FI91159B - Menetelmä imidatsolipitoisten peptidien ja niiden farmaseuttisesti sopivien suolojen valmistamiseksi - Google Patents

Description

91159

MENETELMÄ IMIDATSOLIPITOISTEN PEPTIDIEN JA NIIDEN FARMASEUTTISESTI SOPIVIEN SUOLOJEN VALMISTAMISEKSI

Keksinnön alue Tämä keksintö koskee menetelmää uusien imidatsolipitoisten peptidien ja niiden farmaseuttisesti sopivien suolojen valmistamiseksi.

Keksinnön tausta

On tunnettua, että N-asetyyli-L-fenyylialanyyli-L-fenyyliala-nyyli-L-histidiinimetyyliesterillä on mahahaavan ja haavauman-vastainen vaikutus (US-patentti nro 4.048.305).

Keksinnön yhteenveto

Tuloksena erilaisista tutkimuksista on odottamatta havaittu, että samalla kun ylläolevilla tunnetuilla yhdisteillä on niukasti immunomodulatiivinen vaikutus, on peptideillä, jotka saadaan korvaamalla tunnetun yhdisteen asetyyliryhmä isolla ryhmällä, kuten pivaloyyliryhmä, tert.butyylioksikarbonyyliryh-mä tai bentsyylioksikarbonyyliryhmä, voimakas immunomodulatiivinen vaikutus.

Niinpä tämän keksinnön tarkoituksena on esittää uusi menetelmä imidatsolipitoisen peptidin valmistamiseksi, jolla on erinomainen immunomodulatiivinen vaikutus.

Keksinnön yksityiskohtainen kuvaus Tämän keksinnön mukaisella menetelmällä valmistetaan seuraavan kaavan (I) mukaisia imidatsolipitoisia peptidejä tai niiden farmaseuttisesti sopivia suoloja: R2 R3 R4 R5 . m, I |2 _y^HR6 m R — CON—X — CON—X2—CO— NH—A—^ 2 jossa R1 on haarautunut alkyyliryhmä, haarautunut alkoksiryhmä tai fenyyliryhmällä substituoitu alempi alkoksiryhmä, R2 ja R4 ovat samoja tai erilaisia ja kumpikin on vetyatomi tai alempi alkyyliryhmä, R3 ja R5 ovat fenyyliryhmällä substituoitu alempi alkyyliryhmä, R6 on vetyatomi tai alempi alkoksikarbonyyliryh-mä, R7 on vetyatomi tai pyridyyliryhmällä substituoitu alempi alkyylitioryhmä, X1 ja X2 ovat samoja tai erilaisia ja kumpikin on -CH-, -OCH- tai -N-, A on alempi alkyleeniryhmä, joka voi olla substituoitu alemmalla alkoksikarbonyyliryhmällä, hydrok-simetyyliryhmällä tai seuraavan kaavan mukaisella ryhmällä: -CON— R8 ^R9 jossa R8 ja R9 ovat samoja tai erilaisia ja kumpikin on vety-atomi tai alempi alkyyliryhmä, sillä ehdolla, ettei N-bentsyy-lioksikarbonyyli-fenyylialanyyli-fenyylialanyyli-histidiinime-tyyliesteri kuulu näiden yhdisteiden joukkoon, ja keksinnölle on tunnusomaista se mitä on esitetty patenttivaatimusten tun-nusmerkkiosassa.

Keksinnön mukaisella menetelmällä valmistettavalla yhdisteellä (I) tai sen suolalla on lukuisia erinomaisia ominaisuuksia immunomodulaattorina. Yhdisteellä (I) tai sen suolalla on esimerkiksi voimakas makrofaagien kulkeutumista lisäävä vaikutus makrofaagien kulkeutumiskokeessa, jota käytetään mitattaessa soluvälitteistä immuuniaktiivisuutta. Yhdisteellä (I) on myös voimakas immunomodulatiivinen vaikutus kuten viivästynyt liika-herkkyys. Lisäksi yhdisteellä (I) tai sen farmaseuttisesti sopivalla suolalla on alhainen myrkyllisyys ja se on erittäin turvallinen.

Esimerkkejä keksinnön imidatsolipitoisesta peptideistä ovat ne kaavan (I) yhdisteet, joissa R1 on haarautunut alkyyliryhmä, jossa on 3-6 hiiliatomia, haarautunut alkoksiryhmä, jossa on 3-6 hiiliatomia tai fenyyliryhmällä substituoitu alkoksifCj.*)-ryhmä, ja R7 on vetyatomi tai pyridyyliryhmällä substituoitu alkyylitio()-ryhmä.

Muita esimerkkejä keksinnön mukaisella menetelmällä valmistettavista yhdisteistä ovat ne kaavan (I) mukaiset yhdisteet, joissa R2 ja R4 ovat vetyatomi tai alkyyliryhmä, jossa on 1-4

II

3 91159 hiiliatomia, R3 ja R5 ovat fenyyliryhmällä substituoitu alkyyli(C^)-ryhmä, R6 on alkoksifC^J-karbonyyliryhmä, ja A on alkyleeniryhmä, jossa on 1-4 hiiliatomia, alkoksi^..,)-karbo-nyyliryhmällä substituoitu alkyyleenifCi.*)-ryhmä, hydroksime-tyyliryhmällä substituoitu alkyleenifCi..*)-ryhmä, karbamoyy-liryhmällä substituoitu alkyleeni(Cw)-ryhmä, N-monoalkyyli-(Ci.*)-karbamoyyliryhmällä substituoitu alkyleeni(C^)-ryhmä, tai N-dialkyyliiC^J-karbamoyyliryhmällä substituoitu alkyleeni (Ci.*) -ryhmä.

Edullisia esimerkkejä keksinnön mukaisella menetelmällä valmistettavista yhdisteistä ovat ne kaavan (I) mukaiset yhdisteet, joissa R1 on tert.-butyyli, tert.-butyylioksi tai bentsyyliok-si, R2 ja R4 ovat vetyatomi tai metyyli, R3 ja R5 ovat bentsyyli tai fenetyyli, R6 on vetyatomi tai metoksikarbonyyli, R7 on vetyatomi, 2-pyridyylimetyylitio tai 3-pyridyylimetyylitio, ja A on metyleeni, etyleeni, metoksikarbonyylietyleeni, hydroksi-metyylietyleeni tai karbamoyylietyleeni.

Edullisempia keksinnön yhdisteitä ovat ne kaavan (I) mukaiset yhdisteet, joissa R2 ja R4 ovat vetyatomi ja R3 ja R5 ovat bentsyyli .

Kaavan (I) mukainen imidatsolipitoinen peptidi voi esiintyä tautomeeristen isomeerien muodossa imidatsoliosassa, kuten seuraavassa kaavassa on esitetty: —— —Tl·· ^ NH^r7 jossa symbolit ovat samat kuin edellä on määritelty, ja tämä keksintö käsittää nämä isomeerit.

Lisäksi kaavan (I) mukainen imidatsolipitoinen peptidi voi esiintyä optisten isomeerien muodossa, kun siihen liittyy asymmetrinen hiiliatomi tai -atomeita, ja kaikki optiset isomeerit tai niiden seokset kuuluvat keksinnön piiriin. Näiden isomeerien joukossa yhdiste, jossa kaikki asymmetriset hiiliatomit ovat (S)-konfiguraatiossa, on kuitenkin edullisempi farmaseuttiseen käyttöön.

4

Keksinnön mukaan imidatsolipitoinen peptidi (I) voidaan valmistaa seuraavien vaiheiden mukaan: (A) seuraavan kaavan mukaisen yhdisteen: R2 R3 , I I. (in

R -CON—X -COOH

jossa symbolit ovat samat kuin edellä on määritelty, sen suolan tai reaktiivisen johdannaisen kondensoiminen seuraavan kaavan mukaisen yhdisteen kanssa: R4 R5 | I 6 HN—X2—CONH—A—^jl3R7 (III)

R

jossa symbolit ovat samat kuin edellä on määritelty, tai sen suolan kanssa, tai (B) kondensoidaan seuraavan kaavan mukainen yhdiste: R2 R3 R< R5 r'-CON—X1—CON—X2— C00I1 (1V) jossa symbolit ovat samat kuin edellä on määritelty, sen suola tai reaktiivinen johdannainen seuraavan kaavan mukaisen yhdisteen kanssa: M2N.AHgV (V.

91159 5 jossa symbolit ovat samat kuin edellä on määritelty, tai sen suolan kanssa, tai (C) kondensoidaan seuraavan kaavan mukainen yhdiste: R1 -COOH (VI) jossa symboli on sama kuin edellä on määritelty, sen suola tai reaktiivinen johdannainen seuraavan kaavan mukaisen yhdisteen kanssa: R2 R3 R4 R5 ,| || 6 (vn) HN—X — CON—X2—CONH—A— jossa symbolit ovat samat kuin edellä on määritelty, tai sen suolan kanssa.

yhdisteiden (I) joukossa seuraavan kaavan mukainen yhdiste: R2 R3 R4 R5 ^ || |l, . ,T .

r'-CON-x'-CON—X2-C0NH—A—V -J_)7 (I a)

N K

jossa R*1 on vetyatomi, A1 on hydroksimetyylisubstituoitu alempi alkyleeniryhmä ja Rl , R* , R* , R* , Rs , R7 , X1 ja X* ovat samat kuin edellä on määritelty, voidaan myös valmistaa (D) pelkistämällä seuraavan kaavan mukainen yhdiste: R2 R3 R4 R5 I I I L '1 (I-b) R —CON—X —CON—X2—CONH A—^ 1

N^ R

6 jossa A11 on alempi alkoksikarbonyylisubstituoitu alempi alky-leeniryhmä ja R1 , RJ , R3 , R4 , R5 , R61 , R7 , X1 ja Xs ovat samoja kuin edellä on määritelty, tai sen suola.

Edelleen, seuraavan kaavan mukainen yhdiste: ^ si ,^nhi61 U1 —CON—X, —CON—X2 —CO N Π A \ -J 'S (I'c)

K

jossa As on alkyleeniryhmä, joka on substituoitu kaavan: -CON<-R8 R8 mukaisella ryhmällä (jossa symbolit ovat samat kuin edellä on määritelty), voidaan valmistaa (E) antamalla yhdisteen (I-b) tai sen suolan reagoida amiiniyhdisteen kanssa, jolla on kaava: nh<rr8, (VIII) jossa symbolit ovat samat kuin edellä on määritelty, tai sen suolan kanssa.

Edellämainituissa reaktiossa yhdisteitä (III), (V), (VII), (VIII) ja (I-b) voidaan käyttää joko vapaana tai suolansa muodossa. On edullista käyttää näiden yhdisteiden suoloja happoad-ditiosuolan muodossa. Esimerkkejä suolasta ovat epäorgaaniset happoadditiosuolat, kuten hydrokloridi, hydrobromidi, sulfaatti tai nitraatti, orgaaniset happoadditiosuolat, kuten p-tolueeni-sulfonaatti, metaanisulfonaatti tai trifluoriasetaatti, ja niin edelleen. Lisäksi yhdisteet (II), (IV) ja (VI) voivat olla suolansa muodossa ja esimerkkejä suolasta ovat alkalimetallisuola, trialkyyliamiinisuola tai pyridiinisuola.

Il 91159 7

Sopivia esimerkkejä yhdisteiden (II)/ (IV) ja (VI) reaktiivisista johdannaisista ovat vastaavat happohalogenidit (esim. happo-kloridi, happobromidi), seka-anhydridit (esim. seka-anhydridi alkyylikarbonaatin kanssa), aktiiviset esterit (esim. esteri pentakloorifenolin kanssa, p-nitrofenoli, 2,4-dinitrofenoli, N-hydroksisukkiini-imidi, N-hydroksiftaali-imidi, 1-hydroksibent-sotriatsoli tai l-hydroksi-2-pyrrolidoni), happoatsidi ja muut reaktiiviset johdannaiset, kuten amidi imidatsolin kanssa, 4-substituoitu imidatsoli tai triatsoli.

Menetelmä <A\. ia (C\

Yhdisteen (II) tai sen reaktiivisen johdannaisen kondensoiminen yhdisteen (III) tai sen suolan kanssa, yhdisteen (IV) tai sen reaktiivisen johdannaisen kondensoiminen yhdisteen (V) tai sen suolan kanssa ja yhdisteen (VI) tai sen suolan kondensoiminen yhdisteen (VII) tai sen suolan kanssa voidaan toteuttaa tavanomaisilla peptidien synteesitavoilla. Esimerkiksi kun yhdistettä (II), (IV) tai (VI) käytetään reaktiivisen johdannaisensa muodossa, kondensointireaktio voidaan suorittaa joko happoaksepto-rin läsnäollessa tai ilman sitä liuottimessa. Sopivia esimerkkejä happoakseptorista ovat alkalimetallihydroksidit (esim. nat-riumhydroksidi, kaliumhydroksidi), aikaiimetallikarbonaatit (esim. natriumkarbonaatti, kaliumkarbonaatti), alkalimetallibi-karbonaatit (esim. natriumbikarbonaatti, kaliumbikarbonaatti), trialkyyliamiinit (esim. trimetyyliamiini, trietyyliamiini), Ν,Ν-dialkyylianiliinit (esim. Ν,Ν-dimetyylianiliini, N,N-dietyy-lianiliini), pyridiini, N-alkyylimorfoliinit (esim. N-metyyli-morfOliini) ja niin edelleen. Dioksaani, tetrahydrofuraani, ase-tonitriili, kloroformi, metyleenikloridi, dimetyyliformamidi, Ν,Ν-dimetyyliasetamidi, etyyliasetaatti, pyridiini, asetoni ja vesi ovat sopivia liuottimeksi.

Toisaalta, kun käytetään yhdistettä (II), (IV) tai (VI) vapaan hapon tai sen suolan muodossa, kondensointireaktio voidaan suorittaa vettä poistavan aineen läsnäollessa liuottimessa. Sopivia esimerkkejä vettä poistavasta aineesta ovat N,N'-disykloheksyy-likarbodi-imidi, N-sykloheksyyli-N'-morfolinokarbodi-imidi, N-etyyli-N'-(3-dimetyyliaminopropyyli)karbodi-imidi, fosforioksi-kloridi, fosforitrikloridi, tionyylikloridi, oksalyylikloridi, δ trifenyylifosfiini ja vastaavat. Vilsmeierin reagensseja, jotka on valmistettu dimetyyliformamidista ja fosforioksikloridista, dimetyyliformamidista ja oksalyylikloridista, dimetyyliformamidista ja fosgeenista tai dimetyyliformamidista ja tionyyliklori-dista, voidaan myös käyttää mainittuna vettä poistavana aineena. Samaa liuotinta, joka mainittiin reaktiivisen johdannaisen kon-densoinnissa, voidaan käyttää tässä vaiheessa.

Menetelmä (ΡΪ

Yhdisteen (I-b) tai sen suolan pelkistysreaktio voidaan suorittaa käsittelemällä sitä pelkistimellä liuottimessa. Esimerkkejä pelkistimistä ovat natriumboorihydridi, kalsiumboorihydridi tai litiumboorihydridi. Tetrahydrofuraania, isopropanolia, etanolia ja metanolia voidaan käyttää liuottimena.

Menetelmä fE)

Yhdisteen (I-b) tai sen suolan reaktio yhdisteen (VIII) kanssa voidaan suorittaa liuottimessa. Metanoli, etanoli, dimetyylifor-mamidi ja vastaavat ovat sopivia liuottimeksi.

On edullista suorittaa edellä mainitut reaktion (A) - (E) lämpötilassa -50 - 50eC.

Haluttu yhdiste (I), lähtöyhdisteet (II) - (V) ja (VII) käsittävät joko optisia isomeerejä asymmetris(t)en hiiliatomi(e)n takia tai niiden seoksen. Koska edellä mainitut keksinnön reaktiot etenevät ilman rasemisoitumista, yhdiste (I) saadaan heti optisesti aktiivisen isomeerin muodossa käyttämällä vastaavia läh-töyhdisteiden optisesti aktiivisia isomeerejä.

Kuten edellä on mainittu, keksinnön yhdisteellä (I) tai sen suolalla on voimakas immunomodulatiivinen vaikutus. Erityisesti yhdiste (I) aktivoi makrofaagien kulkeutumista (s.o. makrofaagi-en, jotka pysyvät kroonisesti tulehtuneessa kohdassa) saamalla sen lähtemään tulehtuneesta kohdasta, ja samaan aikaan yhdiste (I) estää viivästyneen liikaherkkyyden. Sen vuoksi yhdiste (I) on käyttökelpoinen hoidettaessa ja/tai ennaltaehkäistäessä autoimmuunisairauksia, kuten nivelreumaa, multippeliskleroosia, sys-

II

91159 9 teemistä punahukkaa (SLE), munuaistautia, reumaattista kuumetta ja tyypin I diabetestä ja atooppista allergiaa.

Keksinnön imidatsolipitoista peptidiä (I) voidaan käyttää farmaseuttiseen käyttöön joko vapaan emäksen tai suolan muodossa. Yhdisteen (I) farmaseuttisesti sopivia suoloja ovat esimerkiksi epäorgaaniset happoadditiosuolat, kuten hydrokloridi, hydrobro-midi, fosfaatti ja sulfaatti, ja orgaaniset happoadditiosuolat, kuten oksalaatti, asetaatti, laktaatti, sitraatti, tartraatti, fumaraatti, maleaatti, aspartaatti, metaanisulfonaatti ja bent-soaatti.

Imidatsolipitoista peptidiä (I) tai sen suolaa voidaan antaa . joko oraalisesti tai parenteraalisesti lämminverisille eläimille, mukaanluettuna ihmiset, ja niitä voidaan myös käyttää farmaseuttisen valmisteen muodossa, joka sisältää tätä yhdistettä seoksena farmaseuttisten täyteaineiden kanssa, jotka sopivat oraalisesti tai parenteraalisesti annettaviksi. Farmaseuttiset valmisteet voivat olla kiinteässä muodossa kuten tabletit, rakeet, kapselit ja jauheet, tai nestemäisinä, kuten liuokset, suspensiot tai emulsiot. Lisäksi, annettaessa parenteraalisesti niitä voidaan käyttää injektioiden muodossa.

Imidatsolipitoisen peptidin (I) tai sen suolan annos voi vaihdella riippuen antotavasta, potilaan iästä, painosta ja tilasta, ja sairauden laadusta, ja on edullisesti noin 0,01-100 mg/kg päivässä, erityisesti 0,1-30 mg/kg päivässä.

Lähtöyhdisteet (III), (V) ja (VIII) voidaan valmistaa pepti-disynteesille tavanomaisella tavalla. Esimerkiksi lähtöyhdiste (III) vodiaan valmistaa kondensoimalla seuraavan kaavan mukainen yhdiste: R* R5 Y*-N—X2—COOH (IX) 10 jossa Y1 on aminosuojaryhmä, R4 , Rs ja X2 ovat samoja kuin edellä on määritelty, tai sen suola yhdisteen (V) tai sen suolan kanssa, ja poistamalla suojaryhraä tuotteesta. Yhdiste (IV) voidaan valmistaa kondensoimalla yhdiste (II) tai sen reaktiivinen johdannainen seuraavan kaavan mukaisen yhdisteen: R4 R5 IL 2 (x) HN-X2-COOY2 jossa Y2 on karboksisuojaryhmä, ja R4 , R5 ja X2 ovat samoja kuin edellä on määritelty, tai sen suolan kanssa, ja poistamalla suo-jaryhmä tuotteesta. Lisäksi yhdiste (VII) voidaan valmistaa kondensoimalla seuraavan kaavan mukainen yhdiste: R2 R3 , I 1 , (xi)

Y-N-X-COOH

jossa symbolit ovat samat kuin edellä on määritelty, tai sen reaktiivinen johdannainen yhdisteen (III) tai sen suolan kanssa, tai kondensoimalla seuraavan kaavan mukainen yhdiste: R2 R3 R4 R5 Υ'-Ν-Χ1— CON— X2— COOH <XU) jossa symbolit ovat samat kuin edellä on määritelty, tai sen raktiivinen johdannainen yhdisteen (V) tai sen suolan kanssa, ja poistamalla suojaryhmä tuotteesta.

Il 91159 11

Edellä mainituissa reaktioissa monia eri suojaryhmiä, joita tavallisesti käytetään suojaamaan amino- tai karboksiryhmää (-ryhmiä) peptidisynteesissä, voidaan käyttää suojaryhmänä tai -ryhminä (Y1 2 3 4 5 6 ja/tai Y7 ).

Koe 1

Vaikutus rakkulamaisten makrofaaoien kulkeutumiseen (Menetelmä)

Japanilaiset valkoiset naaraskanit, jotka painoivat 3-4 kg,^ta-pettiin nukutuksessa. Rakkulamaiset makrofaagit saatiin huuhte-lemalla keuhkot suolaliuoksella.

"Koeryhmässä” makrofaagit kulkeutuivat RPMI-1640 -kasvualustassa, joka sisälsi 5 % kanin seerumia ja 10'7 M koeyhdistettä. Mainittu kulkeutumistesti suoritettiin 37eC:ssa 24 tuntia menetelmän mukaan, joka on kuvattu julkaisussa Journal of Leukocyte Biology 42: 197-203 (1987). Kulkeutumistulos projisoitiin noin 15-kertaisella suurennoksella ja sille annettiin pisteet. Sitten kulkeutumisalue mitattiin planimetrillä.

Kulkeutumistesti "positiivisessa kontrolliryhmässä" suoritettiin käyttämällä RPMI-1640 -kasvualustaa, joka sisälsi 5 % kanin seerumia ja 5 mM L-fukoosia, koeyhdistettä sisältävän kasvualustan sijasta. Toisaalta koe "kontrolliryhmässä" suoritettiin käyttäen kasvualustaa, joka sisälsi pelkästään 5 % kanin seerumia. Kulkeutumia indeksi laskettiin seuraavan kaavan mukaan: koeryhmän kulkeutumis-^/kontrolliryhmän^ 2

Kulkeutumis- _ Value_I ykulkeutumisalue1 x jqo 3 indeksi /positiivisen kontrolli-\ (kontrolliryhmän^ 4

\ryhmän kulkeutumisalue J ykulkeutumisalueJ

5 (Tulokset) 6

Kaikkien taulukossa 1 esitettyjen yhdisteiden kulkeutumisindeksi 7 oli enemmän kuin 100.

12

Taulukko 1

Nro Koeyhdisteet 1 BOC-L-Phe-L-Phe-t-His-OMe 2 BOC-L-Phe-L-Phe-NHN/^_^'('D*Hfc

^NM

3 BOC - L - Phe - L - Phe - NHCH2 «s s

4 BOC-L-Phe-L-Phe-NH

_· X-Q

5 BOC-L-Phe-L-Phe-NH

6 t-BuCO-L-Phe-L-Phe-L-His-OMe 7 BOC-L-Phe-L-Phe-L-Hi s -NH2 8 BOC-azaPhe-L-Phe-L-His-QMe 9 BOC-azaPhe-L- Phe-NH·. ^ V*1

10 BOC-azaPhe-L-Phe-NH

vh/0

11 t-BuCO-azaPhe-L-Phe-NH

12 t - BuCO - azaPhe - L - Phe - NH t t>*H« VHrj _scrti n 13 BOC-L-Phe-L-NHOCHCO-L-His-OMe CH2^Ö , — - - - .. ---- , - ,

II

91159 13

Huomautus: Taulukossa 1 lyhenteiden merkitykset ovat seuraavat: Lyhenne Merkitys BOC tert.butyy1ioks ikarbonyy1i

Me metyyli t—Bu tert.butyyli

His histidiini

Phe fenyylialaniini azaPhe -NHNCO- 0*2-0

Koe 2

Inhibiittorivaikutus pikrvvlikloridilla indusoituun viivästyneeseen liikaherkkvvteen (Menetelmä) BALB/C-naarashiiret (10 viikon ikäisiä) herkistettiin levittämällä 1 ml etanoliliuosta, joka sisälsi 7 w/v-% pikryylikloridia hiirten vatsanahkaan. "Koeryhmässä" koeyhdistettä annettiin oraalisesti hiirille 7 päivää alkaen herkistämispäivästä.

7 päivää herkistämisen jälkeen levitettiin 10 μΐ oliiviöljy-liuosta, joka sisälsi 1 w/v-% pikryylikloridia, vasemman ulko-koirvan molempien puolien ihoon. 24 tunnin kuluttua hiiret tapettiin ja molempien korvien paksuus mitattiin.

Ulkokorvan turpoamisen estyminen (%) laskettiin seuraavan kaavan mukaan: /koeryhmän vasemman ulko-\ ^koeryhmän oikean ulkoA \korvan paksuus J ^korvan paksuus j

1 - --- xlOO

/kontrolliryhmän vasemman) /kontrolliryhmän oikean s. iulkokorvan paksuus / yulkokorvan paksuus /> 14 (Tulokset)

Tulokset on esitetty seuraavassa taulukossa 2.

Taulukko 2

Koeyhdisteet Annos Ulkokorvan turpoamisen (iflQ/kQ) estyminen (%) B0C*a2&Phe*L-Phe-L-His-0Me 10 72.6 BOC-asaPhe-L-Phe-ΝΗνΛ^ 2 70.1 t-BuCO-az&Phe·L-Phe-A_ 2 68.5

'' N. NH

V

B0C-a2aPhe-L-Phe-NH^/\_^>C02Me 10 65.1

Nv NH

ν.χί

SCK2^lT

t - BuCO - sza Phe · L · ?‘ne · NHv A ^ CO?Me 10 55.0

N7 NH

Y X) SCH2^%

Kontrolli ®

Huom.: Taulukossa 2 on käytetty samoja lyhenteitä kuin taulukossa 1.

li 91159 15

Esimerkki 1 L-fenyylialanyyli-L-histidiinin metyyliesteridihydrobromidia (1,75 g) liuotetaan seokseen, jossa on dimetyyliformamidia (10 ml) ja trietyyliamiinia (1,4 ml), ja siihen lisätään N-tert.-butoksikarbonyyli-L-fenyylialaniinisukkiini-imidoesteriä (1,34 g). Seosta sekoitetaan huoneenlämmössä yön yli. Seokseen lisätään etyyliasetaattia ja liukenemattomat aineet suodatetaan pois. Suodos pestään natriumbikarbonaatin vesiliuoksella ja siihen lisätään natriumkloridin vesiliuosta. Saostuneet kiteet -pestään etyyliasetaatilla ja vedellä ja kuivataan, jolloin saadaan N-tert .butoksikarbonyyli-L-fenyylialanyyli-L-fenyylialanyyli-L-histidiinin metyyliesteriä (1,5 g) värittöminä kiteinä. Saanto 71,8%.

Sp. 170-173eC (haj.)

Nujol IR V (cm *1) :3310, 3300, 1740, 1695, 1640 Max NMR (d6-DMSO) 5: 1.28(9H,s), 2.4 - 3.2 (6H,m) .

3.59(3H,s), 3.9-4.8(3H,m), 6.65-7.6(14H,m), 7.8-8.2(lH,m), 8.37-8.7(1H,m)

Esimerkki 2 N-tert .butoksikarbonyyli-L-2-amino-4-fenyylibutyyrihapon disyk-loheksyyliamiinisuolaa (1,84 g) liuotetaan seokseen, jossa on etyyliasetaattia ja natriumbisulfaatin 3% vesiliuosta, ja etyy-liasetaattikerros erotetaan, pestään vedellä, kuivataan ja konsentroidaan sitten liuottimen poistamiseksi. Jäännös liuotetaan dimetyyliformamidiin (20 ml) ja siihen lisätään L-fenyylialanyy-li-L-histidiinin metyyliesteridihydrobromidia (1,91 g), N-hyd-roksisukkiini-imidiä (0,5 g) ja disykloheksyylikarbodi-imidiä (0,9 g) lisätään siihen. Trietyyliamiinia (1,4 ml) lisätään seokseen jäähdyttäen, ja seosta sekoitetaan huoneenlämmössä yön yli. Reaktion tapahduttua seokseen lisätään etyyliasetaattia, ja liukenemattomat aineet suodatetaan pois ja sitten suodos konsentroidaan alipaineessa liuottimen poistamiseksi. Jäännös puhdistetaan silikageelipylväskromatografiällä (liuotin: kloroformi smetanoli=9:1) ja kiteytetään etyyliasetaatilla, jolloin saa- 16 daan N-tert.butoksikarbonyyli-L-2-amino-4-fenyylibutyryyli-L-fenyylialanyyli-L-histidiinin metyyliesteri (1,45 g). Saanto 61%.

Sp. 186-187eC (haj.)

Nujol IR v (cm *1) :3300, 1730, 1685, 1660, 1645

Max NMR (dg -DMSO) 6: 1.36(9H,s), 1.5-1.9(2H,m), 2.35-3.5(6H,m), 3.53(3H,s), 3.7-4.0(1H,m), 4.3-4.7(2H,m) , 6.7-7.45(14H,m), 7.8 - 8.1(1H,m) , 8.4-8.7(lH,m)

Esimerkki 3 (1) N-tert.butoksikarbonyyli-L-2-amino-4-fenyylibutyyrihappoa (2,79 g), L-histidiinimetyyliesteridihydrokloridia (2,42 g), 1-hydroksibentsotriatsolia (1,35 g) ja trietyyliamiinia (2,8 ml) liuotetaan dimetyyliformamidiin (20 ml), ja siihen lisätään di-sykloheksyylikarbodi-imidiä (2,1 g) jäillä jäähdyttäen. Seosta sekoitetaan huoneenlämmössä yön yli. Reaktioseokseen lisätään etyyliasetaattia ja liukenemattomat aineet suodatetaan pois. Suodos pestään natriumbikarbonaatin vesiliuoksella ja natrium-kloridin vesiliuoksella, kuivataan ja konsentroidaan sitten liuottimen poistamiseksi. Jäännös kiteytetään eetterillä, jolloin saadaan N-[N-tert.butoksikarbonyyli-L-2-amino-4-fenyylibu-tyryyli]-L-histidiinin metyyliesteriä (3,3 g) valkoisina kiteinä. Saanto 76,6%.

Sp. 127-130°C Nujol IR v (cm -1) :3320, 1740, 1685, 1650

Max NMR (CDCI3) δ: 1.42(9H,s), 1.7-2.4(2H,m), 2.68(2H,t), 3.12 (2H,d), 3.66(3H,s), 3.95-4.3(1H,m), 4.65-5.0(lH,m), 6.3 - 6.65(1H,m), 6.7 5(1H,s) , 7.0-7.4(5H,m), 7.48(lH,s), 7.4-7.8(lH,m) 91159 17 (2) Kohdassa (1) saatua tuotetta (2,15 g) liuotetaan 20% vety-bromidin ja etikkahapon liuokseen (20 ml) ja seosta sekoitetaan huoneenlämmössä 1 tunti. Reaktioseos konsentroidaan alipaineessa liuottimen poistamiseksi ja jäännös trituroidaan eetterillä, jolloin saadaan N-(L-2-amino-4-fenyylibutyryyli)-L-histidiinin metyyliesteridihydrobromidia. Tuote liutetaan dimetyyliformami-diin (20 ml) ja lisätään N-tert.butoksikarbonyyli-L-fenyyli-alaniinin sukkiini-imidoesteriä (1,81 g) ja trietyyliamiinia (2,1 ml).

Seosta sekoitetaan yön yli. Reaktioseos käsitellään samalla tavalla kuin esimerkissä 2 on kuvattu ja kiteytetään eeterillä, jolloin saadaan N-(N-tert.butoksikarbonyyli-L-fenyylialanyyli)-L-2-amino-4-fenyylibutyryyli-L-histidiinimetyyliesteriä (3,3 g) valkoisina kiteinä. Saanto 69,2%.

Sp. 186-189 eC

Nujol IR v (cm ‘I) :3300, 1740, 1695, 1640 Max NMR (CDCI3 + d6*DMSO) δ: 1.35(9H,s), 1.7- 2.3(2H,m), 2.5-3.2(6H,m), 3.64(3H,s), 4.2-4.8(3H,s), 6.2-6.5(1H,m), 6.78(lH,s), 7.0-7.4(10H,m), 7.46(1H,s), 7.8-8.3(2H,m)

Esimerkki 4 (yhdiste ei kuulu keksinnön piiriin) (1) N-bentsyylioksikarbonyyli-L-fenyylialaniinia (2,99 g) ja p-nitrofenolia (1,39 g) liuotetaan tetrahydrofuraaniin (30 ml), ja lisätään disykloheksyylikarbodi-imidiä (2,1 g) jäillä jäähdyttäen. Seosta sekoitetaan huoneenlämmössä neljä tuntia ja liukenemattomat aineet suodatetaan pois. Etyyliasetaattia lisätään suo-dokseen ja seos pestään natriumbikarbonaatin vesiliuoksella ja natriumkloridin vesiliuoksella, kuivataan ja sitten konsentroidaan liuottimen poistamiseksi. Heksaania lisätään jäännökseen, jolloin saadaan N-bentsyylioksikarbonyyli-L-fenyylialaniini-p-nitrofenyyliesteri kiteinä. Tuote liuotetaan tetrahydrofuraaniin (20 ml), ja jäillä jäähdyttäen lisätään liuos (15 ml), jossa on 18 L-histidiinimetyyliesteridihydrokloridia (2,4 g) ja trietyyli-amiinia (2,8 ml) vedessä, ja seosta sekoitetaan huoneenlämmössä yön yli. Reaktioseos konsentroidaan alipaineessa liuottimen poistamiseksi. Jäännös puhdistetaan silikageelipylväskromatogra-fiällä (liuotin; kloroformi:metanoli=15s 1) ja kiteytetään etyyliasetaatista, jolloin saadaan N-bentsyylioksikarbonyyli-L-fe-nyylialanyyli-L-histidiinimetyyliesteri (2,8 g) värittöminä kiteinä. Saanto 64,1%.

Sp. 113-116 eC

Nujol IR v (cm -1) :3280, 1745, 1710, 1655

Max NMR (d6-DMSO) δ: 2.6 - 3.2(4H,m) , 3.59{3H,s), 4.1- 4.7(2H,m), 4.95 (2H,s), 6.8-7.6(9H,m) , 8.35-8.6(lH,m) (2) Kappaleessa (1) saatu tuote (2,49 g) liuotetaan 25% vetybro-midi-etikkahappoliuokseen (30 ml) ja liuosta sekoitetaan huoneenlämmössä tunti. Reaktioseos konsentroidaan alipaineessa ja jäännös trituroidaan eetterillä, jolloin saadaan L-fenyyli-alanyyli-L-histidiinimetyyliesteridihydrobromidi epäpuhtaana tuotteena. Seosta, jossa on näin saatua tuotetta (1,75 g), N-bentsyylioksikarbonyyli-L-fenyylialaniinin p-nitrofenyyliesteriä (1,55 g), trietyyliamiinia (1,4 ml) ja dimetyyliformamidia (10 ml), sekoitetaan huoneenlämmössä yön yli. Reaktioseos konsentroidaan alipaineessa, ja etyyliasetaattia ja vettä lisätään jäännökseen. Saostuneet kiteet kerätään suodattamalla, jolloin saadaan N-bentsyylioksikarbonyyli-L-fenyylialanyyli-L-fenyyli-alanyyli-L-histidiinimetyyliesteri (1,02 g). Saanto 46,2%.

Sp. 204-206eC

Nujol IR v (cm -1) :3310, 3290, 1740, 1695, 1640

Max NMR (d6-DMSO) δ: 2.4 - 3.2(6H,m), 3.58(3H,s), 4.0- 4.7 5 (3H,m) , 4.92(2H,s), 6 .7-7.6 (1911, m) , 7.9-8.25(1H,m), 8.25 - 8.6(1H,m) li

Esimerkki 5 19 91159 4-[2-(N-bentsyylioksikarbonyyliamino)etyyli]-5-metoksikarbonyy-li-imidatsolia (1,2 g) liuotetaan 30% vetybromidi-etikkahappo-liuokseen (20 ml) ja liuosta sekoitetaan huoneenlämmössä 30 minuuttia. Reaktioseos konsetroidaan alipaineessa ja jäännös tri-turoidaan eetterillä, jolloin saadaan 4-(2-aminoetyyli)-5-metok-sikarbonyyli-imidatsolidihydrobromidia. Näin saatuun tuotteeseen lisätään dimetyyliformamidia (20 ml), N-tert.butoksikarbonyyli-L-fenyylialanyyli-L-fenyylialaniinia (1,65 g) ja 1-hydroksibent-sotriatsolia (0,54 g). Seokseen lisätään disykloheksyylikarbodi-imidiä (0,83 g) jäillä jäähdyttäen ja seosta sekoitetaan 10 minuuttia. Trietyyliamiinia (1,4 ml) lisätään seokseen ja seosta sekoitetaan huoneenlämmössä yön yli. Reaktioseokseen lisätään etyyliasetaattia ja liukenemattomat aineet suodatetaan pois.

Suodos pestään natriumbikarbonaatin vesiliuoksella ja natrium-kloridin vesiliuoksella, kuivataan, ja sitten konsentroidaan liuottimen poistamiseksi. Jäännös puhdistetaan silikageelipyl-väskromatografiällä (liuotin; kloroformi:metanoli=12:1) ja kiteytetään eetterillä, jolloin saadaan 4-{2-[N-(N-tert.butoksi-karbonyyli-L-fenyylialanyyli-L-fenyylialanyyli)amino]etyyli}-5-metoksikarbonyyli-imidatsolia (1,4 g) värittöminä kiteinä. Saanto 62,2%.

Sp. 155-159 eC

KBr IR v (cm -1) :3370, 3280, 1710, 1690, 1650 Max NMR (CDCl3+d6-DMSO) 6: 1.33(9H,s), 2.9 3 .7 (8H,m) , 3.82(3H,s), 4.2-4.8(2H,m), 5.48(1H,brs), 6.9-7.5 (UH, m) , 7.50 (lH,s)

Esimerkit 6-8 N-tert.butoksikarbonyyli-L-fenyylialanyyli-L-fenyylialaniinia [tai N-bentsyylioksikarbonyyli-L-fenyylialanyyli-L-fenyyli-alaniinia] ja 4-aminometyyli-5-metoksikarbonyyli-2-(2-pyridyyli-metyylitio)imidatsolia [tai 4-(2-aminoetyyli)-5-metoksikarbonyy-li-2-(2-pyridyylimetyylitio)imidatsolia] käsitellään samalla 20 tavalla kuin esimerkissä 5 on kuvattu, jolloin saadaan seuraavat yhdisteet.

(6) 4-[N-(N-tert.butoksikarbonyyli-L-fenyylialanyyli-L-fenyyli-alanyyli) aminometyy1i]-5-metoks ikarbonyy1i-2-(2-pyridyy1imetyy-litio)imidatsoli

Sp. 147-150 °C

KBr IR v (cm 'I) :3280, 1705, 1690, 1645

Max NMR (d6-DMSO) 5: 1.26{9H,s), 2.5-3.1(4H,m) , 3.7 0(3 H,s), 3.9-4.7(6H,m), 6.6 - 8.5(17H,m), 12.3 -13.0(1H,br) (7) 4-{2- [N-(N-tert.butoksikarbonyyli-L-fenyylialanyyli-L-fenyy-lialanyyli) amino ] etyyli} - 5-metoks ikarbonyyli-2 - (2-pyridyylime-tyylitio)imidatsoli

Sp. 182-184°C (haj.)

Nu joi IR v (cm - 1) :3275, 1705, 1690, 1645

Max NMR (d6‘DMSO) 5: 1.26(9H,s), 2.4 - 3.1(4H,m) , 3.1-3.3(2H,m) , 3.68(3H,s) , 3.8 - 4.6(6H,m) , 6.7-8.4(17H,m) (8) 4- (N-(N-bentsyylioksikarbonyyli-L-fenyylialanyyli-L-fenyy-lialanyyli) aminometyyli ] -5-metoksikarbonyyli-2- ( 2-pyridyylime-tyylitio)imidatsoli

Sp. 140-142 *C

Nu joi IR v (cm -1) :3270, 1720, 1695, 1640

Max NMR (d6'DMSO) 5 :2.6-3.2(4H,m), 3.70(3H,s), 4.0- 4.7 (6H,m) , 4.84(2H,s) , 6.8 - 8.45(22H,m) , 12.5 -13.0(1H,br)

II

91159 21

Esimerkki 9

Trietyyliamiinia (3,5 ml) lisätään seokseen, jossa on histamii-nidihydrokloridia (1,84 g), N-tert.butoksikarbonyyli-L-fenyyli-alaniinisukkiini-imidoesteriä (3,62 g), dimetyyliformamidia (20 ml) ja vettä (5 ml), jäillä jäähdyttäen ja sitten seosta sekoitetaan huoneenlämmössä 3 tuntia. Reaktioseos konsentroidaan alipaineessa liuottimen poistamiseksi ja etyyliasetaattia lisätään jäännökseen ja sitten liukenemattomat aineet suodatetaan pois. Suodos pestään natriumbikarbonaatin vesiliuoksella ja vedellä, kuivataan, ja sitten konsentroidaan liuottimen poistamiseksi. Jäännös kiteytetään eetterillä, jolloin saadaan N-(N-tert.bu-toksikarbonyyli-L-fenyylialanyyli)histamiinia (2,5 g). Näin saatua tuotetta (1,79 g) liuotetaan 15% vetybromidi-etikkahappoli-uokseen ja liuosta sekoitetaan huoneenlämmössä 30 minuuttia. Reaktioseos konsentroidaan alipaineessa, jolloin saadaan N-(L-fenyylialanyyli)histamiinidihydrobromidia (2,1 g). Näin saatu tuote (2,1 g) liuotetaan dimetyyliformamidiin, ja lisätään N-tert. butoksikarbonyyli-L-fenyylialaniinisukkiini-imidoesteriä (1,81 g) ja trietyyliamiinia (2,1 ml), ja seosta sekoitetaan yön yli. Etyyliasetaattia lisätään reaktioseokseen, ja liukenemattomat aineet suodatetaan pois. Suodos pestään natriumbikarbonaatin vesiliuoksella ja natriumkloridin vesiliuoksella ja kuivataan, ja konsentroidaan sitten liuottimen poistamiseksi. Jäännös puhdistetaan silikageelipylväskromatografiällä (liuotin; kloroformi :metanoli=9 : 1 ) ja kiteytetään eetteristä, jolloin saadaan N-(N-tert .butoks ikarbonyyli-L-fenyylialanyyli-L-fenyylialanyy-li)histamiinia (1,88 g) valkoisina kiteinä. Saanto 74,3%.

Sp. 175-177 °C

KBr IR v (cm ‘1) :3300, 1690, 1650

Max NMR (CDCl3+d6*DMSO) δ: 1.33(9H,s), 2.5-3.6<6H,m), 4.2 - 5.5(5H,m), 6.71(lH,s), 6.9-7.4(12H,m), 7.48(1H,s) 22

Esimerkki 10 10% vetykloridi-dioksaaniliuosta (30 ml) lisätään N-tert.butoksikarbonyyli-L-f enyylalanyyli-L-fenyylialanyyli-L-histidiinime-tyyliesteriin (2f25 g) ja seosta sekoitetaan huoneenlämmössä 2 tuntia. Reaktioseos konsentroidaan alipaineessa liuottimen poistamiseksi ja eetteriä lisätään jäännökseen, jolloin saadaan L-fenyylialanyyli-L-fenyylialanyyli-L-histidiinimetyyliesteridi-hydrokloridia (2,15 g) valkoisena jauheena. Näin saatu tuote (2,15 g) liuotetaan dimetyyliformamidiin (15 ml), ja pivaloyyli-kloridia (0,48 g) lisätään siihen. Seokseen lisätään trietyyli-amiinia (2,24 ml) pisaroittain jäillä jäähdyttäen ja seosta sekoitetaan huoneenlämmössä yön yli. Etyyliasetaatia lisätään reaktioseokseen ja liukenemattomat aineet suodatetaan pois. Suo-dos pestään natriumbikarbonaatin vesiliuoksella ja vedellä, kuivataan ja konsetroidaan sitten liuottimen poistamiseksi. Jäännös puhdistetaan silikageelipylväskromatografialla (liuotin; kloroformi :metanoli= 12 : 1 ) ja trituroidaan eetterillä, jolloin saadaan N-pivaloyyli-L-fenyylialanyyli-L-fenyylialanyyli-L-histidiinin metyyliesteri (0,98 g). Saanto 44,8%.

Sp. 128-131“C

KBr IR v (cm Ί) :3380, 3280, 1740, 1645

Max NMR (dg -DMSO) δ: 0.96(9H,s), 2.6 - 3.3(6H,m) , 3.59(3H,s), 4.3 - 4.8(3H,m), 6.83(lH,s), 7.0-7.5(12H,m), 7.53(lH,s), 7.49(lH,d), 7.94(1H,d)

Esimerkki 11 N-tert.butoksikarbonyyli-L-fenyylialanyyli-L-fenyylialanyyli-L-histidiinimetyyliesteriä (2 g) liuotetaan metanoliliuokseen, joka on kyllästetty ammoniakilla, ja liuosta sekoitetaan paine-pullossa huoneenlämmössä kolme päivää. Reaktioseos konsentroidaan alipaineessa ja jäännös kiteytetään eetterillä, jolloin saadaan N-tert.butoksikarbonyyli-L-fenyylialanyyli-L-fenyyli-alanyyli-L-histidiiniamidi (1,7 g) valkoisina kiteinä. Saanto 87,2%.

91159 23

Sp. 169,6-171‘C (haj.) KBr IR v (cin -1} :3380, 3300, 1670 Max NMR (de-DMSO) 5: 1.26(9H,s), 2.4 - 3.2(6H,m), 3.9- 4.8 (3H,m) , 6.65-7.6(13H,m), 7.9 - 8.3 (2H, in)

Esimerkki 12 N-pivaloyyli-L-fenyylialanyyli-L-fenyylialanyyli-L-histidiinime-tyyliesteriä (1,90 g) liuotetaan tetrahydrofuraaniin (12 ml), ja siihen lisätään pisaroittain liuos, jossa on natriumboorihydri-diä (0,20 g) metanolissa (2,5 ml). Seosta sekoitetaan huoneenlämmössä 4 tuntia, ja seokseen lisätään 5% vetykloridihappoa (4 ml) ja sitten liuotin tislataan pois. Jäännös tehdään emäksiseksi natriumbikarbonaatin vesiliuoksella ja uutetaan sitten etyyliasetaatilla. Uute pestään natriumkloridin vesiliuoksella, kuivataan ja konsentroidaan liuottimen poistamiseksi. Jäännös tri-turoidaan etyyliasetaatilla, jolloin saadaan 4-{2-hydroksimetyy-li-2-[N-(N-pivaloyyli-L-fenyylalanyyli-L-fenyylialanyyli)amino]-etyyli}imidatsoli (1,24 g) valkoisena jauheena. Saanto 68,8%.

Sp. 124-130eC

Nu joi IR v (cm Ί) :3300, 1640

Max NMR (d6-DMSO) 5: 0.97 (9H,s), 2.3 - 3.5(6H,m), 3.7-4.1(2H,m), 4.3-4.7(3H,m), 6.6 - 8.3(16H,m) MS (m/z) : 519 (M+)

Esimerkki 13 (1) Liuos, jossa on fosgeenia (2,6 g) dikloorimetaanissa (25 ml), lisätään pisaroittain seokseen, jossa on L-fenyylialaniini- 24 metyyliesterihydrokloiridia (4/3 g), trietyyliamiinia (6/4 ml) ja dikloorimetaania (25 ml), lämpötilassa -30eC:een alapuolella. Seosta sekoitetaan -30°C:ssa 30 minuuttia ja konsentroidaan alipaineessa liuottimen poistamiseksi. Dimetyyliformamidia (30 ml), N-tert.butoksikarbonyyli-N'-bentsyylihydratsiinia (4,44 g) ja trietyyliamiinia (3,64 ml) lisätään jäännökseen ja seosta sekoitetaan 50eC:ssa viisi tuntia ja sekoitetaan edelleen huoneenlämmössä yön yli. Reaktioseos konsentroidaan alipaineessa liuottimen poistamiseksi, ja etyyliasetaattia ja vettä lisätään jäännökseen. Orgaaninen kerros kerätään talteen, kuivataan ja konsentroidaan sitten liuottimen poistamiseksi. Jäännös puhdistetaan silikageelipylväskromatografiällä (liuotin; tolueenisetyy-liasetaatti=8:1) ja trituroidaan heksaanilla, jolloin saadaan 3-tert.butoksikarbonyyli-2-bentsyylikarbatsoyyli-L-fenyylialanii-nimetyyliesteri (4 g) valkoisena jauheena. Saanto 93,5%.

Sp. 71-73eC

KBr IR v (cm *1) :3400, 3240, 1730, 1650 Max NMR (CDCI3) δ: 1.42(9H,s), 3.13(2H,d), 3.69(3H,s), 4.4-5.1(3H,m), 5.89(1H,brd), 6.01(1H,s), 7.0-7.5(10H,m) (2) Kappaleessa (1) saatua tuotetta (1,71 g) liuotetaan metano-liin (5 ml). Liuottimeen lisätään 2N natriumhydroksidin vesiliuos (2,2 ml) ja seosta sekoitetaan huoneenlämmössä 3 tuntia. Reaktion jälkeen metanoli tislataan pois alipaineessa ja jäännös tehdään happamaksi 10% sitruunahapolla ja sitten seos uutetaan etyyliasetaatilla. Uute pestään natriumkloridin vesiliuoksella, kuivataan ja sitten konsentroidaan liuottimen poistamiseksi, jolloin saadaan 3-tert.butoksikarbonyyli-2-bentsyylioksikarbat-soyyli-L-fenyylialaniinia (1,65 g) epäpuhtaina kiteinä. Näin saatu tuote (1,65 g) liuotetaan dimetyyliformamidiin (20 ml), ja siihen lisätään jäillä jäähdyttäen L-histidiinimetyyliesteridi-hydrokloridia (1,07 g), trietyyliamiinia (1,26 ml), 1-hydroksi-bentsotriatsolia (0,54 g) ja disykloheksyylikarbodi-imidiä 91159 25 (0,91 g). Seosta sekoitetaan huoneenlämmössä yön yli. Etyyliasetaattia lisätään reaktioseokseen, ja liukenemattomat aineet suodatetaan pois. Suodos pestään natriumbikarbonaatin vesiliuoksella ja vedellä, kuivataan ja konsentroidaan sitten liuottimen poistamiseksi. Jäännös puhdistetaan silikageelipylväskromatogra-fiällä (liuotin; kloroformi:metanoli=12:1) ja trituroidaan eetterillä, jolloin saadaan 3-tert.butoksikarbonyyli-2-bentsyyli-karbatsoyyli-L-fenyylialanyyli-L-histidiinimetyyliesteri (1,76 g) värittömänä jauheena. Saanto 77,9%.

Nujol IR v (cm -1) :3400, 3270, 1730, 1655 Max NMR (CDCI3) 5: 1.40(9H,s), 2.9 -3.3(4H,m), 3.65 (3H,s), 4.4-5.0(4H,m), 6.07(lH,d), 6.65- 6.9 (1H, m) , 6.70 (1H, s) , 7.0-7.5 (1H, m) , 7.39(1H,m)

Esimerkit 14-15 3-tert.butoksikarbonyyli-2-bentsyylikarbatsoyyli-L-fenyyli-alaniinia ja histamiinidihydrokloridia tai 4-(2-aminoetyyli)-5-metoksikarbonyyli-2-(2-pyridyylimetyylitio)imidatsolitrihydro-bromidia käsitellään samalla tavalla kuin esimerkissä 13-(2) on kuvattu, jolloin saadaan seuraavat yhdisteet.

(14) N-(3-tert.butoksikarbonyyli-2-bentsyylikarbatsoyyli-L-fe-nyylialanyyli)histamiini KBr IR v (cm -1) :3480, 3250, 1715, 1645 Max NMR (CDCI3) δ: 1.35(9H,s), 2.5*2.8(2H,m), 2.9-3.5(4H,m), 4.3-4.8(3H,m), 6.03(1H,brd), 6.63(1H,s), 6.9-7.4(12H,m) (15) 4-(2-((3-tert.butoksikarbonyyli-2-bentsyylikarbatsoyyli-L-fenyylialanyyli)amino)etyyli]-5-metoksikarbonyyli-2-(2-pyridyylimetyylitio) imidat soli 26

Sp. 132 - 137 ‘e

Nujol IR v (cm *1) :3250, 1710, 1660

Max NMR (CDCI3) δ: 1.38 (9H,s) , 2.9 - 3.8(8H,m), 3.82(2H,s), 4.0-4.9(3H,m) , 5.9 - 6.2(1H,m), 6.9-8.0(15H,m)

Esimerkit 16-18 L-fenyylialaniinimetyyliesteriä ja N-tert.butoksikarbonyyli-N'-fenetyylihydratsiinia tai N-pivaloyyli-N'-bentsyylihydratsiini-hydrobromidia käsitellään samalla tavalla kuin esimerkissä 13- (1) on kuvattu, jolloin saadaan seuraavat yhdisteet.

3-tert .butoksikarbonyyli-2-fenetyylikarbatsoyyli-L-fenyyliala-niinimetyyliesteri

Sp. 97-99*C

Nujol IR v (cm -1) :3400, 3190, 1735, 1640

Max NMR (CDCI3) δ: 1.41(9H,s) , 2.73 - 3.2(4H,m) , 3.65(3H,s) , 3.4-4.0 (2H,m) , 4.6 - 4.9(1H,m) , 5.71 (1H,d) , 5.96(1H,S) , 6.96-7.42(10H,m) 3-pivaloyyli-2-bentsyylikarbatsoyyli-L-fenyylialaniinimetyylies- teri

Sp. 141-143*C

Nujol IR v (cm Ί) :3290, 1725, 1665, 1645

Max NMR (CDCI3) Ö: 1.03(9H,s) , 3.13(2H,d), 3.70(3H,s), 4.40 - 5.10(4H,m), 5.50-5.70 (1H,m) , 6.9-7.50(1011,m)

II

91159 27

Edellä saatuja yhdisteitä ja histamiinidihydrokloridia tai 4-(2-aminoetyyli)-5-metoksikarbonyyli-2-(2-pyridyylimetyylitio)-im-idatsolitrihydrobromidia käsitellään samalla tavalla kuin esimerkissä 13-(2) on kuvattu, jolloin saadaan seuraavat yhdisteet.

(16) N-(3-tert.butoksikarbonyyli-2-fenetyylikarbatsoyyli-L-fe-nyylialanyyli)histamiini

Sp. 87-95eC

Nujol IR v (cm Ί) :3290, 1715, 1645 Max NMR (CDCI3) 6: 1.39(9H,s), 2.56-4.0(2H,d), 4.3-4.6(4H,m), 5.88(lH,d), 6.66(1H,S), 7.0-7.4(1H,m), 7.42 (1H,s), 8.1-8.4(1H,m) (17) N-(3-pivaloyyli-2-bentsyylikarbatsoyyli-L-fenyylialanyy-li)histamiini

Sp. 78-86eC

KBr IR v (cm -1) :3400, 3300, 1650

Max NMR (CDCI3) δ: 0.98(9H,s), 2.6 - 3.6(2H,d) , 4.4-5.0(3H,m), 5.55(1H,d), 6.61(1H,S), 6.95-7.5(10H,m), 8.2-8.9(2H,m) (18) 5-metoksikarbonyyli-4-[2-((3-pivaloyyli-2-bentsyylikarbat-soyyli-L-fenyylialanyyli)amino)etyyli]-2-(2-pyridyylimetyylitio) imidatsoli

Sp. 171-172eC

KBr IR v (cm -1) :3400, 1705, 1660 Max 28 NMR (CDCI3) δ: 1.01 (9H, s) , 2.8-3.8 (6H,m) , 3.83 (3H,s), 4.2-4.8(5H,m). 5.56 - 5.75(1H,m), 6.95-8.00(14H,m) , 8.33 - 8.5(1H,m)

Esimerkki 19 (1) Seokseen, jossa on N-(bentsyylioksikarbonyyli)-L-2-aminoksi- 3-fenyylipropionihappoa (3,09 g), L-histidiinimetyyliesteridi-hydrokloridia (2,42 g), N-hydroksibentsotriatsolia (1,35 g)r trietyyliamiinia (2,8 ml) ja dimetyyliformamidia (20 ml), lisätään disykloheksyylikarbodi-imidiä (2,1 g) jäillä jäähdyttäen, ja seosta sekoitetaan huoneenlämmössä yön yli. Reaktioseos konsentroidaan alipaineessa liuottimen poistamiseksi, ja etyyliasetaattia lisätään jäännökseen. Liukenemattomat aineet suodatetaan pois. Suodos pestään natriumbikarbonaatin vesiliuoksella ja vedellä, kuivataan ja konsentroidaan sitten liuottimen poistamiseksi. Jäännös puhdistetaan silikageelipylväskromatografiällä (liuotin; kloroformi:etyyliasetaatti=12:1) ja kiteytetään hek-saanilla, jolloin saadaan N-[N-(bentsyylioksikarbonyyli)-L-2-aminoksi-3-fenyylipropionyyli]-L-histidiinimetyyliesteriä (2,1 g) valkoisena jauheena.

KBr IR v (cm _1) :3300, 1735, 1665

Max NMR (CDCI3) δ: 2.8-3.2(4H,m), 3.62(3H,s), 4.3- 4.9(2 H,m) , 5.09(2H,s) , 6.66(lH,s), 7.0-7.5(1 OH , m) , 7.36(111,s), 7.95 (1H, d) (2) Kappaleessa (1) saatu tuote (2,1 g) liuotetaan 33% vetybro-midi-etikkahappoliuokseen (30 ml) ja liuosta sekoitetaan huoneenlämmössä tunti. Reaktioseos konsentroidaan alipaineessa liuottimen poistamiseksi ja jäännös trituroidaan eetterillä, jolloin saadaan N-(L-2-aminoksi-3-fenyylipropionyyli)-L-histi-diinimetyyliesteridihydrobromidia (2,32 g). Näin saatu tuote (2,32 g) suspendoidaan dimetyyliformamidiin (20 ml), ja tähän lisätään N-tert.butoksikarbonyyli-L-fenyylialaniinia (1,25 g), 1-hydroksibentsotriatsolia (0,68 g) ja trietyyliamiinia (1,3 11 91159 29 ml). Disykloheksyylikarbodi-imidiä (1/1 g) lisätään seokseen jäillä jäähdyttäen ja seosta sekoitetaan huoneenlämmössä yön yli. Reaktioliuos konsentroidaan alipaineessa ja etyyliasetaattia lisätään jäännökseen. Liukenemattomat aineet suodatetaan pois. Suodos pestään natriumbikarbonaatin vesiliuoksella ja vedellä, kuivataan ja sitten konsentroidaan liuottimen poistamiseksi. Jäännös puhdistetaan silikageelipylväskromatografiällä (liuotin; kloroformi:metanoli=15s 1) ja trituroidaan isopropyyli-eetterillä, jolloin saadaan N-[N-(tert.butoksikarbonyyli-L-fe-nyylialanyyli) -L-2-aminoksi-3-fenyylipropionyyli]-L-histidiini-metyyliesteriä (1,95 g) valkoisena jauheena. Saanto 71,7%.

KBr IR v (cm -1) :3400, 3290, 1745, 1680

Max NMR (CDCI3) δ: 1.35(9H,s), 2.7 - 3.4(6H,m) , 3.70(3H,s) , 4.0 - 5.0(3H,m) , 5.0 - 5.5{1H,m), 6.74(1H,s), 7.0-8.3<llH,d)

Esimerkki 20

Seokseen, jossa on N-(bentsyylioksikarbonyyli)-L-2-aminoksi-3-fenyylipropionihappoa (1,6 g), L-fenyylialanyyli-L-histidiinime-tyyliesteridihydrobromidia (2,39 g), N-hydroksisukkiini-imidiä (0,6 g), trietyyliamiinia (1,4 ml) ja dimetyyliformamidia (20 ml), lisätään disykloheksyylikarbodi-imidiä (1,1 g) jäillä jäähdyttäen ja seosta sekoitetaan sitten huoneenlämmössä yön yli. Reaktioseos konsentroidaan alipaineessa liuottimen poistamiseksi ja etyyliasetaattia lisätään jäännökseen. Liukenemattomat materiaalit suodatetaan pois. Suodos pestään natriumbikarbonaatin vesiliuoksella ja vedellä, kuivataan ja konsentroidaan sitten liuottimen poistamiseksi. Jäännös puhdistetaan silikageelipylväskromatograf iällä (liuotin; kloroformi:metanoli=9s 1) ja kiteytetään eetterillä, jolloin saadaan N-[N-(bentsyylioksikarbonyy-li) -L-2-aminoksi-3-f enyylipropionyyli ] -L-fenyylialanyyli-L-his-tidiinimetyyliesteriä (1,3 g).

30 KBr IR v (cm -1) :3300, 1735, 1650

Max NMR {CDCI3) δ: 2.6-3.3 {6H,in) , 3.62(2H,s), 4.3- 4.9(3H,m), 5.05(2H,s), 6.63(lH,s). 6.8- 7.9 (17 H, ni)

Esimerkki 21 N-pivaloyyli-L-fenyylialaniinia ja N-metyyli-L-fenyylialanyyli-L-histidiinimetyyliesteriä käsitellään samalla tavalla kuin esimerkissä 1 on kuvattu, jolloin saadaan N-pivaloyyli-L-fenyyli-alanyyli-N-metyyli-L-fenyylialanyyli-L-histidiinimetyyliesteri.

Esimerkki 22 N-pivaloyyli-N-metyyli-L-fenyylialaniinia ja L-N-metyylifenyy-lialanyyli-L-histidiinimetyyliesteriä käsitellään samalla tavalla kuin esimerkissä 1 on kuvattu, jolloin saadaan N-pivaloyyli-N-metyyli-L-fenyylialaniini-L-fenylialanyyli-L-histidiinimetyy-liesteri.

Esimerkki 23 N- (N-pivaloyyli-L-fenyylialanyyli)-N'-bentsyylihydratsiinia ja L-histidiinimetyyliesteriä käsitellään samalla tavalla kuin esimerkissä 13 on kuvattu, jolloin saadaan N-pivaloyyli-L-fenyyli-alanyyli-2-bentsyylikarbatsoyyli-L-histidiinimetyyliesteri.

Esimerkki 24 N- (3-pivaloyyli-2-bentsyylikarbatsoyyli) -N' -bentsyylihydratsiinia ja L-histidiinimetyyliesteriä käsitellään samalla tavalla kuin esimerkissä 13 on kuvattu, jolloin saadaan 3-(3-pivaloyyli- 2-bentsyylikarbatsoyyli)-2-bentsyylikarbatsoyyli-L-histidiinime-tyyliesteri.

11

Esimerkki 25 31 91159 N-pivaloyyli-L-fenyylialaniinia ja L-2-aminoksi-3-fenyylipropio-nyyli-L-histidiinimetyyliesteriä käsitellään samalla tavalla kuin esimerkissä 19 on kuvattu, jolloin saadaan N-(N-pivaloyyli-L-fenyylialanyyli) -L-2-aminoksi-3-fenyylipropionyyli-L-histidii-nimetyyliesteri.

Esimerkki 26 N-pivaloyyli-L-2-aminoksi-3-fenyylipropionihappoa ja L-2-aminok-si-3-fenyylipropionyyli-L-histidiinimetyyliesteriä käsitellään samalla tavalla kuin esimerkissä 19 on kuvattu, jolloin saadaan N- (N-pivaloyyli-L-2-aminoksi-3-fenyylipropionyyli) -L-2-aminoksi- 3-fenyylipropionyyli-L-histidiinimetyyliesteri.

Esimerkit 27-32

Esimerkeissä 21-26 saadut yhdisteet muutetaan amideikseen samalla tavalla kuin esimerkissä 11 on kuvattu, jolloin saadaan seu-raavassa taulukossa 3 esitetyt yhdisteet.

32

Taulukko 3

Nro Yhdisteet 27 t-BuCO-L-Phe-L-MePhe-L-His-NH2 28 t-BuCO-L-MePhe-L-MePhe-L-His-NH2 CH2 Ph 29 t-BuCO-L-Phe-NHN- CO -L-His-NH2 CH2Ph CH2Ph 30 t-BuCO-NHN-CONHN- CO -L- H is -NH2 CH2PI1 31 t-BuCO-L-Phe-L-NH- O -CH- CO-L- His -NH2 CH2Ph CjH2Ph 32 t-BuCO-L-NH-O-CH-CO-L-NH-O-CH-CO-L-His-NH2

Huom.: taulukossa 3 olevien lyhenteiden merkitykset ovat seuraa-vat:

Lyhenteet Merkitykset t-Bu tert.butyyli

Ph fenyyli

Phe fenyylialaniini

MePhe N-metyylifenyylialaniini li

Claims (4)

91159 33

1. Menetelmä yleisen kaavan (I) mukaisten imidatsolipitoisten peptidien tai niiden farmaseuttisesti sopivien suolojen valmistamiseksi: R2 R3 R4 R5 . 1 1 , I >2 /^ψ{ p6 m r‘-con—x-con—x2-co-nh—a—f U) jossa R1 on haarautunut alkyyliryhmä, haarautunut alkoksiryhmä tai fenyyliryhmällä substituoitu alempi alkoksiryhmä, R2 ja R4 ovat samoja tai erilaisia ja kumpikin on vetyatomi tai alempi alkyyliryhmä, R3 ja R5 ovat fenyyliryhmällä substituoitu alempi alkyyliryhmä, R6 on vetyatomi tai alempi alkoksikarbonyyliryh-mä, R7 on vetyatomi tai pyridyyliryhmällä substituoitu alempi alkyylitioryhmä, X1 ja X2 ovat samoja tai erilaisia ja kumpikin on -CH-, -OCH- tai -N-, A on alempi alkyleeniryhmä, joka voi olla substituoitu alemmalla alkoksikarbonyyliryhmällä, hydrok-simetyyliryhmällä tai seuraavan kaavan mukaisella ryhmällä: -CON—R® ^R9 jossa R® ja R9 ovat samoja tai erilaisia ja kumpikin on vety-atomi tai alempi alkyyliryhmä, sillä ehdolla, ettei N-bentsyy-lioksikarbonyyli-fenyylialanyyli-fenyylialanyyli-histidiinime-tyyliesteri kuulu näiden yhdisteiden joukkoon, tunnettu siitä, että: [I]-(A) kondensoidaan kaavan (II) mukainen yhdiste, tai sen suola tai sen reaktiivinen johdannainen: R2 R3 r'-con—x'-cooh (ii) jossa substituentit tarkoittavat samaa kuin yllä, kaavan (III) mukaisen yhdisteen, tai sen suolan kanssa: R4 R5 HN— X2-CONH—A.—UI I) R 34 jossa substituentit tarkoittavat samaa kuin yllä, tai (B) kondensoidaan kaavan (IV) mukainen yhdiste, tai sen suola tai sen reaktiivinen johdannainen: R2 R3 R4 R5 i I ^ , ^2 (IV) R-CON-X'-CON—X2-COOII UVj jossa substituentit tarkoittavat samaa kuin yllä, kaavan (V) mukaisen yhdisteen, tai sen suolan kanssa: h2n-a-^^-r6 (V) jossa substituentit tarkoittavat samaa kuin yllä, tai (C) kondensoidaan kaavan (VI) mukainen yhdiste tai sen suola tai sen reaktiivinen johdannainen: R1COOH (VI) jossa substituentti tarkoittaa samaa kuin yllä, kaavan (VII) mukaisen yhdisteen tai sen suolan kanssa: R2 R3 R4 R5 HN-X'-CON—X2-CONH— A—(VH) jossa substituentit tarkoittavat samaa kuin yllä, ja [II] kun lopputuote on yhdiste (I), jossa R6 on vetyatomi ja A on alemmalla alkoksikarbonyyliryhmällä substituoitu alempi al-kyleeniryhmä, valinnaisesti pelkistetään tämä, jolloin saadaan kaavan (I) mukainen yhdiste, jossa R6 on vetyatomi ja A on hyd-roksimetyyliryhmällä substituoitu alempi alkyleeniryhmä, tai annetaan sen reagoida kaavan (VIII) mukaisen amiiniyhdisteen tai sen suolan kanssa: NH—R8 (VIII) VR9 jossa R® ja R9 ovat samoja tai erilaisia ja kumpikin on vety-atomi tai alempi alkyyliryhmä, jolloin saadaan kaavan (I) II 91159 35 mukainen yhdiste, jossa R6 on vetyatomi ja A on alempi alky-leeniryhmä, joka on substituoitu seuraavan kaavan mukaisen ryhmän kanssa: -CON— Re ^R9 jossa substituentit tarkoittavat samaa kuin yllä, ja [III] haluttaessa muutetaan kohdissa [I] ja [II] saadut tuotteet farmaseuttisesti sopiviksi suoloikseen.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että R1 on haarautunut alkyyliryhmä, jossa on 3-6 hiiliatomia, haarautunut alkoksiryhmä, jossa on 3-6 hiiliatomia tai fenyyliryhmällä substituoitu alempi alkoksiryhmä.

3. Patenttivaatimuksen 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että A on alempi alkyleeniryhmä, alemmalla alkoksikar-bonyyliryhmällä substituoitu alempi alkyleeniryhmä, hydroksime-tyyliryhmällä substituoitu alempi alkyleeniryhmä tai karbamoyy-liryhmällä substituoitu alempi alkyleeniryhmä.

4. Patenttivaatimuksen 3 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että R1 on tert.-butyyli, tert.-butyylioksi tai bentsyy-lioksi, R2 ja R4 ovat vetyatomi tai metyyli, R3 ja R1 ovat bent-syyli tai fenetyyli, R6 on vetyatomi tai metoksikarbonyyli, R7 on vetyatomi, 2-pyridyylimetyylitio tai 3-pyridyylimetyylitio, ja A on metyleeni, etyleeni, metoksikarbonyylietyleeni, hydrok-simetyylietyleeni tai karbamoyylietyleeni. Patenttivaatimuksen 4 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että R1 on tert.-butyyli tai tert.-butyylioksi, ja R3 ja R1 ovat bentsyyli. 36