966D1 (de) * | 1986-08-28 | 1992-01-16 | Union Carbide Canada Ltd | Entfrostung und vereisungsverhindernde zusammensetzung fuer flugzeuge. |
| JP2588707B2 (ja) * | 1987-02-27 | 1997-03-12 | 小林製薬株式会社 | サルコシン・オキシダーゼの製造法 |
| TW257792B (fi) * | 1992-10-01 | 1995-09-21 | Lilly Co Eli | |
| US9804154B2 (en) | 2013-03-12 | 2017-10-31 | Epinex Diagnostics, Inc. | Rapid test for urine albumin and urine creatinine |
| EP3415910A1 (en) | 2017-06-16 | 2018-12-19 | Prevention Medicals s.r.o. | A method of quantitative determination of sarcosine in a biological sample using anti-arcosine antibodies and peroxidase-active gold nanoparticles or quantum dots |
Family Cites Families (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS6029473B2 (ja) * | 1977-10-04 | 1985-07-10 | 東洋醸造株式会社 | ザルコシン・オキシダ−ゼの製法 |
| JPS5534001A (en) * | 1978-08-28 | 1980-03-10 | Noda Sangyo Kagaku Kenkyusho | Stabilization of sarcosine oxidase |
| JPS5692790A (en) * | 1979-12-26 | 1981-07-27 | Hideaki Yamada | Preparation of sarcosine oxidase |
| DE3326888A1 (de) * | 1983-07-26 | 1985-02-14 | Boehringer Mannheim Gmbh, 6800 Mannheim | Sarcosin-oxidase |
| JPS61162174A (ja) * | 1985-01-11 | 1986-07-22 | Noda Sangyo Kagaku Kenkyusho | 耐熱性ザルコシン・オキシダ−ゼｎ及びその製造法 |
| DE3519218A1 (de) * | 1985-05-29 | 1986-12-04 | Boehringer Mannheim Gmbh, 6800 Mannheim | H(pfeil abwaerts)2(pfeil abwaerts)o(pfeil abwaerts)2(pfeil abwaerts)-bildende sarcosinoxidase, ihre herstellung und verwendung |
-
1985
- 1985-05-29 DE DE19853519218 patent/DE3519218A1/de not_active Withdrawn
-
1986
- 1986-04-28 ZA ZA863143A patent/ZA863143B/xx unknown
- 1986-04-29 AU AU56794/86A patent/AU561098B2/en not_active Ceased
- 1986-04-30 CA CA000507950A patent/CA1277269C/en not_active Expired - Lifetime
- 1986-05-13 ES ES554907A patent/ES8800345A1/es not_active Expired
- 1986-05-27 DE DE8686107203T patent/DE3679455D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1986-05-27 EP EP86107203A patent/EP0205967B1/de not_active Expired - Lifetime
- 1986-05-27 AT AT86107203T patent/ATE63944T1/de not_active IP Right Cessation
- 1986-05-27 JP JP61120358A patent/JPS61280271A/ja active Granted
- 1986-05-28 SU SU4027546A patent/SU1582993A3/ru active
- 1986-05-28 US US06/868,262 patent/US4743549A/en not_active Expired - Lifetime
- 1986-05-28 KR KR1019860004175A patent/KR890004091B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1986-05-28 FI FI862258A patent/FI91645C/fi not_active IP Right Cessation
-
1988
- 1988-02-09 US US07/153,976 patent/US4845029A/en not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| DE3679455D1 (de) | 1991-07-04 |
| ES554907A0 (es) | 1987-11-16 |
| EP0205967A2 (de) | 1986-12-30 |
| JPS61280271A (ja) | 1986-12-10 |
| KR860009127A (ko) | 1986-12-20 |
| CA1277269C (en) | 1990-12-04 |
| KR890004091B1 (ko) | 1989-10-20 |
| EP0205967B1 (de) | 1991-05-29 |
| ZA863143B (en) | 1986-12-30 |
| DE3519218A1 (de) | 1986-12-04 |
| FI862258A (fi) | 1986-11-30 |
| AU5679486A (en) | 1986-12-04 |
| JPH0414957B2 (fi) | 1992-03-16 |
| US4743549A (en) | 1988-05-10 |
| ATE63944T1 (de) | 1991-06-15 |
| SU1582993A3 (ru) | 1990-07-30 |
| US4845029A (en) | 1989-07-04 |
| FI862258A0 (fi) | 1986-05-28 |
| EP0205967A3 (en) | 1988-07-27 |
| AU561098B2 (en) | 1987-04-30 |
| FI91645B (fi) | 1994-04-15 |
| ES8800345A1 (es) | 1987-11-16 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US3907644A (en) | Creatinine amidohydrolase composition and process for the determination of creatinine | |
| US4241178A (en) | Process and composition for the quantification of glycerol ATP and triglycerides | |
| US5094943A (en) | Process and reagent for the improved quantitative colorimetic determination of hydrogen peroxide | |
| US3884764A (en) | Method and composition for blood serum cholesterol analysis | |
| EP0678576B1 (en) | Fructosyl amino acid oxidase and process for producing the same | |
| JPH0646846A (ja) | フルクトシルアミンデグリカーゼ、その製造法及び該酵素を用いたアマドリ化合物の定量方法 | |
| EP0709457A1 (en) | Fructosyl amino acid oxidase and process for producing the same | |
| WO1997013872A1 (fr) | Procede pour doser les composes d'amadori | |
| JPH07289253A (ja) | フルクトシルアミノ酸オキシダーゼ及びその製造方法 | |
| JPH08154672A (ja) | フルクトシルアミノ酸オキシダーゼ及びその製造方法 | |
| FI91645C (fi) | Vetyperoksidia (H202) muodostava sarkosinoksidaasi, sen valmistaminen ja käyttö | |
| KINOSHITA et al. | A fluorophotometric determination of serum creatinine and creatine using a creatinineamidohydrolase-creatineamidinohydrolase-sarcosine oxidase-peroxidase system and diacetyldichlorofluorescin | |
| US4810642A (en) | Method and test composition for determination of hydrogen peroxide | |
| FI82071B (fi) | Av nukleosiditrifosfat beroende 1-metylhydantoinas och dess anvaendning. | |
| JPH0134035B2 (fi) | ||
| CA1100023A (en) | Process and composition for the quantification of glycerol and triglycerides | |
| US4224407A (en) | Assay of L-lysine | |
| US5246836A (en) | Peroxidase catalyzed enzyme assay by sample prg-treatment | |
| EP1132467A3 (en) | Novel creatine amidinohydrolase, production thereof and use thereof | |
| JPH11243950A (ja) | フルクトシルアミノ酸オキシダーゼ及びその製造方法 | |
| EP0097949B1 (en) | L-glutamic acid oxidase, its production, and its use | |
| JPH01265899A (ja) | トリグリセリドの分析用試薬および分析方法 | |
| JPS6342519B2 (fi) | ||
| JP2017158441A (ja) | カタラーゼ | |
| JP5470906B2 (ja) | カタラーゼ |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| BB | Publication of examined application | ||
| MM | Patent lapsed |
Owner name: BOEHRINGER MANNHEIM GMBH |