FI91159C - Menetelmä imidatsolipitoisten peptidien ja niiden farmaseuttisesti sopivien suolojen valmistamiseksi - Google Patents

Description

91159 i

MENETELMA IMIDATSOLIPITOISTEN PEPTIDIEN JA NIIDEN FARMASEUTTI-SESTI SOPIVIEN SUOLOJEN VALMISTAMISEKSI

Keksinnon alue

Tama keksintd koskee menetelmaa uusien imidatsolipitoisten pep-tidien ja niiden farmaseuttisesti sopivien suolojen valmistami-seksi.

KeksinnQn tausta

On tunnettua, ettå N-asetyyli-L-fenyylialanyyli-L-fenyyliala-nyyli-L-histidiinimetyyliesterilia on mahahaavan ja haavauman-vastainen vaikutus (US-patentti nro 4.048.305).

Keksinnon vhteenveto

Tuloksena erilaisista tutkimuksista on odottamatta havaittu, etta samalla kun yliaolevilla tunnetuilla yhdisteilia on niu-kasti iirauunomodulatiivinen vaikutus, on peptideilia, jotka saadaan korvaamalla tunnetun yhdisteen asetyyliryhma isolla ryhmalia, kuten pivaloyyliryhma, tert.butyylioksikarbonyyliryh-ma tai bentsyylioksikarbonyyliryhma, voimakas immunomodulatii-vinen vaikutus.

Niinpa tåmån keksinndn tarkoituksena on esittaa uusi menetelma imidatsolipitoisen peptidin valmistamiseksi, jolla on erinomai-nen immunomodulatiivinen vaikutus.

Keksinndn vksitviskohtainen kuvaus

Taman keksinnon mukaisella menetelmalia valmistetaan seuraavan kaavan (I) mukaisia imidatsolipitoisia peptideja tai niiden farmaseuttisesti sopivia suoloja: R2 R3 R4 R5 . μ, i i2 _y^pR6 fn R —CON—X —CON—X2—CO— NH—A—^ 2 jossa R1 on haarautunut alkyyliryhma, haarautunut alkoksiryhmå tai fenyyliryhmalla substituoitu alempi alkoksiryhma, R2 ja R4 ovat samoja tai erilaisia ja kumpikin on vetyatomi tai alempi alkyyliryhmS, R3 ja R5 ovat fenyyliryhmaiia substituoitu alempi alkyyliryhma, R6 on vetyatomi tai alempi alkoksikarbonyyliryh-ma, R7 on vetyatomi tai pyridyyliryhmaiia substituoitu alempi alkyylitioryhmS, X1 ja X2 ovat samoja tai erilaisia ja kumpikin on -CH-, -OCH- tai -N-, A on alempi alkyleeniryhma, joka voi olla substituoitu alemmalla alkoksikarbonyyliryhmaiia, hydrok-simetyyliryhmaiia tai seuraavan kaavan mukaisella ryhmallM: -CON— R8 ^R9 jossa R8 ja R9 ovat samoja tai erilaisia ja kumpikin on vetyatomi tai alempi alkyyliryhma, silla ehdolla, ettei N-bentsyy-lioksikarbonyyli-fenyylialanyyli-fenyylialanyyli-histidiinime-tyyliesteri kuulu nåiden yhdisteiden joukkoon, ja keksinnolle on tunnusomaista se mita on esitetty patenttivaatimusten tun-nusmerkkiosassa.

Keksinndn mukaisella menetelmaiia valmistettavalla yhdisteella (I) tai sen suolalla on lukuisia erinomaisia ominaisuuksia immunomodulaattorina. Yhdisteella (I) tai sen suolalla on esi-merkiksi voimakas makrofaagien kulkeutumista lisaava vaikutus makrofaagien kulkeutumiskokeessa, jota kaytetaan mitattaessa soluvalitteistå immuuniaktiivisuutta. Yhdisteella (I) on myds voimakas immunomodulatiivinen vaikutus kuten viivastynyt liika-herkkyys. Lisaksi yhdisteella (I) tai sen farmaseuttisesti sopivalla suolalla on alhainen myrkyllisyys ja se on erittSin turvallinen.

Esimerkkeja keksinnon imidatsolipitoisesta peptideista ovat ne kaavan (I) yhdisteet, joissa R1 on haarautunut alkyyliryhma, jossa on 3-6 hiiliatomia, haarautunut alkoksiryhma, jossa on 3-6 hiiliatomia tai fenyyliryhmSlia substituoitu alkoksifCj.«)-ryhma, ja R7 on vetyatomi tai pyridyyliryhmaiia substituoitu alkyylitio()-ryhmå.

Muita esimerkkeja keksinndn mukaisella menetelmalla valmistet-tavista yhdisteistS ovat ne kaavan (I) mukaiset yhdisteet, joissa R2 ja R4 ovat vetyatomi tai alkyyliryhma, jossa on 1-4

II

3 91159 hiiliatomia, R3 ja R5 ovat fenyyliryhmållå substituoitu alkyyli(C^)-ryhma, R6 on alkoksifC^J-karbonyyliryhina, ja A on alkyleeniryhmå, jossa on 1-4 hiiliatomia/ alkoksifCi..,)-karbo-nyyliryhmallå substituoitu alkyyleenifCi.*)-ryhma, hydroksime-tyyliryhmållS substituoitu alkyleenifCi..*) -ryhma/ karbamoyy-liryhmalla substituoitu alkyleeniiCi.*)-ryhmS, N-monoalkyyli-(Ci.*)-karbamoyyliryhmalla substituoitu alkyleenifC^)-ryhma/ tai N-dialkyyliiC^J-karbamoyyliryhmSlla substituoitu alkylee-niiCi^J-ryhma.

Edullisia esimerkkejå keksinndn mukaisella menetelmSlla valmis-tettavista yhdisteista ovat ne kaavan (I) mukaiset yhdisteet, joissa R1 on tert.-butyyli, tert.-butyylioksi tai bentsyyliok-si/ R2 ja R4 ovat vetyatomi tai metyyli, R3 ja R5 ovat bentsyyli tai fenetyyli/ R6 on vetyatomi tai metoksikarbonyyli, R7 on vetyatomi, 2-pyridyylimetyylitio tai 3-pyridyylimetyylitio, ja A on metyleeni, etyleeni, metoksikarbonyylietyleeni, hydroksi-metyylietyleeni tai karbamoyylietyleeni.

Edullisempia keksinnon yhdisteita ovat ne kaavan (I) mukaiset yhdisteet, joissa R2 ja R4 ovat vetyatomi ja R3 ja R5 ovat bentsyyli .

Kaavan (I) mukainen imidatsolipitoinen peptidi voi esiintyå tautomeeristen isomeerien muodossa imidatsoliosassa, kuten seuraavassa kaavassa on esitetty: ^ NH^r7 jossa symbolit ovat samat kuin edellå on mSSritelty, ja tåmå keksinto kåsittaS namå isomeerit.

Lisåksi kaavan (I) mukainen imidatsolipitoinen peptidi voi esiintyå optisten isomeerien muodossa, kun siihen liittyy asym-metrinen hiiliatomi tai -atomeita, ja kaikki optiset isomeerit tai niiden seokset kuuluvat keksinnon piiriin. NMiden isomeerien joukossa yhdiste, jossa kaikki asymmetriset hiiliatomit ovat (S)-konfiguraatiossa, on kuitenkin edullisempi farmaseuttiseen kåyttoon.

4

Keksinnon mukaan imidatsolipitoinen peptidi (I) voidaan valmis-taa seuraavien vaiheiden mukaan: (A) seuraavan kaavan mukaisen yhdisteen: R2 R3 , I I. (in

R -CON—X -COOH

jossa symbolit ovat samat kuin edella on mååritelty, sen suolan tai reaktiivisen johdannaisen kondensoiminen seuraavan kaavan mukaisen yhdisteen kanssa: R4 R5 I I 6 HN—X2—CONH—A—(III)

R

jossa symbolit ovat samat kuin edellå on mååritelty, tai sen suolan kanssa, tai (B) kondensoidaan seuraavan kaavan mukainen yhdiste: R2 R3 R4 R5 r'-con-x'-con—x2- coon lIV) jossa symbolit ovat samat kuin edella on mååritelty, sen suola tai reaktiivinen johdannainen seuraavan kaavan mukaisen yhdisteen kanssa: 1IjN_A_^JV (v) 91159 5 jossa symbolit ovat samat kuin edellå on mååritelty, tai sen suolan kanssa, tai (C) kondensoidaan seuraavan kaavan mukainen yhdiste: R1 -COOH (VI) jossa symboli on sama kuin edellå on mååritelty, sen suola tai reaktiivinen johdannainen seuraavan kaavan mukaisen yhdisteen kanssa: R2 R3 R4 R5 , i || h 6 (VII) HN—X — CON—X2—CONH—A— jossa symbolit ovat samat kuin edellå on mååritelty, tai sen suolan kanssa.

Yhdisteiden (I) joukossa seuraavan kaavan mukainen yhdiste: R2 R3 R4 R5 || |l, . ,T , r'-CON-x'-CON—X2-C0NII—A—V -J_)7 (I a)

N K

jossa R*1 on vetyatomi, A1 on hydroksimetyylisubstituoitu alempi alkyleeniryhmå ja Rl , R* , R* , R* , Rs , R7 , X1 ja X* ovat samat kuin edellå on mååritelty, voidaan myos valmistaa (D) pelkistå-mållå seuraavan kaavan mukainen yhdiste: R2 R3 R4 R5 I I I L 'i (I-b) R —CON—X—CON—X2—CONH A—^ -Zj^R7 1

N^ R

6 jossa A11 on alempi alkoksikarbonyylisubstituoitu alempi alky-leeniryhma ja R1 , RJ , R3 , R4 , R5 , R61 , R7 , X1 ja Xs ovat samoja kuin edella on mååritelty, tai sen suola.

Edelleen, seuraavan kaavan mukainen yhdiste: ^ * /-π» l61 U1 —CON—X, —CON—X2 —CO Nil A \ -J 'S (I'c)

N*^ K

jossa As on alkyleeniryhmå, joka on substituoitu kaavan: -CON<-R8 R8 mukaisella ryhmållå (jossa symbolit ovat samat kuin edella on maåritelty), voidaan valmistaa (E) antaxnal-la yhdisteen (I-b) tai sen suolan reagoida amiiniyhdisteen kans-sa, jolla on kaava: nh<rrS, (VIII) jossa symbolit ovat samat kuin edella on maåritelty, tai sen suolan kanssa.

Edellåmainituissa reaktiossa yhdisteitå (III), (V), (VII), (VIII) ja (I-b) voidaan kåyttåå joko vapaana tai suolansa muo-dossa. On edullista kåyttåå nåiden yhdisteiden suoloja happoad-ditiosuolan muodossa. Esimerkkejå suolasta ovat epåorgaaniset happoadditiosuolat, kuten hydrokloridi, hydrobromidi, sulfaatti tai nitraatti, orgaaniset happoadditiosuolat, kuten p-tolueeni-sulfonaatti, metaanisulfonaatti tai trifluoriasetaatti, ja niin edelleen. Lisåksi yhdisteet (II), (IV) ja (VI) voivat olla suolansa muodossa ja esimerkkejå suolasta ovat alkalimetallisuola, trialkyyliamiinisuola tai pyridiinisuola.

II

91159 7

Sopivia esimerkkejå yhdisteiden (II)/ (IV) ja (VI) reaktiivisis-ta johdannaisista ovat vastaavat happohalogenidit (esim. happo-kloridi, happobromidi), seka-anhydridit (esim. seka-anhydridi alkyylikarbonaatin kanssa), aktiiviset esterit (esim. esteri pentakloorifenolin kanssa, p-nitrofenoli, 2,4-dinitrofenoli, N-hydroksisukkiini-imidi, N-hydroksiftaali-imidi, 1-hydroksibent-sotriatsoli tai l-hydroksi-2-pyrrolidoni), happoatsidi ja muut reaktiiviset johdannaiset, kuten amidi imidatsolin kanssa, 4-substituoitu imidatsoli tai triatsoli.

Menetelmå <A\. ia (C\

Yhdisteen (II) tai sen reaktiivisen johdannaisen kondensoiminen yhdisteen (III) tai sen suolan kanssa, yhdisteen (IV) tai sen reaktiivisen johdannaisen kondensoiminen yhdisteen (V) tai sen suolan kanssa ja yhdisteen (VI) tai sen suolan kondensoiminen yhdisteen (VII) tai sen suolan kanssa voidaan toteuttaa tavan-omaisilla peptidien synteesitavoilla. Esimerkiksi kun yhdistettå (II), (IV) tax (VI) kåytetåån reaktiivisen johdannaisensa muo-dossa, kondensointireaktio voidaan suorittaa joko happoaksepto-rin låsnåollessa tai ilman sitå liuottimessa. Sopivia esimerkkejå happoakseptorista ovat alkalimetallihydroksidit (esim. nat-riumhydroksidi, kaliumhydroksidi), alkalimetallikarbonaatit (esim. natriumkarbonaatti, kaliumkarbonaatti), alkalimetallibi-karbonaatit (esim. natriumbikarbonaatti, kaliumbikarbonaatti), trialkyyliamiinit (esim. trimetyyliamiini, trietyyliamiini), Ν,Ν-dialkyylianiliinit (esim. Ν,Ν-dimetyylianiliini, N,N-dietyy-lianiliini), pyridiini, N-alkyylimorfoliinit (esim. N-metyyli-morfoliini) ja niin edelleen. Dioksaani, tetrahydrofuraani, ase-tonitriili, kloroformi, metyleenikloridi, dimetyyliformamidi, Ν,Ν-dimetyyliasetamidi, etyyliasetaatti, pyridiini, asetoni ja vesi ovat sopivia liuottimeksi.

Toisaalta, kun kåytetåån yhdistettå (II), (IV) tai (VI) vapaan hapon tai sen suolan muodossa, kondensointireaktio voidaan suorittaa vettå poistavan aineen låsnåollessa liuottimessa. Sopivia esimerkkejå vettå poistavasta aineesta ovat N,N'-disykloheksyy-likarbodi-imidi, N-sykloheksyyli-N'-morfolinokarbodi-imidi, N-etyyli-N'-(3-dimetyyliaminopropyyli)karbodi-imidi, fosforioksi-kloridi, fosforitrikloridi, tionyylikloridi, oksalyylikloridi, δ trifenyylifosfiini ja vastaavat. Vilsmeierin reagensseja, jotka on valmistettu dimetyyliformamidista ja fosforioksikloridista, dimetyyliformamidista ja oksalyylikloridista, dimetyyliformami-dista ja fosgeenista tai dimetyyliformamidista ja tionyyliklori-dista, voidaan myos kayttaå mainittuna vetta poistavana aineena.

Samaa liuotinta, joka mainittiin reaktiivisen johdannaisen kon-densoinnissa, voidaan kayttaå tåsså vaiheessa.

Menetelmå (ΡΪ

Yhdisteen (I-b) tai sen suolan pelkistysreaktio voidaan suorit-taa kåsittelemållå sitå pelkistimellå liuottimessa. Esimerkkejå pelkistimistå ovat natriumboorihydridi, kalsiumboorihydridi tai litiumboorihydridi. Tetrahydrofuraania, isopropanolia, etanolia ja metanolia voidaan kåyttåå liuottimena.

Menetelma fE)

Yhdisteen (I-b) tai sen suolan reaktio yhdisteen (VIII) kanssa voidaan suorittaa liuottimessa. Metanoli, etanoli, dimetyylifor-mamidi ja vastaavat ovat sopivia liuottimeksi.

On edullista suorittaa edella mainitut reaktion (A) - (E) låmpo-tilassa -50 - 50eC.

Haluttu yhdiste (I), låhtoyhdisteet (II) - (V) ja (VII) kåsittå-våt joko optisia isomeereja asymmetris(t)en hiiliatomi(e)n takia tai niiden seoksen. Koska edella mainitut keksinnon reaktiot etenevat ilman rasemisoitumista, yhdiste (I) saadaan heti opti-sesti aktiivisen isomeerin muodossa kåyttåmållå vastaavia låh-toyhdisteiden optisesti aktiivisia isomeereja.

Kuten edella on mainittu, keksinnon yhdisteellå (I) tai sen suo-lalla on voimakas immunomodulatiivinen vaikutus. Erityisesti yhdiste (I) aktivoi makrofaagien kulkeutumista (s.o. makrofaagi-en, jotka pysyvåt kroonisesti tulehtuneessa kohdassa) saamalla sen låhtemåån tulehtuneesta kohdasta, ja samaan aikaan yhdiste (I) eståå viivåstyneen liikaherkkyyden. Sen vuoksi yhdiste (I) on kåyttokelpoinen hoidettaessa ja/tai ennaltaehkåiståesså auto-immuunisairauksia, kuten nivelreumaa, multippeliskleroosia, sys-

II

91159 9 teemistå punahukkaa (SLE), munuaistautia, reumaattista kuumetta ja tyypin I diabetestå ja atooppista allergiaa.

Keksinnon imidatsolipitoista peptidiå (I) voidaan kayttåa far-maseuttiseen kåyttodn joko vapaan emaksen tai suolan muodossa. Yhdisteen (I) farmaseuttisesti sopivia suoloja ovat esimerkiksi epåorgaaniset happoadditiosuolat, kuten hydrokloridi, hydrobro-midi, fosfaatti ja sul£aatti, ja orgaaniset happoadditiosuolat, kuten oksalaatti, asetaatti, laktaatti, sitraatti, tartraatti, fumaraatti, maleaatti, aspartaatti, metaanisulfonaatti ja bent-soaatti.

Imidatsolipitoista peptidiå (I) tai sen suolaa voidaan antaa . joko oraalisesti tai parenteraalisesti lamminverisille elåimil-le, mukaanluettuna ihmiset, ja niita voidaan myos kayttåa far-maseuttisen valmisteen muodossa, joka sisåltåa tåtå yhdistettå seoksena farmaseuttisten tåyteaineiden kanssa, jotka sopivat oraalisesti tai parenteraalisesti annettaviksi. Farmaseuttiset valmisteet voivat olla kiinteåsså muodossa kuten tabletit, ra-keet, kapselit ja jauheet, tai nestemåisinå, kuten liuokset, suspensiot tai emulsiot. Lisaksi, annettaessa parenteraalisesti niitå voidaan kåyttåå injektioiden muodossa.

Imidatsolipitoisen peptidin (I) tai sen suolan annos voi vaih-della riippuen antotavasta, potilaan iåstå, painosta ja tilasta, ja sairauden laadusta, ja on edullisesti noin 0,01-100 mg/kg påivåsså, erityisesti 0,1-30 mg/kg påivåsså.

Låhtoyhdisteet (III), (V) ja (VIII) voidaan valmistaa pepti-disynteesille tavanomaisella tavalla. Esimerkiksi låhtdyhdiste (III) vodiaan valmistaa kondensoimalla seuraavan kaavan mukainen yhdiste: R* R5 γί.Ν-χΖ-ΟΟΟΗ (IX) 10 jossa Y1 on aminosuojaryhmå, R4 , Rs ja X2 ovat samoja kuin edella on maaritelty, tai sen suola yhdisteen (V) tai sen suolan kanssa, ja poistamalla suojaryhraå tuotteesta. Yhdiste (IV) voi-daan valmistaa kondensoimalla yhdiste (II) tai sen reaktiivinen johdannainen seuraavan kaavan mukaisen yhdisteen: R4 R5 I L j «) hn-x2-cooy2 jossa Y2 on karboksisuojaryhma, ja R4 , R5 ja X2 ovat samoja kuin edella on maaritelty, tai sen suolan kanssa, ja poistamalla suo-jaryhma tuotteesta. LisSksi yhdiste (VII) voidaan valmistaa kondensoimalla seuraavan kaavan mukainen yhdiste: R2 R3 , I 1 , (xi)

Y-N-X-COOH

jossa symbolit ovat samat kuin edella on maaritelty, tai sen reaktiivinen johdannainen yhdisteen (III) tai sen suolan kanssa, tai kondensoimalla seuraavan kaavan mukainen yhdiste: R2 R3 R4 R5 y'-n-x'—con—x2— coon (XI1) jossa symbolit ovat samat kuin edella on maaritelty, tai sen raktiivinen johdannainen yhdisteen (V) tai sen suolan kanssa, ja poistamalla suojaryhmå tuotteesta.

II

91159 11

Edella mainituissa reaktioissa monia eri suojaryhmiå, joita ta-vallisesti kaytetaan suojaamaan amino- tai karboksiryhmaa (-ryh-mia) peptidisynteesissa, voidaan kåyttåa suojaryhmana tai -ryh-mina (Y1 ja/tai Y7 ).

Koe 1

Vaikutus rakkulamaisten makrofaaoien kulkeutumiseen (Menetelma)

Japanilaiset valkoiset naaraskanit, jotka painoivat 3-4 kg,^ta-pettiin nukutuksessa. Rakkulamaiset makrofaagit saatiin huuhte-lemalla keuhkot suolaliuoksella.

"Koeryhmåsså" makrofaagit kulkeutuivat RPMI-1640 -kasvualustas-sa, joka sisålsi 5 % kanin seerumia ja 10'7 M koeyhdistetta. Mainittu kulkeutumistesti suoritettiin 37eC:ssa 24 tuntia mene-telman mukaan, joka on kuvattu julkaisussa Journal of Leukocyte Biology 42: 197-203 (1987). Kulkeutumistulos projisoitiin noin 15-kertaisella suurennoksella ja sille annettiin pisteet. Sitten kulkeutumisalue mitattiin planimetrilla.

Kulkeutumistesti "positiivisessa kontrolliryhmassH" suoritettiin kåyttSmållå RPMI-1640 -kasvualustaa, joka sisalsi 5 % kanin seerumia ja 5 mM L-fukoosia, koeyhdistetta sisaltavan kasvualustan sijasta. Toisaalta koe "kontrolliryhmassa" suoritettiin kayttaen kasvualustaa, joka sisalsi pelkastaan 5 % kanin seerumia. Kul-keutumisindeksi laskettiin seuraavan kaavan mukaan:

Ikoeryhman kulkeutumis-kontrolliryhman^

Kulkeutumis- _ Value_I \kulkeutumisalue; x |qo

indeksi fpositiivisen kontrolli-\ /kontrolliryhmanN

\ryhman kulkeutumisalue J ykulkeutumisalueJ

(Tulokset)

Kaikkien taulukossa 1 esitettyjen yhdisteiden kulkeutumisindeksi oli enemman kuin 100.

12 laciukko 1

Nro Koeyhdisteet 1 BOC-L-Phe-L-Phe-lL-His-OMe 2 BOC-L-Phe-L-Phe-NH0*He

^NM

3 BOC - L - Phe - L - Phe - NHCH2 -v, s

4 BOC-L-Phe-L-Phe-NH

_' TcT-O

5 BOC-L-Phe-L-Phe-NH

6 t-BuCO-L-Phe-L-Phe-L-His-OMe 7 BOC-L-Phe-L-Phe-L-Hi s -NH2 8 BOC-azaPhe-L-Phe-L-His-OMe 9 BOC-azaPhe-L- Phe-NH·. ^

V-NH

10 BOC-azaPhe-L-Phe-NH He V%!

11 t-BuCO-azaPhe-L-Phe-NH

12 t - Bu CO - azaPhe - L - Phe - NH

V# _Scrti n 13 BOC-L-Phe-L-NHOCHCO-L-His-OMe , — - - - ---- , - ,

II

91159 13

Huomautus: Taulukossa 1 lyhenteiden merkitykset ovat seuraavat: Lvhenne Merkitvs BOC tert.butyy1ioks ikarbonyy1i

Me metyyli t-Bu tert.butyyli

His histidiini

Phe fenyylialaniini azaPhe -NHNCO· CH2-0

Koe 2

Inhibiittorivaikutus pikrwlikloridilla indusoituun viivastvnee- seen liikaherkkwteen (Menetelraa) BALB/C-naarashiiret (10 viikon ikaisia) herkistettiin levitta-målla 1 ml etanoliliuosta, joka sisalsi 7 w/v-% pikryylikloridia hiirten vatsanahkaan. "Koeryhmåsså" koeyhdistettå annettiin oraalisesti hiirille 7 påivåå alkaen herkistamispåivåstå.

7 paivåå herkistamisen jalkeen levitettiin 10 pi oliivioljy-liuosta, joka sisalsi 1 w/v-% pikryylikloridia, vasemman ulko-korvan molempien puolien ihoon. 24 tunnin kuluttua hiiret tapet-tiin ja molempien korvien paksuus mitattiin.

Ulkokorvan turpoamisen estyminen (%) laskettiin seuraavan kaavan mukaan: /koeryhman vasemman ulko-Λ ^koeryhman oikean ulkoA \korvan paksuus J ^korvan paksuus j

1 - --- xlOO

ikontrolliryhmån vasemman] /kontrolliryhmån oikean s. iulkokorvan paksuus / yulkokorvan paksuus /> 14 (Tulokset)

Tulokset on esitetty seuraavassa taulukossa 2.

Taulukko 2

Koeyhd i steet Annos Ulkokorvan turpoamisen (iflQ/kQ) estyminen (%) B0C-a2aPhe*L-Phe-L-His-0Me 10 72.6 BOC-asaPhe-L-Phe-ΝΗνΛ^ 2 70.1 t-BuCO-az&Phe·L-Phe-Λ_ 2 68.5

'' N. NH

V

B0C-a2aPhe-L-Phe-NH^/\_^>C02Me 10 65.1

NH

V ri

SCK2^lT

t - BuCO - sza Phe · L · ?‘ne · ΝΗν Λ ^ CO?Mq 10 55.0

N7 NH

Y X) SCH2^%

Kontrolli ®

Huom.: Taulukossa 2 on kåytetty samoja lyhenteitå kuin taulukossa 1.

II

91159

Esimerkki 1 15 L-fenyylialanyyli-L-histidiinin metyyliesteridihydrobromidia (1,75 g) liuotetaan seokseen, jossa on dimetyyliformamidia (10 ml) ja trietyyliamiinia (1,4 ml), ja siihen lisåtåån N-tert.-butoksikarbonyyli-L-fenyylialaniinisukkiini-imidoesteriå (1,34 g). Seosta sekoitetaan huoneenlammossa yon yli. Seokseen lisatåan etyyliasetaattia ja liukenemattomat aineet suodatetaan pois. Suodos peståån natriumbikarbonaatin vesiliuoksella ja siihen lisatåan natriumkloridin vesiliuosta. Saostuneet kiteet -peståån etyyliasetaatilla ja vedellå ja kuivataan, jolloin saadaan N-tert .butoksikarbonyyli-L-fenyylialanyyli-L-fenyylialanyyli-L-histidiinin metyyliesteriå (1,5 g) vårittominå kiteinå. Saanto 71,8%.

Sp. 170-173eC (haj.)

Nujol IR V (cm *1) :3310, 3300, 1740, 1695, 1640 Max NMR (d6-DMSO) 6: 1.28(9H,s), 2.4 - 3.2 (6H,m) .

3.59(3H,s), 3.9-4.8(3H,m), 6.65-7.6(14H,m), 7.8-8.2(lH,m), 8.37-8.7(lH.m)

Esimerkki 2 N-tert .butoksikarbonyyli-L-2-amino-4-fenyylibutyyrihapon disyk-loheksyyliamiinisuolaa (1,84 g) liuotetaan seokseen, jossa on etyyliasetaattia ja natriumbisulfaatin 3% vesiliuosta, ja etyy-liasetaattikerros erotetaan, peståån vedellå, kuivataan ja kon-sentroidaan sitten liuottimen poistamiseksi. Jåånnos liuotetaan dimetyyliformamidiin (20 ml) ja siihen lisåtåån L-fenyylialanyy-li-L-histidiinin metyyliesteridihydrobromidia (1,91 g), N-hyd-roksisukkiini-imidiå (0,5 g) ja disykloheksyylikarbodi-imidiå (0,9 g) lisåtåån siihen. Trietyyliamiinia (1,4 ml) lisåtåån seokseen jååhdyttåen, ja seosta sekoitetaan huoneenlåmmdsså yon yli. Reaktion tapahduttua seokseen lisåtåån etyyliasetaattia, ja liukenemattomat aineet suodatetaan pois ja sitten suodos kon-sentroidaan alipaineessa liuottimen poistamiseksi. Jåånnos puh-distetaan silikageelipylvåskromatografialla (liuotin: klorofor-mismetanoli=9:1) ja kiteytetåån etyyliasetaatilla, jolloin saa- 16 daan N-tert.butoksikarbonyyli-L-2-amino-4-fenyylibutyryyli-L-fenyylialanyyli-L-histidiinin metyyliesteri (1,45 g). Saanto 61%.

Sp. 186-187eC (haj.)

Nujol IR v (cm *1) :3300, 1730, 1685, 1660, 1645

Max NMR (dg -DMSO) 6: 1.36(9H,s), 1.5-1.9(2H,m), 2.35-3.5(6H,m), 3.53(3H,s), 3.7-4.0(IH,m), 4.3-4.7(2H,m), 6.7-7.45 (14H,m) , 7.8 - 8.1 (IH, m) , 8.4-8.7(lH,m)

Esimerkki 3 (1) N-tert.butoksikarbonyyli-L-2-amino-4-fenyylibutyyrihappoa (2,79 g), L-histidiinimetyyliesteridihydrokloridia (2,42 g), 1-hydroksibentsotriatsolia (1,35 g) ja trietyyliamiinia (2,8 ml) liuotetaan dimetyyliformamidiin (20 ml), ja siihen lisåtåan di-sykloheksyylikarbodi-imidiå (2,1 g) jåilla jaahdyttaen. Seosta sekoitetaan huoneenlammosså yon yli. Reaktioseokseen lisåtaan etyyliasetaattia ja liukenemattomat aineet suodatetaan pois. Suodos pestaån natriumbikarbonaatin vesiliuoksella ja natrium-kloridin vesiliuoksella, kuivataan ja konsentroidaan sitten liuottimen poistamiseksi. Jåånnos kiteytetåan eetterillå, jol-loin saadaan N-[N-tert.butoksikarbonyyli-L-2-amino-4-fenyylibu-tyryyli]-L-histidiinin metyyliesteriå (3,3 g) valkoisina kitei-na. Saanto 76,6%.

Sp. 127-130°C

Nu jol IR v (cm Ί) :3320, 1740, 1685, 1650

Max NMR (CDCI3) δ: 1.42(9H,s), 1.7-2.4(2H,m), 2.68(2H,t), 3.12 (2H,d), 3.66(3H,s), 3.95-4.3(IH,m), 4.65-5.0(lH,m), 6.3 - 6.65(IH,m), 6.7 5(IH,s) , 7.0-7.4(5H.m), 7.48(lH,s), 7.4-7.8(lH,m) 91159 17 (2) Kohdassa (1) saatua tuotetta (2,15 g) liuotetaan 20% vety-bromidin ja etikkahapon liuokseen (20 ml) ja seosta sekoitetaan huoneenlåmmosså 1 tunti. Reaktioseos konsentroidaan alipaineessa liuottimen poistamiseksi ja jåånnos trituroidaan eetterilia, jolloin saadaan N-(L-2-amino-4-fenyylibutyryyli)-L-histidiinin metyyliesteridihydrobromidia. Tuote liutetaan dimetyyliformami-diin (20 ml) ja lisåtåån N-tert.butoksikarbonyyli-L-fenyyli-alaniinin sukkiini-imidoesteriå (1,81 g) ja trietyyliamiinia (2,1 ml).

Seosta sekoitetaan ydn yli. Reaktioseos kåsitellåån samalla ta-valla kuin esimerkisså 2 on kuvattu ja kiteytetaan eeterilla, jolloin saadaan N-(N-tert.butoksikarbonyyli-L-fenyylialanyyli)-L-2-amino-4-fenyylibutyryyli-L-histidiinimetyyliesteriå (3,3 g) valkoisina kiteina. Saanto 69,2%.

Sp. 186-189 eC

Nujol IR v (cm ‘I) :3300, 1740, 1695, 1640 Max NMR (CDCI3 + d6*DMSO) δ: 1.35(9H,s), 1.7- 2.3(2H,m), 2.5-3.2(6H,m), 3.64(3H,s), 4.2-4.8(3H,s), 6.2-6.5(1H,m), 6.78(lH,s), 7.0-7.4(10H,m), 7.46(1H,s), 7.8-8.3(2H,m)

Esimerkki 4 (yhdiste ei kuulu keksinnon piiriin) (1) N-bentsyylioksikarbonyyli-L-fenyylialaniinia (2,99 g) ja p-nitrofenolia (1,39 g) liuotetaan tetrahydrofuraaniin (30 ml), ja lisåtHMn disykloheksyylikarbodi-imidia (2,1 g) jaillS jaahdytta-en. Seosta sekoitetaan huoneenlåmmosså neljå tuntia ja liukene-mattomat aineet suodatetaan pois. Etyyliasetaattia lisåtåån suo-dokseen ja seos peståån natriumbikarbonaatin vesiliuoksella ja natriumkloridin vesiliuoksella, kuivataan ja sitten konsentroidaan liuottimen poistamiseksi. Heksaania lisåtåån jåånnokseen, jolloin saadaan N-bentsyylioksikarbonyyli-L-fenyylialaniini-p-nitrofenyyliesteri kiteinå. Tuote liuotetaan tetrahydrofuraaniin (20 ml), ja jåillå jååhdyttåen lisåtåån liuos (15 ml), jossa on 18 L-histidiinimetyyliesteridihydrokloridia (2,4 g) ja trietyyli-amiinia (2,8 ml) vedessa, ja seosta sekoitetaan huoneenlammossa yon yli. Reaktioseos konsentroidaan alipaineessa liuottimen poistamiseksi. Jåånnos puhdistetaan silikageelipylvåskromatogra-fialla (liuotin; kloroformi:metanoli=15:l) ja kiteytetåån etyy-liasetaatista, jolloin saadaan N-bentsyylioksikarbonyyli-L-fe-nyylialanyyli-L-histidiiniraetyyliesteri (2,8 g) vårittomina ki-teinå. Saanto 64,1%.

Sp. 113-116 eC

Nujol IR v (cm ‘I) :3280, 1745, 1710, 1655

Max NMR (d6-DMSO) δ: 2.6 - 3.2(4H,m) , 3.59{3H,s), 4.1- 4.7(2H,m), 4.95 (2H,s), 6.8-7.6(9H,m) , 8.35-8.6(lH,m) (2) Kappaleessa (1) saatu tuote (2,49 g) liuotetaan 25% vetybro-midi-etikkahappoliuokseen (30 ml) ja liuosta sekoitetaan huoneenlammossa tunti. Reaktioseos konsentroidaan alipaineessa ja jåannos trituroidaan eetterillå, jolloin saadaan L-fenyyli-alanyyli-L-histidiinimetyyliesteridihydrobromidi epapuhtaana tuotteena. Seosta, jossa on nain saatua tuotetta (1,75 g), N-bentsyylioksikarbonyyli-L-fenyylialaniinin p-nitrofenyyliesteria (1,55 g), trietyyliamiinia (1,4 ml) ja dimetyyliformamidia (10 ml), sekoitetaan huoneenlammossa yon yli. Reaktioseos konsentroidaan alipaineessa, ja etyyliasetaattia ja vetta lisåtåån jåånnokseen. Saostuneet kiteet kerataan suodattamalla, jolloin saadaan N-bentsyylioksikarbonyyli-L-fenyylialanyyli-L-fenyyli-alanyyli-L-histidiinimetyyliesteri (1,02 g). Saanto 46,2%.

Sp. 204-206eC

Nujol IR v (cm -1) :3310, 3290, 1740, 1695, 1640

Max NMR (d6-DMSO) δ: 2.4 - 3.2(6H,m), 3.58(3H,s), 4.0- 4.7 5 (3H,m) , 4.92(2H,s), 6 .7-7.6 (1911, m) , 7.9-8.25(IH,m), 8.25 - 8.6(IH,m) li 91159

Esimerkki 5 19 4-[2-(N-bentsyylioksikarbonyyliamino)etyyli]-5-metoksikarbonyy-li-imidatsolia (1,2 g) liuotetaan 30% vetybromidi-etikkahappo-liuokseen (20 ml) ja liuosta sekoitetaan huoneenlaminossa 30 mi-nuuttia. Reaktioseos konsetroidaan alipaineessa ja jMånnos tri-turoldaan eetterilla, jolloin saadaan 4-(2-aminoetyyli)-5-metok-sikarbonyyli-imidatsolidihydrobromidia. Nain saatuun tuotteeseen lisataan dimetyyliformamidia (20 ml), N-tert.butoksikarbonyyli-L-fenyylialanyyli-L-fenyylialaniinia (1,65 g) ja 1-hydroksibent-sotriatsolia (0,54 g) . Seokseen lisataan disykloheksyylikarbodi-imidiå (0,83 g) jaillå jaåhdyttåen ja seosta sekoitetaan 10 mi-nuuttia. Trietyyliamiinia (1,4 ml) lisataan seokseen ja seosta sekoitetaan huoneenlammossa yon yli. Reaktioseokseen lisataan etyyliasetaattia ja liukenemattomat aineet suodatetaan pois.

Suodos peståan natriumbikarbonaatin vesiliuoksella ja natrium-kloridin vesiliuoksella, kuivataan, ja sitten konsentroidaan liuottimen poistamiseksi. Jåånnos puhdistetaan silikageelipyl-vaskromatografialla (liuotin; kloroformi:metanoli=12:1) ja ki-teytetaSn eetterilla, jolloin saadaan 4-{2-(N-(N-tert.butoksi-karbonyyli-L-fenyylialanyyli-L-fenyylialanyyli)amino]etyyli}-5-metoksikarbonyyli-imidatsolia (1,4 g) varittomina kiteinå. Saan-to 62,2%.

Sp. 155-159 eC

KBr IR v (cm -1) :3370, 3280, 1710, 1690, 1650 Max NMR (CDCl3+d6-DMSO) 6: 1.33(9H,s), 2.9 3 .7 (8H,m) , 3.82(3H,s), 4.2-4.8(2H,m), 5.48(1H,brs), 6.9-7.5(llH.m), 7.50(lH,s)

Esimerkit 6-8 N-tert.butoksikarbonyyli-L-fenyylialanyyli-L-fenyylialaniinia [tai N-bentsyylioksikarbonyyli-L-fenyylialanyyli-L-fenyyli-alaniinia] ja 4-aminometyyli-5-metoksikarbonyyli-2-(2-pyridyyli-metyylitio)imidatsolia (tai 4-(2-aminoetyyli)-5-metoksikarbonyy-li-2-(2-pyridyylimetyylitio)imidatsolia] kåsitellaån samalla 20 tavalla kuin esimerkisså 5 on kuvattu, jolloin saadaan seuraavat yhdisteet.

(6) 4-[N-(N-tert.butoksikarbonyyli-L-fenyylialanyyli-L-fenyyli-alanyyli) aminometyy1i]-5-metoks ikarbonyy1i-2-(2-pyridyy1imetyy-litio)imidatsoli

Sp. 147-150 °C

KBr IR v (cm 'I) :3280, 1705, 1690, 1645

Max NMR (d6-DMSO) 5: 1.26{9H,s), 2.5-3.1(4H,m) , 3.7 0(3 H,s), 3.9-4.7(6H,m), 6.68.5(17H,m), 12.3 -13.0(1H,br) (7) 4-{2- [N-(N-tert.butoksikarbonyyli-L-fenyylialanyyli-L-fenyy-lialanyyli) amino ] etyyli} - 5-metoks ikarbonyyli-2 - (2-pyridyylime-tyylitio)imidatsoli

Sp. 182-184°C (haj.)

Nu jol IR v (cm - 1) :3275, 1705, 1690, 1645

Max NMR (d6‘DMSO) 5: 1.26(9H,s), 2.4 - 3.1(4H,m) , 3.1-3.3(2H,m) , 3.68(3H,s) , 3.8 - 4.6(6H,m) , 6.7-8.4(17H,m) (8) 4-[N-(N-bentsyylioksikarbonyyli-L-fenyylialanyyli-L-fenyy-lialanyyli) aminometyyli ] -5-metoksikarbonyyli-2- ( 2-pyridyylime-tyylitio)imidatsoli

Sp. 140-142 *C

Nu jol IR v (cm -1) :3270, 1720, 1695, 1640

Max NMR (d6'DMSO) δ :2.6-3.2(4H,m), 3.70(3H,s), 4.0- 4.7 (6H,m) , 4.84 (2H,s) , 6.8 - 8.45(22H,m) , 12.5 -13.0(1H,br)

II

91159 21

Esimerkki 9

Trietyyliamiinia (3,5 ml) lisåtåån seokseen, jossa on histamii-nidihydrokloridia (1/84 g), N-tert.butoksikarbonyyli-L-fenyyli-alaniinisukkiini-imidoesteriå (3,62 g), dimetyyliformamidia (20 ml) ja vetta (5 ml), jaillå jååhdyttåen ja sitten seosta sekoi-tetaan huoneenlåmmosså 3 tuntia. Reaktioseos konsentroidaan ali-paineessa liuottimen poistamiseksi ja etyyliasetaattia lisåtåån jåannokseen ja sitten liukenemattomat aineet suodatetaan pois. Suodos peståan natriumbikarbonaatin vesiliuoksella ja vedellå, kuivataan, ja sitten konsentroidaan liuottimen poistamiseksi. Jaånnos kiteytetaån eetterillå, jolloin saadaan N-(N-tert.bu-toksikarbonyyli-L-fenyylialanyyli)histamiinia (2,5 g). Nain saa-tua tuotetta (1,79 g) liuotetaan 15% vetybromidi-etikkahappoli-uokseen ja liuosta sekoitetaan huoneenlåmmosså 30 minuuttia. Reaktioseos konsentroidaan alipaineessa, jolloin saadaan N-(L-fenyylialanyyli)histamiinidihydrobromidia (2,1 g). Nain saatu tuote (2,1 g) liuotetaan dimetyyliformamidiin, ja lisåtåån N-tert. butoksikarbonyyli-L-fenyylialaniinisukkiini-imidoesteriå (1,81 g) ja trietyyliamiinia (2,1 ml), ja seosta sekoitetaan ydn yli. Etyyliasetaattia lisåtåån reaktioseokseen, ja liukenematto-mat aineet suodatetaan pois. Suodos peståån natriumbikarbonaatin vesiliuoksella ja natriumkloridin vesiliuoksella ja kuivataan, ja konsentroidaan sitten liuottimen poistamiseksi. Jåånnos puh-distetaan silikageelipylvåskromatografialla (liuotin; klorofor-mi:metanoli=9:1) ja kiteytetaån eetteristå, jolloin saadaan N-(N-tert .butoks ikarbonyyli-L-fenyylialanyyli-L-fenyylialanyy-li)histamiinia (1,88 g) valkoisina kiteinå. Saanto 74,3%.

Sp. 175-177 °C

KBr IR v (cm ‘^) :3300, 1690, 1650

Max NMR (CDCl3+d6*DMSO) δ: 1.33(9H,s), 2.5-3.6(6H,m), 4.2 - 5.5(5H,m), 6.71(lH,s), 6.9-7.4(12H,m), 7.48(1H,s)

Esimerkki 10 22 10% vetykloridi-dioksaaniliuosta (30 ml) lisåtåån N-tert.butoksikarbonyyli-L-f enyylalanyyli-L-fenyylialanyyli-L-histidiinime-tyyliesteriin (2f25 g) ja seosta sekoitetaan huoneenlåmmosså 2 tuntia. Reaktioseos konsentroidaan alipaineessa liuottimen pois-tamiseksi ja eetteria lisåtåån jåånnokseen, jolloin saadaan L-fenyylialanyyli-L-fenyylialanyyli-L-histidiinimetyyliesteridi-hydrokloridia (2,15 g) valkoisena jauheena. Nain saatu tuote (2,15 g) liuotetaan dimetyyliformamidiin (15 ml), ja pivaloyyli-kloridia (0,48 g) lisatåån siihen. Seokseen lisåtåån trietyyli-amiinia (2,24 ml) pisaroittain jåillå jååhdyttåen ja seosta sekoitetaan huoneenlåmmosså yon yli. Etyyliasetaatia lisåtåån reaktioseokseen ja liukenemattomat aineet suodatetaan pois. Suo-dos peståån natriumbikarbonaatin vesiliuoksella ja vedellå, kui-vataan ja konsetroidaan sitten liuottimen poistamiseksi. Jåånnos puhdistetaan silikageelipylvåskromatografialla (liuotin; kloro-formi:metanoli=12:1) ja trituroidaan eetterillå, jolloin saadaan N-pivaloyyli-L-fenyylialanyyli-L-fenyylialanyyli-L-histidiinin metyyliesteri (0,98 g). Saanto 44,8%.

Sp. 128-131“C

KBr IR v (cm Ί) :3380, 3280, 1740, 1645

Max NMR (dg-DMSO) δ: 0.96(9H,s), 2.6 - 3.3(6H,m) , 3.59(3H,s), 4.3 - 4.8(3H,m), 6.83(lH,s), 7.0-7.5(12H,m), 7.53(lH,s), 7.49(lH,d), 7.94(1H,d)

Esimerkki 11 N-tert.butoksikarbonyyli-L-fenyylialanyyli-L-fenyylialanyyli-L-histidiinimetyyliesteriå (2 g) liuotetaan metanoliliuokseen, joka on kyllåstetty ammoniakilla, ja liuosta sekoitetaan paine-pullossa huoneenlåmmosså kolme påivåå. Reaktioseos konsentroidaan alipaineessa ja jåånnds kiteytetåån eetterillå, jolloin saadaan N-tert.butoksikarbonyyli-L-fenyylialanyyli-L-fenyyli-alanyyli-L-histidiiniamidi (1,7 g) valkoisina kiteinå. Saanto 87,2%.

91159 23

Sp. 169,6-171‘C (haj.) KBr IR v (cm -1) :3380, 3300, 1670 Max NMR (de-DMSO) 5: 1.26(9H,s), 2.4 - 3.2(6H,m), 3.9-4.8(3H,m), 6.65-7.6(13H,m), 7.9 - 8.3(2H,m)

Esimerkki 12 N-pivaloyyli-L-fenyylialanyyli-L-fenyylialanyyli-L-histidiinime-tyyliesteria (1,90 g) liuotetaan tetrahydrofuraaniin (12 ml), ja siihen lisåtåån pisaroittain liuos, jossa on natriumboorihydri-dlå (0,20 g) metanolissa (2,5 ml). Seosta sekoitetaan huoneen-lammosså 4 tuntia, ja seokseen lisatåan 5% vetykloridihappoa (4 ml) ja sitten liuotin tislataan pois. Jaannos tehdaan emåksisek-si natriumbikarbonaatin vesiliuoksella ja uutetaan sitten etyy-liasetaatilla. Uute peståån natriumkloridin vesiliuoksella, kui-vataan ja konsentroidaan liuottimen poistamiseksi. Jaannos tri-turoidaan etyyliasetaatilla, jolloin saadaan 4-{2-hydroksimetyy-1i-2-[N-(N-pivaloyyli-L-fenyylalanyyli-L-fenyylialanyyli)amino]-etyyli>imidatsoli (1,24 g) valkoisena jauheena. Saanto 68,8%.

Sp. 124-130eC

Nu jol IR v (cm Ί) :3300, 1640

Max NMR (d6-DMSO) b: 0.97 (9H,s), 2.3 - 3.5(6H,m), 3.7-4.1(2H,m), 4.3-4.7(3H,m), 6.6-8.3(16H,m) MS (m/z) : 519 (M+)

Esimerkki 13 (1) Liuos, jossa on fosgeenia (2,6 g) dikloorimetaanissa (25 ml), lisatåan pisaroittain seokseen, jossa on L-fenyylialaniini- 24 metyyliesterihydrckloiridia (4/3 g), trietyyliamiinia (6/4 ml) ja dikloorimetaania (25 ml), låmpotilassa -30eC:een alapuolella. Seosta sekoitetaan -30°C:ssa 30 minuuttia ja konsentroidaan ali-paineessa liuottimen poistamiseksi. Dimetyyliformamidia (30 ml), N-tert.butoksikarbonyyli-N'-bentsyylihydratsiinia (4,44 g) ja trietyyliamiinia (3,64 ml) lisataan jåånndkseen ja seosta sekoitetaan 50eC:ssa viisi tuntia ja sekoitetaan edelleen huoneenlåm-mossa yon yli. Reaktioseos konsentroidaan alipaineessa liuottimen poistamiseksi, ja etyyliasetaattia ja vetta lisåtåån jåan-nokseen. Orgaaninen kerros keråtåån talteen, kuivataan ja konsentroidaan sitten liuottimen poistamiseksi. Jåånnos puhdiste-taan silikageelipylvaskromatografialla (liuotin; tolueenisetyy-liasetaatti=8:1) ja trituroidaan heksaanilla, jolloin saadaan 3-tert.butoksikarbonyyli-2-bentsyylikarbatsoyyli-L-fenyylialanii-nimetyyliesteri (4 g) valkoisena jauheena. Saanto 93,5%.

Sp. 71-73eC

KBr IR v (cm *1) :3400, 3240, 1730, 1650 Max NMR (CDCI3) δ: 1.42(9H,s), 3.13(2H,d), 3.69(3H,s), 4.4-5.1(3H,m), 5.89(IH,brd), 6.01(IH,s), 7.0-7.5(10H,m) (2) Kappaleessa (1) saatua tuotetta (1,71 g) liuotetaan metano-liin (5 ml). Liuottimeen lisataan 2N natriumhydroksidin vesiliu-os (2,2 ml) ja seosta sekoitetaan huoneenlammossa 3 tuntia. Reaktion jalkeen metanoli tislataan pois alipaineessa ja jåannos tehdaån happamaksi 10% sitruunahapolla ja sitten seos uutetaan etyyliasetaatilla. Uute pestaån natriumkloridin vesiliuoksella, kuivataan ja sitten konsentroidaan liuottimen poistamiseksi, jolloin saadaan 3-tert.butoksikarbonyyli-2-bentsyylioksikarbat-soyyli-L-fenyylialaniinia (1,65 g) epapuhtaina kiteinH. Nain saatu tuote (1,65 g) liuotetaan dimetyyliformamidiin (20 ml), ja siihen lisataan jåillå jaahdyttåen L-histidiinimetyyliesteridi-hydrokloridia (1,07 g), trietyyliamiinia (1,26 ml), 1-hydroksi-bentsotriatsolia (0,54 g) ja disykloheksyylikarbodi-imidiå 91159 25 (0,91 g). Seosta sekoitetaan huoneenlåmmosså yon yli. Etyyli-asetaattia lisåtåån reaktioseokseen, ja liukenemattomat aineet suodatetaan pois. Suodos peståån natriumbikarbonaatin vesiliuok-sella ja vedellå, kuivataan ja konsentroidaan sitten liuottimen poistamiseksi. Jaånnos puhdistetaan silikageelipylvaskromatogra-fialla (liuotin; kloroformi:metanoli=12:1) ja trituroidaan eet-terillå, jolloin saadaan 3-tert.butoksikarbonyyli-2-bentsyyli-karbatsoyyli-L-fenyylialanyyli-L-histidiinimetyyliesteri (1,76 g) vårittomana jauheena. Saanto 77,9%.

Nujol IR v (cm 'I) :3400, 3270, 1730, 1655 Max NMR (CDCI3) 5: 1.40(9H,s), 2.9 -3.3(4H,m), 3.65 (3H,s), 4.4-5.0(4H,m), 6.07(lH,d), 6.65- 6.9 (IH, m) , 6.70 (IH, s) , 7.0-7.5 (IH, m) , 7.39 UH,m)

Esimerkit 14-15 3-tert.butoksikarbonyyli-2-bentsyylikarbatsoyyli-L-fenyyli-alaniinia ja histamiinidihydrokloridia tai 4-(2-aminoetyyli)-5-metoksikarbonyyli-2-(2-pyridyylimetyylitio)imidatsolitrihydro-bromidia kasitellaan samalla tavalla kuin esimerkisså 13-(2) on kuvattu, jolloin saadaan seuraavat yhdisteet.

(14) N-(3-tert.butoksikarbonyyli-2-bentsyylikarbatsoyyli-L-fe-nyylialanyyli)histamiini KBr IR v (cm -1) :3480, 3250, 1715, 1645 Max NMR (CDCI3) δ: 1.35(9H,s), 2.5*2.8(2H,m), 2.9-3.5(4H,m), 4.3-4.8(3H,m), 6.03(IH,brd), 6.63(IH,s), 6.9-7.4(12H,m) (15) 4—[2—((3-tert.butoksikarbonyyli-2-bentsyylikarbatsoyyli-L-fenyylialanyyli) amino) etyyli ] -5-ir«etoksikarbonyyli-2- (2-pyridyylimetyylitio) imidat sol i 26

Sp. 132 - 137 ’C

Nu jol IR v (cm *1) :3250, 1710, 1660

Max NMR (CDCI3) δ: 1.38 (9H,s) , 2.9-3.8(8H,m), 3.82(2H,s), 4.0-4.9(3H,m) , 5.9 - 6.2(IH,m), 6.9-8.0(15H,m)

Esimerkit 16-18 L-fenyylialaniinimetyyliesteriå ja N-tert.butoksikarbonyyli-N'-fenetyylihydratsiinia tai N-pivaloyyli-N'-bentsyylihydratsiini-hydrobromidia kasitellaån samalla tavalla kuin esimerkisså 13-(1) on kuvattu, jolloin saadaan seuraavat yhdisteet.

3-tert .butoksikarbonyyli-2-fenetyylikarbatsoyyli-L-fenyyliala-niinimetyyliesteri

Sp. 97-99*C

Nujol IR v (cm -1) :3400, 3190, 1735, 1640

Max NMR (CDCI3) δ: 1.41(9H,s) , 2.73 - 3.2(4H,m) , 3.65(3H,s) , 3.4-4.0 (2H,m) , 4.6 - 4.9 (IH, in) , 5.71(IH,d), 5.96(IH,S), 6.96-7.42(10H,m) 3-pivaloyyli-2-bentsyylikarbatsoyyli-L-fenyylialaniinimetyylies- teri

Sp. 141-143*C

Nujol IR v (cm Ί) :3290, 1725, 1665, 1645

Max NMR (CDCI3) δ: 1.03(9H,s) , 3.13(2H,d), 3.70(3H,s), 4.40 - 5.10(4H,m), 5.50-5.70 (IH, m) , 6.9-7.50 (1011, m)

II

91159 27

Edellå saatuja yhdisteitå ja histamiinidihydrokloridia tai 4-(2-aminoetyyli)-5-metoksikarbonyyli-2-(2-pyridyylimetyylitio)-im-idatsolitrihydrobromidia kåsitellåån samalla tavalla kuin esi-merkissa 13-(2) on kuvattu, jolloin saadaan seuraavat yhdisteet.

(16) N-(3-tert.butoksikarbonyyli-2-fenetyylikarbatsoyyli-L-fe-nyylialanyyli)histamiini

Sp. 87-95eC

Nujol IR v (cm Ί) :3290, 1715, 1645 Max NMR (CDCI3) 6: 1.39(9H,s), 2.56-4.0(2H,d) , 4.3- 4.6 (4H, m), 5.88(lH,d), 6.66(1H,S), 7.0-7.4(IH,m), 7.42 (IH,s), 8.1-8.4(lH,m) (17) N-(3-pivaloyyli-2-bentsyylikarbatsoyyli-L-fenyylialanyy-li)histamiini

Sp. 78-86eC

KBr IR v (cm -1) :3400, 3300, 1650

Max NMR (CDCI3) δ: 0.98(9H,s), 2.6 - 3.6(2H,d) , 4.4-5.0(3H,m), 5.55(IH,d), 6.61(1H,S), 6.95-7.5(10H,m), 8.2-8.9(2H,m) 1 5-metoksikarbonyyli-4-[2-((3-pivaloyyli-2-bentsyylikarbat-soyyli-L-fenyylialanyyli) amino)etyyli]-2-(2-pyridyylimetyylitio) imidatsoli

Sp. 171-172eC

KBr IR v (cm -1) :3400, 1705, 1660 Max 28 NMR (CDCI3) δ: 1.01 (9H,s) , 2.8-3.8 (6H,m) , 3.83 (3Η, s) , 4.2-4.8(5H,m). 5.56 - 5.7 5 (1Η, ηι) , 6.95-8.00(14H,m) , 8.33 - 8.5(1Η,m)

Esimerkki 19 (1) Seokseen, jossa on N-(bentsyylioksikarbonyyli)-L-2-aminoksi- 3-fenyylipropionihappoa (3,09 g), L-histidiinimetyyliesteridi-hydrokloridia (2,42 g), N-hydroksibentsotriatsolia (1,35 g)r trietyyliamiinia (2,8 ml) ja dimetyyliformamidia (20 ml), lisa-taan disykloheksyylikarbodi-imidia (2,1 g) jåillå jååhdyttåen, ja seosta sekoitetaan huoneenlåmmosså yon yli. Reaktioseos kon-sentroidaan alipaineessa liuottimen poistamiseksi, ja etyyli-asetaattia lisåtåån jåånnokseen. Liukenemattomat aineet suodate-taan pois. Suodos peståån natriumbikarbonaatin vesiliuoksella ja vedella, kuivataan ja konsentroidaan sitten liuottimen poistamiseksi. Jaannos puhdistetaan silikageelipylvaskromatografialla (liuotin; kloroformi:etyyliasetaatti=12:1) ja kiteytetaSn hek-saanilla, jolloin saadaan N-[N-(bentsyylioksikarbonyyli)-L-2-aminoksi-3-£enyylipropionyyli]-L-histidiinimetyyliesteria (2,1 g) valkoisena jauheena.

KBr IR v (cm _1) :3300, 1735, 1665

Max NMR (CDCI3) δ: 2.8-3.2(4H,m), 3.62(3H,s), 4.3· 4.9 ( 2H, in) , 5.09(2H,s), 6.66(lH,s), 7.0- 7.5( 10H , in) , 7.36(111,s), 7.95 (1H, d) (2) Kappaleessa (1) saatu tuote (2,1 g) liuotetaan 33% vetybro-midi-etikkahappoliuokseen (30 ml) ja liuosta sekoitetaan huo-neenlåmmdsså tunti. Reaktioseos konsentroidaan alipaineessa liuottimen poistamiseksi ja jaannos trituroidaan eetterilla, jolloin saadaan N-(L-2-aminoksi-3-fenyylipropionyyli)-L-histi-diinimetyyliesteridihydrobromidia (2,32 g). Nain saatu tuote (2,32 g) suspendoidaan dimetyyliformamidiin (20 ml), ja tahan lisatåan N-tert.butoksikarbonyyli-L-fenyylialaniinia (1,25 g), 1-hydroksibentsotriatsolia (0,68 g) ja trietyylieuniinia (1,3 11 91159 29 ml). Disykloheksyylikarbodi-imidiå (1/1 g) lisåtaan seokseen jailla jååhdyttåen ja seosta sekoitetaan huoneenlåmmosså yon yli. Reaktioliuos konsentroidaan alipaineessa ja etyyliasetaat-tia lisataan jaannokseen. Liukenemattomat aineet suodatetaan pois. Suodos peståån natriumbikarbonaatin vesiliuoksella ja ve-dellå, kuivataan ja sitten konsentroidaan liuottimen poistami-seksi. Jaannos puhdistetaan silikageelipylvåskromatografialla (liuotin; kloroformi:metanoli=15:1) ja trituroidaan isopropyyli-eetterillå, jolloin saadaan N-[N-(tert .buitoksikarbonyyli-L-fe-nyylialanyyli) -L-2-aminoksi-3-fenyylipropionyyli]-L-histidiini-metyyliesteriå (1/95 g) valkoisena jauheena. Saanto 71/7%.

KBr IR v (cm -1) :3400, 3290, 1745, 1680

Max NMR (CDCI3) δ: 1.35(9H,s), 2.7 - 3.4(6H,m) , 3.70(3H,s) , 4.0 - 5.0(3H,m) , 5.0 - 5.5{IH,m), 6.74(IH,s), 7.0-8.3<llH,d)

Esimerkki 20

Seokseen, jossa on N-(bentsyylioksikarbonyyli)-L-2-aminoksi-3-fenyylipropionihappoa (1,6 g), L-fenyylialanyyli-L-histidiinime-tyyliesteridihydrobromidia (2,39 g), N-hydroksisukkiini-imidia (0,6 g), trietyyliamiinia (1,4 ml) ja dimetyyliformamidia (20 ml), lisataMn disykloheksyylikarbodi-imidia (1,1 g) jåilla jååh-dyttåen ja seosta sekoitetaan sitten huoneenlammossa yon yli. Reaktioseos konsentroidaan alipaineessa liuottimen poistamiseksi ja etyyliasetaattia lisåtaan jaannokseen. Liukenemattomat mate-riaalit suodatetaan pois. Suodos peståån natriumbikarbonaatin vesiliuoksella ja vedellå, kuivataan ja konsentroidaan sitten liuottimen poistamiseksi. Jåånnos puhdistetaan silikageelipylvåskromatograf ialla (liuotin; kloroformiimetanoli=9s 1) ja kitey-tetåån eetterillå, jolloin saadaan N-[N-(bentsyylioksikarbonyy-li) -L-2-aminoksi-3-f enyylipropionyyli ] -L-fenyylialanyyli-L-his-tidiinimetyyliesteriå (1,3 g).

30 KBr IR v (cm -1) :3300, 1735, 1650

Max NMR {CDCI3) δ: 2.6-3.3(6H,m), 3.62(2H,s), 4.3- 4.9(3H,m), 5.05(2H,s), 6.63(lH,s). 6.8- 7.9 (17H, ni)

Esimerkki 21 N-pivaloyyli-L-fenyylialaniinia ja N-metyyli-L-fenyylialanyyli-L-histidiinimetyyliesteriå kåsitellåån samalla tavalla kuin esimerkisså 1 on kuvattu, jolloin saadaan N-pivaloyyli-L-fenyyli-alanyyli-N-metyyli-L-fenyylialanyyli-L-histidiinimetyyliesteri.

Esimerkki 22 N-pivaloyyli-N-metyyli-L-fenyylialaniinia ja L-N-metyylifenyy-lialanyyli-L-histidiinimetyyliesteriå kasitellåSn samalla tavalla kuin esimerkisså 1 on kuvattu, jolloin saadaan N-pivaloyyli-N-metyyli-L-fenyylialaniini-L-fenylialanyyli-L-histidiinimetyy-liesteri.

Esimerkki 23 N- (N-pivaloyyli-L-fenyylialanyyli)-N'-bentsyylihydratsiinia ja L-histidiinimetyyliesteriå kåsitellåån samalla tavalla kuin esi-merkissa 13 on kuvattu, jolloin saadaan N-pivaloyyli-L-fenyyli-alanyyli-2-bentsyylikarbatsoyyli-L-histidiinimetyyliesteri.

Esimerkki 24 N- (3-pivaloyyli-2-bentsyylikarbatsoyyli) -N' -bentsyylihydratsiinia ja L-histidiinimetyyliesteria kåsitellåån samalla tavalla kuin esimerkisså 13 on kuvattu, jolloin saadaan 3-(3-pivaloyyli- 2-bentsyylikarbatsoyyli)-2-bentsyylikarbatsoyyli-L-histidiinime-tyyliesteri.

11 91159 31

Esimerkki 25 N-pivaloyyli-L-fenyylialaniinia ja L-2-aminoksi-3-fenyylipropio-nyyli-L-histidiinimetyyliesteria kasitellaan samalla tavalla kuin esimerkissa 19 on kuvattu, jolloin saadaan N-(N-pivaloyyli-L-fenyylialanyyli) -L-2-aminoksi-3-fenyylipropionyyli-L-histidii-nimetyyliesteri.

Esimerkki 26 N-pivaloyyli-L-2-aminoksi-3-fenyylipropionihappoa ja L-2-aminok-si-3-fenyylipropionyyli-L-histidiinimetyyliesteriå kasitellaan samalla tavalla kuin esimerkissa 19 on kuvattu, jolloin saadaan N- (N-pivaloyyii-L-2-aminoksi-3-fenyylipropionyyli) -L-2-aminoksi- 3-fenyylipropionyyli-L-histidiinimetyyliesteri.

Esimerkit 27-32

Esimerkeissa 21-26 saadut yhdisteet muutetaan amideikseen samalla tavalla kuin esimerkissa 11 on kuvattu, jolloin saadaan seu-raavassa taulukossa 3 esitetyt yhdisteet.

32

Taulukko 3

Nro Yhdisteet 27 t-BuCO-L-Phe-L-MePhe-L-His-NH2 28 t-BuCO-L-MePhe-L-MePhe-L-His-NH2 CH2 Ph 29 t-BuCO-L-Phe-NHN- CO -L- His -NH2 CH2PI1 CH2Ph 30 t-BuCO-NHN-CONHN- CO -L-H i s -NH2 CH2PI1 31 t-BuCO-L-Phe-L-NH- O -CH- CO-L- His -NH2 CH2Ph CjH2Ph 32 t-BuCO-L-NH- O-CH- CO -L-NH-O-CH- CO-L- His -NH2

Huom.: taulukossa 3 olevien lyhenteiden merkitykset ovat seuraa-vat:

Lvhenteet Merkitykset t-Bu tert.butyyli

Ph fenyyli

Phe fenyylialaniini

MePhe N-metyylifenyylialaniini 11

Claims (4)

91159 33

1. Menetelma yleisen kaavan (I) mukaisten imidatsolipitoisten peptidien tai niiden farmaseuttisesti sopivien suolojen valmis-tamiseksi: R2 R3 R4 R5 . 1 1 , I >2 /^ψ{ p6 m R —CON—X —CON—X2—CO— NH—A—£ :d^R7 (I) joss a R1 on haarautunut alkyyliryhma, haarautunut alkoks iryhmS tai fenyyliryhmSlia substituoitu alempi alkoksiryhmå, R2 ja R4 ovat samoja tai erilaisia ja kumpikin on vetyatomi tai alempi alkyyliryhma, R3 ja R5 ovat fenyyliryhmallS substituoitu alempi alkyyliryhma, R6 on vetyatomi tai alempi alkoksikarbonyyliryh-mS, R7 on vetyatomi tai pyridyyliryhmMlla substituoitu alempi alkyylitioryhmS, X1 ja X2 ovat samoja tai erilaisia ja kumpikin on -CH-, -OCH- tai -N-, A on alempi alkyleeniryhma, joka voi olla substituoitu alemmalla alkoksikarbonyyliryhmålla, hydrok-simetyyliryhmMlla tai seuraavan kaavan mukaisella ryhmallS: -CON—R® ^R9 jossa R® ja R9 ovat samoja tai erilaisia ja kumpikin on vetyatomi tai alempi alkyyliryhma, silla ehdolla, ettei N-bentsyy-lioksikarbonyyli-fenyylialanyyli-fenyylialanyyli-histidiinime-tyyliesteri kuulu naiden yhdisteiden joukkoon, tunnettu siitS, ettS: [I]-(A) kondensoidaan kaavan (II) mukainen yhdiste, tai sen suola tai sen reaktiivinen johdannainen: R2 R3 R'-CON—X'-COOH (H) jossa substituentit tarkoittavat samaa kuin yllS, kaavan (III) mukaisen yhdisteen, tai sen suolan kanssa: R4 R5 HN— X2-CONH—a—(II I) N^ r 34 jossa substituentit tarkoittavat samaa kuin ylla, tai (B) kondensoidaan kaavan (IV) mukainen yhdiste, tai sen suola tai sen reaktiivinen johdannainen: R2 R3 R4 R5 1 (IV) R-CON-X'-CON—X2-COOII UVj jossa substituentit tarkoittavat samaa kuin yllS, kaavan (V) mukaisen yhdisteen, tai sen suolan kanssa: K2M-a-^^-r6 (V) jossa substituentit tarkoittavat samaa kuin ylla, tai (C) kondensoidaan kaavan (VI) mukainen yhdiste tai sen suola tai sen reaktiivinen johdannainen: R1COOH (VI) jossa substituentti tarkoittaa samaa kuin ylla, kaavan (VII) mukaisen yhdisteen tai sen suolan kanssa: R2 R3 R4 R5 HN-X'-CON—X2-CONH— A—(VH) jossa substituentit tarkoittavat samaa kuin yllS, ja [II] kun lopputuote on yhdiste (I), jossa R6 on vetyatomi ja A on alemmalla alkoksikarbonyyliryhmalla substituoitu alempi al-kyleeniryhma, valinnaisesti pelkistetåån tama, jolloin saadaan kaavan (I) mukainen yhdiste, jossa R6 on vetyatomi ja A on hyd-roksimetyyliryhmalla substituoitu alempi alkyleeniryhmå, tai annetaan sen reagoida kaavan (VIII) mukaisen amiiniyhdisteen tai sen suolan kanssa: NH—R8 (VIII) VR9 jossa R® ja R9 ovat samoja tai erilaisia ja kumpikin on vetyatomi tai alempi alkyyliryhma, jolloin saadaan kaavan (I) II 91159 35 mukainen yhdiste, jossa R6 on vetyatomi ja A on alempi alkyleeniryhma, joka on substituoitu seuraavan kaavan mukaisen ryhman kanssa: -CON— Re ^R9 jossa substituentit tarkoittavat samaa kuin ylia, ja [III] haluttaessa muutetaan kohdissa [I] ja [II] saadut tuot- teet farmaseuttisesti sopiviksi suoloikseen.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelma, tunnettu siita, etta R1 on haarautunut alkyyliryhma, jossa on 3-6 hii-liatomia, haarautunut alkoksiryhma, jossa on 3-6 hiiliatomia tai fenyyliryhmalia substituoitu alempi alkoksiryhma.

3. Patenttivaatimuksen 2 mukainen menetelma, tunnettu siitå/ ettå A on alempi alkyleeniryhmå, alemmalla alkoksikar-bonyyliryhmalla substituoitu alempi alkyleeniryhma, hydroksime-tyyliryhmalla substituoitu alempi alkyleeniryhma tai karbamoyy-liryhmSllå substituoitu alempi alkyleeniryhma.

4. Patenttivaatimuksen 3 mukainen menetelma, tunnettu siita, etta R1 on tert.-butyyli, tert.-butyylioksi tai bentsyy-lioksi, R2 ja R4 ovat vetyatomi tai metyyli, R3 ja R1 ovat bent-syyli tai fenetyyli, R6 on vetyatomi tai metoksikarbonyyli, R7 on vetyatomi, 2-pyridyylimetyylitio tai 3-pyridyylimetyylitio, ja A on metyleeni, etyleeni, metoksikarbonyylietyleeni, hydrok-simetyylietyleeni tai karbamoyylietyleeni. Patenttivaatimuksen 4 mukainen menetelma, tunnettu siita, etta R1 on tert.-butyyli tai tert.-butyylioksi, ja R3 ja R1 ovat bentsyyli. 36